Tema 1

Nucleótidos y ácidos nucleicos

Los nucleótidos desempeñan una amplia variedad de funciones en el metabolismo celular.

Constituyen la moneda energética en las transacciones metabólicas. También son los
constituyentes de los ácidos nucleicos: ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA).
Mononucleotidos=monómeros de los polímeros de ADN y ARN o pueden ser parte del NADH o
FADH2, CoA o ir por libre (ATP).
Un nucleótido consiste en una base nitrogenada (purina o pirimidina), un azúcar pentosa y uno o
más grupos fosfato. Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos unidos por enlaces
fosfodiéster entre el grupo 5'-hidroxido de una pentosa y el grupo 3'-hidroxilo del siguiente.
Los nucleótidos están formados por tres componentes característicos:
-Una base nitrogenada
-Una pentosa
-Un fosfato.

Las bases y las pentosas de los nucleótidos comunes son compuestos heterocíclicos.

BASES NITROGENADAS
Son derivados de dos compuestos parentales, pirimidina y purina (pirimidina+ imidazol).
La base de un nucleótido está unida covalentemente (por el N-1 en las pirimidinas y el N-9 en las
purinas) a través de un enlace N-𝛽-glucosídico con el carbono 1' de la pentosa, y el fosfato está
esterificado con el carbono 5'. El enlace N-𝛽-glucosídico se forma por: -Eliminación de agua (un
grupo hidroxilo de la pentosa y un hidrógeno de la base), -Formación de los enlaces O-glucosídicos.

● Ambas son moléculas aromáticas. Esta propiedad tiene efectos importantes sobre la
estructura, la distribución electrónica y la capacidad de absorción de la luz de los ácidos
nucleicos. La deslocalización de los electrones entre los átomos del anillo confiere a la
mayoría de los enlaces el carácter de doble enlace parcial.
● Como consecuencia de este hecho, las pirimidinas son moléculas planas y las purinas casi
planas, con una ligera deformación.
● Las bases purínicas y pirimidínicas libres pueden existir en dos o más formas tautoméricas
según el pH.
● Las bases nitrogenadas absorben la radiación. La que más absorbe es el AMP.
● Los ácidos nucleicos absorben a 260nm por sus bases nitrogenadas y estas a su vez por sus
anillos aromáticos.
● Se forman puentes de hidrógeno. Interacciones hidrofóbicas y de Van der Walls. Interacciones
π-π (interacciones de stacking, no covalentes) o interacciones aromáticas. Las tres
interacciones se dan en la dirección perpendicular al plano de la molécula
● Las bases funcionan como bases (no como ácidos) debido a su grupo amino.
● Momento dipolar en ambas por haber átomos de nitrógeno y oxígeno en el anillo y
sustituyentes electronegativos.
Tautómeros: Isómeros constitucionales (igual fórmula molecular pero distinta fórmula estructural) que
difieren en la posición de un átomo de hidrógeno y uno o varios enlaces dobles. Ambas formas tienen una
intercorversión rápida.

Cuando la sustitución tiene lugar en un átomo de los anillos de purina o pirimidina, la convención más
habitual consiste simplemente en indicar la posición en el anillo donde se ha producido la sustitución: por
ejemplo, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina (uridina o pseudouridina si la ribosa está en C5). El
elemento (N, C, O) al cual está unido el sustituyente no está especificado. Las convenciones cambian
cuando el átomo sustituido es exocíclico (no incluido en la estructura del anillo), en cuyo caso se identifica
el tipo de átomo y se indica la posición del anillo a la que se encuentra unido mediante un superíndice. El
6
nitrógeno amínico unido al C-6 de la adenina se denominará 𝑁 ; análogamente, el oxígeno carbonílico y el
 6 `2
nitrógeno amínico en C-6 y C-2 de la guanina se denominará 𝐶 y 𝑁 , respectivamente. Ejemplos de esta
6 `2
nomenclatura son 𝑁 -metiladenosina y la 𝑁 -metilguanosina.

PENTOSAS

Como no hay dobles enlaces, las pentosas no son planas; uno de los átomos se sale del plano. Suele ser
C2 o C3. Si sale para la misma dirección que C5 es endo, y al contrario exo.

Hay dos tipos de ácidos nucleicos: RNA y DNA. Los nucleótidos de RNA contienen ribosa y las bases
pirimidínicas comunes son el uracilo y la citosina. En el DNA los nucleótidos contienen 2'-desoxirribosa y
las bases pirimidínicas comunes son la timina y la citosina. Las purinas primarias son la adenina y la
guanina en ambos casos.

FOSFATO

Los nucleótidos sucesivos del DNA y RNA

están unidos covalentemente mediante
“puentes” de grupos fosfato, en los cuales el
grupo hidroxilo en 5' de un nucleótido está
unido al grupo hidroxilo en 3' del nucleótido
siguiente mediante un enlace fosfodiéster. Por
tanto, los esqueletos covalentes de los ácidos
nucleicos consisten en residuos alternados de
fosfato y pentosa, mientras que las bases
pueden considerarse como grupos laterales
unidos al esqueleto a intervalos regulares.
Si los fosfatos están en distintos carbonos, los nucleotidos se denominan bisfosfato o trisfosfato en lugar
de difosfato o trifosfato.

NUCLEÓSIDOS

Nucleosido= base+pentosa

Nomenclatura de nucleósidos

En pirimidinas: el enlace va de C1 de la pentosa a N1 de la pirimidina.

En purinas: el enlace va de C1 de la pentosa a N9 de la purina.
La base oscila sobre el plano de la pentosa. SIN y ANTI como conformaciones más estables.
Uridina en ARN sin metilo en la posición 5.
Desoxitimidina en ADN con metilo en la posición 5.

ESTRUCTURA PRIMARIA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

La estructura primaria de un ácido nucleico está definida por su estructura covalente y su secuencia de
nucleótidos.
CUESTIONARIO

¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la molécula de DNA es verdadera?

a. El DNA es más hidrofílico que el RNA porque el 3C de la pentosa tiene H en el OH

b. Las bases nitrogenadas tiene muchos grupos amino protonados en condiciones fisiológicas

c. En condiciones fisiológicas el grupo fosfato está cargado negativamente, pero una vez
formado el enlace fosfodiéster, la carga negativa desaparece

d. El DNA absorbe luz ultravioleta debido al anillo furano de la pentosa

e. Todas las anteriores son falsas

Indica cuáles de los siguientes nucleótidos NO serán componentes del RNA

a. GMP

b. AMP

c. TMP

d. CMP

e. dAMP

f. dUMP

g. todos son componentes del RNA

 10 A de distancia

El interior de la molécula contiene bases hidrofóbicas y el exterior contiene el esqueleto hidrofílico

de desoxirribosa y el fosfato
 desoxirribosa

ribosa

2 3 1
por lo que es más
estrecha en vista
axial
más o menos menos larga más larga

Y
R ESTÁN FAVORECIDAS POR

en disolución en situaciones de
deshidratación

ES UNA SECUANCIA, NO UN TIPO DE ESTRUCTURA

una hebra que si se lee 5' 3' y su

complementaria 5' 3' igualmente: palindrómica
flexibles (A,T) y
rígidos (G,C)

Lys y Arg
 145 en nucleo nucleosómico, los
restantes son linkers

numero de bases no
es proporcional al
número de genes
Doble horquilla

Citosina protonada y guanosina crea dos puentes de Hcon la

citosina protonada y la guanina del emparejamiento de Watson y
Crick por lo que el pH ácido favorece formación de la triple hélice
 ocurre en eucariotas y en
plásmidos (bacterias)

Superenrrollamiento positivo: hebra levógira

Superenrrollamiento negativo: hebra dextrogira
 es reversible

es un cofactor de la
transferencia del grupo proviene de la
amino en aa vitamina B6

en matriz mitocondrial
activada por ADP e inhibida por GTP/ATP

aa se oxida y FAD se reduce

No es una reacción redox sino

un proceso de
hidratación-deshidratación porque puede cambiar el pH celular o
reaccionr con el alfa ceto glutarato
parando el ciclo de Krebs

si proviene del
músculo

resto del cuerpo

 Para que Glu pueda reaccionar con el grupo amino
primero tiene que activarse. La forma activada
(fosforilada) del glutamato, llamada gamma-glutamil
fosfato, sí puede reaccionar con el grupo amino

(Ácido glutámico)

(Alanina
aminotransferasa)

en la matriz
mitocondrial

1 grupo
AMP citrolina amino

hidrolasa
alfa-cetoacido
obtenido de
cada aa es ciclo de la urea
distinto
liasa

ciclo de Krebs
Ciclo de la Urea + Ciclo de Krebs =
Biciclo de Krebs

para purinas y
pirimidinas
para purinas
da lugar a aa
no esenciales

lugar a aa no
esenciales

Tambien se forma a partir de

PEP + eritrosa-4-fosfato

Tanto en catabolismo como en anabolismo, participan cofactores

enzimáticos la transferencia de grupos funcionales de un solo C.
Biotina, 5-adenosinmetionina y tetrahidrofolato (H4folato)

para formar el
PRPP
PRPP no es un
coenzima sino un
azúcar

formado a
partir de
PRPP
gastando 5
ATP
10 ATP
11 ATP
IMP
deshidrogenasa
 vias de salvamento se usan cuando hay poco ATP

Síntesis de carbomoil fosfato a

partir de glutamina y bicarbonato

y de carbamoil fosfato

+ carbomoil fosfato
Regulación
Vía de salvación no ocurre casi en
mamíferos porque la síntesis de novo
no es costosa

se sintetiza a partir de
En el centro activo de la
ribonucleotidos
enzima solo puede entrar
ribonucleotidos
difosforilados
 Tema 4: REPLICACIÓN DEL DNA

La replicación del ADN es semiconservadora y se produce en la fase S del ciclo celular. Cada
cadena del DNA actúa de molde para la síntesis de una nueva cadena. El resultado son dos
moléculas de DNA nuevas, cada una con una cadena nueva y otra vieja (parental). Este proceso se
denomina replicación semiconservadora, aunque existen otros dos modelos la conservadora y la
dispersiva.
● Modelo conservador: Se consigue una molécula igual a la parental, y otra completamente
nueva de ADN.
● Modelo dispersiva: Las moléculas que se generan a partir del ADN parental contienen
partes del viejo y también partes nuevas de modo aleatorio. Hay mayor proporción de ADN
nuevo.

