UAMII23489

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Departamento de Biotecnología
Análisis comparativo del secretoma de Aspergillus brasiliensis

obtenido en cultivo líquido y sólido
TESIS
Para obtener el grado de doctor en biotecnología
PRESENTA
M. en B. Daniel Alfonso Salgado Bautista
Director:
Dr. Ernesto Favela Torres
Asesores:
Dra. Tania Lorena Volke Sepúlveda
Dr. Francisco Javier Figueroa Martínez

Ciudad de México a 10 de julio del 2020
“El Doctorado en Biotecnología de la Universidad Autónoma Metropolitana está incluido en
el Programa Nacional de Posgrados de Calidad (PNPC) del CONACYT, con la referencia
001466”
Análisis comparativo del secretoma de Aspergillus brasiliensis
obtenido en cultivo líquido y sólido
TESIS DOCTORAL DIRIGIDA POR:
____________________________________
Dr. Ernesto Favela Torres
Director de tesis
AGRADECIMIENTOS.
Al gran dador de vida por darme la oportunidad de existir.
A mi esposa Juana por estar a mi lado, motivándome siempre a dar lo máximo en todo que me
proponga a realizar.
A Ernesto Favela por su invitación, ya hace muchos años, para formar parte del equipo de la
pp4, agradezco tu paciencia y tus enseñanzas.
A la Dra. Tania, Dr. Figueroa y Dr. Ulises por sus consejos y comentarios durante el desarrollo
de este trabajo, me enseñaron a trabajar en equipo.
Al Dr. Callegari, por la oportunidad de realizar una estancia en su laboratorio, y agradezco a su

familia por recibirnos con los brazos abiertos.
A los pedritos por pasar un buen rato de distracción.
Y a todos los compañeros que me han enseñado con sus comentarios durante toda mi
formación.
RESUMEN
Aspergillus brasiliensis tiene una alta similitud con Aspergillus niger, productor de ácido cítrico y de
una amplia gama de enzimas; lo que lo hace un microorganismo de interés industrial. Generalmente,
la caracterización de diversos microorganismos se realiza en cultivo líquido. El cultivo sólido
presenta ventajas sobre el cultivo líquido, como: baja represión catabólica y menor inhibición por
sustrato, pero la mayoría de los estudios comparativos se han enfocado en proteínas específicas,
generalizando los resultados para diversas condiciones. Es por esto, que se caracterizó el secretoma
de A. brasiliensis en ambos sistemas de cultivo para ampliar el panorama de los procesos que se
realizan en la célula a partir de todas las proteínas expresadas en un tiempo y condición
determinada. Se usó glucosa a diferentes concentraciones, para evitar la inducción de proteínas por
azúcares específicos, permitiendo identificar aquellas proteínas que participan en el crecimiento a
altas concentraciones de sustrato. En la primera sección del escrito, se presenta el efecto de la
concentración del medio sobre las variables analizadas. Los valores de los parámetros cinéticos de
la producción de CO2 fueron mayores en cultivo sólido, y a su vez, la producción de proteína se
relacionó con el nivel de ramificación de las hifas. El secretoma fue más complejo en cultivo sólido
que en cultivo líquido, identificando 242 y 62 proteínas, respectivamente; y clasificadas como
únicas, abundantes no reguladas y reguladas. El primero grupo constó de 17 y 87 proteínas en
cultivo líquido y sólido, respectivamente. En el segundo grupo, el número de proteínas abundantes
no reguladas fue mayor en cultivo líquido (22) que en cultivo sólido (9). Y en el último grupo, 146
proteínas se regularon por aumentar la concentración de glucosa en cultivo sólido, y 23 proteínas
en cultivo líquido. También, las proteínas se clasificaron por su metabolismo/función principal,
sobresaliendo proteínas asociadas al metabolismo de carbohidratos y redox, principalmente en
cultivo sólido. De igual manera, un alto número de proteínas intracelulares se identificó en cultivo
sólido, éstas podrían ser proteínas moonlighting y candidatas para el estudio de mecanismos de
secreción no convencional. En una segunda sección, la comparación de la ramificación y la
concentración de proteína de ambos cultivos con 60 g/L, no mostró diferencias significativas, sin
embargo, el número de proteínas en cultivo sólido incrementó 1.4 veces. Por lo tanto, A. brasiliensis
secreta un complejo sistema de proteínas que disminuyen las condiciones de estrés, optimizan el
crecimiento y remodelamiento de la pared celular, así como, aquellas que permiten incrementar la
secreción de proteínas, ya sea por vía convencional o no convencional en cultivo sólido, mientras
que, en cultivo líquido, las proteínas secretadas sólo permiten el mantenimiento de la célula.
ABSTRACT
Aspergillus brasiliensis has higher similarity with Aspergillus niger, producer of citric acid and a wide
range of enzymes; making this microorganism of industrial interest. Generally, the characterization
of diverse microorganisms is carried out by submerged fermentation. Solid-state fermentation
presents advantages over submerged fermentation, such as: lower carbon catabolite repression and
substrate inhibition, but the majority of comparative studies have been focused on specific proteins,
generalizing the results to different conditions. For this reason, the secretome of A. brasiliensis was
characterized in both systems of culture to extend the outlook of the processes that are done in the
cell from of point all the expressed proteins in a specific time and condition. Glucose was used at
different concentrations to avoid the induction of proteins by specific sugars, allowing the
identification of those proteins that participate in the growth at higher substrate concentrations.
The first section of this work presents the effect of the concentration of media on the analyzed
variables. The values of the kinetic parameters of CO2 production were greater in solid-state
fermentation, and in turn, the production of protein was linked with the level of branching of the
hyphae. The secretome was more complex in solid-state fermentation than submerged
fermentation, with a total of 242 and 62 identified proteins, respectively; which were classified as
unique, non-regulated abundant and regulated. In the first group, 17 and 87 proteins were found in
submerged and solid-state fermentation, respectively. In the second group, the number of non-
regulated abundant proteins was greater in submerged fermentation (22) than solid-state
fermentation (9). In the last group, 146 proteins were regulated to increase the glucose
concentration in solid-state fermentation, with 23 proteins in submerged fermentation. All proteins
were classified for their metabolism and main function, exceling proteins associated with
carbohydrate and redox metabolism, mainly in solid-state fermentation, these proteins could be
moonlighting proteins and candidates to study the non-conventional secretion mechanisms. In the
second section, the comparison of the branching and protein concentration of both cultures with
60 g/L, did not showed significant differences, however, the number of proteins in solid-state
fermentation increased 1.4-fold. Thus, A. brasiliensis secreted a complex system of proteins that
reduce the stress conditions, optimize the growth and remodeling of cell wall, and allow increase
the secretion of proteins either by conventional or non-conventional pathway in solid-state
fermentation, while in submerged fermentation, the secreted proteins only allow the maintenance
of cell.
Contenido
1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 1
2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................................ 3
2.1. Importancia del género Aspergillus ........................................................................................ 3
2.2. Aspergillus niger ...................................................................................................................... 5
2.3. Aspergillus brasiliensis ATCC9642........................................................................................... 5
2.4. Ventajas del cultivo sólido sobre el cultivo líquido ................................................................ 6
2.4.1. Comparación del cultivo sólido y cultivo líquido ................................................................ 7
2.4.2. Morfología de los hongos filamentosos ............................................................................ 10
2.4.3. Represión catabólica en cultivo sólido .............................................................................. 11
2.5. Secreción de proteínas .......................................................................................................... 12
2.6. Antecedentes de la proteómica y sus aplicaciones en hongos filamentosos ..................... 13
2.7. Herramientas utilizadas en proteómica ............................................................................... 15
2.7.1. Separación de proteínas en geles uni- y bidimensionales ................................................ 15
2.7.2. Digestión tríptica ................................................................................................................ 16
2.7.3. Espectrometría de masas ................................................................................................... 16
2.8. Antecedentes directos........................................................................................................... 20
3. JUSTIFICACION .......................................................................................................................... 23
4. HIPOTESIS.................................................................................................................................. 24
5. OBJETIVOS................................................................................................................................. 24
5.1. Objetivo general .................................................................................................................... 24
5.2. Objetivos particulares ........................................................................................................... 24
6.- MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 25
6.1. Cepa y conservación .............................................................................................................. 25
6.1.1. Microorganismo ................................................................................................................. 25
6.1.2. Propagación de la cepa ...................................................................................................... 25
6.1.2.1. Producción de preinóculo ............................................................................................... 25
6.1.2.2. Preparación del inóculo .................................................................................................. 25
6.2. Medio de cultivo .................................................................................................................... 26
6.2.1. Cultivo sólido ...................................................................................................................... 26
6.2.1.1. Esterilización del material ............................................................................................... 26
6.2.1.2. Preparación del cultivo ................................................................................................... 26
6.2.2. Cultivo líquido..................................................................................................................... 27
6.2.3. Estimación de parámetros cinéticos .................................................................................. 27
6.2.4. Cultivos para análisis morfométrico .................................................................................. 27
6.2.4.1. Cultivo sólido ................................................................................................................... 27
6.2.4.2. Cultivo líquido ................................................................................................................. 28
6.2.4.3. Captura de imágenes para análisis morfológico de A. brasiliensis................................ 28
6.2.4.4. Análisis morfométrico ..................................................................................................... 28
6.3. Recuperación de la proteína extracelular ............................................................................ 28
6.3.1. Cultivo sólido ...................................................................................................................... 28
6.3.2. Cultivo líquido..................................................................................................................... 29
6.3.3. Concentración y diálisis de proteína para análisis secretómico ....................................... 29
6.4. Separación de proteína por SDS-PAGE ................................................................................. 29
6.5. Digestión tríptica ................................................................................................................... 30
6.6. LC-MS/MS .............................................................................................................................. 31
6.7. Análisis bioinformático.......................................................................................................... 32
6.8. Clasificación y regulación de proteínas identificadas .......................................................... 33
6.9. Procedimientos analíticos ..................................................................................................... 33
6.9.1. Humedad ............................................................................................................................ 33
6.9.2. pH ........................................................................................................................................ 33
6.9.3. Glucosa................................................................................................................................ 33
6.9.4. Proteína .............................................................................................................................. 34
6.9.5. CO2 ...................................................................................................................................... 34
6.9.6. Biomasa .............................................................................................................................. 34
6.10. Análisis estadístico .............................................................................................................. 34
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN....................................................................................................... 35
7.1. Efecto de la concentración de glucosa sobre parámetros asociados al crecimiento de A.
brasiliensis .................................................................................................................................... 35
7.1.1. Selección de la concentración de glucosa y análisis respirométrico ................................ 35
7.1.2. Morfología de crecimiento de A. brasiliensis en cultivos sólido y líquido ....................... 42
7.2. Separación unidimensional del secretoma de A. brasiliensis en cultivos sólido y líquido . 46
7.3. Descripción del secretoma de A. brasiliensis en cultivo sólido y líquido ............................ 47
7.3.1. Proteínas únicas identificadas en el secretoma ................................................................ 60
7.3.2. Identificación de proteínas intracelulares en el secretoma de A. brasiliensis ................. 62
7.3.3. Enzimas y proteínas sin función enzimática del secretoma de A. brasiliensis en ambos
cultivos .......................................................................................................................................... 66
7.3.4. Proteínas hipotéticas en el secretoma de A. brasiliensis.................................................. 67
7.3.5. Abundancia relativa de cada grupo de clasificación ......................................................... 68
7.3.6. Clasificación de las proteínas identificadas de acuerdo con el metabolismo principal ... 70
7.3.6.1. Proteínas asociadas al metabolismo de carbohidratos ................................................. 70
7.3.6.2. Proteínas asociadas al metabolismo redox y al estrés .................................................. 73
7.3.6.3. Proteínas clasificadas como componente/proceso celular ........................................... 76
7.3.6.4. Proteínas asociadas a síntesis de proteínas ................................................................... 79
7.3.6.5. Proteínas asociadas al metabolismo de lípidos ............................................................. 80
7.3.6.6. Proteínas asociadas al metabolismo de aminoácidos ................................................... 81
7.4. Comparación de resultados entre cultivo sólido y líquido con 60 g/L ................................ 81
8. CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 86
8.1. Conclusión general ................................................................................................................ 86
8.2. Conclusiones parciales .......................................................................................................... 86
9. PERSPECTIVAS ........................................................................................................................... 88
10. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 89
11. ANEXOS ................................................................................................................................. 104
11.1. Anexo 1 .............................................................................................................................. 104
11.2. Anexo 2 .............................................................................................................................. 119
11.3. Anexo 3 .............................................................................................................................. 126
11.4. Anexo 4 .............................................................................................................................. 127
Índice de tablas.
Tabla 1. Resultados comparativos de bioprocesos en cultivo sólido y líquido………..……………………………..8
Tabla 2. Reportes de análisis proteómicos a algunas especies de Aspergillus...……………………………………14
Tabla 3. Parámetros estimados a partir de la producción de CO2 en cultivos líquido y sólido (Salgado,
2015).……………………………………………..………………………………………………………….…………………………..…………..37
Tabla 4. Parámetros medidos en la máxima tasa de producción de CO2 en ambos cultivos con diferentes
concentraciones de glucosa………………………….………………………………..………………………………..………………….39
Tabla 5. Proteínas identificadas y clasificadas del secretoma de A. brasiliensis en cultivo líquido y sólido
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….51
Tabla A1. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas únicas identificadas
en cultivo líquido………………………………………………………………………………………………………………………..104
Tabla A2. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas únicas identificadas
en cultivo sólido………………………………………………………………………………………………………………………….105
Tabla A3. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas abundantes no
reguladas identificadas en cultivo sólido…………………………………………………………………………………….108
Tabla A4. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas abundantes no reguladas
identificadas en cultivo líquido……………………………………………………………………………………………..……………109
Tabla A5. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas reguladas identificadas en
cultivo sólido………………………………………………………………..…………………………………..……………………………….110
Tabla A6. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas reguladas
identificadas en cultivo líquido…………………………………………………………………………………………………..117
Índice de figuras.
Figura 1. Flujo de trabajo simplificado para la identificación de proteínas a través de un análisis

proteómico basado en la separación en gel ……..……………………………………………..……………………..…...15
Figura 2. Mecanismo de ionización del ESI (Ho et al., 2003)……………..……………………………..…………..17
Figura 3. Espectrofotómetros de masas usados en estudios del proteoma (Aebersold y Mann,

2003)……………………………………………………………………………………………………………………………………………19
Figura 4. Ejemplo de corte de los carriles del SDS-PAGE para la digestión tríptica…………………..…...30
Figura 5. Tasa de producción de CO2 y producción de CO2 de A. brasiliensis ATCC9642 en cultivo

líquido con concentraciones de glucosa de 10 a 180 g/L…………………………………………………………..…. 36
Figura 6. Tasa producción de CO2 y producción de CO2 por A. brasiliensis ATCC9642 en cultivo sólido
con concentraciones de glucosa de 30 a 180 g/L.…………..…………………………………………………….……….37
Figura 7. Cultivo líquido con 100 g/L y 180 g/L, los círculos rojos muestran la biomasa crecida en la
pared del matraz a las 90 horas…………………………..………………………….…………………………….…..…………38
Figura 8. Ramificación de A. brasiliensis en cultivo sólido y líquido con tres concentraciones de

glucosa en muestras tomadas al tiempo de la máxima tasa de producción de CO2 (MTPCO2)..….…..43
Figura 9. Nivel de ramificación de las hifas de A. brasiliensis y producción de proteína en función de

la concentración.……….……………………………………………………………………………….……………………..….……..44
Figura 10. Separación de 50 µg de proteína extracelular proveniente de CS en geles SDS-PAGE

(T=12%)………..……………………………………………………………………………………………………………………….……..46
Figura 11. Separación de 50 µg de proteína extracelular proveniente de CL en geles SDS-PAGE

(T=12%)……..………………………………………………………………………………………………………….…………………….46
Figura 12. Diagrama de Venn del secretoma de A. brasiliensis ATCC9642 en cultivo líquido y en
cultivo sólido………………..……………………………………………………………………………………………………………...48
Figura 13. Número de proteínas en función de la concentración de glucosa inicial, número de

proteínas en función del nivel ramificación ………………………………..……………………………………………….49
Figura 14. Metabolismo/proceso principal de las proteínas identificadas en ambos cultivos…………49
Figura 15. Proteínas únicas identificadas por concentración de glucosa en cultivo sólido y líquido...60
Figura 16. Distribución de proteínas únicas encontradas en el secretoma de A. brasiliensis bajo las
tres condiciones evaluadas en cultivo sólido y líquido………………………………………………………………….61
Figura 17. Número de proteínas intracelulares identificadas en el secretoma de A. brasiliensis en

función de la concentración de glucosa en ambos cultivos..………..………………………………………………. 63
Figura 18. Distribución de proteínas típicamente intracelulares encontradas en el secretoma de A.

brasiliensis bajo las tres condiciones evaluiadas en cultivo sólido………………………………………………….64
Figura 19. Distribución de la cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas en cultivo
líquido (azul) y sólido (naranja)…………………………………………………………………………………..…………..…….68
Figura 20. Cuenta espectral ponderada de las proteínas presentes en el secretoma obtenido en
cultivo líquido…………………………………………………...…………………………………………………………..…….………69
Figura 21. Cuenta espectral ponderada de las proteínas presentes en el secretoma obtenido en
cultivo sólido…………………………………………………………………………………………….………………………………….70
Figura 22. Contenido de humedad inicial en función de la concentración de glucosa en cultivo

sólido……………………………………………………………………………………………………………………………………….…..73
Figura 23. Parámetros asociados al crecimiento de A. brasiliensis en cultivo líquido y sólido con 60
g/L. ……….………..……………………………………………………………………………………………………………………………82
Figura 24. Producción de CO2 en cultivo líquido (blanco) y sólido (gris) con 60
g/L.………………………………………………………………………………………………………………………………....…....…….83
Figura 25. Diagrama de Venn correspondiente a las proteínas secretadas en ambos cultivos por A.
brasiliensis a 60 g/L……………………………….………………..…………….………………………………….………………….83
Figura 26. Clasificación de proteínas únicas de cada tipo de cultivo a 60 g/L…….………..…………………..84
Figura 1A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de carbohidratos
Figura 2A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas al metabolismo
redox en cultivo líquido………………………………………………………………….………………………………..………..119
Figura 3A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas diversos procesos
celulares en cultivo líquido………………………………………………………………………………………………………….120
Figura 4A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas al

procesamiento/proteólisis de proteínas en cultivo líquido…………………………………………………………120
Figura 5A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas al metabolismo de
aminoácidos en cultivo líquido………………….…………………………..…………………………………………………..120
Figura 6A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas clasificadas como misceláneos
Figura 7A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de carbohidratos
en cultivo sólido……………………………………………………………………………………………………….…………………121
Figura 8A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas al metabolismo
redox en cultivo sólido………………………………………………………………………………………………………………..122
Figura 9A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas procesos celulares
Figura 10A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas a procesamiento de

proteínas/proteólisis en cultivo sólido…………………………………………………………………………………………123
Figura 11A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de aminoácidos
Figura 12A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de lípidos en
cultivo sólido....................................................................................................................................124
Figura 13A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de nucleótidos
Figura 14A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de cofactores y
vitaminas en cultivo sólido……………………………………………………………………………………….…………………124
Figura 15A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de energía en
cultivo sólido…………………………………………………………………………………..………………………………………….124
Figura 16A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas a mecanismos de defensa a
estrés en cultivo sólido……………………………………………………………………………………………………………….125
Figura 17A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de ácidos
nucleicos en cultivo sólido…………………………………………………………………………………..………………………125
Figura 18A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas componentes celulares en
cultivo sólido…………………………………………………………………………………………………………………………..….125
Figura 19A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas clasificadas como misceláneos en cultivo
sólido………………………………………………………………………………………………………………………………………….125
Figura 20A. Ejemplo de medición de la ramificación de A. brasiliensis con 60 g/L en cultivo líquido
(imagen izquierda), el cuadro rojo indica la hifa que se utilizó para medir el número de puntas. La
imagen derecha es un incremento de la imagen para observar la hifa medida junto con sus
respectivas regiones apicales, la hifa medida (limitada por el entorno rojo) fue de 576 µm, la cual
presentó 10 puntas (círculo rojo)…………………………………………………………………………………………………126
1. INTRODUCCIÓN
El uso de microorganismos es frecuente para la obtención de productos con interés comercial. En

particular, los hongos filamentosos son empleados para la producción de enzimas, antibióticos o
ácidos orgánicos (El-Enshasy, 2007).
Dentro de los hongos filamentosos, los pertenecientes al género Aspergillus suelen ser los
más utilizados en la industria alimentaria, la industria textil, en la biomedicina y en biorremediación
de suelos (Mojsov, 2016). Aspergillus niger es considerado uno de los mejores secretores de
proteínas, destacando la producción de amilasas, celulasas, pectinasas, invertasas, entre otras, y es
muy utilizado a nivel mundial para la producción de ácido cítrico (Papagianni, 2007).
Generalmente, la producción de metabolitos se realiza en condiciones de cultivo líquido

(CL), en los que el control de algunos parámetros como el pH o la temperatura, así como, el
escalamiento de reactores no es complicado. Por otro lado, la optimización y caracterización de los
procesos en cultivo sólido (CS) ha tomado importancia desde hace unos años debido a las ventajas
que presenta sobre el CL; sobresaliendo la baja represión catabólica (RC) y la baja inhibición por
sustrato, las cuales permiten una alta producción de metabolitos (Viniegra-González y Favela-
Torres, 2006); además, se estima que los costos de operación en CS son menores que en CL (Castilho
et al., 2000).
Los estudios comparativos entre ambos cultivos han permitido identificar las ventajas que
presenta el CS sobre el CL; no obstante, las razones por las cuales el CS presenta estas ventajas aún
no son totalmente claras. Se debe tener en cuenta que dichos estudios se han enfocado en el estudio
de proteínas específicas, lo que ha ocasionado una generalización de resultados y la sugerencia de
diversas ideas acerca de los procesos que se llevan a cabo en cada tipo cultivo, sin considerar que
cada sistema es multivariable. Actualmente, el desarrollo y mejoramiento de diversas técnicas,
como la separación de proteínas por geles uni- o bidimensional (SDS-PAGE o 2D-PAGE),
cromatografía líquida (LC), espectrometría de masas (MS), así como, el uso de herramientas
bioinformáticas que contienen una gran cantidad de información acerca de genes y proteínas de
diversos organismos, han permitido el desarrollo de la proteómica, utilizada para la caracterización
de proteínas a gran escala, las cuales son obtenidas en una condición y un tiempo definido (Yu et
al., 2010). El análisis del proteoma ayuda a determinar el impacto de las condiciones del cultivo
sobre la fisiología y bioquímica microbiana (Kniemeyer, 2011).
1
A partir de lo mencionado anteriormente, en este trabajo se caracterizó el secretoma de
Aspergillus brasiliensis ATCC9642 proveniente del CS y CL como estrategia para describir y,
eventualmente entender, algunas de las diferencias reportadas en ambos tipos de cultivo. Para ello,
se realizaron cinéticas de crecimiento, se determinó el nivel de ramificación, y se identificaron las
proteínas secretadas en ambos tipos de cultivo con diferentes concentraciones de glucosa inicial.
El trabajo descrito a continuación presenta cuatro secciones principales. La primera sección

es el marco teórico, donde se muestra información bibliográfica relacionada con algunos estudios
comparativos entre CS y CL utilizando principalmente hongos filamentosos; también hay una
descripción de algunos resultados obtenidos por estudios proteómicos usando hongos del género
Aspergillus, así como la definición de algunas técnicas utilizadas para la identificación de proteínas
y las diferencias entre algunos mecanismos de secreción. La segunda describe las técnicas
empleadas para la obtención de resultados. Después, en la tercera sección se describen y discuten
los resultados obtenidos. Este apartado está dividido en dos secciones: la primera muestra el efecto
del tipo de cultivo y la concentración de glucosa inicial sobre el crecimiento de A. brasiliensis, la
producción de proteínas extracelulares, el nivel de ramificación del micelio y el secretoma
producido. En la segunda parte se comparan los resultados obtenidos a la misma concentración de
glucosa inicial (60 g/L) en ambos tipos de cultivo. Finalmente, se presenta la conclusión y algunas
perspectivas para completar el trabajo y obtener mayor información para comprender mejor las
ventajas del CS.
2
2. MARCO TEÓRICO
En este apartado se describen algunos resultados reportados en la bibliografía donde se emplean

hongos filamentosos, principalmente del género Aspergillus. Así como, algunas características de
cada uno de los tipos de cultivo y de las herramientas utilizadas para el análisis global de proteínas.
2.1. Importancia del género Aspergillus

En diversos campos como la medicina, la industria alimentaria, ambiental o farmacéutica, el uso de
los hongos de filamentosos es de suma importancia debido a la gran capacidad para secretar una
gran variedad de metabolitos que son de interés comercial, como son: ácidos orgánicos, proteínas,
antibióticos, polisacáridos entro otros (El-Enshasy, 2007; Mojsov, 2016). Además, el estudio de
algunos hongos es necesario, debido a la capacidad patógena que presentan sobre otros
organismos, por ejemplo, en humanos y plantas (Doyle, 2011).
Dentro de los hongos filamentosos, el género Aspergillus es uno de los más destacados
dentro de la industria e investigación. Tan solo en el 2014 se identificaron 339 especies
pertenecientes a este género (Samson et al., 2014). A continuación, se mencionan algunas de las
especies más estudiadas:
• Aspergillus nidulans es considerado un excelente modelo de estudio para análisis genéticos,

los cuales han aportado información relevante en un amplio rango de procesos biológicos
como son: reparación del ADN, polaridad celular, ciclo celular, desarrollo de esporas,
mecanismos de señalización, entre otros (Todd et al., 2007). Además de ser un
microorganismo patógeno para humanos debido a la producción de aflatoxinas (Hedayati
et al., 2007; Wang et al., 2019).
• Aspergillus niger es considerado el principal productor de ácido cítrico a nivel mundial
(Papagianni, 2007). También secreta una gran diversidad de enzimas como celulasas,
hemicelulasas, pectinasas, amilasas, inulinasas y lipasas, que junto con A. oryzae presentan
los mayores porcentajes de proteínas extracelulares dentro del género Aspergillus (Pel et
al., 2007).
• Aspergillus oryzae es considerado un gran secretor de enzimas (Pel et al., 2007); es por esto
que se considera importante en la producción a nivel industrial, sobresaliendo su uso en las
industrias de fermentación tradicional japonesa (Machida et al., 2008).
3
• Aspergillus fumigatus es considerado el principal causante de la aspergilosis, presenta una
capacidad de sobrevivir y crecer en diversas condiciones ambientales, su capacidad invasiva
es estudiada para el desarrollo de nuevas medicinas antifúngicas (Anjo et al., 2017; Kwon-
Chung y Sugui, 2013), así como, para la producción de componentes anticancerígenos (Bladt
et al., 2013).
• Aspergillus carbonarius es un hongo productor de aflatoxinas encontradas en productos
fermentados como la cerveza o el vino, debido a su crecimiento en la materia prima para la
elaboración de estas bebidas (Shukla et al., 2017). Se encuentra relacionado con A. niger, A.
brasiliensis y con otros hongos de la sección Nigri (Andersen et al., 2008; Meijer et al., 2011).
• Aspergillus terreus es empleado para la obtención de fármacos que ayudan a la disminución
del colesterol como la pravastatina, simvastatina y lovastatina. A su vez, es estudiado debido
a que también puede causar aspergilosis (Andersen et al., 2008; Han et al., 2010).
• Aspergillus brasiliensis ha sido usado para estudios de biodegradación de hexadecano
(Volke-Sepúlveda et al., 2006; Volke-Sepúlveda et al., 2003), y para la producción de
poligalacturonasa (Zeni et al., 2011).
Se sabe que los hongos Aspergillus secretan un amplio espectro de enzimas que participan
en la degradación de polisacáridos, lípidos y proteínas que provienen de plantas, siendo la celulosa,
hemicelulosa y pectina, los principales polisacáridos en la pared celular vegetal, y el almidón e
inulina, los principales polisacáridos de almacenamiento (Coutinho et al., 2009). Sin embargo,
algunos estudios han demostrado que no únicamente pueden hidrolizar materia biodegradable: la
cutinasa que hidroliza la cutina, componente estructural de lípidos en la cutícula de las plantas, es
utilizada para la degradación de ésteres sintéticos como fibras sintéticas de tereftalato de
polietileno (mejor conocido como PET) y otros plásticos como la policaprolactona (Bermúdez-García
et al., 2017; Maeda et al., 2004). También, se ha reportado la degradación de hidrocarburos como
el hexadecano (Volke-Sepúlveda et al., 2006), presente en la fracción alifática del petróleo crudo y
principal componente del diesel. Este último estudio fue realizado con A. brasiliensis ATCC9642, la
misma cepa que se utilizó en este trabajo.
A. niger y A. brasiliensis presentan una alta similitud genómica y fenotípica, por lo cual los
reportes acerca de A. niger son de utilidad para entender resultados obtenidos con A. brasiliensis.
A continuación, se realiza una breve descripción de ambas especies.
4
2.2. Aspergillus niger
Aspergillus niger es considerado un microorganismo GRAS (generally regarded as safe) (Varga et al.,
2007), es el principal productor de ácido cítrico a nivel mundial, logrando producir hasta más de 200
g/L usando cepas sobre-productoras (Steiger et al., 2019). Este hongo es un gran productor de
enzimas extracelulares junto con A. oryzae; principalmente, enzimas clasificadas como activas de
carbohidratos (CAZy-carbohydrate-active enzymes) (Pel et al., 2007), las cuales tienen diversas
aplicaciones en la industria.
Debido a la importancia industrial de A. niger, secuenciar su genoma fue necesario. La cepa

A. niger CBS 513.88 fue la primera en ser secuenciada, su genoma está conformado de 33.9 Mpb y
con un análisis informático se estimó que tiene 14,165 genes que codifican para proteínas (Pel et
al., 2007). La comparación de secretomas provenientes de diferentes Aspergillus han demostrado
que A. niger junto con A. glaucus presentan altos porcentajes de proteína únicas en su secretoma,
27.3 % y 26.9 %, respectivamente (Vivek-Ananth et al., 2018).
Este hongo filamentoso pertenece a la sección Nigri de los Aspergillus. Esta sección es uno
de los grupos con mayor dificultad para su identificación y clasificación, debido a la falta de
diversidad en las características morfológicas, a la plasticidad fenotípica, y a la influencia significativa
de las condiciones del cultivo sobre el fenotipo (Houseknecht et al., 2008; Varga et al., 2007).
Algunas de las especies que se encuentran clasificadas dentro de la sección Nigri junto con
A. niger son: A. tubingensis, A. heteromorphus, A. ellipticus, A. carbonarius, A. japonicus, A.
aculeatus, A. vadensis, A. costaricaensis, A. piperis, A. lacticoffeatus, A. sclerotioniger, A. ibericus y
A. brasiliensis (Varga et al., 2007), este último presenta una elevada similitud con A. niger.
2.3. Aspergillus brasiliensis ATCC9642

Aspergillus brasiliensis presenta una alta similitud con A. niger, este se encuentra siendo usado
también en la industria por su capacidad de producir enzimas (MycoCosm, JGI). Las esporas de A.
brasiliensis son las únicas que pueden germinar sobre D-galactosa siendo una de las diferencias
notables con respecto al resto de los Aspergillus de la sección Nigri, además de presentar una mayor
actividad α-arabinofuranosidasa (ABF) y β-xilosidasa (BXL) (Meijer et al., 2011).
La complicada caracterización e identificación de los hongos pertenecientes a la sección

Nigri ocasionó que la cepa ATCC9642 fuera clasificada al principio como A. niger. La actual cepa A.
5
brasiliensis ATCC9642 fue depositada a ATCC (American Type Culture Collection) por W. H. Weston
como A. niger ATCC9642; sin embargo, fue renombrada en el 2008 (Houseknecht et al., 2008). Se
encontró que existe el 1% de diferencia en las pares de bases dentro de la región ITS (internal
transcribed spacer) y sutiles diferencias morfológicas en los conidios cuando se compararon ambos
hongos (Houseknecht et al., 2008; Varga et al., 2007). De acuerdo con la información presentada en
el sitio Web de ATCC, la cepa 9642 es empleada sobre adhesivos para pruebas de resistencia
bacteriana o fúngica, en la degradación de plásticos, en la producción de enzimas como la pululano
isopululanasa, 4-glucanohidrolasa, lactoilglutatión glioxalasa, y en pruebas de agentes
antimicrobianos, principalmente.
Algunos estudios con A. brasiliensis se han enfocado a la producción de poligalacturonasa

(Gomes et al., 2011), así como, a la degradación de plásticos como el poliéster alifático sintético
(Sky-Green®) (Iwashita et al., 1999) y el di-2-etilhexil adipato (DEHA) (Nalli et al., 2006). No obstante,
su uso no se limita a la síntesis de proteínas y la degradación de plásticos, esta cepa podría ser una
candidata para procesos de biorremediación en la degradación de hexadecano, donde altas
concentraciones de este hidrocarburo son consumidas en condiciones de CS (Volke-Sepúlveda et
al., 2003; Volke-Sepúlveda et al., 2006).
A continuación, se presentan las ventajas y desventajas de los cultivo sólido y líquido.
2.4. Ventajas del cultivo sólido sobre el cultivo líquido

Generalmente, la producción de metabolitos y enzimas por diferentes microorganismos, ya sea a
nivel industrial o investigación, es realizada en condiciones de CL. Desde hace unos años se ha
observado que, al comparar el CL con el CS, este último presenta diversas ventajas que lo han
convertido un tema de investigación.
El CS se define como el cultivo donde las células microbianas crecen sobre una superficie
sólida constituida de material poroso, el cual puede ser inerte o biodegradable que a la vez puede
ser utilizado como fuente de nutrientes, que asemeja su hábitat natural (Hölker y Lenz, 2005;
Viniegra-González et al., 2003). Los soportes biodegradables generalmente son residuos
agroindustriales empleados como soporte-sustrato, los cuales presentan una heterogeneidad y
complejidad de nutrientes, que en ocasiones dificultan la interpretación de resultados. En cambio,
el uso de soportes inertes e insolubles han sido de gran ayuda durante la caracterización y
comprensión de los efectos de los nutrientes durante el proceso de crecimiento de los
6
microorganismos. La humedad del CS oscila entre 30-85%, rango suficiente para mantener las
funciones de proveer nutrientes, eliminar desechos metabólicos y mantener estructuras biológicas
organizadas a nivel molecular y celular (Machado de Castro et al., 2018). Ya que, un alto porcentaje
de humedad puede ocasionar deficiencias en la transferencia de O2 que podría inducir el
crecimiento bacteriano, y por otra parte, si hay un bajo contenido de humedad, se reduce la
transferencia de nutrientes, lo que ocasionaría una deficiencia en el crecimiento microbiano
(Pandey, 2003). Por lo general, el CS ha sido empleado para el estudio de hongos filamentosos,
debido a sus capacidades de crecer sobre superficies con baja actividad de agua, la cual influye sobre
su fisiología, y producción de metabolitos y proteína (Gomes et al., 2018; Romero, 2001).
Por otro lado, el CL se puede definir como el medio de cultivo en el que los nutrientes se
encuentran solubles en agua y los microorganismos crecen sumergidos, manteniéndose en
constante agitación. En este tipo de cultivo, la obtención de los productos de interés y la
manipulación de parámetros como el pH o la temperatura, así como, el escalamiento de reactores
resulta ser fácil de manejar (Raimbault, 1998). Esto último, suelen ser desventajas para el CS; sin
embargo, este tipo de cultivo presenta también ciertas ventajas sobre el CL que a continuación se
enlistan (Viniegra-González y Favela-Torres, 2006; Hölker y Lenz, 2005).
• Alta producción de biomasa

• Alta producción de proteína
• Menor inhibición por sustrato
• Alta estabilidad de los productos obtenidos
• Baja o ausencia de represión catabólica
• Uso de materiales agroindustriales
• Bajos costos de operación
• Alta transferencia de oxígeno
En el siguiente apartado se mencionan algunos reportes comparando los principales

resultados obtenidos para cada tipo de cultivo.
2.4.1. Comparación del cultivo sólido y cultivo líquido

En la Tabla 1, se indican resultados obtenidos durante la comparación del crecimiento de algunos
microorganismos entre CS y CL. Estos resultados indican las ventajas observadas en CS; sin embargo,
7
en algunos casos se debe tener en cuenta que las unidades de comparación son distintas en el
mismo estudio. En ocasiones, realizar una comparación directa entre CL y CS resulta ser difícil debido
a que cada tipo de cultivo posee características únicas (Hölker y Lenz, 2005); por lo que es necesario
establecer criterios de comparación y unidades medibles para ambos sistemas.
Tabla 1. Resultados comparativos de bioprocesos en cultivo sólido y líquido.
Microrganismo Sustrato Producto Resultado Ventaja Referencia

*Almidón 0.1-
α-amilasa Alta producción
0.2% en CL
Bacillus CS (ST) de enzima y (Ramesh y
*ST en CS 13 860 U/g ST vs. 480 U/mL
Licheniformis M27 CL (0.2% menor RC e IS en Lonsane, 1991)
*ST+10% de otros
almidón) CS
sustratos en CS
3 y 11 veces más endo- y exo- pectinasa
Pectina + glucosa, (CS), respectivamente. Alta producción y
(Solís-Pereira et
A. niger CH4 sacarosa o ácido Pectinasas 14 veces más productividad de endo- productividad,
al., 1993)
galacturónico pectinasa en CS (U/g h vs. U/mL h) menor RC en CS
680 mg proteína total (CS) Alta producción,

375 mg proteína total (CL) secreción y
20% y 52% de la tanasa total es intracelular estabilidad de la
(Lekha y
A. niger PKL 104 ácido tánico Tanasa en CL y CS, respectivamente. tanasa de CS
Lonsane, 1994)
En 3 días la mayor actividad en CS, 6 días Alto porcentaje
para CL con 150 U/mL y 60 U/mL, intracelular en CL
respectivamente a los 7 días
Endo-pectinasa 0.06 (CS) vs. 0.01 (CL) U/mL
Mayor (Acuña-
h; Exo-pectinasa 0.14 (CS) vs. 0.0002 (CL)
A. niger CH4 Pectina + sacarosa Pectinasas productividad en Argüelles et al.,
U/mL h; Pectin liasa 0.008 (CS) vs. 0.0002
CS 1995)
(CL) U/mL h
Baja IS, rápida y
Altas concentraciones (30-450 g/L) y rápido mayor (Favela-Torres
A. niger 10 Glucosa Biomasa
crecimiento y consumo de glucosa en CS producción de et al., 1998)
biomasa
Rápido crecimiento y alta actividad en CS
A. niger CFTRI (medio 150 g/L de glucosa) (Nandakumar et
ST+ glucosa α-amilasa Baja RC
1105 Alrededor de 3000 U/mg de materia seca al., 1999)
final vs. 125 U/mL
Alta producción
Xmax 34 ± 5 g/L en CS y 11 ± 0.3g/L en CL) (Romero-
A. niger Aa20, de biomasa y
Sacarosa Invertasa Productividad enzimática: 87 ± 33 U/L h Gómez et al.,
N402 y C28B25 productividad
en CS y 20 ± 2.3 U/L h, respectivamente 2000)
en CS
Ácido tánico Alta
Actividad: 221 ± 116 IU/L h en CS y (Aguilar et al.,
A. niger Aa20 Ácido tánico + Tanasas productividad y
52 ± 17 IU/L h en CL 2001)
glucosa baja RC en CS
Alta producción
Biomasa con 45 g/L (CS): 0.89 ± 0.07 g/L día
A. brasiliensis de biomasa y (Volke-
Biomasa y y con 40 g/L (CL) 0.03 ± 0.02 g/L día;
ATCC9642 Hexadecano mayor consumo Sepúlveda et
consumo Consumo: 1.42 ± 0.00 g/L día en CS y 0.15 ±
(A. niger) de hexadecano al., 2003)
0.03 g/L día en CL
en CS
A. oryzae NRRL ST, cascarilla de

1808, 6270, 1989, arroz, salvado de
Penicillium arroz, grano de
Alta actividad
funiculosum NRRL elaboración
proteolítica con
1768, gastado, torta de Actividad enzimática: alrededor de (Sandhya et al.,
Proteasas fuentes de
1132, P. aceite de coco, 12 U/g ss y 7 U/g ss en CL 2005)
carbono
pinophilum NRRL torta de almendra
específicas
106 y P. de palma, torta de
aculeatum NRRL aceite de sésamo,
2129 polvo de semillas
8
Microrganismo Sustrato Producto Resultado Ventaja Referencia
de jaca y torta de
aceite de oliva
Proteína CS:
53.7 ± 1.36 mg/g bs a las 32 h Mayor
77.3 ± 2.60 mg/ g bs a las 40 h producción de
Proteína
Proteína CL: proteína y
(concentración (Oda et al.,
A. oryzae RIB40 ST 13.2 ± 2.60 mg/g bs a las 32 h biomasa en CS;
y diversidad) 2006)
11.9 ± 0.89 mg/g bs a las 40 h mayor diversidad
Biomasa
Biomasa seca: 77.3 ± 2.6 mg/g en CS y 11.9 ± de proteínas en
0.89 mg/g en CL; Mayor número de spots en CL
CL, sugiriendo mayor número de proteínas
No hay
B. subtilis DM-03: 80.0±9 mg/g ss en CL y
diferencias (Das y
B. subtilis DM-03, Biosurfactan- 67.0±6 mg/g ss en CS; B. subtilis DM-04:
Cáscara de papa significativas Mukherjee,
DM-04 tes 23.0±5.0 mg/g ss en CL y 20.0±2.5 mg/g ss
entre ambos 2007)
en CS
cultivos
Proteína: 114 ± 18.6 µg/mL en CS y 51 ± 12.2 Alta producción

µg/mL en CL de proteínas,
A. fumigatus (Saqib et al.,
Paja de trigo Glucanasas Actividad: 1 044 ± 281 IU/mL en CS y 321 ± mayor estabilidad
SMN1 2010)
109 IU/mL en CL y actividad
Q10: 1.46 en CS y 1.8 en CL enzimática en CS
Alta producción y
Actividad: 1 861.64 U/mL en CS y 14.76
productividad en
U/mL en CL, ambos en el extracto crudo
CS, mayor
Tanasa identificada de 102 y 105 kDa en CL y
estabilidad de la (Renovato et
A. niger Ácido tánico Tanasas CS, respectivamente; tanasa de CL más
tanasa de CL al., 2011)
estable a pH de 5-7 y a 70 °C
Existencia de
Tanasa de CS con mayor actividad específica
variaciones
(5.5 veces más que CL)
estructurales
Alta producción
Producción de biomasa (g glucosamida/g
de biomasa,
sustrato): 0.25 en CS y 0.6 en CL, alrededor
proteína y
de 7 días
actividad
Neurospora Biomasa Proteína: 43 mg/g sustrato vs. 0.41 mg/ g de (T. Liu et al.,
Paja de trigo enzimática en CS
sitophila Proteínas sustrato a los 4 días 2014)
Diferentes
Mayor actividad celulasa en CS
perfiles de
Un número similar de proteínas secretadas,
proteínas
pero con funciones distintas
secretadas
La deleción de creA y creB incrementan la
A. oryzae actividad amilasa en CL Diferentes
(Ichinose et al.,
ΔligD::loxP, Almidón + glucosa Amilasas La deleción de creA y creA/creB incrementan mecanismos de
2014)
niaD−, sC−, pyrG− la actividad amilasa en CS, RC
únicamente creB no tiene un efecto
La actividad xilanasa y β -glucosidasa

incrementan >100 veces después de la
Madera de haya, Existen
deleción de creA y creA/creB en CL, respecto
A. oryzae carboximetilcelu- mecanismos de
Xilanasa a la cepa silvestre. En CS, incrementa >7 (Ichinose et al.,
ΔligD::loxP, losa RC para cada
β-glucosidasa veces con la doble deleción; La deleción de 2018)
niaD−, sC−, pyrG− p-nitrofenil-β-D- proteína y tipo de
creA o creB no afecta la expresión de la
glucopiranósido cultivo
endo- β-glucanasa en contraste con xilanasa
y β -glucosidasa
ST= Salvado de trigo; RC= Represión catabólica; IS= Inhibición por sustrato; g ss= gramo de sustrato seco; gbs= gramo de biomasa seca
En resumen, en la mayoría de los estudios se ha demostrado mayores rendimientos de los

productos esperados y mayor productividad; las principales razones que justifican la alta
productividad de proteína y metabolitos en CS, es que en este tipo de cultivo hay una alta
disponibilidad de O2, una baja inhibición por sustrato y una baja RC (Viniegra-González et al., 2003).
En el caso de la producción de la proteína, la morfología que desarrollan los hongos filamentosos
9
durante su crecimiento también tiene que ser considerada, debido a que es un variable que
depende de la ramificación (Gomes et al., 2018; Zhang y Zhang, 2016).
2.4.2. Morfología de los hongos filamentosos

La morfología de los hongos filamentosos es una de las variables que se debe considerar durante el
diseño de procesos, ya que esta depende de las condiciones del cultivo (Wucherpfennig et al., 2011).
Por ello, se debe tener en cuenta que diversas variables pueden afectar considerablemente los
niveles de ramificación de las hifas, entre estas variables se encuentra el pH, la temperatura o la
agitación para el caso de CL (Bocking et al., 1999; Dynesen y Nielsen, 2003).
Generalmente, la morfología que desarrollan los hongos filamentosos en CL es la

aglomeración de las hifas formando estructuras conocidas como pellets, aunque el crecimiento de
micelio disperso también es posible (Veiter et al., 2018). La difusión de los nutrientes dependerá de
la densidad de biomasa que exista en el pellet (Zhang y Zhang, 2016). La formación de pellets se ve
influenciada por diversos factores como el tamaño de inoculo, pH, el nivel de oxígeno disuelto,
agitación, agentes nucleantes, aditivos, metales traza, temperatura, tipo de reactor, entre otros
más. Los pellets formados por A. niger se han clasificado como coagulativos, ya que sus esporas
forman agregados durante las primeras 6-8 h de cultivo, para posteriormente germinar (Zhang y
Zhang, 2016).
Por otra parte, el crecimiento del hongo en CS resulta ser en forma de micelio desagregado;
en el cual las hifas se extienden sobre y dentro del soporte sólido (Gomes et al., 2018; Villena y
Gutiérrez-Correa, 2007), asemejando el crecimiento en condiciones naturales. Se ha planteado que
la ramificación de las hifas durante el crecimiento micelial es importante, ya que incrementa el área
superficial mejorando la adquisición de nutrientes. Además, se favorece la fusión de hifas, proceso
que suele ser importante para el intercambio de nutrientes y señalización entre hifas de la misma
colonia (Harris, 2008). Para que el hongo filamentoso pueda crecer sobre y dentro del soporte, éste
tiene que ser poroso (Barrios-González, 2012). En CS, las hifas forman una capa de biomasa sobre el
soporte, la cual se define como una red tridimensional compuesta de tres zonas donde
interaccionan las hifas con los poros del soporte: la primera consiste en hifas aéreas y poros llenos
de aire llamada capa superior, la segunda llamada capa inferior contiene hifas densamente
compactadas que se encuentran en contacto con los poros llenos de líquido y la tercera son las hifas
que han penetrado el soporte (Barrios-González, 2012; Gomes et al., 2018; Oostra et al., 2001).
10
Sin importar el tipo de cultivo, se sabe que existe una relación positiva entre la hiper-
ramificación de las hifas con la secreción de proteína, lo que se traduce en que a un mayor número
de puntas mayor secreción de proteína (Gomes et al., 2018; Villena y Gutiérrez-Correa, 2007). Sin
embargo, la comparación de la morfología de crecimiento en ambos tipos de cultivo utilizando el
mismo medio de cultivo no ha sido reportada.
2.4.3. Represión catabólica en cultivo sólido

Una de las principales ventajas que presenta el CS al compararse con el CL es la baja represión
catabólica (RC). Algunos estudios que demuestran menor RC en CS que en CL se presentan en la
Tabla 1.
La RC se puede definir como el proceso de inhibición del catabolismo de fuentes alternativas

de energía (por ejemplo: polisacáridos) cuando se dispone de otra fuente de carbono más
fácilmente asimilable (frecuentemente glucosa) en el medio de cultivo (Adnan et al., 2018; Viniegra-
González y Favela-Torres et al., 2006). La baja RC en CS es atribuida a la presencia de gradientes
microscópicos entre los agregados de masa celular o un cambio en la permeabilidad celular a los
azúcares (Viniegra-González y Favela-Torres, 2006). No obstante, no está totalmente claro cómo se
lleva a cabo la RC a nivel metabólico en CS (Carrillo-Sancen et al., 2016).
Se ha propuesto que la RC en hongos filamentosos es regulada por el factor de transcripción

