UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA.

ANÁLISIS DE COMPUESTOS ACTIVOS EN EXTRACTOS

DE HOJA Y DE CULTIVO DE CÉLULAS EN SUSPENSIÓN
DE Calophyllum brasiliense CAMBESS Y EVALUACIÓN
DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA.

T E S IS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

MAESTRO EN BIOTECNOLOGÍA

P R E S E N T A :

IBQ. DANIEL CISNEROS TORRES.

DIRECTOR:
DR. FRANCISCO CRUZ SOSA.

ASESORES:
DRA. MA. DEL PILAR NICASIO TORRES.
DR. ANTONIO BERNABÉ ANTONIO.

México, D.F. noviembre de 2015

 La Maestría en Biotecnología de la Universidad Autónoma Metropolitana está
incluida en el Padrón Nacional de Posgrados de Calidad (PNPC) del CONACyT,
con la referencia 001465.

Para la realización de los estudios de maestría el sustentante contó con el

apoyo del CONACyT a través de la beca 302000
 CONTENIDO
Página.
ÍNDICE DE FIGURAS i
ÍNDICE DE TABLAS iv
RESUMEN v
1. INTRODUCCIÓN 1
2. ANTECEDENTES 6
2.1 Género Calophyllum 6
2.2 Descripción botánica de Calophyllum brasiliense Cambess 6
2.2.1 Clasificación taxonómica. 8
2.2.2 Sinonimias botánicas 8
2.2.3 Nombres populares 9
2.2.4 Distribución 9
2.2.5 Usos medicinales 9
2.2.6 Estudios farmacológicos y químicos 9
2.2.6.1 Actividad antiviral. 9
2.2.6.2 Actividad antimicrobiana y antituberculosa 12
2.2.6.3 Actividad anticancerígena 14
2.2.6.4 Actividad analgésica 16
2.2.6.5 Actividad antiulcerogénica y anti Helicobacter pylori 17
2.2.6.6 Actividad cicatrizante 18
2.2.6.7 Actividad moluscicida 19
2.2.6.8 Capacidad antioxidante 20
2.3 Estudios biotecnológicos de especies del género Calophyllum. 21
2.3.1 Estudios biotecnológicos de Calophyllum brasiliense Cambess 26
3. JUSTIFICACIÓN 28
4. HIPÓTESIS 28
5. OBJETIVOS 29
5.1 Objetivos generales 29
5.2 Objetivos particulares 29
6. METODOLOGÍA. 30
6.1 Cultivos in vitro de C. brasiliense 30
6.1.1 Establecimiento de cultivos de callos 30
6.1.2 Establecimiento del cultivo de células en suspensión de C. brasiliense 31
6.1.2.1 Cinéticas de crecimiento 31
6.1.2.2 Determinación de azúcares totales en el medio de cultivo de células en 32
suspensión de C. brasiliense por el método del fenol-sulfúrico.
6.2 Análisis químico. 32
6.2.1 Obtención de extractos metanólicos de células en suspensión de C. 32
brasiliense
6.2.2 Obtención de extractos metanólicos de hojas de plántulas silvestres y 32
aclimatadas de C. brasiliense
6.2.3 Determinación del contenido total de fenoles 33
6.2.4 Determinación del contenido de flavonoides 33
 6.2.5 Determinación de la Capacidad antioxidante por el Método del DPPH. 34
6.2.6 Determinación de la Capacidad antioxidante por el Método del ABTS. 34
6.2.7 Aislamiento y purificación de ácido apetálico, canofilol y calanólidos de 35
partes aéreas de C. brasiliense.
6.2.8 Extracción de biomasa de suspensiones celulares de C. brasiliense. 35
6.2.9 Identificación por HPLC de ácido apetálico, canofilol y (-)-calanólido B en el 36
extracto diclorometánico de células en suspensión de C. brasiliense.
6.3 Evaluación de la actividad anti-inflamatoria. 37
6.3.1 Animales. 37
6.3.2 Modelo agudo de Edema auricular en ratones inducido por TPA (12-O- 38
tetradecanoilforbol-13-acetato).
6.4 Estadística. 38
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 39
7.1 Material vegetal. 39
7.2 Cultivo de callos. 40
7.3 Cultivo de células en suspensión. 40
7.3.1 Cinéticas de crecimiento. 42
7.3.2 Consumo de azúcares totales por los cultivos de células en suspensión de 45
C. brasiliense.
7.4 Determinación de compuestos fenólicos en extractos metanólicos de células 45
en suspensión de C. brasiliense.
7.5 Evaluación de la capacidad antioxidante de los extractos metanólicos de 47
células en suspensión de C. brasiliense con el radical DPPH.
7.6 Determinación de flavonoides totales en extractos metanólicos de células en 48
suspensión de C. brasiliense.
7.7 Evaluación de la capacidad antioxidante de los extractos metanólicos de 49
células en suspensión de C. brasiliense con el radical ABTS.
7.8 Relación entre la producción de compuestos fenólicos y flavonoides con sus 50
capacidades antioxidantes.
7.9 Aislamiento y purificación de ácido apetálico, canofilol y calanólidos del 53
extracto acetónico de hojas de C. brasiliense.
7.10 Cuantificación de ácido apetálico y calanólido B en el extracto 66
diclorometánico de células en suspensión de C. brasiliense.
7.11 Actividad antiinflamatoria: Modelo de edema auricular inducido con TPA 71
8. CONCLUSIONES 76
9. PERSPECTIVAS. 78
10. BIBLIOGRAFÍA. 79
 ÍNDICE DE FIGURAS
Página.
Figura 1. Árbol de Calophyllum brasiliense Cambess. 7
Figura 2. Estructuras químicas del a) (+)-calanólido A, b) (-)-calanólido B, c) (+)- 10
calanólido C, d) soulatrólido, e) ácido apetálico e f) isómero del ácido
apetálico (ácido isoapetálico) aislados de las hojas de C. brasiliense.
Figura 3. Estructura química de la cumarina GUT-70 aislada de la corteza de C. 12
brasiliense.
Figura 4. Estructuras químicas de dipiranocumarinas aisladas de C. brasiliense 13
con actividad antituberculosis. a) (-)-calanólido A; b) (-)-7,8-
dihidrocalanólido B; c) 7,8-dihidrosoulatrólido.
Figura 5. a) Calofilólido y b) mammea B/BB aislados de las hojas de C. 15
brasiliense.
Figura 6. Cumarinas con actividad citotóxica a) mammea A/BA; b) mammea 16
A/BB; c) mammea B/BA; d) mammea B/BB; e) mammea R1: C/OA, R2:
C/OB aisladas de las hojas de C. brasiliense.
Figura 7. a) Friedelina y b) 1,5-dihidroxixantona con actividad antinociceptiva 17
aislados de la raíz de C. brasiliense.
Figura 8. Xantonas con actividad inhibitoria de la enzima H +K+ ATPasa del 18
duramen del tronco de C. brasiliense. a) 6-desoxijacareubina b)
jacareubina c) 1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-xantona d)
1-hidroxi-3,5,6-tri-o-acetil-2(3,3-dimetilalil)-xantona.
Figura 9. Estructura química de la 1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3,3,-dimetilalil)-xantona 20
con capacidad antioxidante.
Figura 10. Planta de C. brasiliense (2 años) aclimatada a la Ciudad de México. 39
Figura 11. Frasco con explantes de hoja de planta aclimatada de C. brasiliense 40
desarrollando callos al final de las 4 primeras semanas de cultivo n =
26. Medio MS con 3% sacarosa, 0.5% fructosa, 24.84 μM PIC, 8.88 μM
BAP.
Figura 12. Frasco con explantes de hoja de planta aclimatada de C. brasiliense 40
desarrollando callos al final de las 8 semanas de cultivo. n = 40. Medio
MS con 3% sacarosa, 0.5% fructosa, 24.84 μM PIC, 8.88 μM BAP.
Figura 13. Matraz erlenmeyer con células de C. brasiliense obtenidas de callos 41
de explantes de hoja de planta climatada. n = 10. Medio MS 3%
sacarosa, 0.5 % fructosa, 24.84 μM PIC, 8.88 μM BAP.
Figura 14. Cinéticas de crecimiento del cultivo de células en suspensión de C. 43
brasiliense a partir de inóculos del 6% (p/v).
Figura 15. Cinéticas de crecimiento celular y consumo de azúcares totales por los 45
cultivos en suspensión de C. brasiliense.
Figura 16. Cinéticas de crecimiento celular y acumulación de compuestos 46

i
 fenólicos en los cultivos en suspensión de C. brasiliense.
Figura 17. Cinéticas de producción de compuestos fenólicos y capacidad 47
antioxidante expresada como TEAC en los cultivos en suspensión de
C. brasiliense. Ensayo del DPPH.
Figura 18. Cinéticas de crecimiento celular y acumulación de flavonoides en los 48
cultivos en suspensión de C. brasiliense.
Figura 19. Cinéticas de producción de compuestos fenólicos y capacidad 49
antioxidante expresada como TEAC en los cultivos en suspensión de
C. brasiliense. Ensayo del ABTS.
Figura 20. Capacidades antioxidantes en función de la producción de compuestos 50
fenólicos en los cultivos en suspensión de C. brasiliense.
Figura 21. Capacidades antioxidantes en función de la producción de compuestos 51
de tipo flavonoide en los cultivos en suspensión de C. brasiliense.
Figura 22. CCF de los extractos de hojas de C. brasiliense corrida en el sistema 53
Hex-MeOH (7:3). A: acetónico; M: metanólico, H2O: acuoso. β:
estándar de β-sitosterol a) placa revelada con solución de sulfato
cérico b) placa observada bajo luz UV de onda corta (254 nm) c) placa
observada bajo luz UV de onda larga (365 nm).
Figura 23. CCF de los extractos de hojas de C. brasiliense. Sistema: 54
diclorometano-MeOH (9:1). A: acetónico; M: metanólico, H2O: acuoso.
Q: estándar de quercetina; O: estándar de ácido oleanólico.
Figura 24. CCF de fase normal. Corrida hexano-acetato de etilo (7:3). R: extracto 54
acetónico de referencia. SN: fracción 2 (hexano –AcOEt 8:2) solución
madre. βs: β-sitosterol. 10: precipitado de la fracción 2 (hexano–AcOEt
80:20). Revelador: 4-hidroxibenzaldehído.
Figura 25. Espectro de RMN de 1H, del compuesto 1 aislado de hojas de C. 55
brasilense.
13
Figura 26. Espectro de RMN de C, del compuesto 1 aislado de hojas de C. 55
brasilense.
13
Figura 26A. Expansión del espectro de RMN de C, del compuesto 1 aislado de 56
hojas de C. brasiliense.
Figura 27. Estructura química del canofilol (1) aislado de hojas de C. brasiliense. 57
Figura 28. CCF de fase normal. Sistema: hexano-AcOEt (7:3). R: Referencia, 58
unión de las fracciones 21-25 de C1; 11 a 15: fracciones eluidas con
Hex-AcOEt 85:15. Revelador: 4-hidroxibenzaldehído.
Figura 29. CCF de reversa. Sistema: acetonitrilo-agua (95:5) a) placa revelada 58
con 4-hidroxibenzaldehído. B) placa observada bajo luz UV=254 nm.
R: referencia reunión de fracciones 31-32 C2; fracciones 1-3 eluídas
con acetonitrilo-agua 95:5; fracciones 4-8 eluídas con acetonitrilo
100%.
Figura 30. Espectro de RMN de 1H, del compuesto (2) aislado de hojas de C. 59
brasiliense.

ii
Figura 30A. Expansión del espectro de RMN de 1H, del compuesto (2) aislado de 60
hojas de C. brasiliense.
Figura 31. Estructura química del ácido apetálico (2) aislado de hojas de C. 61
brasiliense.
Figura 32. CCF de fase reversa. Sistema acetonitrilo-agua 9:1. Fracción 7: 62
acetonitrilo-agua 5:5; fracciones 8 a 13: acetonitrilo-agua 4:6; R:
referencia F2C5. Revelador: 4-hidroxibenzaldehído.
Figura 33. Espectro de RMN de 1H, del compuesto aislado (3) aislado de hojas de 62
C. brasiliense.
13
Figura 34. Espectro de RMN de C, del compuesto (3) aislado de hojas de C. 63
brasiliense.
13
Figura 34A. Expansión del espectro de RMN de C, del compuesto (3) aislado de 63
hojas de C. brasiliense.
13
Figura 34B. Expansión del espectro de RMN de C, del compuesto (3) aislado de 64
hojas de C. brasiliense.
Figura 35. Cromatograma del extracto diclorometánico de la biomasa de C. 66
brasiliense.
Figura 36. Cromatogramas y espectros de absorción del ácido apetálico (2) y del 67
(-)-calanólido B (3) con trazas del (+)-calanólido A.
Figura 37. Cromatogramas comparativos del contenido de ácido apetálico (Tr = 67
19.52 min) y (-)-calanólido B (Tr = 22.13 min) en: a) extracto de
diclorometano íntegro; b) fracción 1 (100%, CH2Cl2) y c) fracción 2
(CH2Cl2-MeOH 9:1).
Figura 38. Cromatograma y espectro de absorción del (-)-calanólido B (3) 68
obtenidos con el método 2.
Figura 39. Cromatogramas y espectros de absorción de los extractos 69
diclorometánicos de la biomasa de C. brasiliense tratados con
diclorometano y diclorometano-metanol 9:1. Método 2.
Figura 40. Cromatograma y espectro de absorción del canofilol (Tr = 16.16 min). 70

Figura 41. CCF de fase reversa. Sistema metanol-acetonitrilo 5:5. A: revelador 4- 70

hidroxi-benzaldehído. B: placa observada a longitud UV de onda corta.
D100: fracción 100% diclorometano; 9:1: fracción dicloro-metanol 9:1;
U: referencia de ácido ursólico; β: referencia de β sitosterol; L: lavado
100% MeOH; A: ácido apetálico; C: canofilol.
Figura 42. Efecto de los extractos metanólico y acetónico de hojas de plantas 71
silvestres de C. brasiliense sobre la formación del edema auricular
inducido con TPA.
Figura 43. Inhibición del edema auricular inducido con TPA por efecto del extracto 72
metanólico y acetónico de hojas de plantas silvestres de C. brasiliense.
Figura 44. Efecto del extracto diclorometánico de células en suspensión de C. 74
brasiliense y de las fracciones de diclorometano (fracción 1) y
diclorometano-metanol (9:1) (fracción 2), sobre la formación del edema

iii
 auricular inducido con TPA.
Figura 45. Inhibición del edema auricular inducido con TPA por efecto de las 75
fracciones de diclorometano (fracción 1) y diclorometano-metanol (9:1)
(fracción 2) del extracto diclorometánico de células en suspensión de
C. brasiliense.

ÍNDICE DE TABLAS
Página.
Tabla 1. Constantes cinéticas del cultivo de células en suspensión de C. 44
brasiliense determinados con base al peso seco de la biomasa celular.
Tabla 2. Comparación del contenido de fenoles totales, flavonoides y 52
capacidades antioxidantes de los extractos de hojas de plantas
silvestre, aclimatada y de la suspensión celular de C. brasiliense.
Tabla 3. Valores de desplazamiento químico de 13C para el canofilol (1). 56
Comparativo con los datos experimentales obtenidos.
Tabla 4. Valores de desplazamiento químico de 13C para el ácido apetálico (2). 60
Comparativo con los datos experimentales obtenidos.
Tabla 5. Valores de desplazamiento químico de 1H para los calanólidos A, B y C. 64
Comparativo con los valores experimentales obtenidos.
Tabla 6. Valores de desplazamiento químico de 13C para los calanólidos A, B y C. 65
Comparativo con los valores experimentales obtenidos.

iv
RESUMEN

Calophyllum brasiliense Cambess es una especie que se distribuye ampliamente

en el continente americano desde México hasta Brasil. Es un árbol que crece en
los bosques lluviosos tropicales, puede medir de 20 a 30 m de alto, cuya madera
es utilizada para la elaboración de muebles principalmente. Los usos
etnobotánicos que se le atribuyen son diversos, debido a que es una especie que
produce gran cantidad de metabolitos secundarios con diversas actividades
biológicas como son la anti-microbiana, enfermedades gastrointestinales, dolor,
diabetes, curar llagas y para tratamiento de inflamaciones, reumatismo, varices,
hemorroides y úlceras, entrte otras. Dependiendo la región donde crece en forma
natural se le conoce por diversos nombres como bari, leche María, Santa María,
etcétera. Dos de las actividades más reconocidas en la especie son la antiviral
(anti VIH-1) y la antitumoral, debidas principalmente a las dipiranocumarinas
calanólidos y mammeas, respectivamente. Un reto al cual se enfrentan los
investigadores es la obtención de estos metabolitos secundarios de manera
sustentable para su aplicación como fitofármacos. Las estrategias van desde
procedimientos silvícolas para lograr la cosecha sustentable de hojas hasta el
cultivo in vitro de la especie.
En este trabajo, se planteó la producción de compuestos activos de Calophyllum
brasiliense (ácido apetálico, canofilol y calanólidos) en cultivos de células en
suspensión.
El establecimiento del cultivo de células en suspensión se realizó a partir de callos
friables derivados de explantes de hoja de planta aclimatada a la Ciudad de
México en el medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS) complementado con 3%
sacarosa, 0.5 % fructosa más 24.84 μM de picloram (PIC) y 8.88 μM de 6-
bencilaminopurina (BAP), obteniendo una suspensión homogénea con agregados
celulares cafés claro pequeños con presencia de células libres. Para este cultivo in
vitro se determinó una cinética de crecimiento de 16 días con base al peso seco
de la biomasa detrminando unaa biomasa máxima de 15.17 g/L al 12° día de
cultivo. Los parámetros cinéticos determinados fueron Índice de crecimiento (2.4),
la velocidad específica de crecimiento (µ = 0.116 h-1), el tiempo de duplicación (TD
v
= 5.95 días) y el rendimiento de crecimiento de la biomasa con relación a la fuente
de carbono (Yx/s = 0.433 g biomasa/g fuente de carbono). Se realizaron también
cinéticas de producción de compuestos fenólicos totales (FT) y de flavonoides
totales (FVT), para ello, se obtuvieron los extractos metanólicos por sonicación de
la biomasa muestreada en cada punto de la cinética las biomasas secas. Se
determinó una producción máxima de FT de 57.26 mg AG/ g BS y de FVT de
271.75 mg Quer/ g BS a los 16 y 12 días de cultivo, respectivamente; la
producción de ambos grupos de compuestos está parcialmente asociados al
crecimiento. Conjuntamente, se realizó la determinación de las capacidades
antioxidantes (CAO) de los extractos metanólicos. Las CAO ensayadas con los
radicales 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) y ácido 2,2´-azino-bis-(3-
etilbenzotiazolina)-6-sulfónico (ABTS) aumentaron en correlación con la
producción de compuestos fenólicos con una máxima actividad de 130.54 M
Trolox/ g BS y 534.5323 mM Trolox/ g BS para el DPPH y ABTS, respectivamente.
La correlación entre la producción de compuestos fenólicos con sus CAO fue del
95% en comparación con un 75% mostrada con los flavonoides, por lo que esta
CAO se debe principalmente a la presencia de flavonoides pero también a otros
compuestos fenólicos. Se realizó la comparación entre la producción de FT, FVT y
sus respectivas CAO entre las tres fuentes de material vegetal usadas en este
trabajo: hojas de planta silvestre, hojas de la planta aclimatada y de la suspensión
celular. La suspensión produjo 1.76 veces más compuestos FT respecto a la
planta silvestre y 5.85 veces más que la planta aclimatada; el mismo
comportamiento se observó para la producción de FVT (1.72 y 4.64 veces
respectivamente). Conjuntamente, la CAO de la suspensión celular fue 1.35 y 3.36
veces superior que la determinada para las plantas silvestre y aclimatada en el
ensayo del DPPH; así como 3 veces mayor respecto a la planta silvestre y 9
respecto a la planta aclimatada en el ensayo del ABTS).
Con la finalidad de conocer qué compuestos activos de C. brasiliense son
producidos en el cultivo de ´celulas en suspensión, se procedió a la purificación de
canofilol, ácido apetálico y calanólidos B y A a partir de las hojas de plantas
silvestres de C. brasiliense. La estructura de los compuestos se confirmó por

vi
análisis espectroscópicos de RMN de 1H y 13
C, cuyos valores de desplazamiento
se compararon con los datos reportados en la literatura para dichos compuestos.
Se identificó la presencia de ácido apetálico y canofilol en el extracto de
diclorometano de los cultivos en suspensión pero no del (-)-calanólido B. El
contenido de ácido apetálico en la biomasa (0.024 mg /g BS) de la suspensión
celular fue menor al determinado en el extracto acetónico de hojas de planta
silvestre de C. brasiliense (6.96 mg/g). El canofilol no pudo ser analizado debido a
su baja solubilidad por lo que es necesario emplear otro método de HPLC para su
análisis.

vii
1. INTRODUCCIÓN

Cultivo de tejidos vegetales.