La hipótesis de la replicación semiconservadora fue propuesta por Watson y Crick, pero fue
confirmada mediante experimentos diseñados por Meselson y Stahl. Estos investigadores
cultivaron células de E. coli durante varias generaciones en un medio cuya única fuente de
nitrógeno contenía N15, el isótopo “pesado” del nitrógeno, en lugar del isótopo “ligero” normal y
más abundante, el N14. El ADN aislado de estas células tenía una densidad un 1% mayor que el
N14 DNA normal. Aunque la diferencia es pequeña, es posible separar la mezcla de 15N DNA
pesado y 14N DNA ligero por equilibrio de sedimentación en gradiente de densidad de cloruro de
cesio.
Las células de E. coli cultivadas en medio con
N15 se transfirieron a un medio que contenía
solamente el isótopo N14, donde se las dejó
crecer justo hasta la duplicación de la
población celular. El DNA aislado de esta
primera generación de células formó una
única banda en el gradiente de CsCl en una
posición que indicaba que los DNA de doble
hélice de las células hijas eran híbridos que
contenían una cadena nueva con 14N y una
cadena parental con N15 . Este resultado
contradecía la replicación conservadora, una
hipótesis alternativa según la cual una molécula de DNA de la progenitora estaría formada por dos
cadenas de ADN recién sintetizadas, mientras que la otra contendría las dos cadenas parentales;
este mecanismo no produciría moléculas de DNA híbridas en el experimento de Meselson y StahI.
La hipótesis de la replicación semiconservadora se confirmó durante la siguiente etapa del
experimento. Se permitió que las células volviesen a doblar su número en el medio con 14N. El
DNA aislado de este segundo ciclo de replicación mostró dos huidas en el gradiente de densidad,
una que presentaba una densidad igual a la del DNA ligero y una segunda que tenía la densidad
del DNA híbrido observada después de la primera duplicación celular.

Proceso
Aparece una horquilla de replicación, se extiende bidireccionalmente (si se marca los nucleótidos se
comprueba). En la horquilla tenemos la doble hélice que sirve de molde para la síntesis de nuevas
hebras: hebra conductora (líder) tiene formación continua 5’-3’ y hebra rezagada replicada por
fragmentos de Okazaki 3’-5’.
La hebra de crecimiento (cebador) se va extendiendo del 3’ OH al 5’ P.
Reacción general:
(dNMP)n+dNTP------>(dNMP)n+1 + PPi(pirofosfato) PPi + H2O ---------> 2Pi

Proteínas que intervienen en la replicación:

La ADN Pol cataliza la extensión de una hebra existente de ácidos nucleicos. Se mantiene la
fidelidad de nucleótidos gracias a la geometría del sitio activo del DNA Pol que limita las bases
donde se puede emparejar. Discrimina lo que no sean los emparejamientos de Watson y Crick.

● ADN polimerasa I : Eliminación

de los cebadores de RNA
(rellenar hueco que deja el
cebador) y reparación del
ADN. Tiene dos sitios activos:
el de la polimerasa y el de la
exonucleasa.
● ADN polimerasa II:
Mecanismos de reparación del
ADN muy especializados. No
tiene nada que ver con la
replicación.
● ADN polimerasa III: Principal enzima polimerasa activo durante la replicación del ADN. Tiene
mayor velocidad de polimerización.
 ● Helicasas: Enzimas que rompen los enlaces de H que mantienen unidas las bases. Abren la
hélice en dos.
● Topoisomerasas: Desenrolla la doble hélice. La más conocida es la ADN-girasa.
● Primasa: Enzima que cataliza la formación de un cebador (ARN) para iniciar la replicación.
● Proteínas SSB: Proteínas que unen las cadenas sencillas de ADN que se van formando.
● ADN-ligasa: Enzima que cataliza la unión de dos oligonucleótidos entre sí. Hay ligasas que
pueden catalizar la unión de ciertos oligonucleótidos pero no de otros dependiendo de
factores como: La naturaleza del ácido nucléico (ej. RNA o DNA) Ó grupos funcionales en
los extremos 5’ o 3’ Ó Si el substrato es de cadena sencilla o doble.

HORQUILLA DE REPLICACIÓN
Puntos dinámicos donde el DNA parental es desenrollado y las cadenas separadas rápidamente
replicadas. Los resultados demostraron que las dos cadenas del DNA se replican simultáneamente.
Se demostró que las secuencias ricas en pares de bases A = T pueden ser desnaturalizadas
selectivamente.

Una hebra nueva (rojo) de DNA se sintetiza

siempre en la dirección 5´--3´ El molde se
lee en dirección opuesta, 3'->5'. La hebra
conductora se sintetiza ininterrumpidamente
en la dirección seguida por la horquilla de
replicación. La otra hebra, la hebra
rezagada, es sintetizada de manera
discontinua en trozos cortos (fragmentos de
Okazaki) en dirección opuesta al
desplazamiento de la horquilla de
replicación. Los fragmentos de Okazaki son
unidos a continuación por la DNA ligasa. En
las bacterias, los fragmentos de Okazaki
tienen una longitud de 1000 a 2000 nucleótidos. En las células eucarióticas tienen de 150 a 200
nucleótidos.

ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS PARA LA REPLICACIÓN

• Exonucleasas: degradan los ácidos nucleicos desde un extremo de la molécula, bien en

dirección 5’-3’ o bien en dirección 3’-5’, siempre necesitando uno de los extremos para funcionar.
Catalizan la hidrólisis de enlace fosfodiester en un extremo de un polinucleótido.
• Endonucleasas: pueden empezar a degradar en puntos internos específicos de una cadena o
molécula de ácido nucleico, reduciéndolo a fragmentos cada vez más pequeños. Endonucleasas
catalizan la hidrólisis de enlace fosfodiester dentro de un polinucleótido. Liberan oligonucleótidos.
Enzimas de restricción.
ADN POLIMERASA I DE E.COLI
Los trabajos iniciales sobre la DNA polimerasa I definieron dos requerimientos básicos para la
polimerización del DNA.
1. Todas las DNA polimerasas requieren un molde. La reacción de polimerización está
dirigida por una cadena molde de DNA (donde hay una guanina en el molde se añade una
citosina a la nueva cadena y así sucesivamente).
2. Las polimerasas requieren un cebador (primer). Un cebador es un segmento de cadena
(complementario del molde) con un grupo 3'OH libre al cual pueden añadirse nucleótidos. El
extremo 3' del cebador se denomina extremo terminal del cebador.

Después de añadir un nucleótido a una cadena de ADN en crecimiento, la DNA polimerasa se

disocia o bien se traslada a lo largo del molde y añade otro nucleótido. La disociación y la
reasociación de la polimerasa pueden limitar la velocidad global de polimerización. El proceso es
generalmente más rápido si la polimerasa añade más nucleótidos sin disociarse del molde.

El enzima polimerasa I es una polimerasa cuando añade nucleótidos de uno en uno y una
exonucleasa cuando quita nucleótidos. Para completar un fragmento de Okazaki, la ADN
polimerasa I usa sus dos capacidades: completa el fragmento de Okazaki mediante la eliminación
del ARN cebador anterior y lo sustituye por nucleótidos de ADN. Cuando la ADN-polimerasa I ha
completado sus actividades, los dos fragmentos de Okazaki previos ya están casi completos. Lo
único que queda por formar es el enlace fosfodiéster.

Un extremo 3’OH mal emparejado impide la elongación del DNA. La DNA polimerasa I se vuelve
hacia atrás y la base mal emparejada se sitúa en el sitio exonucleasa 3’→5’ de la DNA polimerasa.
El nucleótido mal emparejado se elimina y la DNA polimerasa vuelve a avanzar siguiendo con su
polimerización. Cada 10^9 y 10^10 nucleótidos ocurre un error de replicación en E. Coli.

La replicación es muy precisa, el centro activo de la DNA polimerasa I acomoda solamente pares
de bases con esta geometría (A=T y C=G). Un nucleótido incorrecto puede ser capaz de formar
puentes de hidrógeno con una base del molde, pero generalmente no encajará en el centro activo.
Las bases incorrectas pueden ser desechadas antes de que se forme el enlace fosfodiéster.

ETAPAS DE LA REPLICACIÓN

Proteínas requeridas: DNAa, DNAb (helicasa), DNAc, DNAg (primasa), SSB, topoisomerasa.

INICIACIÓN
Comienza en un punto al que llamamos origen de replicación o región OriC.
● OriC: secuencia de nucleótidos de aproximadamente 240 pb que contiene:
- Secuencias cortas de 9 nucleótidos repetidas a las que se van a unir las proteínas DNAa. 5
secuencias R y 3 secuencias I. La I es más específica porque se une al DnaA-ATP, mientras que la
R se une a DnaA-ADP y DnaA-ATP.
-Región DUE: una secuencia de 13 pares de bases repetida tres veces. Ricas en A y T que se
repiten en tándem (la A y T se unen únicamente mediante 2 puentes de H por lo que será más fácil
romper estos enlaces para separar la doble hélice).

La DNAa-ATP es una enzima de acción ATPasa que se va a encargar de superenrollar

dextrógiramente la molécula de ADN, al unirse a las regiones R/I. Este superenrollamiento genera
una tensión que se liberará mediante la rotura de los puentes de H de las regiones DUE ricas en A
y T. Se consigue así la separación de la doble hélice.
En el hueco que se genera, entra la enzima DNAb (acción helicasa), con la ayuda de la DnaC-ATP,
y se va a desplazar a lo largo de la molécula de ADN rompiendo los puentes de H y separando así
las dos hebras. Al igual que la DNAa, se trata de una ATPasa.

El avance de la helicasa, causa un superenrollamiento positivo a la derecha dejando atrás un

superenrollamiento negativo. Si se tratase de un DNA lineal y corto, el superenrollamiento se podría
eliminar por simple rotación de la molécula, en torno a su eje, en sentido contrario. Sin embargo,
esto no es posible en los DNA circulares (procarióticos) ni en los lineales de gran tamaño
(eucarióticos), que están restringidos topológicamente debido a su naturaleza circular y a su unión a
proteínas, respectivamente. Se genera una tensión en la molécula de ADN que va a contrarrestarse
gracias a la acción de la topoisomerasa II o girasa que irán cortando las dos cadenas de ADN y
uniéndolas de nuevo relajando la tensión topológica.

Para evitar que la doble hélice vuelva a enrollarse, las proteínas SSB (Proteínas ligantes del DNA
monocatenario) se van a unir a las cadenas simples y van a estabilizar la estructura de la doble
hélice desenrollada. Esto se consigue gracias al exceso de carga positiva de dichas proteínas que
se van a unir a los grupos fosfato (carga negativa) de la molécula de ADN. Son estructuras
dinámicas que se irán poniendo y quitando para permitirle el paso a la ADN polimerasa.

ELONGACIÓN
vale crack
La DnaG (primasa) es una enzima con
actividad ARN polimerasa que va a sintetizar
el cebador o primer que va a aportar el
extremo 3 ́-OH a partir del cual podrá
empezar a polimerizar la ADN polimerasa.
La DnaG interacciona con la helicasa DnaB
para llevar a cabo esta reacción. El cebador
es sintetizado en la hebra conductora en
dirección opuesta a la del movimiento de la
helicasa DnaB, la cual se desplaza a lo largo
de la hebra rezagada en dirección 5’-3’
Una vez iniciada la síntesis de la hebra
conductora transcurre de manera continua al
mismo ritmo que el desenrollamiento del
DNA en la horquilla de replicación.