CreA, el cual garantiza una compatibilidad óptima con el sustrato que sea más fácil de asimilar. Para
llevar a cabo la RC por medio de CreA es necesario que existan altos niveles de transcripción de
CreA, transporte de glucosa, y la presencia parcial de CreB (Mäkelä et al., 2018). Pero CreA no es el
único mecanismo en este proceso, ya que se ha reportado con A. nidulans que la represión de α-
ramnosidasa es llevada a cabo por medio de algún mecanismo independiente a CreA (Tamayo-
Ramos et al., 2012). También, se ha reportado que CreA no afecta significativamente el orden en
que los azúcares como D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, D-galactosa, L-ramnosa, D-xilosa, L-
arabinosa, D-ácido galacturónico y maltosa sean consumidos por A. niger (Mäkelä et al., 2018). La
actividad α-amilasa por A. oryzae se vio incrementada en CS y en CL cuando fueron suprimidos los
genes creA y creB, sugiriendo que eliminar CreA y CreB se puede suprimir la RC (Ichinose et al.,
2014), por otra parte, la producción de endo-β-glucanasa en ambos cultivos, no se ve afectada por
la supresión de creA y creB, sugiriendo una maquinaria alterna a CreA y CreB para su represión
(Ichinose et al., 2018). Por lo tanto, se puede sugerir que algunas enzimas no son reguladas por el
11
mecanismo de CreA o que este mecanismo es desactivado cuando los hongos filamentosos crecen
en condiciones de CS.
2.5. Secreción de proteínas

Una de las características de A. niger es la capacidad de secretar una alta cantidad y variedad de
proteínas a la región extracelular. El número de proteínas aproximado en el proteoma de A. niger
es alrededor de 14 000 (Vivek-Ananth et al., 2018). De las cuales, se ha estimado de manera
bioinformática que secreta entre 691 a 881 proteínas, donde alrededor del 90% presenta péptido
señal (Tsang et al., 2009), principal característica para diferenciar entre la secreción convencional
de la no-convencional (Miura y Ueda, 2018). El péptido señal es una secuencia de aminoácidos que
se encuentran en la parte N-terminal de la proteínas que serán liberadas a la región extracelular,
consta en promedio de 16-30 aminoácidos, en ocasiones alcanzan hasta los 50 aminoácidos, por lo
que, no existen similitudes entre secuencias (Kapp et al., 2013). Sin embargo, la identificación de
tres partes en la secuencia es fundamental para determinar la presencia del péptido señal: la
primera es una región hidrofílica cargada positivamente (región N), la segunda es una región central
hidrofóbica (región H) compuesta de 5-15 residuos y la tercera (región c) con el sitio de corte para
la peptidasa señal (SPasa) (Kapp et al., 2013). Esta secuencia se puede predecir a partir del análisis
de una secuencia de aminoácidos utilizando el programa SignalP, Psort y TargetP (Miura y Ueda,
2018; Nielsen, 2017);
El proceso de secreción inicia en el retículo endoplásmico (RE), donde las proteínas se

pliegan y pueden ser modificadas por glicosilación, puentes disulfuro, fosforilación o ensamblaje de
subunidades. Después son dirigidas al aparato de Golgi a través de vesículas transportadoras para
ser modificadas (glicosilación o procesamiento de péptidos) y empaquetadas en vesículas secretoras
para llevarlas a la membrana plasmática de donde serán secretadas (Conesa et al., 2001; Miura y
Ueda, 2018).
A pesar de que un alto número de proteínas presentan péptido señal para ser secretadas a
la región extracelular, algunos estudios proteómicos han identificado proteínas que pueden ser
liberadas por mecanismos no-convencionales (Carrillo-Sancen et al., 2016; Miura y Ueda, 2018;
Stock et al., 2012; Volke-Sepulveda et al., 2016). Los mecanismos de secreción no-convencional no
son totalmente claros y además parecen ser bastante complejos. Shoji et al., (2014) mencionan
algunos ejemplos de secreción no-convencional, indicando que la más utilizada por los hongos es la
secreción vesicular.
12
La exocitosis (transporte de vesículas a la membrana plasmática) se lleva a cabo en la punta
de las hifas y ha tomado importancia por su relación con el crecimiento celular y la secreción de
proteínas (Shoji et al., 2014). Este proceso, además de observarse en las puntas de las hifas, ocurre
en los septos (Hayakawa et al., 2011). La secreción vesicular es necesaria para la liberación de
macromoléculas a la región extracelular. Entre las moléculas que son transportadas por vesículas,
se encuentran proteínas, lípidos, polisacáridos y pigmentos, los cuales son componentes utilizados
por diversos hongos patógenos para la invasión del huésped (Rodrigues et al., 2011). Las vesículas
secretadas por Saccharomyces cerevisiae presentan enzimas como glucanasas,
glucanosiltransferasas, proteínas de choque térmico y peptidasas (Ferreira de Oliveira et al., 2010),
incluso enzimas asociadas con la ruta glicolítica y el metabolismo oxidativo pueden ser secretadas a
través de vesículas (Miura y Ueda, 2018).
Diversas proteínas intracelulares identificadas en los secretomas de diversos hongos se han

considerado producto de lisis celular por envejecimiento o procesamiento de la muestra (Li et al.,
2013), o como resultado de la secreción no-convencional. Algunas de estas proteínas son reportadas
como alérgenos, los cuales generalmente participan en la interacción huésped-patógeno (Miura y
Ueda, 2018). Este tipo de proteínas multifuncionales son denominadas proteínas moonlight
(Amblee y Jeffery, 2015). Dentro de las proteínas moonlight, se ha reportado que enzimas como la
enolasa, triosafosfato isomerasa y alcohol deshidrogenasa provenientes de C. albicans interactúan
con el huésped, además de ser parte del mecanismo contra especies reactivas de oxígeno (ERO´s)
(Serrano-Fujarte et al., 2016). Mientras que, la proteína ribosomal RPL44 que participa en la
traducción de ARNm, es expresada para soportar condiciones de estrés abiótico por parte de A.
glaucus (Liu et al., 2014).
Es por estas razones que el descartar proteínas consideradas intracelulares que fueron
identificadas en un secretoma puede resultar en la pérdida de información relevante para el
entendimiento de los procesos de adaptación de algunos organismos.
2.6. Antecedentes de la proteómica y sus aplicaciones en hongos filamentosos

El uso de diversas técnicas para análisis y separación de proteínas, y el uso de las secuencias
genómicas han permitido el desarrollo de la proteómica (Ferreira de Oliveira et al., 2010). La
proteómica es una herramienta que permite analizar de una manera global los patrones de
expresión de las proteínas, posibilitando un mejor entendimiento de los cambios que ocurren
durante la adaptación a diversas condiciones ambientales (Kim et al., 2007). Para ello, se utilizan un
13
conjunto de técnicas que con el tiempo ha mejorado, entre éstas se encuentran: la separación de
proteínas en geles uni- o bidimensionales, la cromatografía líquida, la digestión de proteínas en
solución (método libre de gel) o en gel, el análisis de péptidos por espectrometría de masas, y el uso
de bases de datos a través de la bioinformática. El mejoramiento y la optimización de dichas técnicas
analíticas han permitido el incremento de estudios proteómicos que han sido de utilidad para la
identificación de proteínas fúngicas que participan durante los procesos de infección, en la
producción de metabolitos secundarios, en el metabolismo y en el desarrollo morfológico, así como,
la identificación de nuevas o mejores proteínas de interés biotecnológico (Doyle, 2011).
Es por estas razones que utilizar la proteómica como herramienta para la identificación de
proteínas a gran escala en un tiempo o estado fisiológico determinado aporta información acerca
del metabolismo o de la fisiología de los cultivos. La posibilidad de determinar el estado fisiológico
de un cultivo utilizando la respirometría ha sido de ayuda para comparar los secretomas de A. niger
y A. brasiliensis obtenidos en CS, a pesar de crecer en diferentes concentraciones de sustrato
(Carrillo-Sancen et al., 2016; Volke-Sepulveda et al., 2016). Sin embargo, no hay estudios donde se
realice una comparación de las proteínas expresadas en CS y CL, utilizando la respirometría como
herramienta para establecer el estado fisiológico del microorganismo; y a la vez, pocos trabajos se
han enfocado en la comparación entre ambos tipos de cultivos usando un análisis proteómico. El
primero en realizarlo fue Oda et al., (2006), quien comparó el secretoma de A. oryzae entre ambos
sistemas, encontrando que los mecanismos de secreción y expresión de proteínas difiere entre CS y
CL. Estos resultados nos indican que la proteómica puede ayudar a comprender mejor las diferencias
entre ambos cultivos, así dilucidando las razones por las cuales el CS presenta mayores ventajas
sobre CL.
La Tabla 2 resume algunos estudios realizados donde la proteómica es utilizada para la

identificación de proteínas provenientes de hongos filamentosos correspondientes al género
Aspergillus.
Tabla 2. Reportes de análisis proteómicos a algunas especies de Aspergillus.
Microorganismo Cultivo Proteoma Referencia

A. fumigatus Líquido Membrana (Bruneau et al., 2001)
A. oryzae Líquido Intracelular (Nandakumar y Marten, 2002)
A. flavus Líquido Extracelular (Medina et al., 2005)
A. fumigatus Superficial Superficie de conidios (Asif et al., 2006)
A. oryzae Sólido/líquido Secretoma (Oda et al., 2006)
A. nidulans Líquido Intracelular (Kim et al., 2007)
A. fumigatus Superficial Intracelular (Gautam et al., 2008)
A. fumigatus Líquido Proteoma (Cagas et al., 2011)
14
Microorganismo Cultivo Proteoma Referencia
A. niger Superficial/ líquido Secretoma (Krijgsheld et al., 2012)
A. oryzae Sólido Secretoma (Zhang et al., 2012)
A. fumigatus Sólido Secretoma (Adav et al., 2010)
A. nidulans Líquido Fosfoproteoma (Ramsubramaniam et al., 2014)
A. flavus Superficial Proteoma (Zhang et al., 2015)
A. niger Sólido Secretoma (Carrillo-Sancen et al., 2016)
A. fumigatus Superficial Proteoma de conidios (Anjo et al., 2017)
A. fumigatus, A. flavus, A. niger,
N. D. Secretoma (Vivek-Ananth et al., 2018)
A. terreus, A. nidulans y A. oryzae
A. flavus Superficial/líquido Proteoma (Wang et al., 2019)
N.D. = No disponible
Desde el inicio de la proteómica, las técnicas de identificación y separación de proteínas han ido
mejorando para tener resultados más precisos y lograr caracterizar mejor cada una de las proteínas
que conforman el proteoma. Por ello, se siguen empleando herramientas fundamentales como son
los geles de poliacrilamida, la espectrometría de masas y la bioinformática, que a continuación se
describen brevemente.
2.7. Herramientas utilizadas en proteómica

Para llevar a cabo la identificación de las proteínas utilizando la proteómica, diversas herramientas
son utilizadas. Un esquema general de un estudio proteómico basado en separación a través de
geles de poliacrilamida se muestra en la Figura 1.
Figura 1. Flujo de trabajo simplificado para la identificación de proteínas a través de un análisis proteómico basado en la separación en
gel.
2.7.1. Separación de proteínas en geles uni- y bidimensionales

La separación de un complejo de proteínas puede realizarse por geles unidimensionales o
bidimensionales. El uso de geles unidimensionales forma parte de la estrategia Gel-LC. La cual
consiste en separar las proteinas sólo por su peso molecular (Brunelle y Green, 2014) en geles de
poliacrilamida de una dimensión (SDS-PAGE), seguido por el corte de cada carril en tres regiones (o
más dependiendo del rango dinámico) de peso molecular coincidentes entre carriles. Esta
metodología permite corroborar el perfil de las proteinas en cada muestra, resolver la posible
limitación proveniente del rango dinamico de las proteínas (capacidad para identificar proteínas que
se encuentren con una gran diferencia en la concentración) y eliminar posibles interferentes
presentes (detergentes, inhibidores de proteasas, pH y concentración elevada de sales) que puedan
afectar la actividad de la proteasa utilizada durante el proceso de digestión. Los péptidos obtenidos
15
son separados por cromatografía líquida y analizados por MS; el análisis de todas las proteínas
presentes a gran escala es llamado “shotgun” (Freson, 2019). Esta metodología es utilizada
comúnmente y fue la que se empleó en este trabajo en particular. Por otro lado, la separación
bidimensional se realiza por peso molecular y punto isoeléctrico a través de geles 2D-PAGE; este
último es muy utilizado para la identificación de modificaciones postraduccionales (Chevalier, 2010).
Posteriormente, para observar la distribución de las proteínas en cualquiera de los dos tipos
de geles, se puede realizar tinción con plata, métodos basados en fluorescencia o azul de Coomassie
(Rabilloud, 2009), este último es el más reportado por tener mayor compatibilidad con la
espectrometría de masas (Dyballa y Metzger, 2009).
2.7.2. Digestión tríptica

La digestión tríptica es la más utilizada para la obtención de péptidos para su análisis por
espectrometría de masas; aunque existen otras proteasas que suelen ser usadas como alternativas,
generalmente son usadas en conjunto para el mejoramiento de resultados (Tsiatsiani y Heck, 2015).
La tripsina corta la secuencia de aminoácidos en la unión de Arg-Lys, dando péptidos cortos entre
un rango de 0.5- 3 KDa (Tsiatsiani y Heck, 2015), que son más fáciles de analizar por MS.
2.7.3. Espectrometría de masas

La espectrometría de masas es una herramienta que nos ayuda a estudiar generalmente
biomoléculas, destacando las proteínas (Domon y Aebersold, 2006). Un espectrómetro de masas
está conformado de una fuente de iones, un analizador de masas encargado de separar y estimar la
relación masa/carga (m/z) de los analitos ionizados y un detector que registra el número de iones
en cada valor m/z, lo cual es mostrado posteriormente de manera gráfica como espectro de masas,
el cual indica la abundancia relativa de las señales de acuerdo con su proporción m/z (Aebersold y
Mann, 2003; Ho et al., 2002). Las dos técnicas de ionización suave más utilizadas para la obtención
de iones provenientes de biomoléculas es por MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)
y ESI (Electrospray Ionization), ambos son acoplados a una variedad de analizadores de masas que
incrementan la calidad, resolución y sensibilidad en la identificación de péptidos de una secuencia
proteica (Aebersold y Mann, 2003; Domon y Aebersold, 2006).
• MALDI: Para realizar el análisis de los péptidos, la muestra es mezclada con una matriz,
constituida generalmente por moléculas con anillos aromáticos, como son: el ácido 2,5-
dihidroxibenzóico, el ácido α–ciano-4-hidroxicinámico o el ácido sinapínico (Wysocki et al.,
16
2005). Dicha matriz incrementa y/o mejora la ionización. La muestra cristalizada es
vaporizada y ionizada, por medio de pulsaciones láser, y a través de un tubo de tiempo de
vuelo (TOF), se separan los iones en el tiempo, diferenciando los iones más ligeros (viajan
más rápido) de los más pesados (más lentos), y al final, un detector permite determinar
eficientemente la m/z (también llamada masa observada).
• ESI: El proceso por ESI consta principalmente de tres pasos, el primero la dispersión de
pequeñas gotas cargadas generadas a través del uso de una corriente eléctrica de alto
voltaje y bajo amperaje, segundo la evaporación del solvente (fenómeno de solvatación o
deshidratación) y tercero la inyección de los iones provenientes de las gotas altamente
cargadas (Figura 2). Para generar y transferir los iones a partir de la solución hasta la fase
gaseosa, como se mencionó anteriormente, es necesario energía eléctrica. El
espectrómetro de masas puede ser programado para definir que iones extraer (positivos o
negativos), dependiendo de las características de ionización de cada molécula de interés (en
el caso particular de los péptidos, el mayor porcentaje de estos se ionizan con carga
positiva). Los iones extraídos, son detectados en el analizador de masas (el cuadrupolo más
usado) registrando la m/z (Ho et al., 2002). Algunas de las ventajas del ESI respecto de
MALDI son: a) permite generar iones con diferentes estados de carga como +2, +3, +4 (a
diferencia de MALDI que generalmente son +2) y b) permite utilizar la muestra en forma
líquida, previo a la separación mediante cromatografía mono o bidimensional, lo cual
mejora la resolución de muestras complejas (MALDI requiere usar LC-MALDI para generar
fracciones y luego cada una de estas colocarlas en cada spot) (Wysocki et al., 2005).
Figura 2. Mecanismo de ionización del ESI (Ho et al., 2003).
17
Como se mencionó, la fuente de iones se encuentra acoplada a los analizadores de masas
que determinaran la m/z, utilizando campos eléctricos y/o magnéticos para manipular iones en un
cuerpo dependiente de la masa (Lin et al., 2003). Algunos de los comúnmente utilizados son: el
cuadrupolo (Q), trampa de iones cuadrupolo (QIT), tiempo de vuelo (ToF) y FT-ICR (Fourier transform
ion cyclotrone resonance) (El-Aneed et al., 2009). Sin embargo, para el mejoramiento del análisis
por espectrometría de masas, diversos equipos se modifican con más de un analizador de masas,
conociéndose como espectrofotómetros híbridos (Carrasco Navarro, 2017; Aebersold y Mann,
2003). A continuación, se muestran y describen los analizadores de masas mostrados en la Figura 3
(Aebersold y Mann, 2003):
a) En el instrumento conocido como tiempo de vuelo (TOF) con reflector: los iones se aceleran
a alta energía cinética y se separan a lo largo de un tubo de vuelo como resultado de sus
diferentes velocidades. Los iones se dan la vuelta en un reflector, que compensa las ligeras
diferencias en la energía cinética, y luego afecta a un detector que amplifica y cuenta los
iones que llegan.
b) El instrumento tiempo de vuelo/tiempo de vuelo (TOF-TOF): incorpora una celda de colisión
entre dos secciones TOF. Los iones de una m/z se seleccionan en la primera sección TOF,
fragmentadas en la celda de colisión, y las masas de los fragmentos se separan en la segunda
sección TOF.
c) En el instrumento triple cuadrupolo (Q3): Los espectrómetros de masa cuadrupolo
seleccionan por campos eléctricos que varían en el tiempo entre cuatro cilindros, lo que
permite una trayectoria estable sólo para iones de una m/z deseada en particular. Los iones
de una m/z determinada se seleccionan en una primera sección (Q1), son fragmentados en
una celda de colisión (q2), y los fragmentos separados en Q3. En la trampa de iones lineales,
los iones se capturan en una sección cuádruple, representada por el punto rojo en la Q3.
Luego se excitan a través de un campo eléctrico resonante y los fragmentos son escaneados,
creando el espectro de masas en tándem.
d) Un instrumento cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF): combina la parte frontal de un
instrumento cuádruple triple con una sección TOF con refractron o reflector y al final un
detector para medir la masa de los iones.
e) En un instrumento trampa de iones (Ion Trap) captura los iones como en el caso de la trampa
de iones lineal, fragmentos de iones de una m/z particular, y luego escanea los fragmentos
para generar el espectro de masa en tándem.
18
f) El instrumento FT-MS (Fourier Transform-Mass spectrometry) también atrapa los iones,
pero lo hace con la ayuda de campos magnéticos fuertes. La Figura 3 muestra la
combinación de FT-MS con la trampa de iones lineal para el aislamiento eficiente, la
fragmentación y la detección de fragmentos en la sección FT-MS.
Figura 3. Espectrómetros de masas usados en estudios del proteoma. Los paneles superiores izquierdo y derecho representan el proceso
de ionización e introducción de muestras en ionización por electrospray (ESI) y desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).
(imagen modificada de Aebersold y Mann, (2003)).
2.7.4. Herramientas bioinformáticas

Las secuencias peptídicas obtenidas por espectrometría de masas son analizadas por diversos
motores de búsqueda que permiten la identificación de los más probables péptidos presentes, y
como resultado final, las proteínas, algunos de los más usados son: MASCOT, SEQUEST, X!Tandem
y Andromeda que se interconectan o usan dentro de programas como Proteome Discoverer
(Thermo-Fisher Scientific), TPP (Trans-Proteomic Pipeline) (Seattle Proteome Center), MaxQuant
(Max-Planck-Institute), entre otros (Shteynberg et al., 2013; Yuan et al., 2014). Las alineaciones en
estos motores se realizan con secuencias de proteínas almacenadas en bases de datos como NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y UniProt (https://www.uniprot.org/), donde se encuentra una
gran cantidad de información asociada a las proteínas de interés, si su genoma correspondiente ésta
secuenciado. Otra base de datos que es de gran utilidad durante la caracterización funcional de las
19
proteínas identificadas es KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,
https://www.genome.jp/kegg/), la cual vincula información genómica con información funcional de
orden superior. La primera es almacenada en la base de datos GENES, que es una colección de
catálogos de genes para genomas completa y parcialmente secuenciados con anotaciones
actualizadas de las funciones genéticas. La segunda se almacena en la base de datos PATHWAY, que
contiene representaciones gráficas de procesos celulares, como el metabolismo, el transporte de
membrana, la transducción de señales y el ciclo celular (Kanehisa, 2000).
La predicción de la localización intracelular o extracelular de una proteína se puede realizar

con el uso de algoritmos como SignalP o SecretomeP, asociadas al CBS (Center Biological Sequence
Analysis, http://www.cbs.dtu.dk). La primera estima si una proteína es secretada por vía
convencional, prediciendo si éstas presentan péptido señal, el cual indica si serán secretadas
(Nielsen, 2017). La segunda plataforma, SecretomeP, da una aproximación de que proteínas pueden
ser secretadas por mecanismos no convencionales, los cuales han sido observados de manera
experimental y reportados, este servidor se encuentra diseñado para bacterias y células de
mamíferos (Lonsdale et al., 2016); sin embargo, ha sido empleado para algunos hongos (Liu et al.,
2014; Shah et al., 2009; Volke-Sepulveda et al., 2016).
A continuación, se describe la diferencia entre ambos procesos de secreción observado en

diversos organismos.
2.8. Antecedentes directos

El estudio de A. niger en CS se ha realizado desde hace años en el laboratorio de fermentaciones en
estado sólido de la Universidad Autónoma Metropolitana, con el fin de comprender algunas de las
diferencias entre los cultivos sólido y líquido.
Como se ha mencionado previamente, una de las ventajas del CS, es el uso de altas
concentraciones de fuente de carbono sin observar RC o inhibición por sustrato. A partir de estas
ventajas, algunos de los estudios se han enfocado en la utilización de altas concentraciones de
fuente de carbono o la combinación de polisacáridos junto con algún represor catabólico para la
producción de enzimas de interés comercial.
En 1993, Solís-Pereira et al. evaluaron la producción de pectinasas de A. niger CH4 en CS y

CL, utilizando pectina como inductor de la síntesis de pectinasas y, glucosa, sacarosa y ácido
20
galacturónico como fuentes de carbono y energía. Los resultados muestran una disminución en la
producción de exo y endo-pectinasas en CL cuando se adicionó glucosa o sacarosa, mientras que, la
productividad incrementó en CS, además de un rápido consumo de las fuentes de carbono,
concluyendo que no existe RC para la síntesis de pectinasas en CS.
En 1995, se evaluó la producción de pectinasas por A. niger CH4 (Acuña-Argüelles et al.,

1995) en CS y CL, utilizando pectina como inductor y sacarosa como fuente de carbono y energía;
concluyendo que las pectinasas producidas en CS presentaron mayor estabilidad a pH y
temperatura, así como una mayor afinidad al sustrato por parte de la pectin liasa y la endo-
pectinasa.
En 1996, Solis-Pereyra et al. compararon la producción de pectinasas por A. niger CH4 en CS

utilizando concentraciones de glucosa de 100-450 g/L, y encontraron que la síntesis de pectinasa
disminuye a concentraciones iniciales de glucosa tan altas como 350 y 450 g/L. Este estudio
demostró la capacidad que tiene A. niger para metabolizar, en tiempos relativamente cortos (< 48
h), concentraciones muy elevadas de glucosa en CS; lo que demostró la ausencia de inhibición del
crecimiento en presencia de altas concentraciones de sustrato en este tipo ce cultivo.
En 1998, Favela et al. evaluaron el crecimiento de A. niger 10 en tres tipos de cultivo,

superficial, sólido y líquido, encontrando distintos perfiles de crecimiento, sobresaliendo el CS por
el rápido crecimiento de A. niger; además de no inhibirse por las elevadas concentraciones de
glucosa utilizadas entre 30-450 g/L.
Estudios posteriores encontraron ventajas similares; por ejemplo, mayor producción de

enzimas y baja represión catabólica de la síntesis de tanasa en CS por A. niger Aa-20 (Aguilar et al.,
2001); mayor consumo y biodegradación de hexadecano por A. brasiliensis (A. niger) ATCC9642,
utilizando concentraciones de 45-180 g/L en CS (Volke-Sepúlveda et al., 2003).
Generalmente, los estudios realizados se enfocan en la producción y determinación de

actividad de proteínas específicas, tratando de explicar las ventajas del CS basándose en análisis de
proteínas de manera individual. Posteriormente, el uso de la proteómica dio un nuevo panorama
para la compresión de los procesos que se desarrollan en CS. En el 2016, Carrillo-Sancen et al. y
Volke-Sepúlveda et al. analizaron el secretoma de A. niger 10 y A. brasiliensis ATCC9642 expresado
en CS, respectivamente. Para el primer estudio, se evaluó la secreción de amilasa en
concentraciones crecientes de glucosa con una concentración fija de almidón, encontrando que A.
21
niger 10 secreta proteínas intracelulares y varias isoformas de amilasa. De manera similar, en un
segundo estudio de Carrillo-Sancen et al., (2016), identificaron un sistema complejo de proteínas
que participan sinérgicamente durante el crecimiento de la célula, en donde una gran proporción
de ellas fueron identificadas como proteínas intracelulares. Sin embargo, en nuestro laboratorio no
se había utilizado la proteómica como herramienta para establecer algunas diferencias entre los
cultivos sólido y líquido y, eventualmente, explicar a que se deben las diferencias hasta ese
momento reportadas.
22
3. JUSTIFICACION
El CL es ampliamente utilizado para fines de investigación y obtención de productos industriales; sin

embargo, el CS presenta ventajas en términos de mayor producción y productividad, y menor
represión catabólica de algunas enzimas, así como, una menor inhibición del crecimiento por
sustrato. A pesar de que estas ventajas del CS se conocen desde hace más de dos décadas, los
mecanismos subyacentes no son del todo claros. Esto se debe principalmente a que la mayoría de
los estudios comparativos entre ambos sistemas utilizan la producción, productividad o actividad de
unas pocas proteínas como variable de respuesta, y extrapolan los resultados a procesos complejos
para entender las diferencias entre ambos sistemas de cultivo.
Con el uso de la proteómica se puede obtener información importante para relacionar el

secretoma con el estado fisiológico y metabólico de los cultivos bajo diferentes condiciones. Por lo
que, el análisis del secretoma de A. brasiliensis proveniente de CS y CL aportará información
relevante para comprender los mecanismos que permiten que el CS presente algunas ventajas sobre
el CL.
23
4. HIPOTESIS
El análisis secretómico permitirá comprender algunas de las razones por las cuales el cultivo sólido
presenta ciertas ventajas sobre el cultivo líquido.
5. OBJETIVOS
5.1. Objetivo general

Identificar las proteínas que constituyen el secretoma de A. brasiliensis obtenido en CS y CL, para
comprender algunas diferencias fisiológicas y metabólicas entre ambos tipos de cultivo.
5.2. Objetivos particulares

• Caracterizar cinéticamente el crecimiento de A. brasiliensis en CS y CL con diferente
concentración de glucosa.
• Obtener el secretoma para cada condición de cultivo para identificar y describir las
proteínas que lo conforman, mediante un análisis bioinformático.
• Identificar y discutir las diferencias en los secretomas obtenidos en diferente tipo de cultivo
con diferente concentración de glucosa.
24
6.- MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Cepa y conservación
6.1.1. Microorganismo
Se utilizó la cepa A. brasiliensis ATCC9642 (previamente A. niger ATCC 9642) (Houseknecht et al.,
2008). La cepa se conservó en tubos crioprotectores usando glicerol al 20% (v/v) a -20 °C y liofilizada
en ampolletas.
6.1.2. Propagación de la cepa
La propagación de A. brasiliensis para la obtención del inóculo se realizó en dos etapas. La primera
consistió en la activación de la cepa (preinóculo) y la segunda, la propagación del preinóculo para la
obtención del inóculo final.
6.1.2.1. Producción de preinóculo

La activación de la cepa se realizó tomando una crioperla impregnada con esporas conservadas en
los tubos crioprotectores con glicerol al 20 % (v/v). La crioperla se colocó en un tubo de ensayo
(dimensiones 1.9 cm x 17.5 cm) inclinado con 10 mL de PDA y con tapón de algodón. Una vez
colocada sobre la superficie de PDA, fue movida para distribuir las esporas sobre el medio. El cultivo
se incubó 7 días a 30 °C.
6.1.2.2. Preparación del inóculo

Al concluir el tiempo de incubación del preinóculo, se adicionaron al tubo inclinado 10 mL de Tween
al 0.05% (v/v) estéril; el tubo se agitó ligeramente en un vórtex para desprender las esporas, y a la
vez, evitar la ruptura del PDA. De la suspensión concentrada de esporas se tomó 1 mL para inocular
un matraz Erlenmeyer de 125 mL con 30 mL de PDA (cuadriplicado para cultivo líquido y
sextuplicado para cultivo sólido); el cultivo se incubó 7 días a 30 °C. Al término del cultivo, la cosecha
de esporas se realizó adicionando 30 mL de Tween al 0.05% (v/v) estéril a uno de los matraces
Erlenmeyer con 30 mL de PDA, se agitó ligeramente con agitador magnético estéril durante 1
minuto. Posteriormente, la suspensión obtenida se transfirió al siguiente matraz hasta finalizar con
el número de extracciones correspondiente para cada tipo cultivo. La suspensión concentrada de
esporas provenientes de los cultivos en matraces Erlenmeyer se utilizó como inóculo para CS y CL,
las esporas se contaron en una cámara de Neubauer diluyendo la suspensión de esporas 1/10.
25
6.2. Medio de cultivo
El medio de cultivo utilizado fue el reportado por Hill y Kafer (2001) con una relación C/N=6. La
composición del medio basal es (g/L): Glucosa 20, NaNO3 6, KCl 0.52, KH2PO4 0.815, K2HPO4 1.045 y
MgSO4·7H2O 0.52. Por cada litro de medio se adiciona un mililitro de solución de elementos traza
con la siguiente composición basal (g/L): FeSO4·7H2O 0.005, EDTA 0.05, ZnSO4·7H2O 0.022, H3BO3
0.011, MnCl2·4H2O 0.005, CoCl2·6H2O 0.0016, CuSO4·5H2O 0.0016 y (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.0011,
pH=6.5 ajustado con HCl al 10% v/v o NaOH al 10% (p/v). Para mantener la proporción de nutrientes,
la concentración de sales se incrementó en la misma proporción que la concentración de glucosa
usadas para el estudio.
6.2.1. Cultivo sólido

El CS se realizó utilizando perlita (AGROlita, ACCIMIN S. A. C. V.) como soporte inerte. A
continuación, se describe el proceso de acondicionamiento del soporte inerte y la preparación del
medio para CS. La perlita fue tamizada con tamices No. 10-20, utilizando la fracción retenida por los
tamices del No. 16 y 20 (partícula de 0.84-1.70 mm). Posteriormente, se realizaron tres lavados, los
primeros dos con agua corriente y el tercero con agua destilada caliente, para finalmente, escurrirla
y deshidratar la perlita a 60 °C hasta tener una humedad menor al 3% (p/p).
6.2.1.1. Esterilización del material

El CS se realizó en columnas de vidrio con diámetro interno de 2.15 cm y longitud de 19.59 ± 0.9 cm.
La perlita y las columnas fueron esterilizadas por separado a 120 °C durante 15 minutos. Mientras
que, el medio de cultivo fue esterilizado a 94 °C durante 15 minutos.
6.2.1.2. Preparación del cultivo

Para preparar el CS sin importar la concentración de glucosa utilizada, la perlita estéril se mezcló
con el medio de cultivo inoculado con 1*107 esporas/mL, manteniendo una proporción de 1.8 mL
de medio más 0.17 ± 0.04 mL de suspensión de esporas por cada gramo de perlita seca (1.8/0.2/1
(v/v/p)). Después, la perlita humedecida con el medio inoculado se introdujo en las columnas de
vidrio y se empacó para tener una densidad de empaque de 0.43 ± 0.03 g/cm3. El volumen ocupado
de cada columna fue cercano a 50 ± 3.13 cm3. Las columnas fueron conectadas al sistema de
respirometría para el monitoreo de la producción de CO2 en tiempo real (sección 6.9.5). La tasa de
aireación fue de 20 mL/min. Las columnas se incubaron a 30 °C. Al menos cuatro réplicas fueron
realizadas para cada condición seleccionada para el análisis del secretoma.
26
6.2.2. Cultivo líquido
El CL se realizó en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de medio Hill y Kafer (2001)
esterilizado a 94 °C por 15 minutos. El tamaño del inóculo fue de 1*10 6 esporas/mL de medio.
Después de inocular el medio de cultivo para cada condición evaluada, los matraces Erlenmeyer se
conectaron al sistema de respirometría para cuantificar la producción de CO2 en tiempo real. La tasa
de aireación fue de 20 mL/min. Los matraces se incubaron a 30 °C y una agitación de 200 rpm. Al
menos cuatro réplicas fueron realizadas para cada condición seleccionada para el análisis del
secretoma.
6.2.3. Estimación de parámetros cinéticos

A partir de los valores de producción de CO2 por A. brasiliensis ATCC9642, se estimaron los siguientes
parámetros: fase lag (h), máxima tasa de producción de CO2 (MTPCO2, mgCO2/h mL), tasa específica
de producción de CO2 (μCO2, 1/h) y tiempo en alcanzar la MTPCO2 (h). La μCO2 se estimó ajustando
los datos con el modelo exponencial (f CO2 = CO2(inicial)eμt). Para el análisis de los datos se realizó una
prueba ANOVA de un factor, y posteriormente, una prueba de rango múltiple de Duncan utilizando
α=0.05. Las diferencias significativas se indican con letras diferentes. El análisis estadístico se realizó
utilizando el programa SPSS versión PASW 23 (IBM SPSS-IBM Corp), al menos ocho réplicas fueron
utilizadas.
6.2.4. Cultivos para análisis morfométrico
6.2.4.1. Cultivo sólido

Se realizaron microcultivos en condiciones similares al sistema de columna. La preparación del
soporte inerte con el medio de cultivo se realizó bajo las condiciones establecidas previamente
(Sección 3.2.1.2), humedeciendo 1 g de perlita, pero sin inocular el medio. Después, se colocó una
fracción del soporte inerte humedecido con el medio de cultivo en el centro de un portaobjetos y
se inoculó por picadura. El cultivo se cubrió con un cubreobjetos. En seguida, los microcultivos se
colocaron sobre una varilla de vidrio dentro de una caja Petri con un papel filtro humedecido con
agua destilada y se incubó a 30 °C. El tiempo de cultivo fue el tiempo promedio en alcanzar la
MTPCO2 en las columnas. Al concluir la incubación, se retiraron los portaobjetos de las cajas Petri
para ser observados directamente en el microscopio óptico (Olympus Corp. BX 50).
27
6.2.4.2. Cultivo líquido
El medio de CL se inoculó bajo las mismas condiciones mencionadas anteriormente (Sección 3.2.2).
El cultivo se incubó a 30 °C a 200 rpm durante el tiempo necesario para alcanzar la MTPCO2 (Tabla
3). Al concluir el tiempo de incubación, los pellets suspendidos en el extracto final fueron diluidos
con un buffer fosfato salino (pH 7.4), a una proporción 1:3 (mL de medio cultivado: mL de buffer
fosfato salino); posteriormente, se tomó un pellet y se colocó sobre un portaobjetos, cortándolo en
cuatro partes con un bisturí y separando las partes con una aguja de disección (Colin et al., 2013),
se colocó un cubreobjetos y se observó en un microscopio óptico (Olympus Corp. BX 50).
6.2.4.3. Captura de imágenes para análisis morfológico de A. brasiliensis

Las observaciones se realizaron en un microscopio óptico (Olympus Corp. BX 50), el cual está
equipado con una cámara Evolution VF Monochrome Cooled, el tiempo de exposición se configuró
a 250 ms y la resolución a 64 bit con el programa Image Pro-Plus. Para ambos cultivos, el enfoque
se realizó utilizando el objetivo 10x. Para el análisis de imagen se utilizó el programa ImageJ (NIH,
Bethesda MD) calibrado a 1.64 pixeles/µm, usando como estándar la cámara Neubauer. Las
imágenes se filtraron con el filtro Variance 3D con los siguientes valores: x/y/z radius=2. Para el
análisis de las hifas de ambos cultivos, se consideraron puntas terminales con una longitud mayor a
400 μm.
6.2.4.4. Análisis morfométrico

Se midió la longitud de al menos 30 hifas distales con una longitud mayor a 400 μm. Se contó el
número de puntas en zona distal. El nivel de ramificación de las hifas se estimó como: Nivel de
ramificación = (No. de puntas/longitud total medida) *100. La cual se expresó como número de
puntas por cada 100 µm.
6.3. Recuperación de la proteína extracelular
6.3.1. Cultivo sólido
Una vez alcanzada la MTPCO2, las columnas fueron desconectadas del sistema de respirometría, a
continuación, se les adicionaron 35 mL de buffer Tris-HCl (pH 7.2) frío conteniendo 20 μL de cóctel
inhibidor de proteasas (P2714, Sigma-Aldrich). Las columnas fueron enfriadas a 4 °C por 30 minutos
para detener el metabolismo microbiano. Posteriormente, el buffer de extracción fue recuperado
por vacío. Para incrementar la cantidad de proteína extraída se repitió el paso de extracción con un
segundo volumen de 25 mL de buffer Tris-HCl (pH 7.2), manteniendo el contacto entre el buffer de
28
extracción y el cultivo durante 10 minutos. Al término del tiempo de extracción, los dos extractos
recuperados se combinaron y congelaron a -20 °C hasta su posterior procesamiento.
6.3.2. Cultivo líquido
Inmediatamente después de registrar la MTPCO2 en el sistema de respirometría, los matraces se

desconectaron, se les adicionaron 20 μL de un cóctel inhibidor de proteasas (P2714, Sigma-Aldrich)
y se mantuvieron en refrigeración a 4 °C durante 30 minutos para detener el metabolismo
microbiano. Terminando el tiempo de enfriamiento, el caldo de cultivo fue filtrado a vacío (papel
filtro Whatman 41); el extracto protéico se congeló hasta su procesamiento.
6.3.3. Concentración y diálisis de proteína para análisis secretómico

Los extractos extracelulares de ambos cultivos se descongelaron a temperatura ambiente. Se
utilizaron 40 mL de extracto para obtener la proteína para los análisis secretómicos y el resto fue
guardado para determinar concentración inicial de proteína y pH. El primer paso realizado para
concentrar la proteína del extracto protéico fue eliminar residuos de biomasa y/o soporte inerte (en
el caso de CS), centrifugando a 7000 rpm durante 15 minutos. Después, fracciones de 10 mL de
extracto extracelular se colocaron en tubos Amicon MWCO 10 kDa de 15 mL y se centrifugaron a
7000 rpm por 15 minutos. Entre cada paso se recuperaron alrededor de 1 y 1.5 mL de solución
concentrada. Las cuatro fracciones se juntaron y se les adicionó buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) hasta
alcanzar un volumen de 10 mL. A continuación, se colocó en los tubos Amicon MWCO 10 kDa de 15
mL y se centrifugó a 7000 rpm por 15 minutos obteniendo un volumen entre 2-2.5 mL de extracto
dializado y concentrado, este paso se repite dos veces más. En el último paso, el volumen
recuperado de extracto fue menor a 2 mL. El extracto final fue centrifugado nuevamente a 10000
rpm por 2 minutos para eliminar algún residuo sólido suspendido. Una vez determinada la
concentración de proteína (Sección 6.9.4) en el extracto concentrado, se separaron y liofilizaron
fracciones con 50 μg de proteína. Estas fracciones fueron utilizadas para la separación por
electroforesis para el análisis del secretoma.
6.4. Separación de proteína por SDS-PAGE

Las muestras liofilizadas con 50 μg de proteína de cada condición fueron procesadas con el kit
ReadyPrep 2-D cleanup (1632130, Bio-Rad) siguiendo las indicaciones del proveedor. El pellet
obtenido se solubilizó con 30 μL de buffer Laemmli preparado de acuerdo con el manual de Mini-
PROTEAN® Tetra Cell-Bio-Rad (Bio-Rad). La muestra se agitó durante 1 minuto en intervalos de 10
29
minutos hasta llegar a 30 minutos. Luego, la muestra se centrifugó a 10000 rpm por 10 minutos para
separar el material insoluble. Posteriormente, la muestra se calentó a 95 °C (Thermomixer Comfort,
Eppendorf) por 5 minutos y se centrifugó a 10000 rpm por 5 minutos. Las proteínas desnaturalizadas
y el marcador de peso molecular de 10-250 kDa (Bio-Rad) se colocaron en el SDS-PAGE con 12% de
acrilamida (Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Bio-Rad). La electroforesis corrió a 300 V (fuente de
poder PowerPac Universal, Bio-Rad) hasta que el frente de corrida alcanzó una distancia de 3 cm;
todo esto se realizó en frío. A continuación, el gel se lavó tres veces con agua destilada y se
adicionaron 50 mL de reactivo Coomassie Brilliant Blue G-250 (161-0406, Bio-Rad) para revelar las
proteínas presentes en cada muestra. El proceso de tinción se realizó en 1 hora. Al finalizar la tinción,
el gel se lavó dos veces con 50 mL de agua destilada, manteniéndose en agitación en un agitador
diagonal durante 10 minutos para eliminar el reactivo Coomassie; se realizó un tercer lavado con
agua destilada durante 24 horas bajo agitación constante.
Las imágenes de los geles se capturaron con un foto-documentador GelDoc-EZ (Bio-Rad).

