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    PRELABORATORIO

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    ESTEFANIA MEDINA GUTIERREZ
    Este documento describe los conceptos y procedimientos básicos de la electroforesis, incluyendo cómo se utiliza para separar moléculas en función de su tamaño y carga eléctrica a través de un gel, y los parámetros que pueden variarse para optimizar la separación.

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    ESTEFANIA MEDINA GUTIERREZ
    Este documento describe los conceptos y procedimientos básicos de la electroforesis, incluyendo cómo se utiliza para separar moléculas en función de su tamaño y carga eléctrica a través de un gel, y los parámetros que pueden variarse para optimizar la separación.

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    PRELABORATORIO:

    1. ¿En qué consiste una separación electroforética?

    Es una utilizada para separar el ADN, el ARN, moléculas o proteínas de acuerdo a


    su tamaño y carga eléctrica. Se utiliza una corriente eléctrica para mover las
    moléculas y que estas se separen a través de un gel. Los poros del gel actúan como
    un colador, permitiendo que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido
    que las grandes.

    2. ¿Qué parámetros pueden variarse para determinar las condiciones óptimas


    de separación de componentes por electroforesis?

     Flujo electroosmótico
     Difusión
     Adsorción
     La concentración
     El pH del electrolito
     El voltaje aplicado
     Temperatura
     Fuerza ionica

    3. ¿Cómo influye el pH de la solución reguladora sobre la migración de los iones


    a separar por electroforesis?

    Influye ya que la migración de las partículas depende del pH del medio en que estén,
    ya que su carga neta depende del pH. Una disolución de pH alcalino es mejor para
    conseguir una mayor movilidad electroosmótica, cuando se hace a pH acido las
    movilidades son menores, por esto no se recomienda realizar acondicionamientos
    con pH<6 ya que en estos valores se muestra más inestabilidad de la movilidad.

    5.¿Por qué aumenta la temperatura del sistema durante el desarrollo


    electroforético?.¿Qué efectos pueden producir esas variaciones?

    El aumento de temperatura produce una evaporación que aumenta la concentración


    de las moléculas en la solución tampón. Al aumentar la concentración del electrolito
    aumenta la conductividad del medio, esto hace que disminuya la movilidad
    electroforética.

    6.¿En qué consisten los medios soporte para electroforesis? ¿Qué propiedades de
    los medios soporte influyen en la separación electroforética?

    Medios de baja fricción


     papel
     acetato de celulosa gel de almidón

    Medios de elevada fricción


     gel de agarosa
     gel de poliacrilamida
     gel de agarosa+poliacrilamida

    Papel: Con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.

    Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción;
    baja tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y
    recuperar, respectivamente, los componentes separados.

    Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón caliente


    (se hinchan).

    Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-


    agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de
    alta porosidad.

    Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla


    de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción
    se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de
    agarosa.

    Agarosa+poliacrilamida: se consigue una porosidad intermedia.

    7.Explique cuales son los buffers utilizados en el corrido electroforético y sus


    componentes (TAE, TBE). ¿Cuáles son sus propiedades y cuando se utilizan?

    El buffer TBE y buffer TAE, estos dos sólo se diferencian en un compuesto, ácido
    bórico y ácido acético respectivamente.

    Componentes:

    – Tris (Tris-(hidroximetil)-aminometano): Molécula responsable del tamponamiento.


    Regulación del pH.

    – Ácido Bórico/Ácido Acético : contribuye a ajustar el pH deseado e igual que el


    anterior, a mantenerlo.

    – EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético): quelante de cationes divalentes, cuya


    función es secuestrar Mg2+, con lo que se evita que las posibles nucleasas
    presentes degraden el ADN de la muestra, ya que la mayoría de las nucleasas
    requieren de Mg2+ como cofactor.

    8¿Qué es el buffer de carga y que propósitos cumple en la electroforesis?


