UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

FACULTAD DE INGENIERÍA
INGENIERÍA DE ALIMENTOS

Práctica de Laboratorio N° 2

PREPARACIÓN DE MUESTRAS,
RECUENTO DE BACTERIAS MESÓFITAS

Estudiante: Quispe Velarde Guadalupe

Asignatura: Laboratorio de Microbiología de Alimentos
Sigla: PIA-511
Fecha de experimentación: 23 de septiembre de 2021
Fecha de entrega del informe: 30 de septiembre de 2021

LA PAZ - BOLIVIA
Tabla de contenido
1. OBJETIVOS...........................................................................................................................3
1.1 OBJETIVO GENERAL...................................................................................................3
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.........................................................................................3
2. FUNDAMENTO TEÓRICO..................................................................................................3
2.1 MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE................................................................................3
2.2 INFLUENCIA DE LOS MICROORGANISMOS EN LA LECHE...............................3
2.3 BACTERIAS MÁS COMUNES EN LA LECHE Y SUS DERIVADOS.................3
2.3.1 Bacterias Mesófitas.................................................................................................4
2.3.1.1 Bacterias Psicrófilas.............................................................................................4
2.3.1.2 Bacterias Termodúricas.......................................................................................4
2.3.1.3 Bacterias Termófilas............................................................................................4
2.4 IMPORTANCIA DEL ANÁLISIS DE AEROBIOS MESÓFITOS................................4
3. MATERIALES Y REACTIVOS............................................................................................4
3.1 Materiales de Laboratorio..............................................................................................4
3.2 Reactivos.........................................................................................................................5
3.2.1 Agua peptonada.......................................................................................................5
3.2.2 Agar Plate Count......................................................................................................6
4. MÉTODO................................................................................................................................8
4.1 PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE LECHE CRUDA.............8
4.2 PROCEDIMIENTO DEL RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFITAS VIABLES POR EL
MÉTODO DE RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA........................................................................8
5. RECUENTO.........................................................................................................................10
6. EXPRESIÓN DE RESULTADOS......................................................................................10
7. CONCLUSIONES...............................................................................................................10
8. BIBLIOGRAFÍA....................................................................................................................10
9. ANEXOS..............................................................................................................................11
CUESTIONARIO...........................................................................................................................13
 PREPARACIÓN DE MUESTRAS, RECUENTO DE BACTERIAS MESÓFITAS

1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
 Realizar el recuento de Bacterias Mesófitas Aerobias en leche cruda utilizando
técnicas de vaciado en placa para analizar la contaminación de dicho alimento.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Evaluación del número de colonias formadas en las distintas placas.
 Comparación del recuento total respecto a los requisitos microbiológicos de la
leche según la NB 33013:2013 Productos lácteos – Leche cruda y fresca –
Requisitos

2. FUNDAMENTO TEÓRICO
2.1 MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE
Según Frazier (1962), la leche es un excelente medio de cultivo para numerosos
microorganismos por su elevado contenido de agua, su pH casi neutro y su riqueza
en alimentos microbianos. Posee una gran cantidad de alimentos energéticos en
forma de azúcares (lactosa), grasa, citratos y compuestos nitrogenados. La
presencia de azúcares fermentables, en condiciones ordinarias provoca que las
bacterias produzcan una fermentación ácida, si no existen gérmenes formadores de
ácido o si las condiciones son desfavorables para su actividad, pueden sufrir otros
tipos de alteración.
FAO (1998), señala que es sumamente importante que las muestras de leche que
se tomen para el análisis microbiológico reflejen con exactitud las condiciones
higiénicas-sanitarias existentes en el momento del muestreo, asépticamente
utilizando recipientes e instrumentos estériles, y protegiendo las muestras contra la
contaminación exógena. Además deben mantenerse en condiciones tales que la
microflora original que contiene la leche no mueran ni se multipliquen.
2.2 INFLUENCIA DE LOS MICROORGANISMOS EN LA LECHE
Según Heer (2007), el estudio microbiológico está basado en tres aspectos muy
importantes:
 Los microorganismos pueden producir cambios deseables en las
características físico químicas de la leche durante la elaboración de diversos
productos lácteos.
 Los productos lácteos y la leche pueden contaminarse con microorganismos
patógenos o sus toxinas y provocar enfermedad en el consumidor.
 Los microorganismos pueden causar alteraciones de la leche y productos
lácteos afectando la calidad de sus subproductos.
2.3 BACTERIAS MÁS COMUNES EN LA LECHE Y SUS DERIVADOS
Según Andino Rugama, F., y Castillo, Y. (2010) “los microorganismos indicadores se
pueden dividir en dos grupos: indicadores de condiciones de manejo o deficiencia de
proceso (aerobios mesófilos, coliformes totales, hongos y levaduras), y los indicadores
de contaminación fecal (E. coli, Enterococcus, Cl. Perfringens)”. Estos
microorganismos son utilizados para revelar las condiciones a las que ha sido
expuesto un producto alimenticio, y para evaluar la inocuidad microbiológica del mismo
(Aguayo Quisiguiña & Gamboa Guerra, 2013).
En el presente trabajo se hará referencia únicamente a los microorganismos aerobios
mesófitos.
2.3.1 Bacterias Mesófitas
Revilla (1985), indica que las bacterias mesófitas son un grupo de bacterias que se
desarrollan a temperaturas entre 30-40 ºC, e incluye a varios grupos.
2.3.1.1 Bacterias Psicrófilas
El grupo de bacterias que tienen la capacidad de desarrollarse a bajas temperaturas,
entre 5 a 20 ºC. Siendo su temperatura óptima entre los 12 a 15 ºC.
2.3.1.2 Bacterias Termodúricas
En la industria lechera se denominan así a las bacterias que son resistentes a la
pasteurización (30 minutos a 63-65ºC).Estas bacterias se pueden originar del suelo,
forrajes, silaje, barro, bosta, equipamiento (Revilla, 1985).
2.3.1.3 Bacterias Termófilas
Se denominan bacterias termófilas aquellas que tienen su temperatura óptima de
desarrollo por encima de 40ºC. A ese grupo de bacterias pertenecen algunos géneros
de Bacillus y Estreptococcus, que se utiliza para la determinación biológica de
inhibidores en leche. Estas bacterias sometidas a temperaturas durante un tiempo
prolongado tienen un crecimiento acelerado (Revilla, 1985).
2.4 IMPORTANCIA DEL ANÁLISIS DE AEROBIOS MESÓFITOS
Los aerobios mesófitos son utilizados como indicadores de la calidad del
procesamiento de un alimento. No poseen un hábitat definido, y en general no
provocan enfermedades en el ser humano (Salgado Zeballos, 2002).
El recuento de aerobios mesófitos nos permite obtener información acerca de la vida
útil de los alimentos, la causa de alteración del proceso de elaboración del producto,
verificar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas,
comprobar si hubo un adecuado procedimiento de limpieza y desinfección, y si las
condiciones óptimas de almacenamiento y transporte eran las apropiadas (Alonso
Nore & Poveda Sánchez, 2008).
Además, el recuento de estas bacterias nos sirve para estimar la microflora total sin
especificar tipos de microorganismos. Es importante recalcar que tanto como un
recuento alto o bajo de estas bacterias, no involucra o afirma la presencia de
microorganismos patógenos (Cconchoy Mosqueira, Lázaro Llacua, Pacheco Huamán,
Tupia Montes, & Sicha Evaristo, 2013).
Un recuento elevado puede significar que hubo una excesiva contaminación de la
materia prima, la corta vida útil de los alimentos, deficiente manipulación durante el
proceso de elaboración de un producto, la presencia de posibles microorganismos
patógenos, malas prácticas sanitarias, y problemas de almacenamiento relacionados a
tiempo-temperatura (Aguayo Quisiguiña & Gamboa Guerra, 2013); (Cconchoy
Mosqueira y col., 2013).