En la hebra rezagada ocurre la replicación

discontinua. Primero la primasa va
colocando cebadores de RNA y de estos se
van formando fragmentos de Okazaki. Para
que la replicación ocurra en las dos hebras
simultáneamente y en la misma dirección,
entra en acción la DNA polimerasa III.
La ADN polimerasa III es la principal responsable de la replicación del cromosoma bacteriano.

DNA polimerasa III: se trata de una holoenzima. Está formada por múltiples subunidades:
● 2 Nucleos (core) α, ε y θ: se trata del centro activo de la enzima con actividad polimerasa
(α) y actividad correctora-exonucleasa (ε).

● Dímero β (abrazadera deslizante): acerca el

core a la molécula de ADN aumentando la
procesividad de la enzima.

● Dímero τ: une los dos cores.

● Complejos Υ, δ, δ’,τ y τ: ayuda a unir el

complejo DNA polimerasa III a la molécula de
ADN y cataliza la unión del dímero β a la
cadena de ADN.
Υ y δ ‘ portan la abrazadera.
δ abre la abrazadera.

Replisoma: maquinaria molecular que se

encarga de replicar del ADN. El
replisoma verifica una rápida síntesis de
DNA a un ritmo de unos 1.000
nucleótidos por segundo en cada hebra
conductora y rezagada.

Cada núcleo de dna Pol III sirve para

la replicación de cada hebra. En la
hebra conductora, uno de los núcleos
avanza junto a una abrazadera
añadiendo nucleótidos en dirección
5’-3’. La hebra rezagada forma una
horquilla y de esta manera, desde los
cebadores uno de los núcleos de la pol
III puede añadir nucleótidos en
dirección 5’-3’. Cada tanto la primasa
añade nuevos cebadores y a estos
cebadores se le une otra abrazadera
cargada por un segmento de la pol III.

La DNA pol I elimina los cebadores de

RNA y los reemplaza por DNA. La
DNA ligasa cataliza la formación de un
enlace fosfodiéster entre un 3’ OH y un 5’ fosfato, activando el fosfato con un AMP transferido por la
ligasa. El 5’ fosfato reacciona con el 3’ OH sellando la mella. En la reacción de la DNA ligasa de
E.Coli, el AMP proviene del NAD+ y libera nicotinamida mononucleótido (NMN). Las DNA ligasas
aisladas de otras fuentes víricas y eucarióticas utilizan ATP y liberan pirofosfato (PPi)

TERMINACIÓN

Finalmente, las dos horquillas de replicación del cromosoma circular E.Coli se encuentran en una
región terminal que contiene múltiples copias de una secuencia de 20 pares de bases (Ter J, Ter F,
Ter C...) denominada Ter. Estas secuencias actúan en el cromosoma como una especie de trampa
donde una horquilla de replicación puede entrar pero no salir (bloquear a las dos horquillas de
replicación), la primera horquilla que se para en su trampa espera a la otra.

Además son sitios de unión para una proteína

denominada Tus (terminus utilization
substance). Se trata de una enzima con
actividad contra helicasa que inhibe actividad
de la DNAb y evita que se desenrolle el ADN.
La ADN topoisomerasa IV (topoisomerasa de
tipo II) va a separar las dos cadenas y
obtendremos finalmente 2 cromosomas.

REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

El ADN está organizado en cromosomas que

se encuentran en el núcleo celular.
La replicación ocurre en la fase S del ciclo
celular.

Existen múltiples orígenes de replicación

(replicones) que se distribuyen a lo largo del
cromosoma. No se acepta ninguna secuencia
consenso. Proteína PCNA aumenta
procesividad de DNA pol ε y δ. Los cebadores
son sintetizados por la DNA 𝛼 polimerasa.
MCM es helicasa y RPA es SSB.

En levaduras la secuencia de replicación se llama ARS.

 REPLICACIÓN DE LOS TELÓMEROS

Los telómeros son secuencias cortas de 6 pb ricas en G (TTAGGG) repetidas en tándem (1000
repeticiones) localizadas al final de los cromosomas en los extremos 3’. Al haber riqueza de
guanina, aparece el complejo de cuatro hebras: tetraplete de guanosina. Al final de los telómeros se
forma un bucle de cadena simple (12-16 nucleótidos) al que se van a asociar unas proteínas
llamadas shelterinas.

Su función es el mantenimiento de
los cromosomas:
● Evitar la pérdida de
información genética
esencial
● Proteger de la acción de las
nucleasas
● Evitar la asociación entre
cromosomas

¿Cómo se replican los

telómeros? La enzima implicada
en la replicación de los telómeros
es la telomerasa, una
ribonucleoproteína con actividad
transcriptasa inversa (transcribe ARN a ADN). Esta enzima posee un componente de ARN que
actúa como molde para elongar el extremo 3‘ de la hebra molde del cromosoma. Las primeras
bases de este componente de ARN se aparean con las bases del extremo 3’ de la hebra molde
(secuencia CAAUC) y se elonga dicha hebra colocando nucleótidos complementarios al resto del
componente de ARN. Cuando se unen todos los nucleótidos complementarios, se transloca la
telomerasa hacia la derecha y se continua la transcripción inversa. Este proceso se repite
numerosas veces. La otra hebra será elongada por una ADN polimerasa a partir de un cebador.
La telomerasa es una DNA polimerasa por lo que necesita un cebador. Este cebador lo lleva
consigo.
Gráfica: Pasado el umbral de senescencia, las células llegan a un punto donde mueren o se activa
la telomerasa.

PROCARIOTAS VS EUCARIOTAS
 Procariotas Eucariotas

¿Cuál es la reacción que tiene lugar durante [(dNMP)n + dNTP ‑> [(dNMP)n + dNTP ‑>
la replicación? (dNMP)n+1 + PPi] (dNMP)n+1 + PPi]

¿Dónde comienza la replicación? [OriC] [Aún se desconoce la

secuencia consenso]

¿Cuántos orígenes de replicación existen? [Uno] [Muchos]

¿Qué molécula(s) reconoce ese sitio de [proteína DNA A] [proteínas ORC]

origen?

¿Cuál es la enzima que desnaturaliza el [helicasa] [helicasa]

DNA?

¿Qué enzima se encarga de liberar la [topoisomerasa] [topoisomerasa]

tensión generada durante la replicación?

¿Qué proteínas evitan la renaturalización [SSB] [SSB]

del DNA?

¿Cuántas DNA polimerasas [3. DNA polimerasa I, II y III] [5. DNA polimerasa
existen?¿Cuáles son? alfa, beta, gamma, delta
y epsilon]

¿Qué DNA polimerasa sintetiza la hebra [DNA polimerasa III] [DNA polimerasa
líder? epsilon]

¿Qué DNA polimerasa sintetiza la hebra [DNA polimerasa III] [DNA polimerasa delta]
rezagada?

¿Quién se encarga de aumentar la [Abrazadera beta] [PCNA]

procesividad de la DNA polimerasa?

¿Quién cataliza la síntesis del cebador de [Primasa] [DNA polimerasa alfa]

RNA?

¿Qué DNA polimerasa tiene actividad [DNA polimerasa I, II y III] [DNA polimerasa
exonucleasa 3'-5'? Si hay más de una indica gamma, delta y epsilon]
todas.
¿Qué DNA polimerasa tiene actividad [DNA polimerasa I] [Ninguna de las DNA
exonucleasa 5'-3'? Si hay más de una indica polimerasas]
todas.

¿Qué DNA polimerasa participa en [DNA polimerasa I y II] [DNA polimerasa beta]
mecanismos de reparación del DNA? Si hay
más de una indica todas.

¿Qué enzima eliminar los cebadores de [DNA polimerasa I] [Rnasa H y FEN1]

RNA?

En cada ciclo de replicación, su DNA se [No] [Sí]

acorta?

¿Expresan la enzima telomerasa? En caso [No] [Sí, en gametos]

afirmativo especifica donde se expresa esa
telomerasa.
 TEMA 5: ESTRUCTURA, FUNCIÓN Y METABOLISMO DEL RNA

ESTRUCTURA DEL RNA

• La molécula de RNA está formada por una cadena única (en vez de ser una doble cadena) y adopta
estructuras secundarias en pequeñas regiones de su molécula por el plegamiento de su única hebra sobre
sí misma (dextrógira). Para ello necesitamos secuencias palindrómicas que formarán horquillas, cruces,
emparejamientos atípicos U-G. Dentro de esas secuencias pueden haber partes no complementarias: lazos
internos (abombamientos, salientes o protuberancias).
• Es un polímero de ribonucleótidos: es decir, sus azúcares son ribosas, no desoxirribosas.
• Está formado por las bases U, C, A y G.
• El apareamiento de bases sigue siendo el mismo que en el DNA (A - U y C - G). En consecuencia, se puede
sintetizar directamente RNA sobre un molde de DNA. Al igual que el ADN, tiene enlaces fosfodiéster 5’-3’
• Tiene una estructura tridimensional compleja.

TIPO Y FUNCIONES DEL RNA

Al contrario del DNA, la mayoría de RNA

desempeñan sus funciones en forma de cadena
sencilla. Estas cadenas se pliegan sobre sí mismas y
poseen el potencial para una diversidad
estructural mucho más amplia que la observada en
el DNA, gracias a la cual el RNA es capaz de asumir
una amplia variedad de funciones celulares.

• El coeficiente de sedimentación está relacionado

con la velocidad en la que precipitan cuando se
centrifugan.

• Importante: número de nucleótidos del tRNA: 75. Hace pensar que las primeras moléculas de DNA que
existieron en las protocélulas pudieran haber tenido una longitud parecida y que podría ser un
remanente de esas células primitivas.

RNA mensajero: codifica la secuencia de aminoácidos de uno o más polipéptidos especificados por
un gen o por un conjunto de genes. f(x)En eucariotas lleva la información para la síntesis de
proteínas desde el núcleo a los ribosomas.

• UTR: región sin transcribir y aparece en los dos extremos.

• mRNA policistrónico: contiene información para la síntesis de varias proteínas. Sobre todo en células
procariotas pero es posible encontrarlo en eucariotas.

• mRNA monocistrónico: codifica la información para una proteína. Aparece sobre todo en células
eucariotas. Tiene poliA y una caperuza 5’.
RNA de transferencia: lee la información codificada en el mRNA y transfiere el aminoácido
adecuado a la cadena polipeptídica en crecimiento durante la síntesis proteica.
• Aminoácidos a ribosomas, interacción con codones mRNA.
• 4S.
• Suelen ser estructuras de tipo trébol.