Previo a la digestión tríptica de las proteínas separadas en los geles SDS-PAGE, cada carril se cortó
en tres fracciones de 1 cm (Figura 4); y cada una de ellas se cortó en fracciones ~ 1 mm.
Figura 4. Ejemplo de corte de los carriles del SDS-PAGE para la digestión tríptica.
6.5. Digestión tríptica

La digestión tríptica se realizó en el CINVESTAV Unidad Irapuato siguiendo lo reportado por
Shevchenko et al., (2007). Las piezas de gel se lavaron con 200 μL de agua destilada manteniendo
una ligera agitación durante 15 minutos, después se destiñeron con 50 µL de 100% ACN
(acetonitrilo)/NH4HCO3 (1:1 v/v) por 15 minutos, el gel se deshidrató adicionando 50 µL de ACN al
100% agitando por 15 minutos, después se secó a vacío (Centrivap, Labconco). Las piezas de gel
30
deshidratadas se rehidrataron con 50 µL de 10 mM DTT (ditiotreitol) en 100 mM NH4HCO3. La
reacción de reducción se incubó a 56 °C por 45 minutos; se removió la solución de 10 mM DTT en
100 mM NH4HCO3 y las piezas se lavaron con 100% de ACN/100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) a
temperatura ambiente por 15 minutos. Después de remover la solución de lavado, las proteínas se
alquilaron con 50 µL de 55 mM de iodoacetamida en 100 mM NH4HCO3, la reacción se llevó a cabo
en oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente, las piezas de gel se lavaron
con 50% de ACN en 100 mM NH4HCO3 por 15 minutos, éstas nuevamente se deshidrataron con 100
% de ACN y se secaron al vacío. A continuación, los fragmentos de gel se rehidrataron con 10 µL de
una solución de tripsina de grado de secuenciamiento (Promega, Madison, WI) a una concentración
de 10 ng/µL en 50 mM NH4HCO3 incubándose a 4 °C durante 1 hora. Al concluir la rehidratación de
los fragmentos de gel, se adicionó 20 µL de 50 mM NH4HCO3 para evitar la deshidratación durante
la reacción. La digestión tríptica se llevó a cabo durante toda la noche a 37 °C. La recuperación de
los péptidos en solución se realizó después de centrifugar los fragmentos de gel junto con la solución
tríptica a 10000 rpm por 2 minutos. Para maximizar la extracción de los péptidos, las piezas de los
geles se lavaron primero con 50 µL de 50% ACN en 5% de ácido fórmico y segundo con 100% ACN/5%
ácido fórmico (2:1 v/v). En ambos casos se repitió el proceso de centrifugación para recuperar los
péptidos. Los sobrenadantes se secaron al vacío y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis por LC-
MS/MS. Por cada condición se prepararon y analizaron por separado dos réplicas biológicas.
6.6. LC-MS/MS
Después de la digestión tríptica, los péptidos obtenidos se disolvieron en 16 μL de una solución al
3% ACN/0.1% ácido fórmico, y se centrifugaron a 10000 rpm por un minuto. Los péptidos fueron
separados por cromatografía líquida ultra rendimiento en escala nano (NanoAcquity UPLC, Waters).
El análisis de masas se llevó a cabo en un espectrómetro de masas tipo trampa de iones lineal (LTQ)
(Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) y equipado con una fuente de iones nano electrospray
(nanoESI). El proceso de la separación cromatográfica fue el siguiente: a partir de la solución
peptídica, se inyectaron 8 µL de la muestra para limpiarla y concentrarla a través de una pre-
columna (Symmetry® C18, 5 μm, 180 μm x 20 mm, Waters) usando un flujo de 10 µL/min de 0.1%
ácido fórmico durante 1 minuto. Posteriormente, el flujo cambia automáticamente a la columna
capilar UPLC (100 μm ID BEH-C18 1.7 μm tamaño de partícula) para separar los péptidos por un
gradiente binario (solución A: 0.1% ácido fórmico, solución B: 100% ACN en 0.1% ácido fórmico) con
un flujo de 0.4 µL/min a 35 °C. El gradiente fue programado para que la solución B pasará de 3 a 40
% en 60 minutos, posteriormente en dos minutos llegar hasta 85%, manteniéndose constante
31
durante 10 minutos, después desciende a 3% en dos minutos y se mantiene por 26 minutos. Los
péptidos eluidos entran a la fuente de iones Nano Electrospray del espectrómetro de masas a través
de una punta estándar cubierta de sílice (NewObjective, Woburn, MA). El espectrómetro de masas
fue operado en modo de adquisición de datos dependiente del precursor con la finalidad de alternar
automáticamente entre todos los escaneos (400-1600 m/z) en MS, seguido por la fragmentacion y
los subsecuentes escaneos Top 5 MS/MS en la trampa de iones lineal con la exclusión dinámica
habilitada. La disociación inducida por colisión (CID) empleó helio como gas colisionador con una
energía de colisión del 35% y tiempo de activación 10 ms. Para la adquisición de datos se utilizó el
programa Xcalibur 2.0.7 software (Thermo Fisher Scientific).
6.7. Análisis bioinformático

Los espectros de masa se obtuvieron con el programa Proteome Discoverer versión 1.4 (Thermo-
Fisher Scientific) y la búsqueda de los péptidos se realizó con el programa Sequest utilizando la
información de las secuencias de Aspergillus brasiliensis (13042 entradas) obtenidas de la base de
datos de NCBI (descargada el 9 de febrero del 2017). El programa se configuró de la siguiente
manera: carbamido-metilación de cisteína como modificación fija, oxidación de metionina como
modificación variable y se considero la posibilidad de perdida de sitios de corte (clivaje) hasta un
número de 2. La tolerancia al error de masa del precursor fue configurada a 2 Da, y la del fragmento
fue de 1 Da, considerando el 1% de tasa de detección falsa (FDR) para tener una alta confianza en
la identificación de péptidos.
A las proteínas hipotéticas identificadas por Sequest se les realizó una búsqueda de
ortólogos entre especies, utilizando la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool),
específicamente para proteínas (BLASTp), que se encuentra en el servidor de NCBI (National Center
for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), limitando la búsqueda sólo con datos
de A. brasiliensis y A. niger (principalmente la cepa CBS 513.88). El porcentaje mínimo de identidad
para todas las proteínas fue mayor al 80%. La función de las proteínas identificadas se asignó de
acuerdo a la base de datos de UniProt (www.uniprot.org) y de KEGG (www.genome.jp/kegg). La
localización subcelular se identificó con el servidor WoLF-PSORT (http://wolfpsort.org); mientras
que la identificación del péptido señal o la predicción de secreción por mecanismo no convencional
fue llevada a cabo con los servidores SignalP 4.1 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) y SecretomeP
2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP), respectivamente.
32
6.8. Clasificación y regulación de proteínas identificadas
Las proteínas identificadas en el secretoma se clasificaron en tres grupos: únicas, abundantes no
reguladas y reguladas. Las proteínas únicas fueron consideradas aquellas que sólo se identificaron
en una condición para cada tipo de cultivo. Mientras que, la abundancia y la regulación se basó en
la cuenta espectral ponderada (CEP) por mL de medio para el CS y CL, el cual se calculó como se
indica a continuación:
CEPi=(SpC/L)i
Donde: SpC es la cantidad de espectros de masa para la proteína i por mL de extracto proteico y L
la longitud estimada (número de aminoácidos) de la proteína i. El nivel de regulación de cada
proteína con en función de la concentración de glucosa fue estimado al graficar los valores
normalizados de la CEP obtenidos para cada condición contra los valores normalizados de la
concentración de glucosa. En ambos casos, la normalización fue hecha respecto al máximo valor CEP
y la máxima concentración de glucosa. Los datos fueron ajustados con el modelo de regresión de
mínimos cuadrados. Las proteínas con r2>0.75 fueron consideradas reguladas, y el valor de la
pendiente (VP) fue usado para definir si la proteína fue sobre-regulada (VP positiva) o bajo-regulada
(VP negativa) (Volke-Sepulveda et al., 2016). Las proteínas con r2<0.75 e incluidas en el percentil 90
de todas las proteínas encontradas fueron consideradas como abundantes no reguladas. Debido a
la baja concentración de las proteínas incluidas en el percentil 20 que presentaron valores CEP
menor a 1.1 x 10-4 para CS y 1.8 x 10-6 para CL no se consideraron para la discusión.
6.9. Procedimientos analíticos
6.9.1. Humedad
Para determinar el contenido de humedad del medio sólido se colocó 1 g de materia húmeda en
una termobalanza (Ohaus®, Parsippany, NJ, Estados Unidos). La temperatura de secado fue 130 °C
hasta peso constante.
6.9.2. pH
El pH se midió con un potenciómetro (PHS-3BW, Bante instrument). El pH inicial del medio fue
ajustado a 6.5 utilizando HCl al 10 % (v/v) o NaCl al 10 % (p/v), de acuerdo con lo requerido.
6.9.3. Glucosa
33
La glucosa se cuantificó con el kit de glucosa oxidasa (SPINREACT, Gerona, España) siguiendo el
protocolo establecido por el proveedor.
6.9.4. Proteína
La concentración de proteína se determinó espectrofotométricamente por el método del ácido
bicinconínico (BCA) utilizando Pierce BCA Protein Assay Kit (23228, Thermo Scientific), siguiendo el
protocolo establecido en el manual del proveedor y utilizando seroalbúmina bovina perteneciente
al kit como estándar.
6.9.5. CO2
Un flujo de aire a 20 mL/min fue alimentado en cada unidad experimental, la concentración de CO2
en el aire a la salida del cultivo fue usada como medida indirecta del crecimiento celular. El CO2 del
aire fue medido en tiempo real por un sistema de respirometría usado principalmente para CS
(Carrillo-Sancen et al., 2016; Martínez-Valdez et al., 2015). El sistema consiste en un sensor de flujo
másico (Honeywell, USA) y un sensor infrarrojo para el análisis del CO2 (United Phospshorus Ltd,
India). La adquisición de datos se realiza a través de una plataforma LabView (National Instruments,
USA).
6.9.6. Biomasa
En el caso del CL, la biomasa humeda recuperada por filtración (Whatman 41) fue lavada dos veces
con 50 mL de H2O destilada y cuantificada gravimétricamente en base seca (60 °C, 24 h).
6.10. Análisis estadístico

Los datos para la estimación de parámetros cinéticos asociados a la producción de CO2 fueron
obtenidos a partir de al menos 8 muestras por condición. El nivel de ramificación de las hifas, se
determinó mediante el análisis, de al menos, 30 hifas independientes. Los datos fueron analizados
por ANOVA de un factor y la comparación de medias fue realizada con una prueba de rango múltiple
de Duncan (α = 0.05). Las diferencias significativas entre medias, se indican con letras diferentes.
Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS, versión PASW 23 (IBM SPSS-IBM Corp).
34
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A continuación, se muestran los resultados obtenidos en este estudio, los cuales están divididos en
dos secciones. En la primera sección se presenta el efecto del incremento de la concentración de
glucosa en el medio en cultivo sólido (CS) y líquido (CL) sobre la producción de CO2, el nivel de
ramificación, producción de proteína, y el secretoma. En la segunda sección se presentan los
resultados de la comparación de CS y CL bajo una misma concentración de glucosa; lo que permitirá
mostrar los efectos específicos causados por el tipo de cultivo sobre A. brasiliensis.
7.1. Efecto de la concentración de glucosa sobre parámetros asociados al crecimiento de A.

brasiliensis
En el primer apartado de este trabajo se presentan los resultados de producción de CO2, cantidad
de proteína producida, nivel de ramificación, y características del secretoma en función de la
concentración de glucosa para CS y CL. Estos resultados muestran el efecto del incremento de la
concentración de glucosa inicial en el medio sobre la fisiología y metabolismo de A. brasiliensis.
7.1.1. Selección de la concentración de glucosa y análisis respirométrico

En una primera etapa se evaluó el efecto de la concentración inicial de glucosa en CL sobre algunos
parámetros asociados al crecimiento de A. brasiliensis. El objetivo de esta etapa fue seleccionar el
rango de concentración inicial de glucosa para cada tipo de cultivo (el cual permita un crecimiento
y producción de proteína adecuada para el estudio) y determinar el tiempo de cultivo para la toma
de muestras para el análisis del secretoma. Con base en resultados previos (Volke-Sepulveda et al.,
2016) se seleccionaron concentraciones iniciales de glucosa de 10 a 180 g/L para la evaluación en
CL, ya que a falta de estudios cinéticos con esta cepa y en este tipo de cultivo, un amplio rango de
concentraciones de glucosa fue evaluado. En el caso de CS, a concentraciones iniciales de glucosa
inferiores a 30 g/L la concentración de proteína extracelular es tan baja que resulta insuficiente para
los estudios de proteómica; por otro lado, a concentraciones superiores a 180 g/L, la MTPCO2
disminuye por inhibición por sustrato (Salgado, 2015).
En las Figuras 5 y 6 se muestra el comportamiento de la tasa de producción de CO2 y la

producción de CO2 en función del tiempo para ambos tipos de cultivo. En el caso del CL, el tiempo
en que se alcanza la MTPCO2 (Figura 5 y Tabla 3) es similar con concentraciones iniciales de glucosa
de 10 a 50 g/L y aumenta con 60 g/L, en cambio, con las concentraciones iniciales de glucosa de 100
35
y 180 g/L, la MTPCO2 no se alcanza incluso prologando la duración del cultivo hasta las 90 h. Mientras
que, en CS la MTPCO2 se registró alrededor de las 44 h, en todas las concentraciones evaluadas. El
máximo valor de la MTPCO2 se obtiene con 60 g/L en CL (Figura 5); y estos valores son similares para
las concentraciones de 30 a 50 g/L. Por otro lado, con 180 g/L en condiciones de CS se obtiene el
máximo valor de la MTPCO2. La producción final de CO2 aumenta en función de la concentración
inicial de glucosa para ambos cultivos, obteniendo el máximo valor en el medio con 60 g/L para el
caso de CL (Figura 5 y Tabla 3), y para el CS, en el medio con 180 g/L de glucosa (Figura 6 y Tabla 3).
El tiempo lag, estimado a través de la producción de CO2, no presenta diferencias significativas para
las concentraciones de 10 a 60 g/L en CL y de 30 a 180 g/L en CS, manteniéndose en un promedio
de 22 ± 2.37 h. El tiempo lag en CL para concentraciones iniciales de glucosa de 100 y 180 g/L fue
mayor (Tabla 3). La producción de biomasa fue sólo medida en CL, y su perfil es similar al de la
producción de CO2; es decir, la producción de biomasa aumenta al incrementar la concentración
inicial de glucosa hasta 60 g/L, en donde alcanzó su máximo valor (Tabla 3). En cuanto a la utilización
de glucosa, está fue consumida en un porcentaje mayor al 95% con 10-60 g/L CL; mientras que, en
los cultivos con concentración inicial de glucosa de 100 y 180 g/L el consumo es deficiente. Además
de los problemas de inhibición, tiempos prolongados en alcanzar la MTPCO2 y larga duración de la
fase lag, que presentaron las condiciones de 100 y 180 g/L, se observó presencia importante de
crecimiento pared (Figura 7), provocando células con muy diversos estados fisiológicos en el matraz,
lo que impide la toma de muestras en estados fisiológicos bien definidos para el estudio del
secretoma.
10 g/L 1.00 20 g/L 30 1.00 30 1.00 40 g/L 30

1.00 30 30 g/L
25 25 0.80 25 0.80 25
0.80 0.80
20 20 20 20
0.60 0.60 0.60 0.60 mg/mL
mg/mL h
15 15 15 15
0.40 0.40 0.40 0.40
10 10 10 10
0.20 5 0.20 5 0.20 5 0.20 5
0.00 0 0.00 0 0.00 0 0.00 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80
h h h h
1.00 50 g/L 30 1.00 60 g/L 30 1.00 100 g/L 30 1.00 180 g/L 30
0.80 25 0.80 25 0.80 25 0.80 25

20 20 20 20
0.60 0.60 0.60 0.60
mg/mL h
mg/mL
15 15 15 15
0.40 0.40 0.40 0.40
10 10 10 10
0.20 5 0.20 5 0.20 5 0.20 5
0.00 0 0.00 0 0.00 0 0.00 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80
h h h h
Figura 5. Tasa de producción de CO2 (círculos negros) y producción de CO2 (círculos cafés) de A. brasiliensis ATCC9642 en cultivo líquido
con concentraciones de glucosa de 10 a 180 g/L.
36
30 g/L 60 g/L 100 g/L
100 100 100
6 6 6
80 80 80
4 60 4 60 4 60
mg/mL h
mg/mL
40 40 40
2 2 2
20 20 20
0 0 0 0 0 0
0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60
h h h
120 g/L 140 g/L 160 g/L 180 g/L
100 100 100 6 100
6 6 6
80 80 80 80
4
mg/mL h
60 4 4 4
mg /mL
60 60 60
40 40 40 40
2 2 2 2
20 20 20 20
0 0 0 0 0 0 0 0
0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60
h h h h
Figura 6. Tasa de producción de CO2 (círculos negros) y producción de CO2 (círculos cafés) por A. brasiliensis ATCC9642 en cultivo sólido con
concentraciones de glucosa de 30 a 180 g/L.
Tabla 3. Parámetros estimados a partir de la producción de CO2 en cultivos líquido y sólido (Salgado, 2015).
Tiempo en
Tiempo de Fase Glucosa
Glucosa obtener la CO2 final X
Cultivo cultivo Lag final
(g/L) MTPCO2 (mg CO2/mL) (mg/mL)
(h) (h) (g/L)
(h)
10 74.86 ± 10.86 26.95 ± 0.84 40.90 ± 3.41 3.73 ± 1.74 0.14 ± 0.28 3.82 ± 0.32
20 74.83 ± 11.11 22.54 ± 1.77 46.71 ± 4.58 9.11 ± 2.68 0.25 ± 0.50 7.47 ± 0.56
30 71.64 ± 15.84 20.63 ± 3.61 48.55 ± 4.74 15.20 ± 7.52 0.38 ± 0.77 9.03 ± 1.23
40 74.98 ± 11.35 20.39 ± 4.17 49.14 ± 7.32 19.14 ± 6.87 1.10 ± 1.55 12.20 ± 2.46
CL
50 84.51 ± 0.65 19.47 ± 2.17 51.59 ± 1.12 27.91 ± 1.34 2.87 ± N. D*. 16.24 ± N. D.*
60 91.81 ± 0.09 25.97 ± 3.85 65.97 ± 3.76 31.52 ± 1.82 0.00 ± 0.00 17.71 ± 1.74
100 90.86 ± 0.06 45.07 ± 3.24 N. D 14.46 ± 0.55 55.80 ± 0.49 11.63 ± 0.11
180 90.94 ± 0.06 60.17 ± 12.23 N. D 7.06 ± 4.81 115.25 ± 3.92 8.49 ± 1.52
30 70.94 ± N. D.* 18.69 ± N. D.* 27.86 ± N. D.* 18.82 ± N. D.* N.D. N. D.
60 71.03 ± N. D.* 23.36 ± N. D.* 30.69 ± N. D.* 44.58 ± N. D.* N. D. N. D.
100 63.30 ± 1.12 21.24 ± 1.82 33.32 ± 0.06 84.40 ± 2.98 N. D. N. D.
CS 120 62.66 ± 0.06 20.57 ± 0.65 35.57 ± 0.65 106.15 ± 2.26 N. D. N. D.
140 70.36 ± 0.06 21.99 ± 1.24 37.82 ± 1.12 128.04 ± 24.88 N. D. N. D.
160 70.36 ± 0.06 21.74 ± 0.65 41.32 ± 0.06 154.50 ± 6.93 N. D. N. D.
180 70.36 ± 0.53 22.52 ± 0.23 44.41 ± 0.53 140.41 ± 15.05 N. D. N. D.
MTPCO2= Máxima tasa de producción de CO2; X=biomasa. * Sólo se estimó con una réplica, los datos que no presentan (*) son el
promedio de al menos dos réplicas.
Con base en los resultados obtenidos se seleccionaron las concentraciones iniciales de

glucosa de 20, 40 y 60 g/L para CL y 60, 120 y 180 g/L para CS. En el caso de CL, la proteína
extracelular obtenida es suficiente para los análisis posteriores (cuantificación y separación de
proteína > 50 µg) y 60 g/L es la máxima concentración de glucosa que permite un estado fisiológico
37
homogéneo dentro del cultivo. Para CS, los datos observados previamente (Figura 7 y Tabla 3)
ayudaron a considerar algunos puntos para la selección de las concentraciones mencionadas. La
selección de 60 g/L como concentración mínima para el CS, permitió una comparación directa con
CL y observar el efecto del tipo de cultivo. La concentración de 180 g/L fue la máxima concentración
donde se alcanza el máximo valor de MTPCO2, y finalmente, la concentración de 120 g/L fue una
condición intermedia entre los dos puntos.
Figura 7. Cultivo líquido con 100 g/L (imagen izquierda) y 180 g/L (imagen derecha), los círculos rojos muestran la biomasa crecida en la
pared del matraz a las 90 horas.
Además de haber seleccionado el intervalo de concentraciones de glucosa para los estudios

del secretoma, los estudios cinéticos permitieron establecer el tiempo de MTPCO2 para cada
condición de cultivo (tipo de cultivo y concentración inicial de glucosa). Es importante recordar que
este tiempo, aquel en el que se alcanza la MTPCO2, fue seleccionado como criterio para la toma de
muestras para los estudios del secretoma.
Los rangos seleccionados de glucosa para el estudio del secretoma se encuentran dentro
rangos utilizados en el estudio del crecimiento de A. niger (Favela et al., 1998). En dicho estudio se
evaluaron concentraciones de 30-200 g/L y 50-450 g/L de glucosa para el CL y el CS,
respectivamente. Las concentraciones de biomasa obtenidas en CL fueron similares a nuestros
resultados (Tabla 3), A. niger alcanzó una producción de 10, 14 y 12 g/L usando 30, 50 y 100 g/L en
CL, respectivamente. También, el consumo de glucosa obtenido por A. brasiliensis en este trabajo
(Tabla 3) es muy similar a lo obtenido para A niger en estudios previos (consumió el 99, 95 y 58% a
30, 50 y 100 g/L de glucosa inicial, respectivamente). El bajo consumo de glucosa y la baja
producción de biomasa a concentraciones altas de glucosa en CL se asocia a problemas de inhibición
en estas dos variables, los cuales son solucionados con el uso del CS, el cual permite utilizar
38
concentraciones de hasta 450 g/L (Favela-Torres et al., 1998; Solis-Pereyra et al., 1996). Resultados
similares a los obtenidos en este trabajo fueron obtenidos por Carrillo-Sancen et al., 2016; quienes
demostraron que A. niger 10 produce una mayor concentración de proteína en medios con 20 g/L
de almidón (inductor) complementado con 20 o 40 g/L de glucosa (fuente de carbono) en
condiciones de CL; pero a partir de concentraciones mayores a 80 g/L de glucosa, la producción de
proteína fue mayor en CS. Se ha reportado que en CS, la producción de biomasa y de proteína
aumentan al incrementar las concentración de glucosa inicial en el medio de cultivo (Solís-Pereira
et al., 1993, Gomes et al., 2018; Viniegra-González y Favela-Torres, 2006). Esto hace que diversos
grupos de investigación empleen altas concentraciones de fuente de carbono en CS. Como ejemplo
de ello, a continuación se cita el rango de concentración inicial de fuente de carbono usado por
diversos autores: 50 a 450 g/L de glucosa (Favela-Torres et al., 1998), 300 y 400 g/L de glucosa
(Gutiérrez-Rojas et al., 1995), 45 a 180 g/L de hexadecano (Volke-Sepúlveda et al., 2003) y 20 g/L de
almidón con 80 o 180 g/L de glucosa (Carrillo-Sancen et al., 2016).
En resumen, las concentraciones de 20, 40 y 60 g/L y 60, 120 y 180 g/L de glucosa para el CL
y el CS respectivamente, fueron seleccionadas para el análisis del secretoma. Además, la
cuantificación de proteína en la MTPCO2 proveniente de los cultivos con 20 y 40 g/L en CS, permitió
demostrar que la alta producción de proteína por esta cepa, no es exclusiva del CS (0.05 ± 0.21 y 5.2
± 4.49 µg/mL, respectivamente).
Una vez seleccionado el rango de concentración inicial de glucosa para cada tipo de cultivo
e identificado el tiempo de muestreo, se realizaron cultivos con réplicas experimentales y
temporales (biológicas) para obtener los extractos extracelulares para el análisis del secretoma
(Tabla 4, sección 7.1.3). Como se demostró anteriormente, los parámetros cinéticos (Figs. 5 y 6, y
Tabla 3) y la producción de proteína extracelular (Figura 9) en CS y CL presentan diferencias
importantes; tanto por el tipo de cultivo, como por la concentración inicial de glucosa (Tabla 4).
Tabla 4. Parámetros medidos en la máxima tasa de producción de CO2 en ambos cultivos con
diferentes concentraciones de glucosa (cultivos para obtención de muestra para el análisis
secretómico).
Glucosa Tiempo de µCO2

(g/L) Fase Lag MTPCO2 CO2 producido n
Cultivo muestreo (1/h)
(h) (mg/mL h) mg CO2/mL
Inicial Final (h)
20 1.00 ± 1.35A 53.20 ± 2.47A 28.76 ± 2.25A 0.50 ± 0.06A 5.58 ± 0.56A 0.14 ± 0.01A 25
CL
40 8.75 ± 0.60B 55.46 ± 3.10AB 24.50 ± 2.36BC 0.70 ± 0.13AB 11.47 ± 1.94B 0.10 ± 0.01B 16
39
Glucosa Tiempo de µCO2
(g/L) Fase Lag MTPCO2 CO2 producido n
Cultivo muestreo (1/h)
(h) (mg/mL h) mg CO2/mL
Inicial Final (h)
60 7.94 ± 0.50B 62.16 ± 6.55C 23.92 ± 3.11B 0.78 ± 0.12B 17.36 ± 3.41C 0.08 ± 0.02C 9
60 0.68 ± 0.57A 38.53 ± 1.34D 26.00 ± 1.54C 2.38 ± 0.34C 14.64 ± 2.08D 0.25 ± 0.04D 23
CS 120 0.46 ± 0.28A 47.58 ± 1.98E 27.81 ± 1.15A 4.63 ± 0.39D 36.48 ± 4.49E 0.19 ± 0.02E 10
180 0.77 ± 0.43A 56.80 ± 2.82B 32.33 ± 2.85D 6.97 ± 0.73E 65.28 ± 3.53F 0.16 ± 0.01F 8
MTPCO2= máxima tasa de producción de CO2, µCO2= Tasa específica de producción de CO2, n= número de muestras. Letras diferentes
indican diferencias significativas (ANOVA de un factor con prueba de rango múltiple de Duncan (α = 0.05)).
Uno de los parámetros evaluados y considerado relevante para la toma de muestra fue la
MTPCO2 (Tabla 4), el tiempo en alcanzar este punto incrementa en función de la concentración de
glucosa para ambos cultivos, presentando diferencias significativas entre todas las condiciones de
CS, y entre 20 y 60 g/L del CL. El valor de la MTPCO2 es 8.93 veces mayor en 180 g/L (CS) al
compararse con 60 g/L en CL, y al igual que el tiempo de muestreo, tiende a elevar su valor al
incrementar la concentración de glucosa inicial y sólo existen diferencias significativas en CS.
También, el CO2 producido en el punto de muestreo, incrementó en función de la

concentración de glucosa para ambos cultivos con diferencias significativas entre las condiciones
(Tabla 4), no obstante, la mayor producción fue identificada con 120 y 180 g/L. En cambio, la µCO2
disminuyó al incrementar la glucosa en el medio, mostrando un descenso del 71 y 61 % en CL y CS,
respectivamente. De igual manera que los otros parámetros, esta resultó mayor en CS, teniendo un
incremento de 3.17 veces comparando la misma concentración de glucosa de ambos cultivos.
Por otro lado, la fase lag de producción de CO2 no presentó diferencias significativas al
comparar los resultados entre CS y CL (Tabla 4), sin embargo, la tendencia en función de la
concentración es distinta para cada tipo de cultivo. En el caso del CS, esta incrementó hasta 6 horas
al elevar la concentración de glucosa a 180 g/L; mientras que, disminuye 4 horas en la máxima
concentración para CL, lo que indica que elevar las concentraciones favorece a una germinación
temprana de las esporas en CL. Esta respuesta también es observada con A. niger 10, en CL, inició
su crecimiento exponencial a las 10 h, en cambio para el CS, fue a las 20 h (Favela-Torres et al.,
1998).
A pesar de las diferencias cinéticas entre ambos cultivos, el muestreo en la MTPCO2 permitió
la comparación del secretoma en un estado fisiológico similar entre condiciones y tipos de cultivo
evaluados, ya que, si se considera el mismo tiempo de cultivo para el CS y CL, se estaría comparando
40
estados de crecimiento distintos (Favela-Torres et al., 1998). Además, el muestreo en el tiempo en
que se obtienen la MTPCO2 evita la presencia de proteínas intracelulares asociadas al
envejecimiento celular, ya que el crecimiento de A. brasiliensis en este punto se encuentra en fase
exponencial (Carrillo-Sancen et al., 2016; Volke-Sepulveda et al., 2016; Jami et al., 2010).
Los tiempos en que se alcanza el punto de muestreo son cortos y proporcionales al

incremento de la concentración en el medio en CS, como previamente se reportó (Volke-Sepulveda
et al., 2016). Su comparación con los tiempos de muestreo obtenidos en CL indicó que el crecimiento
de A. brasiliensis es más rápido en CS, a pesar de las altas concentraciones utilizadas; un resultado
similar fue reportado con A. niger, que alcanzó su máxima producción de biomasa a las 40 h con 450
g/L de glucosa en CS, mientras que, con 200 g/L en CL, la máxima producción se logró a las 70 h
(Favela-Torres et al. 1998). Por otro lado, Aguilar et al., (2001) reportaron que la máxima producción
de biomasa se alcanzó a las 20 y 32 h para el CS y CL, respectivamente, usando glucosa a 200 g/L y
ácido tánico a 25 g/L.
El rápido crecimiento en CS se puede asociar a un acelerado consumo de glucosa

determinado indirectamente por los altos valores de la MTPCO2 y la µCO2. Estos resultados podría
indicar un elevado proceso catabólico (oxidación de la glucosa) por parte de A. brasiliensis como
previamente se reportó (Volke-Sepulveda et al., 2016) usando similares concentraciones de glucosa;
mientras que, los procesos anabólicos (síntesis de la pared celular: glucanos, quitina y mananos
(Gastebois et al., 2009) asociados a la biosíntesis de biomasa en CL son sugeridos debido a los bajos
valores de la MTPCO2. Ya que se ha identificado que a concentraciones menores de 100 g/L de ácido
tánico, A. niger produce 2-4 veces más biomasa en CL que en CS (Aguilar et al., 2001).
La concentración de glucosa cuantificada al final del cultivo (Tabla 4), también demostró que
en CS hay una mejor y rápida oxidación de la glucosa, lo cual, nuevamente es soportado por los altos
valores de la MTPCO2 y µCO2. Esto se debe generalmente a la alta transferencia de oxígeno
observada en CS (Viniegra-González et al., 2003), que disminuye la RC y la inhibición por sustrato
(Maeda et al., 2004). Sin embargo, esta última afirmación no es totalmente cierta, ya que en ambos
cultivos, la µCO2 disminuyó al elevar la glucosa en el medio, semejante a lo reportado con A. niger
(Favela-Torres et al., 1998) y A. brasiliensis (Volke-Sepulveda et al., 2016). Con A. niger, la µ de
crecimiento disminuyó el 68% y 27% para el CL (30-200 g/L) y el CS (50-200 g/L), respectivamente.
En cuanto a A. brasiliensis, la µCO2 descendió el 50% en CS (Volke-Sepulveda et al., 2016), mientras
que, en nuestro estudio el descenso fue del 42 y el 38% para CL y CS, respectivamente. Estos
41
resultados sugieren que la inhibición por sustrato no es totalmente nula en CS (Volke-Sepulveda et
al., 2016).
A pesar de identificar una ligera inhibición por la concentración del sustrato en ambos
cultivos, las altas concentraciones favorecieron la producción de CO2, la cual resultó elevada en 120
y 180 g/L en CS; en cambio, la comparación de 60 g/L entre ambos cultivos, indican una menor
producción en CS, siendo 1.19 veces mayor en CL (Tabla 4); sin embargo, al comparar la máxima
producción de CO2 obtenida en CL con 120 y 180 g/L, resultó representar el 47.59% y 26.59% de lo
producido en estas dos condiciones, respectivamente. Incrementar la concentración de glucosa no
sólo favorece la producción de proteína, sino que también la producción de CO2 a una alta velocidad,
lo que indica un rápido crecimiento y consumo de glucosa por parte de A. brasiliensis.
Por lo tanto, los resultados de la producción de CO2 demostraron que el CS permite un

rápido crecimiento de A. brasiliensis, a pesar de las elevadas concentraciones de glucosa. También,
se demostró que elevar la glucosa a altas concentraciones en el medio en condiciones de CS favorece
la producción de metabolitos, como es el CO2 y la concentración de proteína, la cual es discutida en
la siguiente sección.
7.1.2. Morfología de crecimiento de A. brasiliensis en cultivos sólido y líquido

La secreción de proteína está relacionada con una alta producción de biomasa, pero a la vez, con un
alto nivel de ramificación de las hifas de los hongos filamentosos (Gomes et al., 2018). Lo que hace
que la morfología sea un parámetro relevante durante ciertos procesos, como la secreción de
proteína. Algunos reportes demostraron que la secreción de proteína es influenciada por el
crecimiento micelial que desarrollan los hongos filamentosos en CS (Cunha et al., 2012; Domingues
et al., 2000; Singhania et al., 2009). El CS favorece al crecimiento filamentoso para una mayor
colonización de la superficie sólida y penetración del micelio en el sustrato, invadiendo
completamente la matriz, facilitando así el consumo de nutrientes. Por otra parte, el crecimiento de
micelio aglomerado llamado pellet, desarrollado generalmente en CL, limita el transporte de
nutrientes provocando un metabolismo deficiente que evita el desarrollo de zonas apicales (Gomes
et al., 2018).
Ya establecidas las diferencias cinéticas y cuantificada la proteína extracelular (Figura 9) en

ambos cultivos, éstas fueron asociadas con cambios en el nivel de ramificación que presenta A.
brasiliensis en cada condición (Figura 9), por lo cual se evaluó el número de zonas apicales distales
42
a lo largo de una longitud determinada de hifa en ambos cultivos. Para el CL, se tomaron muestras
en forma pellet, y fueron fraccionadas. Por otro lado, la toma de muestras directamente de los
biorreactores (columnas de vidrio) del CS fue imposible, ya que el micelio sufría daño al momento
de extraerlo. Por lo que se realizaron microcultivos (ver sección 6.2.4.1) para el análisis
morfométrico de A. brasiliensis.
De manera cualitativa (Figura 8), el incremento de la concentración de glucosa indujo a una

mayor ramificación en las hifas de A. brasiliensis en CS, sobresaliendo la condición de 180 g/L;
mientras que, no se observaron diferencias entre las condiciones evaluadas en CL. Esto mismo es
observado cuantitativamente (Figura 9), a partir de la determinación del número de puntas por cada
100 µm de hifas terminales, lo que permitió identificar la relación que hay entre la ramificación y la
proteína secretada, bajo el efecto de la concentración de glucosa.
Figura 8. Ramificación de A. brasiliensis en cultivo sólido y líquido con tres concentraciones de glucosa en muestras tomadas al tiempo
de la máxima tasa de producción de CO2 (MTPCO2). Se utilizó el programa ImageJ modificando la imagen con el filtro Variance3D para
mejorar la definición de las hifas. Barra blanca =100 µm.
43
e
1.5 250
Puntas de hifas/100 µm
1.2 200
Proteína (µg/mL)
a ac
D
0.9 bc 150
C
b
0.6 100
B
0.3 50
A AB
A
0.0 0
0 50 100 150 200
Glucosa (g/L)
Figura 9. Nivel de ramificación de las hifas de A. brasiliensis y producción de proteína en función de la concentración de glucosa. Círculos
abiertos: concentración de proteína; círculos cerrados: nivel de ramificación; línea naranja: cultivo sólido; línea azul: cultivo líquido. Letras
diferentes indican diferencias significativas (ANOVA de un factor con prueba de rango múltiple de Duncan (α = 0.05)).
En CL, el nivel de ramificación descendió significativamente (18%) al elevar la concentración

a 60 g/L; mientras que la secreción de proteína incrementó sin presentar diferencias significativas
entre las tres condiciones (Figura 9). Por otra parte, existe una relación positiva entre la proteína
secretada y el nivel de ramificación en CS (Figura 9), ambas incrementaron el 237.47 y 76.31%,
respectivamente, al compararse 180 g/L con 60 g/L. Estos datos permitieron establecer que hay una
relación entre el nivel de ramificación y la secreción de proteína (Gomes et al., 2018), únicamente
en condiciones de CS. La independencia de estas dos variables en condiciones de CL, se ha reportado
por Bocking et al., (1999) usando A. oryzae; por el contrario, Neurospora crassa al encontrarse hiper-
ramificada favoreció la secreción de proteína en CL (Lee et al., 1998). Es importante considerar que
la secreción de proteína no es influenciada únicamente por el grado de ramificación, sino que,
también se ve afectada por cambios en la temperatura, la luz, perturbaciones/daños físicos, cambios
en la fuente de nutrientes, así como, la presencia de hifas adyacentes (Riquelme et al., 2011).
Se ha mencionado que en CS, hay un mayor interacción entre el soporte/medio con el hongo
(M. et al., 2016), lo que permite un crecimiento apical sobre y dentro de las partículas sólidas
sugiriendo un mayor desarrollo de puntas para la toma de nutrientes. Sin embargo, los resultados
obtenidos demuestran que el tipo de cultivo no afecta el nivel de ramificación y la cantidad de
proteína secretada bajo una misma concentración de glucosa inicial, como sucede con la producción
44
de CO2, previamente descrita. Por otra parte, las altas concentraciones de glucosa (120 y 180 g/L)
indujeron un mayor desarrollo de zonas de crecimiento apical a lo largo de la hifa, lo que podría
favorecer la alta secreción de proteína, la toma de nutrientes, la reproducción, así como, la fusión
de hifas para el intercambio de nutrientes y señalización entre hifas de la misma colonia (Gomes et
al., 2018; Harris, 2008). Variables externas como el pH, la temperatura, la agitación (Ahamed y
Vermette, 2009) y la deleción de genes (Wang et al., 2015) han sido manipuladas en ciertos hongos
filamentosos para el desarrollo de un mayor número de zonas apicales, incrementado así, la
concentración de proteína extracelular (Read, 2011). Se ha reportado que una mutante de A. oryzae
incrementa su ramificación al elevar la concentración de glucosa (Müller et al., 2002), así como, la
deleción de creA también hiper-ramificó las hifas de A. oryzae en un medio con glucosa a 40 g/L en
CL (Agger et al., 2002); y se demostró, que las hifas desarrollan una mayor ramificación en cultivo
superficial cuando se utiliza un medio rico en nutrientes que en un medio mínimo (Dynesen y
Nielsen, 2003).
A partir de la información reportada y de nuestros resultados, dos puntos fueron deducidos

por los cuales A. brasiliensis desarrolla hifas con un mayor grado de ramificación a altas
concentraciones de glucosa en CS. El primer punto, es que las altas concentraciones de nutrientes
estimulan la ramificación para lograr una mayor asimilación de éstos, así reduciendo la RC en CS
debido a un mayor número de sitios de contacto con la fuente de carbono; y segundo, que exista
una inactivación total o parcial del factor de transcripción CreA, permitiendo el incremento de la
ramificación, este factor de transcripción participa en la RC, sin embargo, no tiene un efecto
relevante en CS (Ichinose et al., 2018). El crecimiento apical no sólo es estimulado por los factores
mencionados, sino que también la acumulación de zinc o de ERO´s pueden tener un efecto sobre el
nivel de ramificación hifal (Harris, 2008). Además, se debe tener en cuenta que la secreción de
proteína también es realizada en los septos (Hayakawa et al., 2011), lo que indica que a mayor
longitud o número de hifas habrá mayor secreción.
Por lo tanto, las altas concentraciones de glucosa tuvieron un efecto positivo sobre la
producción de CO2, la concentración de proteína inicial y el nivel de ramificación de A. brasiliensis
en CS. Mientras que, a pesar de las diferencias físicas entre el CS y CL, no hay un efecto significativo
sobre las variables mencionadas comparando a 60 g/L para ambos cultivos; no obstante, la
expresión del perfil proteico es distinto para cada tipo de cultivo, los cuales son descritos en la
siguiente sección.
45
7.2. Separación unidimensional del secretoma de A. brasiliensis en cultivos sólido y líquido
Una vez establecidas algunas diferencias cinéticas y morfométricas de A. brasiliensis en CS y CL con
concentraciones crecientes de glucosa, se procedió al análisis del secretoma. Para ello, los extractos
extracelulares obtenidos en el tiempo de incubación en el que se alcanza la MTPCO2 para cada
condición fueron procesados para la preparación de muestras. Los perfiles electroforéticos de las
proteínas muestran reproducibilidad en las bandas de proteína en los carriles obtenidos para cada
concentración de glucosa y tipo de cultivo (Figura 10 y 11). Por lo que, las proteínas separadas en
cada uno de los carriles fueron procesadas para su análisis por espectrometría de masas (Ver Sección
6.6).
Figura 10. Separación de 50 µg de proteína extracelular proveniente de cultivo sólido en geles SDS-PAGE (T=12%), Voltaje a 300 V,
marcador de peso molecular: 10-250 kDa.
Figura 11. Separación de 50 µg de proteína extracelular proveniente de cultivo líquido en geles SDS-PAGE (T=12%), Voltaje a 300 V,
marcador de peso molecular: 10-250 kDa.
46
Adicionalmente, las proteínas presentes en CS se encuentran distribuidas entre 10 a 250
KDa; mientras que, en CL, no se observaron proteínas de bajo peso molecular (<20kDa). Las
proteínas extracelulares de A. terreus mostraron un comportamiento similar, las cuales se
encontraron entre 17 a 115 kDa en CS, mientras que, en CL, se presentó un menor número de
bandas que fue variable entre rangos cortos (M. et al., 2016). También, Liu et al., (2013) reportaron
un número bajo de bandas y una distribución dispersa a lo largo del carril de las proteínas
extracelulares de A. fumigatus en condiciones de CL.
Por lo tanto, podemos ver claramente que las diferencias entre los perfiles proteicos de
ambos sistemas se encuentran en el número y distribución de las bandas, por lo que se espera un
secretoma complejo de A. brasiliensis en condiciones de CS. Estas observaciones serán discutidas a
continuación, al comparar el secretoma de ambos tipos de cultivo.
7.3. Descripción del secretoma de A. brasiliensis en cultivo sólido y líquido

Una vez demostrada la reproducibilidad de los extractos extracelulares obtenidos en CS y CL con
concentraciones crecientes de glucosa en las réplicas biológicas y experimentales, se procedió al
análisis del secretoma obtenido en las diferentes condiciones de cultivo. Las secuencias de péptidos
obtenidas de las proteínas presentes en el extracto extracelular de ambos cultivos se compararon
con las de las bases de datos UniProt y NCBI, limitando la búsqueda a A. niger CBS 513.38 y A.
brasiliensis CBS 101740. Para lograr una mayor cantidad de información de cada una de las proteínas
identificadas, sus secuencias fueron analizadas en diversas bases de datos (Sección 6.7).
Los resultados demostraron que la secreción de proteínas por A. brasiliensis fue mayor en
CS que en CL (Figura 9), principalmente con 120 y 180 g/L. La concentración de proteína extracelular
en CS con concentraciones iniciales de glucosa de 120 y 180 g/L fue 1.7 y 3.4 veces mayor,
respectivamente, que la obtenida con 60 g/L. Por su parte, el análisis secretómico indicó que el
incremento de glucosa favoreció la secreción de una mayor diversidad de proteínas hasta 2.87 veces
mayor con 180 g/L que las obtenidas con 60 g/L. En CL, el número de proteínas identificadas en el
secretoma es significativamente menor que las identificadas en CS. En los medios con
concentraciones de glucosa inicial de 20 y 40 g/L el número de proteínas únicas fue 46 y 43,
respectivamente, aumentando hasta 56 proteínas en 60 g/L. La Figura 12 muestra las diferencias en
los patrones de secreción de las proteínas únicas. Para el caso del CL, sólo se identificaron proteínas
únicas con 20 y 60 g/L, teniendo el mayor número en 60 g/L. Mientras que, en CS, la identificación
de proteínas únicas está en función de la concentración de glucosa, teniendo el máximo número en
47
180 g/L. Nuestros resultados indican que existe una alta diversidad de proteínas en CS, lo que resulta
opuesto al primer estudio comparativo del secretoma de A. oryzae obtenido en CS y CL, realizado
por Oda et al., (2006). Ellos sugirieron mayor número de proteínas secretadas en CL, a partir de la
identificación de un mayor número de spots en 2D-PAGE. También, demostraron los distintos
mecanismos de secreción para cada cultivo, lo que hace que los perfiles de proteínas secretadas
sean distintos para cada cultivo. Una de las diferencias entre nuestro estudio y el reportado por Oda
et al., (2006) es el estado fisiológico del hongo, dicho estudio tomó la muestra al mismo tiempo de
cultivo, sin considerar que los perfiles de crecimiento son distintos entre ambos cultivos.
Figura 12. Diagrama de Venn del secretoma de A. brasiliensis ATCC9642 en cultivo líquido (imagen izquierda) y en cultivo sólido (imagen
derecha).
La Figura 13, muestra la relación positiva que hay entre el número de proteínas secretadas
en CS con la concentración de proteína inicial y con el nivel de ramificación de las hifas de A.
brasiliensis. En cambio, en CL, el número de proteínas identificadas es totalmente independiente de
estas variables, así como, de la concentración de glucosa inicial. Previamente, se mencionó que hay
una relación entre la concentración de proteína y la ramificación de las hifas, la cual incrementa a
mayor concentración de glucosa (Müller et al., 2002); sin embargo, algunos estudios no encontraron
una relación entre la concentración de proteína y el nivel de ramificación (Bocking et al., 1999),
como sucede en CL.
48
250 250
200 200
No. de proteínas
No. de proteínas
150 150
100 100
50 50
0 0
0 50 100 150 200 0.50 0.70 0.90 1.10 1.30 1.50
µg/mL No. de puntas/100µm
Figura 13. Número de proteínas identificadas en función de la concentración de glucosa inicial (imagen izquierda); número de proteínas
identificadas en función del nivel ramificación (imagen derecha). Círculos llenos (●): cultivo sólido; círculos vacíos (Ο): cultivo líquido.
El análisis secretómico identificó un total de 242 y 62 proteínas en CS y CL, respectivamente.

Estas proteínas se clasificaron como únicas, abundantes no reguladas y abundantes reguladas (Tabla
5). Esta clasificación permitió analizar el efecto del incremento de la concentración de glucosa sobre
el secretoma. A su vez, las proteínas se agruparon de acuerdo a la función principal establecida en
las bases de datos utilizadas (CS/CL): metabolismo de carbohidratos (74/28), redox/ estrés (35/9),
proceso/componente celular (26/6), proteínas/ proteólisis (21/5), aminoácidos (16/3), lípidos
(10/0), nucleótidos (8/0), energía (6/0), misceláneos (28/4) y proteínas no caracterizadas (20/7)
(Figura 14, Tabla 5 y Anexo 1).
a) b)
Carbohidratos Carbohidratos
Redox/estrés Redox/estrés
Proceso/componente… Miscelaneos
Metabolismo/proceso
Metabolismo/proceso
Proteínas/proteolisis Proceso/componente…
Miscelaneos Proteínas/proteolisis
Sin caracterizar Sin caracterizar
Aminoácidos Aminoácidos
Nucleotidos/… Cofactores/vitaminas
Lipidos Energía
Cofactores/vitaminas Lipidos
Energía Nucleotidos/…
0 20 40 60 80 0 10 20 30
Número de proteínas Número de proteínas
49
Figura 14. Metabolismo/proceso principal de las proteínas identificadas en ambos cultivos; a) cultivo sólido, b) cultivo líquido.
En ambos cultivos, un alto porcentaje de proteínas fue asociado con los metabolismos de
carbohidratos y redox/estrés. A diferencia de lo observado en CS, en CL no se identificaron proteínas
relacionadas con los metabolismos de energía, lípidos y nucleótidos. La cuantificación relativa
determinada por el valor CEP permitió tener una idea de la abundancia dentro del extracto
extracelular (Tabla 5, Anexo 2), e identificar cuales presentan una mayor abundancia para cada
metabolismo/función (Anexo 2). En resumen, la alta concentración de glucosa en CS favoreció la
secreción de proteína, tanto en concentración como en diversidad que, a su vez, se relacionaron
con un mayor índice de ramificación en CS que en CL. A continuación, se presenta información
detallada de las proteínas presentes en el secretoma de A. brasiliensis en ambos tipos de cultivo.
50
Tabla 5. Proteínas identificadas y clasificadas del secretoma de A. brasiliensis en cultivo líquido y sólido.
CEP CEP CEP Pend r2 de