3. MATERIALES Y REACTIVOS
3.1 Materiales de Laboratorio
CANTIDAD MATERIAL CARACTERÍSTICAS
20 Pipeta 0,1 ml
20 Pipeta 0,5 ml
20 Pipeta 10 ml
 2 Bureta 250 ml
180 Cajas Petri  
6 Matraz Erlenmeyer 50 ml
Balanza de
1 precisión 2000 g
1 Termómetro 10-200°C
2 Mechero de alcohol  
Asas
2 bacteriológicas  
200 Tubos de ensayo 20 ml
40 Tubo de ensayo 50 ml
 2 Gradilla  
 1 Hornilla  
 5 Frascos 500 ml
EQUIPO MATERIAL CARACTERÍSTICAS
1 Estufa de cultivo 37 °C
1 Autoclave 1,5 atm/Incub 37°C
 1 Refrigerador 4 °C
  Baño María 44,5°C

3.2 Reactivos
3.2.1 Agua peptonada
Cantidad: 450 ml
Fórmula:

Peptona 0.45 g
Agua destilada 450 ml

Preparación: Disolver la peptona en agua, ajustar el pH de forma que después

de la esterilización sea de 7,0 ± 0,1 a 40 °C, se distribuye a 225 ml ó 450 ml en
Erlenmeyer o frascos de dilución y se esteriliza a 121 °C durante 15 min.
Control de calidad:

Solubilidad Apariencia Color del Color del Ph FINAL

medio medio (25°c)
deshidratado preparado
Sin restos Polvo fino Ligeramente Ámbar 7,3 ±0,2
tostado

MICROORGANISMOS RESULTADO
Escherichia coli Crecimiento
ATCC 25922
Escherichia coli Crecimiento
ATCC 8739
Staphylococcus aureus Crecimiento
ATCC 6538
Pseudomonas aeruginosa Crecimiento
 ATCC 9027
Salmonella typhimurium Crecimiento
ATCC 14028

Precauciones: El medio no debe ser utilizado si se observa algún tipo de

deterioro.
Almacenamiento y vida útil:
Medio de cultivo deshidratado: 10 – 35 °C
Medio de cultivo preparado: 2-8°C
- Duración de almacenamiento (deshidratado): 5 años
Resultados:

3.2.2 Agar Plate Count

Cantidad: 3000 ml
Fórmula:

Triptona 15 g
Glucosa 3g
Extracto de 7.5 g
levadura
Agar 42 g
Agua destilada 3000 ml
Preparación: Disolver los componentes en agua a ebullición, ajustar el pH de
manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,1 a 45 °C. Trasvasar el
medio de cultivo a matraces de capacidad no mayor a 500 ml y no más de la
mitad del volumen del recipiente. Esterilizar en autoclave a 121 °C ± 1 °C
durante 15 min.
Control de calidad:
Comprobar si hay signos de deterioro. El control de calidad debe ser llevado a
cabo con al menos un organismo que demuestre la actuación esperada. No usar
si el resultado del control del microorganismo es incorrecto. La lista de abajo
ilustra una variedad de actuaciones de las cepas de control de uso rutinario, que
el usuario final puede obtener fácilmente.

MICROORGANISMOS RESULTADO
Escherichia coli Crecimiento
ATCC 25922
Staphylococcus epidermidis Crecimiento
ATCC 14990

Precauciones: Exclusivamente para uso diagnóstico in vitro. Respetar las

preacuciones de seguridad y utilizar técnicas asépticas. Debe ser utilizado solo
por personal de laboratori cualificado y con experiencia. Antes del desecho,
esterilizar todo el material biológico. Consultar la fecha de seguridad del
producto.
Almacenamiento y vida útil:
Todos los contenedores de medios de cultivo deshidratados deben permanecer
herméticamente cerrados y almacenados en un lugar seco de 10 a 25 °C hasta
la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del envase.
Resultados:
4. MÉTODO
4.1 PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE LECHE CRUDA
INICIO

Agregar 50 ml de Frasco de vidrio Agregar 450 ml de

leche cruda estéril agua peptonada

Homogeneizar
Advertencias y precauciones:
- Evitar la formación de espuma
en la toma de 1ml de las
diluciones.
Dilución 10^-1
- Después de cada utilización del
agitador, límpielo con un paño
suave.
Tomar 1 ml de la
dilución

Colocar en los tubos

de ensayo

NO
Agregar a 9 ml de
solución de agua
peptonada

Llevar a un agitador
tipo vortex

¿Dilución 10^ -5?

SÍ

FIN

4.2 PROCEDIMIENTO DEL RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS

MESÓFITAS VIABLES POR EL MÉTODO DE RECUENTO ESTÁNDAR
EN PLACA.
 INICIO

Tomar en un a pipeta 1 ml de las

diluciones preparadas y una
alicuota de 0,1 ml de la dilución
10^-5.

Por duplicado, colocar 1 ml

de las diluciones en Placas
Petri esterilizadas.
Advertencias y
precauciones:
Fundir el Agar PCA
- Controlar muy bien el
agar durante su fundido.
Mantener en Baño - El medio de cultivo no
María a 44°C +- 2
debe impregnarse en la
tapa.
Verter de 10-15 ml
del agar en las
placas Petri con las
muestras.

Tapar la caja Petri

Homogeneizar con
moviminetos
circulares hacia la
derecha e izquierda
y en forma de cruz.

Dejar solidificar en una

superficie horizontal

Una vez sólidos,

invertir las cajas.

Incubar a 29°C – 31°C

por 48 +- 3 h

Elegir dos placas

correspondientes a una
dilución que contengan
entre 30 y 300 colonias

Hacer el conteo con el

contador de colonias.

Expresar el
resultado final en
UFC/ml

FIN
5. RECUENTO
El recuento de bacterias mesófitas aerobias se lo realizó de acuerdo a la Comisión
Internacional de Especificaciones Microbiológicas en Alimentos (ICMSF).

La Norma Boliviana “NB 33013:2013 Productos lácteos – Leche cruda y fresca –

Requisitos” establece que el límite del Recuento total de bacterias mesófilas es < 4 x
10 6 UFC/ml
En el presente trabajo, se realizó el recuento para 180 muestras.

6. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
De 180 muestras:
Nombre: Recuento total de bacterias aerobias mesófilas
Recuento: 2.6 x 10 6 UFC/ml
Informe de ensayo: Recuento de microorganismos aerobios mesófilos
en muestras de alimentos. Técnica de Recuento en placa. Procedimiento
según ICMSF – 2000.