El brazo del aminoácido (extremo 3’) lleva un

aminoácido específico esterificado por su grupo carboxilo
al grupo hidroxilo 2' o 3' del residuo A del extremo 3' del
tRNA. Tiene una secuencia RCCA.
El brazo del anticodón contiene el anticodón. (Secuencia
de tres bases se aparea con el codón del mRNA) y la
posición de balanceo. En su extremo se encuentra el bucle
del anticodón, que contiene siempre siete nucleótidos no
apareados.
Los otros brazos principales son el brazo D que contiene
dos o tres residuos del nucleótido infrecuente
dihidrouridina (D), y el brazo TΨC, que contiene residuos
de ribotimidina (T) y pseudouridina (Ψ). Los brazos D y
TΨC tienen una contribución importante en el
plegamiento de las moléculas de tRNA y el brazo TΨC
interacciona con el rRNA de la subunidad grande.
El brazo adicional puede aparecer o no, con longitud
variable.

Nucleótidos especiales:
D → 5,6-dihidrouridina; G*→ Guanosina / 7-metilguanosina
Py→ Pirimidina (Y); Pu → Purina (R); Ψ→ Pseudouridina

Moléculas de RNA secundarias

• snRNA (small nuclear RNA): participan en el procesamiento de los precursores de mRNA. Se producen a
partir del mRNA.
• miRNA y siRNA: participan en la regulación de la expresión génica. Regulan la transcripción y sobre
todo la traducción de la información genética. Regulan la extensión de la información genética.
• Ribozimas (23sRNAribosómico): son enzimas formados por RNA, moléculas de RNA catalíticas. Un
aspecto muy importante del RNA es su capacidad para catalizar diversas reacciones químicas (síntesis de
proteínas o procesamiento de RNA). Se dice por ello que muchos RNA son ribozimas.
• snoRNA: sirve para el procesamiento de RNA.
RNA ribosómico: forma parte de los ribosomas, las complejas maquinarias celulares que
sintetizan las proteínas. Tiene muchos elementos
estructurales en la estructura secundaria: Bucles , Horquillas,
Abombamientos.
Estructuras secundarias → confieren la actividad enzimática
→ 23S RNA.

SUBUNIDAD GRANDE
• Bacterias: 5S, 23S (36 proteínas)
• Eucariotas: 5S, 28S, 5’8S (49 proteínas)

SUBUNIDAD PEQUEÑA
• Eucariotas: 18S (33 proteínas)
• Bacterias: 16S (21 proteínas)

TRANSCRIPCIÓN

• De las dos hebras de DNA sólo se usa una como molde.

• La hebra de DNA complementaria del molde, la hebra no molde o hebra codificante, es idéntica en
secuencia de bases al RNA transcrito a partir del gen, con T en lugar de U. La naturaleza de las hebras
puede variar. Se transcribe una de las dos
cadenas del gen (distinta para distintos
productos génicos).
• Se leen las hebras en dirección opuestas.

Promotores: Secuencia del DNA que dirige la unión de la RNAPol al DNA. Sólo en el DNA.
La transcripción es selectiva. Es la región del DNA que regula el inicio de la transcripción de un gen. Se
determina mediante secuencias en el propio DNA: promotores. Dirigen la unión de la RNA polimerasa al DNA.
Cuanto más se asemeja la secuencia de un promotor a una secuencia consenso mayor va a ser la
afinidad del RNA pol a ese promotor = más se va a transcribir ese gen.

Corriente arriba (-) es hacia 5´ y corriente abajo (+) es hacia 3´

• Procariotas
o A la secuencia de DNA a la que se le une la RNA polimerasa a través de la subunidad δ, y que indica el
inicio de la transcripción, se le denomina promotor.
o Los promotores basales procarióticos pueden ser de tamaños muy diferentes, pero casi todos comparten
un par de secuencias cortas, de 6 nucleótidos, que se sitúan a 10 y 35 bases antes del punto de inicio de la
transcripción. Como al nucleótido constituyente de dicho punto se le asigna el valor de +1, las secuencias
se conocen como secuencias -10 y -35.
o Un elemento de reconocimiento rico en AT, denominado elemento UP, se encuentra entre las
posiciones -40 y -60 (corriente arriba) en los promotores de algunos genes con un nivel de expresión
elevado. La subunidad α de la RNA polimerasa se une al elemento UP.
 o Nucleotidos espaciadores
o Secuencias consenso: secuencias que no son idénticas en todos los promotores bacterianos, pero los
nucleótidos se encuentran con mucha más frecuencia que otros en cada posición.
▪ La secuencia -10 se denomina caja de Pribnow, y su secuencia consenso es TATAAT.
▪ La secuencia -35 tiene como secuencia consenso TTGACA.

• Eucariotas
o Los promotores basales son imprescindibles para el inicio de la transcripción.
o Destacan dos secuencias comunes:
▪ Una secuencia semejante a la secuencia Pribnow de las procariotas. Está situada 30
nucleótidos antes del punto de inicio de la transcripción (corriente arriba) y se denomina caja
TATA, o caja de Hogness. La secuencia consenso es TATAAA.
▪ Una secuencia denominada elemento iniciador o Inr, que engloba el punto de inicio de
transcripción.

PROCARIOTAS
INICIACIÓN

El inicio se produce cuando la RNA polimerasa se une al promotor. A diferencia de la DNA polimerasa, la RNA
polimerasa no requiere de cebadores para iniciar la síntesis. Hay una fase de unión de la ARNPol a la
secuencias promotores se forma el complejo cerrado que pasa a complejo abierto cuando se separan las hebras
de -40 a +2,3.
• Reacción general:
(NMP)n + NTP → (NMP)n+1 + PPi PPi + H2O → 2Pi catalizada por pirofosfatasa.
• Requisitos:
Molde DNA, 4 NTPs, Mg+2 (cofactor importante para coordinar los sitios activos), Zn+2

RNAPol: No hay actividades 3’ → 5’ exonucleasa = mayor error, cada 10^4-10^5nt. Tampoco hay factores que
aumentan la procesividad

*Omega: es una holoenzima

*Existen varios tipos de delta, pero el más importante es el de 70000 k-Da.

Dentro del promotor, la subunidad δ de la RNA polimerasa reconoce y se une a las dos secuencias comentadas
(-10 y -35). La polimerasa desenrolla un pequeño tramo de DNA alrededor del punto de inicio de la
transcripción, formando una burbuja de transcripción. El DNA queda así en forma monocatenaria y en
disposición de servir como molde para su transcripción.
La RNA polimerasa comienza a sintetizar la cadena naciente, hasta adicionar 10 nucleótidos. En ese momento
la subunidad δ se separa y disminuye la afinidad de la RNA polimerasa por el promotor, lo que permite seguir
avanzando sobre el molde de DNA polimerizando: elongación.
El conjunto de 2 subunidades α, 1 β, 1 β’ y 1 ω constituye el núcleo de la polimerasa. Dicho núcleo cataliza la
incorporación de los NTP al ARN sin necesidad de que esté unida a la subunidad δ.
Sin embargo, sin la subunidad δ, la ARN polimerasa no puede reconocer las secuencias específicas de DNA que
indican el inicio de la transcripción, al principio de cada gen.
ELONGACIÓN
Durante esta fase, la RNA polimerasa avanza sobre el molde de DNA y continúa sintetizando la molécula de RNA.
En su avance, desenrolla el DNA por delante de la burbuja de transcripción, y lo vuelve a enrollar por detrás,
quedando siempre una región transitoria que es donde se da la transcripción, y en la que unas 8-9 bases de la
cadena de RNA naciente permanecen unidas al molde de DNA por complementariedad (= híbrido RNA-DNA).

La incorporación de NTPs continúa hasta que la RNA polimerasa encuentra una señal de terminación,
momento en el que se detiene la transcripción, disociándose la RNA polimerasa del molde de DNA. El δ70 se
disocia y se sustituye por NusA.

Al abrir las hebras se produce un superenrollamiento positivo en la parte delantera y negativo en la trasera.
Las moléculas encargadas de liberar esta tensión son las topoisomerasas.

TERMINACIÓN
Dependiente de rho (ρ)

Una proteína de terminación, denominada rho, se une al RNA y produce su liberación del molde de DNA.
● Secuencia rica en CA llamada elemento rut (rho utilization).
● La proteína ρ es hexamérica y tiene actividad helicasa (separar las dos hebras de DNA).
● El movimiento de la proteína ρ sobre el RNA naciente hacia el híbrido DNA-RNA requiere energía que
viene de hidrólisis de ATP.
*La razón por la que se da el proceso no es porque ARN pol se encuentre con codón de terminación

Independiente de rho (ρ)

● Algunas secuencias pausan la RNApol. VALE CRACK

● Normalmente la RNApol continúa después de la pausa.
● Si el ARN pol llega a una secuencia de terminación, la pausa resulta en terminación.
Se transcribe la secuencia de terminación, que es una secuencia palindrómica rica en GC seguida de
varios residuos de A. Da lugar a la formación de una horquilla estable en el ARN por
autocomplementariedad de bases. Se altera la unión del RNA con el molde de DNA, contribuyendo
también a la disociación de la molécula de RNA por las interacciones bastante débiles entre la cadena de
poli A y la secuencia de poli U transcrita complementaria.
 EUCARIOTAS Procariotas → RNA polimerasa + subunidad δ
Eucariotas → RNA polimerasa + FT

Es un proceso más complejo:

- Los eucariotas poseen varios tipos de RNA polimerasas. Para iniciar la transcripción = RNA polimerasa
(completa u holoenzima).
- Estas RNA polimerasas necesitan interaccionar con determinadas proteínas (factores de transcripción, FT)
para poder unirse al DNA e iniciar la transcripción.
- La maquinaria transcripcional hace actuar sobre la cromatina, con diferentes grados de compactación.
- Esta complejidad hace que la regulación génica sea mucho más sutil que en procariotas.

RNA polimerasas

INICIACIÓN

Factores de transcripción (FT)

Los principales FT de la RNA pol II son:

1. TFIID: reconocimiento de promotores (a través de la TBP).
2. TFIIH: helicasa y quinasa (fosforila dominio CTD).

El RNA interacciona con gran cantidad de estos factores, los cuales, a su vez, han de unirse a las distintas
secuencias promotoras de los genes que van a ser transcritos.
Se distinguen 2 tipos de FT:
● FT generales: reconocen los promotores basales, imprescindibles para el inicio de la transcripción.
● Otros FT: se unen a otras secuencias promotoras, regulando la expresión de genes específicos.

Para que comience el proceso de transcripción es

necesaria la actuación de los siguientes FT generales:
● TFIID: es el primer paso en la formación del
complejo de iniciación de la transcripción. Está
formado por varias subunidades:
- TBP: proteína de unión a TATA, que
permite a FTIID unirse a la secuencia
promotora de la caja TATA. El TFIIB se une
al TBP y permite la unión de la RNA
polimerasa II.
- TAF: varios polipéptidos denominados
factores asociados a TBP, con capacidad de
unirse a diferentes secuencias de los
promotores basales.
● TFIIF: el siguiente factor que se une a la
polimerasa.
● TFIIE y TFIIH: finalmente, la constitución del
complejo de iniciación se completa con la unión de
dos factores más. TFIIH posee varias subunidades
y dos actividades enzimáticas muy importantes:
- Actividad helicasa: le permite separar las
hebras de DNA alrededor del sitio de inicio,
 para que la RNA polimerasa pueda acceder a las bases.
- Actividad quinasa: fosforila determinadas secuencias repetidas del dominio C-terminal (CTD) de
la subunidad mayor de la RNA polimerasa II.