a Metabolismo/ b c
Total
No. acceso Proteína No. E.C E/I Loc 20/60 40/120 60/180 (N) CEP
proceso CEP e
Sp/mL d Sp/mL d Sp/mL d CEP f (N) g
Proteínas únicas en CL (20 g/L)
XP_001392640.1 Endoglucanasa-4 Carbohidratos 3.2.1.4 E Extra 5.33E-07 0.00E+00 0.00E+00 5.33E-07 -1.50 0.75
XP_001400902.1 Endoglucanasa A Carbohidratos 3.2.1.4 E Extra 1.87E-06 0.00E+00 0.00E+00 1.87E-06 -1.50 0.75
XP_001399223.1 Endo-1,3(4)-β-glucanasa Carbohidratos 3.2.1.6 E Extra 7.94E-07 0.00E+00 0.00E+00 7.94E-07 -1.50 0.75
OJJ75131.1 HP ASPBRDRAFT_53082 ND Enzima E Extra 2.54E-07 0.00E+00 0.00E+00 2.54E-07 -1.50 0.75
Proteínas únicas en CL (60 g/L)
XP_001389342.1 Tirosinasa Aminoácidos 1.14.18.1 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 2.02E-06 2.02E-06 1.50 0.75
XP_001389884.1 L-asparaginasa Aminoácidos 3.5.1.1 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 1.29E-06 1.29E-06 1.50 0.75
XP_001391302.1 Malato deshidrogenasa Carbohidratos 1.1.1.37 E Mito 0.00E+00 0.00E+00 1.01E-06 1.01E-06 1.50 0.75
XP_001393626.1 α-amilasa Carbohidratos 3.2.1.1 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 6.52E-07 6.52E-07 1.50 0.75
XP_001389956.2 Glucan endo-1,6-β-glucosidasa BGN16.3 Carbohidratos 3.2.1.75 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 5.93E-07 5.93E-07 1.50 0.75
Proteína enriquecida en serina
XP_001400266.1 Carbohidratos E Extra 0.00E+00 0.00E+00 9.09E-07 9.09E-07 1.50 0.75
extracelular
OJJ66423.1 HP ASPBRDRAFT_49057 ND Enzima E Extra 0.00E+00 0.00E+00 1.90E-06 1.90E-06 1.50 0.75
OJJ78081.1 HP ASPBRDRAFT_167552 ND E Extra 0.00E+00 0.00E+00 1.44E-06 1.44E-06 1.50 0.75
XP_001389120.1 Proteína como reductasa Redox 1.1.1.- E Cito 0.00E+00 0.00E+00 2.39E-06 2.39E-06 1.50 0.75
Redox/Carbohidratos/
XP_001388595.1 Catalasa R 1.11.1.6 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 7.03E-07 7.03E-07 1.50 0.75
aminoácidos/estrés
XP_001394119.2 Aldehído reductasa 1 Redox/Lípidos 1.1.1.21 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.75E-06 1.75E-06 1.50 0.75
XP_001402471.1 Purina nucleósido permeasa Transporte/Procesos celulares E Extra 0.00E+00 0.00E+00 1.83E-06 1.83E-06 1.50 0.75
Proteínas únicas en CS (60 g/L)
XP_001395879.1 Inulinasa Carbohidratos 3.2.1.7 E Extra 8.22E-06 0.00E+00 0.00E+00 8.22E-06 -1.50 0.75
XP_001399078.1 Enolasa Carbohidratos 4.2.1.11 E Cito 1.60E-05 0.00E+00 0.00E+00 1.60E-05 -1.50 0.75
OJJ67062.1 HP ASPBRDRAFT_347736 ND E Extra 1.94E-04 0.00E+00 0.00E+00 1.94E-04 -1.50 0.75
OJJ66216.1 HP ASPBRDRAFT_138427 ND I Extra 5.47E-06 0.00E+00 0.00E+00 5.47E-06 -1.50 0.75
XP_001402325.1 Pectinesterasa A Carbohidratos 3.1.1.11 E Extra 0.00E+00 2.26E-05 0.00E+00 2.26E-05 0.00 0.00
XP_001397549.1 aldo/ceto reductasa Cofactores y vitaminas 1.1.1.65 I Cito 0.00E+00 3.31E-05 0.00E+00 3.31E-05 0.00 0.00
OJJ70333.1 Mono- y diacilglicerol lipasa Lípidos 3.1.1.34 E Extra 0.00E+00 5.96E-05 0.00E+00 5.96E-05 0.00 0.00
6-Fosfogluconato deshidrogenasa, Misceláneos/señalización/proceso
XP_001394208.2 1.1.1.44 I Cito 0.00E+00 5.41E-05 0.00E+00 5.41E-05 0.00 0.00
descarboxilante 1 celular/transporte
OJJ66777.1 HP ASPBRDRAFT_137377 ND E Extra 0.00E+00 1.12E-04 0.00E+00 1.12E-04 0.00 0.00
XP_001392987.1 Carboxipeptidasa Y Proteólisis 3.4.16.5 E Extra 0.00E+00 1.33E-05 0.00E+00 1.33E-05 0.00 0.00
XP_001401510.1 Endopeptidasa ctsD tipo aspártico Proteólisis/proteínas 3.4.23.1 E Extra 0.00E+00 1.75E-05 0.00E+00 1.75E-05 0.00 0.00
XP_001397476.1 CipB oxidorreductasa unión a zinc Redox 1.3.1.- E Cito 0.00E+00 2.92E-05 0.00E+00 2.92E-05 0.00 0.00
XP_001393985.2 Proteína Nrd1 unión a RNA Ácidos nucleicos E Nucl 0.00E+00 0.00E+00 4.23E-05 4.23E-05 1.50 0.75
GAQ45375.1 Proteína de reparación por escisión UV Ácidos nucleicos E Nucl 0.00E+00 0.00E+00 9.20E-05 9.20E-05 1.50 0.75
XP_001388823.2 antígeno nuclear de células proliferantes Ácidos nucleicos I Nucl 0.00E+00 0.00E+00 1.06E-04 1.06E-04 1.50 0.75
XP_001399877.1 Homoserina deshidrogenasa Aminoácidos 1.1.1.3 I Extra 0.00E+00 0.00E+00 2.65E-04 2.65E-04 1.50 0.75
XP_001392906.1 3-hidroxi-isobutirato deshidrogenasa Aminoácidos 1.1.1.31 I Mito 0.00E+00 0.00E+00 6.24E-05 6.24E-05 1.50 0.75
XP_001396334.2 aril-alcohol deshidrogenasa Aminoácidos 1.1.1.90 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 9.60E-04 9.60E-04 1.50 0.75
51
Metabolismo/ Total
No. acceso a Proteína No. E.C E/Ib Loc c 20/60 40/120 60/180 (N) CEP
proceso CEP e
XP_001402519.4 Tirosinasa Aminoácidos 1.14.18.1 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 5.74E-05 5.74E-05 1.50 0.75
XP_001396247.1 Fosforibosiltransferasa ATP Aminoácidos 2.4.2.17 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 4.76E-04 4.76E-04 1.50 0.75
Cito_
EHA19736.1 6-fosfogluconato deshidrogenasa Aminoácidos 2.4.2.28 I 0.00E+00 0.00E+00 7.64E-05 7.64E-05 1.50 0.75
Mito
XP_001398731.2 Similar a Glutatión S-transferasa Ure2 Aminoácidos 2.5.1.18 E Mito 0.00E+00 0.00E+00 3.36E-04 3.36E-04 1.50 0.75
1-(5-Fosforibosil)-5-[(5-
XP_001398393.1 Fosforibosilamino) metilideneamino] Aminoácidos 5.3.1.16 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 7.49E-05 7.49E-05 1.50 0.75
imidazola-4-carboxamida isomerasa
XP_001400684.1 Proteína de la familia alanina racemasa Aminoácidos Enzima E Mito 0.00E+00 0.00E+00 1.77E-04 1.77E-04 1.50 0.75
XP_001391209.1 Alcohol deshidrogenasa Carbohidratos 1.1.1.1 E Mito 0.00E+00 0.00E+00 9.11E-05 9.11E-05 1.50 0.75
XP_001397074.1 L-xilulosa reductasa Carbohidratos 1.1.1.10 E Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.11E-04 1.11E-04 1.50 0.75
XP_001391440.1 L-xilulosa reductasa Carbohidratos 1.1.1.10 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 2.50E-04 2.50E-04 1.50 0.75
XP_001390140.2 manitol 2-deshidrogenasa Carbohidratos 1.1.1.67 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 7.99E-05 7.99E-05 1.50 0.75
XP_001396580.2 Formato deshidrogenasa Carbohidratos 1.17.1.9 I Pero 0.00E+00 0.00E+00 1.60E-04 1.60E-04 1.50 0.75
XP_001397271.1 Riboquinasa Carbohidratos 2.7.1.15 E Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.56E-04 1.56E-04 1.50 0.75
XP_001388941.1 6-Fosfogluconolactonasa Carbohidratos 3.1.1.31 E Mito 0.00E+00 0.00E+00 6.13E-04 6.13E-04 1.50 0.75
XP_001395336.1 Feruloil esterasa C Carbohidratos 3.1.1.73 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 3.72E-04 3.72E-04 1.50 0.75
XP_001394024.1 β-glucosidasa M Carbohidratos 3.2.1.21 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 3.99E-05 3.99E-05 1.50 0.75
XP_001389622.1 β-galactosidasa E Carbohidratos 3.2.1.23 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 4.06E-05 4.06E-05 1.50 0.75
XP_001391662.1 Formamidasa Carbohidratos 3.5.1.49 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 9.04E-05 9.04E-05 1.50 0.75
XP_001397850.1 Glucosa-6-fosfato isomerasa Carbohidratos 5.3.1.9 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.42E-04 1.42E-04 1.50 0.75
HP ASPBRDRAFT_56532/
OJJ70774.1 Carbohidratos 5.4.2.8 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.32E-04 1.32E-04 1.50 0.75
Fosfomanomutasa
XP_001402447.1 Inositol-3-fosfato sintasa Carbohidratos 5.5.1.4 E Cito 0.00E+00 0.00E+00 7.43E-05 7.43E-05 1.50 0.75
Nucl/
OJJ74849.1 HP ASPBRDRAFT_40067 Carbohidratos Enzima I Cito_ 0.00E+00 0.00E+00 5.27E-04 5.27E-04 1.50 0.75
nucl
Carbohidratos/Lípidos/Cofactores
XP_001393983.1 Citrato sintasa 2.3.3.16 I Pero 0.00E+00 0.00E+00 5.24E-05 5.24E-05 1.50 0.75
y vitaminas
Subunidad reguladora de la proteína
XP_001397686.1 Carbohidratos/proteínas E Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.26E-04 1.26E-04 1.50 0.75
quinasa dependiente de AMPc
XP_001392218.1 Aminotransferasa, clase V Cofactores y vitaminas 2.6.1.- I Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.63E-04 1.63E-04 1.50 0.75
Proteína relacionada a tiamina
XP_001388657.1 Cofactores y vitaminas 2.7.6.2 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.42E-04 1.42E-04 1.50 0.75
pirofosfoquinasa
Proteína de la familia fosfato
XP_001401701.1 Cofactores y vitaminas 2.7.7.3 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 9.31E-05 9.31E-05 1.50 0.75
adeniltransferasa-panteteína
OJJ71066.1 HP ASPBRDRAFT_126631 Cofactores y vitaminas E Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.37E-04 1.37E-04 1.50 0.75
Cofactores y
XP_001390926.2 Oxidorreductasa dependiente de FAD 1.5.1.37 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.28E-04 1.28E-04 1.50 0.75
vitaminas/misceláneos
Componente Sec8 del complejo de
XP_001390302.2 Componente celular I Nucl 0.00E+00 0.00E+00 6.06E-05 6.06E-05 1.50 0.75
exocitosis
OJJ65940.1 HP ASPBRDRAFT_35578 Componente celular I Plas 0.00E+00 0.00E+00 3.37E-05 3.37E-05 1.50 0.75
Cito/
OJJ74700.1 HP ASPBRDRAFT_459120 Energía Enzima I 0.00E+00 0.00E+00 1.50E-04 1.50E-04 1.50 0.75
Golg
XP_001392647.1 Hsp88 estrés /ácidos núcleicos I Cito 0.00E+00 0.00E+00 2.57E-05 2.57E-05 1.50 0.75
XP_001398224.1 Hsp estrés /Aminoácidos I Cito 0.00E+00 0.00E+00 3.25E-04 3.25E-04 1.50 0.75
52
Metabolismo/ Total
proceso CEP e
XP_001392293.1 Glicerol dehydrogenasa Gcy1 Lípidos 1.1.1.- E Cito 0.00E+00 0.00E+00 5.53E-05 5.53E-05 1.50 0.75
XP_001393532.1 Lipasa Lípidos 3.1.1.3 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 8.33E-05 8.33E-05 1.50 0.75
XP_001393442.1 Lisofosfolipasa 1 Lípidos 3.1.1.5 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 1.32E-04 1.32E-04 1.50 0.75
XP_001393366.1 2-ácido haloalcanoico deshalogenasa Misceláneos 3.8.1.2 I Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.17E-04 1.17E-04 1.50 0.75
HP ASPBRDRAFT_38420 /Regulador de Misceláneos /cofactores y
OJJ76051.1 I Mito 0.00E+00 0.00E+00 1.71E-04 1.71E-04 1.50 0.75
transcripción PAB1642 vitaminas
OJJ78194.1 HP ASPBRDRAFT_203008 ND Enzima E Extra 0.00E+00 0.00E+00 4.85E-05 4.85E-05 1.50 0.75
OJJ70000.1 HP ASPBRDRAFT_56749 ND Enzima E Mito 0.00E+00 0.00E+00 1.85E-04 1.85E-04 1.50 0.75
OJJ75701.1 HP ASPBRDRAFT_38007 ND Enzima I Mito 0.00E+00 0.00E+00 4.80E-04 4.80E-04 1.50 0.75
XP_001393389.1 HP ANI_1_54084 ND E Cito 0.00E+00 0.00E+00 2.88E-04 2.88E-04 1.50 0.75
Cito_
OJJ68162.1 HP ASPBRDRAFT_33455 ND E 0.00E+00 0.00E+00 2.22E-04 2.22E-04 1.50 0.75
Mito
OJJ69948.1 HP ASPBRDRAFT_45261 ND E Cito 0.00E+00 0.00E+00 2.94E-04 2.94E-04 1.50 0.75
OJJ74684.1 HP ASPBRDRAFT_39873 ND I Cito 0.00E+00 0.00E+00 2.94E-04 2.94E-04 1.50 0.75
OJJ75468.1 HP ASPBRDRAFT_51220 ND E Cito 0.00E+00 0.00E+00 2.31E-04 2.31E-04 1.50 0.75
Cito_
XP_001391100.1 HP ANI_1_8064 ND I 0.00E+00 0.00E+00 7.46E-04 7.46E-04 1.50 0.75
nucl
OJJ70578.1 HP ASPBRDRAFT_128823 ND I Mito 0.00E+00 0.00E+00 2.12E-04 2.12E-04 1.50 0.75
OJJ68161.1 HP ASPBRDRAFT_199302 ND I Cysk 0.00E+00 0.00E+00 1.75E-04 1.75E-04 1.50 0.75
XP_001396184.1 Uridilato quinasa Nucleótidos 2.7.4.14 I Nucl 0.00E+00 0.00E+00 1.23E-04 1.23E-04 1.50 0.75
XP_001392148.1 Guanilato quinasa Nucleótidos 2.7.4.8 I Mito 0.00E+00 0.00E+00 2.26E-04 2.26E-04 1.50 0.75
XP_001393901.1 uracil-DNA glycosilasa Nucleótidos 3.2.2.27 E Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.48E-04 1.48E-04 1.50 0.75
Proteína de la familia dienelactona
XP_001399596.1 Proceso celular Enzima I Cito 0.00E+00 0.00E+00 3.02E-04 3.02E-04 1.50 0.75
hidrolasa
XP_001393178.1 Proceso celular Enzima E Cito 0.00E+00 0.00E+00 3.15E-04 3.15E-04 1.50 0.75
hidrolasa
XP_001399260.2 Proteína crn1 similar a coronina Proceso celular E Mito 0.00E+00 0.00E+00 6.08E-05 6.08E-05 1.50 0.75
XP_001401121.1 Proteína de control celular (Cwf8) Proceso celular E Cito 0.00E+00 0.00E+00 9.51E-05 9.51E-05 1.50 0.75
Proteína en defectuosa nedilación de
XP_001402270.2 Proceso celular I Mito 0.00E+00 0.00E+00 1.57E-04 1.57E-04 1.50 0.75
culina 1
OJJ73826.1 HP ASPBRDRAFT_120976 Proceso celular E Cito 0.00E+00 0.00E+00 8.59E-05 8.59E-05 1.50 0.75
XP_001397530.1 epóxido hidrolasa Proteínas 3.3.2.9 I Mito 0.00E+00 0.00E+00 1.30E-04 1.30E-04 1.50 0.75
XP_001400609.1 Disulfuro isomerasa Proteínas 5.3.4.1 E Extra 0.00E+00 0.00E+00 7.35E-05 7.35E-05 1.50 0.75
Cito_
XP_001399237.1 X-Pro dipeptidil-peptidasa (Familia S15) Proteólisis 3.4.14.5 E 0.00E+00 0.00E+00 4.86E-05 4.86E-05 1.50 0.75
nucl
XP_001396351.1 Endopeptidasa opsB tipo aspártico Proteólisis 3.4.23.- E Extra 0.00E+00 0.00E+00 5.93E-05 5.93E-05 1.50 0.75
XP_001388485.2 Endopeptidasa aspártica AP1 Proteólisis 3.4.23.12 E Nucl 0.00E+00 0.00E+00 6.93E-05 6.93E-05 1.50 0.75
OJJ66423.1 HP ASPBRDRAFT_49057 Proteólisis/proteínas Enzima E Extra 0.00E+00 0.00E+00 2.30E-04 2.30E-04 1.50 0.75
XP_001388583.1 Proteína dominio de unión a FAD Redox 1.5.3.- E Extra 0.00E+00 0.00E+00 1.03E-04 1.03E-04 1.50 0.75
XP_001389279.1 Tiorredoxina reductasa Redox 1.8.1.9 E Cito 0.00E+00 0.00E+00 1.43E-04 1.43E-04 1.50 0.75
XP_001391200.1 Glutatión S-transferasa Redox/estrés/aminoácidos 2.5.1.18 I Mito 0.00E+00 0.00E+00 2.01E-04 2.01E-04 1.50 0.75
XP_001397810.1 Proteína vip1 Señalización E Nucl 0.00E+00 0.00E+00 1.19E-04 1.19E-04 1.50 0.75
Proteínas abundantes no reguladas en CS
60 y 120 g/L
53
Metabolismo/ Total
proceso CEP e
XP_001394158.2 Glucanasa de pared celular Carbohidratos Enzima E Extra 1.27E-05 2.65E-05 0.00E+00 3.92E-05 -0.72 0.23
XP_001398728.2 Multicobre oxidase Misceláneos 1.10.-.- E Extra 1.20E-05 2.33E-05 0.00E+00 3.53E-05 -0.77 0.27
XP_001389767.1 Lacasa-1 Redox 1.10.3.2 E Extra 9.85E-06 1.09E-05 0.00E+00 2.08E-05 -1.35 0.67
60, 120 y 180 g/L
XP_001402053.1 α-glucosidasa Carbohidratos 3.2.1.20 E Extra 8.56E-05 7.12E-05 2.63E-04 4.20E-04 1.01 0.69
OJJ70100.1 HP ASPBRDRAFT_45424 /Isopululanasa Carbohidratos 3.2.1.57 E Extra 1.24E-04 1.10E-04 2.48E-04 4.82E-04 0.75 0.66
OJJ73275.1 HP ASPBRDRAFT_40942/ Nitrilasa Proceso celular /carbohidratos 3.5.5.1 E Mito 2.86E-05 1.04E-03 6.88E-04 1.75E-03 0.96 0.42
Proceso celular /energía
GAQ46904.1 YkgB E Extra 1.25E-03 9.33E-04 3.03E-03 5.21E-03 0.88 0.62
/aminoácidos
Redox/estrés/señalización/
OJJ67831.1 HP ASPBRDRAFT_134466 1.2.3.- E Extra 6.16E-05 5.60E-05 1.14E-04 2.32E-04 0.69 0.67
trasducción
60 y 180 g/L
XP_001391138.1 Glucosa oxidasa Carbohidratos/redox 1.1.3.4 E Extra 9.86E-06 0.00E+00 4.39E-05 5.38E-05 1.16 0.55
Proteínas abundantes no reguladas en CL
20 y 40 g/L
XP_001388522.1 Endo-1,4-β-xilanasa A Carbohidratos 3.2.1.8 E Extra 5.06E-06 1.53E-05 0.00E+00 2.03E-05 -0.50 0.11
20, 40 y 60 g/L
AGI04246.1 Glucosa oxidasa Carbohidratos 1.1.3.4 E Nucl 3.49E-06 2.16E-06 5.81E-06 1.15E-05 0.60 0.39
XP_001398728.2 Multicobre oxidase Redox 1.10.-.- E Extra 5.58E-07 5.02E-07 6.95E-07 1.75E-06 0.30 0.48
Redox/carbohidratos/aminoácidos
XP_001388621.1 Catalasa R 1.11.1.6 E Extra 2.29E-06 1.71E-06 2.72E-06 6.72E-06 0.23 0.17
/estrés
HP ASPBRDRAFT_42048 /
OJJ72358.1 Cofactores y vitaminas 1.5.3.6 E Extra 8.47E-07 6.72E-07 1.31E-06 2.83E-06 0.53 0.49
D-6-hidroxinicotina oxidasa
XP_001399628.1 Endopoligalacturonasa C Carbohidratos 3.2.1.15 E Extra 3.89E-06 5.49E-06 3.81E-06 1.32E-05 -0.02 0.00
XP_001398816.1 β-glucosidasa A Carbohidratos 3.2.1.21 E Extra 9.76E-07 5.25E-07 5.93E-07 2.09E-06 -0.59 0.62
XP_001390530.1 Glucoamilasa Carbohidratos 3.2.1.3 E Extra 2.08E-04 5.42E-05 7.45E-05 3.37E-04 -0.96 0.64
XP_001390410.1 Glucan endo-1,3-β-glucosidasa eglC Carbohidratos 3.2.1.39 E Extra 1.46E-05 6.26E-06 1.05E-05 3.14E-05 -0.42 0.24
XP_001397982.2 Endoglucanasa A Carbohidratos 3.2.1.4 E Extra 2.76E-06 8.38E-07 1.05E-06 4.65E-06 -0.93 0.66
XP_001389998.1 α-L-arabinofuranosidasa axhA Carbohidratos 3.2.1.55 E Extra 6.26E-06 7.05E-06 6.79E-06 2.01E-05 0.11 0.43
XP_001392475.1 Glucan 1,3-β-glucosidasa Carbohidratos 3.2.1.58 E Extra 8.47E-07 7.11E-07 9.70E-07 2.53E-06 0.19 0.23
XP_001389996.2 Endo-1,4-β-xilanasa F1 Carbohidratos 3.2.1.8 E Extra 9.27E-06 8.40E-06 1.15E-05 2.92E-05 0.29 0.49
XP_001390847.1 Tripeptidil-peptidasa sed2 Proteólisis/transporte Enzima E Extra 1.20E-06 1.29E-06 1.18E-06 3.67E-06 -0.03 0.04
Celulasa extracelular CelA/Alérgeno Asp
GAQ44118.1 Carbohidratos Enzima E Mito 4.07E-07 4.02E-07 4.09E-07 1.22E-06 0.01 0.04
F7
XP_001394158.2 Glucanasa de pared celular Carbohidratos Enzima E Extra 1.73E-06 1.37E-06 1.93E-06 5.04E-06 0.16 0.13
OJJ67200.1 HP ASPBRDRAFT_59193 Misceláneos Enzima E Extra 1.64E-06 6.69E-07 1.17E-06 3.48E-06 -0.43 0.23
XP_001394372.1 Proteína de dominio de unión a FAD Redox Enzima E Extra 2.84E-06 5.75E-07 1.01E-06 4.43E-06 -0.96 0.58
OJJ73062.1 HP ASPBRDRAFT_53305 ND E Extra 5.00E-06 1.23E-05 9.30E-06 2.66E-05 0.52 0.34
20 y 60 g/L
XP_001402325.1 Pectinesterasa A Carbohidratos 3.1.1.11 E Extra 1.32E-06 0.00E+00 6.65E-07 1.98E-06 -0.74 0.25
OJJ74465.1 HP ASPBRDRAFT_27493 ND Enzima E Extra 2.12E-06 0.00E+00 1.45E-06 3.57E-06 -0.47 0.09
40 y 60 g/L
OJJ71409.1 HP ASPBRDRAFT_127351 ND E Cito 0.00E+00 1.97E-05 1.78E-05 3.76E-05 1.36 0.67
Proteínas reguladas en CS
54
Metabolismo/ Total
proceso CEP e
120 y 180 g/L
1,2-dihidroxi-3-ceto-5-metiltiopenteno
XP_001396639.1 Aminoácidos 1.13.11.54 I Cito 0.00E+00 3.61E-05 3.35E-04 3.71E-04 1.50 0.83
dioxigenasa
XP_001389935.1 Tirosinasa Aminoácidos 1.14.18.1 E Extra 0.00E+00 2.16E-05 1.35E-04 1.57E-04 1.50 0.87
Aminotransferasa de aminoácidos de
XP_001401406.1 Aminoácidos 2.6.1.42 I Mito 0.00E+00 5.18E-05 1.48E-04 2.00E-04 1.50 0.97
cadena ramificada
XP_001397565.2 treonina sintasa Aminoácidos 4.2.3.1 I Mito 0.00E+00 6.65E-05 3.23E-04 3.90E-04 1.50 0.90
XP_001402432.1 Celobiosa deshidrogenasa Carbohidratos 1.1.99.18 E Extra 0.00E+00 7.92E-06 2.56E-05 3.36E-05 1.50 0.95
Glucosamina 6-fosfato N-
XP_001395835.2 Carbohidratos 2.3.1.4 I Cie 0.00E+00 1.29E-04 1.19E-03 1.32E-03 1.50 0.83
acetiltransferasa
XP_001395912.1 Glucoquinasa Carbohidratos 2.7.1.2 I Cito 0.00E+00 6.31E-05 5.76E-04 6.39E-04 1.50 0.83
GAQ45768.1 α-galactosidasa C Carbohidratos 3.2.1.22 E Extra 0.00E+00 1.50E-05 6.53E-05 8.03E-05 1.50 0.91
XP_001390419.1 Precursor endoglucanasa-1 Carbohidratos 3.2.1.4 E Extra 0.00E+00 3.83E-05 8.48E-05 1.23E-04 1.50 1.00
3.2.1.4
XP_001395335.2 Endoglucanasa Carbohidratos E Extra 0.00E+00 5.23E-05 1.60E-04 2.13E-04 1.50 0.96
3.2.1.176
XP_001396769.1 α-N-arabinofuranosidasa B Carbohidratos 3.2.1.55 E Extra 0.00E+00 3.92E-05 2.31E-04 2.70E-04 1.50 0.87
XP_001388482.1 α-N-arabinofuranosidase A Carbohidratos 3.2.1.55 E Extra 0.00E+00 1.92E-05 9.98E-05 1.19E-04 1.50 0.89
XP_001400449.2 exo-β-1,3-glucanasa Carbohidratos 3.2.1.58 E Extra 0.00E+00 1.56E-05 7.85E-05 9.41E-05 1.50 0.89
XP_001389956.2 glucan endo-1,6-β -glucosidasa BGN16.3 Carbohidratos 3.2.1.75 E Extra 0.00E+00 2.46E-05 6.21E-05 8.67E-05 1.50 0.99
OJJ67369.1 β-xilanasa Carbohidratos 3.2.1.8 E Extra 0.00E+00 1.22E-04 4.17E-04 5.39E-04 1.50 0.95
XP_001396893.2 endo-arabinasa Carbohidratos 3.2.1.99 E Extra 0.00E+00 5.83E-05 6.26E-04 6.84E-04 1.50 0.82
XP_001396717.2 2-metilcitrato deshidratasa Carbohidratos 4.2.1.79 E Mito 0.00E+00 3.87E-05 1.14E-04 1.53E-04 1.50 0.97
XP_001401742.1 aldosa 1-epimerasa Carbohidratos 5.1.3.15 E Mito 0.00E+00 1.18E-04 5.05E-04 6.23E-04 1.50 0.91
XP_001390334.1 Hidrolasa de la superfamilia HAD Carbohidratos 5.4.2.- I Cito 0.00E+00 1.85E-04 8.07E-04 9.92E-04 1.50 0.91
XP_001401157.2 Glicosil hidrolasa de pared celular YteR Carbohidratos Enzima E Extra 0.00E+00 3.77E-05 1.35E-04 1.73E-04 1.50 0.94
OJJ66437.1 HP ASPBRDRAFT_49077 /Quitinasa Carbohidratos/aminoácido Enzima E Extra 0.00E+00 3.75E-05 2.66E-04 3.03E-04 1.50 0.85
Carbohidratos/cofactores y
XP_001399898.1 Fosfoglucomutasa 5.4.2.2 E Cito 0.00E+00 1.92E-04 1.08E-03 1.28E-03 1.50 0.88
vitaminas/redox
OJJ68333.1 HP ASPBRDRAFT_58357 Componente celular E Plas 0.00E+00 1.97E-05 1.81E-04 2.00E-04 1.50 0.83
XP_001391393.1 S-formilglutatión hidrolasa Energía 3.1.2.12 E Mito 0.00E+00 1.93E-05 1.84E-04 2.04E-04 1.50 0.83
XP_001397234.1 cianato hidratasa Energía 4.2.1.104 I Pero 0.00E+00 1.57E-04 1.13E-03 1.29E-03 1.50 0.85
XP_001396780.2 Proteína similar de la familia nmrA Energía E Mito 0.00E+00 3.51E-05 3.80E-04 4.16E-04 1.50 0.82
Energía/carbohidratos/
XP_001401521.1 difosfomevalonato descarboxilasa 4.1.1.33 E Cito 0.00E+00 2.91E-05 2.16E-04 2.45E-04 1.50 0.85
aminoácidos/estrés
XP_001401891.1 Familia dominio Aha1 estrés E Cito 0.00E+00 6.06E-05 2.50E-04 3.10E-04 1.50 0.92
XP_001392074.2 Hsp estrés /Aminoácidos I Cito 0.00E+00 3.01E-04 2.06E-03 2.36E-03 1.50 0.86
Glutamato deshidrogenasa específica de
XP_001401464.1 estrés /procesos celulares 1.4.1.2 E Cito 0.00E+00 1.80E-04 3.05E-04 4.85E-04 1.50 0.99
NADP
XP_001392486.1 ADP- factor ribosilación estrés /proteínas I Mito 0.00E+00 6.54E-05 2.93E-04 3.58E-04 1.50 0.91
XP_001391137.1 Precursor de Lipasa 1 Lípidos 3.1.1.3 E Extra 0.00E+00 1.56E-05 4.89E-05 6.46E-05 1.50 0.96
XP_001399436.1 Proteína de la familia de unión a acil CoA Lípidos I Cito 0.00E+00 1.28E-04 5.92E-04 7.21E-04 1.50 0.90
2.5.1.1;
XP_001400163.1 Geraniltranstransferasa Misceláneos I Cito 0.00E+00 2.36E-05 1.73E-04 1.96E-04 1.50 0.85
2.5.1.10
XP_001397406.1 Proteína de la familia thiJ/PfpI Misceláneos 3.4.-.- E Cito 0.00E+00 9.53E-05 4.11E-04 5.07E-04 1.50 0.91
XP_001395965.2 Misceláneos Enzima E Cito 0.00E+00 3.83E-05 2.44E-04 2.83E-04 1.50 0.86
hidrolasa
55
Metabolismo/ Total
proceso CEP e
OJJ71705.1 Misceláneos Enzima E Extra 0.00E+00 6.74E-05 3.31E-04 3.99E-04 1.50 0.90
Glucanasa de pared de celular
Homeostasis de calcio proteína
XP_001401709.1 Misceláneos I Cito 0.00E+00 2.95E-05 2.05E-04 2.35E-04 1.50 0.86
Regucalcina
XP_001391915.2 Alérgeno Asp f 4 Misceláneos E Extra 0.00E+00 3.64E-04 1.39E-03 1.76E-03 1.50 0.93
XP_001388959.2 Alérgeno menor Alt a 7 Misceláneos /nucleótidos 1.6.5.- E Extra 0.00E+00 8.58E-05 3.37E-04 4.22E-04 1.50 0.93
XP_001391760.1 Dihidrolipoil deshidrogenasa Misceláneos /procesos celulares 1.8.1.4 I Mito 0.00E+00 2.65E-05 4.15E-05 6.80E-05 1.50 0.98
Factor de iniciación de la traducción
XP_001398409.1 Misceláneos /virucidad I Cito 0.00E+00 1.13E-04 6.04E-04 7.18E-04 1.50 0.88
eucariota 6
OJJ66434.1 HP ASPBRDRAFT_666063 ND E Extra 0.00E+00 8.43E-05 1.47E-03 1.56E-03 1.50 0.79
OJJ67239.1 Nucleótidos 2.4.2.10 E Mito 0.00E+00 4.30E-05 4.19E-04 4.62E-04 1.50 0.83
Orotato fosforibosiltransferasa
XP_001398362.1 Adenosina quinasa Nucleótidos 2.7.1.20 I Cito 0.00E+00 1.11E-04 5.63E-04 6.74E-04 1.50 0.89
XP_001393898.1 Nucleósido difosfato quinasa Nucleótidos 2.7.4.6 I Cito 0.00E+00 1.35E-04 4.07E-04 5.42E-04 1.50 0.96
XP_001390332.1 ADP-ribosa pirofosfatasa Nucleótidos 3.6.1.13 I Nucl 0.00E+00 5.36E-05 3.01E-04 3.54E-04 1.50 0.88
XP_001395432.1 orotidina 5'-fosfato descarboxilasa Nucleótidos 4.1.1.23 I Mito 0.00E+00 3.65E-05 3.24E-04 3.60E-04 1.50 0.83
Proteína similar a esferulina de superficie
XP_001400262.1 Proceso celular E Extra 0.00E+00 2.47E-05 1.56E-04 1.81E-04 1.50 0.87
celular 4
XP_001388668.1 Factor de maduración glial Proceso celular I Nucl 0.00E+00 1.18E-04 5.96E-04 7.14E-04 1.50 0.89
XP_001399080.1 Proteína 14-3-3 Proceso celular I Nucl 0.00E+00 7.30E-05 2.48E-04 3.21E-04 1.50 0.95
XP_001394989.2 Proteína endocitosis end4 Proceso celular I Nucl 0.00E+00 1.30E-05 3.47E-05 4.76E-05 1.50 0.98
Proteína relacionada con Ras Rab-7a/
XP_001398680.2 Proceso celular /energía 3.1.5.1 I Mito 0.00E+00 5.52E-05 2.33E-04 2.88E-04 1.50 0.92
dGTPasa
Proceso celular /proceso
OJJ74465.1 HP ASPBRDRAFT_27493 Enzima E Extra 0.00E+00 4.85E-05 4.63E-04 5.11E-04 1.50 0.83
metabólico
Cito_
XP_001393994.1 Proteína ypt1 de unión a GTP Proceso celular /redox Enzima E 0.00E+00 1.60E-04 3.27E-04 4.87E-04 1.50 1.00
nucl
Cito_
XP_001389030.1 Proteína relacionada con Ras Rab-11A Proceso celular /transporte Enzima I 0.00E+00 9.13E-05 1.84E-04 2.75E-04 1.50 1.00
nucl
XP_001401404.1 Dipeptidil peptidasa III Proteólisis 3.4.14.4 I Cito 0.00E+00 9.14E-05 5.49E-04 6.41E-04 1.50 0.87
XP_001401570.2 peptidil-prolil cis-trans isomerasa B Proteólisis 5.2.1.8 E Extra 0.00E+00 3.90E-05 1.69E-04 2.08E-04 1.50 0.91
XP_001401759.1 Aminopeptidasa 2 Proteólisis/proteínas 3.4.11.- I Pero 0.00E+00 2.34E-05 7.11E-04 7.35E-04 1.50 0.77
XP_001393995.2 Aminopeptidasa Proteólisis/proteínas 3.4.11.- I Cito 0.00E+00 1.67E-05 2.61E-04 2.78E-04 1.50 0.80
XP_001390068.2 Aminopeptidasa Y Proteólisis/proteínas 3.4.11.15 E Extra 0.00E+00 1.67E-05 6.70E-05 8.37E-05 1.50 0.92
XP_001395660.1 Serina carboxipeptidasa extracelular Proteólisis/proteínas 3.4.14.2 E Extra 0.00E+00 1.92E-05 5.07E-05 6.99E-05 1.50 0.98
XP_001401653.1 Aminopeptidasa C Proteólisis/proteínas 3.4.22.40 E Cito 0.00E+00 4.94E-05 2.15E-04 2.65E-04 1.50 0.91
HP ASPBRDRAFT_132450 /Proteína de
OJJ69179.1 familia de dominio conservado de factor Proteólisis/proteínas E Cito 0.00E+00 4.00E-05 1.21E-04 1.61E-04 1.50 0.96
de elongación 1
XP_001393937.1 Aspartil aminopeptidasa vacuolar Lap4 Proteólisis/transporte 3.4.11.- E Mito 0.00E+00 1.24E-05 2.08E-04 2.20E-04 1.50 0.79
XP_001390256.1 Lacasa-1 Redox 1.10.3.2 E Extra 0.00E+00 2.28E-05 9.64E-05 1.19E-04 1.50 0.92
XP_001390822.1 Lacasa-1 Redox 1.10.3.2 E Extra 0.00E+00 4.22E-05 1.44E-04 1.86E-04 1.50 0.95
XP_001390247.2 Glutatión reductasa Redox 1.8.1.7 I Mito 0.00E+00 2.17E-05 3.37E-04 3.59E-04 1.50 0.80
56
Metabolismo/ Total
proceso CEP e
XP_001398917.1 Rho inhibidor de disociación de GDP Redox E Cito 0.00E+00 4.15E-05 4.88E-04 5.30E-04 1.50 0.81
Porfobilinógeno desaminasa / 4.2.1.24-
XP_001398757.1 Redox/aminoácidos I Mito 0.00E+00 1.00E-04 7.44E-04 8.44E-04 1.50 0.85
hidroximetilbilano sintasa 2.5.1.61
XP_001388687.1 Tiorredoxina Redox/carbohidratos 1.8.4.10 I Cito 0.00E+00 3.31E-04 1.03E-03 1.36E-03 1.50 0.96
Epimerasa dependiente de NAD/Proteína
XP_001397790.1 Redox/Carbohidrato/aminoácido Enzima I Cito 0.00E+00 6.98E-05 3.62E-04 4.32E-04 1.50 0.89
de la familia deshidratasa
XP_001401851.1 Superóxido dismutasa [Mn] Redox/estrés 1.15.1.1 E Mito 0.00E+00 1.78E-04 4.13E-04 5.91E-04 1.50 0.99
XP_001397405.1 Peroxirredoxina pmp20 Redox/estrés 1.11.1.15* E Cito 0.00E+00 7.80E-05 4.15E-04 4.93E-04 1.50 0.89
Cito_
XP_001393974.1 Hsp 90 Redox/lípidos I 0.00E+00 2.30E-05 8.81E-05 1.11E-04 1.50 0.93
nucl
XP_001401635.1 Aldehído reductasa 1 Redox/proceso celular 1.1.1.184 I Cito 0.00E+00 2.52E-05 1.02E-04 1.27E-04 1.50 0.92
OJJ71117.1 HP ASPBRDRAFT_179180 /Peroxidasa Redox/señalización 1.11.1.- E Mito 0.00E+00 2.70E-05 1.61E-04 1.88E-04 1.50 0.87
60, 120 y 180 g/L
XP_001389342.1 Tirosinasa Aminoácidos 1.14.18.1 E Extra 5.76E-05 1.31E-04 6.55E-04 8.44E-04 1.37 0.84
5-Metiltetrahidropteroiltriglutamato-β-
XP_001401543.1 Aminoácidos 2.1.1.14 I Mito 1.84E-05 1.12E-04 7.45E-04 8.75E-04 1.46 0.84
homocisteína metilltransferasa
2.5.1.16;
XP_001392771.2 Espermidina sintasa Aminoácidos I Nucl 1.02E-05 5.25E-05 1.05E-03 1.11E-03 1.49 0.78
2.5.1.22
XP_001391302.1 Malato deshidrogenasa Carbohidratos 1.1.1.37 E Mito 9.25E-05 3.65E-04 3.99E-03 4.44E-03 1.47 0.80
AGI04246.1 Glucosa oxidasa Carbohidratos 1.1.3.4 E Nucl 1.65E-04 4.33E-04 1.48E-03 2.08E-03 1.33 0.90
XP_001391467.1 Transaldolasa Carbohidratos 2.2.1.2 I Cito 1.48E-04 2.09E-03 1.23E-02 1.46E-02 1.48 0.87
OJJ74329.1 Probable manosil-oligosacárido Carbohidratos 3.2.1.- E Extra 5.46E-05 7.42E-05 2.70E-04 3.99E-04 1.20 0.82
α-1,2-mannosidase 1B
XP_001393626.1 α-amilasa Carbohidratos 3.2.1.1 E Extra 7.30E-05 1.12E-04 5.52E-04 7.37E-04 1.30 0.81
XP_001397301.1 α-amilasa Carbohidratos 3.2.1.1 E Extra 8.31E-06 1.80E-05 4.83E-05 7.47E-05 1.24 0.92
GAQ42198.1 ácida α-amilasa estable Carbohidratos 3.2.1.1 E Plas 2.01E-05 7.69E-05 1.44E-04 2.41E-04 1.29 1.00
XP_001400489.2 Familia 18 Glicosil hidrolasa/quitinasa Carbohidratos 3.2.1.14 E Extra 2.53E-05 1.45E-04 3.89E-04 5.59E-04 1.40 0.96
XP_001397023.2 Endo-β-1,4-glucanasa D Carbohidratos 3.2.1.151 E Extra 8.95E-05 1.56E-04 4.16E-04 6.61E-04 1.18 0.89
3.2.1.20;
XP_001389510.2 α/β-glucosidasa agdC Carbohidratos E Extra 7.88E-06 4.66E-05 2.69E-04 3.24E-04 1.46 0.86
3.2.1.21
XP_001398816.1 β-glucosidasa A Carbohidratos 3.2.1.21 E Extra 4.26E-05 1.37E-04 5.75E-04 7.54E-04 1.39 0.88
XP_001394632.2 β-manosidasa A Carbohidratos 3.2.1.25 E Extra 6.10E-06 1.58E-05 3.79E-05 5.98E-05 1.26 0.95
XP_001388594.1 ácido trehalasa Carbohidratos 3.2.1.28 E Extra 1.75E-05 5.54E-05 3.62E-04 4.35E-04 1.43 0.83
XP_001390530.1 Glucoamilasa Carbohidratos 3.2.1.3 E Extra 4.70E-04 1.12E-03 2.14E-03 3.73E-03 1.17 0.99
XP_001390410.1 Glucan endo-1,3-β-glucosidasa eglC Carbohidratos 3.2.1.39 E Extra 2.55E-04 4.41E-04 1.66E-03 2.36E-03 1.27 0.85
XP_001400902.1 Endoglucanasa A Carbohidratos 3.2.1.4 E Extra 8.45E-05 3.17E-04 1.25E-03 1.66E-03 1.40 0.89
XP_001392640.1 Endoglucanasa-4 Carbohidratos 3.2.1.4 E Extra 1.82E-05 7.86E-05 2.23E-04 3.20E-04 1.38 0.95
XP_001393538.1 N-acetilglucosaminidasa Carbohidratos 3.2.1.52 E Extra 7.35E-06 1.83E-05 5.86E-05 8.42E-05 1.31 0.90
XP_001389998.1 α-L-arabinofuranosidasa axhA Carbohidratos 3.2.1.55 E Extra 1.33E-04 2.14E-04 3.04E-04 6.51E-04 0.85 1.00
XP_001389652.2 exo-β-1,3-glucanasa Exg0 Carbohidratos 3.2.1.58 E Extra 1.25E-04 1.44E-04 7.10E-04 9.79E-04 1.24 0.77
XP_001392475.1 glucan 1,3-β-glucosidasa Carbohidratos 3.2.1.58 E Extra 7.57E-05 9.90E-05 7.28E-04 9.03E-04 1.34 0.78
XP_001398868.1 glucan 1,3-β-glucosidasa A Carbohidratos 3.2.1.58 E Extra 5.02E-05 1.31E-04 3.97E-04 5.78E-04 1.31 0.91
Proteína de la familia 71 glicosil
XP_001397010.2 Carbohidratos 3.2.1.59 E Extra 2.57E-05 2.68E-05 5.32E-05 1.06E-04 0.78 0.78
hidrolasa/glucan endo-1,3-α-glucosidasa
XP_001399223.1 endo-1,3(4)-β-glucanasa Carbohidratos 3.2.1.6 E Extra 3.15E-05 4.82E-05 1.46E-04 2.26E-04 1.18 0.86
57
Metabolismo/ Total
proceso CEP e
XP_001389996.2 endo-1,4-β-xilanasa F1 Carbohidratos 3.2.1.8 E Extra 3.10E-04 3.70E-04 2.05E-03 2.73E-03 1.27 0.78
XP_001388522.1 endo-1,4-β-xilanasa A Carbohidratos 3.2.1.8 E Extra 6.28E-04 2.86E-03 1.22E-02 1.57E-02 1.42 0.89
XP_001389926.1 pectin liasa F Carbohidratos 4.2.2.10 E Extra 1.91E-04 3.45E-04 1.05E-03 1.58E-03 1.23 0.88
XP_001401115.1 Triosafosfato isomerasa Carbohidratos 5.3.1.1 I Pero 4.68E-05 3.09E-04 3.25E-03 3.61E-03 1.48 0.81
XP_001394051.1 Ribosa 5-fosfato isomerasa A Carbohidratos 5.3.1.6 E Cito 1.87E-05 5.70E-05 5.11E-04 5.87E-04 1.45 0.81
XP_001391828.2 Glicosidasa crf2 Carbohidratos Enzima E Extra 1.02E-05 2.21E-05 6.47E-05 9.69E-05 1.26 0.90
OJJ75131.1 HP ASPBRDRAFT_53082 Carbohidratos Enzima E Extra 3.01E-05 3.91E-05 1.03E-04 1.72E-04 1.06 0.84
Celulasa extracelular CelA/
GAQ44118.1 Carbohidratos Enzima E Mito 2.26E-05 6.42E-05 1.35E-04 2.22E-04 1.25 0.98
Alérgeno Asp F7
OJJ72358.1 Cofactores y vitaminas 1.5.3.6 E Extra 2.18E-05 8.53E-05 6.93E-04 8.00E-04 1.45 0.82
D-6-hydroxynicotina oxidasa
Cito_
XP_001400329.2 Parcial pirofosfatasa inorgánica Energía 3.6.1.1 E 2.98E-05 1.36E-04 1.02E-03 1.19E-03 1.46 0.83
Mito
Proteína de dominio SUN (Uth1)/
XP_001391356.2 Lípidos 3.1.1.3 E Extra 2.91E-05 2.76E-04 1.50E-03 1.80E-03 1.47 0.87
triacilglicerol lipasa
XP_001397501.1 Lipasa Lípidos 3.1.1.3 E Extra 1.63E-04 8.08E-04 2.67E-03 3.64E-03 1.41 0.93
XP_001398185.1 Triacilglicerol lipasa Lípidos 3.1.1.3 E Extra 6.44E-06 2.45E-05 1.35E-04 1.66E-04 1.43 0.85
XP_001393823.2 Colinesterasa Lípidos 3.1.1.7 E Extra 1.46E-05 2.47E-05 9.18E-05 1.31E-04 1.26 0.85
OJJ67200.1 HP ASPBRDRAFT_59193 Misceláneos Enzima E Extra 4.41E-05 7.25E-05 2.29E-04 3.46E-04 1.21 0.86
XP_001401488.1 Proteína ecm33 Misceláneos E Extra 1.20E-03 1.75E-03 6.47E-03 9.42E-03 1.22 0.83
XP_001395113.2 Proteína HMF1 Misceláneos I Cito 7.03E-05 1.96E-04 4.18E-04 6.85E-04 1.25 0.98
Misceláneos /señalización/
XP_001389020.1 Cianovirina-N I Cito 6.93E-05 2.22E-04 1.46E-03 1.75E-03 1.43 0.83
proceso celular
OJJ71409.1 HP ASPBRDRAFT_127351 ND E Cito 1.93E-04 3.90E-04 1.66E-03 2.25E-03 1.33 0.85
XP_001392850.1 1,3-β-glucanosiltransferasa gel2 Proceso celular 2.4.1.- E Extra 2.82E-05 7.22E-05 2.45E-04 3.45E-04 1.33 0.89
XP_001391851.1 Proteína 14-3-3 Proceso celular I Cito 2.03E-05 1.73E-04 8.49E-04 1.04E-03 1.46 0.88
XP_001400160.1 Proteína NMT1 Proceso celular /carbohidratos I Cito 4.78E-05 2.55E-04 1.20E-03 1.50E-03 1.44 0.88
XP_001390497.2 1,3-β-glucanosiltransferasa gel3 Proceso celular /proteínas/estrés 2.4.1.- E Extra 1.48E-05 3.36E-05 1.30E-04 1.79E-04 1.33 0.87
XP_001402433.1 1,3-β-glucanosiltransferasa gel1 Proceso celular /redox 2.4.1.- E Extra 3.33E-04 6.92E-04 3.20E-03 4.22E-03 1.34 0.84
OJJ72478.1 Proteínas 3.4.21.- E Extra 3.70E-05 1.51E-04 1.41E-03 1.60E-03 1.46 0.81
Serina proteinasa pepC
XP_001398198.2 Carboxipeptidasa S1 Proteólisis 3.4.16.- E Extra 1.45E-05 3.07E-05 2.59E-04 3.04E-04 1.42 0.80
HP ASPBRDRAFT_59296 /Enzima Cito_
OJJ66856.1 Proteólisis/proteínas I 4.32E-06 1.82E-05 9.54E-05 1.18E-04 1.43 0.86
activadora de ubiquitina E1 1 6.2.1.45 nucl
XP_001400873.1 Tripeptidil-peptidasa sed2 Proteólisis/transporte 3.4.14- E Extra 1.50E-04 2.95E-04 1.12E-03 1.56E-03 1.30 0.86
XP_001390502.1 Proteína de unión a FAD Redox 1.-.-.- E Pero 1.50E-05 1.96E-05 6.86E-05 1.03E-04 1.17 0.81
XP_001389120.1 Similar a reductasa Redox 1.1.1.- E Cito 1.87E-04 1.46E-03 6.84E-03 8.48E-03 1.46 0.89
XP_001388595.1 Catalasa R Redox 1.11.1.6 E Extra 3.63E-05 1.38E-04 5.05E-04 6.80E-04 1.39 0.90
XP_001390337.1 aldo-ceto reductasa Redox 1.11.1.7 E Cito 1.50E-05 5.47E-05 2.57E-04 3.27E-04 1.41 0.87
XP_001393905.1 Sulfidril oxidasa Redox 1.8.3.2 E Extra 1.39E-04 2.35E-04 7.92E-04 1.17E-03 1.24 0.86
XP_001394119.2 Aldehído reductasa 1 Redox/carbohidratos 1.1.1.21 I Cito 9.95E-05 4.38E-04 4.56E-03 5.10E-03 1.47 0.81
XP_001391459.1 Superóxido dismutasa [Cu-Zn] Redox/carbohidratos/nucleótidos 1.15.1.1 E Cito 1.82E-04 4.68E-04 1.13E-03 1.78E-03 1.26 0.95
XP_001395908.1 Peroxirredoxina pmp20 Redox/nucleótidos 1.11.1.15 I Cito 1.78E-04 1.08E-03 7.45E-03 8.71E-03 1.46 0.84
Redox/procesos celulares/
XP_001389952.1 Oxígenasa dependiente de FAD 1.5.3.6 E Extra 1.73E-05 3.37E-05 7.92E-05 1.30E-04 1.17 0.93
carbohidratos
XP_001388621.1 Catalasa R Redox/terpenoides y poliquétidos 1.11.1.6 E Extra 6.47E-05 1.16E-04 5.23E-04 7.03E-04 1.31 0.83
58
Metabolismo/ Total
proceso CEP e
XP_001402471.1 purina nucleósido permeasa Transporte Enzima E Extra 1.98E-04 3.85E-04 1.27E-03 1.86E-03 1.27 0.88
Proteínas reguladas en CL
20 y 40 g/L
XP_001390497.2 1,3-β-glucanosiltransferasa gel3 Proceso celular /carbohidratos 2.4.1.- E Extra 7.09E-07 5.72E-07 0.00E+00 1.28E-06 -1.50 0.89
20, 40 y 60 g/L
XP_001390502.1 Proteína de dominio de unión a FAD Redox 1.-.-.- E Pero 7.32E-07 6.35E-07 2.57E-07 1.62E-06 -0.97 0.90
XP_001389952.1 Oxigenasa dependiente de FAD Redox 1.5.3.6 E Extra 2.44E-06 1.07E-06 9.68E-07 4.48E-06 -0.90 0.80
XP_001393905.1 Sulfidril oxidasa Redox 1.8.3.2 E Extra 9.37E-06 6.12E-06 4.42E-06 1.99E-05 -0.79 0.97
OJJ78207.1 Proceso celular /carbohidratos 2.4.1.- E Extra 6.33E-07 7.18E-07 2.83E-06 4.19E-06 1.17 0.78
1,3-β-glucanosiltransferasa
XP_001402433.1 1,3-β-glucanosiltransferasa gel1 Proceso celular /carbohidratos 2.4.1.- E Extra 1.11E-05 6.45E-06 6.08E-06 2.36E-05 -0.68 0.81
XP_001392850.1 1,3-β-glucanosiltransferasa gel2 Proceso celular /carbohidratos 2.4.1.- E Extra 8.83E-07 8.99E-07 9.94E-07 2.78E-06 0.17 0.86
OJJ74329.1 Probable manosil-oligosacárido α-1,2- Carbohidratos 3.2.1.- E Extra 2.30E-06 9.19E-07 6.79E-07 3.90E-06 -1.06 0.86
manosidasa 1B
GAQ42198.1 Ácida α-amilasa estable Carbohidratos 3.2.1.1 E Plas 7.67E-06 3.32E-06 3.12E-06 1.41E-05 -0.89 0.78
XP_001402053.1 α-glucosidasa Carbohidratos 3.2.1.20 E Extra 8.86E-07 5.91E-07 2.95E-07 1.77E-06 -1.00 1.00
XP_001394632.2 β-manosidasa A Carbohidratos 3.2.1.25 E Extra 4.40E-07 3.50E-07 2.59E-07 1.05E-06 -0.62 1.00
XP_001388594.1 Ácida trehalasa Carbohidratos 3.2.1.28 E Extra 9.61E-07 7.46E-07 4.74E-07 2.18E-06 -0.76 1.00
OJJ70100.1 HP ASPBRDRAFT_45424 /Isopululanasa Carbohidratos 3.2.1.57 E Extra 3.76E-06 3.09E-06 2.70E-06 9.54E-06 -0.42 0.98
XP_001400873.1 Tripeptidil-peptidasa sed2 Proteólisis/Transporte 3.4.14.10 E Extra 1.61E-05 8.76E-06 4.90E-06 2.98E-05 -1.04 0.97
XP_001392582.1 Tripeptidil-peptidasa 1 Proteólisis /Transporte 3.4.14.10 E Extra 5.22E-07 8.60E-07 1.09E-06 2.47E-06 0.78 0.99
XP_001398198.2 Carboxipeptidasa S1 Proteólisis 3.4.16.6 E Extra 1.48E-06 1.39E-06 8.35E-07 3.71E-06 -0.65 0.85
XP_001401093.1 Aspergilopepsin 1 Proteólisis /proteínas 3.4.23.18 E Extra 3.88E-06 2.00E-06 1.47E-06 7.35E-06 -0.93 0.90
XP_001399157.1 Amidasa Aminoácidos 3.5.1.4 E Extra 9.65E-07 6.71E-07 6.66E-07 2.30E-06 -0.47 0.76
GAQ46904.1 YkgB Proceso celular E Extra 6.37E-05 1.35E-05 7.09E-06 8.42E-05 -1.33 0.83
XP_001401488.1 Proteína ecm33 Misceláneos /procesos celulares E Extra 4.36E-05 1.63E-05 6.07E-06 6.59E-05 -1.29 0.94
XP_001400808.1 Proteína PhiA de pared celular Proceso celular E Extra 1.48E-05 4.51E-05 6.48E-05 1.25E-04 1.16 0.99
40 y 60 g/L
OJJ67369.1 HP ASPBRDRAFT_69025 /β-xilanasa Carbohidratos 3.2.1.8 E Extra 0.00E+00 2.85E-06 6.21E-06 9.06E-06 1.50 1.00
XP_001389926.1 Pectin liase F Carbohidratos 4.2.2.10 E Extra 0.00E+00 3.31E-06 6.62E-06 9.94E-06 1.50 1.00
a Números de acceso correspondientes a la base de datos de NCBI, los que inician con las letras “XP” corresponden a A. niger CBS 513.88, con “OJJ” corresponden a A. brasiliensis CBS 101740, el resto
corresponde a otras cepas de A. niger. b Caracterizada como: Extracelular (E) o como intracelular (I) (basándose en los servidores SignalP y/o SecretomeP); c Loc=Localización predicha por WoLF PSORT:
(Cito) citosol, (Extra) extracelular, (Mito) mitocondrial, (Pero) peroxisomas, (Nucl) núcleo, (Plas) membrana plasmática, (Cis) citoesqueleto, (Cit_mit) citosol/mitocondria. d Cuenta espectral ponderada
(CEP) determina el número de espectros contados por mL de medio para cada una de las condiciones; e Representa la suma de la CEP de las tres condiciones para cada proteína; f Representa el valor de
la pendiente al graficar los valores de la CEP normalizado en función de la concentración de glucosa, (-) bajo-regulación y (+) sobre-regulación; g Coeficiente de determinación >0.75 las proteínas fueron
reguladas.
59
7.3.1. Proteínas únicas identificadas en el secretoma
Un total de 17 y 87 proteínas únicas fueron identificadas en CL y CS (Figura 12 y Tabla 5),
respectivamente. El mayor número de proteínas únicas para cada tipo de cultivo se encuentra en el
medio con mayor concentración de glucosa inicial (Figura 15); 13 proteínas para CL y 75 proteínas
para CS en los medios de cultivo con 60 y 180 g/L respectivamente. En CL, se encontraron proteínas
únicas en los medios con 20 y 60 g/L. En el caso de 20 g/L se identificaron tres endoglucanasas y una
proteína hipotética (Tabla 5), y con 60 g/L se identificaron 13 proteínas únicas; de las cuales, cuatro
están asociadas al metabolismo de carbohidratos (malato deshidrogenasa, α-amilasa, glucan endo-
1-6-β-glucosidasa BGN16.3 y una proteína enriquecida en serina extracelular (XP_001400266.1) y
tres a mecanismos de defensa contra estrés (catalasa R, una proteína similar a reductasa y aldehído
reductasa), el resto se ha relacionado al metabolismo de aminoácidos, procesos de transporte y a
proteínas hipotéticas (Figura 16).
a) b)
5%
9%
24%
0%
76%
86%
60 g/L 120 g/L 180 g/L 20 g/L 40 g/L 60 g/L
Figura 15. Proteínas únicas identificadas por concentración de glucosa en cultivo sólido (a) y líquido (b).
60
a) b)
Carbohidratos
Carbohidratos
ND
Aminoácidos
Metabolismo/proceso
Metabolismo/proceso
Proteínas/proteólisis ND
Componente/proceso…
Redox/estrés
Redox/estrés
Cofactores y vitaminas
Lípidos
Misceláneos Aminoácidos
Nucleotidos
Ácidos nucleicos Transporte
Energía
0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8
Número de proteínas Número de proteínas
Figura 16. Distribución de proteínas únicas encontradas en el secretoma de A. brasiliensis bajo las tres condiciones evaluadas en cultivo
sólido (a) y líquido (b).
Por otro lado, el 86.2% de las proteínas únicas de CS corresponden a la condición de 180
g/L, de las cuales el 53.33% presentaron evidencia de secreción a través de SignalP y/o SecretomeP.
La mayor parte de las proteínas únicas de 180 g/L se relacionaron al metabolismo de carbohidratos
y aminoácidos, representando el 19.54 y 10.35% en esta condición, respectivamente; mientras que,
el 13.79% corresponde a proteínas hipotéticas (Figura 16).
En ambos cultivos, el mayor porcentaje de las proteínas únicas participa en el metabolismo