El Cultivo de Tejidos Vegetales (CVT) es un conjunto de técnicas que permiten el

establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de una planta,
desde una célula hasta un organismo completo, bajo condiciones artificiales,
axénicas y controladas. El uso de estos sistemas biotecnológicos ofrece varias
ventajas con respecto al método tradicional de obtención de metabolitos a partir de
plantas cultivadas en el campo. Entre ellos se pueden citar los siguientes:
independencia de las condiciones climáticas adversas y de los problemas de
plagas y enfermedades, la posibilidad de mantener consistencia en la calidad de
los productos deseados y amplias perspectivas para incrementar la productividad
(Taticek et al., 1991; Alferman y Paterson, 1995). El CVT tiene diversas
aplicaciones en la biotecnología vegetal como la micropropagación, la generación
de plantas libres de enfermedades y la conservación de germoplasma in vitro.
(Pérez et al., 1999).

Principios básicos del CVT.

El CVT se basa en tres principios básicos, de cuya comprensión y manipulación

depende el éxito o fracaso de cualquier trabajo en este campo (Pérez et al., 1999)
Los principios básicos son los siguientes:
1) Elección del explante. Se llama explante al órgano, tejido o segmento de tejido
vegetal que va a ser utilizado para iniciar el cultivo. Entre más joven y menos
diferenciado sea un tejido, más fácil será su adaptación y respuesta al cultivo in
vitro. El cultivo de un fragmento de tejido vegetal en condiciones artificiales
significa el cese de sus relaciones con otros órganos, tejidos y células de la planta
completa; las cuales deben de ser compensadas por el medio y las condiciones de
cultivo.

1
2) Elección del medio y condiciones de cultivo. El medio de cultivo junto con el tipo
de explante determina la respuesta que se obtendrá del mismo, por lo que su
elección y adecuada formulación son fundamentales para el éxito del CTV. El
medio de cultivo consiste en dos grupos de componentes. Los primeros son los
esenciales, aquellos que satisfacen los requerimientos nutricionales básicos del
tejido cultivado: incluye a los nutrientes minerales, la fuente de carbono y algunas
vitaminas. El segundo grupo de compuestos son los llamados opcionales, los
cuales determinan el tipo de respuesta que se obtendrá del tejido, y por tanto
influyen en el establecimiento y respuesta de los cultivos in vitro. A este grupo
pertenecen las fitohormonas o reguladores de crecimiento vegetal.

Reguladores del crecimiento vegetal:

- Promotores del crecimiento: auxinas (p.e. ácido 2,4 diclorofenoxiacético: 2,4-D),

citocininas (p.e. 6-bencilaminopurina: BAP) y giberelinas (p.e. ácido giberélico).

- Inhibidores del crecimiento: ácido abscísico.

- Promotor de la maduración de los frutos y senescencia de las hojas: etileno.

Además es importante considerar las condiciones físicas como luz, fotoperiodo,

temperatura y humedad; ya que contribuyen a la respuesta del explante.

3) Condiciones asépticas. Para que un cultivo de cualquier tejido vegetal prospere

de la manera deseada, debe excluirse del mismo a cualquier tipo de organismo
contaminante (Pérez et al., 1999).

*Callo.

Es un tejido obtenido por medio del aislamiento de órganos o tejidos diferenciados,

los cuales posteriormente son llevados a una desdiferenciación celular,

2
presentando estas células una proliferación continua, acelerada y de apariencia
desorganizada, que da origen a una masa amorfa de tejido (Hurtado y Merino,
2001).

*Cultivo de células en suspensión.

Se le denomina cultivo de células en suspensión al cultivo in vitro de células

vegetales aisladas o en pequeños agregados, distribuidas en un medio nutritivo
líquido y en constante movimiento, las cuales presentan una alta tasa de división
celular y una homogeneidad relativamente alta. El cultivo de células en suspensión
puede iniciarse a partir de cualquier explante inoculado en medio líquido con
agitación; sin embargo, hay una mayor probabilidad de éxito y rapidez en la
obtención del cultivo si se parte de tejido calloso; por lo tanto, los cultivos de
células en suspensión generalmente se inician transfiriendo fragmentos de tejido
calloso a medio nutritivo líquido, y agitándolos para facilitar la dispersión celular y
la oxigenación del medio. Los cultivos celulares se han utilizado como sistemas
modelo para estudiar distintos procesos en la ciencia vegetal básica y aplicada.
Además ofrecen sistemas adecuados para diferentes procesos, ya que nos
permiten disponer de grandes poblaciones de células relativamente homogéneas
creciendo en condiciones perfectamente controladas. Por otra parte, estas células
son susceptibles de recibir de manera rápida y uniforme cualquier tipo de estímulo
externo que se aplique y cuyo efecto se desee estudiar; asimismo, la falta de
clorofilas y carotenos en la mayoría de las células vegetales obtenidas de un
cultivo celular, es de gran utilidad para el aislamiento y purificación de enzimas de
origen vegetal. La velocidad de crecimiento de un cultivo de células en suspensión
depende de la densidad inicial del inóculo, de la cual dependerá la fase lag, y de la
tasa de multiplicación del cultivo. Los dos últimos factores dependen del genotipo
de las líneas celulares, del medio nutritivo y de las condiciones de incubación
(Pérez et al., 1999; Hurtado y Merino, 2001).

3
Inflamación

La inflamación se define como la respuesta local de los tejidos de mamíferos vivos

al daño debido a cualquier agente, tales como bacterias, virus, hongos, parásitos
o reacciones inmunes, traumas mecánicos, venenos orgánicos e inorgánicos, o
cuerpos extraños. Es una reacción del cuerpo para prevenir el esparcimiento del
agente dañiño y remover las células y tejidos necrosados. La inflamación involucra
dos procesos básicos: el primero es la respuesta inflamatoria temprana y el
segundo la sanación. Los signos de inflamación incluyen enrojecimiento, calor,
dolor, pérdida de función.
Existen dos tipos de inflamación: aguda y crónica. La primera es de corta
duración y representa la respuesta temprana del cuerpo, se resuelve rápidamente
y usualmente es seguida de sanación. La inflamación crónica se define como el
proceso prolongado en el cual la destrucción del tejido y la inflamación ocurren al
mismo tiempo (Harsh M. 2005, citado por Mitul Patel et al., 2012).

Modelo agudo de edema auricular en ratones inducido con TPA

Fue descrito por De Young et al., 1989 y modificado por Payá et al., 1993. El TPA
(12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato) tiene propiedades irritantes, pro-
inflamatorias y promotoras de tumores. Su aplicación desencadena todos los
eventos propios del proceso inflamatorio: vasodilatación, eritrema, extravasación y
edema (Gómez et al. 2011, citado por Murakawa et al., 2006). El edema está
asociado con un incremento de eicosanoides como prostaglandinas (PGE2) y
leucotrienos (LTB4), además induce la expresión de otros mediadores
inflamatorios como las citosinas (Murakawa et al., 2006).
El éster de forbol TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato) es un compuesto
activo componente del aceite de crotón (Croton tiglium L.) que tiene propiedades
irritantes que induce la inflamación de la piel y respuestas hiperproliferativas en
animales, que en muchos aspectos recuerda los signos de enfermedades tales
como la psoriasis. (Gábor, 2005).

4
 Cuando el TPA (1 µg en acetona) se aplica con ayuda de una pipeta
automática en la oreja de un ratón, ocurre la vasodilatación de la piel y el eritrema
en 1-2 horas hasta 3-4 horas, la oreja comienza a adelgazarse como resultado de
la trasvasación de líquidos y el edema alcanza un máximo a las 6 horas,
menguando después cerca de los niveles del control a las 24 horas (Young et al.,
1983; Yound y De Young, 1989).
Se ha demostrado que la aplicación de una sola o de múltiples aplicaciones de
TPA en la oreja de un ratón, induce respuestas inflamatorias prolongadas,
caracterizadas por el incremento del peso de la oreja, hiperplasia epidérmica e
infiltración de neutrófilos (Nakadate, 1989). Los esteroides aplicados tópicamente
(dipropionato de betametasona, hidoxicortisona 17-valerato) reducen
significativamente el peso del edema, el contenido de mieloperoxidasa y la
delgadez epidérmica.
Según Stanley et al. (1991) este modelo crónico de inflamación de la piel
puede ser más relevante para la evaluación de compuestos antiinflamatorios que
el modelo agudo de TPA, debido a que los compuestos probados son aplicados
después de que se produce la lesión inflamatoria, que reflejan el uso clínico de
drogas antiinflamatorias. Además este modelo puede ser más selectivo que el
modelo agudo de TPA para compuestos que afectan la producción de
leucotrienos, ya que otros agentes farmacológicos que son activos en el modelo
agudo no lo son el modelo de aplicación múltiple (Stanley et al., 1991).
El TPA es capaz de activar la proteína kinasa C (PKC), que activa otras
enzimas en turno en cascada tales como mitógeno activado por PKC (MAPK) y
fosfolipasa A2 (PLA2), que conduce a la liberación del factor de activación de
plaquetas y AA. Esta cascada de eventos estimula la permeación vascular, la
migración de leucocitos polimorfonucleares, liberación de histamina, serotinina, y
síntesis moderada de eicosanoides por las enzimas ciclooxigenasa (COX) y 5-
lipooxigenasa (5-LOX). Los inhibidores de COX y 5-LOX leucotrieno B4 (LTB4)
antagonistas y corticoesteroides muestran actividad antiinflamatoria tópica en
modelos animales con inflamación de la piel inducida con TPA o aceite de crotón.
(Mitul Patel et al., 2012).

5
2. ANTECEDENTES

2.1 Género Calophyllum

El género Calophyllum comprende cerca de 180 especies, principalmente árboles,
distribuidos en las zonas tropicales del planeta (Stevens, 1980). Estudios
fitoquímicos previos han revelado que son una fuente rica en compuestos de
interés farmacológico (Mesía-Vela et al., 2001). Por ejemplo, Calophyllum
inophyllum produce neoflavonoides inhibidores de la transcriptasa reversa del HIV-
1 (Patil et al., 1993; Spino et al., 1998) y con actividad antitumoral (Itoigawa et al.,
2001); C. moonii y C. teysmannii var. inophylloide producen compuestos con
actividad citotóxica contra ciertas líneas celulares (Bandara, 1986; Cao, 1998).
Calophyllum brasiliense Cambess produce diversos tipos de metabolitos
secundarios como xantonas, coumarinas, biflavonoides (como la amentoflavona),
saponinas, triterpenos (friedelina, canofilol) y ácidos libres (ácido shiquímico)
(Reyes-Chilpa et al., 1997, 2004).

La presencia de dipiranocumarinas en el extracto hexánico son capaces de

inhibir la actividad de la transcriptasa reversa (TR) tales como los calanólidos A y
B asilados de C. lanigerum var. austrocoriaceum en 1992, los inophyllums B y P
aislados de C. inophyllum y el soulatrólido aislado también de C. inophyllum y C.
teysmanii, y (Huerta-Reyes et al., 2004; Pawar et al., 2007).

2.2 Descripción botánica de Calophyllum brasiliense (Cambess)

Es un árbol perennifolio, dioico, de 20 a 30 m de alto, pudiendo llegar hasta los 50

m y un diámetro de 40 a 60 cm. Su copa se caracteriza por ser redondeada,
extendida y densa. Presenta un tronco cilíndrico y recto con una corteza fisurada
color pardo del lado externo, y por el lado interno de color crema rosado; es
laminada, fibrosa, amarga con exudado intensamente amarillo. Sus hojas son
verde oscuras, brillantes en el haz, verde pálidas en el envés, decusadas, simples;
láminas de 6 x 2.5 a 14 x 5.5 cm, elípticas u oblongas. Tienen nervadura central
6
prominente en el envés; nervios secundarios perpendiculares al central,
numerosos y cercanos unos de otros. Sus flores son dioicas y pueden encontrarse
flores masculinas y bisexuales en el mismo árbol, las flores femeninas presentan
el perianto semejante a las masculinas. Las flores se encuentran en panículas
auxiliares de 2 a 5 cm de largo, glabras; son blancas, ligeramente perfumadas,
actinomórficas, con pétalos de color crema amarillentos, redondos y cóncavos;
estambres numerosos, y ovario súpero hinchado, estilo corto, estigma grande y
obtuso, florece de julio a diciembre. Sus frutos son drupas de 2.5 a 3 cm de largo,
de forma ovoide o esférica, verde amarillentos en la madurez y olor fragante, con
endocarpio duro y semilla grande por fruto, esféricas, de 1.5 x 1.3 cm de color
blanco amarillentas sin endospermo. Las fibras del mesocarpio se contraen y
arrugan cuando se secan (Niembro, 1986; Vozzo, 2003; CONABIO, 2005).

Figura 1. Árbol de Calophyllum brasiliense Cambess. Fuente: Antonio Bernabé-

Antonio: [email protected].

7
2.2.1 Clasificación taxonómica.

Cronquist (1981) clasificó a Calophyllum brasiliense de la siguiente manera:

 Reino: Plantae
 Subreino: Tracheobionta
 División: Magnoliophyta
 Clase: Magnoliopsida
 Subclase: Dilleniidae
 Orden: Theales
 Familia: Clusiaceae
 Género: Calophyllum
 Especie: Calophyllum brasiliense.

Hoy en día el Missouri Botanical Garden (http://www.tropicos.org,

http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/) indica la clasificación taxonómica
como sigue:

 Clase: Equisetopsida C. Agardh

 Subclase: Magnoliidae Novák ex Takht.
 Superorden: Rosanae Takht.
 Orden: Malpighiales Juss. ex Bercht. & J. Presl.
 Familia: Calophyllaceae J. Agardh
 Género: Calophyllum L.
 Especie: Calophyllum brasiliense Cambess.

2.2.2 Sinonimias botánicas

Las sinonimias descritas por la CONABIO (2005) son: Calophyllum antillanum

Britton; Calophyllum brasiliense var. antillanum (Britton) Standl; Calophyllum
brasiliense var. rekoi Standl.; Calophyllum calaba Jacq.; Calophyllum jacquinii
Fawc. & Rendle.; Calophyllum lucidum Benth.; Calophyllum piaroanum Anibal
Castillo & Celia Gil.; Callophylum chiapense Standl.

8
2.2.3 Nombres populares

En nuestro país, dependiendo de la región donde se encuentre se le conoce como

Guaya, Barillo, Cedro cimarrón, Ocú, Palo María, Barí, Leche amarilla, Santa
María, Sacbalamté, Leche María (CONABIO, 2005).

2.2.4 Distribución

Calophyllum brasiliense es la especie con mayor distribución e importancia

medicinal en América, se localiza desde Brasil hasta México. En nuestro país es la
única representante de su género, se encuentra en la vertiente del Golfo de
México y en la vertiente del Pacífico (Stevens, 1980).

2.2.5 Usos en la medicina tradicional

Se tiene reporte del uso de las hojas y corteza de C. brasiliense en la medicina

tradicional para tratar enfermedades como dolor, infecciones, el asma y como
laxantes (Oliveira, 1994). También se han usado para tratar la bronquitis,
disturbios gástricos y hepáticos (Sartori et al. 1999), reumatismo, varices,
hemorroides, úlceras crónicas (Correa, 1978), diarrea y herpes (Rutter, 1990), así
como diabetes e hipertensión (Duke y Martínez 1994). En algunas comunidades
rurales en México se extrae el aceite de las semillas y se usa para curar
enfermedades cutáneas. La resina que mana del tronco se conoce como bálsamo
de María y se le atribuyen propiedades medicinales para disminuir la comezón en
la piel, cicatrizar úlceras, diuréticas, inflamación de ojos e insolación (Niembro,
1986; Dweck y Meadowsy, 2002).

2.2.6 Estudios fitoquímicos y farmacológicos

2.2.6.1 Actividad antiviral.

Algunos trabajos han reportado la actividad antiviral en Calophyllum brasiliense.