1. Primero ocurre el ensamblaje de TBP con la ayuda de TFIIB a la caja TATA (-30). El TFIIA estabiliza la unión
de esos dos factores al promotor. Se forma el complejo cerrado.
2. Dentro del complejo cerrado el DNA es desenrollado en la región Inr -secuencia consenso- por la actividad
helicasa de TFIIH y TFIIE, que crean el complejo abierto. En el complejo tendremos todos los factores ligados.
3. El dominio carboxilo terminal de la subunidad mayor de la pol II es fosforilado por TFIIH y entonces la
polimerasa abandona el promotor y empieza la transcripción.
4. El complejo durante la síntesis de los primeros 60 nucleótidos permanece cerrado.

ELONGACIÓN

La elongación requiere de la participación de numerosos factores de elongación, algunos de los cuales son
reclutados por el dominio CDT fosforilado.

Al comienzo de la elongación se unen los factores de elongación (FE) que aumentan la actividad de la RNA pol II,
evitan que se interrumpa la elongación y coordinan las interacciones entre complejos proteicos involucrados en
el procesamiento post-traduccional.

TERMINACIÓN

En la terminación no hay señales definidas, ocurre la desfosforilación y la disociación de la ARN pol II, que
luego es reciclada. La elongación del RNA o la RNA polimerasa es inhibida por la actinomicina D, que se intercala
en el DNA y lo curva produciendo una interferencia. Así también la acridina, la rifampicina y ⍺-anantina inhiben
la elongación.

PROCESAMIENTO Y MADURACIÓN DEL RNA

Una molécula de RNA recién sintetizada se denomina transcrito primario: sus elementos son intrones, exones,
caperuza 5’ y UTR (secuencia final no codificante) sobre la que se une la cadena de poli A.
● Los mRNA eucarióticos se modifican en ambos extremos.
● Un residuo modificado, denominado caperuza 5’, se añade al extremo 5’.
● El extremo 3’ se corta y se le añaden unos 80 a 250 residuos de A para formar una “cola” de poli A.
Luego, en un proceso denominado splicing (corte y empalme), los intrones se unen para formar una secuencia
continua que especifica un polipéptido funcional.

Caperuza 5’
Se forma por condensación de una molécula de GTP con el trifosfato del extremo 5’, la guanina se metila
posteriormente en N7 y por la guanina 7-metiltransferasa y se metila adicionalmente en C2’. Antes de agregar la
7-metil guanosina el extremo 5’ se desfosforila por la fosfohidrolasa. El producto final es 𝛼, 𝛽 y 𝛾 trifosfato
metilguanosina .El residuo de 7-metilguanosina esta unido al residuo 5’-terminal de mRNA a través de un
enlace 5’, 5’-trifosfato poco común.

También se une a un complejo proteico específico y participa en la unión del mRNA al ribosoma para iniciar la
traducción. El casquete (caperuza) en 5’ protege al mRNA de las ribonucleasas.
Cola poli A
La mayor parte de mRNA eucarióticos tiene una serie de 80 a 250 residuos de A en el extremo 3’ que forman la
cola de poli A.

La adición de la cola poli A necesita un cebador de ARN pero no molde. El sitio del mRNA donde se produce el
corte y la adición de poli A está indicado por dos secuencias:
1. La secuencia 5’-AAUAAA-3’, altamente conservada, situada de 10 a 30 nucleótidos en el lado 5’ (corriente
arriba) del sitio de corte.
2. La secuencia peor definida, rica en residuos de G y U, situada de 20 a 40 nucleótidos corriente abajo del
sitio de corte.

El corte catalizado por la ribonucleasa intracelular genera el grupo 3’-hidroxilo libre que caracteriza el
extremo final del mRNA, al que se añaden inmediatamente los residuos de A por la poliadenilato polimerasa
(Poli A polimerasa).

Muchos mRNA bacterianos también adquieren colas de poli A, pero estas colas estimulan la degradación del
mRNA en lugar de protegerlo. Esta cola sirve de lugar de unión de una o más proteínas específicas. La cola de
poli A y sus proteínas asociadas ayudan a proteger el mRNA de la destrucción enzimática y le dan estabilidad a
la molécula.

Intrones y exones

En los eucariotas muchos genes de los polipéptidos están interrumpidos por secuencias NO codificantes
(intrones). Los intrones del DNA son transcritos junto con el resto del gen por las RNA polimerasas. A
continuación, los intrones del transcrito primario del RNA son cortados y los exones empalmados para formar
un RNA maduro y funcional.

Hay 4 clases de intrones.

• Tanto el grupo I como el II son autocatalíticos (no necesitan enzimas proteicos), y no necesitan
cofactores de alta energía como ATP. Los grupos III y IV sí necesitan los complejos proteicos.
• En ambos grupos, los mecanismos de corte y empalme incluyen dos reacciones de transesterificación,
en las que un grupo 2’ o 3’-hidroxilo de una
ribosa realiza un ataque nucleofílico sobre un
fósforo, formándose en cada paso un nuevo
enlace fosfodiéster.

Grupo I:
Ocurre en genes snRNA, mitocondriales, de rRNA,
mRNA y tRNA. Ocurre un autocorte y empalme sin
uso de proteínas ni ATP.
El corte y empalme requiere un nucleósido de
guanina o un cofactor nucleotídico, pero el cofactor
no se utiliza como fuente de energía, el grupo
hidroxilo de la guanina hace un ataque nucleofílico al
fosfato 5´. El 3’-hidroxilo del exón desplazado en este
paso actúa seguidamente como nucleófilo en una
reacción similar en el extremo 3’ del intrón.
El resultado es la escisión exacta del intrón y la
ligación de los exones. Se trata de un proceso
catalítico catalizado por la propia RNA.
 Grupo II (imagen de la izquierda en la esquina superior
no confundirse. Rta: vale crack): Ocurre en el mRNA
mitocondrial en hongos y plantas. El proceso es
parecido pero se usa un nucleósido de adenina. Se
produce un intermedio ramificado con una estructura
en forma de lazo.

Grupo III
Se encuentra en los transcritos primarios de mRNA
nuclear.
Se denominan intrones de espliceosoma, porque su
eliminación ocurre en el interior y por acción de un
gran complejo proteico denominado espliceosoma.

*CBC se une a la caperuza

Los intrones experimentan corte y empalme por el
mismo mecanismo de formación de lazo de los intrones
del grupo II.

El espliceosoma está formado por complejos RNA-proteína especializados, denominados pequeñas

ribonucleoproteínas nucleares (snRNP). Cada snRNP contiene un RNA de 100 a 200 nucleótidos de un tipo
denominado RNA nuclear pequeño (snRNA).
Mecanismo de corte y empalme en los transcritos primarios de mRNA
1. Reacciones de apareamiento de RNA en la formación de los complejos del espliceosoma
a. El snRNP U1 tiene una secuencia próxima del extremo 5’ que es complementaria del sitio de corte y empalme
del extremo 5’ del intrón.
b. El apareamiento de U1 a esta región del transcrito primario ayuda a definir el sitio de corte y empalme en 5’
durante el ensamblaje del complejo de corte y empalme.
2. Ensamblaje de los espliceosomas
a. Primero se unen los snRNP U1 al extremo 5 y U2 al extremo 3, usando ATP. A continuación se unen los
restantes snRNP (el complejo U4-U6 y U5) para formar un espliceosoma inactivo.
b. Reordenamientos internos convierten esta especie en un espliceosoma activo, del cual han sido descartados
U1 y U4 y donde U6 está apareado simultáneamente con el lugar de corte en 5’ y con U2.
c. A continuación siguen las etapas catalíticas, similares a las de los intrones del grupo II: formación del lazo y
liberación del intrón. El complejo U2-U5-U6 liberal el intrón.

Grupo IV:
Se usan endonucleasas y ATP
rRNA en procariotas
1. Antes del corte del precursor de RNA 30S es metilado en bases especificas, y algunos residuos de
uridina se convierten en pseudouridina. Las reacciones de metilación son de múltiples tipos; algunas
ocurren en las bases y otras en los grupos 2’-hidroxilo.

2. El corte libera precursores de los rRNA y tRNA. El corte en los puntos marcados como 1, 3 y 3 es llevado a
cabo por los enzimas RNasa III, RNasa P (ribozima) y RNasa E, respectivamente.

3. Los rRNA finales, 16S, 23S y 5S, resultan de la acción de una variedad de nucleasas especificas. Las
siete copias del gen pre-rRNA difieren en número, localización e identidad de los tRNA incluidos en el
transcrito primario. Algunas copias del gen tienen segmentos genéricos del tRNA adicionales entre los
segmentos de rRNA 16S, 23S y en el extremo 3’ más alejado del transcrito primario.

rRNA en eucariotas
Procesamiento similar a procariotas. Como en las bacterias, la maduración consiste en reacciones de corte por
endo o exorribonucleasas y en reacciones de modificación de nucleósidos. Las reacciones de corte y todas las
modificaciones requieren pequeños RNA nucleolares (snoRNA), que forman parte de complejos proteicos del
nucléolo que recuerdan a los espliceosomas.

1. El precursor 45S se metila, algunas uridinas se convierten en pseudouridina y también se producen

unas pocas modificaciones de otro tipo. Una serie de cortes enzimáticos del precursor 45S producen los
rRNA 18S, 5’8S y 28S, y las subunidades ribosómicas gradualmente toman forma con la incorporación
de proteínas ribosómicas.
2. Se produce un corte inicial del pre-rRNA y se producen pre-40S (40S) y pre-60S (60S). Entre paréntesis →
subunidades ribosómicas maduras

tRNA en eucariotas y procariotas

El tRNA se procesa tanto en eucariotas como en procariotas.

1. Las secuencias nucleotídicas mostradas en amarillo se eliminan del transcrito primario.

2. A continuación, se añade CCA al extremo 3’ (brazo del aminoácido), un paso necesario en la maduración
de los tRNA eucarióticos, así como en los tRNA bacterianos que carecen de esta secuencia en el transcrito
primario. Mientras los extremos están siendo modificados, también se modifican bases específicas del
resto del transcrito.
3. La etapa final para los tRNA eucarióticos es el corte y empalme del intrón de 14 nucleótidos. Los intrones
se encuentran en algunos tRNA eucarióticos, pero no en los tRNA bacterianos
 TRANSCRIPTASA INVERSA

Ciertos virus que infectan células animales contienen en el interior de la partícula vírica una DNA
polimerasa dependiente de RNA denominada transcriptasa inversa.