de carbohidratos, el 21.8 y 47%, en CS y CL, respectivamente. El porcentaje obtenido en CS, se
encuentra dentro del rango observado en hongos filamentosos como: Stagonospora sp.,
Pyrenochaeta sp. y Alternaria alternata, donde se identificó el 15, 18 y 30% (Zeiner et al., 2016),
respectivamente; lo contrario con CL, el cual se obtuvo un porcentaje mayor a lo reportado.
De las enzimas únicas relacionadas al metabolismo de carbohidratos, la 6-

fosfogluconolactonasa resulta ser abundante de acuerdo con la CEP. Esta enzima participa en la ruta
de pentosas fosfato (PPP); también fueron identificadas otras enzimas abundantes que participan
en rutas centrales como en la glucólisis (glucosa-6-fosfato-isomerasa), PPP (fosfogluconato
deshidrogenasa, descarboxilante 1) y en el ciclo de ácidos tricarboxílicos (CAT) (citrato sintasa). El
44% de las 87 proteínas únicas en CS se identificaron como intracelulares, en cambio en CL,
61
únicamente la aldehído reductasa se encontró como única e intracelular. Las razones por las cuales
proteínas intracelulares son identificadas en la región extracelular son descritas más adelante.
Por lo tanto, los resultados previos demuestran que la concentración de glucosa

nuevamente tiene un efecto sobre la secreción, en este caso sobre la secreción de proteínas únicas
y proteínas únicas intracelulares en CS, principalmente en la concentración de 180 g/L.
7.3.2. Identificación de proteínas intracelulares en el secretoma de A. brasiliensis

A través del análisis por SignalP y SecretomeP se determinó la presencia de un alto número de
proteínas intracelulares (sin evidencia de secreción) siendo el 33% y 1.6% del número total de
proteínas identificadas en CS y CL, respectivamente.
Generalmente, en los estudios del secretoma se espera encontrar proteínas secretadas a

través del péptido señal o por mecanismos no convencionales reportados. Sin embargo, la
identificación de proteínas intracelulares es común (Jun et al., 2011; Li et al., 2013). Esto se convierte
en un problema al discriminar dichas proteínas durante la caracterización del secretoma, lo que
provoca pérdida de información relevante (Brown et al., 2014, 2015). La presencia de proteínas
intracelulares en la región extracelular se justifica por algunos investigadores como el resultado de
algún grado de lisis celular durante el crecimiento o en la obtención de la muestra (Li et al., 2013),
así descartándolas de la interpretación de resultados. No obstante, hay evidencia de la secreción de
proteínas por mecanismos no convencionales en hongos, plantas, animales y bacterias (Jeffery,
2015), las cuales tienen un impacto sobre la comunicación célula-célula y en procesos de virulencia
(Miura y Ueda, 2018; Zamith-Miranda et al., 2018).
Para evitar la presencia de proteínas intracelulares en el secretoma debido a lisis celular o

al envejecimiento del cultivo se minimizó la lisis celular con un cuidadoso procesamiento de la
muestra (Sección 6.3), y el envejecimiento celular al definir el tiempo de cultivo en el que se alcanza
la máxima tasa de producción de CO2 como el tiempo de muestreo para el análisis del secretoma
(Sección 6.2.1.2).
El secretoma de A. brasiliensis proveniente de CS presentó 81 proteínas identificadas como

típicamente intracelulares, las cuales fueron identificadas en función de la concentración de glucosa
(Figura 17) y distribuidas de la siguiente manera (Figura 18 y Tabla 5): 1 proteína única en 60 g/L, 2
proteínas únicas en 120 g/L, 35 proteínas únicas en 180 g/L, 32 proteínas en común entre 120 y 180
g/L y 11 proteínas en común entre las tres condiciones. De acuerdo con la función principal, un alto
62
número de estas proteínas se vincula al metabolismo redox/estrés y de carbohidratos (Figura 16).
Mientras que, 26.7, 22.9 y 61.1% de las proteínas corresponden a los grupos de proteínas
abundantes no reguladas, enzimas reguladas y enzimas no reguladas respectivamente (Tabla 5). En
cambio, en CL, sólo aldehído reductasa se identificó como proteína intracelular.
80 2
a) b)
No. Proteínas intracelulares

No. Proteínas intracelulares
60
40 1
20
0 0
0 40 80 120 160 200 20 40 60
Glucosa (g/L) Glucosa (g/L)
Figura 17. A) Número de proteínas intracelulares identificadas en el secretoma de A. brasiliensis en función de la concentración de
glucosa en ambos cultivos. Círculos llenos (●): cultivo sólido; círculos vacíos (Ο): cultivo líquido. B) Ampliación de lo observado en
cultivo líquido.
La alta presencia de proteínas intracelulares que no corresponden a proteínas con

mecanismos de secreción asociados a la secuencia señal (SignalP) o predichas por SecretomeP en
CS puede ser el resultado de mecanismos de secreción como vesículas o exosomas (Rabouille, 2017)
y proteínas moonlighting (Huberts y van der Klei, 2010). La alta presencia de estas proteínas
identificadas como intracelulares también puede ser debida a la secreción de proteínas en la zona
apical de las hifas, en esta zona existe un flujo de componentes necesarios para la síntesis de la
pared celular (Gomes et al., 2018), y de proteínas indispensables para la extensión apical (Pakula et
al., 2005).
63
Redox/estrés
Carbohidratos
Componente/proceso celular
Aminoácidos
Metabolismo/proceso Misceláneos
Nucleótidos
ND
Proteinas/proteólisis
Energía
Lípidos
Ácidos nucleicos
0 2 4 6 8 10 12 14
Número de proteínas
Figura 18. Distribución de proteínas típicamente intracelulares encontradas en el secretoma de A. brasiliensis bajo las tres condiciones
evaluiadas en cultivo sólido.
La secreción vesicular se considera como única ruta de secreción para diversas proteínas
que no presentan péptido señal (Vallejo et al., 2012), algunas proteínas como la triosafosfato
isomerasa, enolasa, glucan 1-3-β-glucosidasa, glucoquinasa, transaldolasa, glucosa-6-fosfato-
isomerasa, HSP´s, tiorredoxina, superóxido dismutasa, y proteínas ribosomales son secretadas a
través de vesículas por Paracoccidioides brasiliensis. En las vesículas se secreta una amplia variedad
de proteínas asociadas a: i) el metabolismo de carbohidratos y lípidos, ii) estructurales en la pared
celular, iii) señalización celular, iv) relacionadas al crecimiento, v) virulencia, y vi) estrés oxidativo y
térmico (Joffe et al., 2016; Rodrigues et al., 2008). Con base en lo anterior, se sugiere que la
secreción de proteínas típicamente intracelulares se lleve a cabo por medio de vesículas,
principalmente en 120 y 180 g/L, debido a que varias de las proteínas mencionadas han sido
identificadas en estas condiciones. Además, la presencia de la proteína ypt1 de unión a GTP , la Rab7
relacionada con Ras/dGTPasa, la Rab-11A relacionada con Ras y un componente del complejo de
exocitosis Sec8 apoya la hipótesis de secreción vesicular de estas proteínas, ya que de acuerdo con
la información obtenida por las bases de datos y con lo reportado (Chen et al., 2015; Riquelme et
al., 2014; Sánchez-León et al., 2015)) son proteínas que participan en el transporte
vesicular/exocitosis.
Por otro lado, las proteínas con función moonlighting en el secretoma de A. brasiliensis no
son descartadas; sin embargo, su corroboración es complicada, ya que no existen métodos que
64
determinen dichas funciones a partir de características biofísicas (Amblee y Jeffery, 2015). Por lo
que, experimentalmente se siguen determinando nuevas proteínas (Mani et al., 2015) como la
proteína ribosomal RPL44 de A. glaucus que confiere resistencia a estrés abiótico (Liu et al., 2014).
Enzimas citosólicas y chaperonas (Hsp´s) identificadas en nuestro estudio han demostrado tener
otras funciones dependiendo su localización dentro de la célula (Amblee y Jeffery, 2015; Gancedo
et al., 2016). Proteínas secretadas por A. brasiliensis como la triosafosfato isomerasa, transaldolasa,
malato deshidrogenasa, catalasas, SOD1, peroxiredoxinas, proteína 14-3-3 y factores de
transcripción, también han demostrado poseer otras funciones diferentes a la principal (Amblee y
Jeffery, 2015; Breitenbach et al., 2015; Gancedo et al., 2016; Nimrichter et al., 2016; Serrano-Fujarte
et al., 2016; Sluchanko y Gusev, 2017).
La triosafosfato isomerasa y la SOD han sido identificadas por actuar en la región

extracelular o en la superficie celular durante la adhesión a matrices sólidas, denominándose
adhesinas, las cuales participan en la unión con el huésped o como receptores de la superficie
(Amblee y Jeffery, 2015). Otro ejemplo de adhesinas es la transaldolasa, esta enzima favorece la
adhesión de especies de Bifidobacterium al tracto intestinal del huésped (González-Rodríguez et al.,
2012; Westermann et al., 2016). La presencia de la transaldolasa (abundante y sobre-regulada) en
la región extracelular en condiciones de CS indica una relevante participación en la adhesión de A.
brasiliensis sobre la perlita. Estudios recientes han demostrado que la transaldolasa es secretada a
través de vesículas extracelulares de hongos patógenos como Candida spp. y A. fumigatus
(Nimrichter et al., 2016); y se ha identificado en secretomas expresados por otras especies de
Aspergillus, como oryzae (Oda et al., 2006), niger (Carrillo-Sancen et al., 2016) y brasiliensis (Volke-
Sepulveda et al., 2016) en condiciones de CS. Cabe mencionar que la adherencia es relevante para
la toma de nutrientes, secreción de enzimas, y para el crecimiento apical de las hifas (Gamarra et
al., 2010). La adherencia es un proceso complejo y metabólicamente activo, mediado por moléculas
secretadas como: carbohidratos, proteínas y lípidos que se unen al sustrato, pero existe una
carencia de información en especies de uso industrial (Gow et al., 2017; Villena y Gutiérrez-Correa,
2007). Esto último ha permitido investigar y entender el papel que juegan las proteínas
extracelulares durante la adhesión fúngica, ya que se ha sugerido que el proceso implica
mecanismos de señalización, expresión diferencial de genes y el comportamiento metabólico, lo
cual puede ejercer un efecto en el aumento de la productividad de las enzimas producidas en
superficies sólidas (Villena y Gutiérrez-Correa, 2007) y ayudar a comprender mejor las diferencias
entre CS y CL.
65
Por lo tanto, al incrementar la concentración de glucosa en CS se favoreció la presencia de
proteínas intracelulares consideradas con función moonlighting que podrían participar en la
adhesión de A. brasiliensis a la perlita, lo que facilita el consumo de nutrientes en altas
concentraciones de glucosa. Estudios posteriores sobre este tipo de proteínas podrían ayudar a
entender mejor los mecanismos de secreción por parte de los hongos filamentosos en CS.
7.3.3. Enzimas y proteínas sin función enzimática del secretoma de A. brasiliensis en

ambos cultivos
Una alta diversidad de proteínas con y sin funciones enzimáticas se identificó en el secretoma de A.
brasiliensis en ambos cultivos (Tabla 5). De las 62 proteínas identificadas en CL, 53 son proteínas
con actividad enzimática y 9 proteínas no tienen función enzimática. En cuanto al CS, 188 proteínas
de las 242 resultaron ser enzimas, mientras que, 54 proteínas no presentan funciones enzimáticas.
Para el CL, enzimas como: β-xilanasa (HP ASPBRDRAFT_69025), pectin liasa F, 1,3-β-
glucanosiltransferasa gel2, 1,3-β-glucanosiltransferasa (HP ASPBRDRAFT_142667) y la tripeptidil-
peptidasa 1 fueron sobre-reguladas; mientras que, 15 fueron bajo-reguladas, la mayoría asociadas
al metabolismo de carbohidratos (ácida trehalasa, ácida α-amilasa estable, probable manosil-
oligosacárido α-1,2-manosidasa 1B, isopululanasa, α-glucosidasa y β-manosidasa A). Por otra parte,
3 proteínas sin función enzimática fueron reguladas, la proteína ecm33 y YkgB, reguladas
negativamente; y la proteína PhiA de pared celular sobre-regulada.
En CS se identificaron 120 y 26 enzimas y proteínas sin función enzimática, respectivamente;

todas ellas sobre-reguladas en función de la concentración inicial de glucosa en el medio de cultivo,
las relacionadas al metabolismo de carbohidratos representaron el 41%, mientras que, el 16.6 y 10%
corresponden a enzimas relacionadas a procesos redox y al procesamiento de proteínas,
respectivamente. La endo-1,4-β-xilanasa A, peroxirredoxina pmp20 y la serina proteinasa pepC son
consideradas las proteínas más abundantes de cada uno de los procesos mencionados,
respectivamente. Por otro lado, las proteínas reguladas sin función enzimática corresponden
principalmente a procesos celulares (factor de maduración glial, 2 isoformas de la proteína 14-3-3,
proteína endocitosis end4, proteína similar a esferulina de superficie celular 4 y la proteína NMT1)
y seis asociadas a diferentes procesos, denominando al grupo como misceláneos (Tabla 5).
Generalmente, el incremento de glucosa inhibe parcial o totalmente la síntesis de algunas

proteínas, y esto se observó en CL, en donde existe una bajo-regulación de ciertas proteínas. La
66
comparación con lo reportado previamente en CS, demuestra que no sólo la concentración de
glucosa es un factor que influya sobre la secreción de las proteínas, sino que otras variables como
el pH (Boratyński et al., 2018), operación del reactor (Lopez-Ramirez et al., 2018) y la disponibilidad
de oxígeno (Rahardjo et al., 2005) pueden ser relevantes, siendo estás variables diferentes en
nuestro estudio.
En el siguiente apartado se presenta una descripción de las proteínas no caracterizadas a

partir de las bases de datos (proteínas hipotéticas), y posteriormente, se presenta la descripción de
las proteínas identificadas de acuerdo con la clasificación establecida a partir de su función principal
reportada.
7.3.4. Proteínas hipotéticas en el secretoma de A. brasiliensis

A partir de los datos obtenidos por espectrometría de masas, la identificación de las proteínas
presentes se realizó utilizando las bases de datos disponibles en UniProt y NCBI. Las secuencias
peptídicas fueron alineadas con la información disponible de A. brasiliensis CBS 101740; sin
embargo, la información obtenida era mínima debido a que todas las proteínas alineadas nos
indicaban ser proteínas hipotéticas (Anexo 1). Entonces, para la obtención de información se realizó
un segundo alineamiento limitando el organismo a A. niger debido a su alta similitud con A.
brasiliensis (Houseknecht et al., 2008); los datos utilizados fueron principalmente de A. niger CBS
513.88, cuyo genoma se encuentra completamente secuenciado (Pel et al., 2007). Con este
procesamiento de datos disminuyó el número de proteínas hipotéticas (Tabla 5).
De las 242 proteínas encontradas en CS, 31 fueron hipotéticas, 22 de ellas con evidencia de
secreción, el resto fueron únicas e intracelulares en 180 g/L. Por el contrario, las 9 proteínas
hipotéticas identificadas en CL presentaron evidencia de secreción, 3 exclusivas de la condición de
60 g/L.
El incremento en la concentración inicial de glucosa en ambos tipos de cultivo conduce a

una mayor secreción de proteínas. Este efecto es mayor en CS. Con relación a las proteínas
hipotéticas, su proporción es similar en ambos tipos de cultivo (12.81% y 14.51% en CS y CL,
respectivamente). Estos valores son cercanos a lo observado en el secretoma de diversos hongos,
en los que las proteínas hipotéticas representan entre el 12-14% al realizar el alineamiento en NCBI
y UniProt (Zeiner et al., 2016). No obstante, Florencio et al. (2016) identificaron 35% y 31% de
proteínas hipotéticas en el secretoma de A. niger expresado en CL en lote y en lote sucesivo,
67
respectivamente; mientras que, en el secretoma de T. reseei en CL el contenido de proteínas
hipotéticas representó 14.4 y 17.7% en cultivos en lote y en lote sucesivo, respectivamente. Los
datos de ambos hongos fueron alineados contra todas las proteínas fúngicas presentes en la base
de datos de NCBI. El análisis del proteoma puede ser el resultado de diferentes variables, por
ejemplo: la base de datos utilizada, secuenciación del genoma, anotación del genoma y proteoma,
cepa o microorganismo utilizado para el alineamiento, actualización de las bases de datos, equipos
y programas utilizados para la adquisición de datos, entre otros factores (Gulcicek et al., 2005; Pible
et al., 2014).
7.3.5. Abundancia relativa de cada grupo de clasificación

Como se ha mencionado, en este estudio se obtuvo una gran cantidad de proteínas. Para una mejor
comprensión de los resultados, las proteínas encontradas se clasificaron en tres grupos (únicas,
abundantes no reguladas y reguladas) (Figura 19). Para ello, se consideró la abundancia relativa de
las proteínas, determinada por la CEP (cuenta espectral ponderada) (Sección 6.8).
100
Cuenta espectral ponderada
80
60
(%)
40
20
0
Únicas Abundantes no Reguladas
reguladas
Clasificación
Figura 19. Distribución de la cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas en cultivo líquido (azul) y sólido
(naranja).
En ambos tipos de cultivo las proteínas únicas (aquellas que se encuentran en un sólo medio
de cultivo para cada tipo de cultivo) representan menos del 7.7%; siendo 3 veces menor en CL que
en CS (Figura 19). Por otro lado, el patrón de proteínas no reguladas y reguladas en ambos tipos de
cultivo es completamente diferente. En cultivo líquido las proteínas no reguladas son 30% más que
las reguladas; sin embargo, en CS las proteínas reguladas son más de 20 veces más que las no
68
reguladas. Esto es consistente con las múltiples evidencias que se han presentado con relación a
una menor represión catabólica en CS que en CL.
Por otra parte, la distribución de la CEP en CS es distinta al CL; en CS, el mayor porcentaje
(87.89%) se concentró en las proteínas reguladas (Figura 19). La CEP de las proteínas únicas en CS
es 620 veces mayor en CS que en CL; mientras que, ésta es 14.5 y 378 veces mayor en CS que en CL
para las proteína no reguladas y reguladas, respectivamente. Estas diferencias son el resultado de
la alta diversidad de proteínas en CS y su abundancia en el secretoma; principalmente en el medio
de cultivo sólido con una concentración inicial de glucosa de 180 g/L; en el que la diversidad de
proteínas es 2.87 veces mayor a la observada en CL.
Las proteínas del secretoma también se clasificaron de acuerdo con su función/proceso

principal. A partir de la CEP total de cada grupo se demostró que las proteínas relacionadas al
metabolismo de carbohidratos se encuentran con mayor abundancia en ambos cultivos (Figs. 20 y
21); en el segundo grupo más abundante están aquellas relacionadas al metabolismo redox y a
procesos celulares para el CS y el CL, respectivamente.
Carbohidratos
Proceso celular
ND
Metabolismo/ Proceso
Misceláneos
Proteólisis/proteínas
Redox
Aminoácidos
Transporte
0 1 2 3 4 5 6
Cuenta espectral ponderada (x104)
Figura 20. Cuenta espectral ponderada de las proteínas presentes en el secretoma obtenido en cultivo líquido.
69
Carbohidratos
Redox
Proceso celular
Misceláneos
Metabolismo/ proceso
ND
Proteólisis/proteínas
Lípidos
Aminoácidos
Estrés
Energía
Nucleótidos
Transporte
Componente celular
Ácidos nucleicos
Señalización
0 200 400 600 800
Cuenta espectral ponderada (x104)
Figura 21. Cuenta espectral ponderada de las proteínas presentes en el secretoma obtenido en cultivo sólido.
A partir de la cuantificación de la abundancia relativa se logró identificar las proteínas sobre

o bajo-reguladas en función de la concentración de glucosa; además, se identificaron las proteínas
más abundantes de cada grupo, lo que permitió identificar los posibles roles desarrollados durante
el crecimiento de A. brasiliensis.
A continuación, se muestran las proteínas caracterizadas de A. brasiliensis, clasificadas de acuerdo

con el metabolismo principal identificado por el análisis bioinformático
7.3.6. Clasificación de las proteínas identificadas de acuerdo con el metabolismo

principal
En la Figura 14 se muestra la clasificación de las proteínas del secretoma de acuerdo con el
metabolismo/proceso principal en que participan, sobresaliendo que en el CS se identificaron
proteínas involucradas en un mayor número de procesos. Esta clasificación permitió reconocer el
rol que tienen las proteínas identificadas durante el crecimiento de A. brasiliensis (Tabla 5).
7.3.6.1. Proteínas asociadas al metabolismo de carbohidratos

El mayor número las proteínas identificadas participa en el metabolismo de carbohidratos. En el
caso del CL, el 45.16% (todas con evidencia de secreción) de las 62 proteínas corresponde a este
metabolismo (Tabla 5); de ellas, 19 son abundantes, y a la vez, de éstas abundantes seis fueron
reguladas: 4 proteínas bajo-reguladas (α-amilasa ácida estable, isopululanasa (HP
70
ASPBRDRAFT_45424), probable manosil-oligosacárido α-1,2-manosidasa 1B (HP
ASPBRDRAFT_27362), y una trehalasa ácida) y dos proteínas sobre-reguladas (pectin liasa y β-
xilanasa (HP ASPBRDRAFT_69025)). Sólo la α-glucosidasa y la β-manosidasa A fueron bajo-reguladas
en función de la concentración de glucosa sin presentar una alta abundancia en el secretoma; su
CEP corresponde el 0.19 y 0.33% de la CEP total para las proteínas del metabolismo de
carbohidratos. De las proteínas abundantes no reguladas, la glucoamilasa representó el 62.64% de
la CEP total para este grupo. En segundo, tercer y cuarto lugar respecto abundancia, la glucan endo-
1,3-β-glucosidasa eglC, endo-1,4-β-xilanasa F1 y endo-1,4-β-xilanasa A presentaron porcentajes
entre el 3.77 al 5.83%.
Mientras que, en el secretoma proveniente del CS, se identificaron 74 proteínas asociadas

al metabolismo de carbohidratos (Tabla 5), de las cuales, 51 presentaron evidencia de secreción. De
las proteínas secretadas, 40 proteínas fueron abundantes (CEP > 1.1 x 10-4), de las cuales 34 sobre-
reguladas. De acuerdo con la abundancia estimada, la endo-1,4-β-xilanasa A fue la más abundante
y sobre-regulada representando el 21.37% del valor total de la CEP correspondiente a este
metabolismo, la CEP del resto de las proteínas representó entre el 0.21-6.05% de la CEP total de
este metabolismo, en donde sobresalen: la malato deshidrogenasa, glucoamilasa y la endo-1,4-β-
xilanasa F1. La glucan endo-1,3-β-glucosidasa eglC, glucosa oxidasa, endoglucanasa A, pectin liasa F,
fosfoglucomutasa, exo-β-1,3-glucanasa Exg0, glucan 1,3-β-glucosidasa, β-glucosidasa A y α-amilasa
se identificaron abundantes y no reguladas. En cambio, una precursor endoglucanasa-1, α-N-
arabinofuranosidasa A, glucan endo-1,3-α-glucosidasa, glicosidasa crf2, exo-β-1,3-glucanasa, glucan
endo-1,6-β-glucosidasa BGN16.3, N-acetilglucosaminidasa, α-galactosidasa C, α-amilasa, β-
manosidasa A y celobiosa deshidrogenasa resultaron no ser abundantes (CEP entre 0.05-0.17% de
la CEP total de las proteínas del metabolismo de carbohidratos), pero estas fueron reguladas por la
concentración de glucosa.
La CEP normalizada permitió evaluar el tipo y grado de regulación de las proteínas en

función de la concentración de glucosa; lo que permitió inferir el grado de represión catabólica en
las síntesis de estas proteínas. La baja RC en CS es una de las principales ventajas que tiene sobre el
CL, principalmente usando hongos filamentosos (Viniegra-González y Favela-Torres, 2006). Se ha
demostrado que enzimas como las tanasas (Aguilar et al., 2001), pectinasas (Díaz-Godínez et al.,
2001) e invertasas (Giraldo et al., 2012) son reprimidas en CL, al contener glucosa y otro sustrato en
el medio. Generalmente, la glucosa cuando se encuentra en el medio se considera un represor
71
catabólico que reprime los genes que codifican enzimas relacionadas a la degradación de
polisacáridos (por ejemplo, xilanasas, celulasas, arabinasas, etc.), debido a que es una fuente de
carbono eficiente en energía y fácilmente metabolizable (Ries et al., 2016). Entonces, la bajo-
regulación de algunas enzimas en CL, como la ácida α-amilasa estable, isopululanasa (HP
ASPBRDRAFT_45424) o β-xilanasa (HP ASPBRDRAFT_69025) indicó un cierto nivel de RC en estas
enzimas. En cambio, la sobre-regulación de enzimas como: xilanasas, glucanasas, glucosidasas,
arabinofuranosidasas, amilasas, galactosidasas, por mencionar algunas, afirman la ausencia de RC
en CS. La alta abundancia de la endo-1,4-β-xilanasa A, muestra el bajo efecto represor que tiene la
glucosa en CS, similar a lo reportado previamente con A. niger, que produce alrededor de 10 veces
más α-amilasa y amiloglucosidasa en CS que en CL (Nandakumar et al., 1999), así como, mayor
producción de endo- y exo-poligalacturonasa con altas concentraciones en CS (Solis-Pereyra et al.,
1996).
Un factor considerado clave durante la secreción de metabolitos y proteínas, y la baja RC en

altas concentraciones de sustrato es la baja actividad de agua (Aw) en CS (Gomes et al., 2018). Se
ha considerado que con bajos niveles de Aw se reduce la difusión de azúcares fácilmente
metabolizables presentes en el medio, formando gradientes en el soporte sólido que, junto con la
formación de agregados microbianos, mantienen concentraciones limitantes de nutrientes
independientemente de su concentración en el medio de cultivo (Viniegra-González y Favela-Torres,
2006; Maeda et al., 2004). El porcentaje de humedad en CS descendió hasta un 13% del valor inicial
en la concentración mínima (Figura 22), partiendo del 60.62 al 52.76 % en 180 g/L. También, el
análisis de las proteínas expresadas en la ruta glicolítica y en el ciclo de ácidos tricarboxílicos podría
aportar información relevante para comprender la baja RC, ya que previamente se ha relacionado
la baja RC a una disminución en la expresión de genes de enzimas relacionadas a éstas rutas
metabólicas (Maeda et al., 2004).
72
65
Humedad inicial (%)

60
55
50
45
20 60 100 140 180
Glucosa (g/L)
Figura 22. Contenido de humedad inicial en función de la concentración de glucosa en cultivo sólido.
Aunque la RC de enzimas involucradas en la hidrólisis de polisacáridos por fuente de

carbono en CL es bien conocida, en este trabajo se encontró que la β-xilanasa y la pectina liasa F
fueron sobre-reguladas en función de la concentración inicial de glucosa. Este resultado indica que
la expresión de los genes de estas enzimas no es reprimida por la presencia de glucosa en el medio,
y podrían ser interesantes candidatas para estudiar mecanismos de regulación alternos a la clásica
RC realizada por el factor de transcripción CreA, y así tener un mayor panorama de lo que sucede
en CS. Es posible que las proteínas sobre-reguladas y sin RC por la glucosa en CS, no sean reguladas
por CreA/CreB como sucede con la xilanasa, glucosidasa y amilasa provenientes de A. oryzae, donde
al eliminar dichos factores incrementó la actividad de las enzimas en CL, mientras que, sólo la
amilasa incrementó su actividad en CS (Ichinose et al., 2014, 2018), concluyendo que los
mecanismos de RC por CreA/CreB no son generales para todas las proteínas y dependerán del tipo
de cultivo.
Por lo tanto, la presencia de proteínas degradadoras de polisacáridos y su regulación en

función de la concentración de glucosa, nos permitieron reafirmar que, en CS, la RC es menor que
en CL; sin embargo, la identificación de una β-xilanasa y pectin liasa F, ambas sobre-reguladas en
CL, indican que no todas las proteínas son reprimidas bajo un mismo mecanismo y que pueden ser
candidatas de estudios posteriores para el entendimiento de la RC en ambos sistemas.
7.3.6.2. Proteínas asociadas al metabolismo redox y al estrés

En este grupo se encuentran proteínas que se han identificado como proteínas de defensa contra
especies reactivas de oxígeno (ERO´s); así como, mecanismos de defensa contra otros tipos de
estrés.
73
En total 9 proteínas fueron asociadas al proceso redox en CL (Tabla 5), de las cuales 8
proteínas presentaron evidencia de secreción, siendo la sulfidril oxidasa y la oxigenasa dependiente
de FAD (XP_001389952.1) abundantes y bajo-reguladas; mientras que, la catalasa R, proteína de
dominio de unión a FAD (XP_001394372.1) y una proteína similar a reductasa (XP_001389120.1) no
presentaron algún tipo de regulación. Únicamente la proteína de dominio de unión a FAD
(XP_001390502.1) es bajo-regulada y no abundante. En la Figura 20, la suma de la CEP de todas las
proteínas asociadas a este metabolismo en CL, se encuentra en sexto lugar en cuanto abundancia,
mientras que, en CS, es el segundo grupo más abundante en el secretoma de A. brasiliensis.
En CS se identificaron 28 proteínas asociadas al metabolismo redox; 19 de ellas con

evidencia de secreción. Dentro de las proteínas con evidencia de secreción, 13 proteínas fueron
abundantes y de éstas, 11 sobre-reguladas: proteína similar a reductasa (XP_001389120.1),
superóxido dismutasa [Cu-Zn], sulfidril oxidasa, dos isoformas de catalasa R, superóxido dismutasa
[Mn], Rho inhibidor de disociación de GDP, peroxirredoxina pmp20, aldo-ceto reductasa, peroxidasa
(HP ASPBRDRAFT_179180) y la lacasa-1; mientras que, la tiorredoxina reductasa y una proteína
hipotética (HP ASPBRDRAFT_134466) sólo fueron abundantes, y la oxígenasa dependiente de FAD
(XP_001389952.1) sólo se sobre-reguló. De las proteínas reguladas, la CEP de las primeras ocho
representó el 1.48-25.51% de la CEP total para este grupo.
Por otra parte, en CL no se encontraron proteínas asociadas a mecanismos de defensa

contra estrés. En cambio, en CS se identificaron 6 proteínas; de las cuales glutamato deshidrogenasa
específica de NADP y una proteína de la familia dominio Aha1 (XP_001401891.1) presentaron
evidencia de secreción.
Los resultados indican la presencia de un mejor sistema proteico para mantener un balance
redox en CS, probablemente debido al incremento del O2 disponible y el nivel de la ramificación
(Barrios-González, 2018; Gomes et al., 2018). Un estudio reporta que A. terreus presenta un mayor
balance redox en condiciones de CS que en CL, donde en este último, la concentración de ERO´s es
alrededor de 10 veces más durante el crecimiento exponencial (Miranda et al., 2013), siendo la fase
de crecimiento donde se tomaron las muestras de A. brasiliensis en nuestro estudio. Se sabe que
debe existir un balance entre enzimas productoras y degradadoras de ERO´s, ya que estas influyen
sobre los mecanismos de señalización, regulando la ramificación de las hifas, así como, el
metabolismo secundario (Li et al., 2015). La identificación de enzimas antioxidantes y su sobre-
74
regulación como la superóxido dismutasa, catalasas, glutatión reductasa y glutatión peroxidasa son
útiles como marcadores de estrés oxidativo (Grintzalis et al., 2014).
En ambos cultivos, se identificaron dos isoformas de catalasas R, siendo abundantes y sobre-

reguladas en CS. La catalasa R junto con peroxidasas metabolizan el H2O2 producido
extracelularmente por la glucosa oxidasa y la D-6 hidroxicotina oxidasa (ambas identificadas en CS)
(Baez y Shiloach, 2014; Doyle, 2011; Volke-Sepulveda et al., 2016), y por la alta transferencia y
disponibilidad de O2 en CS (Gomes et al., 2018; Viniegra-González y Favela-Torres, 2006). La catalasa
junto con la superóxido dismutasa trabajan sinérgicamente como mecanismo de defensa y tienen
un papel importante en la síntesis de aflatoxinas en A. flavus (Grintzalis et al., 2014)
Se identificaron dos superóxido dismutasas en CS, la superóxido dismutasa [Cu-Zn]

(abundante) y superóxido dismutasa [Mn]. Aunque la actividad de estas enzimas tiene lugar dentro
de las células (Lambou et al., 2010), en este estudio, ambas fueron encontradas en el secretoma y
presentan péptido señal, lo que sugiere su presencia en la región extracelular en A. brasiliensis.
Otra proteína relevante es la peroxirredoxina, dos isoformas fueron identificadas en

abundancia en CS; solo una de ellas presenta evidencia de secreción. Las peroxirredoxinas son
abundantes en levaduras y en hongos filamentosos, representando hasta el 1% de la proteína
soluble de la célula (Breitenbach et al., 2015). Las peroxirredoxinas, peroxidasas y lacasas también
han sido identificadas en otros secretomas de otros Aspergillus (Adav et al., 2010; Carrillo-Sancen
et al., 2016; Lu et al., 2010; Sorensen et al., 2009; Volke-Sepulveda et al., 2016).
A pesar de que la dipeptidil peptidasa III participa en la proteólisis, tiene una participación
importante en la eliminación de H2O2 (García Ortiz, 2016; Liu et al., 2007). Su presencia en medios
con 120 y 180 g/L en CS, indica que la concentración de glucosa y el tipo de cultivo inducen su
expresión para ser parte del sistema de defensa contra el estrés oxidativo.
A primera vista, la sobre-regulación de enzimas antioxidantes en función de la

concentración de glucosa por parte de A. brasiliensis podrían indicar un incremento en la producción
de ERO´s, provocando un estrés oxidativo. Sin embargo, esto no puede ser el resultado del
incremento de las concentraciones glucosa, ya que previamente (Volke-Sepulveda et al., 2016) se
reportó una bajo-regulación de estas enzimas bajo condiciones similares usando 30-180 g/L de
glucosa, afirmando una baja presencia de ERO´s. Una diferencia relevante que tiene un impacto en
los perfiles de regulación de las enzimas antioxidantes entre ambos estudios es el tipo de reactor.
75
El estudio realizado por Volke-Sepulveda et al., (2016), emplearon matraces Erlenmeyer, mientras
que, en nuestro estudio se utilizaron columnas de vidrio verticales, donde el flujo de aire pasaba a
través de todo el soporte, así, mejorando la transferencia y disponibilidad del O2.
La identificación de un alto número de enzimas antioxidantes en CS demuestra que A.

brasiliensis secreta un eficiente sistema antioxidante durante una fase temprana de crecimiento, y
la sobre-regulación que presentan podría ligarse a la creciente producción de ERO´s a causa de una
mayor disponibilidad de O2 y un incremento en la ramificación.
7.3.6.3. Proteínas clasificadas como componente/proceso celular

La suma de la CEP de las proteínas relacionadas a procesos celulares, indica que es el segundo grupo
más abundante dentro de las proteínas de CL, y el tercero en CS. En CL, 6 proteínas se relacionan
con estos procesos (Tabla 5), donde la YkgB y la 1,3-β-glucanosiltransferasa gel1 fueron
consideradas abundantes bajo-reguladas, mientras que, la proteína PhiA de pared celular, 1,3-β-
glucanosiltransferasa (HP ASPBRDRAFT_142667) y la 1,3-β-glucanosiltransferasa gel2 fueron
identificadas como abundantes sobre-reguladas. Otra glucanasa, la 1,3-β-glucanosiltransferasa gel3
fue considerada únicamente bajo-regulada.
Por otra parte, en el secretoma de CS, 21 proteínas se asociaron con esta función (Tabla 5)
presentando 12 proteínas evidencia de secreción, siendo 9 abundantes, y a su vez, 6 de estas sobre-
reguladas: la 1,3-β-glucanosiltransferasa gel1, proteína ypt1 de unión a GTP, 1,3-β-
glucanosiltransferasa gel2, proteína similar a esferulina de superficie celular 4, 1,3-β-
glucanosiltransferasa gel3 y la HP ASPBRDRAFT_27493, siendo la 1,3-β-glucanosiltransferasa gel1 y
la proteína ypt1 de unión a GTP, las más abundantes con un porcentaje de la CEP total del 28.81 y
23.34%, respectivamente. Las proteínas YkgB, nitrilasa (HP ASPBRDRAFT_40942) y la proteína de la
familia dienelactona hidrolasa (XP_001393178.1) únicamente resultaron ser abundantes, sin
regulación alguna.
En cuanto a las proteínas que participan como componente celular, 3 fueron identificadas
exclusivamente en CS: teniendo sólo una con evidencia de secreción, la HP ASPBRDRAFT_58357
abundante y sobre-regulada.
Durante el crecimiento celular de los hongos filamentosos, es indispensable la presencia de

diversas proteínas que participan en el mantenimiento y la elongación de las hifas (Free, 2013). Las
glucanosiltransferasas y la ecm33 se presentan en ambos cultivos, estas se encuentran asociadas,
76
principalmente al mantenimiento de la pared celular; la ecm33 fue abundante en ambos cultivos
(Tabla 5). Las glucanosiltransferasas se encargan principalmente de la elongación de glucanos
durante el crecimiento de las hifas, los glucanos son un componente principal para la pared celular
(Free, 2013; Zhao et al., 2013), y la ecm33 se considera esencial en la morfología y esporulación del
hongo (Chabane et al., 2006), esta proteína pertenece a la familia de las proteínas ancladas a GPI
(glicosilfosfatidilinositol), y junto con las glucanosiltransferasas son componentes para la integridad
de la pared celular, además es considerada la proteína más abundante de la pared celular (Free,
2013; Romano et al., 2006). La emc33 es una proteína que facilita el transporte de glucosa al interior
de la célula activando la ruta de señalización TORC1, para activar la proliferación celular en S.
cerevisiae (Umekawa et al., 2017). Es posible que la emc33, la cual se encuentra en abundancia en
ambos cultivos, participe en la asimilación de la glucosa del medio, así facilitando su consumo.
Los resultados demuestran que el sistema de proteínas asociadas al crecimiento de A.

brasiliensis es más complejo en CS, ya que también diversas proteínas que participan en el
metabolismo de carbohidratos tienen alguna función durante el desarrollo celular del hongo. Entre
ellas se encuentran la quitinasa, N-acetilglucosaminidasa, galactosidasas, glucosidasas, y la β-
manosidasa, las cuales se encargan de sintetizar/degradar la quitina y el galactomanano (Meijer et
al., 2011; Müller et al., 2002) que son componentes de la pared celular; la cual se constituye de 4̴ %
de β-1,6-glucano ramificado, 20-35% de β-1,3-glucano, 35-46% de α-1,3-glucano, 20-25% de
galactomananos (galactofuranosa), 7-15% de quitina (N-acetil-glucosamina) y otros (galactoamina
galactano, glicoproteínas de pared celular (galactomano-proteínas)) (Gastebois et al., 2009; Park et
al., 2016; Schachtschabel et al., 2012).
A pesar de identificar diversas proteínas asociadas al crecimiento en CS, la proteína PhiA de

pared celular fue identificada exclusivamente en CL. La proteína PhiA es una proteína estructural en
hongos filamentosos, sin embargo, su presencia abundante en CL indica que puede participar como
un mecanismo de defensa contra alguna clase de estrés generado por las condiciones del cultivo
(Svanström et al., 2013).
Por otro lado, entre las proteínas identificadas únicamente en CS se encuentra la proteína
14-3-3 asociada a diversos procesos celulares. Esta proteína está asociada a resistencia estructural
y se considera importante para una morfogénesis normal en los hongos (Ibarra et al., 2018). La
proteína 14-3-3 participa en la síntesis de aflatoxinas con A. flavus (Ibarra et al., 2018), en la
señalización a través de diversas interacciones (Stevers et al., 2018), así como, en el desarrollo de
77
las hifas de A. nidulans (Kraus et al., 2002) y la secreción de proteína con Trichoderma reesei (Vasara
et al., 2002), estas dos últimas funciones podrían relacionarse a los resultados obtenidos en este
estudio, como es el alto nivel de ramificación y la alta secreción de proteína por parte de A.
brasiliensis. A pesar de que no presenta evidencia de secreción (SignalP y SecretomeP) su
abundancia y su identificación extracelularmente de dos isoformas, sugiere que estas proteínas
podrían desempeñar un papel importante durante la elevación de la secreción y ramificación, ya
que de acuerdo con la base de datos Aspergillus Genome Database es secretada (Volke-Sepulveda
et al., 2016), además previamente se han identificado en S. pombe, S. cerevisiae y A. nidulans dos
isoformas de la proteína 14-3-3 (Kraus et al., 2002). Esta proteína durante la secreción se vincula a
la exocitosis interactuando con las proteínas Sec (Vasara et al., 2002).
El crecimiento de las puntas hifales se caracteriza por una secreción altamente polarizada y
la síntesis de la pared celular, ambas localizadas cerca de los vértices de las hifas extendidas (Read,
2011). La exocitosis es un proceso que administra enzimas que participan en la síntesis de la pared
celular, proteínas y lípidos de membrana a la membrana plasmática apical durante el desarrollo de
las puntas (Read, 2011), considerándolo un proceso importante para el crecimiento de las hifas y la
secreción de enzimas (Shoji et al., 2014). La exocitosis se realiza al transportar vesículas a la
membrana plasmática en la región apical (Shoji et al., 2014); sin embargo, es un proceso que no sólo
se realiza en las puntas de las hifas, sino que también en los septos, como se ha demostrado con A.
oryzae (Hayakawa et al., 2011). Se sugiere la posibilidad de una alta actividad exocítica en A.
brasiliensis debido a la presencia extracelular de la proteína ypt1 de unión a GTP, la cual puede
trabajar en conjunto con las proteínas intracelulares Rab7 relacionada con Ras/dGTPasa, proteína
Rab-11A relacionada con Ras y un componente del complejo de exocitosis Sec8, que al igual que la
proteína 14-3-3 fueron identificadas en 120 y 180 g/L, en donde la ramificación y secreción de
proteína fue más alta.
Con las proteínas identificadas en esta sección se puede mencionar que A. brasiliensis
requiere de un constante mantenimiento/ crecimiento de las hifas, principalmente en CS, en donde
proteínas asociadas a la exocitosis fueron identificadas sugiriendo una alta actividad de secreción
vesicular, la cual es necesaria para el desarrollo de las hifas, durante la elevada ramificación y
secreción de proteína que presentan las altas concentraciones de glucosa.
78
7.3.6.4. Proteínas asociadas a síntesis de proteínas
De las 62 proteínas que componen al secretoma identificado en CL, 5 proteínas abundantes
participan en la síntesis de proteínas (Tabla 5): la tripeptidil-peptidasa sed2 (XP_001400873.1),
aspergilopepsin 1 y la carboxipeptidasa S1 bajo-reguladas, y una sobre-regulada, la tripeptidil-
peptidasa 1, y una isoforma tripeptidil-peptidasa sed2 (XP_001390847.1) que resultó ser sólo
abundante. Las proteínas tripeptidil-peptidasa sed2 (XP_001400873.1) y la aspergilopepsin 1
presentaron una alta CEP, su valor representa el 63.39 y 15.64%, respectivamente, del total
estimado para este grupo.
Por otro lado, de las 242 proteínas del CS, 21 fueron clasificadas en este grupo (Tabla 5).
Dieciséis proteínas secretadas de acuerdo con SecretomeP y SignalP, identificándose la serina
proteinasa pepC (HP ASPBRDRAFT_54314), tripeptidil-peptidasa sed2, carboxipeptidasa S1,
aminopeptidasa C, aspartil aminopeptidasa vacuolar Lap4, peptidil-prolil cis-trans isomerasa B,
proteína de familia de dominio conservado de factor de elongación 1 (HP ASPBRDRAFT_132450),
todas abundantes y sobre-reguladas, en cambio la HP ASPBRDRAFT_49057, sólo resultó ser
abundante. La serina proteinasa pepC (HP ASPBRDRAFT_54314) y tripeptidil-peptidasa sed2
presentaron la mayor abundancia en este grupo. La aminopeptidasa Y y la serina carboxipeptidasa
se agruparon como proteínas no abundantes reguladas.
Las proteasas son clasificadas de acuerdo con el sitio donde actúan: ácido aspártico, cisteína,
serina entre otras (Monod et al., 2002). Principalmente, son utilizadas para la obtención de
aminoácidos, así como, en el reciclado y síntesis de proteínas (Jung et al., 1999). Sin embargo, se
han identificado que las proteasas fúngicas son secretadas para procesos invasivos, encontrándose
sobre la superficie que se adhiere al huésped (Monod et al., 2002).
La tripeptidil-peptidasa sed2, abundante en ambos cultivos, es considerada una

exoproteasa y secretada en pH ácido, forma parte de la familia subtilisina, son peptidasas de aminos
no específicos, pero no son capaces de cortar antes y después de prolina (Eugster et al., 2015). Es
posible que su presencia en abundancia y regulación en CS, se encuentre relacionada a la alta
secreción de proteínas, y a los procesos de adherencia. También, la serina proteinasa encontrada
en abundancia puede tener un papel fundamental en procesos invasivos, ya que diversas serina
proteinasas son consideras alérgenos de A. fumigatus, ésta participa junto con el alérgeno Asp f4,
la proteasa aspártica y la peptidil prolil isomerasa (Shen et al., 2001), las cuales se identificaron en
CS.
79
A pesar de que, los cultivos fueron balanceados para mantener la disponibilidad de
nitrógeno para la síntesis de proteínas durante el crecimiento, varias proteasas fueron identificadas,
asociándose a la síntesis de proteínas, y debido al alto número identificado en CS, algunas podrían
ser relevantes para los procesos de adhesión al soporte inerte.
7.3.6.5. Proteínas asociadas al metabolismo de lípidos