7. CONCLUSIONES
 En la presente práctica de laboratorio se obtuvo el recuento total de bacterias
aerobias mesófilas por la técnica de Recuento en placa; dicho recuento, en
promedio (de las 180 muestras), evidenció a 2.6 x 10 6 UFC/ml.

 Al comparar el resultado del recuento total de las muestras analizadas con lo

que indica la NB 33013:2013 Productos lácteos – Leche cruda y fresca –
Requisitos, se concluye que la muestra de leche analizada está dentro de los
parámetros requeridos y, por tanto, es apta para su utilización en la industria.

8. BIBLIOGRAFÍA

 Aguayo Quisiguiña, P., & Gamboa Guerra, M. (2013). Implementación de un

Plan de Mejoras en Prácticas y Operaciones de Higiene para la Preparación de
Alimentos en un Centro Infantil en un Sector del Noroeste de Guayaquil.
Guayaquil, Ecuador: Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la
Producción. Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL).

 Alonso Nore, L. X., & Poveda Sánchez, J. A. (2008). Estudio comparativo en

técnicas de recuento rápido en el mercado y placas petrifilmTM 3MTM para el
análisis de alimentos.

 Andino Rugama, F., & Castillo, Y. (2010). Un enfoque practico para la

inocuidad alimentaria.

 Cconchoy Mosqueira, V., Lázaro Llacua, M., Pacheco Huamán, K., Tupia
Montes, M., & Sicha Evaristo, A. (24 de Noviembre de 2013). Análisis
Microbiológico de los alimentos: Identificación de aerobios mesófilos.
Recuperado el Sábado 18 de Octubre de 2014, de Scribd:
http://es.scribd.com/doc/186747801/informe-aerobios-mesofilos
  FAO (Organización de la Naciones Unidas para la Agricultura yAlimentación).
2009. Anuario de Producción.Roma-Italia.

 Frazier, W., & Westhoff, D. (1988). Microbiología de los Alimentos. 3ra. ed.
Editorial Acribia SA. Zaragoza, España, 239-594.

 Heer, G. (2007). Microbiología de la leche. Cátedra de tecnología de la leche.

Universidad Nacional del litoral. Santa Fe, Argentina.

 Lopez Gomez, N. M., & Pérez Calderón, N. K. M. (2019). Numeración de bacterias

aerobias mesófilas viables y coliformes en leche cruda acopiada para el programa
Vaso de Leche en el distrito de Chiclayo. Mayo–Octubre 2018.

 Salgado Zeballos, V. R., & Barrientos, E. (2002). Análisis de mesófilos

aerobios, mohos y levaduras, coliformes totales y Salmonella spp. en cuantro
ingredientes utilizados en la planta de lácteos de Zamorano, Honduras (No.
T1607). ESCUELA AGRICOLA PANAMERICANA.

9. ANEXOS
Anexo N°1: Acta de inspección y toma de muestra
Anexo N°2: Muestras recolectadas y debidamente refrigeradas.

Anexo N°3: Numeración de microrganismos mesófilos aerobios viables

 CUESTIONARIO
1.- ¿Que son las bacterias viables no cultivables (BVNC)?
R.- Las bacterias viables no cultivables (BVNC) representan un estado celular
adaptativo, de supervivencia a largo término bajo condiciones ambientales
desfavorables (Ducret et al., 2014). Estas bacterias están vivas, con actividad
metabólica, pero no pueden desarrollar colonias en condiciones de cultivo en que
habitualmente podrían crecer. Células de diferentes especies bacterianas pueden
subsistir como BVNC. El concepto fue propuesto unas décadas atrás y aunque
inicialmente se lo consideró un estado de inactividad, actualmente se considera un
estado de supervivencia de las bacterias (Oliver, 2005, Oliver, 2010, Pinto et al.,
2014). En el estado no cultivable la célula vegetativa normal no sólo cambia
morfológicamente, sino también metabólicamente; se modifica la expresión de sus
genes y su potencial de virulencia (Li et al., 2014). Bajo determinadas condiciones
las bacterias pueden “resucitar” y abandonar este estado. Debido a su falta de
desarrollo en los medios de cultivo, muchas veces se subestima la densidad real de
sus poblaciones (Ramamurthy et al., 2014).

2.- Indique la importancia del estudio de las Bacterias viables no cultivables

(BVNC)
R.- Las BVNC son de gran importancia para la seguridad alimenticia y la salud
pública. Muchas especies potencialmente peligrosas sobreviven y persisten en
alimentos procesados, leche pasteurizada, agua potable y en el ambiente en
general (Sardessai, 2005). Bacterias patógenas causantes de gastroenteritis
(Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae), tuberculosis
(Mycobacterium tuberculosis) y otras enfermedades pueden entrar en dicho estado
y recuperar posteriormente su virulencia. Se ha comprobado que algunas bacterias
patógenas pueden ser avirulentas en el estado BVNC recobrándola después de su
“resucitación”, bajo condiciones favorables (Du et al., 2007). Por otra parte, estos
microorganismos están siendo actualmente estudiados en relación a la potencial
transformación y degradación de contaminantes en el ambiente (Su et al., 2013).

3.- Indique las diferencias entre microorganismos índice y microorganismos

indicadores
Microorganismos Índices: Su presencia en un alimento indica la posible presencia
simultánea de microorganismos patógenos ecológicamente relacionados. Así, por
ejemplo, E. coli ha venido utilizándose como índice de posible presencia de
patógenos de procedencia entérica (entre ellos, Salmonela) en el agua y los
alimentos.
Microorganismos Indicadores: Ponen de manifiesto deficiencias en la calidad
microbiológica de un determinado alimento en términos más generales. Por
ejemplo, presencia de bacterias del grupo coliformes en la leche pasteurizada, en
número que exceda a un valor de referencia experimentalmente establecido, puede
advertir diversas deficiencias de este producto:
a) Un tratamiento térmico insuficiente,
b) Una contaminación posterior al tratamiento,
c) Un almacenamiento del producto final a una temperatura demasiado elevada.
4.- ¿Cómo se realiza la prueba de productividad y selectividad de un medio de
cultivo?
Prueba de productividad y especificidad
Preparar cultivos de trabajo:
En general para cada una de las cepas control, realizar lo siguiente:
 A partir de los cultivos desarrollados en agar soya tripticasa (AST) de 24
horas a 34 °C entre 38 °C +/- 1 °C, transferir una colonia a 10 mL de caldo
BHI incubar 18 horas a 35 °C 36 °C +/- 1 °C.
 Tomar 1 mL del cultivo anterior y realizar diluciones decimales en 9 mL de
solución peptona salina, (10-1 – 10-10), hasta obtener una densidad
microbiana de entre 100 y 150 UFC / mL.
 Sembrar 1 mL de las diluciones apropiadas para obtener el inóculo deseado
por vaciado en placa en AST o tomar 0.1 mL y sembrarlo por extensión en
placa en AST por duplicado.  Incubar las cajas invertidas a entre 34 °C y 38
°C durante 24 horas. Contar las colonias para establecer en qué dilución se
encuentra el inóculo deseado.
 Realizar este procedimiento varias veces hasta obtener resultados
repetibles. Una vez establecida la dilución, inocular el medio de cultivo a
probar incubando bajo las condiciones establecidas en el método.