Huerta-Reyes et al. (2004) demostraron que los extractos orgánicos de las hojas
de la planta silvestre de Los Tuxtlas, Veracruz tienen actividad contra la

9
trasnscriptasa reversa (TR) del virus del VIH-1. Los extractos hexánico, acetónico
y metanólico obtenidos se probaron primeramente en un ensayo in vitro
inmunocolorimétrico no radioactivo de inhibición de la TR del VIH-1, logrando
inhibir la actividad de la enzima en un 77.9%, 81.3% y 83.3%, respectivamente.
También se evaluó la citotoxicidad de estos extractos en líneas celulares de
linfocitos sanos MT2, observándose que sólo los extractos hexánico y metanólico
no presentaron citotoxicidad; dichos extractos se probaron en el ensayo de
inhibición de la replicación del VIH-1 en la línea celular IIIb/LAV, donde sólo el
extracto hexánico logró inhibir la replicación del virus en un 74.5%, mientras que el
metanólico en un 52%. Mediante un estudio biodirigido y siguiendo el mismo
esquema de evaluación, del extracto hexánico se aislaron e identificaron los
calanólidos A y B, los cuales presentaron el mayor porcentaje de inhibición de la
TR del VIH-1 (81.5 y 76.2 %, respectivamente), seguidos del soulatrólido (77.7%).
El (+)-calanólido C sólo tuvo 50.7% de actividad y los ácidos apetálico e
isoapetálico puros no fueron activos (Figura 2). Los valores de concentración
inhibitoria 50 (IC50) reportados fueron de 0.34 μM para el (+)-calanólido A, 0.5 μM
(-)-calanólido B y 0.66 μM para el soulatrólido.

a b c d

e f

Figura 2. Estructuras químicas de compuestos aislados de las hojas de C.

brasiliense. a) (+)-calanólido A, b) (-)-calanólido B (aislado en este trabajo), c) (+)-

10
calanólido C, d) soulatrólido, e) ácido apetálico e f) isómero del ácido apetálico
(ácido isoapetálico) aislados. Fuente: Huerta-Reyes et al. (2004).

En otra colecta de C. brasiliense realizada en la región del Soconusco,

Chiapas, también se encontraron el ácido apetálico y los calanólidos B y C en los
extractos de hojas, indicando que a pesar de ser la misma especie existen
diferencias en su composición químicas (García-Zebadúa et al., 2011). Los
extractos hexánicos de las hojas fueron probadas en el ensayo in vitro de
inhibición de la TR del VIH-1 y la citotoxicidad en líneas celulares de linfocitos
humanos MT2 sanos y su toxicidad (DL50) en pruebas ex vitro usando ratones. El
extracto hexánico demostró la inhibición de la TR in vitro (IC50= 20.2 µg/mL) y no
resultó tóxico para los ratones (DL 50= 1.99 g/ Kg). Además, el estudio histológico
de los ratones tratados con la mayor dosis no reveló alteración de los hepatocitos
e incluso hubo un aumento en el número de los megacariocitos del bazo (García-
Zebadúa et al., 2011).

Estudios más recientes de Matsuda et al. (2015) demostraron que la cumarina

tricíclica 5-metoxi-2,2-dimetil-6-(2-metil-1-oxo-2-butenil)-10-propil-2H, 8H-benzo [2-
b;3,4-b]-dipiran-8-ona (C23H26O5), también conocida como GUT-70 (Figura 4),
aislada de la corteza de C. brasiliense estabiliza la fluidez de la membrana
plasmática de las células T hospederas. Este mecanismo es de suma importancia
ya que la unión de las células T al virus del VIH-1 es el paso inicial para que
comience la infección y la fluidez de la membrana plasmática y promueve la
infectividad. Se demostró también que la GUT-70 regula la expresión por una
cascada de regulación de los genes CD4, CCR5 y CXCR4. La GUT-70 también
muestra efecto inhibitorio de la replicación del virus mediante la inhibición de NK-
kB. (Matsuda et al., 2015).

11
Figura 3. Estructura química de la cumarina GUT-70 aislada de la corteza de C.
brasiliense. Fuente: Matsuda et al. 2015.

2.2.6.2 Actividad antimicrobiana y antituberculosa.

Otros metabolitos secundarios aislados de C. brasiliense como las cumarinas,

xantonas y triterpenos se han evaluado para determinar su actividad
antimicrobiana. Por ejemplo, la mammea A/BA (Figura 6a) y la friedelina (Figura
7a) purificadas del extracto hexánico de las hojas, las xantonas como la
jacareubina (Figura 8b), la 1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3,3,-dimetilalil)-xantona (Figura
10) y la 6-desoxijacareubina (Figura 8a) obtenidas del extracto acetónico del
duramen de la corteza de C. brasiliense inhiben el crecimiento de Escherichia coli
C600 y Staphylococcus aureus 209P. Las concentraciones mínimas inhibitorias
(CMI) más altas contra E. coli C600 fueron de >512 µg/mL para la friedelina y la 6-
desoxijacareubina, >256 µg/mL para la mammea A/BA y 128 µg/mL para la
jacareubina y la 1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3,3,-dimetilalil)-xantona. Para S. aureus
209P, la CMI fue de 1 µg/mL para la mammea A/BA y la 1,3,5,6-tetrahidroxi-2-
(3,3,-dimetilalil)-xantona, 8 µg/mL para la jacareubina y 256 µg/mL y >512 µg/mL
para la 6-desoxijacareubina y la friedelina, respectivamente (Yasunaka et al.,
2005).

De la misma manera, las mammeas A/BB y B/BB (Figuras 6b y 6d) aisladas de

los extractos de diclorometano de hojas fueron evaluados para inhibir el
crecimiento de Mycobacterium tuberculosis H37Rv junto con los extractos acuoso
y de diclorometano, siendo las CMI de 76.85 y 83.87 μM respectivamente para las

12
mammeas, y 125 y 62.5 μg/mL respectivamente, para los extractos acuoso y de
diclorometano respectivamente. Además de la cepa H37Rv, se evaluó la actividad
de los extractos y de los compuestos puros con cepas aisladas de hospitales,
tanto sensibles como resistentes a antibióticos, encontrando que la mammeas
tuvieron actividad con valores de CMI entre 76.85 μM y 153.94 μM (A/BB) y 83.87
μM y 168.01 μM (B/BB). En los ensayos de citotoxicidad con macrófagos, el
extracto de diclorometano y las mammeas purificadas mostraron valores de índice
de selectividad ente 0.59 -1.06 (Pires et al., 2014).

Otro compuesto que ha demostrado actividad contra M. tuberculosis es el (+)-

calanólido A (Figura 2a) que ha sido probado contra diversas cepas de
Mycobacterium como la H37Rv demostrando un porcentaje de inhibición mayor al
96% a una concentración de 12.5 μg/mL, con una CMI 3.13 μg/mL y una IC50= 7.6
μg/mL. Otras dipiranocoumarinas como el (-)-calanólido B, el soulatrólido, (Figuras
2b y 2d), el (-)-calanólido A, (-)-7,8-dihidrocalanólido B y el 7,8-dihidrosoulatrólido
(Figura 4) fueron activas contra M. tuberculosis con valores en el mismo nivel que
el (+)-calanólido A (Xu et al., 2004).

Al ser evaluado el (+)-calanólido A contra cepas de M. tuberculosis resistentes

a antibióticos como la estreptomicina y el rifampin, tuvo actividad a una CMI de 8–
16 μg/mL, siendo importante mencionar que no perdió actividad contra estas
cepas tales como la H37Ra, CSU 19 y CSU 33, 36 y 38; H37 Rv-INH-R y H37 Rv-
EMB-R (Xu et al., 2004).

a b c

Figura 4. Estructuras químicas de dipiranocumarinas aisladas de C.

brasiliense con actividad antituberculosis. a) (-)-calanólido A; b) (-)-7,8-
dihidrocalanólido B; c) 7,8-dihidrosoulatrólido. Fuente: Xu et al., 2004.

13
2.2.6.3 Actividad anticancerígena.

Algunas pruebas anticancerígenas con extractos de C. brasiliense también han

sido evaluadas. La cumarina tricíclica 5-metoxi-2,2-dimetil-6-(2-metil-1-oxo-2-
butenil)-10-propil-2H,8H-benzo-[1,2-b;3,4-b’]-dipiran-8-ona (C23H26O5), también
conocida como GUT-70 (Figura 3), aislada de la corteza de C. brasiliense inihibió
significativamente el crecimiento de las líneas celulares de leucemia BV173, K562,
NALM6, HL60 y SEM, y la línea celular de adenocarcinoma colonrectal HCT116
probadas por Kimura et al. (2005), en una concentración tiempo-dependiente con
valores de IC50 de 2 a 5 μM. Además, ésta cumarina no inhibió la formación de
colonias celulares de progenitores hematopoyéticos, ni la proliferación de
hepatocitos humanos normales, ambos a concentraciones mayores de 30 μM. La
GUT -70 activa las enzimas caspasas 2, 3, 8 y 9 e induce la apoptosis en las
líneas celulares de leucemia, dicha apoptosis estaba inhibida debido a inhibidores
de las casapasas. Además, la GUT-70 indujo efectos antileucémicos
independientes de la vía de p53-p2lWAFl/CIP1 y aumentó la expresión de
p27KIP1 y p57KIP2, para detener el ciclo celular y la transición G1/S. Estudios
más recientes han demostrado que la cumarina GUT-70 inhibe la proiliferación de
células del linfoma del manto (MCL) mediante la inhibición de Hsp90, además de
presentar actividad proapotótica (Jin et al., 2011).

De los extractos hexánicos de hojas de C. brasiliense colectadas en Los

Tuxtlas también se aislaron cumarinas del tipo mammea A/BA y A/BB, las cuales
han mostrado citotoxicidad contra la línea de leucemia K562. (Gómez-Verjan et al.,
2014). La citotoxicidad de la mezcla de coumarinas A/BA y A/BB (3:1) se evaluó
mediante el ensayo del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazolio y
la muerte celular se evaluó con el ensayo TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl
transferase dUTP nick end labeling), además de inmunofluorescencia de la
caspasa activa 3 obteniendo una IC50 = 43.5 μM. Estas mammeas también han
sido reportadas con actividad citotóxica significativa contra las líneas cancerígenas

14
PC3 (Adenocarcinoma de próstata humano) y U251 (glioblastoma neuronal
humano) (Gómez-Verjan et al., 2014).

El calofilólido y la mammea B/BB (Figura 5) también aislados de C. brasiliense

demostraron ser citotóxicas contra células leucémicas de la línea HL-60,
observándose que la condensación de cromatina y la fragmentación del núcleo
aumentaba conforme el tiempo en células apoptóticas. Además, estos dos
compuestos indujeron dicha apoptosis mediante la activación de la ruta de la
caspasa-9/caspasa-3 que se desencadena por la disfunción mitocondrial (Ito et al.,
2006).

a b

Figura 5. a) Calofilólido y b) mammea B/BB aislados de las hojas de C.

brasiliense. Fuente: Ito et al., 2006.

Como se ha mencionado, las coumarinas, principalmente del tipo mammea,

han demostrado tener actividad anticancerígena. De acuerdo a Reyes-Chilpa et al.
(2004) una serie de metabolitos secundarios aislados de las hojas de C.
brasiliense recolectadas en la región de Santa Martha, Estado de Veracruz,
México, poseen actividad significativa contra líneas de cáncer: K562 (linfoma),
U251 (cáncer de la médula espinal) y PC3 (cáncer prostático). Los compuestos
más activos fueron las mezclas de las mammea A/BB + mammea B/BA y
mammea C/OA +mammea C/OB, aisladas del extracto hexánico de las hojas de la
planta, con una actividad inhibitoria en un 88 a 100%; el triterpeno friedelina
obtenido del mismo extracto, logró inhibir en un 61.9% la línea celular de PC3. La
mezcla de mammeas mammea B/BA ciclo F y B/BB ciclo F, además de la
isommameigina, asiladas del extracto acetónico de las hojas, sólo inhibieron el
15
crecimiento tumoral de 38 a 69%. Los valores de IC 50 calculados para los
compuestos puros y las mezclas más activas fueron de 0.04 a 0.59 µM para la
mammea A/BA; ≤ 4.05 µM para las mezclas mammea A/BA + A/BB, mammeas
B/BA + B/BB, mammeas C/OA + C/OB (Figura 6).

a b d

R1
R2
e

Figura 6. Cumarinas con actividad citotóxica a) mammea A/BA; b) mammea A/BB;

c) mammea B/BA; d) mammea B/BB; e) mammea R1: C/OA, R2: C/OB aisladas
de las hojas de C. brasiliense. Fuente: Reyes-Chilpa et al., 2004.

2.2.6.4 Actividad analgésica.

Los extractos orgánicos de C. brasiliense han sido probados en modelos de dolor

para determinar su actividad antinociceptiva (Isaías et al., 2004). Éste mismo
autor comparó el efecto del extracto metanólico de las raíces y la fracción
diclorometánica en la prueba de dolor inducida con formalina, ambos extractos
sólo presentaron actividad en 87.0 ± 3.5 % y 76.0 ± 8.0% respectivamente hasta la
segunda fase, los cuales fueron superiores al ácido acetilsalicílico e la

16
indometacina. Cuando los compuestos puros de friedelina (Figura 7a) y el 1,5-
dihidroxixantona (Figura 7b) se evaluaron por vía intraperitoneal en el modelo de
constricción abdominal, mostrando una inhibición dosis-dependiente de las
constricciones abdominales a valores de (Dosis Inhibitoria) DI50 de 12.0 (10-14.5) y
30 (27.0-32.0) mg/kg respectivamente, siendo la friedelina (de 9 a 13 veces más
potente), y la 1,5-dihidroxixantona (de 4 a 5 veces más potente) que los
compuestos referenciados.

a b

Figura 7. Friedelina a) y 1,5-dihidroxixantona b) con actividad antinociceptiva

aislados de la raíz de C. brasiliense. Fuente: Isaías et al., 2004

2.2.6.5 Actividad antiulcerogénica y anti-Helicobacter pylori

Los extractos hexánico y fracciones de hojas de C. brasiliense han sido reportadas

también con actividad antiulcerogénica en modelos de ratones cuya úlcera
gástrica se indujo por ingesta de etanol (75% v/v) o indometacina (50 mg/kg).
Después de inducir la úlcera se evaluó la actividad de la catalasa, y contenido de
malondialdehído y glutatión reducido en el tejido estomacal. La mezcla de ácidos
derivados de cromanonas previno la ulceración gástrica causada por los
tratamientos con etanol e indometacina, su efecto gastroprotector se debió
parcialmente a la reducción de los niveles de malonaldehído y actividad de la
catalasa en el tejido gástrico, sin embargo no modificó los niveles de glutatión
reducido (Lemos et al., 2012).

Para la prueba anti Helicobacter pylori la evaluación del extracto hexánico y de

los ácidos orgánicos derivados de cromanonas fue positiva, observándose halos

17
de inhibición parcial de crecimiento en el rango de concentraciones de 25-400
µg/mL (Lemos et al., 2012).

Las xantonas 6-desoxijacareubina, jacareubina, 1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3-

hidroxi-3-metilbutil)-xantona y la 1-hidroxi-3,5,6-tri-o-acetil-2(3,3-dimetilalil)-
xantona (Figura 8) aisladas del duramen del tronco de C. brasiliense, inhibieron la
actividad de la enzima H+,K+ ATPasa gástrica en concentraciones de CI 50 = 47 µM
a 1.6 mM. Las cumarinas mammea A/BA y mammea C/OA (Figura 6a y 6e R1)
aisladas de las partes aéreas también mostraron actividad inhibitoria de la ATPasa
con una CI50 de 110 y 638 µM, respectivamente (Reyes-Chilpa et al., 2006).

a b c d

Figura 8. Xantonas con actividad inhibitoria de la enzima H +K+ ATPasa del

duramen del tronco de C. brasiliense. a) 6-desoxijacareubina b) jacareubina c)
1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-xantona d) 1-hidroxi-3,5,6-tri-o-acetil-
2(3,3-dimetilalil)-xantona. Fuente: Reyes-Chilpa et al., 2006.

2.2.6.6 Actividad cicatrizante

Se ha probado un extracto estandarizado de hojas de C. brasiliense en una

emulsión aplicada por vía tópica en modelos de ratones con heridas cutáneas. La
evaluación demostró que los ratones tratados con la emulsión cicatrizaron más
rápidamente que con el medicamento Dersani® a los 7 y 14 días. Al día 14, la
emulsión con extracto de C. brasiliense redujo el área afectada de las heridas en
un 90.67%, la cual a los 21 días de tratamiento mostró un incremento en los

18
fibroblastos producidos en comparación con los demás grupos. El análisis por
HPLC del extracto de hojas probado demostró la presencia de la cumarina (-)
mammea A/BB (Tr = 21.8min), estandarizándo el extracto antes de prepararse en
la emulsión a una concentración de 28.04 ± 0.9 µg/mg de extracto (Lordani et al.,
2014).

La (-) mammea A/BB purificada del extracto metanol-agua (10:90) de hojas de

C. brasiliense, ha sido probada en modelos de Leishmaniasis con ratones para
evaluar su efecto cicatrizante en las heridas que causa L. amazonensis. Los
ratones parasitados recibieron tratamiento por vía intramuscular y local con la
cumarina por 30 días, a dosis de 18 mg/kg/d y 0.2% respectivamente, reduciendo
significativamente las lesiones de la piel en las almohadillas de las patas de
ratones parasitados en comparación con el control. Las dosis probadas por ambas
vías de administración mostraron actividad similar a la del medicamento
Glucantime® administrado por vía intramuscular (Tiuman et al., 2012).

2.2.6.7 Actividad moluscicida.

La mammea A/BB (Figura 6b) aislada de los extractos hidroalcohólicos de hojas y

ramas de C. brasiliense colectadas en Brasil presentó actividad contra el molusco
Biomphalaria glabrata, vector del protozoario Schistossoma sp causante de la
elefantiasis. Los extractos hidroalcohólicos en concentración de 25 ppm causaron
100% de mortalidad del molusco. La mammea A/BB presentó una dosis letal
media (DL50) de 0.67 ppm y DL 90 de 1.47 ppm después de 24 horas, la cual es
comparable en potencia con el control niclosamida (DL50= 0.77 ppm y DL90= 1.75
ppm) por lo cual podría ser sustituto potencial de esta sustancia utilizada en el
combate de los hospederos intermediarios de Schistossoma sp (Gasparotto et al.,
2005).

19
2.2.6.8 Capacidad antioxidante.

Las xantonas jacareubina (Figura 8b) y 2-(3,3-dimetilalil)-1,3,5,6-

tetrahidroxixantona (Figura 9) fueron aisladas de C. brasiliense y se probó su
capacidad antioxidante frente a especies reactivas de oxígeno (ERO’s), como el
peróxido de hidrógeno y el anión superóxido en la degradación del DNA murino y
albúmina sérica bovina (BSA). La tetrahidroxixantona mostró mejor capacidad
antioxidante que la jacareubina frente al anión superóxido (O2·-) y los radicales
peroxinitrito (ONOO-) e hidroxilo (OH·), sin embargo ambas xantonas fueron
incapaces de atrapar al compuesto peróxido de hidrógeno (H 2O2). Ambas
xantonas también demostraron actividad protectora dependiente de la
concentración, contra la degradación oxidativa de la BSA inducida por el radical
hidroxilo de manera, comparando esta capacidad con la α-mangostina. De la
misma manera, las xantonas demostraron un efecto protector contra la
degradación de ADN murino inducido por el radical (OH·) sólo que no se observó
un efecto dependiente de la dosis.

