1. Describa los principios generales de extracción de ADN.

Los métodos de extracción de ácidos nucleicos se clasifican en:

Métodos convencionales:

• Tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo.
• Extracción alcalina.
• Método de extracción CTAB.
• Centrifugación en gradiente de bromuro de etidio-cloruro de cesio.
• Purificación de ARN Poli (A) por cromatografía de celulosa de oligo (dT).

Extracción en fase sólida:

• Matrices de sílica.
• Partículas de vidrio.
• Tierra de diatomeas.
• Perlas magnéticas.
• Material de intercambio aniónico.

Los pasos generales para la extracción y purificación de ADN se pueden dividir en dos
procedimientos fundamentales:

Extracción:

• Lisis de las células que contienen a los ácidos nucleicos.

• Inactivación de nucleasas.
• Clarificación: separación de los ácidos nucleicos de los restos celulares.

Purificación:

• Purificación de otros ácidos nucleicos no deseados.

• De lípidos y carbohidratos.
• De sales y otros compuestos orgánicos.

El primer paso para la extracción de los ácidos nucleicos: es la rotura o lisis de las
células que contienen el ácido nucleico. Para que la lisis celular se realice
adecuadamente, es necesario emplear la fuerza adecuada en post de romper el material de
inicio, ya sean células o tejidos, y la delicadeza necesaria para preservar las moléculas de
interés (ADN y ARN).

La lisis celular para la extracción de ácidos nucleicos se puede realizar mediante métodos
mecánicos y métodos no mecánicos:

Métodos mecánicos:

• Molienda manual en mortero.

• Congelación y descongelación.
• Ultrasonidos.

Métodos no mecánicos:

• Empleo de agentes químicos, fundamentalmente detergentes como el CRAB y el

SDS.
• Enzimáticos: empleo de proteasas (lisozima, gluconasas, peptidasas) y ARNasa.

Métodos convencionales

Extracción con tiocianato de guanidino-fenol-cloroformo (método de Chomczynski)

La extracción de ácidos nucleicos empleando una solución del agente caotrópico de

tiocianato de guanidina genera lisis celular y degradación de proteínas con la consecuente
liberación de ácidos nucleicos. Posteriormente, se emplean solventes orgánicos como el
fenol-cloroformo que permiten la separación del ácido nucleico de restos de lípidos y
proteínas. Finalmente el empleo de etanol o isopropanol favorece la precipitación de los
ácidos nucleicos.

Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina

Este método se emplea fundamentalmente para la extracción de ADN plasmídico de

E.coli. Se basa en las diferencias en la desnaturalización y renaturalización del ADN
plasmídico y el ADN cromosómico al aplicar NaOH en presencia de un detergente
fuertemente aniónico como el SDS (dodesilsulfato de sodio) y el acetato de potasio.

Método de extracción CTAB

Está indicado en la extracción de ADN de vegetales, pues es efectivo a la hora de eliminar
los polisacáridos y los compuestos fenólicos que dañarían al ADN. Las células vegetales
pueden romperse empleado el detergente iónico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB),
que forma un complejo Insoluble con los ácidos nucleicos en medio hiposalino.

Centrifugación en gradiente de bromuro de etidio-cloruro de cesio

Este método, que se emplea para la preparación de ADN plasmídico, requiere cultivos
bacterianos a gran escala. Separa el ADN plasmídico superrenrrollado del ADN plasmídico
circular que está en estado relajado, concentrándolos por centrifugación en un gradiente de
bromuro de etidio-cloruro de cesio.

Purificación del ARN Poli (A) por cromatografía de celulosa de oligo (dT)

El ARNm de las células eucariotas difiere de otras especies de ARNm en que contiene en el
extremo 3’ una extensión de aproximadamente 200-3000 residuos de adenina, en una
secuencia que se denomina cola de poli A.

Cromatografía:

Permite separar el conjunto de los ARNm celulares de otros ácidos nucleicos, ya que, los
ARNm quedarán retenidos en la columna, debido a la hibridación entre las colas de poli A
y los oligómeros de poli T que contiene la resina cromatográfica.

Extracción de ácidos nucleicos en fase sólida

La extracción de ácidos nucleicos en fase sólida logra una Purificación más rápida y eficaz
que en el caso de los métodos convencionales. Hay que tener en cuenta que los sistemas de
fase sólida absorberán los ácidos nucleicos en el proceso de extracción en función del
contenido en sales del buffer y del pH.

2. Diga usted para que se utilizamos detergente en el procedimiento.

El detergente utilizado en el experimento tiene como función destruir las membranas

celulares del tejido vivo que estamos utilizando. El detergente disuelve las grasas o lípidos,
que es el componente principal de la membrana plasmática y nuclear de las células (es el
mismo principio por el que el gel limpia las grasas de nuestra piel). Al romperse las
membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior.