Todo esto para tener concentraciones aproximadas de 100 UFC / mL

Para la prueba de productividad y especificidad, utilizar placas del medio a probar
estriando (estría cruzada) con asa para cada microorganismo de prueba de manera
que se obtengan colonias aisladas.

Prueba de selectividad.
Estriar usando un asa de 1 µl para cada microorganismo de prueba con una sola línea
recta en la misma placa paralelamente sin que se crucen las estrías. Deben ser
distinguibles para permitir la observación morfológica típica y tamaño de la colonia.
Incubar las placas bajo condiciones definidas en los métodos de prueba
correspondientes.

El crecimiento de las placas se evalúa como sigue:

 0 Corresponde a nulo crecimiento, completamente inhibido,
 1 Corresponde a crecimiento débil (aun cuando se reduzca el crecimiento o el
tamaño de la colonia), parcialmente inhibido.
 2 Corresponde a buen crecimiento

La calificación del microorganismo blanco debe ser 2 y tener apariencia, tamaño y

morfología colonial (especificidad) típica. Para las pruebas de selectividad dependerá
del grado de inhibición y de tipo de medio. El crecimiento para microorganismos no
blanco deber ser parcialmente inhibidos o completamente inhibidos.

Ejemplo: Evaluación de desempeño de agar XLD

Preparar suspensiones de aproximadamente 100 UFC como se indicó de los
siguientes microorganismos Salmonella Typhimurium, E. coli y Enterococcus faecalis
Estriar de la suspensión de Salmonella Typhimurium una placa de XLD por estría
cruzada. En otra placa de XLD inocular E. coli utilizando un asa de 1 µl haciendo una
línea recta, inocular Enterococcus faecalis con otra asa de 1 µl haciendo otra línea
recta paralela a la primera. Incubar a 36 °C +/- 1 °C por 24 h +/- 2 h y leer los
resultados.
5.- Investigue y llene el siguiente cuadro del análisis microbiológico que se realiza a diferentes grupos de alimentos.

Criterio
Preparación de
Grupo de microbiológico
Bacterias Diluyente la muestra para Análisis microbiológico
alimentos (UFC/G O ML)
su análisis
m M
Carnes Aerobios Agua Para Si se trata de alimentos líquidos o material 106 107
Mesófilos (30 peptonada homogeneizar el que fluya libremente, el recipiente debe
°C) alimento si se agitarse hasta que su contenido sea
utiliza licuadora homogéneo. Con el fin de asegurar un
o Stomacher. reparto uniforme de microorganismos,
Se pesa 10 g de mezclar cuidadosamente invirtiendo el
muestra y se recipiente varias veces. Igualmente es posible
añade 90 ml de agitar la muestra mecánicamente, si se
diluyente y se obtiene el mismo resultado. Si el recipiente
homogeneiza. esta completamente lleno, transferir a otro
Se hace las recipiente esterilizado y continuar con el
diluciones procedimiento. Si el recipiente es demasiado
correspondientes grande para manejarlo convenientemente,
deben tomarse muestras con tubos de
muestreo o toma-muestras, asegurándose de
que las mismas sean representativas del
producto o muestra. NB 32002 7 En el caso
de productos embotellados como refrescos,
cerveza, aguas minerales; productos
enlatados líquidos y otros similares, lavar y
desinfectar antes de la homogeneización el
envase de la muestra. Tomar 25 ml ó 50 ml
de muestra y mezclar con 225 ml ó 450 ml
respectivamente del diluyente
Escherichia Coli Agua Se tomó 1ml de cada dilución y se procedió
peptonada al sembrado por el método de vertido en
placa por triplicado.
Se procedió a preparar caldo de cultivo agar
Chromocult, adicionando 18-29 ml de agar
Chromocult homogenizando la muestra con
movimientos en forma de ocho, dejando
solidificando durante 10 min
Posteriormente se incubaron las placas en
forma invertida a una temperatura de 35
-37°C por 18-24 horas en la incubadora
Luego de la incubación se precedió a
cuantificar las colinas bacterianas utilizando
un contador de colonias
Salmonella sp Caldo lactosa La detección de Se transfirió asépticamente la mezcla Ausencia/25
Salmonella sp., homogeneizada a un recipiente estéril de g
se basó en la boca ancha, tapón de rosca (500 ml) u otro
metodología del recipiente apropiado, se dejó reposar 60 ± 5
Manual Analítico min a temperatura ambiente, luego se ajustó
Bacteriológico el pH a 6,8 ± 0,2. Se desajustó la tapa del
(BAM) recipiente 1/4 de vuelta y se incubo la mezcla
(FDA/CFSAN, de muestra durante 24 ± 2 h a 35 °C.
2001). Se
pesaron
asépticamente
25 g de muestra
en un
Erlenmeyer
estéril de 500 ml,
se añadieron
225 ml de caldo
lactosa estéril y
mezclaron 2 min
 con un agitador
magnético.
Derivados Aerobios Agua 106 107
cárnicos mesofilos (30° peptonada
C)

Escherichia coli Agua

peptonada
Staphylococcus Agua
aureus peptonada

Clostridium Agua
perfringens peptonada

Salmonella sp. Agua

peptonada

Pescados Agua de Se pesó 10 g de De cada una de las diluciones se tomó 0.1 ml 106 ufc / g
estafilococos peptona salina la muestra, para y se sembró sobre la superficie seca de agar
coagulasa luego mezclarla Baird y/o Chapman, y con ayuda del asa de
positivo y homogenizarla dilgarky se esparció el inóculo sobre la
con 90 ml de superficie del medio. Se incubó las placas
agua peptonada invertidas a 35°C durante 30 a 48 horas,
0,1% a 30% en luego, con círculo opaco y rodeadas de un
un vaso de lado claro transparente, se contabilizó para
licuadora estéril. realizar la prueba de la coagulasa.
Se transfirió el
homogenizado Prueba confirmatoria
en un matraz Al total de las colonias contabilizadas se le
estéril y se dejó sacó la raíz cuadrada, y a la cifra resultante se
reposar durante le realizó dicha prueba. De ser el caso de que
 5 minutos, la cifra producto de la raíz cuadrada salga
obteniéndose menor de 5, se tomó de todas maneras 5
así la dilución colonias. De las colonias elegidas se sembró
104. Luego se en caldo BIII por 24 horas a 37°C, para luego
tomó 1ml de examinar los tubos y verificar la presencia de
esta dilución y coágulos. En caso de que en este tiempo la
se transfirió a un prueba fuera negativa se continuará la
tubo incubación hasta las 24 horas.
conteniendo 9
ml de agua
peptonada de la
misma
concentración
anterior,
teniendo de esta
manera la
dilución 102; de
igual manera se
procedió en la
dilución 103.
Agua de idem A partir de los tubos positivos se inoculó 103 ufc / g
peptona salina mediante una asada a tubos que contienen 9
ml de BRILA y a los tubos con 5 ml de agua
triptonada. Una vez inoculadas se incubó a
44°C, en baño maría, durante 24 a 48 horas.
E.coli A los tubos que después de esta incubación
presentaron formación de gas e indol en las
campanas de Durham, se les consideró como
positivos. A partir de cada uno de estos se
sembraron por estría en placas individuales
que contenían agar AMB. Estas placas se
llevaron a incubación a 37°C por 24 horas.
Luego de este tiempo, las placas con colonias
 características con brillo metálico pasaron por
la prueba de IMVIC. Previamente dichas
colonias se sembraron con TSA.
Agua de idem Para la preparación de la muestra se pesó 25 Aus. /25 g
peptona salina g de la muestra para 225 ml de agua
Salmonella peptonada bufferada a 30°C, se dejó incubar a
Shigella 37°C por 24 horas, luego se transfirió 1m. del
cultivo a 10 ml de caldo de cultivo Rapapport
Vassiliadis, dejándose incubar a 43°C por 24
horas. A partir de estos cultivos se realizaron
aislamientos en placas con agar SS y XLD,
para ser incubadas a 37°C por 24 horas. Si se
encontraba colonias sospechosas de
salmonella se realizaba pruebas bioquímicas
en ISI.LIA.UREA.
Mariscos V. Agua de Se pesan 3 Se prepara un medio de cultivo selectivo agar 102 103
parahaemolyticus peptona salina gramos de con tiosulfato, citrato, sales billiares y
camarón y se sacarosa, que es el medio que se prefiere
añade a tubos para el aislamiento. Incubar las cajas Petri por
que contienen 24 h y hacer el recuento
10 ml de agua
estéril y se
realiza las
diluciones
correspondiente
s

