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NUEVAS TECNOLOGÍAS EN
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO:
AUTOMATIZACIÓN Y ALGUNAS APLICACIONES
EN IDENTIFICACIÓN MICROBIANA Y ESTUDIO DE
SUSCEPTIBILIDAD
NEW TECHNOLOGIES IN MICROBIOLOGY: AUTOMATIZATION AND SOME
APPLICATIONS IN MICROBIAL IDENTIFICATION AND SUSCEPTIBILITY TESTS
Email: [email protected]
RESUMEN SUMMARY
A diferencia de otras áreas del laboratorio, la automatización del Unlike other areas of the laboratory, microbiology laboratory
laboratorio de microbiología no ha sido fácil, sin embargo es una automation has not been easy, but it is a clinical need
necesidad clínica para mejorar el manejo de pacientes críticos. to improve the management of critically ill patients. To
Para lograr este objetivo, es necesario optimizar la productividad achieve this goal, it is necessary to optimize productivity and
y flujos de trabajo, partiendo desde el pre-analítico, pasando workflow, starting from the pre-analytical, through different
por los diferentes test de identificación y susceptibilidad, hasta identification and susceptibility tests, to the post-analytical,
el post-analítico, que en gran medida se ha automatizado a which has been largely automated through computerized
través de la informatización de los resultados. Se muestra en results. It is shown in this paper, some of the advances in
este documento, cuáles son algunos avances en las diferentes the different steps, for traditional methodologies, proposing
áreas, respecto de las metodologías tradicionales, proponiendo schemes of work for early identification by MALDI-TOF
esquemas de trabajo para identificación precoz mediante meto- methodology as well as criteria for correct susceptibility report.
dología MALDI-TOF, así como elementos de juicio para realizar un The implementation of rapid methodologies and automated
correcto informe de antibiograma. La implementación de meto- microbiology laboratory equipment in turn leads to the need
dologías rápidas y automatizadas en el laboratorio de microbio- for an adaptation of technical and professional staff, correctly
logía implica una adaptación del personal técnico y profesional, interpreting the results obtained, both for identification and
interpretando correctamente los resultados obtenidos, tanto en susceptibility studies. It is also a requirement for managers
identificación como en estudios de susceptibilidad. También who must make the necessary investments and changes , to
constituye una exigencia para los administradores, que deben maintain service on a 24/7 basis, maximizing the advantages
hacer las inversiones necesarias y modificaciones en la planta offered by automation.
física y humana, para mantener el servicio en una base de 24/7,
aprovechando al máximo las ventajas ofrecidas por la automati- Key words: Laboratory diagnosis, microbiology, automatization,
zación de los procesos. microbial identification, susceptibility testing.
En el pre analítico se han desarrollado equipos que de manera TABLA 1. SISTEMAS DE SIEMBRA AUTOMATIZADA
robotizada, logran sembrar muestras en formato líquido,
sobre diversas placas para luego ser incubadas y analizadas
Nombre del Fabricante/ Tipo de Técnica de
(6).
equipo Proveedor muestra siembra
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AUTOMATIZACIÓN DEL ANALÍTICO: IDENTIFICACIÓN Y perfil bioquímico, que al ser comparados con perfiles cono-
ESTUDIOS DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS cidos, permite la identificación (5, 8, 9).
El ideal actual consiste en la “automatización total” del labo-
ratorio de microbiología, lo que comprende equipos en línea El tiempo de la identificación convencional era de 24-48 hrs
para siembra, incubación, análisis remoto de colonias desarro- para permitir la expresión de la reacción, ya que debía lograrse
lladas mediante digitalización de imágenes y posterior identi- un número crítico de bacterias, que dependen de su velocidad
ficación mediante espectometría de masas (MALDI-TOF; Matrix de replicación. Con la automatización se logró reducir este
Assisted Laser Desorption Ionization -Time of Flight) con realiza- tiempo a 8-10 horas, ya sea porque se detecta reacción con
ción de antibiograma automatizado a las colonias así identifi- sustratos preformados, o se logra visualizar la reacción bioquí-
cadas. Todos estos equipos en línea, estarían interconectados mica con un menor número de replicaciones, dada la minia-
mediante un software que además comunica con equipos de turización de la reacción. Esta reducción en los tiempos exige
hemocultivo automatizado, tinción de Gram y la realización de la necesidad a contar con personal capacitado durante las 24
técnicas serológicas. hrs en el laboratorio, para optimizar y hacer más eficientes los
procesos, aprovechando así las ventajas que ofrece esta tecno-
Si bien el ideal de automatización involucra el proceso logía más rápida. En Tabla 2 se presentan los diferentes tipos
completo del laboratorio de microbiología, la automatización de equipos y kits disponibles para identificación bioquímica
total es un concepto aún lejano en la realidad de la mayor (11).
parte de los laboratorios. Lo que sí es posible en la actualidad,
es contar con metodologías de identificación más rápida que Durante los últimos años, cada vez más laboratorios están
la convencional. implementando la tecnología de espectometría de masas
MALDI-TOF, que mediante el análisis proteómico de cepas
bacterianas y fúngicas, permite su identificación en minutos.