Este tipo de proteínas se identificaron únicamente en CS, teniendo un total de 10 proteínas (1
intracelular). De las que presentaron evidencia de secreción, 5 proteínas se sobre-regularon: la
lipasa, proteína de dominio SUN (Uth1) / triacilglicerol lipasa, triacilglicerol lipasa, colinesterasa y un
precursor de lipasa, las primeras tres fueron abundantes dentro de grupo.
Las lipasas hidrolizan triglicéridos teniendo productos como ácidos grasos y glicerol, y bajo
ciertas condiciones pueden catalizar la reacción reversa. La alta secreción de lipasas por A.
brasiliensis en CS puede deberse a la alta similitud que tiene con A. niger, que es considerado uno
de los mejores productores de lipasas, además de que se ha encontrado que en CS es mayor la
producción que en CL (Falony et al., 2006), lo que sugiere una baja concentración de lipasas en CL,
y posiblemente esto dificultará su identificación a través de MS/MS. También, es posible que la alta
presencia de lipasas en CS sea inducida por un aumento de la permeabilidad de la membrana celular
en A. brasiliensis, ya que, microorganismos como A. niger y Monascus purpureus incrementan la
concentración de ácidos grasos insaturados en CS (Maldonado y Strasser de Saad, 1998; Zhang et
al., 2015), lo que facilita el consumo de glucosa y, por ende, elevar la tasa de producción de CO2,
incrementar la velocidad de crecimiento e incrementar la secreción de proteína.
Por otra parte, las lipasas identificadas participan en el metabolismo de glicerolípidos de

acuerdo con KEGG. Esto puede ser relevante para la síntesis de la pared celular, ya que se encuentra
constituida de diversas proteínas que contienen un ancla de GPI, molécula glicolipídica, que permite
anclar proteínas dentro de parte externa de la bicapa de la membrana plasmática; las proteínas que
son secretadas a través de un péptido señal son sujetas al anclaje por GPI; las proteínas integrales
son importantes para la biogénesis de la pared celular, otras pueden funcionar como sensores,
adhesinas, adquisición de hierro y en liberación de ERO´s (Free, 2013).
Por lo tanto, las lipasas identificadas se encuentran relacionadas principalmente a la síntesis

de la pared celular, en donde la síntesis de GPI puede ser relevante para la secreción de proteínas,
la cual es elevada al incrementar la concentración de glucosa en el medio.
80
7.3.6.6. Proteínas asociadas al metabolismo de aminoácidos
Dentro de este grupo, 3 proteínas se encontraron en CL, siendo abundantes la amidasa y tirosinasa.
Además, la amidasa mostró una bajo-regulación en función de la concentración de glucosa.
En cuanto al secretoma de CS, 16 proteínas se clasificaron dentro de este grupo. Seis son
consideradas extracelulares: aril-alcohol deshidrogenasa, tirosinasa, proteína similar a glutatión S-
transferasa Ure2, proteína de la familia alanina racemasa (XP_001400684.1) y dos isoformas de
tirosinasa, de las cuales cinco fueron abundantes. Además de ser abundantes las tirosinasas,
XP_001389342.1 y XP_001389935.1, también resultaron ser sobre-reguladas. Previamente, el
secretoma de A. brasiliensis en CS presentó 23 proteínas involucradas en el metabolismo de
aminoácidos (Volke-Sepulveda et al., 2016).
El tipo de cultivo puede ser un factor relevante para la expresión de ciertas proteínas, como
ha descrito Oda et al., (2006), ciertas proteínas son expresadas únicamente en CS o CL, siendo una
regulación a nivel transcripcional; por ejemplo, la glucoamilasa B, expresada en el secretoma de A.
oryzae en CS, mientras que, se encuentra ausente en CL. Un resultado similar fue identificado en
nuestro estudio con diversas proteínas. Las tirosinasas son un ejemplo de este fenómeno, en CS se
identificaron tres isoformas en abundancia, mientras que, en CL (60 g/L) sólo una isoforma, que se
encuentra en común con las condiciones de CS, esto puede sugerir que su presencia es debido a una
alta concentración de glucosa. Un estudio previo encontró que A. oryzae expresa una tirosinasa
exclusivamente en CL, la cual proviene del gen melO, mientras que, la tirosinasa expresada en CS
proviene del gen melB, y su homología entre ambas alcanza apenas el 24% (Obata et al., 2004).
La alta presencia de proteínas asociadas al metabolismo de aminoácidos se puede vincular

a la alta secreción y diversidad de proteínas observada en CS, siendo los aminoácidos el
componente principal de éstas.
7.4. Comparación de resultados entre cultivo sólido y líquido con 60 g/L
Los resultados descritos previamente demuestran el efecto del tipo de cultivo y de la concentración
de glucosa sobre el crecimiento de A. brasiliensis analizados a través de la respirometría y la
composición del secretoma para el CS y CL. Los valores de los parámetros asociados a la
respirometría, la ramificación, así como, en la cantidad y diversidad de proteínas secretadas se
incrementaron en función de la concentración del medio en CS, dichos valores resultan ser más
elevados al compararse con CL. Sin embargo, esto puede ser una desventaja para el CL, ya que, la
81
concentración de glucosa más alta en CS (180 g/L) es 3 veces mayor a la utilizada en CL (60 g/L). Por
esta razón, para tener un panorama de las diferencias debido al tipo de cultivo, se compararon los
resultados obtenidos con la misma concentración inicial de glucosa (60 g/L) en ambos tipos de
cultivo.
En la Figura 23, se presentan gráficamente los datos de los parámetros obtenidos del análisis
respirométrico, previamente mencionados, así como, la cantidad de proteína secretada y el nivel
ramificación de A. brasiliensis en ambos cultivos, usando 60 g/L de glucosa.
a) b) c)
30 a a 80 a 3 b
mg CO2/mL h
2.4
60
20 1.8
b
h
h
40
1.2 a
10
20 0.6
0 0 0
CL CS CL CS CL CS
Tipo de cultivo Tipo de cultivo Tipo de cultivo
d) e) f)
No. de puntas/100 µm
80 1 a
b a a
0.3 0.8
60
0.6
µg/mL
0.2 a
1/h
40
a 0.4
0.1 20 0.2
0 0 0
CL CS CL CS CL CS
Tipo de cultivo Tipo de cultivo Tipo de cultivo
Figura 23. Parámetros asociados al crecimiento de A. brasiliensis en cultivo líquido y sólido con 60 g/L. a) fase lag, b) tiempo de muestreo,
c) MTPCO2 (Máxima tasa de producción de CO2, d) µCO2 (Tasa especifíca de producción de CO2), e) proteína inicial y f) nivel de ramificación.
Letras diferentes indican diferencias significativas (ANOVA de un factor con prueba de rango múltiple de Duncan (α = 0.05)).
La comparación de los resultados respirométricos entre CS y CL obtenidos bajo una misma

concentración de glucosa inicial, demostraron que no hay diferencias en el tiempo de la fase lag de
producción de CO2, ya que esta se encontró entre las 23-26 h; de igual manera, la concentración de
proteína en el tiempo de muestreo y el nivel de ramificación no presentaron diferencias
significativas entre ambos cultivos (Figura 23). Los resultados obtenidos en la concentración de
proteína son opuestos a lo reportado, donde generalmente se muestra mayor secreción en CS que
en CL (M. et al., 2016; Oda et al., 2006; G. Zhao et al., 2019). Sin embargo, estos estudios consideran
el mismo tiempo de cultivo, tanto para el CS como el CL, y no tienen en cuenta que el crecimiento
es más rápido en CS, como se ha demostrado previamente con A. niger (Favela-Torres et al., 1998),
82
y observado indirectamente a partir de la tasa de producción de CO2, alcanzando la MTPCO2 a las
38.53 horas, mientras que, en CL a las 62.16 h.
Los resultados respirométricos indicaron que la producción de CO2 es significativamente

menor en CS, alrededor del 14%, al compararse con el CL (Tabla 4 y Figura 24). A pesar de este
resultado, la MTPCO2 y µCO2 resultaron ser alrededor de 3 veces más altas en CS. Este resultado
puede estar relacionado con el rápido crecimiento de A. brasiliensis observado en CS.
25
a
20
b
15
(mg CO2/mL)
10
0
CL CS
Tipo de cultivo
Figura 24. Producción de CO2 en cultivo líquido (blanco) y sólido (gris) con 60 g/L. Letras diferentes indican diferencias
significativas.
Por otra parte, a pesar de que no existen diferencias estadísticamente significativas entre la
concentración de proteína obtenida con 60 g/L de glucosa en ambos cultivos (Figura 25), el análisis
secretómico demostró que hay una mayor diversidad de proteínas en el secretoma de A. brasiliensis
en condiciones CS (Tabla 5). En total 79 proteínas identificadas en CS y 56 para el CL (Figura 25). El
mayor número de proteínas únicas se encuentra en CS, identificando 43 proteínas, siendo 2.15
veces más que en CL (Figura 26). Mientras que, 36 proteínas fueron identificadas en común entre
ambos cultivos, siendo en su mayoría relacionadas al metabolismo de carbohidratos, y como
segundo grupo abundante, asociadas al metabolismo redox.
Figura 25. Diagrama de Venn correspondiente a las proteínas secretadas en ambos cultivos por A. brasiliensis a 60 g/L.
83
Carbohidratos
Sin caracterizar
Lípidos
Metabolismo/proceso Proteínas/proteólisis
Proceso/componente…
Aminoácidos
Transporte
Redox/estrés
Misceláneos
Energía
0 5 10 15 20 25
No. de proteínas
Figura 26. Clasificación de proteínas únicas de cada tipo de cultivo a 60 g/L; Barras vacías: cultivo líquido, barras oscuras:
cultivo sólido.
Todas las proteínas únicas de 60 g/L en CL, presentaron evidencia de secreción; en cambio
en CS, se identificaron 10 proteínas consideradas intracelulares. Como se ha discutido previamente,
la presencia de proteínas sin evidencia de secreción sería el resultado de la participación de
proteínas moonlighting secretadas vesicularmente, y que pueden estar asociadas a procesos de
adhesión, como la transaldolasa y la triosafosfato isomerasa (Serrano-Fujarte et al., 2016;
Westermann et al., 2016), por lo que la identificación de estas enzimas en la región extracelular
correspondería exclusivamente del CS.
El mayor número de proteínas se concentra en el metabolismo de carbohidratos, sin

embargo, al compararse entre CS y CL, se observa 3.5 veces más proteínas en CS; entre estas,
diversas glucanasas, glucosidasas, una quitinasa y una N-acetilglucosaminidasa, todas relacionas al
crecimiento celular, lo que sugiere que A. brasiliensis utiliza un amplio sistema de enzimas asociadas
al crecimiento y mantenimiento de las hifas, lo que hace que el crecimiento sea más rápido en CS,
como lo demostró con el corto tiempo que requirió A. brasiliensis en alcanzar la MTPCO2, así como,
el alto valor que presentó este parámetro.
Por lo tanto, el tipo de cultivo no es un factor que influya en la alta producción de CO2 y la
concentración de proteína secretada por parte de A. brasiliensis, así como, en el nivel de
ramificación, ya que los resultados obtenidos no mostraron diferencias significativas al compararse
84
60 g/L de glucosa entre ambos cultivos, esto demuestra lo contrario a lo reportado frecuentemente
con CS. Sin embargo, con el estudio del secretoma se demostró que el tipo de cultivo influye a nivel
molecular, en donde el número de proteínas únicas fue mayor en CS; secretando una alta diversidad
y número de proteínas relacionadas al crecimiento celular. A partir de esta observación, se puede
inferir que A. brasiliensis expresa un amplio sistema proteico que permite un crecimiento más
rápido en CS, a su vez, dicho cultivo permite obtener la misma concentración de proteína en menor
tiempo, y con la ventaja que se puede incrementar aún más la concentración de glucosa sin observar
efectos negativos en el crecimiento como se observó en CL.
85
8. CONCLUSIONES
8.1. Conclusión general

El análisis del secretoma de Aspergillus brasiliensis en cultivos sólido y líquido permitió identificar y
explicar algunas de las diferencias observadas en los estudios cinéticos y morfométricos realizados
en ambos tipos de cultivo; en particular, el estudio secretómico demostró la ausencia de represión
catabólica y la secreción de un gran número de proteínas típicamente intracelulares en cultivo
sólido; algunas de ellas, posibles proteínas moonlighting, que pueden estar asociadas con procesos
de adhesión de las hifas a los soportes sólidos. El incremento de la complejidad del secretoma en
función de la concentración de glucosa permitió establecer que, en cultivo sólido, Aspergillus
brasiliensis secreta un importante grupo de proteínas asociadas al metabolismo oxidativo, al
crecimiento celular y a la biosíntesis de pared celular; lo que permite explicar algunas de las
importantes diferencias fisiológicas y metabólicas entre los cultivos sólido y líquido.
8.2. Conclusiones parciales

• La definición del tiempo de cultivo con base a la máxima tasa de producción de CO2, para
cada cultivo y condición evaluada, estableció un criterio de muestreo que permitió la
comparación de muestras biológicas con un estado fisiológico comparable entre los cultivos
sólido y líquido.
• La mayor producción de proteína extracelular en cultivo sólido se encontró relacionada con

el mayor índice de ramificación de las hifas en este tipo de cultivo. Mientras que, no existen
diferencias significativas en cultivo líquido.
• La complejidad del secretoma en cultivo sólido es mayor que en cultivo líquido; el número
de proteínas en cultivo sólido aumento al elevar la concentración de glucosa inicial en el
medio.
• La mayor parte de las proteínas identificadas en cultivo sólido no están sujetas a represión
catabólica; mientras que, en cultivo líquido la identificación de sólo dos enzimas (la pectin
liasa F y β-xilanasa), permiten establecer que la represión catabólica por glucosa no es
general para todas las proteínas en cultivo líquido, y éstas podrían ser candidatas para el
estudio de mecanismos de represión alternos al factor de transcripción CreA.
86
• La presencia en el secretoma de un número importante de proteínas involucradas en
reacciones de óxido-reducción puede estar relacionada con la regulación de especies
reactivas de oxígeno; así como, con el aumento en el índice de ramificación en cultivo sólido.
• El incremento en el grado de ramificación y el rápido crecimiento observados en cultivo

sólido pueden estar relacionados con un complejo sistema enzimático involucrado en los
procesos de biosíntesis de la pared celular durante el crecimiento apical.
• El alto número de proteínas identificadas que no presentaron evidencia de secreción en

cultivo sólido sugiere la presencia de mecanismos de secreción aún desconocidos para los
hongos filamentosos crecidos en este tipo de cultivo.
• El cultivo sólido induce a A. brasiliensis secretar posibles proteínas moonlighting que

favorecen principalmente a los procesos de adhesión al soporte.
87
9. PERSPECTIVAS
A partir de los resultados obtenidos en este trabajo, se sugieren las siguientes perspectivas para la
realización de posibles estudios que permitan comprender mejor las diferencias entre ambos
cultivos.
• Realizar cinéticas de producción de biomasa y consumo de glucosa en ambos cultivos.

• Determinar el nivel de actividad exocítica en cada condición y su posible caracterización del
contenido de las vesículas a través de espectrometría de masas.
• Caracterizar el proteoma intracelular para identificar el flujo de carbono en cada tipo de
cultivo y a la vez, identificar el cambio de abundancia de las proteínas relacionadas con la
secreción.
• Realizar la caracterización de subproteomas (pared celular, vesículas, mitocondrias) para
tener la localización específica de las proteínas y determinar con mayor precisión proteínas
moonlighting.
• Disrupción de genes de posibles proteínas moonlighting para determinar sus funciones en
A. brasiliensis.
• Analizar los niveles de expresión del gen creA y determinar su papel en el proceso de
represión catabólica en los sistemas de CS y CL, así como, identificar los cambios de los
patrones de fosforilación de CreA en ambos sistemas de cultivo.
• Corroborar actividades enzimáticas de aquellas proteínas que se encontraron en mayor
número y abundancia, y que podrían tener un papel importante durante el desarrollo
celular (por ejemplo, aquellas relacionadas con especies reactivas de oxígeno, síntesis de
pared celular, síntesis de biopelículas, enzimas proteolíticas, etc.), así como, la
determinación del nivel de expresión de éstas, con el objeto de tener una visión más
completa de como responde cada sistema.
88
10. BIBLIOGRAFÍA
Acuña-Argüelles, M. E., Gutiérrez-Rojas, M., Viniegra-González, G., & Favela-Torres, E. (1995). Production and
properties of three pectinolytic activities produced by Aspergillus niger in submerged and solid-state
fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology, 43(5), 808–814.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7576547
Adav, S. S., Li, A. A., Manavalan, A., Punt, P., & Sze, S. K. (2010). Quantitative iTRAQ Secretome Analysis of
Aspergillus niger Reveals Novel Hydrolytic Enzymes. Journal of Proteome Research, 9(8), 3932–3940.
https://doi.org/10.1021/pr100148j
Adnan, M., Zheng, W., Islam, W., Arif, M., Abubakar, Y. S., Wang, Z., & Lu, G. (2018). Carbon catabolite
repression in filamentous Fungi. In International Journal of Molecular Sciences (Vol. 19, Issue 1). MDPI
AG. https://doi.org/10.3390/ijms19010048
Aebersold, R., & Mann, M. (2003). Mass spectrometry-based proteomics. In Nature (Vol. 422, Issue 6928, pp.
198–207). https://doi.org/10.1038/nature01511
Agger, T., Petersen, J. B., O’Connor, S. M., Murphy, R. L., Kelly, J. M., & Nielsen, J. (2002). Physiological
characterisation of recombinant Aspergillus nidulans strains with different creA genotypes expressing
A. oryzae alpha-amylase. Journal of Biotechnology, 92(3), 279–285. https://doi.org/10.1016/s0168-
1656(01)00366-2
Ahamed, A., & Vermette, P. (2009). Effect of culture medium composition on Trichoderma reesei’s
morphology and cellulase production. Bioresource Technology, 100(23), 5979–5987.
https://doi.org/10.1016/j.biortech.2009.02.070
Amblee, V., & Jeffery, C. J. (2015). Physical Features of Intracellular Proteins that Moonlight on the Cell
Surface. PLOS ONE, 10(6), e0130575. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130575
Andersen, M. R., Nielsen, M. L., & Nielsen, J. (2008). Metabolic model integration of the bibliome, genome,
metabolome and reactome of Aspergillus niger. Molecular Systems Biology, 4, 178.
https://doi.org/10.1038/msb.2008.12
Anjo, S. I., Figueiredo, F., Fernandes, R., Manadas, B., & Oliveira, M. (2017). A proteomic and ultrastructural
characterization of Aspergillus fumigatus’ conidia adaptation at different culture ages. Journal of
Proteomics, 161, 47–56. https://doi.org/10.1016/j.jprot.2017.03.021
Asif, A. R., Oellerich, M., Amstrong, V. W., Riemenschneider, B., Monod, M., & Reichard, U. (2006). Proteome
of Conidial Surface Associated Proteins of Aspergillus fumigatus Reflecting Potential Vaccine Candidates
and Allergens. Journal of Proteome Research, 5(4), 954–962. https://doi.org/10.1021/pr0504586
Baez, A., & Shiloach, J. (2014). Effect of elevated oxygen concentration on bacteria, yeasts, and cells
propagated for production of biological compounds. Microbial Cell Factories, 13, 181.
https://doi.org/10.1186/s12934-014-0181-5
Barrios-González, J. (2012). Solid-state fermentation: Physiology of solid medium, its molecular basis and
applications. In Process Biochemistry (Vol. 47, Issue 2, pp. 175–185). Elsevier.
https://doi.org/10.1016/j.procbio.2011.11.016
Barrios-González, J. (2018). Secondary Metabolites Production: Physiological Advantages in Solid-State

Fermentation. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering, 257–283.
https://doi.org/10.1016/B978-0-444-63990-5.00013-X
89
Bermúdez-García, E., Peña-Montes, C., Castro-Rodríguez, J. A., González-Canto, A., Navarro-Ocaña, A., &
Farrés, A. (2017). ANCUT2, a Thermo-alkaline Cutinase from Aspergillus nidulans and Its Potential
Applications. Applied Biochemistry and Biotechnology, 182(3), 1014–1036.
https://doi.org/10.1007/s12010-016-2378-z
Bladt, T. T., Frisvad, J. C., Knudsen, P. B., & Larsen, T. O. (2013). Anticancer and antifungal compounds from
Aspergillus, Penicillium and other filamentous fungi. In Molecules (Vol. 18, Issue 9, pp. 11338–11376).
Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI). https://doi.org/10.3390/molecules180911338
Bocking, S. P., Wiebe, M. G., Robson, G. D., Hansen, K., Christiansen, L. H., & Trinci, A. P. (1999). Effect of
branch frequency in Aspergillus oryzae on protein secretion and culture viscosity. Biotechnology and
Bioengineering, 65(6), 638–648. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10550770
Boratyński, F., Szczepańska, E., Grudniewska, A., Gniłka, R., & Olejniczak, T. (2018). Improving of hydrolases
biosythesis by solid-state fermentation of Penicillium camemberti on rapeseed cake. Scientific Reports,
8(1), 1–9. https://doi.org/10.1038/s41598-018-28412-y
Breitenbach, M., Weber, M., Rinnerthaler, M., Karl, T., & Breitenbach-Koller, L. (2015). Oxidative Stress in
Fungi: Its Function in Signal Transduction, Interaction with Plant Hosts, and Lignocellulose Degradation.
Biomolecules, 5(2), 318–342. https://doi.org/10.3390/biom5020318
Brown, L., Kessler, A., Cabezas-Sanchez, P., Luque-Garcia, J. L., & Casadevall, A. (2014). Extracellular vesicles
produced by the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis are disrupted by the lipopeptide surfactin.
Molecular Microbiology, 93(1), 183–198. https://doi.org/10.1111/mmi.12650
Brown, L., Wolf, J. M., Prados-Rosales, R., & Casadevall, A. (2015). Through the wall: Extracellular vesicles in
Gram-positive bacteria, mycobacteria and fungi. In Nature Reviews Microbiology (Vol. 13, Issue 10, pp.
620–630). Nature Publishing Group. https://doi.org/10.1038/nrmicro3480
Bruneau, J. M., Magnin, T., Tagat, E., Legrand, R., Bernard, M., Diaquin, M., Fudali, C., & Latgé, J. P. (2001).
Proteome analysis of Aspergillus fumigatus identifies glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins
associated to the cell wall biosynthesis. Electrophoresis, 22(13), 2812–2823.
https://doi.org/10.1002/1522-2683(200108)22:13<2812::AID-ELPS2812>3.0.CO;2-Q
Brunelle, J. L., & Green, R. (2014). One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). In
Methods in Enzymology (Vol. 541, pp. 151–159). Academic Press Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-
12-420119-4.00012-4
Cagas, S. E., Jain, M. R., Li, H., & Perlin, D. S. (2011). Profiling the Aspergillus fumigatus proteome in response
to caspofungin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 55(1), 146–154.
https://doi.org/10.1128/AAC.00884-10
Carrasco Navarro, U. (2017). Análisis proteómico de las vías de señalización mediadas por la subunidad Gα
Pga1 de una proteína G heterotrimérica de Penicillium chrysogenum. Universidad Autónoma
Metropolitana.
Carrillo-Sancen, G., Carrasco-Navarro, U., Tomasini-Campocosio, A., Corzo, G., Pedraza-Escalona, M. M., &
Favela-Torres, E. (2016). Effect of glucose as a carbon repressor on the extracellular proteome of
Aspergillus niger during the production of amylases by solid state cultivation. Process Biochemistry,
51(12), 2001–2010. https://doi.org/10.1016/J.PROCBIO.2016.09.001
Castilho, L. R., Polato, C. M. S., Baruque, E. A., Sant’Anna, G. L., & Freire, D. M. G. (2000). Economic analysis of
lipase production by Penicillium restrictum in solid-state and submerged fermentations. Biochemical
Engineering Journal, 4(3), 239–247. https://doi.org/10.1016/S1369-703X(99)00052-2
90
Chabane, S., Sarfati, J., Ibrahim-Granet, O., Du, C., Schmidt, C., Mouyna, I., Prevost, M.-C., Calderone, R., &
Latge, J.-P. (2006). Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Ecm33p Influences Conidial Cell Wall
Biosynthesis in Aspergillus fumigatus. Applied and Environmental Microbiology, 72(5), 3259–3267.
https://doi.org/10.1128/AEM.72.5.3259-3267.2006
Chen, T., Zhao, J., Ma, J., & Zhu, Y. (2015). Web resources for mass spectrometry-based proteomics. In
Genomics, Proteomics and Bioinformatics (Vol. 13, Issue 1, pp. 36–39). Beijing Genomics Institute.
https://doi.org/10.1016/j.gpb.2015.01.004
Chevalier, F. (2010). Highlights on the capacities of “Gel-based” proteomics. In Proteome Science (Vol. 8, p.
23). https://doi.org/10.1186/1477-5956-8-23
Colin, V. L., Baigorí, M. D., & Pera, L. M. (2013). Tailoring fungal morphology of Aspergillus niger MYA 135 by
altering the hyphal morphology and the conidia adhesion capacity: biotechnological applications. AMB
Express, 3(1), 27. https://doi.org/10.1186/2191-0855-3-27
Conesa, A., Punt, P. J., Van Luijk, N., & Van den Hondel, C. A. M. J. J. (2001). The secretion pathway in
filamentous fungi: A biotechnological view. In Fungal Genetics and Biology (Vol. 33, Issue 3, pp. 155–
171). Academic Press Inc. https://doi.org/10.1006/fgbi.2001.1276
Coutinho, P. M., Andersen, M. R., Kolenova, K., vanKuyk, P. A., Benoit, I., Gruben, B. S., Trejo-Aguilar, B., Visser,
H., van Solingen, P., Pakula, T., Seiboth, B., Battaglia, E., Aguilar-Osorio, G., de Jong, J. F., Ohm, R. A.,
Aguilar, M., Henrissat, B., Nielsen, J., Stålbrand, H., & de Vries, R. P. (2009). Post-genomic insights into
the plant polysaccharide degradation potential of Aspergillus nidulans and comparison to Aspergillus
niger and Aspergillus oryzae. Fungal Genetics and Biology : FG & B, 46 Suppl 1, S161–S169.
https://doi.org/10.1016/j.fgb.2008.07.020
Cunha, F. M., Esperança, M. N., Zangirolami, T. C., Badino, A. C., & Farinas, C. S. (2012). Sequential solid-state
and submerged cultivation of Aspergillus niger on sugarcane bagasse for the production of cellulase.
Bioresource Technology, 112, 270–274. https://doi.org/10.1016/J.BIORTECH.2012.02.082
Das, K., & Mukherjee, A. K. (2007). Crude petroleum-oil biodegradation efficiency of Bacillus subtilis and
Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a petroleum-oil contaminated soil from North-East India.
Bioresource Technology, 98(7), 1339–1345. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2006.05.032
Díaz-Godínez, G., Soriano-Santos, J., Augur, C., & Viniegra-González, G. (2001). Exopectinases produced by
Aspergillus niger in solid-state and submerged fermentation: a comparative study. Journal of Industrial
Microbiology & Biotechnology, 26(5), 271–275. https://doi.org/10.1038/sj/jim/7000113
Domingues, Queiroz, Cabral, & Fonseca. (2000). The influence of culture conditions on mycelial structure and
cellulase production by Trichoderma reesei Rut C-30. Enzyme and Microbial Technology, 26(5–6), 394–
401. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10713213
Domon, B., & Aebersold, R. (2006). Mass spectrometry and protein analysis. In Science (Vol. 312, Issue 5771,
pp. 212–217). https://doi.org/10.1126/science.1124619
Doyle, S. (2011). Fungal proteomics: From identification to function. In FEMS Microbiology Letters (Vol. 321,
Issue 1, pp. 1–9). https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2011.02292.x
Dyballa, N., & Metzger, S. (2009). Fast and sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteins in
polyacrylamide gels. Journal of Visualized Experiments, 30. https://doi.org/10.3791/1431
Dynesen, J., & Nielsen, J. (2003). Branching is coordinated with mitosis in growing hyphae of Aspergillus
nidulans. Fungal Genetics and Biology : FG & B, 40(1), 15–24.
91
El-Aneed, A., Cohen, A., & Banoub, J. (2009). Mass spectrometry, review of the basics: Electrospray, MALDI,
and commonly used mass analyzers. In Applied Spectroscopy Reviews (Vol. 44, Issue 3, pp. 210–230).
Taylor & Francis Group . https://doi.org/10.1080/05704920902717872
El-Enshasy, H. A. (2007). Filamentous Fungal Cultures-Process Characteristics, Products, and Applications. In

Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources (pp. 225–261). Elsevier.
https://doi.org/10.1016/B978-044452114-9/50010-4
Eugster, P. J., Salamin, K., Grouzmann, E., & Monod, M. (2015). Production and characterization of two major
Aspergillus oryzae secreted prolyl endopeptidases able to efficiently digest proline-rich peptides of
gliadin. Microbiology (United Kingdom), 161(12), 2277–2288. https://doi.org/10.1099/mic.0.000198
Falony, G., Armas, J. C., Mendoza, J. C. D., & Hernández, J. L. M. (2006). Production of Extracellular Lipase from
Aspergillus niger by Solid-State Fermentation. Food Technol. Biotechnol., 44 (2), 235–240.
https://www.ftb.com.hr/archives/80-volume-44-issue-no-2/452-production-of-extracellular-lipase-
from-aspergillus-niger-by-solid-state-fermentation
Favela-Torres, E., Cordova-López, J., García-Rivero, M., & Gutiérrez-Rojas, M. (1998). Kinetics of growth of
Aspergillus niger during submerged, agar surface and solid state fermentations. Process Biochemistry,
33(2), 103–107. https://doi.org/10.1016/S0032-9592(97)00032-0
Ferreira de Oliveira, J. M. P., van Passel, M. W. J., Schaap, P. J., & de Graaff, L. H. (2010). Shotgun proteomics
of Aspergillus niger microsomes upon D-xylose induction. Applied and Environmental Microbiology,
76(13), 4421–4429. https://doi.org/10.1128/AEM.00482-10
Florencio, C., Cunha, F. M., Badino, A. C., Farinas, C. S., Ximenes, E., & Ladisch, M. R. (2016). Secretome analysis
of Trichoderma reesei and Aspergillus niger cultivated by submerged and sequential fermentation
processes: Enzyme production for sugarcane bagasse hydrolysis. Enzyme and Microbial Technology, 90,
53–60. https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2016.04.011
Free, S. J. (2013). Fungal Cell Wall Organization and Biosynthesis. In Advances in genetics (Vol. 81, pp. 33–82).
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-407677-8.00002-6
Freson, K. (2019). The Platelet Proteome. In Platelets (pp. 155–167). Elsevier. https://doi.org/10.1016/b978-
0-12-813456-6.00008-4
Gamarra, N. N., Villena, G. K., & Gutiérrez-Correa, M. (2010). Cellulase production by Aspergillus niger in
biofilm, solid-state, and submerged fermentations. Applied Microbiology and Biotechnology, 87(2), 545–
551. https://doi.org/10.1007/s00253-010-2540-4
Gancedo, C., Flores, C.-L., & Gancedo, J. M. (2016). The Expanding Landscape of Moonlighting Proteins in
Yeasts. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 80(3), 765–777.
https://doi.org/10.1128/MMBR.00012-16
García Ortiz, N. (2016). CALIDAD Y PROTEOMA DE CONIDIOS DE Metarhizium anisopliae PRODUCIDOS CON
ATMÓSFERAS MODIFICADAS. Universidad Autónoma Metropolitana.
Gastebois, A., Clavaud, C., Aimanianda, V., & Latgé, J.-P. (2009). Aspergillus fumigatus : cell wall
polysaccharides, their biosynthesis and organization. Future Microbiology, 4(5), 583–595.
https://doi.org/10.2217/fmb.09.29
Gautam, P., Shankar, J., Madan, T., Sirdeshmukh, R., Sundaram, C. S., Gade, W. N., Basir, S. F., & Sarma, P. U.
(2008). Proteomic and transcriptomic analysis of Aspergillus fumigatus on exposure to amphotericin B.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52(12), 4220–4227. https://doi.org/10.1128/AAC.01431-07
92
Giraldo, M. A., da Silva, T. M., Salvato, F., Terenzi, H. F., Jorge, J. A., & Guimarães, L. H. S. (2012). Thermostable
invertases from Paecylomyces variotii produced under submerged and solid-state fermentation using
agroindustrial residues. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(2), 463–472.
Gomes, E., da Silva, R., de Cassia Pereira, J., & Ladino-Orjuela, G. (2018). Fungal Growth on Solid Substrates:
A Physiological Overview. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering, 31–56.
Gomes, J., Zeni, J., Cence, K., Toniazzo, G., Treichel, H., & Valduga, E. (2011). Evaluation of production and
characterization of polygalacturonase by Aspergillus niger ATCC 9642. Food and Bioproducts Processing,
89(4), 281–287. https://doi.org/10.1016/J.FBP.2010.10.002
González-Rodríguez, I., Sánchez, B., Ruiz, L., Turroni, F., Ventura, M., Ruas-Madiedo, P., Gueimonde, M., &
Margolles, A. (2012). Role of extracellular transaldolase from Bifidobacterium bifidum in mucin adhesion
and aggregation. Applied and Environmental Microbiology, 78(11), 3992–3998.
https://doi.org/10.1128/AEM.08024-11
Gow, N. A. R., Latge, J.-P., & Munro, C. A. (2017). The Fungal Cell Wall: Structure, Biosynthesis, and Function.
Microbiology Spectrum, 5(3). https://doi.org/10.1128/microbiolspec.FUNK-0035-2016
Grintzalis, K., Vernardis, S. I., Klapa, M. I., & Georgiou, C. D. (2014). Role of oxidative stress in sclerotial
differentiation and aflatoxin B1 biosynthesis in Aspergillus flavus. Applied and Environmental
Microbiology, 80(18), 5561–5571. https://doi.org/10.1128/AEM.01282-14
Gulcicek, E. E., Colangelo, C. M., McMurray, W., Stone, K., Williams, K., Wu, T., Zhao, H., Spratt, H., Kurosky,
A., & Wu, B. (2005). Proteomics and the Analysis of Proteomic Data: An Overview of Current Protein-
Profiling Technologies. Current Protocols in Bioinformatics, 10(1), 13.1.1-13.1.31.
https://doi.org/10.1002/0471250953.bi1301s10
Gustavo Viniegra-González* and Ernesto Favela-Torres. (2006). Why Solid-State Fermentation Seems to be
Resistant to Catabolite Repression? http://www.ftb.com.hr/archives/76-volume-44-issue-no-3/389-
why-solid-state-fermentation-seems-to-be-resistant-to-catabolite-repression
Gutiérrez-Rojas, M., Córdova, J., Auria, R., Revah, S., & Favela-Torres, E. (1995). Citric acid and polyols
production by Aspergillus niger at high glucose concentration in solid state fermentation on inert
support. Biotechnology Letters, 17(2), 219–224. https://doi.org/10.1007/BF00127992
Han, M.-J., Kim, N.-J., Lee, S. Y., & Chang, H. N. (2010). Extracellular proteome of Aspergillus terreus grown on
different carbon sources. Current Genetics, 56(4), 369–382. https://doi.org/10.1007/s00294-010-0308-
0
Harris, S. D. (2008). Branching of fungal hyphae: Regulation, mechanisms and comparison with other
branching systems. Mycologia, 100(6), 823–832. https://doi.org/10.3852/08-177
Hayakawa, Y., Ishikawa, E., Shoji, J. ya, Nakano, H., & Kitamoto, K. (2011). Septum-directed secretion in the
filamentous fungus Aspergillus oryzae. Molecular Microbiology, 81(1), 40–55.
https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2011.07700.x
Hedayati, M. T., Pasqualotto, A. C., Warn, P. A., Bowyer, P., & Denning, D. W. (2007). Aspergillus flavus: Human
pathogen, allergen and mycotoxin producer. In Microbiology (Vol. 153, Issue 6, pp. 1677–1692).
https://doi.org/10.1099/mic.0.2007/007641-0
Hill, T. W., & Kafer, E. (2001). Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal
medium salt stock solutions. Fungal Genetics Newsletter.
93
Ho, Y., Gruhler, A., Heilbut, A., Bader, G. D., Moore, L., Adams, S. L., Millar, A., Taylor, P., Bennett, K., Boutilier,
K., Yang, L., Wolting, C., Donaldson, I., Schandorff, S., Shewnarane, J., Vo, M., Taggart, J., Goudreault,
M., Muskat, B., … Tyers, M. (2002). Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces
cerevisiae by mass spectrometry. In Nature (Vol. 415, Issue 6868, pp. 180–183).
https://doi.org/10.1038/415180a
Hölker, U., & Lenz, J. (2005). Solid-state fermentation - Are there any biotechnological advantages? In Current
Opinion in Microbiology (Vol. 8, Issue 3, pp. 301–306). Elsevier Current Trends.
https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.04.006
Houseknecht, J., Stamenova, E., Suh, S.-O., Beck, B., McKee, M., & Zhou, J. (2008). Reclassification of ATCC®
16404TM and ATCC® 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter
– Vol. 14 (10).
Huberts, D. H. E. W., & van der Klei, I. J. (2010). Moonlighting proteins: An intriguing mode of multitasking.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 1803(4), 520–525.
https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2010.01.022
Ibarra, B. A., Lohmar, J. M., Satterlee, T., McDonald, T., Cary, J. W., & Calvo, A. M. (2018). The 14-3-3 protein
homolog ArtA regulates development and secondary metabolism in the opportunistic plant pathogen
Aspergillus flavus. Applied and Environmental Microbiology, 84(5).
https://doi.org/10.1128/AEM.02241-17
Ichinose, S., Tanaka, M., Shintani, T., & Gomi, K. (2014). Improved α-amylase production by Aspergillus oryzae
after a double deletion of genes involved in carbon catabolite repression. Applied Microbiology and
Biotechnology, 98(1), 335–343. https://doi.org/10.1007/s00253-013-5353-4
Ichinose, S., Tanaka, M., Shintani, T., & Gomi, K. (2018). Increased production of biomass-degrading enzymes
by double deletion of creA and creB genes involved in carbon catabolite repression in Aspergillus oryzae.
Journal of Bioscience and Bioengineering, 125(2), 141–147.
https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2017.08.019
Iwashita, K., Nagahara, T., Kimura, H., Takano, M., Shimoi, H., & Ito, K. (1999). The bglA gene of Aspergillus
kawachii encodes both extracellular and cell wall-bound beta-glucosidases. Applied and Environmental
Microbiology, 65(12), 5546–5553. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10584016
Jami, M. S., Barreiro, C., García-Estrada, C., & Martín, J. F. (2010). Proteome analysis of the penicillin producer
Penicillium chrysogenum: Characterization of protein changes during the industrial strain improvement.
Molecular and Cellular Proteomics, 9(6), 1182–1198. https://doi.org/10.1074/mcp.M900327-MCP200
Jeffery, C. J. (2015). Why study moonlighting proteins? Frontiers in Genetics, 6, 211.