Caldo lactosa En el caso de c. Añadir al cultivo anterior un volumen de Ausencia/

huevos enteros, caldo RV de doble concentración. Incubar a 25g
Salmonella sp. lavar la cáscara 42,5ºC durante 16-18 hs. d. Con un asa
con una sembrar en estrías el cultivo anterior sobre
 solución al 0,1% placas de agar XLDN. Incubar 18-24 hs a
de dodecil- 37ºC. Observar las colonias negras con halo
sulfato de sodio rojo. CALDO RV. Peptona de soja 9 g, cloruro
Huevos y y desinfectar de sodio 14,2 g, fosfato monopotásico 2,8 g,
derivados con una dilución cloruro de magnesio hexa-hidratado 72 g,
al 8% de verde de malaquita oxalato 0,072 g, agua
lavandina destilada 1 L. Esterilizar 120ºC durante 15
comercial minutos. AGAR XLDN. Extracto de levadura 3
(hipoclorito de g, L-lisina.HCl 5 g, xilosa 3,75 g, lactosa 7,5 g,
sodio 5,25%) sacarosa 7,5 g, Na desoxicolato 2,5 g, cloruro
recién de sodio 2,5 g, tiosulfato de sodio 6,8 g, citrato
preparada. férrico amónico 0,8 g, rojo fenol 0,08 g, agar
Cascar y pesar 15 g, agua 1 L. Una vez fundido y enfriado a
el contenido en 50ºC, agregar 10 mL de solucion filtrada por
condiciones de membrana (poros de 0,2 µm) de novobiocina
asepsia. al 0,1%. No esterilizar en autoclave (3, 12).
b. Agregar 25 g
de muestra a
225 mL de
diluyente en una
bolsa plástica
estéril y
homogeinizar en
un ‘masticador’
durante 2
minutos, o en un
frasco con 20
perlas de vidrio
estériles de 2
mm de diámetro
y mezclar
mediante
agitación
 mecánica o
manual. Tomar
tantas unidades
de 25 g como
sean
necesarias.
Incubar 4- 6 hs
a 30ºC.

Lecha y Aerobios Agua Con el fin de Una vez preparadas las diluciones, se pipeteó 5x105 106
derivados mesófilos peptonada asegurar un por duplicado en placas Petri, alícuotas de
reparto uniforme 1mL de las diluciones 10-1 ,10-2 , 10-3 , 10-4 ,
de 10-5 y una alícuota de 0,1 mL de la dilución
microorganismo 10-5, lo que supuso la siembra por placa de
s, mezclar 10-1 a 10-6 gramos de alimento. Se fundió el
cuidadosamente agar para recuento en placa y se mantuvo en
la muestra, baño maría a una temperatura de 44°C ± 2, y
invirtiendo el se controló cuidadosamente su temperatura
recipiente varias para que al ser mezclado con la dilución del
veces. alimento no sean inactivados los
Igualmente es microorganismos. Luego vertimos
posible agitar la inmediatamente en las placas Petri 10 mL –
muestra 15 mL del medio fundido y templado. El
mecánicamente, periodo de tiempo transcurrido entre la
si se obtiene el realización de las diluciones y el vertido del
mismo medio no superó los 20 minutos. Después, se
resultado. El mezcló el inóculo con el medio fundido,
tiempo inclinando y girando las placas de la siguiente
transcurrido manera: se imprimió a la placa movimientos
desde la mezcla de vaivén 5 veces en una dirección, luego se
hasta la toma hizo girar 5 veces en sentido de las agujas del
para ensayo no reloj, después se volvió a realizar movimientos
debe ser de vaivén en una dirección que forme ángulo
 superior a 3 min.
recto con la primera y finalmente se giró 5
Tomar 25 ml ó veces en sentido contrario a las agujas del
50 ml de
reloj. Con el fin de controlar la esterilidad se
muestra y
preparó una placa del medio y el diluyente sin
homogeneizar inocular. Una vez que solidificado el agar, se
con 225 ml ó invirtieron las placas para posteriormente
450 ml
incubarlas a 30 ± 1°C durante 48 ± 3 horas.
respectivamente Se eligieron dos placas correspondientes a
del diluyente
una dilución que presenten entre 30 y 300
más colonias, para realizar este recuento se utilizó
conveniente un contador de colonias y se procedió a dar el
yrealizar las
valor obtenido como el recuento estándar en
diluciones placa. El valor obtenido como recuento
estándar en placa en UFC /mL, fue igual a la
media aritmética de dos valores por el factor
de dilución.
Grasas Aerobio mesofilo Agua 25 g muestra en Para esta determinación se utilizó el medio de 102 103
comestibles peptonada 225 g de cultivo agar tripticasa de soya. Se realizó la
diluyente y siembra por el método de vertido en placa y se
homogeneizar incuban de 35+-2°C por 48 h