IDENTIFICACIÓN La Figura 1 muestra un esquema de esta tecnología y sus
Los procedimientos convencionales de identificación de principales etapas. Existen diversos equipos disponibles en el
microorganismos consisten en observación de características mercado, siendo los más representativos: MALDI-Biotyper de
físicas y tintoriales (morfología de colonias, tinción de Gram) y Bruker y Vitek MS, de BioMerieux, ambos presentan fortalezas
de reacciones bioquímicas. Inicialmente, estas pruebas bioquí- y debilidades.
micas se realizaban en medios en tubos, los que con el tiempo
se miniaturizaron en formatos que permitieron aumentar el En nuestro centro, realizamos una verificación de la tecno-
número de pruebas y eventualmente automatizar la lectura logía MALDI-TOF, con el objetivo de conocer la concordancia
de estos resultados. Dependiendo de las reacciones de cada en identificación de género y de especie, entre metodo-
microorganismo frente a diferentes sustratos, se obtiene un logía convencional y espectometría de masas, comparando
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[REV. MED. CLIN. CONDES - 2015; 26(6) 753-763]
Adquisición de perfil
protéico mediante
MALDI TOF
Colonia a identificar
Preparación de lámina de
identificación Identificación mediante
comparación con patrones
conocidos en base de datos
los resultados obtenidos por Vitek 2 Compact y Vitek MS en satisfactoria por esta metodología, ya que no permite dife-
205 cepas, obteniendo una concordancia global de 95% renciar cepas de E. coli de Shigella, ni tipificar las cepas de
para género y especie y 98% para género solamente. Cabe Salmonella spp. En Tabla N° 3 se muestra los resultados por
destacar que la identificación de enteropatógenos, no es grupo de microorganismo. La probabilidad de identifica-
% concord género y
Tipo de microorganismo n % concord género
especie
Levaduras*** 20 100 95
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[NUEVAS TECNOLOGÍAS EN DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO... - Dra. Beatrice Hervé E.]
ción de una cepa bacteriana o fúngica por espectometría de inoculados en placas de agar sangre, comparado con método
masas, depende de que el perfil proteómico de esa cepa esté convencional (MC), según tipo de frasco y tipo de microorga-
incluido en la biblioteca de perfiles del equipo, es así que las nismo. Se incluyó en el estudio 145 muestras de hemocultivo
especies “misceláneas” de la tabla, tienen un menor grado positivo detectados por equipo Bact /Alert. Los resultados de
de identificación, posiblemente por ser cepas aisladas con ambos procesos fueron comparados en relación a resultado
menor frecuencia y por ende, menos representadas en esta de identificación. Se toma en cuenta el tipo de frasco y tipo
biblioteca o base de datos (12). de microorganismo detectado. Los resultados se muestran
en Tablas 4 y 5, evidenciando que el estudio de hemocul-
El análisis proteómico de microorganismos por espectrome- tivos positivos en forma directa por MS, sembrando a ciegas
tría de masas (MS) es una metodología confiable, económica a las 4 a 6 horas de inoculación en placas, permite identificar
y rápida, que muestra resultados promisorios al compararlo en forma segura el 81% de los casos, adelantando el dg en
con métodos convencionales (MC). Se han publicado reportes 12-16 horas respecto del método tradicional. Este resultado
que indican que MS puede ser utilizado con buenos resul- mejora cuando se utilizan frascos sin resina o carbón activado
tados en la identificación a partir de muestra directa, con (dg correcto en 93% de los casos), y se observa mayor preco-
protocolos publicados para urocultivo y hemocultivo, desta- cidad para diagnosticar bacilos Gram negativo que cocáceas
cando el aporte que esto significa en el manejo clínico. Sin Gram positivo. En base a estos resultados, se estableció un
embargo, la aplicación de los protocolos publicados para algoritmo que se muestra en Figura 2, que permite adelantar
hemocultivo, resulta laboriosa e interrumpe el flujo normal la ID sin aumentar los costos ni la carga de trabajo del labora-
de trabajo de un laboratorio, ya que en el momento en torio de microbiología (13, 14).