https://doi.org/10.3389/fgene.2015.00211
Joffe, L. S., Nimrichter, L., Rodrigues, M. L., & Del Poeta, M. (2016). Potential Roles of Fungal Extracellular
Vesicles during Infection. MSphere, 1(4). https://doi.org/10.1128/mSphere.00099-16
Jun, H., Kieselbach, T., & Jönsson, L. J. (2011). Enzyme production by filamentous fungi: analysis of the
secretome of Trichoderma reesei grown on unconventional carbon source. Microbial Cell Factories,
10(1), 68. https://doi.org/10.1186/1475-2859-10-68
Jung, G., Ueno, H., & Hayashi, R. (1999). Carboxypeptidase Y: Structural basis for protein sorting and catalytic
triad. In Journal of Biochemistry (Vol. 126, Issue 1, pp. 1–6). Japanese Biochemical Society.
https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a022408
Kanehisa, M. (2000). KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Research, 28(1), 27–30.
94
https://doi.org/10.1093/nar/28.1.27
Kapp, K., Schrempf, S., Lemberg, M. K., & Dobberstein, B. (2013). Post-Targeting Functions of Signal Peptides.
Kim, Y., Nandakumar, M. P., & Marten, M. R. (2007). Proteome map of Aspergillus nidulans during
osmoadaptation. Fungal Genetics and Biology, 44(9), 886–895.
Kniemeyer, O. (2011). Proteomics of eukaryotic microorganisms: The medically and biotechnologically

important fungal genus Aspergillus. In Proteomics (Vol. 11, Issue 15, pp. 3232–3243).
https://doi.org/10.1002/pmic.201100087
Kraus, P. R., Hofmann, A. F., & Harris, S. D. (2002). Characterization of the Aspergillus nidulans 14-
3â3 homologue, ArtA. FEMS Microbiology Letters, 210(1), 61–66.
https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2002.tb11160.x
Krijgsheld, P., Altelaar, A. F. M., Post, H., Ringrose, J. H., Müller, W. H., Heck, A. J. R., & Wösten, H. A. B. (2012).
Spatially resolving the secretome within the mycelium of the cell factory Aspergillus niger. Journal of
Proteome Research, 11(5), 2807–2818. https://doi.org/10.1021/pr201157b
Kwon-Chung, K. J., & Sugui, J. A. (2013). Aspergillus fumigatus-What Makes the Species a Ubiquitous Human
Fungal Pathogen? PLoS Pathogens, 9(12), 1–4. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003743
Lambou, K., Lamarre, C., Beau, R., Dufour, N., & Latge, J. P. (2010). Functional analysis of the superoxide
dismutase family in Aspergillus fumigatus. Molecular Microbiology, 75(4), 910–923.
https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2009.07024.x
Lee, I. H., Walline, R. G., & Plamann, M. (1998). Apolar growth of Neurospora crassa leads to increased
secretion of extracellular proteins. Molecular Microbiology, 29(1), 209–218.
Lekha, P. K., & Lonsane, B. K. (1994). Comparative titres, location and properties of tannin acyl hydrolase
produced by Aspergillus niger PKL 104 in solid-state, liquid surface an submerged fermentations. Process
Biochemistry, 29(6), 497–503. https://doi.org/10.1016/0032-9592(94)85019-4
Li, C., Shi, L., Chen, D., Ren, A., Gao, T., & Zhao, M. (2015). Functional analysis of the role of glutathione
peroxidase (GPx) in the ROS signaling pathway, hyphal branching and the regulation of ganoderic acid
biosynthesis in Ganoderma lucidum. Fungal Genetics and Biology, 82, 168–180.
Li, Y., Peng, X., & Chen, H. (2013). Comparative characterization of proteins secreted by Neurospora sitophila
in solid-state and submerged fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering, 116(4), 493–498.
https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2013.04.001
Lin, D., Tabb, D. L., & Yates, J. R. (2003). Large-scale protein identification using mass spectrometry. In
Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics (Vol. 1646, Issues 1–2, pp. 1–10). Elsevier.
https://doi.org/10.1016/S1570-9639(02)00546-0
Liu, D., Li, J., Zhao, S.,Zhang, R., Wang, M., Miao, Y., Shen, Y. and Shen, Q. (2013). Secretome diversity and
quantitative analysis of cellulolytic Aspergillus fumigatus Z5 in the presence of different carbon sources.
Biotechnology for Biofuels, 6, 149. http://www.biotechnologyforbiofuels.com/content/6/1/149
Liu, T., Song, T., Zhang, X., Yuan, H., Su, L., Li, W., Xu, J., Liu, S., Chen, L., Chen, T., Zhang, M., Gu, L., Zhang, B.,
& Dou, D. (2014). Unconventionally secreted effectors of two filamentous pathogens target plant
salicylate biosynthesis. Nature Communications, 5(1), 4686. https://doi.org/10.1038/ncomms5686
95
Liu, X.-D., Xie, L., Wei, Y., Zhou, X., Jia, B., Liu, J., & Zhang, S. (2014). Abiotic Stress Resistance, a Novel
Moonlighting Function of Ribosomal Protein RPL44 in the Halophilic Fungus Aspergillus glaucus. Applied
and Environmental Microbiology, 80(14), 4294–4300. https://doi.org/10.1128/AEM.00292-14
Liu, Y., Kern, J. T., Walker, J. R., Johnson, J. A., Schultz, P. G., & Luesch, H. (2007). A genomic screen for
activators of the antioxidant response element. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 104(12), 5205–5210. https://doi.org/10.1073/pnas.0700898104
Lonsdale, A., Davis, M. J., Doblin, M. S., & Bacic, A. (2016). Better than nothing? Limitations of the prediction
tool secretomeP in the search for leaderless secretory proteins (LSPs) in plants. Frontiers in Plant
Science, 7(September2016), 1451. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.01451
Lopez-Ramirez, N., Volke-Sepulveda, T., Gaime-Perraud, I., Saucedo-Castañeda, G., & Favela-Torres, E. (2018).
Effect of stirring on growth and cellulolytic enzymes production by Trichoderma harzianum in a novel
bench-scale solid-state fermentation bioreactor. Bioresource Technology, 265, 291–298.
https://doi.org/10.1016/j.biortech.2018.06.015
Lu, X., Sun, J., Nimtz, M., Wissing, J., Zeng, A.-P., & Rinas, U. (2010). The intra- and extracellular proteome of
Aspergillus niger growing on defined medium with xylose or maltose as carbon substrate. Microbial Cell
Factories, 9, 23. https://doi.org/10.1186/1475-2859-9-23
M., S., Singh, S., Tiwari, R., Goel, R., & Nain, L. (2016). Do cultural conditions induce differential protein
expression: Profiling of extracellular proteome of Aspergillus terreus CM20. Microbiological Research,
192, 73–83. https://doi.org/10.1016/j.micres.2016.06.006
Machado de Castro, A., Fragoso dos Santos, A., Kachrimanidou, V., Koutinas, A. A., & Freire, D. M. G. (2018).
Solid-State Fermentation for the Production of Proteases and Amylases and Their Application in Nutrient
Medium Production. In Current Developments in Biotechnology and Bioengineering (pp. 185–210).
Elsevier. https://doi.org/10.1016/b978-0-444-63990-5.00010-4
Machida, M., Yamada, O., & Gomi, K. (2008). Genomics of Aspergillus oryzae: learning from the history of koji
mold and exploration of its future. In DNA Research (Vol. 15, Issue 4, pp. 173–183).
https://doi.org/10.1093/dnares/dsn020
Maeda, H., Sano, M., Maruyama, Y., Tanno, T., Akao, T., Totsuka, Y., Endo, M., Sakurada, R., Yamagata, Y.,
Machida, M., Akita, O., Hasegawa, F., Abe, K., Gomi, K., Nakajima, T., & Iguchi, Y. (2004). Transcriptional
analysis of genes for energy catabolism and hydrolytic enzymes in the filamentous fungus Aspergillus
oryzae using cDNA microarrays and expressed sequence tags. Applied Microbiology and Biotechnology,
65(1), 74–83. https://doi.org/10.1007/s00253-004-1608-4
Mäkelä, M. R., Aguilar-Pontes, M. V., Van Rossen-Uffink, D., Peng, M., & De Vries, R. P. (2018). The fungus
Aspergillus niger consumes sugars in a sequential manner that is not mediated by the carbon catabolite
repressor CreA. Scientific Reports, 8(1), 1–8. https://doi.org/10.1038/s41598-018-25152-x
Maldonado, M. C., & Strasser de Saad, A. M. (1998). Production of pectinesterase and polygalacturonase by
Aspergillus niger in submerged and solid state systems. Journal of Industrial Microbiology &
Biotechnology, 20(1), 34–38. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9523455
Mani, M., Chen, C., Amblee, V., Liu, H., Mathur, T., Zwicke, G., Zabad, S., Patel, B., Thakkar, J., & Jeffery, C. J.
(2015). MoonProt: a database for proteins that are known to moonlight. Nucleic Acids Research, 43(D1),
D277–D282. https://doi.org/10.1093/nar/gku954
Martínez-Valdez, F. J., Martínez-Ramírez, C., Martínez-Montiel, L., Favela-Torres, E., Soto-Cruz, N. O., Ramírez-
Vives, F., & Saucedo-Castañeda, G. (2015). Rapid mineralisation of the Organic Fraction of Municipal
Solid Waste. Bioresource Technology, 180, 112–118. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2014.12.083
96
Medina, M. L., Haynes, P. A., Breci, L., & Francisco, W. A. (2005). Analysis of secreted proteins from Aspergillus
flavus. PROTEOMICS, 5(12), 3153–3161. https://doi.org/10.1002/pmic.200401136
Meijer, M., Houbraken, J. A. M. P., Dalhuijsen, S., Samson, R. A., & de Vries, R. P. (2011). Growth and hydrolase
profiles can be used as characteristics to distinguish Aspergillus niger and other black Aspergilli. Studies
in Mycology, 69(1), 19–30. https://doi.org/10.3114/sim.2011.69.02
Miranda, R. U., Gómez-Quiroz, L. E., Mejía, A., & Barrios-González, J. (2013). Oxidative state in idiophase links
reactive oxygen species (ROS) and lovastatin biosynthesis: Differences and similarities in submerged-
and solid-state fermentations. Fungal Biology, 117(2), 85–93.
https://doi.org/10.1016/J.FUNBIO.2012.12.001
Miura, N., & Ueda, M. (2018). Evaluation of Unconventional Protein Secretion by Saccharomyces cerevisiae
and other Fungi. Cells, 7(9). https://doi.org/10.3390/cells7090128
Mojsov, K. D. (2016). Aspergillus Enzymes for Food Industries. New and Future Developments in Microbial
Biotechnology and Bioengineering, 215–222. https://doi.org/10.1016/B978-0-444-63505-1.00033-6
Monod, M., Capoccia, S., Léchenne, B., Zaugg, C., Holdom, M., & Jousson, O. (2002). Secreted proteases from
pathogenic fungi. International Journal of Medical Microbiology, 292(5–6), 405–419.
https://doi.org/10.1078/1438-4221-00223
Müller, C., McIntyre, M., Hansen, K., & Nielsen, J. (2002). Metabolic engineering of the morphology of
Aspergillus oryzae by altering chitin synthesis. Applied and Environmental Microbiology, 68(4), 1827–
1836. https://doi.org/10.1128/aem.68.4.1827-1836.2002
Nalli, S., Horn, O. J., Grochowalski, A. R., Cooper, D. G., & Nicell, J. A. (2006). Origin of 2-ethylhexanol as a VOC.
Environmental Pollution, 140(1), 181–185. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2005.06.018
Nandakumar, M. P., & Marten, M. R. (2002). Comparison of lysis methods and preparation protocols for one-
and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis,
23(14), 2216–2222. https://doi.org/10.1002/1522-2683(200207)23:14<2216::AID-ELPS2216>3.0.CO;2-
Y
Nandakumar, M. P., Thakur, M. S., Raghavarao, K. S. M. S., & Ghildyal, N. P. (1999). Studies on catabolite
repression in solid state fermentation for biosynthesis of fungal amylases. Letters in Applied
Microbiology, 29(6), 380–384. https://doi.org/10.1046/j.1472-765X.1999.00652.x
Nielsen, H. (2017). Predicting secretory proteins with signaIP. In Methods in Molecular Biology (Vol. 1611, pp.
59–73). Humana Press Inc. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7015-5_6
Nimrichter, L., de Souza, M. M., Del Poeta, M., Nosanchuk, J. D., Joffe, L., Tavares, P. de M., & Rodrigues, M.
L. (2016). Extracellular Vesicle-Associated Transitory Cell Wall Components and Their Impact on the
Interaction of Fungi with Host Cells. Frontiers in Microbiology, 7.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01034
Noé Aguilar, C., Augur, C., Favela-Torres, E., & Viniegra-González, G. (2001). Induction and repression patterns
of fungal tannase in solid-state and submerged cultures. Process Biochemistry, 36(6), 565–570.
https://doi.org/10.1016/S0032-9592(00)00251-X
Obata, H., Ishida, H., Hata, Y., Kawato, A., Abe, Y., Akao, T., Akita, O., & Ichishima, E. (2004). Cloning of a novel
tyrosinase-encoding gene (melB) from Aspergillus oryzae and its overexpression in solid-state culture
(Rice Koji). In Journal of Bioscience and Bioengineering (Vol. 97, Issue 6, pp. 400–405). Society of
Fermentation and Bioengineering. https://doi.org/10.1016/S1389-1723(04)70226-1
97
Oda, K., Kakizono, D., Yamada, O., Iefuji, H., Akita, O., & Iwashita, K. (2006). Proteomic Analysis of Extracellular
Proteins from Aspergillus oryzae Grown under Submerged and Solid-State Culture Conditions. Applied
and Environmental Microbiology, 72(5), 3448–3457. https://doi.org/10.1128/AEM.72.5.3448-
3457.2006
Oostra, J., Le Comte, E. P., Van Den Heuvel, J. C., Tramper, J., & Rinzema, A. (2001). Intra-particle oxygen
diffusion limitation in solid-state fermentation. Biotechnology and Bioengineering, 75(1), 13–24.
https://doi.org/10.1002/bit.1159
Pakula, T. M., Salonen, K., Uusitalo, J., & Penttilä, M. (2005). The effect of specific growth rate on protein
synthesis and secretion in the filamentous fungus Trichoderma reesei. Microbiology, 151(1), 135–143.
https://doi.org/10.1099/mic.0.27458-0
Pandey, A. (2003). Solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 13(2–3), 81–84.

https://doi.org/10.1016/S1369-703X(02)00121-3
Papagianni, M. (2007). Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: Biochemical aspects,
membrane transport and modeling. Biotechnology Advances, 25(3), 244–263.
https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2007.01.002
Park, J., Hulsman, M., Arentshorst, M., Breeman, M., Alazi, E., Lagendijk, E. L., Rocha, M. C., Malavazi, I.,
Nitsche, B. M., van den Hondel, C. A. M. J. J., Meyer, V., & Ram, A. F. J. (2016). Transcriptomic and
molecular genetic analysis of the cell wall salvage response of Aspergillus niger to the absence of
galactofuranose synthesis. Cellular Microbiology, 18(9), 1268–1284. https://doi.org/10.1111/cmi.12624
Pel, H. J., De Winde, J. H., Archer, D. B., Dyer, P. S., Hofmann, G., Schaap, P. J., Turner, G., De Vries, R. P.,
Albang, R., Albermann, K., Andersen, M. R., Bendtsen, J. D., Benen, J. A. E., Van Den Berg, M., Breestraat,
S., Caddick, M. X., Contreras, R., Cornell, M., Coutinho, P. M., … Stam, H. (2007). Genome sequencing
and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88. Nature Biotechnology, 25(2), 221–
231. https://doi.org/10.1038/nbt1282
Pible, O., Hartmann, E. M., Imbert, G., & Armengaud, J. (2014). The importance of recognizing and reporting
sequence database contamination for proteomics. EuPA Open Proteomics, 3, 246–249.
https://doi.org/10.1016/j.euprot.2014.04.001
Rabilloud, T. (2009). Solubilization of proteins in 2DE: an outline. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.),
519, 19–30. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-281-6_2
Rabouille, C. (2017). Pathways of Unconventional Protein Secretion. Trends in Cell Biology, 27(3), 230–240.
https://doi.org/10.1016/j.tcb.2016.11.007
Rahardjo, Y. S. P., Sie, S., Weber, F. J., Tramper, J., & Rinzema, A. (2005). Effect of low oxygen concentrations
on growth and α-amylase production of Aspergillus oryzae in model solid-state fermentation systems.
Biomolecular Engineering, 21(6), 163–172. https://doi.org/10.1016/j.bioeng.2005.01.001
Ramesh, M. V., & Lonsane, B. K. (1991). Ability of a solid state fermentation technique to significantly minimize
catabolic repression of α-amylase production by Bacillus licheniformis M27. Applied Microbiology and
Biotechnology, 35(5), 591–593. https://doi.org/10.1007/BF00169621
Ramsubramaniam, N., Harris, S. D., & Marten, M. R. (2014). The phosphoproteome of Aspergillus nidulans
reveals functional association with cellular processes involved in morphology and secretion. Proteomics,
14(21–22), 2454–2459. https://doi.org/10.1002/pmic.201400063
Read, N. D. (2011). Exocytosis and growth do not occur only at hyphal tips. Molecular Microbiology, 81(1), 4–
7. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2011.07702.x
98
Renovato, J., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Durán, L. V., Bergman, C., Rodríguez, R., & Aguilar, C. N. (2011).
Differential properties of Aspergillus niger tannase produced under solid-state and submerged
fermentations. Applied Biochemistry and Biotechnology, 165(1), 382–395.
Ries, L. N. A., Beattie, S. R., Espeso, E. A., Cramer, R. A., & Goldman, G. H. (2016). Diverse Regulation of the
CreA Carbon Catabolite Repressor in Aspergillus nidulans. Genetics, 203(1), 335–352.
https://doi.org/10.1534/genetics.116.187872
Riquelme, M., Bredeweg, E. L., Callejas-Negrete, O., Roberson, R. W., Ludwig, S., Beltrán-Aguilar, A., Seiler, S.,
Novick, P., & Freitag, M. (2014). The Neurospora crassa exocyst complex tethers Spitzenkörper vesicles
to the apical plasma membrane during polarized growth. Molecular Biology of the Cell, 25(8), 1312–
1326. https://doi.org/10.1091/mbc.E13-06-0299
Riquelme, M., Yarden, O., Bartnicki-Garcia, S., Bowman, B., Castro-Longoria, E., Free, S. J., Fleißner, A., Freitag,
M., Lew, R. R., Mouriño-Pérez, R., Plamann, M., Rasmussen, C., Richthammer, C., Roberson, R. W.,
Sanchez-Leon, E., Seiler, S., & Watters, M. K. (2011). Architecture and development of the Neurospora
crassa hypha - a model cell for polarized growth. Fungal Biology, 115(6), 446–474.
https://doi.org/10.1016/j.funbio.2011.02.008
Rodrigues, M. L., Nimrichter, L., Oliveira, D. L., Nosanchuk, J. D., & Casadevall, A. (2008). Vesicular trans-cell
wall Transport in fungi: A mechanism for the delivery of virulence-associated macromolecules? In Lipid
Insights: Vol. 2 1 (pp. 27–40). NIH Public Access. https://doi.org/10.4137/lpi.s1000
Rodrigues, M. L., Nosanchuk, J. D., Schrank, A., Vainstein, M. H., Casadevall, A., & Nimrichter, L. (2011).
Vesicular transport systems in fungi. In Future Microbiology (Vol. 6, Issue 11, pp. 1371–1381).
https://doi.org/10.2217/fmb.11.112
Romano, J., Nimrod, G., Ben-Tal, N., Shadkchan, Y., Baruch, K., Sharon, H., & Osherov, N. (2006). Disruption of
the Aspergillus fumigatus ECM33 homologue results in rapid conidial germination, antifungal resistance
and hypervirulence. Microbiology, 152(7), 1919–1928. https://doi.org/10.1099/mic.0.28936-0
Romero-Gómez, S. J., Augur, C., & Viniegra-González, G. (2000). Invertase production by Aspergillus niger in
submerged and solid-state fermentation. Biotechnology Letters, 22(15), 1255–1258.
https://doi.org/10.1023/A:1005659217932
Romero Gómez, S. de J. (2001). Producción de lnvertasa por Aspergillus niger en Fermentación Líquida y
Fermentaci6n Sólida. Universidad Autónoma Metropolitana.
Salgado Bautista, D. A. (2015). Analisis comparativo del secretoma de Aspergillus brasiliensis obtenido con
diferentes concentraciones de glucosa en medio sólido. Universidad Autónoma Metropolitana.
Samson, R. A., Visagie, C. M., Houbraken, J., Hong, S. B., Hubka, V., Klaassen, C. H. W., Perrone, G., Seifert, K.
A., Susca, A., Tanney, J. B., Varga, J., Kocsubé, S., Szigeti, G., Yaguchi, T., & Frisvad, J. C. (2014). Phylogeny,
identification and nomenclature of the genus Aspergillus. Studies in Mycology, 78(1), 141–173.
https://doi.org/10.1016/j.simyco.2014.07.004
Sánchez-León, E., Bowman, B., Seidel, C., Fischer, R., Novick, P., & Riquelme, M. (2015). The Rab GTPase YPT-
1 associates with Golgi cisternae and Spitzenkörper microvesicles in Neurospora crassa. Molecular
Microbiology, 95(3), 472–490. https://doi.org/10.1111/mmi.12878
Sandhya, C., Sumantha, A., Szakacs, G., & Pandey, A. (2005). Comparative evaluation of neutral protease
production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation. Process Biochemistry,
40(8), 2689–2694. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2004.12.001
99
Saqib, A. A. N., Hassan, M., Khan, N. F., & Baig, S. (2010). Thermostability of crude endoglucanase from
Aspergillus fumigatus grown under solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF).
Process Biochemistry, 45(5), 641–646. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2009.12.011
Schachtschabel, D., Arentshorst, M., Lagendijk, E. L., & Ram, A. F. J. (2012). Vacuolar H+-ATPase plays a key
role in cell wall biosynthesis of Aspergillus niger. Fungal Genetics and Biology, 49(4), 284–293.
Serrano-Fujarte, I., López-Romero, E., & Cuéllar-Cruz, M. (2016). Moonlight-like proteins of the cell wall
protect sessile cells of Candida from oxidative stress. Microbial Pathogenesis, 90, 22–33.
https://doi.org/10.1016/j.micpath.2015.10.001
Shah, P., Gutierrez-Sanchez, G., Orlando, R., & Bergmann, C. (2009). A proteomic study of pectin-degrading
enzymes secreted by Botrytis cinerea grown in liquid culture. PROTEOMICS, 9(11), 3126–3135.
https://doi.org/10.1002/pmic.200800933
Shen, H. D., Lin, W. L., Tam, M. F., Chou, H., Wang, C. W., Tsai, J. J., Wang, S. R., & Han, S. H. (2001).
Identification of vacuolar serine proteinase as a major allergen of Aspergillus fumigatus by
immunoblotting and N-terminal amino acid sequence analysis. Clinical and Experimental Allergy, 31(2),
295–302. https://doi.org/10.1046/j.1365-2222.2001.01026.x
Shevchenko, A., Tomas, H., Havli\[sbreve], J., Olsen, J. V, & Mann, M. (2007). In-gel digestion for mass
spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols, 1(6), 2856–2860.
https://doi.org/10.1038/nprot.2006.468
Shoji, J., Kikuma, T., & Kitamoto, K. (2014). Vesicle trafficking, organelle functions, and unconventional
secretion in fungal physiology and pathogenicity. Current Opinion in Microbiology, 20, 1–9.
https://doi.org/10.1016/j.mib.2014.03.002
Shteynberg, D., Nesvizhskii, A. I., Moritz, R. L., & Deutsch, E. W. (2013). Combining results of multiple search
engines in proteomics. In Molecular and Cellular Proteomics (Vol. 12, Issue 9, pp. 2383–2393). American
Society for Biochemistry and Molecular Biology. https://doi.org/10.1074/mcp.R113.027797
Shukla, S., Kim, D. H., Chung, S. H., & Kim, M. (2017). Occurrence of Aflatoxins in Fermented Food Products.
In Fermented Foods in Health and Disease Prevention (pp. 653–674). Elsevier Inc.
Singhania, R. R., Patel, A. K., Soccol, C. R., & Pandey, A. (2009). Recent advances in solid-state fermentation.
Biochemical Engineering Journal, 44(1), 13–18. https://doi.org/10.1016/J.BEJ.2008.10.019
Sluchanko, N. N., & Gusev, N. B. (2017). Moonlighting chaperone‐like activity of the universal regulatory 14‐
3‐3 proteins. The FEBS Journal, 284(9), 1279–1295. https://doi.org/10.1111/febs.13986
Solís-Pereira, S., Favela-Torres, E., Viniegra-González, G., & Gutiérrez-Rojas, M. (1993). Effects of different
carbon sources on the synthesis of pectinase by Aspergillus niger in submerged and solid state
fermentations. Applied Microbiology and Biotechnology, 39(1), 36–41.
https://doi.org/10.1007/BF00166845
Solis-Pereyra, S., Favela-Torres, E., Gutiérrez-Rojas, M., Roussos, S., Saucedo-Castañeda, G., Gunasekaran, P.,
& Viniegra-Gonzlez, G. (1996). Production of pectinases by Aspergillus niger in solid state fermentation
at high initial glucose concentrations. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 12(3), 257–260.
https://doi.org/10.1007/BF00360924
Sørensen, L. M., Lametsch, R., Andersen, M. R., Nielsen, P. V, & Frisvad, J. C. (2009). Proteome analysis of
Aspergillus niger: Lactate added in starch-containing medium can increase production of the mycotoxin
100
fumonisin B2 by modifying acetyl-CoA metabolism. BMC Microbiology, 9(1), 255.
https://doi.org/10.1186/1471-2180-9-255
Steiger, M. G., Rassinger, A., Mattanovich, D., & Sauer, M. (2019). Engineering of the citrate exporter protein
enables high citric acid production in Aspergillus niger. Metabolic Engineering, 52, 224–231.
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2018.12.004
Stevers, L. M., Sijbesma, E., Botta, M., Mackintosh, C., Obsil, T., Landrieu, I., Cau, Y., Wilson, A. J., Karawajczyk,
A., Eickhoff, J., Davis, J., Hann, M., O’Mahony, G., Doveston, R. G., Brunsveld, L., & Ottmann, C. (2018).
Modulators of 14-3-3 Protein-Protein Interactions. Journal of Medicinal Chemistry, 61(9), 3755–3778.
https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.7b00574
Stock, J., Sarkari, P., Kreibich, S., Brefort, T., Feldbrügge, M., & Schipper, K. (2012). Applying unconventional
secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of
Biotechnology, 161(2), 80–91. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2012.03.004
Svanström, Å., Boveri, S., Boström, E., & Melin, P. (2013). The lactic acid bacteria metabolite phenyllactic acid
inhibits both radial growth and sporulation of filamentous fungi. BMC Research Notes, 6(1), 464.
Tamayo-Ramos, J. A., Flipphi, M., Pardo, E., Manzanares, P., & Orejas, M. (2012). L-Rhamnose induction of
Aspergillus nidulans α-L-rhamnosidase genes is glucose repressed via a CreA-independent mechanism
acting at the level of inducer uptake. Microbial Cell Factories, 11, 26. https://doi.org/10.1186/1475-
2859-11-26
Todd, R. B., Davis, M. A., & Hynes, M. J. (2007). Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: Meiotic progeny
for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols, 2(4), 811–821.
https://doi.org/10.1038/nprot.2007.112
Tsang, A., Butler, G., Powlowski, J., Panisko, E. A., & Baker, S. E. (2009). Analytical and computational
approaches to define the Aspergillus niger secretome. Fungal Genetics and Biology : FG & B, 46 Suppl
1(1), S153–S160. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2008.07.014
Tsiatsiani, L., & Heck, A. J. R. (2015). Proteomics beyond trypsin. In FEBS Journal (Vol. 282, Issue 14, pp. 2612–
2626). Blackwell Publishing Ltd. https://doi.org/10.1111/febs.13287
Umekawa, M., Ujihara, M., Nakai, D., Takematsu, H., & Wakayama, M. (2017). Ecm33 is a novel factor involved
in efficient glucose uptake for nutrition-responsive TORC1 signaling in yeast. In FEBS Letters (Vol. 591,
Issue 22, pp. 3721–3729). Wiley Blackwell. https://doi.org/10.1002/1873-3468.12882
Vallejo, M. C., Nakayasu, E. S., Matsuo, A. L., Sobreira, T. J. P., Longo, L. V. G., Ganiko, L., Almeida, I. C., &
Puccia, R. (2012). Vesicle and vesicle-free extracellular proteome of Paracoccidioides brasiliensis:
Comparative analysis with other pathogenic fungi. Journal of Proteome Research, 11(3), 1676–1685.
https://doi.org/10.1021/pr200872s
Varga, J., Kocsubé, S., Tóth, B., Frisvad, J. C., Perrone, G., Susca, A., Meijer, M., & Samson, R. A. (2007).
Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57(8), 1925–1932.
https://doi.org/10.1099/ijs.0.65021-0
Vasara, T., Keränen, S., Penttilä, M., & Saloheimo, M. (2002). Characterisation of two 14-3-3 genes from
Trichoderma reesei: interactions with yeast secretory pathway components. Biochimica et Biophysica
Acta, 1590(1–3), 27–40. https://doi.org/10.1016/s0167-4889(02)00197-0
Veiter, L., Rajamanickam, V., & Herwig, C. (2018). The filamentous fungal pellet—relationship between
101
morphology and productivity. In Applied Microbiology and Biotechnology (Vol. 102, Issue 7, pp. 2997–
3006). Springer Verlag. https://doi.org/10.1007/s00253-018-8818-7
Villena, G. K., & Gutiérrez-Correa, M. (2007). Morphological patterns of Aspergillus niger biofilms and pellets
related to lignocellulolytic enzyme productivities. Letters in Applied Microbiology, 45(3), 231–237.
https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2007.02183.x
Viniegra-González, G., Favela-Torres, E., Aguilar, C. N., Rómero-Gomez, S. de J., Dı ́az-Godı ́nez, G., & Augur, C.
(2003). Advantages of fungal enzyme production in solid state over liquid fermentation systems.
Biochemical Engineering Journal, 13(2–3), 157–167. https://doi.org/10.1016/S1369-703X(02)00128-6
Vivek-Ananth, R. P., Mohanraj, K., Vandanashree, M., Jhingran, A., Craig, J. P., & Samal, A. (2018). Comparative
systems analysis of the secretome of the opportunistic pathogen Aspergillus fumigatus and other
Aspergillus species. Scientific Reports, 8(1), 6617. https://doi.org/10.1038/s41598-018-25016-4
Volke-Sepúlveda, T. ., Gutiérrez-Rojas, M., & Favela-Torres, E. (2003). Biodegradation of hexadecane in liquid

and solid-state fermentations by Aspergillus niger. Bioresource Technology, 87(1), 81–86.
https://doi.org/10.1016/S0960-8524(02)00207-9
Volke-Sepúlveda, T., Gutiérrez-Rojas, M., & Favela-Torres, E. (2006). Biodegradation of high concentrations of
hexadecane by Aspergillus niger in a solid-state system: Kinetic analysis. Bioresource Technology, 97(14),
1583–1591. https://doi.org/10.1016/J.BIORTECH.2005.07.026
Volke-Sepulveda, T., Salgado-Bautista, D., Bergmann, C., Wells, L., Gutierrez-Sanchez, G., & Favela-Torres, E.
(2016). Secretomic Insight into Glucose Metabolism of Aspergillus brasiliensis in Solid-State
Fermentation. Journal of Proteome Research, 15(10). https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.6b00663
Wang, M., Yang, H., Zhang, M., Liu, K., Wang, H., Luo, Y., & Fang, X. (2015). Functional analysis of Trichoderma
reesei CKIIα2, a catalytic subunit of casein kinase II. Applied Microbiology and Biotechnology, 99(14),
5929–5938. https://doi.org/10.1007/s00253-015-6544-y
Wang, P., Chang, P. K., Kong, Q., Shan, S., & Wei, Q. (2019). Comparison of aflatoxin production of Aspergillus
flavus at different temperatures and media: Proteome analysis based on TMT. International Journal of
Food Microbiology, 310, 108313. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2019.108313
Westermann, C., Gleinser, M., Corr, S. C., & Riedel, C. U. (2016). A Critical Evaluation of Bifidobacterial
Adhesion to the Host Tissue. Frontiers in Microbiology, 7. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01220
Wucherpfennig, T., Hestler, T., & Krull, R. (2011). Morphology engineering - Osmolality and its effect on
Aspergillus niger morphology and productivity. Microbial Cell Factories, 10(1), 58.
Wysocki, V. H., Resing, K. A., Zhang, Q., & Cheng, G. (2005). Mass spectrometry of peptides and proteins.
Methods, 35(3 SPEC.ISS.), 211–222. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2004.08.013
Yu, L. R., Stewart, N. A., & Veenstra, T. D. (2010). Proteomics. The Deciphering of the Functional Genome. In
Essentials of Genomic and Personalized Medicine (pp. 89–96). Elsevier Inc.
Yuan, Z. F., Lin, S., Molden, R. C., & Garcia, B. A. (2014). Evaluation of proteomic search engines for the analysis
of histone modifications. Journal of Proteome Research, 13(10), 4470–4478.
https://doi.org/10.1021/pr5008015
Zamith-Miranda, D., Nimrichter, L., Rodrigues, M. L., & Nosanchuk, J. D. (2018). Fungal extracellular vesicles:
modulating host–pathogen interactions by both the fungus and the host. Microbes and Infection, 20(9–
102
10), 501–504. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2018.01.011
Zeiner, C. A., Purvine, S. O., Zink, E. M., Paša-Tolić, L., Chaput, D. L., Haridas, S., Wu, S., LaButti, K., Grigoriev, I.
V., Henrissat, B., Santelli, C. M., & Hansel, C. M. (2016). Comparative Analysis of Secretome Profiles of
Manganese(II)-Oxidizing Ascomycete Fungi. PLOS ONE, 11(7), e0157844.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157844
Zeni, J., Cence, K., Grando, C. E., Tiggermann, L., Colet, R., Lerin, L. A., Cansian, R. L., Toniazzo, G., de Oliveira,
D., & Valduga, E. (2011). Screening of Pectinase-Producing Microorganisms with Polygalacturonase
Activity. Applied Biochemistry and Biotechnology, 163(3), 383–392. https://doi.org/10.1007/s12010-
010-9046-5
Zhang, B., Guan, Z. B., Cao, Y., Xie, G. F., & Lu, J. (2012). Secretome of Aspergillus oryzae in Shaoxing rice wine
koji. International Journal of Food Microbiology, 155(3), 113–119.
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2012.01.014
Zhang, F., Zhong, H., Han, X., Guo, Z., Yang, W., Liu, Y., Yang, K., Zhuang, Z., & Wang, S. (2015). Proteomic
profile of Aspergillus flavus in response to water activity. Fungal Biology, 119(2–3), 114–124.
https://doi.org/10.1016/j.funbio.2014.11.005
Zhang, J., & Zhang, J. (2016). The filamentous fungal pellet and forces driving its formation. In Critical Reviews
in Biotechnology (Vol. 36, Issue 6, pp. 1066–1077). Taylor and Francis Ltd.
https://doi.org/10.3109/07388551.2015.1084262
Zhao, G., Ding, L.-L., Pan, Z.-H., Kong, D.-H., Hadiatullah, H., & Fan, Z.-C. (2019). Proteinase and glycoside
hydrolase production is enhanced in solid-state fermentation by manipulating the carbon and nitrogen
fluxes in Aspergillus oryzae. Food Chemistry, 271, 606–613.
https://doi.org/10.1016/J.FOODCHEM.2018.07.199
Zhao, W., Lu, Y., Ouyang, H., Zhou, H., Yan, J., Du, T., & Jin, C. (2013). N-Glycosylation of Gel1 or Gel2 is vital
for cell wall -glucan synthesis in Aspergillus fumigatus. Glycobiology, 23(8), 955–968.
https://doi.org/10.1093/glycob/cwt032
103
11. ANEXOS
11.1. Anexo 1
En esta sección se muestra información adicional para las proteínas identificadas en ambos secretomas, conservando la información como fue
identificada en las bases de datos.
Tabla A1. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas únicas identificadas en cultivo líquido.
20 20 40 40 60 60
Glucosa No
No accesoa2 Proteínab Ruta metabólica o funciónc g/L g/L g/L g/L g/L g/L
g/L accesoa1
PSM PSM PSM PSM PSM PSM
20 OJJ75131.1 OJJ75131.1 HP ASPBRDRAFT_53082 4 7 0 0 0 0
20 OJJ73670.1 XP_001392640.1 endoglucanase-4 Carbohydrate metabolism 4 4 0 0 0 0
20 OJJ77019.1 XP_001400902.1 endoglucanase A Starch and sucrose metabolism 9 7 0 0 0 0
Endohydrolysis of (1->3)- or (1->4)-linkages in beta-D-glucans when the glucose
20 OJJ76633.1 XP_001399223.1 endo-1,3(4)-beta-glucanase residue whose reducing group is involved in the linkage to be hydrolyzed is itself 4 7 0 0 0 0
substituted at C-3
Citrate cycle (TCA cycle); Cysteine and methionine metabolism; Pyruvate
60 OJJ72339.1 XP_001391302.1 malate dehydrogenase 0 0 0 0 3 11
metabolism; Glyoxylate and dicarboxylate metabolism; Methane metabolism
60 OJJ74607.1 tyrosinase Tyrosine metabolism; Isoquinoline alkaloid biosynthesis; Betalain biosynthesis 0 0 0 0 24 10
XP_001389342.1
Pentose and glucuronate interconversions; Fructose and mannose metabolism;
60 OJJ77535.1 XP_001394119.2 aldehyde reductase 1 0 0 0 0 7 17
Galactose metabolism; Glycerolipid metabolism; Folate biosynthesis
60 OJJ67898.1 XP_001402471.1 purine nucleoside permease transmembrane transport 0 0 0 0 8 9
60 OJJ75269.1 XP_001388595.1 catalase R Tryptophan metabolism; Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 0 0 0 0 10 11
glucan endo-1,6- β-
60 OJJ66103.1 XP_001389956.2 Random hydrolysis of (1->6)-linkages in (1->6)-beta-D-glucans 0 0 0 0 5 7
glucosidase BGN16.3
60 OJJ69630.1 XP_001393626.1 alpha-amylase Starch and sucrose metabolism 0 0 0 0 8 7
60 OJJ74134.1 XP_001389884.1 L-asparaginase Alanine, aspartate and glutamate metabolism; Cyanoamino acid metabolism 0 0 0 0 5 15
60 OJJ74808.1 XP_001389120.1 reductase-like protein Oxydoreductase activity 0 0 0 0 13 19
extracellular serine-rich
60 OJJ75721.1 XP_001400266.1 carbohydrate metabolic process 0 0 0 0 11 13
protein
104
a1 Número de acceso de la base de datos de NCBI alineando con la base de datos de A. brasiliensis CBS 101740; a2 número de accedo de la base de datos de NCBI alineando con la base de datos de A.
niger¸ principalmente la cepa CBS 513.88; b Nombre de la proteína encontrado en las bases de datos; c función encontrada en la base de datos KEGG; PSM=peptide spectral match, número de péptidos
alineados con las secuencias de proteína de las bases de datos, HP= Hypothetical protein
Tabla A2. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas únicas identificadas en cultivo sólido.
60 60 120 120 180 180

Glucosa No.
No. Accesoa2 Proteínab Ruta metabólica o funciónc g/L g/L g/L g/L g/L g/L
g/L Accesoa1
60 OJJ69961.1 XP_001395879.1 inulinase Fructose and mannose metabolism 4 6 0 0 0 0
60 OJJ70755.1 XP_001399078.1 enolase Glycolysis / Gluconeogenesis; Methane metabolism 7 9 0 0 0 0
120 OJJ73362.1 XP_001392987.1 carboxypeptidase Y Release of a C-terminal amino acid with broad specificity 0 0 4 4 0 0
120 OJJ72073.1 XP_001397549.1 aldo/keto reductase Vitamin B6 metabolism 0 0 4 8 0 0
Preferential cleavage: hydrophobic, preferably aromatic, residues in P1
and P1' positions. Cleaves Phe1!Val, Gln4!His, Glu13!Ala, Ala14!Leu,
120 OJJ71369.1 XP_001401510.1 aspartic-type endopeptidase ctsD 0 0 5 4 0 0
Leu15!Tyr, Tyr16!Leu, Gly23!Phe, Phe24!Phe and Phe25!Tyr bonds in
the B chain of insuli
120 OJJ70333.1 OJJ70333.1 mono- and diacylglycerol lipase Glycerolipid metabolism 0 0 8 12 0 0
6-phosphogluconate dehydrogenase,
120 OJJ77603.1 XP_001394208.2 PPP and glutathione metabolism 0 0 4 27 0 0
decarboxylating 1
120 OJJ72134.1 XP_001397476.1 zinc-binding oxidoreductase CipB 0 0 4 7 0 0
120 OJJ67114.1 XP_001402325.1 pectinesterase A Pentose and glucuronate interconversions 0 0 4 4 0 0
180 OJJ66342.1 XP_001393442.1 lysophospholipase 1 Glycerophospholipid metabolism 0 0 0 0 13 16
180 OJJ66392.1 XP_001393389.1 HP ANI_1_54084 0 0 0 0 8 15
Chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation; Chloroalkane and
180 OJJ66415.1 XP_001393366.1 2-haloalkanoic acid dehalogenase 0 0 0 0 5 5
chloroalkene degradation
Tyrosine metabolism; Phenylalanine metabolism; Xylene degradation;
180 OJJ70406.1 XP_001396334.2 aryl-alcohol dehydrogenase 0 0 0 0 138 79
Toluene degradation
180 OJJ70449.1 XP_001390140.2 mannitol 2-dehydrogenase Fructose and mannose metabolism 0 0 0 0 12 4
180 OJJ74036.1 XP_001392218.1 aminotransferase, class V 0 0 0 0 16 8
180 OJJ74104.1 XP_001392148.1 guanylate kinase Purine metabolism 0 0 0 0 8 8
180 OJJ73138.1 XP_001390926.2 FAD dependent oxidoreductase Riboflavin metabolism 0 0 0 0 14 9
180 OJJ71513.1 XP_001398224.1 heat shock protein Translation, rRNA processing 0 0 0 0 23 43
180 OJJ75417.1 XP_001400609.1 protein disulfide-isomerase Catalyses the rearrangement of -S-S- bonds in proteins 0 0 0 0 3 9
105
60 60 120 120 180 180
Glucosa No.
g/L Accesoa1
1-(5-phosphoribosyl)-5-[(5-
phosphoribosylamino)
180 OJJ68720.1 XP_001398393.1 Histidine metabolism 0 0 0 0 4 3
methylideneamino]
imidazole-4-carboxamide isomerase
thiamin pyrophosphokinase-related
180 OJJ75203.1 XP_001388657.1 Thiamine metabolism 0 0 0 0 5 10
protein
180 OJJ76609.1 XP_001399260.2 coronin-like protein crn1 actin binding; actin filament binding 0 0 0 0 7 6
180 OJJ74959.1 XP_001388941.1 6-phosphogluconolactonase Pentose phosphate pathway 0 0 0 0 38 23
180 OJJ75361.1 XP_001388485.2 aspartic endopeptidase (AP1 Similar to pepsin, but also cleaves on either side of Asp and at Lys!Arg 0 0 0 0 4 6
180 OJJ74669.1 XP_001389279.1 thioredoxin reductase Selenocompound metabolism 0 0 0 0 16 5
180 OJJ68100.1 XP_001396351.1 aspartic-type endopeptidase opsB Proteolysis 0 0 0 0 7 4
Tyrosine metabolism; Isoquinoline alkaloid biosynthesis; Betalain
180 OJJ70280.1 XP_001402519.4 tyrosinase 0 0 0 0 4 3
biosynthesis
180 OJJ69293.1 XP_001393985.2 RNA binding protein Nrd1 RNA binding 0 0 0 0 5 6
180 OJJ76803.1 XP_001400684.1 alanine racemase family protein 0 0 0 0 11 7
180 OJJ66672.1 XP_001396184.1 uridylate kinase Pyrimidine metabolism 0 0 0 0 4 5
180 OJJ69294.1 XP_001393983.1 citrate synthase acetyl-CoA + H2O + oxaloacetate = citrate + CoA 0 0 0 0 5 4
Streptomycin biosynthesis;
180 OJJ67865.1 XP_001402447.1 inositol-3-phosphate synthase 0 0 0 0 7 7
Inositol phosphate metabolism
cAMP-dependent protein kinase
180 OJJ71961.1 XP_001397686.1 Growth, signalization and oxidative stress (Aspergillus fumigatus) 0 0 0 0 11 8
regulatory subunit
180 OJJ68803.1 XP_001397074.1 L-xylulose reductase Pentose and glucuronate interconversions 0 0 0 0 6 6
Glycolysis / Gluconeogenesis; Pentose phosphate pathway; Starch and
180 OJJ71817.1 XP_001397850.1 glucose-6-phosphate isomerase sucrose 0 0 0 0 12 15
metabolism; Amino sugar and nucleotide sugar metabolism
180 OJJ73664.1 XP_001392647.1 heat shock protein Hsp88 Stress response; ATP binding (Aspergillus terreus) 0 0 0 0 2 4
180 OJJ71848.1 XP_001397810.1 protein vip1 actin related 0 0 0 0 6 5
180 OJJ76318.1 XP_001399596.1 dienelactone hydrolase family protein 0 0 0 0 16 12
180 OJJ68736.1 GAQ45375.1 UV excision repair protein Reparair nucleotide 0 0 0 0 6 6
180 OJJ72085.1 XP_001397530.1 epoxide hydrolase Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 0 0 0 0 11 8
X-Pro dipeptidyl-peptidase (S15 family)
180 OJJ76621.1 XP_001399237.1 Proteolysis 0 0 0 0 5 5
protein
180 OJJ66283.1 XP_001391100.1 HP ANI_1_8064 0 0 0 0 25 21
106
60 60 120 120 180 180
Glucosa No.
g/L Accesoa1
Glycine, serine and threonine metabolism; Cysteine and methionine
180 OJJ76083.1 XP_001399877.1 homoserine dehydrogenase 0 0 0 0 18 17
metabolism; Lysine biosynthesis
180 OJJ66735.1 XP_001396247.1 ATP phosphoribosyltransferase Histidine metabolism 0 0 0 0 17 33
180 OJJ66987.1 XP_001397271.1 ribokinase Pentose phosphate pathway 0 0 0 0 10 9
180 OJJ75281.1 XP_001388583.1 FAD binding domain protein 0 0 0 0 9 10
180 OJJ72457.1 XP_001391440.1 L-xylulose reductase Pentose and glucuronate interconversions 0 0 0 0 16 11
180 OJJ77967.1 EHA19736.1 6-phosphogluconate dehydrogenase Cysteine and methionine metabolism 0 0 0 0 17 8
180 OJJ77211.1 XP_001401121.1 cell cycle control protein (Cwf8) ubiquitin-protein transferase 0 0 0 0 8 8
180 OJJ69216.1 XP_001396580.2 formate dehydrogenase formate + NAD+ = CO2 + NADH 0 0 0 0 18 8
HP ASPBRDRAFT_56532/ Fructose and mannose metabolism; Amino sugar and nucleotide
180 OJJ70774.1 OJJ70774.1 0 0 0 0 13 9
Phosphomannomutase sugar metabolism
Cyanoamino acid metabolism; Starch and sucrose metabolism;
180 OJJ77452.1 XP_001394024.1 beta-glucosidase M 0 0 0 0 6 5
Phenylpropanoid biosynthesis
180 OJJ69707.1 XP_001393532.1 lipase Glycerolipid metabolism 0 0 0 0 5 4
180 OJJ73970.1 XP_001392293.1 glycerol dehydrogenase Gcy1 0 0 0 0 3 3
HP ASPBRDRAFT_38420 /Transcription
180 OJJ76051.1 OJJ76051.1 DNA replication 0 0 0 0 10 6
regulator PAB1642
Glycolysis / Gluconeogenesis; Fatty acid degradation Glycine, serine
and threonine metabolism; Tyrosine metabolism alpha-Linolenic acid
180 OJJ65888.1 XP_001391209.1 alcohol dehydrogenase metabolism Chloroalkane and chloroalkene degradation; Naphthalene 0 0 0 0 5 6
degradation; Retinol metabolism; Metabolism of xenobiotics by
cytochrome P450
Cyanoamino acid metabolism; Glyoxylate and dicarboxylate
180 OJJ72642.1 XP_001391662.1 formamidase 0 0 0 0 6 7
metabolism
180 OJJ75060.1 XP_001388823.2 proliferating cell nuclear antigen DNA replication 0 0 0 0 3 6
180 OJJ68548.1 XP_001390302.2 exocyst complex component Sec8 Transport (Aspergillus nidulans) 0 0 0 0 30 12
Neddylation of cullins play an essential role in the regulation of SCF-
180 OJJ67164.1 XP_001402270.2 defective in cullin neddylation protein 1 0 0 0 0 5 9
type complexes activity
glutathione S-transferase Ure2-like Glutathione metabolism; Metabolism of xenobiotics by cytochrome
180 OJJ67066.1 XP_001398731.2 0 0 0 0 8 17
protein P450
pantetheine-phosphate
180 OJJ71183.1 XP_001401701.1 Pantothenate and CoA biosynthesis 0 0 0 0 6 7
adenylyltransferase family protein
180 OJJ73228.1 XP_001393178.1 dienelactone hydrolase family protein 0 0 0 0 13 14
180 OJJ73437.1 XP_001392906.1 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase Valine, leucine and isoleucine degradation 0 0 0 0 4 4
180 OJJ70171.1 XP_001395336.1 feruloyl esterase C feruloyl-polysaccharide + H2O = ferulate + polysaccharide 0 0 0 0 11 22
107
60 60 120 120 180 180
Glucosa No.
g/L Accesoa1
Hydrolyses single-stranded DNA or mismatched double-stranded DNA
180 OJJ69364.1 XP_001393901.1 uracil-DNA glycosylase 0 0 0 0 3 12
and polynucleotides, releasing free uracil
Glutathione metabolism; Metabolism of xenobiotics by cytochrome
180 OJJ65896.1 XP_001391200.1 glutathione S-transferase 0 0 0 0 6 10
P450
Galactose metabolism; Other glycan degradation; Glycosaminoglycan
180 OJJ74366.1 XP_001389622.1 beta-galactosidase E degradation; Sphingolipid metabolism; Glycosphingolipid biosynthesis - 0 0 0 0 6 8
ganglio series
a1
Número de acceso de la base de datos de NCBI alineando con la base de datos de A. brasiliensis CBS 101740; a2 número de accedo de la base de datos de NCBI alineando con la base de datos de A.
Tabla A3. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas abundantes no reguladas identificadas en cultivo sólido.
60 60 120 120 180 180

Glucosa
No accesoa1 No accesoa2 Proteína b Ruta metabólica o función c g/L g/L g/L g/L g/L g/L
g/L
60 y 120 OJJ77564.1 XP_001394158.2 cell wall glucanase 4 6 5 5 0 0
60 y 120 OJJ67069.1 XP_001398728.2 multicopper oxidase 11 6 7 8 0 0
Tryptophan and Cyanoamino acid metabolism; Aminobenzoate and
60, 120
OJJ73275.1 OJJ73275.1 HP ASPBRDRAFT_40942/ nitrilase Styrene 18 3 293 20 43 31
y 180
degradation; Nitrogen metabolism
60 y 180 OJJ65853.1 XP_001391138.1 glucose oxidase 4 benzenediol + O2 = 4 benzosemiquinone + 2 H2O 4 9 0 0 4 5
60, 120
OJJ74153.1 GAQ46904.1 YkgB 451 672 195 207 266 180
y 180
60, 120 HP ASPBRDRAFT_45424
OJJ70100.1 OJJ70100.1 Hydrolysis of pullulan to isopanose (6-alpha-maltosylglucose) 78 93 39 32 30 24
y 180 /Isopullulanase
60 y 120 OJJ74240.1 XP_001389767.1 laccase-1 4 benzenediol + O2 = 4 benzosemiquinone + 2 H2O 9 5 4 3 0 0
60, 120 HP ASPBRDRAFT_134466
OJJ67831.1 OJJ67831.1 Hidrolysis of chitin 34 40 14 18 10 11
y 180 (FAD_binding_4)
60, 120
OJJ70876.1 XP_001402053.1 alpha-glucosidase Galactose, starch and sucrose metabolism 87 106 28 49 36 52
y 180
108
Tabla A4. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas abundantes no reguladas identificadas en cultivo líquido.
20 20 40 40 60 60
Glucosa No
No acceso* Proteína Ruta metabólica o función*** g/L g/L g/L g/L g/L g/L
g/L acceso*
20, 40 y 60 OJJ76295.1 XP_001399628.1 endopolygalacturonase C Pentose and glucuronate interconversions 25 31 25 42 29 28
20, 40 y 60 OJJ73065.1 XP_001390847.1 tripeptidyl-peptidase sed2 13 15 15 10 15 14
20, 40 y 60 OJJ68547.1 GAQ44118.1 extracellular cellulase CelA/allergen Asp F7-like 3 7 4 3 5 4
20 y 60 OJJ74465.1 OJJ74465.1 HP ASPBRDRAFT_27493 14 22 0 0 5 19
Endohydrolysis of (1->4)-beta-D-xylosidic
20 y 40 OJJ75322.1 XP_001388522.1 endo-1,4-beta-xylanase A 28 5 87 22 0 0
linkages in xylans
20, 40 y 60 OJJ77564.1 XP_001394158.2 cell wall glucanase 12 10 7 9 17 11
Tryptophan metabolism; Glyoxylate and
20, 40 y 60 OJJ75244.1 XP_001388621.1 catalase R 32 31 16 26 42 40
dicarboxylate metabolism
20, 40 y 60 OJJ73817.1 XP_001392475.1 glucan 1,3-beta-glucosidase Starch and sucrose metabolism 4 7 4 3 4 8
20, 40 y 60 OJJ67200.1 OJJ67200.1 HP ASPBRDRAFT_59193 15 21 5 7 14 12
20, 40 y 60 OJJ67987.1 XP_001390410.1 glucan endo-1,3-beta-glucosidase eglC Starch and sucrose metabolism 93 218 50 45 69 130
20 y 60 OJJ67114.1 XP_001402325.1 pectinesterase A Pentose and glucuronate interconversions 9 6 0 0 5 4
20, 40 y 60 OJJ73062.1 OJJ73062.1 HP ASPBRDRAFT_53305 17 11 27 40 23 39
20, 40 y 60 OJJ74152.1 AGI04246.1 glucose oxidase Pentose phosphate pathway 40 40 17 27 67 78
20, 40 y 60 OJJ68397.1 XP_001389998.1 alpha-L-arabinofuranosidase axhA Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 41 35 35 43 42 51
20, 40 y 60 OJJ67069.1 XP_001398728.2 multicopper oxidase 6 7 4 6 7 10
Endohydrolysis of (1->4)-beta-D-xylosidic
20, 40 y 60 OJJ68396.1 XP_001389996.2 endo-1,4-beta-xylanase F1 61 43 48 40 58 93
linkages in xylans
20, 40 y 60 OJJ72358.1 OJJ72358.1 HP ASPBRDRAFT_42048 /D-6-hydroxynicotine oxidase Nicotinate and nicotinamide metabolism 8 8 6 5 15 12
20, 40 y 60 OJJ77774.1 XP_001394372.1 FAD binding domain protein 32 28 5 6 9 15
Cyanoamino acid metabolism; Starch and
20, 40 y 60 OJJ70519.1 XP_001398816.1 beta-glucosidase A sucrose metabolism; Phenylpropanoid 17 13 7 8 8 13
biosynthesis
20, 40 y 60 OJJ65991.1 XP_001390530.1 glucoamylase Starch and sucrose metabolism 2909 1593 520 645 1028 959
20, 40 y 60 OJJ71721.1 XP_001397982.2 endoglucanase A carbohydrate metabolic process 29 24 5 10 12 11
40 y 60 OJJ71409.1 OJJ71409.1 HP ASPBRDRAFT_127351, partial 0 0 23 43 37 36
109
Tabla A5. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas reguladas identificadas en cultivo sólido.
60 60 120 120 180 180