AGUA idem Se utilizo el agar saboraud con la siembra por 10 102

Mohos PEPTONADA el método de vertido enplaca y se incuba a 25
°C +- 2 °C durante 8 dias

idem idem Se incuban las diliuciones preparadas a 35-37 10 102

°C durante 48 h para continuar con la siembra
Coliformes por el método de extensión en placa utilizando
el medio EMB y se incubó a temperatura 35-
37°C por 48 h
 idem idem El medio de cultivo es el agar baird Parker. La 10 102
Staphylococcus incubación se realiza a 35-37 °C durante 48 h
aureus para continuar con la siembra por el método
de extensión en placa utilizando el medio EMB
y se incubó a temperatura 35-37°C por 48 h
Cereales Mohos Se usará para Sembrar en sendas placas del medio de 104 105
cereales en cultivo con 0,1 mL de las diluciones decimales
grano, del alimento (comúnmente 10-2 a 10-6) y
almendras, extender el inóculo con una varilla de vidrio
nueces, etc. Se doblada en L. Incubar a 30ºC durante 24 hs.
toma Si es necesario incubar otras 24 hs. Observar
asépticamente las colonias redondas, chatas, secas, de color
25 g ó 50 g de rosado a violeta pues no ha sido fermentado
muestra y se el manitol, rodeadas de un precipitado
mezcla con 225 causado por la actividad lecitinasa. Repicar 5
ml ó 450 ml colonias en agar nutritivo e incubar a 30ºC
respectivamente durante 24 hs. Colorear las preparaciones;
de los diluyentes observar el endosporo verde, central a
Solución diluida subterminal, que no deforma la célula y los
de trabajo) y se glóbulos pseudolipídicos dentro del citoplasma
homogeneiza en teñido de azul obscuro. AGAR MYP. Extracto
licuadora de carne 1 g, peptona 10 g, D-manitol 10 g,
cloruro de sodio 10 g, rojo de fenol 0,025 g,
agar 15 g, agua 900 mL. Distribuir en
porciones de 200 mL Esterilizar a 120ºC
durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC, agregar 10
mL de la emulsión de yema de huevo y 2 mL
de la solución de polimixina. SOLUCIÓN DE
POLIMIXINA. Disolver 500.000 unidades de
sulfato de polimixina B estéril en 50 mL de
agua destilada estéril. COLORACIÓN DE
ENDOSPOROS Y GLOBULOS DE
POLIHIDROXIBUTIRATO.. Cubrir con verde
 de malaquita al 5% y calentar dos o tres veces
sin que se seque. Lavar, secar con papel y
cubrir durante 20 minutos con solución de
negro Sudan B al 0,3% en etanol al 70%.
Volcar y cubrir con xileno durante 10
segundos. Secar y colorear con safranina al
0,5% durante 20 segundos (2).
Aerobios 104 105
mesófilos

Leguminosas

103 104

Mohos

Coliformes 102 103

102 104

Bacillus
cereus
 Ausencia/
25 g
Salmonella sp.

Harinas y Agua La extracción de Las placas Compact Dry YM son un medio 104 105
derivados Mohos peptonada la muestra debe cromogénico listo para uso en el recuento de
realizarse en un mohos y levaduras que contiene medio de
ambiente seco y cultivo deshidratado y un agente gelificante
exento de polvo soluble en agua fría en una matriz no tejida de
y olores, lo más tela. El medio es hidratado cuando se inocula
rápidamente con la muestra, y por acción capilar se difunde
posible, la muestra de manera uniforme sobre la matriz
procurando para formar un gel. Debido a que estas placas
reducir al contienen el sustrato cromogénico, 5-bromo-6-
mínimo el cloro-3-indoxilo fosfato (X-Phos) que produce
tiempo que el un color azul-verde cuando se utiliza por la
producto a ser mayoría de especie de mohos y levaduras. El
ensayado pH final es de 5,5 +0,3 a 25 ° C. (Lab. Microkit,
permanezca en 2007)
contacto con el
aire. Se mezcla
la muestra
invirtiendo el
envase
repetidas veces,
también se
puede transferir
el polvo a un
frasco limpio
bien seco y
 estéril de
capacidad dos
veces el
volumen de la
muestra. Pesar
25 g ó 50 g de
muestra y
suspenderla a
225 ml ó 450 ml
respectivamente
del diluyente
adecuado
idem idem La determinación de microorganismos 10 102
coliformes totales por el método NMP, se
Escherichia Coli fundamenta en la capacidad de este grupo de
microbiano de fermentar la lactosa con
producción de ácido y gas al incubarlos a
35°C durante 24horas, utilizando un medio de
cultivo que contenga sales biliares. Esta
determinación consta de dos fases, la fase
presuntiva y la fase confirmativa. (NOM, 2009)
En la fase presuntiva el medio de cultivo que
se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el
cual permite la recuperación de
microorganismos dañados que se encuentren
en la muestra y que sean capaces de utilizar
la lactosa como fuente de carbono. Durante la
fase confirmativa se utiliza como medio de
cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el
cual es selectivo y solo permite el desarrollo
de aquellos microrganismos capaces de
tolerar tanto las sales biliares como el verde
brillante. La determinación del NMP de
 microorganismos coliformes fecales se realiza
a partir de los tubos positivos de la prueba
presuntiva y se fundamenta en la capacidad
de las bacterias para fermentar la lactosa y
producir gas cuando son incubados a una
temperatura de 44.5°C en 24h a 48 horas.
(Lopéz, 2011)
idem idem Las placas Compact Dry TC son un medio 103 104
Aerobios cromogénico lista para uso en análisis de
mesófilos recuento de bacterias aeróbicas totales
viables, contiene medio de cultivo
deshidratado y un agente gelificante soluble
en agua fría en una matriz no tejida de tela. El
medio es hidratado cuando se inocula la
muestra, y por acción capilar se difunde la
muestra de manera uniforme sobre la matriz
para formar un gel. Las colonias que crecen
se vuelven de color rojo debido al indicador
redox, cloruro de triphenlytetrazolium (TTC). El
pH final es de 7,0 + 0,2 a 25 ° C (Lab. Microkit,
2007)
Frutas y Agua Las frutas La determinación de Escherichia coli en agua 102 103
derivados Escherichia coli peptonada fueron se realizó por la técnica de fermentación de
procesadas tubos múltiples (Número Más Probable/100
según lo mL), según la norma: NC 93-11/1986. La
establecido en calidad microbiológica del agua se evaluó
la Norma teniendo en cuenta el criterio: Escherichia coli
COVENIN N° = 103. 10
1126-89 para
muestras
sólidas [17]. Se
pesaron 25 g de
cada tipo de
 fruta y se
colocaron en
una bolsa
plástica estéril.
Posteriormente
se adicionaron
225 mL de agua
peptonada al
0,1% y se
procedió a
triturar su
contenido
ejerciendo
presión manual
hasta obtener
una mezcla
homogénea,
tomándose la
solución
resultante como
una dilución
1:10, a partir de
la cual se
prepararon
diluciones 1:103,
1:105 y 1:106,
empleando el
mismo
diluyente.
idem idem Para el aislamiento e identificación Ausencia/
Salmonella sp. de Salmonella spp, se procedió según la 25 g
Norma COVENIN N° 1291-88 [20]. Las
muestras fueron procesadas en varias etapas:
a) Pre-enriquecimiento: se pesaron 25 g de
cada una de las frutas a los cuales se
añadieron 225 mL de agua peptonada estéril
al 0,1%, los 225 mL de la mezcla obtenida
fueron transferidos a tubos estériles e
incubados a 35-37°C por 24 horas con la tapa
floja; b) Enriquecimiento: después del periodo
de incubación en caldo de pre-
enriquecimiento, se trasfirió 1 ml del cultivo a
tubos con 10 mL de caldo tetrationato estéril e
incubados a 35-36°C por 24 horas; c)
Aislamiento: se transfirió una asada del medio
de enriquecimiento selectivo, previamente
homogeneizado, a la superficie de placas de
agar Salmonella-Shigella (SS) y agar xilosa-
lisina-desoxicolato (XLD); las placas se
incubaron invertidas a una temperatura de 35-
37°C durante 24 horas. Al final de la
incubación se observaron las placas para
determinar la presencia de colonias
presuntivas de Salmonella spp., que se
caracterizan por ser claras o incoloras con o
sin centro negro, procediéndose luego a la
realización de las pruebas bioquímicas
preliminares, mediante la siembra de dos o
más colonias típicas en los medios Kliger y
LIA (Agar Lisina Hierro) haciendo la
inoculación en profundidad y en la superficie
siguiendo un trazo longitudinal. Estos tubos
fueron incubados a 35-37°C por un período de
24 horas. Al final de la incubación se
observaron los resultados de las pruebas, y
los cultivos sospechosos de Salmonella spp.,
 fueron aquellos que presentaron un Kliger con
bisel alcalino y taco ácido con o sin producción
de sulfuro de hidrógeno, que se manifestó por
el ennegrecimiento total o parcial del agar.
Posteriormente, a partir de estos cultivos se
realizaron pruebas bioquímicas confirmatorias
mediante la inoculación de caldo malonato,
caldo urea, agar citrato, gelatina y agar
fenilalanina.
Hortalizas y Escherichia coli buffer triptona Para la De cada una de estas diluciones se inoculó 1 102 103
verduras 0,1% cuantificación mL en una serie de 3 tubos con 9 mL de caldo
de E.coli, se lauril triptosa (OXOID) en campana Durham,
pesaron 25 g de incubándose por 48 h a 35 °C.
la muestra, a la Posteriormente, los tubos que mostraron
cual se le turbidez y gas, se reinocularon en tubos con
agregaron 225 caldo EC-MUG (OXOID), que se incubaron a
mL de buffer 44,5 °C por 24 h. Se consideraron positivos
triptona 0,1% y los tubos que mostraron turbidez, gas y
se homogenizó fluorescencia con luz UV.
por 3 min a 230
rpm (Stomacher
400 Circulator
Seward). A
partir de esta
dilución inicial
(10-1) se
realizaron
diluciones
seriadas
decimales de
10-2 y 10-3.
idem idem Para la detección de Shigella, se pesaron 25 Ausencia/
Salmonella sp g de la muestra, la cual se incubó con 225 mL 25 g
 de caldo GN (Hajna-BBL) y se homogenizó
por 3 min a 230 rpm (Stomacher 400
Circulator Seward). Luego, muestras y
controles se incubaron a 37 ºC por un período
de 20 h. Posteriormente, se inocularon en
agar T7 agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) y
agar desoxicolato citrato (DC) (OXOID) y se
incubaron por 24 horas a 35 ºC. La lectura se
realizó por presencia de UFC similares o
sospechosas de Shigella.