La jacareubina y la 2-(3,3-dimetilalil)-1,3,5,6-tetrahidroxixantona (ambas a 0.5,

1 y 2.5 µM) mostraron la misma efectividad al reducir los niveles basales de
ERO’s, así como la peroxidación de lípidos producidas por acción del FeSO 4 en
órganos como el prosencéfalo, hígado y riñón de manera dependiente de la
concentración. Se observó también que estas xantonas lograron prevenir el
decremento en actividad de la glutatión reductasa en tejidos de prosencéfalo
(Blanco-Ayala et al., 2013).

Figura 9. Estructura química de la 1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3,3,-dimetilalil)-xantona

con capacidad antioxidante. Fuente: Blanco-Ayala et al., 2013.

20
 La capacidad antioxidante de los extractos de distinta polaridad de hojas y/o
tallo de C. brasiliense, C. inophyllum y Calophyllum sp. fue probada con diferentes
metodologías: fenoles totales, ABTS, DPPH, ORAC (Oxigen Radical Absorbance
Capacity), FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power). El material vegetal se
extrajo por percolación con solventes (hexano, diclorometano, acetato de etilo y
metanol), siendo los extractos polares y medianamente polares los que
presentaron alta capacidad antioxidante. Los extractos metanólicos de tallos de C.
brasiliense mostraron los mejores valores de inhibición de los radicales DPPH
(2.65 mM trolox/g extracto), ABTS (8.49 mM trolox/g extracto), FRAP (47.2 g ácido
ascórbico/100g muestra) y contenido de fenoles totales (249 mg ácido gálico/ g
extracto). Resultados similares se obtuvieron con el extracto metanólico de hojas y
tallos de C. inophyllum. Por otra parte, el extracto de acetato de etilo de hojas de
C. brasiliense mostró los mejores valores de inhibición de los radicales DPPH
(1.94 mM trolox/g extracto), ABTS (4.61 mM trolox/g extracto), FRAP (57.5 g ácido
ascórbico/100g muestra) y contenido de fenoles totales (493 mg ácido gálico/ g
extracto). Se obtuvieron resultados similares con el extracto de acetato de etilo de
hojas y tallos de Calophyllum sp., con este extracto se obtuvo el mayor contenido
de fenoles totales de los 16 extractos reportados (518 mg ácido gálico/ g extracto).
Para el ensayo ORAC, el valor más alto de inhibición (11.64 mM trolox/g muestra)
fue para el extracto metanólico de hojas de C. brasiliense y el más bajo (3.49 mM
trolox/g muestra) para el extracto de acetato de etilo de hojas de C. brasiliense
(Mesa-Vanegas et al., 2009).

2.3 Estudios biotecnológicos de especies del género Calophyllum

Calophyllum apetalum es un árbol endémico del sureste de India, posee

propiedades medicinales además de una madera apreciada para la construcción
de botes y muebles, por lo que su número está declinando severamente. En un
esfuerzo por su conservación, Nair y Seeni (2003) establecieron un método de
propagación in vitro a partir de explantes nodales de árboles de C. apetalum de 6
a 8 semanas de edad, los cuales generaron brotes que se subcultivaron dos veces

21
en medio MS con 8.8 μM BAP observando que 68% de los explantes respondían
al subcultivo formando 3.2 brotes/ explante en 7 semanas de cultivo. Nair y Seeni
(2003) observaron que al subcultivar los explantes derivados de brotes in vitro
durante 5 semanas en medio MS con 4.4 μM BAP se obtenían mayor número y
porcentaje de brotes en los nodos (5.3 por explante, 74% de los explantes). Los
cultivos de brotes se transfirieron a medio MS basal al 50% de la concentración
de sales durante 4 semanas para inducir la elongación de los mismos (~3 cm). El
enraizamiento de los microbrotes (>2 cm) se logró al subcultivarlos en medio MS
al 25% de la concentración de sales complementado con 9.8 μM de AIB durante 4
semanas, seguido de un subcultivo únicamente en medio MS al 25% de la
concentración de sales durante 4 semanas más. Las plántulas enraizadas se
transfirieron a macetas con tierra, arena y estiércol (1:1:1), mantenidas en una
cámara de niebla con humedad relativa del 80 - 90%, aclimatadas en un rango de
56% después de 6 semanas. De las 345 plantas micropropagadas llevadas a su
hábitat natural, 293 sobrevivieron sin mostrar defectos morfológicos.

Por su parte, Thengane et al. (2006) establecieron un método de

micropropagación de Calophyllum inophyllum a través de brotes múltiples
obtenidos de explantes de semillas maduras. Las semillas germinadas in vitro en
medio Woody Plant Medium (WPM) con o sin hormonas (2.22 μM BAP) dieron
origen a plántulas que fueron utilizadas para obtener explantes de brotes y raíces
que se cultivaron en medio WPM con 0.91 μM TDZ donde se obtuvo el mayor
número de brotes múltiples después de 60 días de inoculación, observando 20.9
brotes por explante. Inclusive a esta concentración de hormona se obtuvo la
mayor elongación de brotes de tamaño >4.0 cm (4.9-7.2 por explante). La
elongación de brotes continuó por cerca de 30-40 días en medio WPM a la mitad
de la concentración de sales sin adición de hormonas. El máximo enraizamiento
de los brotes fue obtenido en medio WPM más 2.46 μM AIB (52%). Los brotes
enraizados dieron origen a plántulas que fueron transferidas a una mezcla estéril
de tierra, fibra de coco y arena (1:2:1) y aclimatadas a 25 ± 2°C y 80% humedad
relativa, observando un porcentaje de sobrevivencia del 77% de las plántulas a las

22
5 semanas, después, a las 8 semanas de cultivo se transfirieron a macetas con
una mezcla de abono y tierra (1:1) para finalmente ser transferidas a campo
(Thengane et al., 2006).

El cultivo in vitro de callos de C. inophyllum fue establecido a partir de

explantes de semillas maduras, nodales e internodales y de hojas (de plántulas de
2-3 meses de edad), cultivados en medio WPM complementado con distintas
combinaciones y concentraciones de fitohormonas: 4 mg/L IBA +1 mg/L BAP
(semillas), 4 mg/L IBA (nodos), 6 mg/L PIC +2 mg/L BAP (hojas). Los explantes de
semillas originaron callos en 96.01% (callos blancos, friables e irregulares)
después de 45 días de incubación, mientras que los nodales/internodales y de
hojas en 87.5 y 86.66% respectivamente (callos café oscuro, nodulares y
compactos) a los 30 días de incubación. La finalidad de manejar diversas
fitohormonas en diversas formulaciones de medio fue observar su influencia en la
inducción de callos y en el patrón de expresión de dipiranocumarinas anti VIH-1
inophyllums B y P. El análisis cuantitativo por HPLC de los extractos de los callos
reveló que el mayor contenido de inophyllum B (40.59 mg/100 g callo) se
cuantificó en callos derivados de explantes de semillas crecidos con 2 mg/L AIB,
mientras que la mayor cantidad de inophyllum P (141.35 mg/ 100g callo) se estimó
en callos derivados de explantes de semillas crecidos con 2 mg/L AIB + 1 mg/L
BAP (Pawar et al., 2007).

El cultivo de células en suspensión de C. inophyllum fue reportado por Pawar y

Thengane (2009) desarrollado a partir de callos derivados de explantes de semilla
o nodales/internodales de plántulas in vitro. Para ambos tipos de cultivo iniciados
con los dos tipos de callos, se desarrollaron cinéticas de crecimiento en medio
WPM sin adición de reguladores de crecimiento vegetal. Ambas cinéticas duraron
60 días de cultivo, observándose una biomasa máxima a los 50 días (1.383 g/L y
0.932 g/L para las suspensiones de callos hojas y segmentos nodales
respectivamente).

23
 Para conocer la influencia de la manipulación del medio de cultivo se variaron
las concentraciones de nitratos, sulfatos y vitaminas totales del medio WPM
líquido. La biomasa más alta (6.2 veces) se logró en cultivos iniciados con callos
derivados de explantes nodales/internodales complementados con tres veces la
cantidad de sulfato total. Se observó que la variación de nitrato y sulfato en el
medio de cultivo tuvo un efecto positivo en la expresión de inophyllums A y C, así
como las vitaminas en la expresión de inophyllums A, C y B. Las fitohormonas
Picloram y BAP a concentraciones de 8.28 μM y 8.88 μM respectivamente,
incrementaron 295.05 veces la producción de inophyllum A en las suspensiones
iniciadas con callos de hoja, mientras que el AIB 14.70 μM más BAP 4.44 μM
incrementaron la producción de inophyllum B 1065 veces en los cultivos iniciados
con callos de explantes de hoja. Por sí solo, el AIB a una concentración de 4.9 μM
y 9.8 μM logró aumentar la producción de inophyllum C 616 veces e inophyllum P
23.22 veces en cultivos en suspensión obtenidos a partir de callos derivados de
explantes de hoja (Pawar y Thengane 2009).

La elicitación abiótica para estimular la producción de las dipiranocumarinas

inophyllums en cultivos en suspensión de C. inophyllum fue probada por Pawar y
Thengane (2011) utilizando metales pesados. El cadmio (Cd) como CdCl2 mostró
ser el mejor elicitor en cultivos en suspensión de callos derivados de explantes de
tallo elicitando la producción máxima de inophyllums A (981 veces, CdCl2 0.1 mM),
C (129 veces, CdCl2 5 mM), y calofilólido (~1 mg/ 100 mg biomasa, CdCl2 10 mM)
mientras que este mismo metal en cultivos en suspensión de callos derivados de
explantes de hoja elicitó la máxima producción de inophyllums B (300 veces, 1.0
mM) y P (340 veces, 0.5 mM). El inophyllum D fue la única dipiranocumarina cuya
máxima producción (2230 veces) se alcanzó al utilizar 1.0 mM de cromo (Cr) como
K2Cr2O7 como elicitor en cultivos en suspensión de callos derivados de explantes
de tallo. Ninguno de los tres elicitores abióticos empleados (Cu, Cr, Cd) resultó en
buen crecimiento de la biomasa del cultivo de células en suspensión de C.
inophyllum, por lo que fue la adición de CaCl 2 la que estimuló el crecimiento
celular pero no la producción de dipiranocumarinas. La biomasa creció 35.26

24
veces más en la suspensión de callos derivados de explantes de tallo al adicionar
al medio 2.0 mM de CaCl 2.

La elicitación de la producción de inophyllums por los cultivos en suspensión

de C. inophyllum mediante el uso de hongos endófitos fue probada por Pawar et al
(2011). Dos hongos, Nigrospora sphaerica y Phoma spp. ambos endófitos de C.
inophyllum se aislaron de hojas y fueron identificados por técnicas moleculares
(rRNA, subunidad 18s). La elicitación de los cultivos celulares en suspensión
iniciados con callos de explantes de hoja o de tallo se hizo mediante filtrados de
cultivo o polvo de células secas de ambos hongos adicionados al medio WPM
después de 10 d de iniciado el cultivo. La mayor producción de inophyllums A, C y
P fue observada en los cultivos en suspensión iniciados con callos derivados de
explantes de hoja, mientras que los cultivos iniciados con callos derivados de
explantes de tallo sólo produjeron inophyllum B al ser elicitados. Al elicitar los
cultivos en suspensión de explantes de hoja con 40 mg de polvo de células secas
de Phoma cpp., se produjeron 751 veces más inophyllum A (6.84 mg/ 100 g
biomasa elicitada) comparada con el control. Por otra parte, al elicitar con 20 mg
de polvo de células secas de N. sphaerica los cultivos celulares derivados de
explantes de tallo se produjeron 414 veces más inophyllum B (6.22 mg/ 100g
biomasa elicitada) comparada con el control. La máxima producción de inophyllum
C y P se logró utilizando 10% de filtrado de cultivo de N. sphaerica en los cultivos
en suspensión derivados de explantes de hoja, observándose una producción de
928 veces más de inophyllum C (7.43 mg/ 100g biomasa elicitada) y 750 veces
más (1.5 mg/ 100g biomasa elicitada) al comparar ambos cultivos con sus
respectivos controles.

25
2.3.1 Estudios biotecnológicos de Calophyllum brasiliense

Debido a la colecta excesiva de C. brasiliense por sus propiedades medicinales y

su atractiva madera, además de la baja viabilidad de sus semillas recalcitrantes,
su población ha disminuido drásticamente (Afolayan y Adebola, 2004; Sorol et al.,
2015), ahí la importancia de establecer herramientas biotecnológicas para su
propagación y la obtención de metabolitos de manera sustentable.
El establecimiento de los cultivos in vitro de C. brasiliense a partir de
explantes de hoja y de semilla para la producción de calanólidos fue reportado por
Bernabé-Antonio et al., (2010). La inducción de callo se logró en explantes de
semilla en medio WPM con 8.88 µM de BAP más 24.84 µM de PIC mientras que la
mayor inducción de callos para los explantes de hoja se obtuvo con el medio WPM
con 0.46 µM de KIN + 5.37 µM de ANA. Los análisis cuantitativos realizados a los
extractos hexánicos de callos por medio de HPLC reveló que hubo una mayor
producción de (-)-calanólido B y (+)-calanólido C en los callos provenientes de
explantes de semillas que en aquellos desarrollados a partir de explantes de hoja,
en cantidades de 309.25 mg kg -1 en comparación con 8.70 mg kg-1 de (-)-
calanólido B; y de 117.7 mg kg-1 PS para el (+)-calanólido C producido únicamente
en los callos derivados de explantes de semilla.

Se ha cuantificado la presencia de ácidos grasos producidos por el cultivo de

callos de C. brasiliense, como una fuente sustentable para obtener aceites no
comestibles que puedan ser usados como biocombustibles. El cultivo de callos
derivados de explantes de hoja y de explantes de semilla de dos regiones del
estado de Veracruz (San Andrés Tuxtla y Pajapan) se inició en medio MS
complementado con 3% de sacarosa y 0.5% de fructosa, con 8.88 µM BAP más
24.84 µM PIC, medio que resultó más efectivo para el desarrollo de la biomasa en
comparación con el WPM. Se determinó una cinética de crecimiento únicamente
de los callos derivados de explantes de hoja en medio semisólido MS
observándose que la fase de adaptación duró aproximadamente 10 días, después
de los cuales se alcanzó una fase de crecimiento logarítmico que duró hasta
aproximadamente 40 días, momento en el cual logró la biomasa máxima (18.72
26
g/L) por lo que se eligió este periodo de subcultivo para la extracción de la
biomasa y la identificación de ácidos grasos.
Ambos tipos de callos produjeron principalmente ácidos grasos en cantidades
entre 68.06 y 75.76%. En general, los callos derivados de explantes de hoja
produjeron la mayor cantidad de ácidos grasos saturados y la mejor región fue
San Andrés Tuxtla en todos los casos (72.41 y 75.76% respectivamente). El mayor
contenido de ácidos grasos insaturados se produjo en los callos derivados de
semillas (25,25 % región de Pajapan y 31.94% región de San Andrés Tuxtla). Los
ácidos grasos saturados de los extractos de callos tanto de hojas como de
semillas de ambas regiones estuvieron compuestos principalmente de ácido
palmítico identificado en un 31.22-39.18%, seguido del ácido esteárico en un
19.52-21.18%; mientras que el predominante insaturado fue el oleico (23.14-
31.63%). La concentración de los ácidos restantes saturados e insaturados
(mirístico, pentadecanoico, palmitoleico, araquidónico, behénico y lignocérico) fue
de 0.3 a 3.8% (Bernabé-Antonio et al., 2015).

La micropropagación de C. brasiliense fue lograda a partir de segmentos

nodales de plántulas in vitro de 6 meses de edad, germinadas a partir de semillas
colectadas en la región de San Andrés Tuxtla, Veracruz, México. Las semillas
fueron germinadas in vitro en medio MS mostrando un 48.6% de germinación. Los
segmentos nodales mostraron un alto porcentaje de inducción de brotes (77.5%),
brotes por segmento (6.9), nodos por brote (3.8), hojas por brote (8.0) y longitud
del brote (45 cm) cuando se adicionó al medio de cultivo 0.5 mg/L de ácido 3-
indolbutírico (AIB) más 0.1 mg/L thidiazuron (TDZ). Además, el máximo
enraizamiento de los brotes (63.5%) y longitud de las raíces (2.2 cm) se lograron
utilizando 1.0 mg/L de AIB. Más de tres cuartas partes de las plantas aclimatadas
(77.5%) crecieron exitosamente en macetas (Maldonado et al., 2015).

27
3. JUSTIFICACIÓN

Se ha demostrado que las plantas medicinales constituyen una fuente

invaluable de metabolitos secundarios, los cuales son potenciales fármacos para
los seres humanos. En especial, Calophyllum brasiliense produce compuestos
activos para padecimientos que afectan importantemente la salud del ser humano
como el cáncer y el VIH-1. La obtención de los compuestos a partir del árbol limita
la posibilidad de desarrollar medicamentos para ser utilizados en el tratamiento de
dichos padecimientos. Los cultivos de células en suspensión de la especie son
una alternativa viable para producir de manera constante y controlada los
metabolitos secundarios de interés farmacológico. Asimismo, este sistema
biotecnológico puede ser viable para valorar el uso etnobotánico reportado para
Calophyllum brasiliense en el tratamiento de la inflamación.

4. HIPÓTESIS

Con base a la totipontecialidad de la células vegetales, se postula que los

cultivos de células en suspensión de C. brasiliense tienen la capacidad de producir
los compuestos bioactivos identificados en las hojas del árbol.

El uso etnomédico de C. brasiliense para tratar la artritis, postula que las hojas
y las células en suspensión de esta especie contienen compuestos con actividad
antiinflamatoria.

28
5. OBJETIVOS

5.1 Objetivos generales

 Evaluar la presencia de calanólidos, ácido apetálico y canofilol en los cultivos de

células en suspensión de C. brasiliense.
 Valorar la actividad antiinflamatoria de extractos orgánicos obtenidos de hojas
de plantas silvestres y de células en suspensión de C. brasiliense a través del
uso de la prueba aguda de edema auricular.