3. Diga usted para qué utilizamos alcohol en el procedimiento.

El alcohol disminuye la constante dieléctrica de la solución acuosa. El etanol frio provoca

que el ADN se separe del agua y precipite. Cuando el ADN se separa de la solución acuosa,
tiende agruparse, lo que hace que sea visible. Las largas cadenas del ADN se enrollarán
alrededor de la varilla al revolver la interfase entre las dos capas:

 ADN: material genético que conseguimos en todos los seres vivos, desde bacterias
hasta mamíferos, se encuentra en el núcleo de los organismos eucariotes y en los
cloroplastos y mitocondrias.
 Cromosomas: son la forma de empaquetar la información genética del ADN dentro
de la célula.
4. Diga usted qué tipo de enzimas contienen los suavizadores de carne y el jugo de
piña y para qué los utilizamos en este experimento.

La piña es una fruta tropical de la familia de las bromeliaceae fundamental para

complementar la dieta de los mexicanos, ya que es rica en vitaminas A, B, C y tiene
actividad proteolítica debida a la bromelina que se activa por la cisteína, tiosulfato y
glutatión. La bromelina y otras cisteínas proteasas son enzimas bien conocidas presentes en
diferentes partes de la piña, sobre todo en la cáscara y corona. (Ketnawa, 2012) Se ha
demostrado que la bromelina debe su actividad proteolítica a un grupo sulfihidrilo (-SH)
propio de una cisteína-25, asemejando su actividad a la de la papaína, enzima activa de la
papaya. (Clavijo, 2012)

La bromelina es una glicoproteína del grupo de las cisteínas que actúa sobre los
aminoácidos básicos y aromáticos de las proteínas. Su pH óptimo varía con el sustrato y
oscila en un rango de 5 a 8. Debido a sus características, la bromelina es utiliza en la
industria cárnica (ablandador de carnes), panificación (prevención de encogimiento de la
masa), complemento alimenticio y como fármaco (aumento de absorción de medicamentos,
regulación de desórdenes digestivos, enfermedades virales, propiedades antiinflamatorias y
antitumorales en resumen la bromelina, es una enzima proteolítica que rompe moléculas y
degrada el AND.

5. Diga usted cuántos usos se le puede dar al ADN una vez extraído.

6.¿Diga usted que relevancia tiene el ADN en el diagnóstico clínico?

El análisis de ADN es una herramienta que se utiliza de forma rutinaria en la investigación

biomédica, aportando no solo conocimiento sobre la genética del organismo y su papel en
determinadas enfermedades, sino también importantes aplicaciones médicas que abarcan
desde el diagnóstico prenatal, a conocer la susceptibilidad de padecer determinadas
enfermedades, así como pruebas clínicas con valor diagnóstico, predictivo y terapéutico.
Enfermedades hereditarias: Se analiza el ADN de los diferentes componentes de la
familia para saber si son portadores de los genes que confieren la susceptibilidad o la
seguridad de sufrir una determinada enfermedad y, en caso de que el resultado sea positivo,
se les somete a un estrecho seguimiento médico que permitirá adoptar medidas preventivas.

Diagnóstico prenatal: La amniocentesis o la biopsia corial son pruebas que se realizan en

embarazos considerados de riesgo cuyo objetivo es identificar mediante el análisis del ADN
determinadas anomalías cromosómicas que pudieran determinar que el feto sufriera algún
tipo de malformación o anomalía congénita.

Diagnóstico de enfermedades: Cada vez son más las enfermedades a las que se asocian
alteraciones genéticas concretas, ya sea como causa o como factor de riesgo, y que no son
necesariamente hereditarias, sino que se producen por la interacción con el medio
ambiente: alzheimer, parkinson, cáncer, etc. En estos casos el análisis de ADN puede tener
un valor determinante a la hora de confirmar el diagnóstico.

7. Diga usted cuáles son las funciones biológicas del ADN?

1) Almacenamiento de información (genes y genoma).

2) Codificación de proteínas (transcripción y traducción).
3) Su autoduplicacion (replicación del ADN) de esta manera asegurando la transmisión
de la información a las células hijas durante la división celular.
4) Controla la actividad de las células
5) Permite la capacidad de mutación (cambios evolutivos).

8. Diga usted cuáles son las diferencias en cuanto a la extracción de ADN y ARN.

ADN ARN
La molécula de ADN menos reactiva y La molécula de ARN es menos estable.
mucho más estable y sólo se requiere
mantener las muestras congeladas antes de
su extracción.
 Inicialmente es necesario llevar a cabo una Primero es necesario agregarle una
lisis para liberar al ADN del interior solución que estabilice al ARN lo antes
celular, para lo cual se utilizan los posible.
buffers de extracción.

Como el etanol precipita también al ARN Degradación de ADN por DNAsa I:

(por que son polimeros muy similares) se proceso que rompe específicamente
debe colocar una RNAsa, el cual rompe el cadenas ADN con el fin de evitar
ARN con el fin de dejar solo ADN. contaminación de este material.

