PCR pt 1.

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OrnellaC

Seguridad Alimentaria

4º Grado en Veterinaria

Facultad de Veterinaria
Universidad Alfonso X El Sabio

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 Sm. PCR
POLIMERASE CHAIN REACTION

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
INTRODUCCION
La genética es la ciencia que estudia la herencia biológica, es decir, la transmisión de los
caracteres morfológicos y fisiológicos que pasan de un ser vivo a sus descendientes.
GENÉTICA MENDELIANA: Es el estudio de la herencia biológica mediante experimentos
de reproducción. Intenta averiguar cuál es la información biológica de los individuos a
partir de las proporciones matemáticas en que se hereda un carácter.
GENÉTICA MITOCONDRIAL: estudio de la transmisión del ADN mitocondrial de madres a
hijos.( Herencia materna; Poliplasmia-Efecto Umbral; Segregación mitótica)
GENÉTICA MOLECULAR: Estudio de las moléculas que contienen la información biológica
y de los procesos químicos, de su transmisión y manifestación. El sentido de su estudio

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es, pues, inverso al de la Genética mendeliana. A partir de la información (ácidos
nucleicos) se deduce cómo serán los caracteres (proteínas).
Genotipo: Conjunto o parte de la constitución genética de un individuo. Conjunto de los
genes existentes en cada uno de los núcleos celulares de los individuos pertenecientes a
una determinada especie vegetal o animal.
Fenotipo: a la manifestación visible del genotipo en un determinado ambiente.
FENOTIPO: Genotipo + Medio ambiente
Alelos: Una de las formas variantes de un gen en un locus o de un marcador particular
en un cromosoma.
Diferentes alelos de un gen producen variaciones en las características hereditarias tales
como el color del cabello o el tipo de sangre.
Gen: Región de ADN que controla una característica hereditaria discreta que comprende
secuencias codificantes, reguladoras y no codificantes, y que se corresponde
habitualmente con un solo ARN o proteína.
Extracción de DNA:
• Músculo
• Sangre
• Células
PCR- Introducción
• Dr. Kary Mullis, entre 1983-85 desarrolló una nueva técnica que permitía la síntesis de
grandes cantidades de un fragmento de ADN, sin clonarlo.
• Consiste en amplificar enzimáticamente secuencias especificas de material genético
extraído de cualquier tejido.
• La técnica de PCR ha tenido un auge muy grande en el diagnóstico en el laboratorio
clínico, ha contribuido al desarrollo de diversas áreas de la medicina y la ciencia en
general.

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 Fundamento
Consiste En 3 Etapas:
1. Desnaturalización Adn
2. Hibridación Cebadores (PRIMERS)
3. Extensión
1. DESNATURALIZACION
El ADN de doble cadena se calienta hasta ebullición (90 a 95 oC) separándose las dos
cadenas que servirán de molde.

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2. HIBRIDACIÓN
La segunda etapa es la hibridación que se produce por fragmetnos lineares
monocatenarios de adn (primers).
• Se añaden los cebadores (primers). La unión se hace entre 40 y 60 oC, los cebadores se
unen con su secuencia complementaria de las cadenas molde.
• Duración (30-60 sg)

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• La TEMPERATURA de unión es específica de cada primer y depende de varios factores.
Tm= 4(G+C) + 2(A+T)
3. EXTENSIÓN
La ADN-Polimerasa comienza la copia de cada molde a partir de los cebadores en
dirección 5’>3’.
Se usa Taq-Polimerasa, su Temperatura óptima de trabajo oscila de 68 a 72 oC.

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 COMPONENTES
1. ADN
2. POLIMERASA
3. BUFFER (MgCl2)
4. NUCLEOTIDOS
5. PRIMERS
ADN

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PRIMERS. Diseño
– El diseño es esencial para el éxito de la PCR.
– Secuencias de entre 18 y 30 pb.
– Evitar en el extremo 3’ muchas G y C, zonas complementarias.
– Gran Homología con el molde en el extremo 3’.
– Las condiciones de PCR y las concentraciones del buffer deben ser ajustadas para
cada pareja de primers
No presentar secuencias complementarias en un mismo cebador para evitar horquillas y

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 Primer-Dimer (intra-primer).

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Evitar la presencia de secuencias complementarias entre los cebadores. Primer-dimer
(interprimer).

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 En la genética molecular se busca lo que puede haber pasado a nivel del adn.
Las regiones intronicas (intrones) que son las no codificantes también al final tienen
valor.
En base al modelo natural del mecanismo molecular se ha obtenido la realización de la
PCR reproduciendo in vitro lo que estaba pasando in vivo.
En la técnica tradicional el adn es mas puro y se conserva durante mas tiempo.
Pcr convencional
→ se necesita la electroforesis en gel, pero en caso de la pcr en tiempo real no se

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necesita.
Para desnaturalizar siempre se hace a 94-95°
PROBLEMAS:
• Contaminacion
• errores de la polimerasa
• amplificaciones inespecificas
• errores en el pipeteo
• cantidad de muestr

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• degradación de adn
• …

Aplicaciones:
• Detección y cunatificacion de patógenos
• identificación de OGM, fraudes (cuantificación)
• manipulación genica y estudios de expresión
• secuenciacion de las regiones amplificadas
• detección de mutaciones, deleciones,..
• clonar por PCR, genes, extremos ARNm, ADN genomico
• diagnostico de enf genéticas
• estudios filogeneticos

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 PCR tiempo real

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SISTEMAS DE DETECCION
1. Sybrgreen
2. Sondas Taqman
1. SybrGreen
Emite fluorescencia de baja intensidad al ser
excitada por un haz de luz. Al intercalarse en
el ADN de doble hélice aumenta la
fluorescencia, de manera proporcional al
producto amplificado.

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2. Sondas Taqman
La sonda se marca en sus extremos con dos
fluoróforos distintos o con un fluoróforo y un
quencher.
El quencher apaga la emisión del fluoróforo, al comenzar la amplificación la actividad
exonucleasa de la polimerasa separa al fluoroforo del quencher y se produce emisión de
fluorescencia, proporcional al producto amplificado.
Se usan para cuantificación de transcritos (RT-PCR), copias de genomas y cuando se
requiera mucha especificidad.
Cuando utilizamos sondas fluorescentes estas son
cebadores un poco mas cortos en cuyo extemo 3'
hay un inhibidor. Si la sonda está entera no hay
fluorescencia.
Cuando la polimerasa empieza a copiar los
cebadores, se encuentra con la sonda que la rompe
y entonces el inhibidor que bloquea la fluorescencia
se libera y la sonda empieza a emitir. Entonces las sondas son mas especificas que el
syber green porque solo emite si se amplifica una zona especifica.
El tamaño hace que el mas pequeño migre mas rápido.
Electroferograma: secuencia de 4 colores (uno por cada fase).

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