5.2 Objetivos particulares

 Desarrollar un sistema de cultivo de células en suspensión a partir de callos de

C. brasiliense generados previamente.
 Establecer la cinética de crecimiento del cultivo de células en suspensión en
lote.
 Establecer las cinéticas de la producción de compuestos fenólicos y flavonoides
en los cultivo de células en suspensión.
 Valorar la capacidad antioxidante de los extractos metanólicos de los cultivos de
células en suspensión.
 Aislar e identificar los compuestos calanólidos, ácido apetálico y canofilol a
partir de hojas de planta silvestre.
 Analizar por HPLC el contenido de ácido apetálico en los extractos
diclorometánicos del cultivo de células en suspensión.
 Evaluar la actividad antiinflamatoria de los extractos orgánicos de hojas de
plantas silvestres y del de células en suspensión.

29
6. METODOLOGÍA

6.1 Cultivos in vitro de C. brasiliense

6.1.1 Establecimiento de los cultivos de callos

Para la generación del cultivo de callos se utilizaron explantes de hojas inmaduras

de plántulas aclimatadas de C. brasiliense de aproximadamente 5 cm de longitud.
Las hojas se desinfectaron de manera superficial con una solución jabonosa por 5
min, seguida por una inmersión en etanol al 70% (v/v) por 30 s. Posteriormente,
las hojas se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 0.6% (v/v) por
15 min, agregando tres gotas de Tween-20 por cada 100 mL de solución
preparada y agitando constantemente a baja velocidad (Bernabé-Antonio et al.,
2010).

Una vez desinfectadas, las hojas se lavaron tres veces con agua destilada
estéril en el interior de una campana de flujo laminar. Las hojas se cortaron en
segmentos de 5 x 5 mm se cortaron dentro de cajas Petri con solución
antioxidante (100 mg/L de ácido cítrico y 150 mg/L de ácido ascórbico). Los
explantes se sumergieron en soluciones nuevas de antioxidante en vasos de
precipitados, realizando 3 cambios periódicos de dicha solución durante 3 o 4 min
para eliminar la mayor parte del látex exudado durante los cortes. Para inducir
callogénesis, se colocaron 3 o 4 explantes en frascos tipo Gerber que contenían
25 mL de medio de cultivo semisólido previamente esterilizado a 121º C por 20
min a 18 psi. (Bernabé-Antonio et al., 2010).

Se empleó el medio de cultivo de Murashige & Skoog (MS) suplementado con

3% de sacarosa (p/v), 0.5% fructosa (p/v), 100 mg/L de ácido cítrico, 150 mg/L de
ácido ascórbico, 6 mg/L de picloram (24.84 μM) (PIC), 2 mg/L (8.88 μM) de 6-
bencilaminopurina (BAP) y 2 g/L de phytagel (p/v) (Sigma, St. Louis, MO, USA)
ajustado a pH de 5.8. Los cultivos se incubaron a 25 ± 2°C en oscuridad total,
realizando subcultivos a medio fresco cada 4 semanas (Bernabé-Antonio et al.,
2010).

30
6.1.2 Establecimiento del cultivo de células en suspensión de C. brasiliense

Empleando un inóculo del 4 % (p/v), la biomasa de callos derivados de explantes

de hojas (en peso fresco) se transfirió a matraces de 500 mL que contenían 100
mL del medio de cultivo MS suplementado con 3% de sacarosa (p/v), 0.5 %
fructosa (p/v), 100 mg/L de ácido cítrico, 150 mg/L de ácido ascórbico, 6 mg/L
(24.84 μM) de (PIC) y 2 mg/L (8.88 μM) de BAP a pH 5.8. Los cultivos se
incubaron a una temperatura de 25 ± 2°C, bajo un fotoperiodo de 16 h luz /8 h de
oscuridad en un agitador orbital a 110 rpm.

Los subcultivos se realizaron cada 15 días agregando un inóculo del 6% (p/v)

al medio de cultivo descrito anteriormente. La biomasa se filtró en condiciones de
esterilidad, con ayuda de un disgregador celular para remover los agregados
celulares más oxidados, y posteriormente una filtración al vacío con papel filtro
Whatman No.1 en un matraz Kitasato con embudo Büchner.

6.1.2.1 Cinéticas de crecimiento

Las cinéticas de crecimiento en lote se determinaron por 16 días registrando el

peso fresco (PF) y el peso seco (PS) cada tercer día, al filtrar la biomasa de cada
matraz (3 matraces por cada punto de la cinética) al vacío en un embudo Büchner
(papel filtro Whatman No.1) en condiciones de esterilidad. La biomasa recuperada
se lavó con agua destilada estéril para eliminar los residuos del medio; después de
medir el PF, la biomasa se secó en estufa a 55°C y se determinó el PS (Nicasio-
Torres et al., 2010).

Los parámetros cinéticos de crecimiento determinados fueron: la velocidad

específica de crecimiento (μ) calculada a través del logaritmo de los pesos secos
de las biomasas secas determinadas durante la fase exponencial vs tiempo;
tiempo de duplicación (td), que es el tiempo requerido para duplicar la biomasa y
se determinó mediante la siguiente ecuación td = In2/µ; el índice de crecimiento

31
se determinó calculando la biomasa máxima obtenida menos el inoculo entre el
inoculo; el rendimiento de la fuente de carbono entendido como los gramos de
biomasa seca producida por cada gramo de fuente de carbohidratos totales
suplementados al medio de cultivo.

6.1.2.2 Determinación de azúcares totales en el medio de cultivo de células

en suspensión de C. brasiliense por el método del fenol-sulfúrico

Para determinar el consumo de azúcares por los cultivos celulares se empleó el

método del fenol-sulfúrico (Dubois et al., 1956) con ligeras modificaciones. A 0.2
mL del medio de cultivo filtrado y diluido (1:300) se mezcla vigorosamente con 0.2
mL de fenol al 5%, y se adiciona 1 mL ácido sulfúrico concentrado. La mezcla se
dejó reaccionar durante 30 min a temperatura ambiente y se leyó la absorbancia a
490 nm contra un blanco de reactivos.

6.2 Análisis químico

6.2.1 Obtención de los extractos metanólicos de las células en suspensión

de C. brasiliense

Se pesaron 50 mg de las muestras de biomasa seca de cada intervalo de tiempo

de la cinética de crecimiento en tubos falcon con tapa, adicionando 5 mL de
metanol grado reactivo y se extrajeron por sonicación a 80% amplitud durante 10
min en un baño de hielo. Posteriormente los extractos se centrifugaron a 6000 rpm
por 20 min. Los sobrenadantes se colectaron en frascos ámbar con tapa y se
almacenaron a 4 °C. Para cada una de las muestras se manejó un total de tres
repeticiones.

6.2.2 Obtención de los extractos metanólicos de hojas de plántulas silvestres

y aclimatadas de C. brasiliense

Las partes aéreas (hojas) de C. brasiliense fueron colectadas en San Andrés de

los Tuxtlas, municipio de Catemaco, Estado de Veracruz, México (No. espécimen

32
14425, Herbario del IMSS). Las hojas frescas de plantas de C. brasiliense
silvestres y aclimatadas a la Ciudad de México, se secaron a 60°C en una estufa y
posteriormente se pulverizaron en un mortero. Se pesaron 3 muestras de 350 mg
de las hojas pulverizadas de cada planta en tubos Falcón con tapa, adicionando 5
mL de metanol grado reactivo y cada muestra se extrajo por sonicación durante 10
min en un baño de hielo. Posteriormente los extractos se centrifugaron a 6000 g
por 20 min. Los sobrenadantes se colectaron en frascos ámbar con tapa y se
almacenaron a 4 °C.

6.2.3 Determinación del contenido total de fenoles

Se determinó el contenido de fenoles totales en los extractos metanólicos de las

hojas de las plantas silvestres, plantas aclimatadas y células en suspensión de C.
brasiliense, utilizando como base el método de Yim et al. (2012). En tubos de
ensaye se mezclaron 20 µL del extracto metanólico con 0.1 mL de reactivo de
Folin-Ciocalteau (diluido 1:1). Después de 3 minutos se adicionaron a la mezcla
0.3 mL de Na2CO3 al 20% y se ajustó el volumen a 2 mL con agua desionizada. La
mezcla se dejó reaccionar en oscuridad por 90 min. La absorbancia se midió
contra un blanco de reactivos a 725 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.
Se utilizó un estándar de ácido gálico (GA) para la curva de calibración en un
rango de concentraciones de 80-1000 mg/L y se analizó como se describió
anteriormente. Los resultados se expresaron como mg equivalentes de ácido
gálico por g de biomasa seca (mg EAG/g BS).

6.2.4 Determinación del contenido de flavonoides

Se tomaron 0.2 mL del extracto metanólico y se mezclaron con 1.25 mL de agua

destilada, enseguida se adicionó 75 µL de NaNO 2 al 5% y se dejaron reaccionar
durante 6 min. Después se agregó 0.15 mL de AlCl 3 al 10%, la mezcla se agitó
vigorosamente y transcurridos 5 min de reacción se agregó 0.5 mL de NaOH 1 M y
se completó el volumen a 2.5 mL con agua destilada. Se leyó la absorbancia
contra un blanco de reactivos a 510 nm en un tiempo menor a 30 min después de
adicionado el hidróxido. Se utilizó un estándar de quercetina para la curva de
33
calibración en un rango de concentraciones de 100-3200 μg/mL y se analizó como
se describió anteriormente (Liu et al., 2002). Los resultados se expresaron como
mg equivalentes de quercetina por g de biomasa seca (mg querc/g BS).

6.2.5 Determinación de la capacidad antioxidante por el método del DPPH

Las capacidades antioxidantes de los extractos metanólicos de las hojas y de

células en suspensión se evaluaron por el método del DPPH reportado por Yim et
al. (2012). Se preparó una solución stock de DPPH (0.075 mM) en metanol y 1.9
mL de la solución se mezclaron con 0.01 mL del extracto metanólico. La mezcla se
agitó vigorosamente por 1 min y se dejó reaccionar durante 30 min en oscuridad a
temperatura ambiente. Se midió la absorbancia contra un blanco de reactivos a
517 nm. La capacidad antioxidante se determinó calculando la TEAC (capacidad
antioxidante como equivalentes de TROLOX) utilizando una curva de calibración
con TROLOX en un rango de concentraciones de 0-8 mM, y expresando por
gramo de biomasa seca.

6.2.6 Determinación de la capacidad antioxidante por el método del ABTS

La capacidad antioxidante de los extractos metanólicos de las hojas y de células

en suspensión se evaluaron con base al método del ABTS reportado por Gong et
al. (2002). Se preparó una solución stock de ABTS (7 mM) mezclada con 2.45 mM
de persulfato de potasio. La mezcla se dejó reposar en oscuridad a temperatura
ambiente por 12-16 h. La solución de trabajo de ABTS se obtuvo por dilución de la
solución stock de ABTS con metanol hasta lograr una absorbancia de 0.7 ± 0.02 a
734 nm. Una vez ajustada la solución, se tomaron 2 mL y se añadieron 20 μL de
extracto metanólico, agitando vigorosamente y dejando reposar por 6 min. La
capacidad antioxidante se determinó calculando la TEAC (capacidad antioxidante
como equivalentes de TROLOX) utilizando una curva de calibración con TROLOX
en un rango de concentraciones de 0-15 μM, expresando por gramo de material
vegetal.

34
6.2.7 Aislamiento y purificación de ácido apetálico, canofilol y calanólidos de
partes aéreas de C. brasiliense

Las partes aéreas (hojas) de C. brasiliense se secaron y el material vegetal (200

g) se trituró en un molino Pulvex a un tamaño de partícula de 4 mm;
posteriormente se colocó en un matraz al cual se le agregó acetona, metanol y
agua (extracciones en serie), en periodos de 24 h. Cada uno de los extractos se
filtró con papel Whatman no. 4 y se concentró a presión reducida en rota vapor
(Heidolph L3).
El fraccionamiento del extracto acetónico se llevó a cabo por cromatografía en
columna (CC) utilizando sílica gel de fase normal (sílica gel 60 9858 Merck) y de
fase reversa (sílica gel 60-50 c18 Macherey-Nagel). La identificación de
compuestos presentes en las fracciones eluidas se realizó por cromatografía de
capa fina (CCF) de fase normal (Sílica gel 60 F 254, Merck) y fase reversa (Sílica
gel 60 RP-18 F254S, Merck) comparando con estándares comerciales (β-sitosterol,
ácido ursólico, rutina, quercetina) y el revelado se hizo con los siguientes
reactivos: sulfato cérico amoniacal (revelador general), 4-hidroxibenzaldehído
(compuestos de tipo terpenoide) o 2-aminoetil difenilborinato (revelador de
flavonoides).

El análisis de los espectros de RMN en una ( 1H, 13

C, DEPT) y dos
dimensiones (COSY, NOESY, HSQC y HMBC) nos permitió conocer la estructura
química del ácido apetálico, el canofilol y el (-)-calanólido B.

6.2.8 Extracción de biomasa de suspensiones celulares de C. brasiliense

Para obtener el extracto de diclorometano de la biomasa, se pesaron 46.9 g de

células en suspensión de C. brasiliense secadas previamente en estufa a 60°C por
24 horas, se extrajeron con diclorometano y se dejó reposar 24 h, después se filtró
el extracto con papel whatman no. 4 y se concentró a presión reducida en
evaporador rotatorio (Heidolph L3).

35
 La identificación de compuestos presentes en el extracto se realizó por
cromatografía de capa fina (CCF) de fase normal (Sílica gel 60 F 254, Merck) y fase
reversa (Sílica gel 60 RP-18 F254S, Merck) comparando con los compuestos
purificados de calanólidos, ácido apetálico, canofilol y los estándares de ácido
ursólico y β-sitosterol. El revelado se hizo con los siguientes reactivos: sulfato
cérico amoniacal (revelador general), 4-hidroxibenzaldehído (compuestos de tipo
terpenoide) o 2-aminoetil difenilborinato (revelador de flavonoides).

6.2.9 Identificación por HPLC de ácido apetálico, canofilol y (-)-calanólido B

en el extracto diclorometánico de células en suspensión de Calophyllum
brasiliense

Se utilizó un equipo de HPLC (High Performance Liquid Chromatography) para la

detección y cuantificación de los compuestos presentes en el extracto
diclorometánico de la biomasa de C. brasiliense. El equipo consta de un módulo
de separación (Waters 2695) equipado con un detector de arreglo de diodos
(Waters 2996) y operando con un software Empower 1. Se desarrollaron dos
métodos de análisis: el Método 1 para la determinación del ácido apetálico, y el
Método 2 para el (-)-calanólido B y el canofilol.

Método 1: Se empleó una columna de fase reversa GRACE Prevail C-18 (5 µm,
4.6 x 150 mm), utilizando como fase móvil ácido trifluoroacético (TFA) al 0.5% en
agua como solvente A, y acetonitrilo como solvente B, con un flujo de 1 mL/min y
utilizando un sistema de gradiente durante 24 min de corrida de muestra, de la
siguiente manera: el solvente A durante los dos primeros minutos se mantuvo al
100%, al minuto 3 disminuyó hasta alcanzar el 90%, al minuto 6 se llevó al 85%,
posteriormente en los minutos 11 y 12 bajó hasta al 80%, cambiando a 70% al
minuto 13 y al minuto 15 hasta el 50%, al minuto 16 se realizó un cambio de
gradiente de concentración que llegó a 100% del solvente B, el cual se mantuvo
hasta el minuto 21, y regresó a las condiciones iniciales al minuto 22 en donde el
solvente A es 100%.
36
 La cuantificación del ácido apetálico en los extractos de diclorometano se
realizó en HPLC con una curva de calibración con concentraciones de 7.81, 15.62,
31.26, 62.5 a 125 µg/mL preparada a partir de una concentración de 3.5 mg del
compuesto (2) y diluida con diclorometano para llegar a una concentración de
1000 µg/mL. Se graficó el promedio de las áreas contra la concentración y la
ecuación de la recta resultante fue y = 45278x + 142163 con un valor de R 2=
0.9996.

Método 2: Se empleó una columna de fase reversa GRACE Prevail C-18 (5 µm,
4.6 x 150 mm), utilizando como fase móvil agua como solvente A y acetonitrilo
como solvente B, con un flujo de 1 mL/min utilizando un sistema de gradiente
durante 23 min de corrida de muestra, de la siguiente manera: el solvente A
durante los dos primeros minutos se mantuvo al 100%, al minuto 3 disminuyó
hasta alcanzar el 60%, al minuto 6 se llevó hasta el 20% manteniéndose así hasta
el minuto 10, realizando un cambio de gradiente de concentración que llegó a
100% del solvente B al minuto 11 y manteniéndose así hasta el minuto 20, y
regresó a las condiciones iniciales al minuto 21 en donde el solvente A es 100%.

Para ambos métodos las muestras se monitorearon con un detector de arrego

de diodos a 200-600 nm, los compuestos puros (ácido apetálico, canofilol y
calanólidos) previamente identificados por RMN de 1H y 13C se prepararon e
inyectaron a un volumen de inyección de 10 µL.

6.3 Evaluación de la actividad anti-inflamatoria

6.3.1 Animales
Los ratones ICR (28 g) utilizados para las pruebas farmacológicas fueron
manipulados de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999
(Especificaciones técnicas para la producción y uso de animales de laboratorio) y
guías éticas internacionales para el uso experimental de animales. Los ratones

37
fueron mantenidos a temperatura de 22 ± 3°C, humedad de 70 ± 5% con ciclos de
12 h luz/oscuridad y acceso libre a comida y agua (ad libitum).

6.3.2 Modelo agudo de edema auricular en ratones inducido por TPA (12-O-
tetradecanoilforbol-13-acetato)

Los ratones se asignaron a grupos de siete individuos cada uno, y el TPA (2.5 µg,
disuelto en 20 µL de acetona; Sigma-Aldrich) se aplicó en la oreja derecha en las
superficies interna y externa para generar edema; la oreja izquierda no fue tratada.
Después de 10 min, dosis de 1.0 y 2.0 mg por oreja de los extractos de las plantas
silvestre y aclimatada (acetónico, metanólico y biomasa de la suspensión celular
(diclorometano 100%, y diclorometano-metanol 9:1 de biomasa) y el control
positivo indometacina (1 mg/oreja) disueltos en acetona, fueron aplicados
tópicamente en ambas orejas. Cuatro horas después de la administración del
agente antiinflamatorio, los animales se sacrificaron con éter y dislocación cervical,
secciones circulares (6 mm de diámetro) fueron tomadas de ambas orejas, tratada
y sin tratar, y se determinó el edema por diferencias de peso (Mitul Patel et al.,
2012; Pérez-Hernández et al., 2014).

El porcentaje de inhibición se calculó como:

%Inhibición = [( peso del edema control negativo -  peso del edema
tratamiento/ del peso del edema del control) *100].