Para Salmonella, se pesaron porciones de

25 g de lechuga, a las cuales se les agregó
225 mL de caldo lactosado (OXOID). Luego
de una incubación por 24 h a 35 ºC, se cultivó
en caldos tetrationato (T) y Rappaport
Vassidialis (RV).

Las muestras y controles se incubaron a 35

ºC por 24 h, con posterior inoculación en agar
XLD, Hektoen (HK) y sulfito de bismuto (SB)
(OXOID). Las placas se incubaron por 24 h a
35 ºC y luego se realizó lectura de UFC
sospechosas.

Edulcorantes 102 103

naturales y
derivados Aerobios
mesófilos
 <10 10

Mohos

<50 50

Levaduras

Condimento Se mezcló Para Lactobacillus delbrueckii subsp. 104 5x10

4
s y especias cuidadosame bulgaricus, se mantuvo al medio MRS
nte el en baño de agua a 45ºC, se vertió 15
Aerobios contenido del mL del medio en placas Petri, se
Mesófilos recipiente de mezcló cuidadosamente el inóculo con
la muestra el medio por rotación de las placas, se
usando una colocó en una superficie fría para que
espátula. Se se solidifique la mezcla. Se incubó las
pesó 10 g ± placas Petri en posición invertida, en
0,1 g de la una jarra anaeróbicas en la incubadora
muestra de a 37ºC por 72 h.
ensayo en un
recipiente
disponible. Se
realizaron las
diluciones de
acuerdo con
la norma ISO
8261/IDF 122,
 y se transfirió
por duplicado,
1 mL de cada
dilución a
placas Petri
con una
pipeta estéril.
Conservas Prueba de Se usará para productos alimenticios Aceptación: Estéril Rec
animales y Esterilidad enlatados o embotellados, que fueron comercialmente hazo
vegetales Comercial(*) sometidos a un tratamiento de : No
esterilización durante el proceso de estér
elaboración. En este caso la il
investigación microbiológica se com
realizará sobre tres series de muestras ercia
paralelas del mismo lote. La primera lmen
serie será analizada al momento de su te
recepción al laboratorio. Se abre en el
interior de la campana estéril, con
todas las condiciones de asepsia
requeridas, luego se reemplaza la tapa
con la base de una caja de petri estéril.
La segunda serie será analizada
después de una incubación a 35 °C ±
2 °C durante 10 días. La tercera serie
será analizada después de una
incubación a 55 °C ± 2 °C durante 5
días. Posteriormente se procede al
procesamiento de la muestra según
procedimiento para alimentos de
esterilidad comercial.
Alimentos TSB La prueba en producto se siguió los 10 102
estimulantes lineamientos de la USP 39 NF 34, la
y derivados cual consistió en diluir y neutralizar la
Mohos se preparó la muestra para contar los
muestra y microorganismos presentes. En el
neutralizó su recuento total de microorganismos
actividad aerobios, la muestra diluida con Tryptic
antimicrobian Soy Broth (TSB), se transfirió a la
a. En este placa Petri de Tryptic Soy Agar (TSA)
estudio se y para el recuento total de mohos y
realizó la levaduras se transfirió a la placa Petri
preparación de Sabouraud Dextrose Agar (SAB)
diluyendo la (Farmacopea de los Estados Unidos,
muestra en 2016).
Tryptic Soy
Broth (TSB)
con lo cual se
neutraliza
también la
actividad
antimicrobian
a, y en
algunos
casos se usó
polisorbato 80
para la
neutralización
(Farmacopea
de los
Estados
Unidos,
2016).
Para la identificación de bacterias se 102 104
Bacillus procedió a realizar primero una tinción
cereus (*) Gram para la distinción de
Grampositivas y Gramnegativas y de
 la forma de las bacterias. Se visualiza
de manera mejor en los diagramas de
flujo en el Anexo E. Bacillus spp. De
las colonias que crecieron en el medio
TSA agar se hizo la tinción Gram, que
dio como resultados bacilos
Grampositivos. Los pasos siguientes
para la identificación fueron: Prueba de
la Catalasa Se colocó en un
portaobjeto limpio y seco una gota de
agua oxigenada de 30 volúmenes. Con
la ayuda de un palillo estéril se tomó
colonias del medio TSA donde se
encontraban estos bacilos. Luego se
homogenizó la muestra en la gota de
agua oxigenada. Se observó el
aparecimiento de burbujas dando
como resultado positivo. Siembra en
Agar MYP Para diferenciar que tipo de
Bacillus presentó el jarabe. Se
procedió a través de la técnica de
estriación en el agar MYP y se incubó
a 37 °C por 24- 48 horas. Si el
resultado es un crecimiento óptimo de
las colonias típicas de Bacillus cereus
de 5mm, son ásperas, rugosas y secas
con un fondo rosado brillante rodeado
por un precipitado de yema de huevo.
32 Si el resultado es un crecimiento de
10 – 300 ufc/ml de colonias cremosas
de Bacillus subtilis de color amarillo sin
zona de precipitado.
Platos Aerobios Se pesaron Se preparó la muestra por el método 105 106
preparados Mesófilos 25 g o 25 mL anterior.  Se pipeteó por duplicado en
de la muestra placas de Petri alícuotas de 1 mL de
en un las diluciones 10-2 , 10-3 , 10-4 . Se
recipiente aconseja esta serie de diluciones en
estéril, luego aquellos casos en que se desconoce
se procedió a el número aproximado de gérmenes
colocar la presentes en el alimento.  Se mezcló
muestra en el inoculo con el medio fundido y
225 mL de girando las placas de esta manera: (a)
diluyente, se se realizó a las placas movimientos de
homogenizó y vaivén 5 veces en una dirección, (b)