1. Durante la infección, el genoma de RNA monohebra y la enzima penetran en la célula del huésped.
2. La transcriptasa inversa primero cataliza la síntesis de una cadena de DNA complementaria del
RNA vírico, y a continuación degrada la cadena de RNA del híbrido RNA-DNA gracias a su actividad
ribonucleasa y lo reemplaza con DNA.
3. Se pasa de una hebra sencilla de ADN a una hebra doble, con la función DNA pol dependiente de ADN de la
transcriptasa. La hebra doble de ADN queda incorporado en el genoma de la célula eucariótica del huésped.

Los retrovirus son característicos por tener transcriptasa inversa.

*Es posible encontrar moléculas de doble hebra de ARN en virus.

Hay actividad 3' exonucleasa → Replicación,

Se usa todo el DNA como molde para obtener el producto → Replicación,
Los mononucleótidos que se usan son trifosfato. Es decir, no son ni mono ni difosfato. → Ambas,
No hay actividad 3' exonucleasa → Transcripción,
No necesita cebador → Transcripción,
Hay tres fases: Inicio, elongación y terminación → Ambas,
Se usa sólo parte del DNA como molde → Transcripción, Necesita cebador → Replicación,
Sólo se usa una de las dos hebras de DNA como molde para obtener el producto → Transcripción,
Necesitan molde → Ambas, La síntesis ocurre en dirección 5'->3' → Ambas,
La polimerasa correspondiente tiene una subunidad específica para aumentar la cantidad de
nucleotidos que se añaden antes de que la polimerasa se disocie → Replicación
Procariotas Eucariotas

¿Cuál es la reacción global de la transcripción? [(NMP)n + NTP ‑> [(NMP)n + NTP ‑>
(ignorar la primera reacción) (NMP)n+1 + PPi] (NMP)n+1 + PPi]

¿Dónde comienza la transcripción? [Promotor] [Promotor]

En general, ¿cómo son los genes que se [Policistrónicos] [Monocistrónicos]

transcriben?

¿cómo se denomina el primer nucleótido que se [+1] [+1]

transcribe?
¿Qué secuencias consenso aparecen en los [Caja Prinbow] [Caja TATA]
promotores?

¿Qué enzima se encarga de liberar la tensión [Topoisomerasa] [Topoisomerasa]

generada tras la desnaturalización del DNA?

¿Quién se encarga de desnaturalizar el DNA en el [Núcleo de la RNA [TFIIE y TFIIH]

inicio de la transcripción? polimerasa]

¿Cuántas RNA polimerasas hay? Indícalas [Uno. RNA [Tres. RNA polimerasa I, II y
polimerasa] III]

¿Qué molécula reconoce el promotor? [Subunidad sigma [TBP]

de la RNA
polimerasa]

¿Qué enzima transcribe el mRNA? [RNA polimerasa] [RNA polimerasa II]

¿Qué enzima transcribe el tRNA? [RNA polimerasa] [RNA polimerasa III]

¿Qué enzima transcribe el rRNA? [RNA polimerasa] [RNA polimerasa I]

Se han descrito dos mecanismos para finalizar la [Sí] [No]

transcripción: uno dependiente de Rho y otro
independiente. (Responde: Sí o No)

¿finaliza la transcripción tras la defosforilación de [No] [Sí]

la RNA polimerasa? (Responde: Sí o No)

¿Qué dos procesos principales ocurren en la [Cortes del RNA y [Cortes del RNA y
maduración del tRNA y rRNA? modificaciones de modificaciones de bases]
bases]

¿Dónde tiene lugar el procesamiento del rRNA? [Citoplasma] [Nucleolo]

En la maduración del tRNA, ¿CCA se añade en el [Sí] [Sí]

extremo 3’? (Responde: Sí o No)

¿Dónde tiene el mRNA la caperuza? [En ningún sitio] [Extremo 5']

 Tema 6: Síntesis de proteínas. Traducción
CÓDIGO GENÉTICO
Se trata de la relación química que existe entre un lenguaje de 4 nucleótidos a un lenguaje de
20 aminoácidos. Por tanto, relaciona la secuencia de bases en el ARN con la secuencia de
aminoácidos en las proteínas.
● Hacen falta al menos 3 nucleótidos para codificar un aminoácido para tener suficientes
combinaciones, por ello se habla de codones o tripletes. Si dos nucleótidos codificaran
un aa (4^2) habría 16 aminoácidos distintos. Sin embargo,
si tres nucleótidos codifican un aminoácido (4^3) nos
encontramos con 64 combinaciones. En este caso nos
pasamos de los 20 existentes, pero hay aminoácidos que
están sintetizados por más de un triplete, y además existen
3 codones de finalización.
● Los tripletes (codones) no se solapan y no hay “signos de puntuación” entre los codones.
El código carece de signos de puntuación y se lee secuencialmente. Esto se supo porque
sabiendo que existen 20 tipos de aminoácidos diferentes, si solo un nucleótido codificara
a un aa tan solo habrían 4 combinaciones posibles.
● Tiene direccionalidad. El código se lee desde el extremo 5’ del RNA mensajero hacia su
extremo 3’.
● Un aminoácido puede ser especificado por más de un codón, por lo que el código se
califica como degenerado, pero no ambiguo porque no existe un codón que codifique
para más de un aminoácido.
● El código genético es casi universal. Con la excepción de pequeñas variaciones en las
mitocondrias.

ELUCIDACIÓN DEL CÓDIGO (Experimento: Qué aa codifica para cada codón)

Así se descifró el código genético. Está degenerado, lo que da ventaja a mutaciones. Solo hay
dos aa codificados por un codón (metionina y triptófano).
Marco de lectura abierta

Los codones son la clave de la traducción de la información genética, que hace posible la síntesis
de proteínas específicas. El marco de lectura se establece cuando empieza la traducción de una
molécula de mRNA y se mantiene mientras la maquinaria de síntesis lee secuencialmente un
triplete tras otro. Si el marco de lectura inicial se desplaza una o dos bases o si de algún modo la
traducción pasa por alto un nucleótido en el mRNA, todos los codones siguientes estarán fuera
de registro; el resultado es normalmente una proteína “sin sentido” con una secuencia de
aminoácidos alterada.

ORF (open Reading frame - marco de lectura abierta): Secuencia de ADN que comienza en
AUG y finaliza en un codón stop. (En una secuencia de nucleótidos al azar, uno de cada 20
codones de cada marco de lectura, es, como promedio, un codón STOP). En general, un marco de
lectura sin un codón de terminación en 50 o más codones, se denomina marco de lectura abierto
(ORF). Normalmente se detectan para predecir genes, pero no está demostrado que se
transcriban. En eucariotas, el ORF tiene intrones. Los marcos de lectura abiertos largos
normalmente corresponden a genes que codifican proteínas.
CDS (coding sequence): Secuencia (de DNA o RNA) codificante que se traduce finalmente a
proteína. En procariotas en ORF y el CDS es el mismo; en eucariotas está dentro de la ORF.

HIPÓTESIS DEL BALANCEO (o tambaleo)

Al unirse al tRNA las dos primeras bases del codón se unen al anticodón, pero la primera base
del anticodón es menos selectiva. Esta holgura de la primera base del anticodón se llama
hipótesis de balanceo. Los primeros dos nucleótidos del codón se emparejan con los primeros
dos nucleótidos del anticodón mediante el emparejamiento de Watson y Crick (Johnny el mazas).
Mientras que el primer nucleótido del anticodón puede unirse por emparejamientos atípicos.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA TRADUCCIÓN

La traducción es el proceso en el cual la información, que estaba almacenada en el ADN, se va a

expresar funcionalmente en forma de proteínas.
➔ En ribosomas libres o en ribosomas asociados al RE.
➔ Dirección específica: Lectura mRNA: 5´→ 3´ Síntesis de proteínas: NH2 → COOH
➔ Codón de lectura inicial: AUG, codifica a metionina (Met).
➔ Selectiva
➔ Requiere adaptador: tRNA
➔ Ocurre de forma repetida (polisoma o polirribosomas)
➔ En eucariotas el mRNA tiene que salir del núcleo ya que el procedimiento ocurre en el
citoplasma, pero no en bacterias
➔ La traducción y la transcripción ocurren de forma coordinada

ETAPAS DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

1) Activación de los aminoácidos por la aminoacil-tRNA sintetasa

Se trata del proceso en el cual el aminoácido va a unirse a su ARNt específico, requisito previo
a la traducción. Por cada aminoácido que es cargado en su respectivo ARN se gastan 2 ATP. El
aminoácido se va a unir al ARNt mediante un enlace éster que se va a formar entre el grupo
carboxilo del AA y el grupo 3’-OH del adenilato que está en el ARNt, dando lugar a un
aminoacil-tRNA. El intermediario es el aminoacil-AMP y el factor de la reacción es el Mg2+.

Pues bien, este proceso de activación tiene lugar en dos etapas: etapa de activación y etapa de
transferencia. Ambas etapas son catalizadas por la enzima Aminoacil ARNt sintetasa. Estas
enzimas son específicas para cada aminoácido y para cada ARN de transferencia. Algunas
aminoacil-tRNA sintetasas tienen prueba de lectura.
Hay dos clases de aminoacil tRNA sintetasas (aRS)
En ambos casos hay activación del aminoácido con ATP y la formación del 5’ aminoaciladenilato
● Clase I: –Enlace AA-2’OH Se necesita transesterificación para unirse a 3’OH.
● Clase II: - Enlace AA-3’OH
Especificidad de la aRS
No todos los aRS tienen los tres mecanismos de especificidad. Se corrige el codón que no
corresponde al anticodón.
1. Unión preferente de sustratos concretos: la aRS identifica los tRNA por unos puntos
de discriminación, que pueden servir de reconocimiento para una aRS o para varias.

2. Corrección (hidrólisis) de la aminoacil-tRNA unidos incorrectamente. Los aRS

tienen un lugar de corrección además de un lugar de síntesis, en este lugar de corrección
se hidrolizan los aminoácidos discriminados por el tamaño.
3. Hidrólisis de aminoacil-tRNA incorrecto en disolución

2) Iniciación

Ribosomas

• Proteínas de la subunidad 30S: S1-S21

• Proteinas de la subunidad 50S: L1-L36

L7 = L12 modificado (4 copias en total). Al tener 4 copias así se cumple el nº total de proteínas (36)

L8 = 3 proteínas en complejo

L26= S20

En el ribosoma:
–Se comprueba la correspondencia codón (mRNA) - anticodón (tRNA)
–No se comprueba la correspondencia codón (mRNA) - aa

Son los complejos responsables de la síntesis proteica y de la elucidación del código genético.
El ribosoma consta de tres sitios:
● Sitio A: punto de entrada para el aminoacil-ARNt (excepto para el primer
aminoacil-ARNt, fmet-ARNt, que entra en el sitio P)
● Sitio P: Donde se "aloja" el peptidil-ARNt
 ● Sitio E: Sitio de salida del ARNt, una vez descargado tras ofrecer su aminoácido a la
cadena peptídica en crecimiento.

Secuencia Shine-Dalgarno: Exclusivo iniciación en procariotas. 2 reacciones para la síntesis de

fMet-tRNA y esta se une al ribosoma en el sitio P sólo para la iniciación. Se encuentra corriente
arriba (-) desde el codón de inicio.