6.4 Estadística

El tratamiento de los datos de las actividades antiinflamatorias de los extractos

probados se llevó a cabo mediante un ANOVA simple con una post-prueba de
comparación de medias de Dunnet y una prueba de Tukey realizados con el
programa estadístico SAS®. El tratamiento estadístico realizado del contenido de
fenoles totales y flavonoides, así como las actividades antioxidantes determinados
en los extractos de la suspensión celular y de las plantas, se llevó a cabo
mediante un ANOVA simple con una prueba de Tukey realizados con el programa

38
estadístico SAS®. El análisis de regresión lineal se realizó para determinar el
coeficiente de correlación entre el contenido de fenoles totales y/o flavonoides con
la actividad antioxidante con el programa Excel de Microsoft Office ®.

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1 Material vegetal

Se inició el cultivo de callos utilizando explantes de hojas inmaduras de un
espécimen de C. brasiliense aclimatada a la Ciudad de México (2 años, Figura 10)
proporcionada por el Dr. Antonio Bernabé. Las hojas (5 cm longitud) se lavaron y
cortaron para iniciar los cultivos como se mencionó anteriormente, colocando 4
explantes por frasco de medio semisólido MS con 30 g/L sacarosa
complementado con 0.5% fructosa y 24.84 μM PIC + 8.88 μM BAP. Al final de las
primeras 4 semanas se realizó el primer cambio de los explantes a medio fresco,
en los tejidos se observó un 100% de respuesta morfogénica con la presencia de
pequeños agregados celulares (Figura 11).

Figura 10. Planta de C. brasiliense (2 años) aclimatada a la Ciudad de México.

39
7.2 Cultivo de callos

Figura 11. Frasco con explantes de hoja de planta aclimatada de C. brasiliense

desarrollando callos al final de las 4 primeras semanas de cultivo n = 26. Medio
MS con 3% sacarosa, 0.5% fructosa, 24.84 μM PIC, 8.88 μM BAP.

Los explantes empezaron a desarrollar callos a distintos tiempos, siendo aquellos

que tuvieron parte de las nervaduras de la hoja seccionada los que respondieron
primero (8 semanas en cultivo, Figura 12); se desarrollaron callos verde oscuro de
consistencia dura, algunos de ellos con algunos agregados celulares blanco-
grisáceos signo de una estado más avanzado de callogénesis (Bernabé-Antonio et
al., 2010). Los callos más grandes se separaron en frascos con sólo dos unidades,
mientras que algunos otros quedaron con tres o cuatro explantes de tamaño
pequeño.

Figura 12. Frasco con explantes de hoja de planta aclimatada de C. brasiliense

desarrollando callos al final de las 8 semanas de cultivo. n = 40. Medio MS con 3%
sacarosa, 0.5% fructosa, 24.84 μM PIC, 8.88 μM BAP.

7.3 Cultivo de células en suspensión

Los cultivos de células en suspensión se iniciaron con un inóculo de 4 g de callos
derivados de explantes de hoja, transferidos a medio MS líquido complementado

40
con 3% de sacarosa, 0.5 % fructosa, 24.84 μM de PIC y 8.88 μM BAP. El cultivo
se desarrolló en las condiciones mencionadas en el apartado de metodología, y el
subcultivo se realizó cada 3 semanas (Figura 13).

Figura 13. Matraz erlenmeyer con células de C. brasiliense obtenidas de callos de

explantes de hoja de planta aclimatada. n = 10. Medio MS 3% sacarosa, 0.5 %
fructosa, 24.84 μM PIC, 8.88 μM BAP.

Utilizando el disgregador celular, se filtraron los segmentos de callo más

grandes y/u oxidados, para dejar solamente los agregados celulares más finos, de
un color café claro, pesando 6 g de células desdiferenciadas como inóculo (en
PF). Mediante la observación de la coloración del cultivo se determinó que la vejez
se alcanzaba después de los 15 días debido a una biomasa más oxidada,
eligiendo este periodo como tiempo de subcultivo, una vez que los cultivos
lograron la estabilidad.

En un trabajo preliminar de Bernabé-Antonio et al. (2010) se reporta el

establecimiento de cultivos de callos de C. brasiliense en medio WPM
suplementado con 3% de sacarosa, más la adición de 24.84 μM PIC y 8.88 μM
BAP como mejores fitohormonas para desarrollar callos. Sin embargo, en estas
condiciones los cultivos fenolizaban rápidamente y la biomasa moría, por lo que se
eligió cambiar por el medio nutritivo WPM por el de Murashige y Skoog (MS)
debido a que contiene una mayor cantidad de sales, además de la adición de
0.5% de fructosa. Estos cambios permitieron el desarrollo óptimo de los cultivos de
callos sirviendo estas condiciones para el establecimiento del cultivo en

41
suspensión, el cual una vez estable presentó se observó como una suspensión
homogénea de células libres y pequeños agregados celulares de color café claro
(Figura 13).

En las condiciones de cultivo en las cuales se desarrollaron las células en

suspensión de C. brasiliense únicamente se observó la biosíntesis de ácido
apetálico y canofilol, pero no la producción de calanólidos. Pawar y Thengane
(2009) reportaron en una línea celular producida a partir de explantes de hoja de
C. inophyllum utilizando 8.28 μM PIC más 8.88 μM BAP, un incremento en la
producción de la dipiranocumarina inophyllum A. Otra estrategia utilizada por estos
autores fue cambiar la auxina PIC por ácido indolbutírico (AIB) 14.7 μM con BAP
8.88 μM en cultivos iniciados con explantes de hojas donde se observó la
producción de inophyllum B; esta misma auxina fue utilizada sola en la formulación
del medio a concentraciones de 9.8 μM y 4.9 μM para estimular la producción del
inophyllum P y C respectivamente. Esta estrategia bien podría ser una perspectiva
para la producción de los compuestos calanólidos A, B y/o C en los cultivos en
suspensión de C. brasiliense en trabajos posteriores.

7.3.1 Cinéticas de crecimiento

Se realizaron dos cinéticas de crecimiento tipo lote independientes a partir de un

cultivo de células en suspensión estable de C. brasiliense. Se empleó el inóculo
del 6 %. En cada cinética se tomaron 3 muestras cada tercer día en un total de 16
días. Las cinéticas presentaron un comportamiento similar, en la Figura 14 se
presenta el promedio de los datos de peso fresco y seco de ambas con respecto al
tiempo.

42
 180 18
160 16
140 14

Biomasa (g/L)
120 12
100 10
80 8
60 PF 6
40 4
PS
20 2
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Tiempo (Días)

Figura 14. Cinéticas de crecimiento del cultivo de células en suspensión de C.

brasiliense a partir de inóculos del 6% (p/v).

En la figura 14 se observa que la biomasa en PS presenta una fase de

adaptación o fase lag de 4 días, después de la cual inicia la fase de crecimiento
exponencial que termina a los 12 días y entra rápidamente a la fase estacionaria al
final el crecimiento decae con rapidez después de los 14 días de iniciado el cultivo.
Para los datos del peso fresco (PF) la biomasa logra mantenerse más tiempo en la
fase estacionaria (16 días), lo cual puede deberse al contenido de agua retenido al
momento de filtrar la suspensión celular.
En la literatura no existen reportes del cultivo de células en suspensión de C.
brasiliense, el único trabajo reportado es el de Pawar y Thengane (2009) con C.
inophyllum. En las condiciones de cultivo descritas por los autores, la cinética de
crecimiento fue lenta (60 días de duración), se observó una fase lag que duró
hasta los veinte días, después de los cuales comenzó a crecer lentamente
alcanzando la fase de crecimiento exponencial que duró hasta los cincuenta días,
tiempo al cual alcanzó la biomasa máxima (1.38 g/L), decayendo hasta el final de
cultivo. El cálculo de los parámetros cinéticos en éste primer trabajo permite
caracterizar los cultivos para posteriores estudios de producción de metabolitos
con actividad biológica de interés.
Las constantes cinéticas calculadas para los cultivos en suspensión de C.
brasiliense se resumen en la Tabla 1 (promedio de datos de ambas cinéticas

43
manejadas). Se puede observar que la biomasa máxima se alcanzó a los 12 días
y fue de 15.17 g/L, en comparación con la biomasa obtenida en el cultivo de
suspensión de C. inophyllum que fue de 1.38 g/L a los 50 días en las condiciones
de cultivo descritas (Pawar y Thangane, 2009). En cuanto al índice de crecimiento
para el cultivo de C. brasiliense fue de 2.14, una unidad mayor en comparación
con el reportado para C. inophyllum (1.4).

Tabla 1. Constantes cinéticas del cultivo de células en suspensión de C.

brasiliense determinados con base al peso seco de la biomasa celular.

Vel. Rendimiento
Biomasa Biomasa Esp. (Yx/s, g
Tiempo* Índice de TD
inicial Máxima De biomasa
(días) crecimiento (días)
(g/L) (g/L) crecim. seca /g
-1
(µ, h ) sacarosa
4.82 15.17 12 2.14 5.95 0.1164 0.433

*: Tiempo al cual se alcanza la biomasa máxima.

En cuanto al tiempo de duplicación (TD), la biomasa se duplicó en

aproximadamente 6 días, a una velocidad específica de crecimiento de cerca de
0.12 h-1. Estos datos de índice de crecimiento, T D y µ se encuentran en
concordancia con lo reportado para plantas mexicanas que producen metabolitos
con actividad antiinflamatoria como Tilia americana variedad mexicana y
Spharalcea angustifolia (Martínez-Almanza, 2015; Pérez-Hernández et al., 2014)
además de otras especies vegetales que producen diversos metabolitos como
Cecropia obtusifolia que produce metabolitos con actividad antidiabética (Nicasio-
Torres et al., 2010), Galphimia glauca que produce metabolitos con actividad
ansiolítica (Osuna et al., 2013) o Taxus globosa cuyos metabolitos son

44
anticancerígenos (Tapia et al., 2013). Por su parte, el rendimiento Yx/s= 0.433 g
biomasa /g fuente de carbono fue muy cercano al teórico reportado para plantas
de 0.5 g biomasa/g sacarosa (Quintero, 1990).

7.3.2 Consumo de azúcares totales por los cultivos de células en suspensión

de C. brasiliense
Se puede observar en la Figura 15 que existe una relación entre el consumo de
azúcares con el incremento de la biomasa en la suspensión celular. Después del
día 10 de cultivo, el consumo de azúcares totales se incrementó, utilizándose
rápidamente como fuente de energía para satisfacer el metabolismo primario, y
posteriormente el consumo es casi total, observándose un decremento de
biomasa después del 12° día de cultivo.

40 18
35 16
30 14
Azúcares Totales (g/L)

12
25
10

BS (g/L)
20
8
15
6
10 4
5 2
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Tiempo (Días)

Figura 15. Cinéticas de crecimiento celular y consumo de azúcares totales por los
cultivos en suspensión de C. brasiliense.

7.4 Determinación de compuestos fenólicos en extractos metanólicos de

células en suspensión de C. brasiliense

Los extractos metanólicos se obtuvieron como se menciona en la metodología. De

dichos extractos se realizó la determinación de compuestos fenólicos totales
expresando los resultados como miligramos equivalentes de ácido gálico (EAG)
por gramo de peso seco, como se muestra en la Figura 18.

45
 70 18

60 16
14

Fenoles Totales (mg AG/g BS)

50
12
40 10
30 8

FT 6
20
BS 4
10 2
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Tiempo de Cultivo (Días)

Figura 16. Cinéticas de crecimiento celular y acumulación de compuestos

fenólicos en los cultivos en suspensión de C. brasiliense.

Se detectó la presencia de compuestos fenólicos en los extractos metanólicos

de los cultivos de células en suspensión de C. brasiliense, cuya producción está
parcialmente asociada al crecimiento La máxima producción de fenoles se obtuvo
a los 16 días de cultivo (57.26 mg AG/ g BS). La literatura reporta la presencia de
distintos compuestos fenólicos aislados de diversos órganos de los árboles de C.
brasiliense colectados en distintos países: triterpenos como el canofilol, la
friedelina, aislados del duramen, ácido betulínico de las raíces; flavonoides como
quercetina, hiperósido y amentoflavona de las hojas; brasixantona y jacareubina
de la corteza del árbol, inclusive dipiranocumarinas como los canalólidos y
mammeas de las hojas de C. brasiliense (Noldin et al., 2006, García-Zebadúa et
al., 2014).

46
7.5 Evaluación de la capacidad antioxidante de los extractos metanólicos de
células en suspensión de C. brasiliense con el radical DPPH

Se probó la capacidad antioxidante de los extractos metanólicos de las células del

cultivo en suspensión de C. brasiliense. Las muestras presentaron una notable
capacidad de inhibición del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), la cual
aumentó en correlación a la producción de los compuestos fenólicos Figura 17. La
mayor actividad antioxidante expresada como capacidad antioxidante en
equivalentes de trolox (TEAC por sus siglas en inglés) en M trolox/ g BS se
presenta al final de los 16 días de cultivo, con un valor de 130.54 M trolox/ g BS, la
cual parece estabilizarse al alcanzarse la fase de decaimiento.

140 70
120 60
CAO, DPPH (M Trolox/g BS)

100 50
80 40
60 30
CAO (DPPH)
40 20
FT
20 10
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Tiempo de Cultivo (Días)

Figura 17. Cinéticas de producción de compuestos fenólicos y capacidad

antioxidante expresada como TEAC en los cultivos en suspensión de C.
brasiliense. Ensayo del DPPH.

La literatura reporta el ensayo de decoloración del DPPH para extractos

metanólicos de hoja y tallo de C. brasiliense, siendo los extractos metanólicos los
que presentaron mayor TEAC en comparación con los extractos metanólicos de
hojas y tallos de C. inophyllum y Calophyllum sp., siendo sólo superados en TEAC
por los extractos de acetato de etilo de hojas y tallos de C. inophyllum (Mesa-
Vanegas et al., 2010).

47
7.6 Determinación de flavonoides totales en extractos metanólicos de células
en suspensión de C. brasiliense

El contenido total de flavonoides está asociado con el contenido de fenoles totales

como se observa por comparación de las cinéticas de las Figuras 16 y 18. El
contenido de compuestos fenólicos disminuye durante el décimo día de cultivo y
posteriormente aumenta, observándose su estabilización al pasar la fase de
crecimiento exponencial y entrar en la estacionaria y de decaimiento, el mismo
comportamiento se observa para el contenido de flavonoides. El máximo
contenido determinado fue de 271.75 mg quercetina/ g BS a los 12 días de cultivo
(Figura 18).

300 18
Flavonoides Totales (mg Qerc/ g

16
250
14
200 12
10
BS)

150
8
100 6
FVT
BS
4
50
2
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Tiempo de Cultivo (Días).

Figura 18. Cinéticas de crecimiento celular y acumulación de flavonoides en los

cultivos en suspensión de C. brasiliense.

La literatura reporta la presencia de flavonoides en los extractos de hoja y de

corteza de tallo de especies del género Calophyllum tales como C. brasiliense de
cuyos extractos de partes aéreas se ha aislado amentoflavona, quercetina e
hiperósido (Reyes-Chilpa et. al. 2004; García-Zebadúa et al., 2014); quercetina y
miricetina de extractos del androceo de hojas de C. inophyllum (Subramanian y
Nair, 1971, citado por Su et al., 2008).

48
7.7 Evaluación de la capacidad antioxidante de los extractos metanólicos de
células en suspensión de C. brasiliense con el radical ABTS

La capacidad antioxidante medida con el radical ABTS mostró un comportamiento

similar al observado durante la producción de compuestos fenólicos y con la
actividad medida con DPPH (Figuras 17,18 y 19). Sin embargo, la capacidad de
los extractos para reducir el radical ABTS fue menor que con el radical DPPH. La
diferencia entre ambos ensayos podría estar en que el ABTS puede disolverse
tanto en medio orgánico como acuoso y en ambos puede medirse la actividad
dependiendo de la naturaleza hidrofílica o lipofílica de los compuestos en la
muestra (Wojdylo et al., 2007); en tanto que el DPPH sólo puede medirse en
medio orgánico (Surveswaran et al., 2007). Así, el contenido de compuestos de
naturaleza lipofílica podría ser mayor en C. brasiliense respecto al contenido de
compuestos de naturaleza hidrofílica. Además, cabe tener en cuenta la
preparación de reactivos, ya que el DPPH es más estable en su formación al sólo
disolverse en metanol, y el ABTS debe ser activado por mínimo 12 horas con
ayuda del persulfato de potasio, por lo que lo hace menos estable.

700 70
CAO, ABTS (mM Trolox/ g BS)

600 60
500 50
400 40
300 30
CAO (ABTS)
200 20
100 FT 10
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Tiempo de Cultivo (Días)

Figura 19. Cinéticas de producción de compuestos fenólicos y capacidad

antioxidante expresada como TEAC en los cultivos en suspensión de C.
brasiliense. Ensayo del ABTS.

49
7.8 Relación entre la producción de compuestos fenólicos y flavonoides con
sus capacidades antioxidantes

La capacidad antioxidante de los extractos metanólicos tienen una correlación

directamente proporcional con el contenido de compuestos fenólicos producidos
por los cultivos en suspensión de C. brasiliense, tanto con el radical DPPH como
el ABTS, tal como se observa en la Figura 20; los valores del coeficiente de
correlación son cercanos a 1, lo cual indica que al menos en un 93-95% dichas
actividades se deben a la producción de fenólicos.

140 700
CAO, DPPH (M Trolox /g BS)

120 600
y = 2.5042x - 10.223
100 R² = 0.9552 500

80 400
y = 12.001x - 107.4
60 R² = 0.935 300

40 200
DPPH
20 100
ABTS
0 0
0 20 40 60 80
FT (mg AG/ g BS)

Figura 20. Capacidades antioxidantes en función de la producción de compuestos

fenólicos en los cultivos en suspensión de C. brasiliense.

Por el contrario, al graficar la capacidad antioxidante en función de la

producción de flavonoides, (Figura 21) se observa que los valores del coeficiente
de correlación obtenidos para ambos radicales son menores en comparación con
los determinados para FT), lo cual indica que las capacidades antioxidantes

50
observadas podrían deberse en aproximadamente un 70% a los flavonoides y el
restante porcentaje a otros compuestos fenólicos.
600 140

CAO, DPPH (M Trolox/g BS) 500 120

y = 0.4671x - 3.7745
R² = 0.7659 100
400
80
300
60
200 y = 2.3029x - 90.153
R² = 0.7936 40
100 ABTS
20
DPPH
0 0
0 50 100 150 200 250 300
FVT (mg Querc/ g BS)

Figura 21. Capacidades antioxidantes en función de la producción de compuestos

de tipo flavonoide en los cultivos en suspensión de C. brasiliense.