Glucosa
g/L
60, 120 y
OJJ74339.1 P_001389652.2 exo-beta-1,3-glucanase Exg0 Starch and sucrose metabolism 114 156 63 86 80 144
180
120 180 OJJ71129.1 XP_001401759.1 aminopeptidase 2 0 0 5 18 107 113
60, 120 y Endohydrolysis of (1->4)-beta-D-xylosidic linkages in
OJJ68396.1 XP_001389996.2 endo-1,4-beta-xylanase F1 126 105 68 59 96 128
180 xylans
60, 120 y
OJJ73817.1 XP_001392475.1 glucan 1,3-beta-glucosidase Starch and sucrose metabolism 23 29 18 14 16 53
180
Cysteine and methionine metabolism; Arginine and
60, 120 y
OJJ73563.1 XP_001392771.2 spermidine synthase proline metabolism; beta-Alanine metabolism; 4 3 5 12 48 58
180
Glutathione metabolism
60, 120 y glycosyl hydrolase family 71 protein/glucan endo-1,3- Endohydrolysis of (1->3)-alpha-D-glucosidic linkages
OJJ68845.1 XP_001397010.2 14 15 9 5 4 5
180 alpha-glucosidase in isolichenin, pseudonigeran and nigeran
120 180 OJJ66434.1 OJJ66434.1 HP ASPBRDRAFT_666063 0 0 10 6 82 24
120 y 180 OJJ69332.1 XP_001393937.1 vacuolar aspartyl aminopeptidase Lap4 Proteolysis 0 0 3 4 22 17
120 y 180 OJJ69282.1 XP_001393995.2 aminopeptidase Proteolysis 0 0 6 12 64 33
120 y 180 OJJ68507.1 XP_001390247.2 glutathione reductase Glutathione metabolism 0 0 8 5 34 33
60, 120 y
OJJ71535.1 XP_001398198.2 carboxypeptidase S1 Translation, rRNA processing 7 11 12 6 16 31
180
Citrate cycle (TCA cycle); Cysteine and methionine
60, 120 y
OJJ72339.1 XP_001391302.1 malate dehydrogenase metabolism; Pyruvate metabolism; Glyoxylate and 33 39 67 67 310 195
180
dicarboxylate metabolism; Methane metabolism
Pentose and glucuronate interconversions; Fructose
60, 120 y
OJJ77535.1 XP_001394119.2 aldehyde reductase 1 and mannose metabolism; Galactose metabolism; 75 9 97 59 309 244
180
Glycerolipid metabolism; Folate biosynthesis
60, 120 y Pentose phosphate pathway; Fructose and mannose
OJJ77477.1 XP_001394051.1 ribose 5-phosphate isomerase A 7 5 7 10 40 15
180 metabolism
Glycolysis / Gluconeogenesis; Fructose and
60, 120 y
OJJ77205.1 XP_001401115.1 triosephosphate isomerase mannose metabolism; Inositol phosphate 24 5 60 21 89 177
180
metabolism
60, 120 y
OJJ69630.1 XP_001393626.1 alpha-amylase Starch and sucrose metabolism 43 50 30 38 37 65
180
60, 120 y
OJJ72478.1 OJJ72478.1 HP ASPBRDRAFT_54314 /Serine proteinase pepC Proteolysis 13 31 26 64 88 163
180
120 180 OJJ70618.1 XP_001398917.1 Rho GDP-dissociation inhibitor Rho GDP-dissociation inhibitor activity 0 0 3 6 9 22
60, 120 y
OJJ65770.1 XP_001390502.1 FAD binding domain protein 12 8 6 6 5 8
180
110
60 60 120 120 180 180
Glucosa
g/L
HP ASPBRDRAFT_27362/Probable mannosyl-
60, 120 y
OJJ74329.1 OJJ74329.1 oligosaccharide 37 48 26 29 29 35
180
alpha-1,2-mannosidase 1B
120 180 OJJ69032.1 XP_001396780.2 nmrA-like family protein 0 0 3 10 26 20
Endohydrolysis of (1->5)-alpha-arabinofuranosidic
120 y 180 OJJ68942.1 XP_001396893.2 endo-arabinase 0 0 15 5 9 53
linkages in (1->5)-arabinans
60, 120 y
OJJ72358.1 OJJ72358.1 HP ASPBRDRAFT_42048 /D-6-hydroxynicotine oxidase Nicotinate and nicotinamide metabolism 17 9 23 23 66 58
180
HP ASPBRDRAFT_136183 /Orotate
120 y 180 OJJ67239.1 OJJ67239.1 0 0 6 5 17 18
phosphoribosyltransferase Pyrimidine metabolism
120 y 180 OJJ72415.1 XP_001391393.1 S-formylglutathione hydrolase Methane metabolism 0 0 3 3 10 9
60, 120 y
OJJ71393.1 XP_001401488.1 protein ecm33 499 598 388 368 318 545
180
60, 120 y
OJJ75670.1 XP_001400329.2 Inorganic pyrophosphatase, partial Oxidative phosphorylation 11 9 5 39 77 36
180
1,2-dihydroxy-3-keto-5-methylthiopentene
120 y 180 OJJ69155.1 XP_001396639.1 Cysteine and methionine metabolism 0 0 3 4 13 9
dioxygenase
120 y 180 OJJ69988.1 XP_001395835.2 glucosamine 6-phosphate N-acetyltransferase Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 0 0 14 11 44 34
Glycolysis / Gluconeogenesis; Galactose
metabolism; Starch and sucrose
120 y 180 OJJ69942.1 XP_001395912.1 glucokinase metabolism; Amino sugar and nucleotide sugar 0 0 15 19 62 43
metabolism; Streptomycin biosynthesis; Neomycin,
kanamycin and gentamicin biosynthesis
60, 120 y
OJJ75270.1 XP_001388594.1 acid trehalase Starch and sucrose metabolism 30 15 26 39 54 78
180
60, 120 y
OJJ74889.1 XP_001389020.1 cyanovirin-N Virucity (Volke et al.2016) 10 8 10 17 39 22
180
60, 120 y Tryptophan metabolism; Glyoxylate and
OJJ75244.1 XP_001388621.1 catalase R 59 51 39 53 68 67
180 dicarboxylate metabolism
120 y 180 OJJ67429.1 XP_001395432.1 orotidine 5'-phosphate decarboxylase Pyrimidine metabolism 0 0 5 6 14 17
60, 120 y Tyrosine metabolism; Isoquinoline alkaloid
OJJ74607.1 XP_001389342.1 tyrosinase 28 26 31 26 32 56
180 biosynthesis; Betalain biosynthesis
60, 120 y
OJJ75131.1 OJJ75131.1 HP ASPBRDRAFT_53082 20 47 17 26 17 19
180
60, 120 y
OJJ69946.1 XP_001395908.1 peroxiredoxin pmp20 Glutathione metabolism 59 15 92 105 266 193
180
60, 120 y
OJJ67851.1 XP_001402433.1 1,3-beta-glucanosyltransferase gel1 153 195 151 194 212 288
180
111
60 60 120 120 180 180
Glucosa
g/L
60, 120 y 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-beta- Cysteine and methionine metabolism;
OJJ71337.1 XP_001401543.1 17 16 15 82 151 71
180 homocysteine methyltransferase Selenocompound metabolism
60, 120 y
OJJ69428.1 XP_001393823.2 cholinesterase Glycerophospholipid metabolism 6 12 6 9 9 9
180
60, 120 y
OJJ67987.1 XP_001390410.1 glucan endo-1,3-beta-glucosidase eglC Starch and sucrose metabolism 138 134 116 103 107 153
180
60, 120 y
OJJ71409.1 OJJ71409.1 HP ASPBRDRAFT_127351, partial 26 19 19 23 26 31
180
porphobilinogen deaminase/hydroxymethylbilane
120 y 180 OJJ70469.1 XP_001398757.1 Porphyrin and chlorophyll metabolism 0 0 11 26 39 47
synthase
120 y 180 OJJ71358.1 XP_001401521.1 diphosphomevalonate decarboxylase Terpenoid backbone biosynthesis 0 0 4 9 24 10
120 y 180 OJJ75814.1 XP_001400163.1 geranyltranstransferase Terpenoid backbone biosynthesis 0 0 3 6 21 4
120 y 180 OJJ66955.1 XP_001397234.1 cyanate hydratase Nitrogen metabolism 0 0 15 12 27 35
60, 120 y
OJJ71546.1 XP_001398185.1 triacylglycerol lipase Translation, rRNA processing 4 4 9 5 11 14
180
120 y 180 OJJ66437.1 OJJ66437.1 HP ASPBRDRAFT_49077 /function chitinase (GO) 0 0 23 25 64 50
120 180 OJJ71176.1 XP_001401709.1 calcium homeostasis protein Regucalcin L-ascorbic acid biosynthetic process 0 0 5 5 12 11
Endohydrolysis of (1->3)- or (1->4)-linkages in beta-
60, 120 y D-glucans when the glucose
OJJ76633.1 XP_001399223.1 endo-1,3(4)-beta-glucanase 10 13 6 11 4 11
180 residue whose reducing group is involved in the
linkage to be hydrolysed is itself substituted at C-3
60, 120 y
OJJ69362.1 XP_001393905.1 sulfhydryl oxidase 2 R'C(R)SH + O2 = R'C(R)S-S(R)CR' + H2O2 52 66 50 44 60 47
180
120 180 OJJ73019.1 XP_001392074.2 heat shock protein ATP binding 0 0 90 119 275 204
Cyanoamino acid metabolism; Starch and sucrose
60, 120 y
OJJ74472.1 XP_001389510.2 alpha/beta-glucosidase agdC metabolism; Phenylpropanoid biosynthesis; 4 11 27 16 16 57
180
Galactose metabolism
60, 120 y
OJJ76993.1 XP_001400873.1 tripeptidyl-peptidase sed2 111 103 100 95 108 129
180
ATP + ubiquitin + [E1 ubiquitin-activating enzyme]-L-
60, 120 y HP ASPBRDRAFT_59296 /Ubiquitin-activating enzyme cysteine = AMP + diphosphate +
OJJ66856.1 OJJ66856.1 5 9 10 19 25 24
180 E1 1 S-ubiquitinyl-[E1 ubiquitin-activating enzyme]-L-
cysteine
60, 120 y
OJJ67200.1 OJJ67200.1 HP ASPBRDRAFT_59193 29 26 21 21 18 24
180
120 y 180 OJJ69906.1 XP_001395965.2 dienelactone hydrolase family protein 0 0 5 7 13 12
120 180 OJJ75723.1 XP_001400262.1 cell surface spherulin 4-like protein Integral component of membrane 0 0 4 4 7 9
Tyrosine metabolism; Isoquinoline alkaloid
120 y 180 OJJ66125.1 XP_001389935.1 tyrosinase 0 0 4 5 11 8
biosynthesis; Betalain biosynthesis
60, 120 y
OJJ72476.1 XP_001391467.1 transaldolase Pentose phosphate pathway 111 11 527 188 687 717
180
112
60 60 120 120 180 180
Glucosa
g/L
60, 120 y
OJJ68065.1 XP_001390497.2 1,3-beta-glucanosyltransferase gel3 Integral component of membrane 10 8 9 10 12 12
180
60, 120 y 2 phenolic donor + H2O2 = 2 phenoxyl radical of the
OJJ67914.1 XP_001390337.1 aldo-keto reductase 6 4 6 11 11 14
180 donor + 2 H2O
Release of an N-terminal dipeptide from a peptide
120 y 180 OJJ71470.1 XP_001401404.1 dipeptidyl peptidase III comprising four or more residues, with broad 0 0 34 36 76 64
specificity. Also acts on dipeptidyl 2-naphthylamides
120 y 180 OJJ71117.1 OJJ71117.1 HP ASPBRDRAFT_179180 /Peroxidase Sulfur relay system/thioredoxin peroxidase activity 0 0 12 4 16 16
60, 120 y
OJJ72381.1 XP_001391356.2 SUN domain protein (Uth1)/triacylglycerol lipase Glycerolipid metabolism 16 13 56 72 53 150
180
120 y 180 OJJ69042.1 XP_001396769.1 alpha-N-arabinofuranosidase B Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 0 0 12 9 13 25
60, 120 y
OJJ67881.1 XP_001402471.1 purine nucleoside permease 95 92 102 66 53 116
180
60, 120 y Cyanoamino acid metabolism; Starch and sucrose
OJJ70519.1 XP_001398816.1 beta-glucosidase A 49 37 72 54 83 90
180 metabolism; Phenylpropanoid biosynthesis
Glycolysis / Gluconeogenesis; Pentose phosphate
pathway; Galactose metabolism; Purine
120 y 180 OJJ76062.1 XP_001399898.1 phosphoglucomutase metabolism; Starch and sucrose metabolism; Amino 0 0 59 56 118 99
sugar and nucleotide sugar metabolism;
streptomycin biosynthesis
120 y 180 OJJ68567.1 XP_001390332.1 ADP-ribose pyrophosphatase Purine metabolism 0 0 6 6 11 11
Eliminative cleavage of (1->4)-alpha-D-galacturonan
60, 120 y methyl ester to give oligosaccharides with 4-deoxy-
OJJ66136.1 XP_001389926.1 pectin lyase F 108 64 65 77 91 57
180 6-O-methyl-alpha-D-galact-4-enuronosyl groups at
their non-reducing ends
60, 120 y
OJJ75817.1 XP_001400160.1 protein NMT1 thiamine biosynthetic process 10 26 34 62 79 68
180
60, 120 y DNA/ protein binding Ras/MAPK signaling,
OJJ72815.1 XP_001391851.1 14-3-3 protein 5 7 13 37 31 44
180 exocytosis (Volke et al., 2016)
mature ribosome assembly; ribosomal large subunit
120 180 OJJ68739.1 XP_001398409.1 eukaryotic translation initiation factor 6 0 0 9 22 19 31
biogenesis; ribosomal subunit export from nucleus
120 y 180 OJJ72208.1 XP_001397405.1 peroxiredoxin pmp20 0 0 7 7 14 11
60, 120 y
OJJ74808.1 XP_001389120.1 reductase-like protein 134 19 291 217 435 366
180
120 y 180 OJJ71861.1 XP_001397790.1 NAD dependent epimerase/dehydratase family protein galactose metabolic process (A0A0F0IJE6) 0 0 16 4 20 16
60, 120 y Endohydrolysis of (1->4)-beta-D-xylosidic linkages in
OJJ75322.1 XP_001388522.1 endo-1,4-beta-xylanase A 159 168 325 376 447 513
180 xylans
120 y 180 OJJ75363.1 XP_001388482.1 alpha-N-arabinofuranosidase A Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 0 0 7 6 8 13
120 y 180 OJJ68696.1 XP_001398362.1 adenosine kinase Purine metabolism 0 0 25 17 56 22
113
60 60 120 120 180 180
Glucosa
g/L
Debraching: negative regulation of Arp2/3 complex
120 180 OJJ75191.1 XP_001388668.1 glial maturation factor 0 0 9 9 13 16
mediated actin nucleation
120 y 180 OJJ75576.1 XP_001400449.2 exo-beta-1,3-glucanase Starch and sucrose metabolism 0 0 8 5 9 12
60, 120 y
OJJ77019.1 XP_001400902.1 endoglucanase A Starch and sucrose metabolism 30 18 24 60 37 63
180
60, 120 y
OJJ73486.1 XP_001392850.1 1,3-beta-glucanosyltransferase gel2 12 19 19 19 10 28
180
60, 120 y
OJJ68834.1 XP_001397023.2 endo-beta-1,4-glucanase D xyloglucan + H2O = xyloglucan oligosaccharides 40 43 33 35 29 30
180
60, 120 y
OJJ74152.1 AGI04246.1 glucose oxidase Pentose phosphate pathway 166 75 144 139 159 158
180
120 y 180 OJJ71705.1 OJJ71705.1 HP ASPBRDRAFT_124942 /Cell wall glucanase 0 0 20 27 27 44
Glycine, serine and threonine metabolism; Vitamin
120 y 180 OJJ72059.1 XP_001397565.2 threonine synthase 0 0 14 25 52 17
B6 metabolism
Other glycan degradation; Various types of N-glycan
60, 120 y biosynthesis; Amino sugar and nucleotide sugar
OJJ68479.1 XP_001393538.1 N-acetylglucosaminidase 4 6 5 7 5 7
180 metabolism; Glycosaminoglycan degradation;
Glycosphingolipid biosynthesis
120 180 OJJ76458.1 XP_001399436.1 acyl CoA binding protein family fatty-acyl-CoA binding 0 0 10 10 12 17
60, 120 y Tryptophan metabolism; Glyoxylate and
OJJ75269.1 XP_001388595.1 catalase R 30 31 63 45 62 67
180 dicarboxylate metabolism
60, 120 y
OJJ72798.1 glycosidase crf2 5 5 6 4 3 6
180 XP_001391828.2
120 180 OJJ73804.1 XP_001392486.1 ADP-ribosylation factor small GTPase mediated signal transduction 0 0 6 7 7 11
Inactivates bleomycin B2 (a cytotoxic
glycometallopeptide) by hydrolysis of a
carboxyamide bond of beta-aminoalanine, but also
120 y 180 OJJ71229.1 XP_001401653.1 aminopeptidase C 0 0 21 14 35 19
shows general aminopeptidase activity. The
specificity varies somewhat with source, but amino
acid arylamides of Met, Leu and Ala are preferred
120 y 180 OJJ67912.1 XP_001390334.1 HAD superfamily hydrolase 0 0 32 16 36 34
Galactose metabolism; Glycerolipid metabolism;
120 y 180 OJJ66428.1 GAQ45768.1 alpha-galactosidase C Sphingolipid metabolism; Glycosphingolipid 0 0 7 5 8 9
biosynthesis - globo and isoglobo series
peptidylproline (omega=180) = peptidylproline
120 y 180 OJJ71308.1 XP_001401570.2 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B 0 0 4 5 10 4
(omega=0)
120 y 180 OJJ72207.1 XP_001397406.1 thiJ/PfpI family protein 0 0 13 11 17 17
60, 120 y
OJJ70569.1 XP_001398868.1 glucan 1,3-beta-glucosidase A Starch and sucrose metabolism 28 21 28 31 23 33
180
120 y 180 OJJ71147.1 XP_001401742.1 aldose 1-epimerase Glycolysis / Gluconeogenesis 0 0 19 22 31 27
114
60 60 120 120 180 180
Glucosa
g/L
120 y 180 OJJ68515.1 XP_001390256.1 laccase-1 4 benzenediol + O2 = 4 benzosemiquinone + 2 H2O 0 0 9 6 8 12
120 y 180 OJJ68194.1 XP_001398680.2 Ras-related protein Rab7/ dGTPase Purine metabolism 0 0 5 8 7 10
120 180 OJJ71021.1 XP_001401891.1 Aha1 domain family cellular response to heat; protein folding 0 0 8 14 14 15
60, 120 y
OJJ67021.1 XP_001397301.1 alpha-amylase Starch and sucrose metabolism 6 5 6 5 3 6
180
Arachidonic acid metabolism; Folate biosynthesis;
120 y 180 OJJ71246.1 XP_001401635.1 aldehyde reductase 1 0 0 3 6 4 7
Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450
120 y 180 OJJ68449.1 XP_001390068.2 aminopeptidase Y Preferentially, release of N-terminal lysine 0 0 6 3 6 6
FMN binding NAD(H) dehydrogenase; (quinone)
120 y 180 OJJ74942.1 XP_001388959.2 minor allergen Alt a 7 0 0 8 11 9 14
activity (Aspergillus lentulus)
60, 120 y
OJJ72111.1 XP_001397501.1 lipase Glycerolipid metabolism 92 27 151 106 42 202
180
120 180 OJJ69302.1 XP_001393974.1 heat shock protein 90 protein folding; response to stress 0 0 4 14 14 9
120 180 OJJ72869.1 XP_001391915.2 allergen Asp f 4 0 0 48 83 53 98
60, 120 y
OJJ66105.1 XP_001389952.1 FAD-dependent oxygenase Nicotinate and nicotinamide metabolism 10 10 11 7 7 7
180
120 y 180 OJJ77241.1 XP_001401157.2 cell wall glycosyl hydrolase YteR 0 0 9 8 10 10
Endohydrolysis of (1->4)-beta-D-xylosidic linkages in
120 y 180 OJJ67369.1 OJJ67369.1 Beta-xylanase 0 0 19 12 20 16
xylans
120 180 OJJ66038.1 XP_001390822.1 laccase-1 4 benzenediol + O2 = 4 benzosemiquinone + 2 H2O 0 0 16 11 14 16
120 180 OJJ70757.1 XP_001399080.1 14-3-3 protein 0 0 9 15 15 12
60, 120 y
OJJ73670.1 XP_001392640.1 endoglucanase-4 10 7 14 20 15 16
180
60, 120 y
OJJ72473.1 XP_001391459.1 superoxide dismutase [Cu-Zn] 2 superoxide + 2 H+ = O2 + H2O2 29 35 38 40 37 27
180
60, 120 y
OJJ77986.1 XP_001394632.2 beta-mannosidase A Other glycan degradation 6 7 7 9 5 7
180
cellobiose + acceptor = cellobiono-1,5-lactone +
120 180 OJJ67850.1 XP_001402432.1 cellobiose dehydrogenase 0 0 4 4 3 5
reduced acceptor
120 180 OJJ65854.1 XP_001391137.1 lipase 1 precursor Glycerolipid metabolism 0 0 4 3 3 4
AMP + sulfite + thioredoxin disulfide = 5'-adenylyl
120 180 OJJ75173.1 XP_001388687.1 thioredoxin 0 0 16 23 24 17
sulfate + thioredoxin
Starch and sucrose metabolism; Hydrolysis of (1-
>4)-beta-D-glucosidic linkages in cellulose and
120 180 OJJ70172.1 XP_001395335.2 endoglucanase 0 0 11 4 12 5
similar substrates, releasing cellobiose from the
reducing ends of the chains
HP ASPBRDRAFT_132450 /Elongation factor 1 gamma
120 180 OJJ69179.1 OJJ69179.1 0 0 6 12 10 8
conserved domain family protein
60, 120 y
OJJ75520.1 XP_001400489.2 glycosyl hydrolase, family 18 /chitinase Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 12 13 37 30 24 33
180
115
60 60 120 120 180 180
Glucosa
g/L
120 180 OJJ69367.1 XP_001393898.1 nucleoside diphosphate kinase Purine metabolism; Pyrimidine metabolism 0 0 6 17 11 11
120 180 OJJ69080.1 XP_001396717.2 2-methylcitrate dehydratase Propanoate metabolism 0 0 6 18 18 7
Cysteine and methionine metabolism; Valine,
leucine and isoleucine degradation;
120 180 OJJ71468.1 XP_001401406.1 branched-chain-amino-acid aminotransferase 0 0 12 11 12 10
Valine, leucine and isoleucine biosynthesis;
Pantothenate and CoA biosynthesis
60, 120 y
OJJ66611.1 XP_001395113.2 protein HMF1 13 8 11 16 13 7
180
Glycolysis / Gluconeogenesis; Citrate cycle (TCA
cycle); Glycine, serine and threonine metabolism;
120 180 OJJ72740.1 XP_001391760.1 dihydrolipoyl dehydrogenase 0 0 5 10 5 3
Valine, leucine and isoleucine degradation; Pyruvate
metabolism; Propanoate metabolism
60, 120 y
OJJ68547.1 GAQ44118.1 extracellular cellulase CelA/allergen Asp F7-like 15 13 18 19 17 10
180
120 180 OJJ78318.1 XP_001394989.2 endocytosis protein end4 0 0 4 11 7 6
Release of an N-terminal dipeptide, Xaa-Yaa!,
120 180 OJJ70197.1 XP_001395660.1 extracellular serine carboxypeptidase preferentially when Yaa is Ala or Pro. Substrates are 0 0 6 5 6 4
oligopeptides, preferentially tripeptides
60, 120 y
OJJ65991.1 XP_001390530.1 glucoamylase Starch and sucrose metabolism 526 209 472 303 266 229
180
Random hydrolysis of (1->6)-linkages in (1->6)-beta-
120 180 OJJ66103.1 XP_001389956.2 glucan endo-1,6-beta -glucosidase BGN16.3 0 0 7 6 6 5
D-glucans
Arginine biosynthesis; Alanine, aspartate and
120 180 OJJ71413.1 XP_001401464.1 NADP-specific glutamate dehydrogenase glutamate metabolismTaurine and hypotaurine 0 0 14 79 34 19
metabolism
120 180 OJJ71046.1 XP_001401851.1 superoxide dismutase [Mn] 2 superoxide + 2 H+ = O2 + H2O2 0 0 25 19 23 13
120 180 OJJ67996.1 XP_001390419.1 endoglucanase-1 precursor Starch and sucrose metabolism 0 0 6 5 4 4
60, 120 y
OJJ77724.1 GAQ42198.1 acid-stable alpha-amylase Starch and sucrose metabolism 22 9 34 18 18 15
180
60, 120 y
OJJ68397.1 XP_001389998.1 alpha-L-arabinofuranosidase axhA Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 57 46 36 41 16 19
180
120 180 OJJ69283.1 XP_001393994.1 GTP-binding protein ypt1 0 0 9 26 12 11
120 180 OJJ74881.1 XP_001389030.1 Ras-related protein Rab-11A 0 0 9 12 5 8
116
Tabla A6. Datos complementarios del análisis bioinformático de las proteínas reguladas identificadas en cultivo líquido.
20 20 40 40 60 60
Glucosa g/L g/L g/L g/L g/L g/L
No acceso* No acceso* Proteína Ruta metabólica o función***
g/L PS PS PS PS PS PS
M M M M M M
Arginine and proline metabolism; Phenylalanine
metabolism; Tryptophan
20, 40 y 60 OJJ76685.1 XP_001399157.1 amidase 9 15 6 7 7 9
metabolism; Aminobenzoate degradation; Styrene
degradation
HP ASPBRDRAFT_142667/1,3-beta-
20, 40 y 60 OJJ78207.1 OJJ78207.1 7 5 5 8 32 31
glucanosyltransferase
20, 40 y 60 OJJ77724.1 GAQ42198.1 acid-stable alpha-amylase Starch and sucrose metabolism 125 7 40 29 40 42
20, 40 y 60 OJJ66105.1 XP_001389952.1 FAD-dependent oxygenase Nicotinate and nicotinamide metabolism 25 18 7 11 10 10
20, 40 y 60 OJJ67851.1 XP_001402433.1 1,3-beta-glucanosyltransferase gel1 91 109 40 59 59 56
20, 40 y 60 OJJ74153.1 GAQ46904.1 YkgB 383 735 33 153 40 76
20, 40 y 60 OJJ71535.1 XP_001398198.2 carboxypeptidase S1 Proteolysis 16 14 9 17 8 11
HP ASPBRDRAFT_27362/Probable mannosyl-
20, 40 y 60 OJJ74329.1 OJJ74329.1 29 32 9 12 4 15
oligosaccharide alpha-1,2-mannosidase 1B
20, 40 y 60 OJJ73486.1 XP_001392850.1 1,3-beta-glucanosyltransferase gel2 4 19 4 11 10 10
20 y 40 OJJ68065.1 XP_001390497.2 1,3-beta-glucanosyltransferase gel3 Transferase activity 7 7 4 6 0 0
20, 40 y 60 OJJ65770.1 XP_001390502.1 FAD binding domain protein 7 10 5 7 3 3
20, 40 y 60 OJJ77191.1 XP_001401093.1 aspergillopepsin 1 Hydrolysis of proteins with broad specificity. 35 13 13 13 12 12
20, 40 y 60 OJJ71393.1 XP_001401488.1 protein ecm33 254 529 33 195 40 60
20, 40 y 60 OJJ76993.1 XP_001400873.1 tripeptidyl-peptidase sed2 Proteolysis/pathogenecity 172 227 79 100 57 67
20, 40 y 60 OJJ69362.1 XP_001393905.1 sulphydryl oxidase 2 R'C(R)SH + O2 = R'C(R)S-S(R)CR' + H2O2 62 81 30 48 29 40
Hydrolysis of pullulan to isopanose (6-alpha-
20, 40 y 60 OJJ70100.1 OJJ70100.1 HP ASPBRDRAFT_45424 /Isopullulanase 40 50 21 42 36 31
maltosylglucose)
Cell wall protein involved in development of asexual
structures such as phialide and conidium
development, and thus required for spore formation.
20, 40 y 60 OJJ76937.1 XP_001400808.1 cell wall protein PhiA 65 17 100 180 313 182
Plays a role as a general stress protectant produced
by the fungus in competition with antagonistic
bacteria.
20, 40 y 60 OJJ73716.1 XP_001392582.1 tripeptidyl-peptidase 1 Proteolysis/pathogenecity 6 5 11 5 9 17
20, 40 y 60 OJJ75270.1 XP_001388594.1 acid trehalase Starch and sucrose metabolism 19 21 10 17 10 11
Endohydrolysis of (1->4)-beta-D-xylosidic linkages in
40 y 60 OJJ67369.1 OJJ67369.1 HP ASPBRDRAFT_69025 /Beta-xylanase (EC 3.2.1.8) 0 0 13 18 31 52
xylans
20, 40 y 60 OJJ77986.1 XP_001394632.2 beta-mannosidase A Other glycan degradation 5 15 4 7 6 4
20, 40 y 60 OJJ70876.1 XP_001402053.1 alpha-glucosidase Galactose, starch and sucrose metabolism 16 18 5 15 5 7
Eliminative cleavage of (1->4)-alpha-D-galacturonan
methyl ester to give oligosaccharides with 4-deoxy-6-
40 y 60 OJJ66136.1 XP_001389926.1 pectin lyase F 0 0 30 10 30 73
O-methyl-alpha-D-galact-4-enuronosyl groups at
their non-reducing ends
117
118
11.2. Anexo 2
En esta sección se muestra información adicional respecto a la abundancia relativa de las proteínas
identificadas para cada metabolismo/proceso.
11.2.1 Abundancia relativa de las proteínas identificadas en cultivo líquido.
Metabolismo de carbohidratos
Glucoamilasa
Glucan endo-1,3-β-glucosidasa eglC
Endo-1,4-β-xilanasa F1
Endo-1,4-β-xilanasa A
α-L-arabinofuranosidasa axhA
Ácida α-amilasa estable
Endopoligalacturonasa C
Glucosa oxidasa
Pectin liase F
HP ASPBRDRAFT_45424 /Isopululanasa
PRoteínas identificadas
HP ASPBRDRAFT_69025 /β-xilanasa (EC 3.2.1.8)

Glucanasa de pared celular
Endoglucanasa A
HP ASPBRDRAFT_27362/Probable manosil-…
Glucan 1,3-β-glucosidasa
Ácida trehalasa
β-glucosidasa A
Pectinesterasa A
Endoglucanasa A
α-glucosidasa
Celulasa extracelular CelA/Alérgeno Asp F7
β-manosidasa A
Malato deshidrogenasa
Proteína enriquecida en serina extracelular
Endo-1,3(4)-β-glucanasa
α-amilasa
Glucan endo-1,6-β-glucosidasa BGN16.3
Endoglucanasa-4
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

CEP (104)
Figura 1A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de carbohidratos en cultivo líquido.
Metabolismo redox
Sulfidril oxidasa
Catalasa R
Oxigenasa dependiente de FAD
Proteínas identificadas
Proteína de dominión de unión a FAD

Proteína como reductasa
Multicobre oxidase
Aldehído reductasa 1
Proteína de dominio de unión a FAD
Catalasa R
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

CEP (104)
Figura 2A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas al metabolismo redox en cultivo líquido.
119
Procesos celulares
Proteína PhiA de pared celular
YkgB
1,3-β-glucanosiltransferasa gel1
HP ASPBRDRAFT_142667/1,3-β-…
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40

CEP (104)
Figura 3A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas a diversos procesos celulares en cultivo líquido.
Proteólisis/síntesis de proteína
Tripeptidil-peptidasa sed2
Aspergilopepsin 1
Carboxipeptidasa S1
Tripeptidil-peptidasa 1
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

CEP (104)
Figura 4A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas al procesamiento/proteólisis de proteínas en cultivo
líquido.
Metabolismo de aminoácidos
identificadas
Proteínas
Amidasa
Tirosinasa
L-asparaginasa
0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03

CEP (104)
Figura 5A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas al metabolismo de aminoácidos en cultivo líquido.
Misceláneos
Proteína ecm33
HP ASPBRDRAFT_127351
HP ASPBRDRAFT_53305
HP ASPBRDRAFT_27493
HP ASPBRDRAFT_49057
Purina nucleósido permeasa
HP ASPBRDRAFT_53082
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

CEP (104)
Figura 6A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas clasificadas como misceláneos en cultivo líquido.
120
11.2.2 Abundancia relativa de las proteínas identificadas en cultivo sólido.
Metabolismo de carbohidratos
endo-1,4-β-xilanasa A
Transaldolasa
Malato deshidrogenasa
Glucoamilasa
triosephosphate isomerase
endo-1,4-β-xilanasa F1
Glucan endo-1,3-β-glucosidasa eglC
Glucosa oxidasa
Endoglucanasa A
pectin liasa F
Glucosamina 6-fosfato N-acetiltransferasa
Fosfoglucomutasa
Hidrolasa de la superfamilia HAD
exo-β-1,3-glucanasa Exg0
glucan 1,3-β-glucosidasa
β-glucosidasa A
α-amilasa
endo-arabinasa
Endo-β-1,4-glucanasa D
α-L-arabinofuranosidasa axhA
Glucoquinasa
aldosa 1-epimerasa
6-Fosfogluconolactonasa
Ribosa 5-fosfato isomerasa A
glucan 1,3-β-glucosidasa A
Familia 18 Glicosil hidrolasa/quitinasa
β-xilanasa
HP ASPBRDRAFT_40067
HP ASPBRDRAFT_45424 /Isopululanasa
ácido trehalasa
α-glucosidasa
HP ASPBRDRAFT_27362/Probable manosil‐oligosacárido…
Feruloil esterasa C
α/β-glucosidasa agdC
Endoglucanasa-4
HP ASPBRDRAFT_49077 /Quitinasa
α-N-arabinofuranosidasa B
L-xilulosa reductasa
ácida α-amilasa estable
endo-1,3(4)-β-glucanasa
Celulasa extracelular CelA/Alérgeno Asp F7
Endoglucanasa
Glicosil hidrolasa de pared celular YteR
HP ASPBRDRAFT_53082
Formato deshidrogenasa
Riboquinasa
2-metilcitrato deshidratasa
Glucosa-6-fosfato isomerasa
HP ASPBRDRAFT_56532/Fosfomanomutasa
Subunidad reguladora de la proteína quinasa dependiente de AMPc
Precursor endoglucanasa-1
α-N-arabinofuranosidase A
L-xilulosa reductasa
Proteína de la familia 71 glicosil hidrolasa/glucan endo-1,3-α-glucosidasa
Glicosidasa crf2
exo-β-1,3-glucanasa
Alcohol deshidrogenasa
Formamidasa
glucan endo-1,6-β -glucosidasa BGN16.3
N-acetilglucosaminidasa
α-galactosidasa C
manitol 2-deshidrogenasa
α-amilasa
Inositol-3-fosfato sintasa
β-manosidasa A
Glucosa oxidasa
Citrato sintasa
β-galactosidasa E
β-glucosidasa M
Glucanasa de pared celular
Celobiosa deshidrogenasa
Pectinesterasa A
enolasa
inulinasa
0 20 40 60 80 100 120 140 160

Cuenta espectral ponderada (104)
Figura 7A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de carbohidratos en cultivo sólido.
121
Metabolismo redox
Peroxirredoxina pmp20
Similar a reductasa
Superóxido dismutasa [Cu-Zn]
Tiorredoxina
Sulfidril oxidasa
Porfobilinógeno desaminasa / hidroximetilbilano…
Catalasa R
Catalasa R
Superóxido dismutasa [Mn]
Rho inhibidor de disociación de GDP
Peroxirredoxina pmp20
Epimerasa dependiente de NAD/Proteína de la…
Glutatión reductasa
aldo-ceto reductasa
Glutatión S-transferasa
HP ASPBRDRAFT_179180 /Peroxidasa
Lacasa-1
Tiorredoxina reductasa
Oxígenasa dependiente de FAD
Lacasa-1
Hsp 90
Proteína de unión a FAD
Proteína dominio de unión a FAD
CipB oxidorreductasa unión a zinc
Lacasa-1
0 20 40 60 80 100
Figura 8A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas al metabolismo redox en cultivo sólido.
Procesos celulares
YkgB
HP ASPBRDRAFT_40942/ Nitrilasa
Proteína NMT1
Proteína 14-3-3
Factor de maduración glial
Proteína identicadas
HP ASPBRDRAFT_27493
Proteína ypt1 de unión a GTP
Proteína 14-3-3
Proteína de la familia dienelactonae hidrolasa
Proteína de la familia dienelactonae hidrolasa
Proteína relacionada con Ras Rab-7a/ dGTPasa
Proteína relacionada con Ras Rab-11A
Proteína similar a esferulina de supercifie celular 4
Proteína en defectuosa nedilación de culina 1
Proteína de control celular (Cwf8)
Proteína crn1 similar a coronina
Proteína endocitosis end4
0 10 20 30 40 50 60
Figura 9A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas procesos celulares en cultivo sólido.
122
Procesamiento de proteínas/proteólisis
HP ASPBRDRAFT_54314 /Serina proteinasa pepC
Aminopeptidasa 2
Dipeptidil peptidasa III
Carboxipeptidasa S1
Aminopeptidasa
Aminopeptidasa C
HP ASPBRDRAFT_49057
Aspartil aminopeptidasa vacuolar Lap4
peptidil-prolil cis-trans isomerasa B
HP ASPBRDRAFT_132450 /Proteína de familia de…
epoxido hidrolasa
HP ASPBRDRAFT_59296 /Enzima activadora de…
Aminopeptidasa Y
Disulfuro isomerasa
Serina carboxipeptidasa extracelular
Endopeptidasa aspartica AP1
Endopeptidasa opsB tipo aspártico
X-Pro dipeptidil-peptidasa (Familia S15)
Endopeptidasa ctsD tipo aspártico
Carboxipeptidasa Y
0 5 10 15 20
Figura 10A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas a procesamiento de proteínas/proteólisis en cultivo sólido.
Metabolismo de aminoácidos
Espermidina sintasa
aril-alcohol deshidrogenasa
5-Metiltetrahidropteroiltriglutamato-β-homocisteína …
Tirosinasa
Fosforibosiltransferasa ATP
treonina sintasa
1,2-dihidroxi-3-ceto-5-metiltiopenteno dioxigenasa
Proteína similar a Glutatión S-transferasa Ure2
Homoserina deshidrogenasa
Aminotransferasa de aminoácidos de cadena ramificada
Proteína de la familia alanina racemasa
Tirosinasa
6-fosfogluconato deshidrogenasa
1‐(5‐Fosforibosil)‐5‐[(5‐…
3-hidroxi-isobutirato deshidrogenasa
Tirosinasa
0 2 4 6 8 10 12
Figura 11A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de aminoácidos en cultivo sólido.
123
Metabolismo de lípidos
Proteínas identificadas Lipasa
Proteína de dominio SUN (Uth1)/triacilglicerol lipasa
Proteína de la familia de unión a acil CoA
Triacilglicerol lipasa
Lisofosfolipasa 1
Colinesterasa
Lipasa
Percursor de Lipasa 1
Mono- y diacilglicerol lipasa
Glicerol dehydrogenasa Gcy1
0 10 20 30 40
Figura 12A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de lípidos en cultivo sólido.
Metabolismo de nucleótidos
Adenosina quinasa
Nucleósido difosfato quinasa

HP ASPBRDRAFT_136183 /Orotato…
orotidina 5'-fosfato descarboxilasa
ADP-ribosa pirofosfatasa
Guanilato quinasa
uracil-DNA glycosylase
Uridilato quinasa
0 1 2 3 4 5 6 7
Figura 13A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de nucleótidos en cultivo sólido.
Metabolismo de cofactores y vitaminas

HP ASPBRDRAFT_42048 /D-6-hydroxynicotina oxidasa

Aminotransferasa, clase V
Proteína relacionada a tiamina pirofosfoquinasa
Oxidorreductasas dependiente de FAD
Proteína de la familia fosfato adeniltransferasa-panteteína
aldo/ceto reductasa
0 2 4 6 8
Figura 14A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de cofactores y vitaminas en cultivo sólido.
Metabolismo de energía
cianato hidratasa
identificadas
Parcial pirofosfatasa inorgánica

Proteínas
Proteína similar de la familia nmrA

difosfomevalonato descarboxilasa
S-formilglutatión hidrolasa
0 2 4 6 8 10 12 14
Figura 15A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de energía en cultivo sólido.
124
Proteínas asociadas a estrés
Hsp
Glutamato deshidrogenasa específica de NADP
ADP-ribosylation factor
Hsp
Familia dominio Aha1
Hsp88
0 5 10 15 20 25
Figura 16A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas a mecanismos de defensa a estrés en cultivo sólido.
Metabolismo de ácidos nucleicos

identificadas
Proteínas
antígeno nuclear de células proliferantes

Proteína de reparación por escisión UV
Proteína Nrd1 unión a RNA
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20

Figura 17A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas al metabolismo de ácidos nucleicos en cultivo sólido.
Componentes celulares
identificadas
Proteínas
HP ASPBRDRAFT_58357
Componente Sec8 del complejo de exocitosis
HP ASPBRDRAFT_35578
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00

Figura 18A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas componentes celulares en cultivo sólido.
Proteínas clasificadas como misceláneos

Proteína ecm33
Alérgeno Asp f 4
Cianovirina-N
Factor de iniciación de la traducción eucariota 6

Proteína HMF1
Proteína de la familia thiJ/PfpI
Álergeno menor Alt a 7
HP ASPBRDRAFT_124942 /Glucanasa de pared de celular
HP ASPBRDRAFT_59193
Proteína de la familia dienelactona hidrolasa
Homeostasis de calcio proteína Regucalcina
Geraniltranstransferasa
HP ASPBRDRAFT_38420 /Regulador de transcripción PAB1642
2-ácido haloalcanoico deshalogenasa
Dihidrolipoil deshidrogenasa
6-Fosfogluconato deshidrogenasa, descarboxilante 1
Multicobre oxidase
0 20 40 60 80 100
Figura 19A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas clasificadas como misceláneos en cultivo sólido.
125
11.3. Anexo 3
Ejemplo de como fue realizado el conteo de número de puntas para las hifas de Aspergillus
brasiliensis.
Figura 20A. Ejemplo de medición de la ramificación de A. brasiliensis con 60 g/L en cultivo líquido (imagen izquierda), el cuadro rojo
indica la hifa que se utilizó para medir el número de puntas. La imagen derecha es un incremento de la imagen para observar la hifa
medida junto con sus respectivas regiones apicales, la hifa medida (limitada por el entorno rojo) fue de 576 µm, la cual presentó 10
puntas (círculo rojo).
126
11.4. Anexo 4
Artículo publicado con la información reportada en la tesis.
127
128

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

División de Ciencias Biológicas y de la Salud

Análisis comparativo del secretoma de Aspergillus brasiliensis

Para obtener el grado de doctor en biotecnología

M. en B. Daniel Alfonso Salgado Bautista

Dr. Ernesto Favela Torres

Dra. Tania Lorena Volke Sepúlveda

Dr. Francisco Javier Figueroa Martínez

TESIS DOCTORAL DIRIGIDA POR:

Dr. Ernesto Favela Torres

Al gran dador de vida por darme la oportunidad de existir.

Al Dr. Callegari, por la oportunidad de realizar una estancia en su laboratorio, y agradezco a su

A los pedritos por pasar un buen rato de distracción.

Tabla 1. Resultados comparativos de bioprocesos en cultivo sólido y líquido………..……………………………..8

Tabla 2. Reportes de análisis proteómicos a algunas especies de Aspergillus...……………………………………14

Figura 1. Flujo de trabajo simplificado para la identificación de proteínas a través de un análisis

Figura 2. Mecanismo de ionización del ESI (Ho et al., 2003)……………..……………………………..…………..17

Figura 3. Espectrofotómetros de masas usados en estudios del proteoma (Aebersold y Mann,

Figura 5. Tasa de producción de CO2 y producción de CO2 de A. brasiliensis ATCC9642 en cultivo

Figura 8. Ramificación de A. brasiliensis en cultivo sólido y líquido con tres concentraciones de

Figura 9. Nivel de ramificación de las hifas de A. brasiliensis y producción de proteína en función de

Figura 10. Separación de 50 µg de proteína extracelular proveniente de CS en geles SDS-PAGE

Figura 11. Separación de 50 µg de proteína extracelular proveniente de CL en geles SDS-PAGE

Figura 13. Número de proteínas en función de la concentración de glucosa inicial, número de

Figura 17. Número de proteínas intracelulares identificadas en el secretoma de A. brasiliensis en

Figura 18. Distribución de proteínas típicamente intracelulares encontradas en el secretoma de A.

Figura 22. Contenido de humedad inicial en función de la concentración de glucosa en cultivo

Figura 26. Clasificación de proteínas únicas de cada tipo de cultivo a 60 g/L…….………..…………………..84

Figura 4A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas identificadas asociadas al

Figura 10A. Cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas a procesamiento de

El uso de microorganismos es frecuente para la obtención de productos con interés comercial. En

Generalmente, la producción de metabolitos se realiza en condiciones de cultivo líquido

El trabajo descrito a continuación presenta cuatro secciones principales. La primera sección

En este apartado se describen algunos resultados reportados en la bibliografía donde se emplean

2.1. Importancia del género Aspergillus

• Aspergillus nidulans es considerado un excelente modelo de estudio para análisis genéticos,

Debido a la importancia industrial de A. niger, secuenciar su genoma fue necesario. La cepa

2.3. Aspergillus brasiliensis ATCC9642

La complicada caracterización e identificación de los hongos pertenecientes a la sección

Algunos estudios con A. brasiliensis se han enfocado a la producción de poligalacturonasa

A continuación, se presentan las ventajas y desventajas de los cultivo sólido y líquido.

2.4. Ventajas del cultivo sólido sobre el cultivo líquido

• Alta producción de biomasa

En el siguiente apartado se mencionan algunos reportes comparando los principales

2.4.1. Comparación del cultivo sólido y cultivo líquido

Tabla 1. Resultados comparativos de bioprocesos en cultivo sólido y líquido.

Microrganismo Sustrato Producto Resultado Ventaja Referencia

680 mg proteína total (CS) Alta producción,

A. oryzae NRRL ST, cascarilla de

Proteína: 114 ± 18.6 µg/mL en CS y 51 ± 12.2 Alta producción

La actividad xilanasa y β -glucosidasa

En resumen, en la mayoría de los estudios se ha demostrado mayores rendimientos de los

2.4.2. Morfología de los hongos filamentosos

Generalmente, la morfología que desarrollan los hongos filamentosos en CL es la

2.4.3. Represión catabólica en cultivo sólido

La RC se puede definir como el proceso de inhibición del catabolismo de fuentes alternativas

Se ha propuesto que la RC en hongos filamentosos es regulada por el factor de transcripción

2.5. Secreción de proteínas

El proceso de secreción inicia en el retículo endoplásmico (RE), donde las proteínas se

Diversas proteínas intracelulares identificadas en los secretomas de diversos hongos se han