Secuencia Kozak y metionil-tRNA: Exclusivo iniciación en eucariotas.

• El primer aminoácido de Met NO se formila
• Hay dos tRNAMet: Una para la Met de inicio y otra para las metioninas de elongación
• Met-tRNAMet de inicio se une al ribosoma en el sitio P sólo para la iniciación

Complejo de iniciación

PROCARIOTAS FUNCIÓN EUCARIOTAS

IF1 Impedir que fMet-tRNA se una al sitio A eIF1A

IF3 Impedir que la subunidad grande y eIF3

pequeña se unan

IF2 Unir GTP y hacer que el fMet-tRNA se eIF2

una al sitio P

vale crack - Cielo Goicoechea 2020 Unirse a la caperuza 5’ (eIF4F) eIF4E

excelente servicio - Cielo Estructural ¨de andamiaje¨ (eIF4F) eIF4G

Goicoechea 2020

no soy yo es oscar- Vlad el -Helicasa (eIF4F) eIF4A

Escopetas 2020 -ATPasa

“johny el mazas” - Paola Cristóbal Ayudar al eIF4A eIF4B

2020

yolanda aprueba esto- Yolanda la -Análogo al IF2 eIF5B

de las canciones italianas por la -Producir hidrólisis de GTP unido a eIF2
mañana 2020 -Une e hidroliza GTP
*En eucariotas el complejo eIF4F une los extremos 3' y 5' del mRNA???????????
La iniciación de la traducción en procariotas comienza con las subunidades 50s y 30s sin asociar.
La subunidad 30S no tiene sitio E, solo la 50S.

❖ El IF-1 bloquea el sitio A para asegurar que el fMet-ARNt sólo se puede acoplar al sitio P
y que ningún otro aminoacil-ARNt puede acoplarse al sitio A durante la iniciación.
 ❖ El IF-3 bloquea el sitio E y evita que las dos subunidades se asocien. El IF1 y IF3 se unen
al ARNr 16s de la subunidad ribosómica pequeña 30S gracias a la secuencia
Shine-Dalgarno (-5/-10 desde el codón de iniciación AUG).
❖ El IF-2-GTP se asocia con el fmet-ARNt y le ayuda a acoplarse con la subunidad
ribosómica pequeña. Esto ayuda a posicionar correctamente el ribosoma sobre el ARNm
para que el sitio P esté directamente sobre el codón de
iniciación AUG. El IF-3 ayuda a posicionar el fmet-ARNt en el
sitio P, de manera que el fmet-ARNt interactúa mediante el
emparejamiento de bases con el codón de iniciación del ARNm
(AUG).

En el caso de los procariotas el GTP se hidroliza y eso provoca el

desacoplamiento de todos los factores de iniciación. También se deja
libre el sitio A, se une la subunidad grande y se forma el complejo de
iniciación. En el tiempo necesario para la hidrólisis de GTP, si el
emparejamiento de bases entre el codón y el anticodón no es correcto,
el complejo se disocia.

Hay que tener en cuenta que las procariotas pueden distinguir entre un
codón normal AUG (que codifica la metionina) y un codón de iniciación
AUG (que codifica la formilmetionina e indica el comienzo de un nuevo
proceso de traducción).

En el caso de las eucariotas las proteínas son parecidas pero también

está la proteína PAB que se une a la cola poliA.

3) Elongación

PROCARIOTAS EUCARIOTAS

EF-Tu eEF1α

EF-Ts eEF1𝛽ɣ

EF-G eEF2

El polipéptido naciente se alarga mediante la unión covalente de sucesivas unidades de aa,

transportada cada una al ribosoma y posicionada correctamente por su tRNA, que se aparea con
su correspondiente codón en el mRNA. La elongación requiere proteínas citosólicas,
denominadas factores de elongación. La fijación de los aminoacil-tRNA entrantes y el
desplazamiento del ribosoma a lo largo del mRNA están facilitados por la hidrólisis de GTP, a
medida que los residuos son añadidos al polipéptido en crecimiento.

El Tu unido a GTP se enlaza al aminoacil-tRNA para hacer posible la unión al sitio A. Mientras se
hidroliza el GTP se comprueba la correspondencia del codón al anticodón. Si el emparejamiento
es incorrecto, se disociará. Al hidrolizarse el GTP a GDP la EF-Tu se une al EF-Ts para unirse a
otro GTP. Se forma un enlace peptídico entre los aminoácidos mientras ocurre el desplazamiento
del ribosoma y la translocación de los tres nucleótidos de golpe gracias a EF-G-GTP. El primer
tRNA sale por el sitio E y continúa la secuencia. Catalizado por la peptidiltransferasa, se forma
el primer enlace peptídico se forma entre el grupo carboxilo del primer aminoácido y el grupo
amino del segundo en dirección 3’-5’.

4) Terminación y reciclado del ribosoma

La finalización de la cadena polipeptídica está señalada por un codón de terminación del mRNA.
A continuación la cadena polipeptídica se desprende del ribosoma con ayuda de proteínas
denominadas factores de liberación, y el ribosoma es reciclado para una nueva ronda de síntesis.

Requerido: Codón de terminación en mRNA , Factores de liberación (RF-1, RF-2, RF-3, RRF) ,
EF-G , IF-3

Factor de liberación Codones

Procariota RF 1 UAA, UAG

Procariota RF 2 UAA, UGA

Eucariota eRF UAA, UAG, UGA

INHIBIDORES DE ETAPAS ESPECÍFICAS DE LA TRADUCCIÓN EN PROCARIOTAS.

Procariotas: estreptomicina (a [bajas] se leen bases incorrectas y a [altas] se inhibe la

iniciación, puromicina (se une al sitio A parando la extensión), tetraciclina (bloquea el sitio A)..
Eucariotas: cicloheximida o toxina de difteria (inactiva eEF2) y ricina (depuración del 28S
rRNA)

Modificaciones postraduccionales

1. Plegamiento
Proceso reversible que ocurre paso a paso, pero rápido, se produce una reducción de entropía y
de energía libre (proceso espontáneo). Proteína se pliega a su estructura nativa,, pero puede
ocurrir erróneamente. Interacciones hidrofóbicas para contribuyen al plegamiento correcto.
Sin embargo, estas proteínas si interaccionan entre sí forman agregados.
Chaperonas para el plegamiento: impiden que se plieguen mal las proteínas.
Priones inducen el mal plegamiento de las proteínas, lo que lleva a una mala funcionalidad de la
proteína. Se forman placas amiloides (precipitados de proteínas que se acumulan en el espacio
intracelular). Estas placas impiden la sinapsis de neuronas.

Chaperonas para el plegamiento de proteínas

Si no está correctamente plegada

repite el ciclo o va al sistema de
chaperoninas.

Procariotas Eucariotas

DnaK Hsp70

DnaJ Hsp40

GrpE NEF

Chaperoninas:
Dos sistemas GroEL (barril de 7 subunidades) se cierran con una ‘’tapa’’, el GroES. El sistema
GroEL- GroEs tiene varios ATP que se van hidrolizando de manera aleatoria, lo que da tiempo a
un plegamiento correcto. En el interior de esta estructura se pliega la proteína y después,
cuando se abre el GroES, se libera.
En el caso de las eucariotas este proceso ocurre con una única proteína, la Hsp60.
[chaperonas] baja + [ROS (radicales O2 y H2O2)] alta = Plegamiento incorrecto

2. Formación de puentes disulfuro

Es reversible. Puentes disulfuro se van a formar entre residuos de cisteína, formando un enlace
covalente. Esto va a condicionar la estructura final de la proteína.
Se forma un enlace covalente que se puede revertir con GSSG- glutatión, consiste en 3aa (glicina,
glutamato, cisteína) como también tiene cisteína puede ser reducida u oxidada para el puente
disulfuro. El glutatión pasa a se 2GSH.
3. Modificaciones de aminoácidos (fosforilación de grupos –OH, carboxilación, metilación,
acetilación, hidroxilación, glicosilación).
● Fosforilación: Es reversible. Ocurre en aa que tengan grupos alcohol. Consiste en la
adición de grupos fosfatos a determinados aminoácidos (Ser,Thr, Tyr) aportados por la
molécula de ATP. Este proceso se lleva a cabo en la activación o desactivación de
proteínas, en el control metabólico, en la traducción de señales. La reacción es catalizada
por quinasas y la reacción inversa por fosfatasas.
● Metilación: Es reversible. Normalmente se metilan Lys y Arg, pero también se pueden
metilar los extremos N-terminal y C-terminal de las proteínas. Se pueden añadir varios
residuos metilo a cada aminoácido. No altera la carga del aa, pero sí al impedimento
estérico. Catalizado por metiltransferasas y la reacción inversa por demetilasas.
● Acetilación: Se acetilan los grupos amino del extremo N-terminal, Lys y Arg. El 50% de
las proteínas eucariotas tiene el extremo N-terminal acetilado. La acetilación elimina
una carga positiva del aminoácido/proteína. Catalizada por acetiltransferasa y la
reacción inversa por desacetilasa.
● Hidroxilación: Se trata de la adición de grupos hidroxilos a determinados aminoácidos.
La unión de -OH a lisina y prolina para dar Hyp y Hyl (hidroxiprolina e hidroxilisina)
dependiendo de la estereoquímica se consigue configuración R/S. Catalizado por
Pro/Lys 4R/S-Hidroxilasa.
● Glicosilación: Ocurre por un enlace en O (Ser, Thr, Hyp, Hyl) o N (Asn) o C (Trp).
Se trata de la adición de hidratos de carbono más o menos complejos, desde glucosa
hasta polisacáridos complejos.
Anclaje GPI: la glicofosfatidilinositol se une a los carbohidratos unidos a una proteína, de
esta manera se ancla el glucolípido a la membrana celular.

Esto tiene lugar en el RE y en el Aparato de Golgi. El transportador de azúcares es el

dolicol. El dolicol con la cadena de azúcares se une a la Asn de una proteína recién
sintetizada. En la base de la cadena de carbohidratos encontramos 2N-Acetilglucosamina
(GlcNAc) y 3-manosa.

Existen tres tipos de glicosilación:

O-glucosilación: se da cuando la estructura de hidratos de carbonos se unen por enlaces
covalentes a los grupos hidroxilos de las cadenas laterales de la serina y treonina. Se
llaman O-glucosilación porque se unen a nivel del oxígeno.
N-glicosilación: se da cuando la parte de hidratos de carbonos se une por enlaces
covalentes al grupo amino de la cadena lateral de la asparagina. Las proteínas que
llevan estos hidratos de carbono unidos reciben el nombre de glucoproteínas y son muy
frecuentes en las proteínas de secreción, como por ejemplo en los anticuerpos.
C-glicosilación: anillo indol del triptófano.