    El buffer de carga es la solución en la que se disuelve la muestra. Contiene colorante
    que sirve para visualizar la migración de DNA y también indica cuando debe
    detenerse la electroforesis

    9.En que consiste un patron de peso molecular

    En la electroforesis se añade una mezcla de proteínas de peso molecular conocido


    el cual sirve como patrón. Este patrón nos permite hacer una estimación de nuestras
    proteínas de interés. Para ello medimos la movilidad relativa o la migración de la
    banda de la proteína.

    POST-LABORATORIO:

    1. ¿En qué caso se utiliza la poliacrilamida para separación de ácidos


    nucleicos?

    La poliacrilamida se suele utilizar en situaciones donde se dispone de fragmentos


    de bajo tamaño molecular, es decir, de menos de 1000 pares de bases.

    2. ¿Qué factores afectan la velocidad de migración del ADN en geles de


    agarosa?

    El tamaño es el factor que determina la velocidad de la migración en los geles de


    agarosa, si los ácidos nucleicos son sometidos a movimiento por medio de un gel
    formado por una malla tridimensional de un polímero, (como la agarosa) la fricción
    hará que las moléculas más grandes migren con más lentitud, mientras que las más
    pequeñas migraran más rápido. Esto permite que las diferentes moléculas se
    separen en función de su tamaño.

    3. ¿Por qué se utiliza Ultravioleta para visualizar el ADN?

    Porque se le añade bromuro de etidio, esta sustancia se intercala entre las bases
    del ADN y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la
    electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y lo que se verán las
    bandas correspondientes a las muestras de ADN aplicado y los marcadores de peso
    molecular.

    4. Entre un ADN lineal, enrollado (con un corte), súper enrollado, ¿cuál migra
    más rápido y por qué?

    La movilidad aumenta con el grado de enrollamiento, es decir, cuanto más retorcido


    esté, más compacto es, atraviesa mejor el gel y tiene mayor movilidad, por lo que
    avanza más. En este caso, el súper enrollado migraría más rápido, debido a que su
    súper enrollamiento conllevaría a que la molécula sea más compacta, que tenga
    menos longitud por recorrer y migrar, causando así que esta molécula tenga una
    migración con una mayor rapidez.

    5. ¿Cómo funciona el bromuro de etidio o cualquier otro colorante de acidos


    nucleicos? Explique en un diagrama el fundamento Como se cuantifican
    ácidos nucleicos con estos colorantes?

    El bromuro de etidio se utiliza como marcador fluorescente del ADN. Su utilidad


    proviene de su fluorescencia, la cual aumenta al encontrarse en un entorno
    hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. De esta manera podemos teñir el ADN
    del gel, y descubrir su posición.

    Colorantes que
    cuantifican acidos
    nucleicos

    Azul de
    Bromuro de etidio Xileno-cianol GelRed™
    bromofenol

    Cuando se expone esta El xilene cianol en Al unirse al DNA los dos


    sustancia a luz ultravioleta, El azul de bromofenol En forma libre, los dos núcleos se separan y, al
    geles de encontrarse en un entorno
    emite una luz roja- en 8% de poliacrilamida al 8% núcleos aromáticos
    anaranjada, que se interaccionan entre sí hidrófobo, emiten una
    concentración de migra de manera fluorescencia intensa. Se
    intensifica unas 20 veces poliacrilamida es y por ello la molécula
    después de haberse unido similar a un fragmento excitan con luz ultravioleta
    equivalente a un de ADN de 160 pb apenas es de onda corta, 254 nm, y
    a una cadena de ADN. Lo fluorescente.
    cual aclara los ácidos fragmento de 45 pb emiten luz visible, de color
    nucleicos rojo.

    6. Que otros agentes intercalantes se pueden utilizar y que ventajas tienen?

    Azul de bromofenol: En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más


    rápido que las proteínas o que la mayoría de moléculas de DNA (aquéllas superiores
    a 300 pb). Puesto que su color azul-violeta es bien visible, permite detener la
    electroforesis con la confianza de que las moléculas de proteína o DNA no se hayan
    salido del gel.
    Xileno-cianol y verde cianol: En la electroforesis el xileno-cianol se mueve
    aproximadamente como las moléculas de DNA de 3500 a 5000 pb. Ambos tienen
    un color azul turquesa que permite detener la electroforesis con la confianza de que
    las moléculas grandes de DNA no se hayan salido del gel.