Las determinaciones realizadas a las hojas secas de C. brasiliense fueron las

mismas que para el cultivo celular. Se puede apreciar en la Tabla 2 que la planta
silvestre produjo una cantidad significativamente mayor de compuestos fenólicos
(32.38 mg AG/ g BS) en comparación con la planta aclimatada (9.78 mg AG/ g
BS). Sin embargo, el cultivo celular produjo 1.76 veces más compuestos fenólicos
(57.26 mg AG/ g BS) respecto a la planta silvestre, y 5.85 veces más que la planta
aclimatada (F = 2395.29, ρ < 0.0001; de acuerdo a la prueba de Tukey0.05 2.1067).

El contenido de flavonoides totales detectado fue significativamente mayor en

la planta silvestre (157.8 mg quercetina/ g BS) respecto a la planta aclimatada
(58.53 mg quercetina/ g BS). La producción de flavonoides por el cultivo celular
fue de 1.72 y 4.64 veces mayor respecto a lo producido por la planta silvestre y
climatada (F = 663.93, ρ < 0.0001; de acuerdo a la prueba de Tukey0.05 15.941).

51
Tabla 2. Comparación del contenido de fenoles totales, flavonoides y capacidades
antioxidantes de los extractos de hojas de plantas silvestre, aclimatada y de la
suspensión celular de C. brasiliense.

Flavonoides CAO DPPH CAO ABTS

Fuente Fenoles Totales
totales (M Trolox/g (mM
Biológica (mg AG/g BS)
(mg Querc/g BS) BS) Trolox/g BS)

Planta Silvestre 32.38 ± 0.87 157.82 ± 7.42 96.25 ± 3.87 193.66 ± 3.41

Planta
9.78 ± 0.62 58.52 ± 7.44 38.79 ± 1.54 59.57 ± 9.2
Aclimatada

Suspensión 534.53 ±
57.26 ± 1.32 271.75 ± 8.0* 130.54 ± 1.98
celular (16 días) 15.30

*Máxima producción a los 12 días de cultivo, según la cinética de producción.

Las capacidades antioxidantes determinadas tanto con DPPH como con ABTS
fueron significativamente mayores en los extractos metanólicos de hojas de planta
silvestre respecto a los extractos de hoja de planta aclimatada. La capacidad con
el radical DPPH de los extractos celulares fue de 130.542M Trolox/ g BS, que
representa 1.35 veces y 3.36 veces más respecto a las CAO’s de la planta
silvestre y la aclimatada (F = 997.63, ρ < 0.0001; de acuerdo a la prueba de Tukey0.05 6.3683).
De la misma forma, se observa una relación entre la producción de fenólicos y sus
CAO’s medidas con ABTS, donde la mayor actividad (534.532 mM Trolox/g BS) se
asoció con la mayor producción de fenólicos en el cultivo celular in vitro (57.262
mg AG/ gBS). La CAO con ABTS de la suspensión celular fue casi tres veces
mayor respecto a la planta silvestre y casi nueve respecto a la planta aclimatada,
lo cual concuerda con lo descrito anteriormente con el radical DPPH (F = 1624.74, ρ
< 0.0001; de acuerdo a la prueba de Tukey0.05 26.359).

52
7.9 Aislamiento y purificación de ácido apetálico, canofilol y calanólidos del
extracto acetónico de hojas de C. brasiliense

De acuerdo a lo reportado por Huerta-Reyes et al., 2004 y Bernabé-Antonio et al.,

2010, en el extracto de n-hexano de hojas de C. brasiliense se aislaron a los
calanólidos, compuestos activos contra VIH-1. Para la búsqueda de estos
compuestos en las células en suspensión se decidió cuantificarlos y para ello fue
necesaria la purificación. En un primer paso las fracciones eluidas con acetona,
metanol y agua fueron plaquedas en CCF y eluidas en una mezcla de disolventes
de media polaridad a alta polaridad, para conocer el contenido químico. La
presencia de algunos metabolitos comunes en plantas fue identificada por
comparación directa con estándares como los terpenos β-sitosterol y ácido
oleanólico, así como el flavonoide quercetina. Debido a que los calanólidos tienen
absorciones de 300-365 nm se buscaron compuestos que absorbieran la luz UV a
esta longitud de onda, el trabajo se enfocó en su separación. La identificación
preliminar por CCF no mostró presencia de β-sitosterol ni de quercetina en los
diferentes extractos, pero sí la presencia de ácido oleanólico principalmente en el
extracto acetónico de hojas (Figuras 22 y 23).

a b c

Figura 22. CCF de los extractos de hojas de C. brasiliense corrida en el sistema

Hex-MeOH (7:3). A: acetónico; M: metanólico, H2O: acuoso. β: estándar de β-
sitosterol, (a) placa revelada con solución de Sulfato cérico, (b) placa observada
bajo luz UV de onda corta (254 nm), (c) placa observada bajo luz UV de onda
larga (365 nm).

53
Figura 23. CCF de los extractos de hojas de C. brasiliense. Sistema:
diclorometano-MeOH (9:1). A: acetónico; M: metanólico, H2O: acuoso. Q: estándar
de quercetina; O: estándar de ácido oleanólico.

Con base a la CCF se decidió trabajar en la separación química con el extracto

acetónico debido a que se observan por lo menos cuatro compuestos que
absorben la luz UV (Figura 22c). Este extracto se adsorbió en sílica gel (105 g) de
fase normal (Columna 1, C1) y se eluyó con un sistema hexano-acetato de etilo en
un gradiente de polaridad creciente de 1:0 hasta 5:5; se obtuvieron 40 fracciones
de un volumen de 50 mL cada una. Las fracciones fueron reagrupadas de acuerdo
a la similitud de los compuestos observados en CCF en 8 sub-fracciones. En la
fracción 20 (CbC1F20, Compuesto 1) se observó un precipitado blanco que fue
lavado con metanol y disuelto en diclorometano. La CCF muestra la presencia de
un terpeno diferente al -sitosterol (Figura 24). Este compuesto se sometió a
análisis de RMN de 1H y 13C.

Figura 24. CCF de fase normal. Corrida hexano-acetato de etilo (7:3). R: extracto
acetónico de referencia. SN: fracción 20 (Hexano –AcOEt 8:2) solución madre. βs:
β-sitosterol. 10: precipitado de la fracción 20 (Hexano –AcOEt 80:20). Revelador:
4-hidroxibenzaldehído.

54
Análisis espectroscópico del compuesto 1.
El análisis de la RMN de 1H, nos indicó la presencia de 7 metilos a campo alto y
un grupo de metileno (CH2) de un alcohol (Figura 25).

1.13
UAMIfcs_cbs.CbDcF20.001.esp

0.98
1.0

0.73
0.92
0.87
1.00
0.9

0.8

0.7
Normalized Intensity

0.6

0.5
3.63

1.29
0.4

0.01
1.41
1.32
0.3

0.2

0.1

3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

Chemical Shift (ppm)

Figura 25. Espectro de RMN de 1H, del compuesto 1 aislado de hojas de C.

brasiliense.

13
El espectro de RMN de C, corroboró la presencia de 7 metilos, el carbono de un
alcohol y un carbonilo. 14.66
UAMIfcs_cbs.CbDcF20.002.esp
18.07

1.0
39.44
32.85

0.9
28.13

6.82
19.06
58.20

0.8
34.49

19.19
52.46

41.23
67.98

31.39

0.7
59.46

41.48
Normalized Intensity

42.09

0.6
35.43

22.26

0.5

0.4

0.3
213.10

77.05
77.31

76.80

0.2

0.1

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Chemical Shift (ppm)

13
Figura 26. Espectro de RMN de C, del compuesto 1 aislado de hojas de C.
brasiliense.

55
 14.66
UAMIfcs_cbs.CbDcF20.002.esp

18.07
1.0

0.9

6.82
19.06
0.8

19.19

18.23
0.7
Normalized Intensity

0.6
22.26

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

22 20 18 16 14 12 10 8 6 4
Chemical Shift (ppm)

13
Figura 26A. Expansión del espectro de RMN de C, del compuesto 1 aislado de
hojas de C. brasiliense.

De acuerdo al análisis de los datos de RMN de 1H y 13

C (Tabla 3) y a la
comparación con lo descrito por Thuy et al., (2007), este compuesto (Figura 27)
corresponde al canofilol (1).

13
Tabla 3. Valores de desplazamiento químico de C para el canofilol (1).
Comparativo con los datos experimentales obtenidos.
Canofilol  13C (400 MHz,
CARBONO NO. 13C DOCl3),
DESCRITOS (1)
1 22.7 22.21
2 41.51 41.43
3 213.13 213.04
4 58.23 58.15
5 42.11 42.04
6 41.25 41.18
7 18.25 18.18
8 52.5 52.41
9 37.47 37.40
10 59.49 59.41
11 34.51 35.38
12 28.15 30.04

56
 13 38.16 39.3
14 37.47 38.09
15 29.14 31.21
16 31.26 29.07
17 35.17 35.10
18 39.38 39.39
19 33.38 34.44
20 30.1 32.80
21 31.41 31.34
22 41.51 33.31
23 6.82 6.77
24 14.67 14.61
25 19.2 18.02
26 19.08 19.01
27 18.08 19.14
28 68.04 67.93
29 34.26 32.80
30 32.85 34.21

Figura 27. Estructura química del canofilol (1) aislado de hojas de C. brasiliense.

Por otro lado, la fracción reunida 1 de C1 (C1R1) (950 mg) se adsorbió en 2.5
g de sílica gel de fase normal para ser separada por cromatografía en columna
(CC). Se utilizó un sistema de elución de hexano-acetato de etilo en un gradiente
de 1:0 hasta 5:5., obteniendo 36 fracciones que fueron reagrupadas en 7 sub-
fracciones (R1-R7) de acuerdo a la similitud en los compuestos. En la fracción R3
se observó un precipitado blanco que fue lavado con metanol y comparado con el
canofilol por CCF demostró ser este compuesto aislado anteriormente (Figura 28).

La fracción R7 de C2 (250 mg), se preparó para una columna de fase reversa

(RP18, C3), el sistema de elución empleado fue de acetonitrilo-agua 95:5 hasta
acetonitrilo 100% se obtuvieron 22 fracciones. En las primeras fracciones (2-3) se

57
observó un compuesto azul oscuro al revelarse con 4-hidroxibenzaldehído eluída
con un sistema acetonitrilo-agua 95:5 (Figura 29). Estas fracciones (2 y 3) fueron
reunidas (R2) y concentradas en un rotavapor y se realizó el análisis de RMN de
1
H y 13C.

Canofilol

Otro compuesto.

Figura 28. CCF de fase normal. Sistema: Hexano-AcOEt (7:3). R: referencia,

unión de las fracciones 21-25 de C1; 11 a 15: fracciones eluidas con hexano-
AcOEt 85:15. Revelador: 4-hidroxibenzaldehído.

a b

Figura 29. CCF de fase reversa. Sistema: acetonitrilo-agua (95:5) a) placa

revelada con 4-hidroxibenzaldehído. B) placa observada bajo luz UV=254 nm. R:
referencia reunión de fracciones 31-32 C2; fracciones 1-3 eluídas con acetonitrilo-
agua 95:5; fracciones 4-8 eluídas con acetonitrilo 100%.

58
Análisis espectroscópico del compuesto 2.

El análisis de RMN de 1H, mostró la presencia de un sistema AB en 6.60 (1-H, d,

J= 10 Hz) de doble enlace (Figura 30).

1.44
UAMIfcs_cbs.CbDcC3F23 proton.esp

1.0

0.85
0.9 Sistema AB
de doble enlace

1.14
0.8

1.13
0.7
5.46
5.44
Normalized Intensity

6.59
6.61

0.6

1.36
1.35

0.87
0.5

0.84
0.4

0.3

2.00
2.80
2.82
0.2

2.85
2.83
4.49
4.50
4.51
4.51

1.16
2.53
2.54
0.1

6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
Chemical Shift (ppm)

Figura 30. Espectro de RMN de 1H, del compuesto 2 aislado de hojas de C.

brasiliense.

Se observó también otra señal base de oxígeno como doble de cuarteto con
constante de acoplamiento de 3.28 y 7.25 Hz, que indica una posición cis de los
hidrógenos (H-2 y H-3) (Figura 30A, incisos a) y c)) éste a su vez se acopla en
COSY con dos señales, una doblete en con una J = 6.56 Hz para tres
hidrógenos, que es asignado a un metilo de H-15 (ver figura 30A, inciso b)), y la
otra una señal doble de cuarteto en con una J = 3.28 Hz para un hidrógeno
que se asigna a H-3 (Figura 30A, inciso c)), que a su vez este se acopla a un
metilo encon una J = 7.25 Hz, que es asignado a H-16 (Figura 30A, inciso
b)) (Ajithabai et al., 2012).

59
 a b

Figura 30A. Expansión del espectro de RMN de 1H, del compuesto (2) aislado de
hojas de C. brasiliense.

De acuerdo al análisis de los datos de RMN (Tabla 4) y la comparación con lo

descrito en la literatura (Plattner et al., 1974; Huerta-Reyes et al., 2004) este
compuesto corresponde al ácido apetálico (2) (Figura 31).

13
Tabla 4. Valores de desplazamiento químico de C para el ácido apetálico (2).
Comparativo con los datos experimentales obtenidos.
Ácido apetálico
 13C (400 MHz
CARBONO NO.  13C
(DOCl3), (2)
DESCRITOS
2 79 78.18
3 45.9 44.18
4 199.5 201.09
5 157.2 157.28
6 116 115.61

60
 7 125.7 125.62
8 78.3 76.04
10 102 102.55
11 160 160.50
12 102.8 101.23
13 109.5 108.88
14 160 160.50
15 19.7 16.21
16 10.7 9.27
17 28.5 28.07
18 28.5 28.47
19 30.8 30.48
20 38.9 38.63
21 173.7 179.38
22 35.8 35.45
23 21.1 20.76
24 14.3 13.96

COOH

O O

OH O

Ácido apetalico

Figura 31. Estructura química del ácido apetálico (2) aislado de hojas de C.
brasiliense.

La fracción 6, se separó en una columna de fase reversa la cual fue eluída con
una mezcla de acetonitrilo-agua 5:5, hasta 4:6, obteniendo 20 fracciones de 12
mL. En las fracciones 9-13 se observó un punto de color azul al revelarse con 4-
hidroxibenzaldehído (Figura 32). Estas fracciones fueron reunidas y concentradas
a presión reducida obteniendo 8 mg del compuesto (3). Este compuesto se analizó
por RMN de 1H y 13C para su identificación.

61
Figura 32. CCF de fase reversa. Sistema acetonitrilo-agua 9:1. Fracción 7:
acetonitrilo-agua 5:5; fracciones 8 a 13: acetonitrilo-agua 4:6; R: referencia F2C5.
Revelador: 4-hidroxibenzaldehído.

El espectro de RMN de 1H y 13
C (Figuras 33, 34, 34A y 34B), mostró señales
características de una dipiranocumarina (Tablas 5 y 6), esto de acuerdo a los
datos descritos en la literatura (Kashman et al., 1992), resultando este compuesto
como el (-)-calanólido B y que de acuerdo al análisis de HPLC se encuentra
mezclado en una proporción (80:20) con el (+)-calanólido A.

1.48
1H CALANOLIDO.esp

1.0
1.49

0.9

0.8
1.25

0.7
1.03
Normalized Intensity

1.44

0.6
1.14

0.00

0.5

0.4
1.02
5.94
7.26

0.3
5.54
5.52
6.64
6.62

4.96

0.96
4.97

1.62 1.65
1.71 1.66
3.60

0.2
1.41

0.88
0.95
1.75
4.31

1.73
1.74
2.88
2.88
2.91
4.26
4.25

2.89
4.24

2.89

2.86
4.27

2.91
2.92
4.32

3.65

0.1

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
Chemical Shift (ppm)

Figura 33. Espectro de RMN de 1H, del compuesto (3) aislado de hojas de C.
brasiliense.

62
 76.80
77.02
13C CALANOLIDO.esp

77.23
1.0

0.9

0.8

0.7
Normalized Intensity

0.6

0.5

27.68
27.84
110.29

73.00

12.52
23.28
116.57
0.4

126.79

38.58

14.00
61.83
0.3

29.71
106.15

77.67
158.85

153.16

18.86
151.40

38.28
103.53
0.2

104.06
130.91
161.07

106.38
153.92

65.57
0.1

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Chemical Shift (ppm)

Figura 34. Espectro de RMN de 13C, del compuesto (3) aislado de hojas de C.
brasiliense.

13C CALANOLIDO.esp
0.8

0.7

0.6
Normalized Intensity

0.5

0.4
110.29
116.57
126.79

0.3
106.15
158.85

153.16
151.40

0.2
103.53
104.06
130.91
161.07

106.38
153.92

0.1

160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105
Chemical Shift (ppm)

13
Figura 34A. Expansión del espectro de RMN de C, del compuesto (3) aislado de
hojas de C. brasiliense.
.

63
 77.23
77.02
76.80
13C CALANOLIDO.esp

0.7

Normalized Intensity 0.6

0.5

27.68
27.84
0.4

73.00

12.52
23.28
38.58

14.00
61.83
0.3

29.71
77.67

18.86
0.2

38.28
65.57

0.1

80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10
Chemical Shift (ppm)

13
Figura 34B. Expansión del espectro de RMN de C, del compuesto (3) aislado de
hojas de C. brasilense.

Tabla 5. Valores de desplazamiento químico de 1H para los calanólidos A, B y C.

Comparativo con los valores experimentales obtenidos.
PROTÓN  1H DESCRITOS.  1H (600 MHz,
NO. Calanólido A Calanólido B Calanólido C DOCl3), (3).
5.94, t, J= 1.0
3 5.92, t, J= 1.0 Hz 5.93, t, J= 1.0 Hz 5.94, s
Hz
4 — — — —
4ª — — — —
4b — — — —
6 — — — —
5.56, d, J=10.5
7 5.52, d, J=9.5 Hz 5.51, d, J=10 Hz 5.53, d, J= 9.59 Hz
Hz
6.83, d, J= 10.5
8 6.60, d, J= 9.5 Hz 6.61, d, J= 10 Hz
Hz
8a — — — 6.63, d, J= 10.05 Hz
8b — — —
3.90, dq, J= 9.0, 4.24, dq, J= 10.5, 4.32, dq, J= 2.5, 4.25, dq, J= 6.4, 10.9
10
6.5 Hz 6.5 Hz 7.0 Hz Hz
2.22, ddq,
1.91, ddq, J=9.0, 1.73, ddq, J=10.5,
11 J=2.5, 6.0, 7.0 1.70-1.76, m
8.0, 6.5 Hz 3.3, 6.5 Hz
Hz
5.06, d, J= 6.0,
12 4.70, d, J= 8.0 Hz 4.95, d, J= 3.3 Hz 4.96, d, J= 3.20 Hz
1.5 Hz
12ª — — — —
12b — — — —
13 a 2.88, ddd 2.84-2.94, m
2.87, m 2.87, m
13 b 2.79, ddd 2.84-2.94, m

64
 14 a 1.63 sext, J= 7.0 1.60 sext, J= 7.0 1.65, sext, J= 7.31 Hz
1.63 m
14 b Hz Hz 1.65, sext, J= 7.31 Hz
0.98, t, J= 7.5
15 1.01, t, J= 7.5 Hz 1.01, t, J= 7.5 Hz 1.03, d, J= 7.31
Hz
16 1.44 s 1.46 s 1.46 s 1.48, s
17 1.49 s 1.47 s 1.46 s 1.49, s
1.41, d, J= 7.0
18 1.44, d, J= 6.5 Hz 1.41, d, J= 6.0 Hz 1.43, d, J= 6.40
Hz
1.06, d, J= 7.5
19 1.13, d, J= 6.5 Hz 1.12, d, J= 7.0 Hz 1.14, d, J= 7.31
Hz

13
Tabla 6. Valores de desplazamiento químico de C para los calanólidos A, B y C.
Comparativo con los valores experimentales obtenidos.