que un hemocultivo da alarma de positivo, debe haber un
profesional disponible para realizar la secuencia completa
de concentración-centrifugación y resuspensión de pellet ESTUDIOS DE SUSCEPTIBILIDAD
que indica el procedimiento, lo que no siempre existe en la En cuanto a estudios de susceptibilidad a antimicrobianos,
práctica diaria. En nuestro centro aplicamos este protocolo existen diferentes metodologías, que se pueden sistema-
el año 2012 en 39 muestras de hemocultivo, logrando un tizar en: convencionales o fenotípicos, y automatizados ya
74% de diagnóstico directo, que se veía fuertemente redu- sea fenotípicos o genotípicos. Cada vez más, se hace nece-
cido si el frasco de hemocultivo tenía resina/carbón activado. sario detectar de manera oportuna y precisa, la existencia de
Dado que este resultado no fue satisfactorio, se mantuvo el mecanismos de resistencia con implicancia epidemiológica,
método convencional de identificación (incubación por 18 como son: Enterococcus resistentes a vancomicina, S. aureus
horas en placas y luego identificación de colonias). Durante con sensibilidad reducida a vancomicina, enterobacterias
el primer semestre de 2014, establecimos un algoritmo productoras de Betalactamasas de Espectro Extendido (BLEE)
acortado del método tradicional, realizando una identifica- o productoras de carbapenemasas. Estos mecanismos de
ción a ciegas a partir de placas incubadas por 4 a 6 horas (sin resistencia pueden ser detectados por técnicas rápidas, de
colonias visibles), para conocer la correlación del diagnós- screening, o confirmatorias, ya sea fenotípicas o genotípicas,
tico adelantado a ciegas por MS en hemocultivos positivos que deben estar disponibles para realizar frente a una alerta
TABLA 4. RENDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN PRECOZ, SEGÚN TIPO DE FRASCO HEMOCULTIVO POSITIVO, POR VITEK MS
n° identificación precoz
% identificación
Tipo de frasco n° tot positivos concordante con identificación
precoz concordante
18 hrs
FA 53 35 66
PF 21 14 67
SA 54 50 93
SN 17 16 94
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TABLA 5. RENDIMIENTO IDENTIFICACIÓN PRECOZ SEGÚN TIPO DE MICROORGANISMO, HEMOCULTIVO POSITIVO POR VITEK MS
n° concordantes por
Tipo de n° total % identificación
identificación precoz vs
Microorganismo identificados precoz concordante
identificación 18 hrs
BNEG 72 62 86
CPOS 62 49 79
LEVAD 7 4 57
BPOS 2 0 0
mixto 2 0 0
BNEG: bacilo gram negativo; CPOS:cocácea gram positivo; LEVAD:levadura;BPOS:bacilo gram positivo. Mixto: desarrollo de mas de un microorganismo
en la interpretación del antibiograma (generalmente estas Los métodos automatizados disponibles son:
alertas están dadas por la identificación de alguna especie a) Microdilución rápida (métodos comerciales fenotípicos:
en particular , o la detección de concentraciones inhibitorias Vitek, Phoenix, Microscan). Estos métodos, al igual que la
mínimas (CIM) sugerentes). (15-18). identificación automatizada, consisten en paneles con poci-
llos miniaturizados que contienen diferentes concentraciones
Los métodos convencionales o fenotípicos, a su vez pueden de antimicrobianos, según los puntos de corte que permiten
ser: diferenciar cepas resistentes de cepas intermedias o sensibles.
a) Cuantitativos: permiten conocer la CIM de un antimicro- Estos paneles o tarjetas contienen antimicrobianos definidos
biano frente a un determinado microorganismo (en ug/ml), para los distintos grupos de microorganismos (bacilos, cocá-
lo que es de gran utilidad al momento de definir las dosifica- ceas, levaduras, gram positivo, gram negativo), se ingresan al
ciones, especialmente en pacientes críticos. Existen métodos equipo respectivo, el cual mediante turbidimetría establece
cuantitativos de referencia o Gold standard (ya sea micro o las CIM de cada cepa. Actualmente estos equipos cuentan con
macro dilución en caldo y/o dilución en agar) y aquellos que softwares de interpretación o reglas de experto, para informar
no son de referencia (E-test, Just-One), pero que facilitan de resultados coherentes de susceptibilidad. Estos equipos
manera importante la realización de antibiograma por CIM permiten realizar la identificación (ya sea bioquímica o por
en la práctica diaria a la vez que da flexibilidad respecto de a MALDI) y estudio de susceptibilidad en forma integrada (19).