se dejó que luego se giró 5 veces en el sentido de
las partículas las agujas del reloj, (c) se realizó
grandes movimientos de vaivén en una
sedimenten, dirección que forme ángulo recto con
durante 15 la primera y (d) se giró 5 veces en
minutos. sentido contrario a las agujas del reloj.
 Una vez solidificado el agar, se
invirtió las placas y se incubó a 35 °C
durante 24 horas ± 2 horas.  Se
calculó el recuento estándar en placa
eligiéndose dos placas
correspondientes a una dilución, que
presenten entre 30 a 300 colonias. Se
obtuvo la media 68 aritmética de los
valores y se multiplicó por el factor de
dilución.  Los resultados que fueron
obtenidos se expresaron como
recuento estándar en placa por gramo
del alimento
idem idem Se colocaron las placas Petrifilm para 102 103
Coliformes el recuento de Coliformes / E. coli
sobre una superficie plana y lisa.  Se
 levantó la lámina superior y transfirió
por medio de una pipeta estéril 1 mL
de las diluciones decimales a cada una
de las dos placas Petrifilm,
colocándose en el centro de la lámina.
Dejar caer la lámina hacia abajo sobre
la muestra, evitar la formación de aire.
 Se colocó el esparcidor plástico
sobre el centro de la placa Petrifilm,
presionándose cuidadosamente y
distribuyéndose la muestra sobre el
área de crecimiento antes de que se
forme el gel. 69  Se removió el
aplicador de la placa Petrifilm y se
esperó que se gelatinice la placa. No
se deslizó el aplicador a través de la
lámina. Incubación  Se incubó las
placas en una posición horizontal, con
el área limpia hacia arriba y no más de
20 placas una sobre otra, por 24 horas
± 2 horas a 35 °C ± 1 °C, para el
recuento de coliformes totales.  Para
recuento de E. coli se incubó
adicionalmente 24 horas ± 2 horas (48
horas ± 4 horas) a 35 °C ± 1 °C.
idem idem Inoculación  Es el mismo 10 102
Staphylococc procedimiento del método anterior.
us aureus. Incubación  Se incubaron las placas
en una posición horizontal, con el área
limpia hacia arriba y no más de 20
placas una sobre otra, por 24 horas ±
2 horas a 35 °C ± 1 °C.
Escherichia idem idem Como confirmación de E. coli se 10 102
coli tomaron las colonias de color azul a
rojo-azulado asociados con formación
de burbujas de gas. Las colonias
azules sin gas no serán enumeradas
como E. coli.  El recuento total de
coliformes consistió en enumerar las
colonias rojas y azules asociadas con
gas en 24 h. Las colonias no
asociadas con gas no fueron
enumeradas como coliformes totales.
idem idem Pre – enriquecimiento no - selectivo  Ausencia/25 g
Salmonella Se preparó la suspensión inicial
sp. añadiéndose 25 gramos de la muestra
a 225 mL de Agua Peptona
Tamponada.  Se incubó la
suspensión inicial a 37 °C ± 1 °C por
18 a 24 horas a 35 °C – 37 °C.
Enriquecimiento selectivo  De la
suspensión inicial obtenida, se
transfirió 10 mL a un matraz que
contenía 90 mL de Caldo Tetrationato.
 Se incubó el Caldo Tetrationato a 43
°C ± 0.05 °C por 24 horas. 72 Siembra
en Placa en Medio de Agar Selectivo
para Salmonella  Del Caldo
Tetrationato se tomó un asa de 5 mm
para el sembrado en la superficie de
una placa de medio agar selectivo de
Agar SS y extender de tal manera que
se obtengan colonias aisladas. Se
incubaron las placas de Agar SS
durante 24 horas a 35 °C – 37 °C. 
Las colonias típicas de Salmonella son
 de color grises a negro, con un halo
transparente, a veces con un brillo
metálico. Confirmación bioquímica 
Se hizo el uso de medios de cultivo
como: agar citrato de SIMMONS, agar
hierro lisina (LIA), agar hierro triple
azúcares (TSI), agar SIM, caldo Urea e
Indol.
Aguas y
hielo
Todo se realiza con material estéril y <2,2
Coliformes bajo condiciones de seguridad bajo la
campana de flujo laminar y entre
mecheros de gas tipo bunsen. Con
base a lo que marca la Norma Oficial
Mexicana NOM-127-SSA1-1994 se
hizo análisis de las muestras de agua
aplicando las pruebas: a) presuntiva,
b) confirmativa y c) completa, de
microorganismos coliformes totales,
coliformes fecales y Escherichia coli,
posteriormente se consultan las tablas
del número más probable y así se
determinó el NMP
Helados agua Las muestras en Agar Plate Count a 30°C 104 105
Aerobios peptonada al se
mesófilos 0,1% descongelaro
n a 40°C por
15 minutos.
De cada
unidad
muestra se
midieron 10
 ml. y se
preparó la
dilución 10-1
con 90 ml de
agua
peptonada al
0,1%. A partir
de esta
primera
dilución, se
realizaron
diluciones
decimales en
agua
peptonada al
0,1% hasta
10 -3.
idem idem en Caldo Lauril Sulfato, para la prueba 10 102
presuntiva, y en Caldo Lactosa Bilis
Coliformes Verde Brillante para la confirmación, a
35 ºC y Caldo EC a 44ºC,
respectivamente
idem idem en Agar de Baird Parker con 10 102
Staphylococc incubación a 35º y confirmación de las
us aureus colonias sospechosas con la prueba
de la coagulasa

idem idem mohos y levaduras en Agar Papa Ausencia/25 g

Salmonella Dextrosa a pH 3,5 con Ácido Tartárico
sp. al 10%, incubando a 25ºC

Listeria idem idem mohos y levaduras en Agar Papa Ausencia/25 g

monocytogen Dextrosa a pH 3,5 con Ácido Tartárico
 es al 10%, incubando a 25ºC

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