9. Explique usted por que la cocentracion de ADN se mide a 260nm.

El ADN tiene la peculiaridad de presentar absorbancia específica con un determinado tipo
de luz UV a 260nm de longitud de onda, dicha absorbancia es proporcional a la cantidad de
ADN presente.
Tener un aparato espectrofotómetro que mida la absorbancia obtenida en una muestra con
ADN, traduce  la cantidad de ADN presente y su concentracion. Así es como se cuantifica
el ADN presente para determinar la pureza del ADN ya que su absorbancia esta entre
A260nm y A280nm y su proporción es aceptada a 1.8.

10. Indique usted qué tipo de contaminantes podemos encontrar en un extracto de

ADN?

La contaminación del ADN requiere de cinco momentos en los que puede producirse de
manera exógena:

Durante la deposición del resto, por traspaso de ADN entre organismo próximos.

Durante la excavación por personal arqueológico.

Durante el depósito en un museo por el personal encargado de la conservación.

Durante el análisis genético en el laboratorio por el personal investigador o por material
genético extraído y/o amplificado con anterioridad en el mismo lugar.

Además, así como encontramos ADN en la muestra, también se encuentran contaminantes

tales como proteínas o fenol residual que pueden incurrir en un falso positivo. Es decir, la
absorbancia a 260 nm no es específica para ADN.

11. Explique usted por que la medicion de una muestra de ADN a 260/280 nos da
información sobre la pureza de la muestra.

Porque la información que se da es mediante la espectrofotometría y se puede determinar la

concentración y la pureza de una muestra de ADN basándose en la capacidad de
absorbancia sobre un compuesto presente en una solución a una longitud de onda
determinada.

De este modo la concentración de la muestra de ADN se calcula teniendo en cuenta el valor

de absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260nm. Mientras que la relación de
absorbancia A260/280 y A260/230 se utilizan para evaluar la pureza de las muestras.

La relación A260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza optima tiene
un valor entre 1.8 – 2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relación
A260/280 > 1.6-1.7. Un valor A260/280 < 1.6 indica ADN contaminado una posible
contaminación por compuestos aromáticos como fenoles y proteínas. Un radio A260/280
> 2.1 ADN contaminado con ARN podría deberse a la presencia de ARN en la muestra.
A 260/230nm absorben contaminantes como sales caotrópicas, fenoles o carbohidratos. En
general, se considera que el ADN es puro cuando la ratio A260/230 se sitúa en torno > 1.8
pureza aceptable y >2-2,2. Pureza optima Una ratio menor de < 1.8 ADN contaminado
con sales, fenol e hidratos de carbono y se relaciona con presencia de contaminantes en la
muestra. Cuanto menor sea este ratio la presencia de contaminantes en la muestra será
mayor. Una ratio < 1.5 ADN altamente contaminado estaría indicando una impureza
relevante en la muestra que podría comprometer su funcionalidad.

No obstante, esta relación resulta más variable que la relación A260/280 dependiendo de
factores como la concentración de ADN o de la composición del tampón de resuspensión
de la muestra.

12. Diga para qué fines se puede utilizar el ADN genómico humano.

Hoy en día, el ADN en el campo de la medicina se utiliza para curar enfermedades

mediante el reemplazo de un mal gen por uno bueno. Sin embargo, el uso de la
modificación del ADN, tan común en plantas y animales, sigue teniendo problemas éticos
importantes cuando se intenta aplicar en seres humanos.

También se puede utilizar para hacer los llamados perfiles de ADN, en los que se utilizan
los rasgos típicos y únicos del ADN de una persona. En general, esta técnica se utiliza en
los test de paternidad, para resolver dudas en un asesinato, para identificar personas, para
curar enfermedades hereditarias y para realizar trasplantes.

En síntesis, se utiliza para fines de diagnósticos, especialmente en el área de laboratorio, en

pacientes con diferentes padecimientos como enfermedades genéticas, cáncer, infecciones,
entre otras.

13. ¿Cuándo realizamos extracción de ADN, aparte de concentración y pureza, que

otros parámetros de calidad de la extracción de ADN se deben investigar?

Otros parámetros de calidad que se deben investigar en la extracción de ADN son:

 Cuantificación de ADN, una forma de estimar la cantidad presente en el extracto es
mediante la cuantificación. Según el método que se utilice, se puede apreciar la
cantidad de ácidos nucleicos totales, proteínas presentes, pureza del extracto.

 Rendimiento de ADN, el rendimiento depende del tipo y cantidad de material inicial

utilizado, así como, de la capacidad de carga de la matriz empleada.

 Integridad del ADN es importante conocer si el ADN esta integro, esto se puede
observar mediante electroforesis en gel de agarosa, si esta integro se observa una
banda estrecha cercana al pozo en que se coloco la mezcla de ADN.

 Almacenamiento de ADN, Una vez purificado, cuantificado, y analizado mediante

electroforesis, una parte de la muestra se pueden almacenar a 4°c para los análisis
inmediatos y el material restante a -20°C ó -80°C, para una preservación por varios
meses.