qué antimicrobianos estudiar la CIM y a cuáles no.
b) PCR (métodos comerciales genotípicos), que detectan
b) Cualitativos (difusión en disco o Kirby Bauer), que a presencia de genes de resistencia conocidos, o bien,
través de la medición de un halo en mm permite correla-
cionar con la CIM y entregar una categoría de Susceptible, c) La detección de perfiles proteómicos mediante
Intermedio o Resistente frente a cada antimicrobiano. MALDI-TOF post exposición a un determinado antimicrobiano.
c) De screening y punto de corte, permiten separar cepas Las últimas dos mencionadas, son técnicas en desarrollo o ya
con algún mecanismo de resistencia específico, de aquellas comercializadas, que escapan el ámbito de esta revisión (20, 21).
que no lo poseen. Para esto, existen diversos agares cromó-
genos o de screening, que contienen una concentración de En Tabla N°6 se muestra una comparación de las principales
antimicrobiano que constituye el punto de corte para iden- características de las diferentes metodologías fenotípicas
tificar las cepas resistentes. mencionadas.
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[NUEVAS TECNOLOGÍAS EN DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO... - Dra. Beatrice Hervé E.]
Aviso telefónico
resultado de tinción Antibiograma
de Gram directo
Cargar 2 pocillos
MS “a ciegas”
Sí No
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Velocidad
Método Precisión Facilidad Flexibilidad Costo
(resultado)
Screening + +++ + + ++
Actualmente persiste un desfase entre la velocidad de iden- con resistencias intrínsecas o naturales, que no siempre se
tificación que se logra por espectometría de masas, y la evidencian in vitro, por lo que el laboratorio de microbio-
menor velocidad en obtener un resultado de susceptibilidad logía debe emitir un informe de susceptibilidad interpretado
a antimicrobianos, ya que a pesar de su automatización, de acuerdo a la identificación del microorganismo, y de los
esta última sigue basada en la velocidad de replicación del mecanismos de resistencia subyacentes. También existen
microorganismo. fenotipos de resistencia inusuales, que deben hacer sospe-
char al microbiólogo y repetir el estudio, o intentar confir-
Es necesario considerar también que, pese a los grandes marlo por algún otro método. En Tabla 8 se presentan los
avances logrados en relación a automatización de estudios microorganismos con fenotipos de resistencia intrínseca más
de susceptibilidad, en este momento aún no es posible pres- frecuentemente encontrados en la práctica clínica y en Tabla 9
cindir del todo de los métodos manuales, ya que hay algunos aquellos fenotipos de resistencia poco habituales, que deben
microorganismos, o combinaciones de microorganismo/ llevar a realizar más pruebas (23).
antimicrobiano (Tabla 7) que presentan falsas sensibilidades
o resistencias (22). Asimismo, el laboratorio de microbiología debe proveer a
sus clínicos de tablas de susceptibilidad de la microbiota
Es fundamental, para una correcta interpretación de los local actualizadas en forma periódica, de manera de orientar
resultados de susceptibilidad, contar con una identifica- adecuadamente los tratamientos empíricos que se inician
ción precisa y confiable, ya que existen microorganismos frente a una sospecha clínica determinada (24).
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[NUEVAS TECNOLOGÍAS EN DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO... - Dra. Beatrice Hervé E.]
TABLA 7. RECOMENDACIONES ESPECÍFICAS PARA REALIZAR ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD POR METODOLOGÍA MANUAL
Bacilos no Fermentadores de
Difusión en disco o E-test todo el antibiograma
paciente con Fibrosis Quística*
*En pacientes con FQ, los BNF presentan un metabolismo lento, que hace que los equipos automatizados consideren cepas sensibles cuando pueden
ser resistentes.
** Especialmente cuando las CIM por método automatizado caen en el rango de intermedio o resistente.
Resistencia Intrínseca
C.krusei R a Fluconazol
K.pneumoniae R a ampicilina
R: Resistencia.
Table CLSI MIDO S24.
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Fenotipos infrecuentes
NS a carbapenémico, o cefalosporina de 3º o
H.influenzae no reportado
fluoroquinolona
NS: No sensible.
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