    GelRed™: Es la marca comercial de un compuesto adecuado para revelar el DNA


    en geles. Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia. En la electroforesis, se
    utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el gel. Se puede bañar el gel
    tras la electroforesis en una disolución de GelRed™, o bien incorporar éste a la
    disolución de agarosa con la que se prepara el gel.

    7. ¿Para qué se usa la electroforesis en campo pulsado y en qué se diferencia


    de la convencional que usted aprendió en esta práctica?

    Para que las moléculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb se


    pueden separar empleando gel de agarosa. Para esto se emplean geles de agarosa
    al 1%, pero se altera periódicamente la orientación del campo eléctrico aplicado,
    activando alternativamente dos pares de electrodos. El cambio de dirección del
    campo eléctrico consigue que las moléculas se desplieguen y avancen a través de
    los poros en conformación extendida. A mayor tamaño, se reorientan con más
    dificultad, por lo que avanzan más despacio.

    Se diferencia de la convencional en que esta no puede separar fragmentos de ADN


    de longitud superior a 20-40 kb debido a que las moléculas de DNA, que adoptan
    una conformación más o menos globular, poseen un tamaño excesivamente grande
    para atravesar los poros del gel y no se separan en función de su tamaño.

    Referencias:

    Factores afectan la velocidad de migraci\u00f3n del ADN en geles de agarosa 6 |


    Course Hero [Internet]. Coursehero.com. [citado 23 Abril 2021].Obtenido de:
    https://www.coursehero.com/file/p31id9g3/6-Qu%C3%A9-factores-afectan-la-
    velocidad-de-migraci%C3%B3n-del-ADN-en-geles-de-agarosa-6/

    Características y preparación del Buffer TBE (Tris, Borato, EDTA) y TAE (Tris, Ácido
    Acético, EDTA) [Internet]. Laboratorio de Ideas de Esquilo. [citado 23 Abril
    2021].Obtenido de:
    https://antoniogomezmartin.wordpress.com/2012/03/08/preparacion-tbe-
    tae/#:~:text=y%20Docente%202.0-
    ,Caracter%C3%ADsticas%20y%20preparaci%C3%B3n%20del%20Buffer%20TBE
    %20(Tris%2C%20Borato%2C%20EDTA,b%C3%B3rico%20y%20%C3%A1cido%2
    0ac%C3%A9tico%20respectivamente

    Electroforesis [Internet]. Biomodel.uah.es. [citado 23 April 2021]. Obtenido de:


    http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

    Electroforesis | NHGRI [Internet]. Genome.gov. [citado 23 Abril 2021].Obtenido de:


    https://www.genome.gov/es/genetics-
    glossary/Electroforesis#:~:text=La%20electroforesis%20es%20una%20t%C3%A9c
    nica,a%20trav%C3%A9s%20de%20un%20gel

    Rodríguez F. Electroforesis - Blog de Laboratorio Clínico y Biomédico [Internet]. Blog


    de Laboratorio Clínico y Biomédico. [citado 23 Abril 2021].Obtenido de:
    https://www.franrzmn.com/electroforesis/#:~:text=Temperatura%3A%20La%20corr
    iente%20el%C3%A9ctrica%20aplicada,mol%C3%A9culas%20en%20la%20soluci
    %C3%B3n%20tamp%C3%B3n.&te
    http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/reactivos/reactivos.htmxt=Adem%C3%A1s%2
    C%20un%20exceso%20de%20temperatura,desnaturalizaci%C3%B3n%20prot%C
    3%A9ica%20de%20la%20muestra

    Tesis Doctorals en Xarxa [Internet]. Tdx.cat. [citado el 23 Abril 2021]. Obtenido de:
    https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/6423/04cap1.pdf?sequence=4

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