 13C DESCRITOS  13C (600 MHz

CARBONO NO.
Calanólido A Calanólido B Calanólido C DOCl3), (3).
2 160.4 160.9 160.8 161.07
3 110.1 110.3 111.1 110.29
4 158.9 158.7 158.6 158.85
4ª 104 103.5 103.5 103.53
4b 151.1 151.4 150.6 151.4
6 76.6 77.7 78.8 77.67
7 126.9 126.7 126.9 126.79
8 116.5 116.5 115.7 116.57
8ª 106.3 106.1 102.9 106.15
8b 153.1 153.9 152.6 153.92
10 77.7 73.0 75.6 73
11 40.5 38.6 35.1 38.58
12 67.2 61.9 65.9 61.83
12ª 106.3 106.2 109.2 106.38
12b 154.4 153.1 154.6 153.16
13 38.7 38.2 38.9 38.28
14 23.3 23.3 23.2 23.28
15 14 14 14 14
16 27.4 27.8 28.2 27.84
17 28 27.7 28.4 27.68
18 18.9 18.9 16.8 18.86
19 15.1 12.5 7.2 12.52

65
7.10 Cuantificación de ácido apetálico y (-)-calanólido B en el extracto de
diclorometano de células en suspensión de C. brasiliense

El extracto de diclorometano de la biomasa (264.2 mg, 1.24 %), fue inyectado en

el HPLC y analizado con el Método 1 y mostró el siguiente cromatograma:

Figura 35. Cromatograma del extracto de diclorometano de la biomasa de C.

brasiliense.

El análisis comparativo por HPLC del extracto de diclorometano de la biomasa

con los tiempos de retención del ácido apetálico (Tr = 19.52 min) y el (-)-calanólido
B (Tr = 22.13 min) (Figuras 35 y 36) no muestra la presencia de ambos
compuestos en la biomasa. Debido al alto contenido de carbohidratos
provenientes de los residuos de medio de cultivo en la biomasa celular, el extracto
de diclorometano se purificó a través de una cromatografía en columna. El
extracto se adsorbió con sílica gel de fase normal (70-230 mesh) y se inició la
elución con diclorometano al 100% colectando 200 mL (fracción 1) y un avance de
polaridad con una mezcla diclorometano-metanol 9:1 (200 mL, fracción 2) y
finalmente un lavado con metanol 100% (300 mL, fracción 3). Las dos primeras
fracciones se analizaron por HPLC, haciendo un comparativo con el
cromatograma del extracto inicial. De acuerdo al cromatograma de HPLC en la
fracción 1, se observa la presencia de ácido apetálico con Tr = 19.52 min (Figura
37).

66
|

Figura 36. Cromatogramas y espectros de absorción del ácido apetálico (2) y del
(-)-calanólido B (3) con trazas del (+)-calanólido A.

Figura 37. Cromatogramas comparativos del contenido de ácido apetálico (Tr =

19.52 min) y (-)-calanólido B (Tr = 22.13 min) en: a) extracto de diclorometano
íntegro; b) fracción 1 (100%, CH2Cl2) y c) fracción 2 (CH2Cl2-MeOH 9:1).

67
 La cuantificación del ácido apetálico se realizó usando la curva de calibración
descrita en la metodología con ayuda de las áreas de los picos de los respectivos
cromatogramas y resolviendo la respectiva ecuación, dando como resultado que el
compuesto 2 (ácido apetálico) se encuentra en 0.0235 mg /g BS en la suspensión
celular de C. brasiliense y en 6.96 mg/g en el extracto acetónico de hojas de
planta silvestre.

Por otra parte, el (-)-calanólido B con trazas del (+)-calanólido A no fue

observado en alguno de los dos tratamientos realizados al extracto de
diclorometano de la biomasa (fracción 1 y fracción 2). Con la finalidad de reducir el
Tr del (-)-calanólido B para poder observarlo en los extractos de los cultivos
celulares se modificó el Método 2, logrando reducirlo a 10.54 min en comparación
con el obtenido con el Método 1 (Figura 38) sin observar cambio en su espectro de
absorción.

Figura 38. Cromatograma y espectro de absorción del (-)-calanólido B (3)

obtenidos con el Método 2.

Los extractos de diclorometano tratados se analizaron por HPLC utilizando el

Método 2, sin observarse la presencia de los calanólidos (Figura 39) ya que al
comparar los Tr de los compuestos eluídos ninguno coincide con el estándar de (-
)-calanólido B (Tr = 10.54 min), incluso al comparar los espectros de absorción de
dichos compuestos, estos tampoco coinciden con el observado para el estándar
(compuesto 3). Por lo anterior podemos concluir que los cultivos de células en

68
suspensión de C. brasiliense no producen estos compuestos en estas condiciones
de cultivo.
En cambio, se observó la presencia de dos compuestos mayoritarios con Tr de
12.67 y 13.57 min en la fracción 1, y dos compuestos del tipo diterpeno en 12.55 y
19.58 min respectivamente en la fracción 2. Dichos compuestos también se
observaron en CCF (Figura 41).

Figura 39. Cromatogramas y espectros de absorción de los extractos de

diclotometano de la biomasa de C. brasiliense tratados con diclorometano y
diclorometano-metanol 9:1. Método 2.

Debido a que el canofilol no se observó en el método 1, se propuso un

segundo método que permitió identificar el canofilol en los extractos de la biomasa
de C. brasiliense (Figura 40). Comparando su Tr = 16.16 min con los Tr de los
compuestos separados en los extractos, observamos que sólo la fracción 1,

69
mostró la presencia de canofilol (Tr = 16.10 min) aunque en muy baja cantidad
(Figura 39). Con la finalidad de cuantificar el compuesto (1), se trató de hacer una
curva de calibración sin conseguirlo debido a que el canofilol presentó poca
solubilidad en metanol para poder analizarse con el Método 2, observándose un
cromatograma con baja resolución en sus picos, haciendo necesario adaptar un
nuevo método con una columna para HPLC de fase normal para cuantificar su
presencia en los cultivos in vitro de C. brasiliense.

Figura 40. Cromatograma y espectro de absorción del canofilol (Tr = 16.16 min).

A B

Figura 41. CCF de fase reversa. Sistema metanol-acetonitrilo 5:5. A: revelador 4-

hidroxibenzaldehído. B: placa observada a longitud UV de onda corta. D100:
fracción 100% diclorometano; 9:1: fracción diclorometano-metanol 9:1; U:
referencia de ácido ursólico; β: referencia de β sitosterol; L: lavado 100% MeOH;
A: ácido apetálico; C: canofilol.

70
7.11 Actividad antiinflamatoria: Modelo de edema auricular inducido con TPA

Se determinó la actividad antiinflamatoria de los extractos acetónico (CbAcet) y

metanólico (CbMeOH) de hojas de plantas silvestres de C. brasiliense en el
modelo agudo de edema auricular en ratones. Los extractos de la planta aplicados
a una concentración de 2 mg/oreja, inhiben significativamente el desarrollo del
edema auricular. La mayor inhibición se obtuvo con el extracto metanólico, la cual
fue inferior al del fármaco indometacina (Figuras 42 y 43).

14
12
10
**
8 **
Edema (mg)

6
4
2 **
0
CbMeOH 2.0 CbAcet 2.0 Indo 1.0 TPA
Concentración (mg/oreja)


X = n=5 ±D.E.; F = 100.73, ρ < 0.0001; de acuerdo a la prueba de Dunnett0.05 1.45, promedios con
** son estadísticamente diferentes al control negativo.
Figura 42. Efecto de los extractos metanólico y acetónico de hojas de plantas
silvestres de C. brasiliense sobre la formación del edema auricular inducido con
TPA.

71
 100
a

Inhibición del edema (%)

90
80
70
60
50
b
40
30 c
20
10
0
CbMeOH 2.0 CbAcet 2.0 Indo 1.0
Concentración (mg/oreja)


Porcentaje de inhibición del edema. X = n=5 ±D.E.; F = 100.73, ρ < 0.0001; de acuerdo a la
prueba de Tukey0.05 1.6, promedios con letras iguales son significativamente similares.
Figura 43. Inhibición del edema auricular inducido con TPA por efecto del
extracto metanólico y acetónico de hojas de plantas silvestres de C. brasiliense.

Para determinar si la actividad antiinflamatoria del extracto metanólico era

debido a los compuestos puros aislados canofilol (1) o ácido apetálico (2), ambos
se probaron en el modelo agudo de edema auricular, encontrándose que a un
nivel de significancia de ρ < 0.05, los dos compuestos no son activos a las
concentraciones evaluadas (1 y 0.5 mg /oreja, respectivamente). La actividad anti-
inflamatoria del extracto metanólico se deba a otros compuestos presentes en este
extracto de las hojas de plantas silvestres. La jacareubina y la 6-desoxijacareubina
se han identificado tanto en C. brasiliense como en C. inophyllum, se tiene
reportes de su actividad antiinflamatoria tanto por vía intraperitoneal como por vía
oral al ser administrados a ratas en modelos de edema subplantar inducido con
carragenina y granuloma con pellets de algodón en ratas normales y
adrenalectomizadas, además de mostrar actividad antiulcerosa (Gopalakrishnan et
al. 1980). Por otra parte, estudios recientes de Zakaria et al. (2014) demostraron
que el extracto crudo obtenido de los frutos de C. inophyllum a una concentración
de 50 μg/ml inhibieron en 77% y 88% las actividades de las ciclooxigenasas y
lipooxigenasas, respectivamente, indicando su potencial como agente
antiinflamatorio. De este extracto se aislaron los inophyllums A, C y E, el ácido

72
calofílico, el canofilólido; xantonas como la 1,7-dihidroxi-6-metoxixantona y ácidos
como el gálico, catéhuico y protocathéhuico, además de β-sitosterol, a los que se
les atribuye en conjunto esta actividad antiinflamatoria. De éstos compuestos, sólo
el ácido gálico, β-sitosterol, el ácido protocatéhuico y el calofilólido se han
identificado en C. brasilisense (García-Zebadúa et al., 2014) junto con la hiperina,
la amentoflavona y la quercetina, que han demostrado actividad analgésica en el
ensayo de retorcimiento y en relación a la segunda fase (dolor inflamatorio) de la
prueba de formalina en ratones, lo que sugiere que esta planta puede ser útil para
el tratamiento de procesos dolorosos (Da Silva et al, 2001).
Una perspectiva podría evaluar la actividad antiinflamatoria de los extractos de
frutos de C. brasiliense y de los compuestos mencionados anteriormente de
manera individual en modelos de inflamación in vitro y la búsqueda de nuevos
compuestos en caso de obtenerse actividad antiinflamatoria positiva.

En cuanto a las actividades biológicas del ácido apetálico y del canofilol, se ha

reportado principlamente antifúngica del primero contra cepas de Aspergillus
fumigatus a una concentración mínima inhibitoria del 80% (MIC 80) >250 μg/mL
(Hay et al., 2003), mientras que del canofilol se ha reportado actividad
antimicrobiana contra cepas de bacterias Grampositivas como Staphylococcus
aureus y Corynebacterium diphteriae, además de inhibir el crecimiento de
Klebsiella pneumonia y Proteus mirabilis a una concentración de 400 μg/mL
comparado con ampicilina y amoxicilina (Shaiq Ali et al.,1999).

Por otro lado, se realizó la comparación de los porcentajes de inhibición del

extracto metanólico de hojas de C. brasiliense con el extracto de diclorometano de
la biomasa del cultivo in vitro, encontrándose a un nivel de significancia de ρ <
0.05, ambos extractos tienen una actividad antiinflamatoria similar. Este mismo
comportamiento se observó al comparar los porcentajes de inhibición del extracto
acetónico de las hojas con el de diclorometano de la biomasa.
El extracto de diclorometano de células en suspensión de C. brasiliense, así
como las fracciones de diclorometano (fracción 1) y diclorometano-metanol (9:1)

73
(fracción 2) derivadas del extracto, también se evaluaron en el modelo agudo de
edema auricular en ratones. El análisis estadístico mostró que al compararse con
el control negativo, el extracto íntegro y la fracción 1 disminuyen significativamente
la formación del edema auricular inducido con TPA; en tanto que la fracción 2 fue
inactiva (Figura 44).

16
14
12
Edema (mg)

10 **
8 ** **
6
4
2 **
0
Dicloro F1 1.0 F1 2.0 F2 1.0 F2 2.0 Indo 1.0 TPA
Concentración (mg/oreja)


X = n=5 ±D.E.; F = 16.45, ρ < 0.0001; de acuerdo a la prueba de Dunnett0.05 3.26, promedios con
** son estadísticamente diferentes al control negativo.
Figura 44. Efecto del extracto de diclorometano de células en suspensión de C.
brasiliense y de las fracciones de diclorometano (fracción 1) y diclorometano-
metanol (9:1) (fracción 2), sobre la formación del edema auricular inducido con
TPA.

Con base a la prueba de Tukey se determinó que la inhibición del edema

auricular inducido por TPA es significativamente mayor en la fracción 1, en
comparación al efecto determinado con la fracción 2 y el extracto de diclorometano
íntegro empleando la misma dosis (2 mg/oreja). La actividad antiinflamatoria de
ambas fracciones disminuyó al disminuir la dosis a 1 mg/oreja (Figura 45).

74
 100
90
a

Inhibición del Edema (%)

80
70
60 b
c
50
40
d
30
20
10
0
Dicloro F1 1.0 F1 2.0 F2 1.0 F2 2.0 Indo 1.0
Concentración (mg/oreja)

Porcentaje de inhibición del edema. X = n=5 ±D.E.; F = 16.45, ρ < 0.0001; de acuerdo a la prueba
de Tukey0.05 3.8, promedios con letras iguales son significativamente similares.
Figura 45. Inhibición del edema auricular inducido con TPA por efecto de las
fracciones de diclorometano (fracción 1) y diclorometano-metanol (9:1) (fracción 2)
del extracto diclorometánico de células en suspensión de C. brasiliense.

75
8. CONCLUSIONES

• Es el primer trabajo reportando el establecimiento del cultivo de células en

suspensión de Calophyllum brasiliense, y la determinación de sus parámetros
de crecimiento, los cuales fueron similares a los reportados para cultivos in vitro
de otras especies de plantas productoras de compuestos antiinflamatorios.

• La producción de compuestos fenólicos totales en el cultivo de células en

suspensión de C. brasiliense está asociada al crecimiento y la máxima
producción fue de 57.2mg GAE/g BS en el día 16 de cultivo.

• Se determinó la capacidad antioxidante de los compuestos fenólicos de los

extractos metanólicos de células de C. brasiliense con los radicales DPPH y
ABTS, siendo la mayor actividad de 130.5 M Trolox/g BS y 534.5 mM/g BS
respectivamente, ambos a los 16 días de cultivo. La capacidad antioxidante está
estrechamente relacionada con la producción de fenoles totales.

• Se determinaron flavonoides en el extracto metanólico de los cultivos de células

en suspensión de C. brasiliense obteniéndose un máximo de 247.4 mg
quercetina/g BS a los 12 días de cultivo. La producción de flavonoides está
asociada al crecimiento.

• Se observó una mayor producción de fenoles totales, flavonoides totales, así

como una mayor CAO en los extractos metanólicos de la planta silvestre en
comparación con los extractos de planta aclimatada.

• La suspensión celular de C. brasiliense mostró una mayor producción de fenoles

totales, flavonoides totales, así como una mayor CAO determinadas con DPPH y
ABTS en comparación con los extractos metanólicos de la planta silvestre y la
planta aclimatada, por lo que puede ser una fuente sustentable de compuestos
fenólicos.

76
• Se aislaron, purificaron e identificaron por RMN los compuestos ácido apetálico,
canofilol y (-)-calanólido B con trazas del (+)-calanólido A del extracto acetónico
de hojas de C. brasiliense.

• Se cuantificó el ácido apetálico por el método del estándar externo, estando

presente en 0.0235 mg /g BS en la suspensión celular y en 6.96 mg/g en el
extracto acetónico de hojas de planta silvestre de C. brasiliense.

• Es necesario un nuevo método de cuantificación del canofilol por HPLC debido a

su baja solubilidad.

• Los cultivos en suspensión de C. brasiliense no producen el (-)-calanólido B, por

lo que es necesario aplicar técnicas de estimulación abióticas como reducción
del contenido de nitratos y/o cobre en el medio de cultivo.

77
9. PERSPECTIVAS

 Aislar, purificar e identificar los dos compuestos mayoritarios con Tr de 12.67

min y 13.57 min presentes en la fracción 1 de la biomasa celular; además de los
dos compuestos del tipo diterpeno con Tr de 2.55 min y 19.58 min
respectivamente presentes en la fracción 2 de la biomasa, y determinar si los
cuatro compuestos están presentes en las hojas del árbol silvestre y si es así,
cuantificarlos.

 Aplicar técnicas de estimulación abióticas como reducción del contenido de

nitratos y/o cobre en el medio de cultivo para la producción de los calanólidos
por el cultivo de células en suspensión de C. brasiliense.

 Establecer un método de cuantificación por HPLC para el canofilol acorde con

sus características de solubilidad que permita determinar si este compuesto es
producido por el cultivo de células en suspensión.

 Evaluar la actividad antiinflamatoria del extracto diclorometánico de la biomasa,

metanólico de hojas y de los compuestos puros ácido apetálico y canofilol
mediante curvas de dosis-respuesta en el modelo de edema auricular con
ratones.

 Aislar, purificar e identificar los flavonoides que produce la suspensión celular

de C. brasiliense en el día de máxima producción y evaluar su actividad
antiinflamatoria en el modelo de edema auricular con ratones.

78
10. BIBLIOGRAFÍA

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