Migración de proteínas: la glicosilación determina el destino de las proteínas

(lisosomas, retículo endoplásmico, mitocondria). Las secuencias que dirigen las
proteínas a una localización celular suelen estar en el extremo amino.

LISOSOMAS: la manosa-glucoproteína + UDP-GlcNAc → Manosa-6-fosfato (catalizado

por 1-GlcNAc fosfotransferasa y 2-Fosfodiesterasa
 RETÍCULO E. : Las proteínas que llevan a cabo este tipo de transporte se caracterizan
porque poseen una secuencia de aa que forman parte de la cadena polipeptídica y que
sirven para la secuencia final.

Esta secuencia se sitúa en el el extremo amino-terminal y presenta una longitud variable

de entre 13 y 36 aa. Contienen 10-15 residuos con grupos R no polares, un residuo o más
cargados positivamente cerca del extremo N-terminal y residuos con grupos R pequeños
cerca del sitio de corte o C-terminal.

MITOCONDRIA
La migración ocurre después de acabar la síntesis.
Las proteínas se unen al Hsp70(chaperona) o MSF. Hay una secuencia señal que permite
unirse al complejo receptor Tom. Ocurre la translocación a la luz mitocondrial donde se
une al Hsp70 y se hidroliza la secuencia señal.
Tom: Complejo transportador/translocasa de membrana externa (“outer membrane”)
Tim: Complejo transportador/translocasa de membrana interna (“inner membrane”)

NÚCLEO
El péptido señal que no se hidroliza es NLS. No se hidroliza porque estas proteínas
entran y salen todo el rato. Es identificado por la importina con dos subunidades. El
complejo importina-proteina se une al poro nuclear. Cada subunidad de la importina
(alfa y beta) se une a una RanGTP mientras que la proteína se disocia. Las dos
subunidades se vuelven a juntar con la hidrólisis de GTP despues de salir del núcleo. La
RanGDP se une a la NTF2 para volverse a meter dentro y la molécula de GDP es relevada
por una de GTP. La RanGEF es el factor de intercambio de nucleótidos de guanosina.

5. Adición de grupos prostéticos

Se trata de estructuras no proteicas que se asocian de forma estable a la cadena polipeptídica y
será necesaria y fundamental para la actividad o función biológica de la proteína. Lo solemos
asociar a las enzimas para pasar de apoenzimas a holoenzimas pero también hay proteínas
que lo necesitan.
6. Adición de lípidos:
Permiten el anclaje de la proteína a la membrana celular. Consiste en la unión covalente de
lípidos a las proteínas. Estas proteínas, en la cadena lateral, se van a unir mediante enlaces
covalentes derivados del colesterol. Esto lo vemos en las proteínas Ras, una proteína G que juega
un papel importante en la diferenciación y proliferación celular.

7. Modificaciones proteolíticas
Eliminación de N-formilmetionina, metionina y otros aminoácidos en N y C terminal. Es
necesario para la activación de proteínas que son sintetizadas en su forma inactiva -zimógeno-.
En la insulina las cadenas a y b se unen por puentes de disulfuro para que la parte sobrante
pueda proteolizarse. Pasa de preproinsulina a insulina activa.

Degradación de proteínas
Se produce en lisosomas o en el citoplasma.
La ubiquitina se une a la proteína diana que ha de ser degradada: ubiquitinación.
3 familias de enzimas que catalizan el proceso. E1 (activadora), E2 (reguladora) y E3 (ligasa). Se
van intercambiando.
La poliubiquitina unida a la proteína interactúa con el proteasoma. Cuando llega al interior del
proteosoma, se produce la hidrólisis y se degradan. Las ubiquitinas interactúan con la partícula
19S, En la partícula 20S -núcleo proteasomico- hay 4 anillos con actividad catalítica

CUESTIONARIO

ADN: TCATGATTTTATTAC → Proteína producto: VIKS

¿Cuál de las siguientes afirmaciones es INCORRECTA?

a. Normalmente (exceptuando el núcleo celular), una vez una proteína se dirige a su localización
final las peptidasas cortan su secuencia señal

b. El complejo ribonucleoproteico SRP dirige las proteínas al retículo endoplásmico

c. Las importinas RanGTP y RanGDP hacen que proteínas con NLS entren en el núcleo

d. El complejo Tim/Tom reconoce y transloca proteínas dirigidas a la mitocondria

e. Las secuencias que dirigen las proteínas a una localización celular suelen estar en el extremo
N

Un mRNA bacteriano tiene 336 nucleótidos incluyendo el codón de inicio y el de stop. ¿Cuántos
residuos de aminoácidos habrá en la cadena polipeptídica obtenida después de la
traducción?

111 porque se quita el codón de stop

Replicación Transcripcióon Traducción

[Síntesis de [Síntesis de RNA a [Síntesis de proteína a

DNA a partir partir de DNA] partir de mRNA]
¿Cuál es el proceso que se lleva a de DNA]
cabo?

[Las dos [Una de las hebras [mRNA]

hebras del del DNA]
¿Qué molécula se utiliza como DNA]
molde para que el proceso se lleve
a cabo?

¿En qué sentido se la el proceso en

sí? [Sentido 5' ‑ [Sentido 5' ‑ 3' ] [Sentido amino ‑
3' ] carboxilo]

[A‑U; G‑C] ----

[A‑T; G‑C]
Por norma general, ¿Cuál es
emparejamiento típico (según
Watson y Crick) de las bases?

[Sitio OriC] [Promotor] [Codón AUG]

En procariotas, ¿dónde empieza?

[Proteína DnaA] [Factor sigma de la RNA [tRNA‑fMet que tiene el

polimerasa] anticodón CAU]
¿Quién reconoce el sitio de inicio
en procariotas?

[Uno] [Muchos] [Muchos]

¿Cuántos sitios de inicio existen en
todo el genoma?
 [DNA [RNA polimerasa] [23S rRNA]
polimerasa III]
En procariotas, ¿cuál es la enzima
principal que participa en el
proceso?¿la que cataliza la reacción
principal?

[Actividad DNA [Actividad RNA [Actividad peptidil

polimerasa y 3'> polimerasa] transferasa]
¿Qué actividad(es) catalítica(s)
5' exonucleasa]
tiene(n) las enzimas mencionadas
en el apartado anterior?

[dNTP] [NTP] [aminoácido]

¿Cuál es el substrato de las
enzimas mencionadas en el
apartado anterior?

[Cuando la [Mediante mecanismos [Cuando aparece un

horquilla de dependientes o codón STOP ]
¿Cómo finaliza el proceso?
replicación da independientes de Rho]
con los
complejos
Ter/Tus]
TEMA 7: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
1. Modificaciones pretranscripcionales.
2. Iniciación de la transcripción.
3. Regulación postranscripcional.
4. Regulación de la traducción.
5. Regulación en eucariotas.

0. INTRODUCCIÓN
La expresión génica es el proceso que va desde que tenemos un gen hasta que se forma el producto.
Limitada por la accesibilidad del DNA que se encuentra condensado en forma de cromatina. La
relajación de la cromatina permite a los factores de transcripción unirse a la cadena. El promotor queda
expuesto al RNA.

- Expresión génica constitutiva: los genes se expresan de forma constante, pero la expresión génica es
pequeña, en casi todas las células, productos que se requieren en todo momento (genes constitutivos)
como por ejemplo la maquinaria del ciclo de Krebs.

- Expresión génica regulada (facultativa): bajo determinadas condiciones moleculares, los genes se
expresan aumentando la concentración de los productos (genes inducibles) o disminuyéndola (genes
reprimibles).

Pasos regulables en la síntesis de proteínas

- La concentración de proteínas depende de varios procesos.
- ​Hay múltiples opciones de regulación en cada paso.

Niveles de regulación de la expresión génica en eucariotas

La expresión de los genes de un organismo superior puede ser regulada a distintos niveles.
- Control pretranscripcional.
- Control de transcripción.
- Control postranscripcional.
Control de procesamiento del RNA.
Control de transporte del RNA.
Control de degradación del RNA.
Control de traducción.
Control del procesamiento de proteínas.
Control de la actividad de las proteínas.
1. MODIFICACIONES PRETRANSCRIPCIONALES
No está en procariotas. Los cromosomas están
condensados en la zona que no van a ser
transcritos. Por tanto, dependiendo del tejido,
los cromosomas estarán descondensados solo en
la parte que les interesa transcribir.
El DNA solo se puede transcribir cuando está en
forma de fibra de 10 nm y depende a su vez de
tres factores:
a)Posición específica de los nucleosomas.
b)Retirada de los nucleosomas.
 c)Avance compatible con la presencia de los nucleosomas.

1.1 REORGANIZACIÓN DE LA CROMATINA

Los factores de transcripción son proteínas muy complejas y el DNA tiene que estar disponible para ellas.

Los complejos remodeladores de cromatina (*CRC) o (HATs) hacen que la cromatina se remodele, la
cromatina se descondensa debido a la relajación de la cromatina. Cuando la cromatina se descondensa, una
región del DNA que incluye el promotor queda expuesta, esto es la exposición del promotor.
*Complejo remodelador de cromatina (CRC): hay diferentes opciones para que el DNA esté más disponible:
- Que haya un cambio conformacional del DNA: relajación para mayor accesibilidad
- Que se dé el desplazamiento del octámero
- Que se reemplacen las histonas
- La eliminación parcial o total del octámero

1.2 CAMBIOS EN LAS HISTONAS: (DES)ACETILACIÓN.

La acetilación de las histonas (en los residuos de Lys) facilita su disociación del DNA (en un gen eucariótico
activado).
Al acetilarse desaparecen las cargas y hacen que el DNA NO se una con tanta afinidad por no tener cargas, el
DNA va a estar accesible, los genes activos. Este es un proceso reversible.

Cuando las histonas están acetiladas la cromatina está menos condensada, es transcripcionalmente activa y
los genes están activos, se expresan. En caso contrario, cuando las histonas no están acetiladas ocurre lo
contrario, la cromatina está más condensada, transcripcionalmente inactiva, los genes están reprimidos, no
se expresan.

En este proceso se emplean dos enzimas: la histona acetiltransferasa o HATs (cataliza la acetilación) e
histona desacetilasa (al contrario que la anterior). En la reacción toma parte la Ac-SCoA que pasa a Coa-SH.
Además, hay un equilibrio entre la heterocromatina y la eucromatina.

1.3 CAMBIOS EN LAS HISTONAS: (DES)METILACIÓN.

La existencia del grupo -CH3 en los residuos Lys y Arg sirve de señal para algunas proteínas. Lys y Arg pueden
estar mono-, di- o tri-metilados.
En función de los residuos metilados la transcripción se encuentra reprimida o activada. Los genes metilados
están condensados y no se expresan, pero a veces hay genes metilados que están descondensados y no se
expresan. Es un proceso reversible. Por ejemplo: H4(histona 4)K20(Lisina 20)me3(trimetilado)

En este proceso se emplean dos enzimas: la histona metiltransferasa (HMT) para metilar y la histona
demetilasa (HDM) para desmetilar.
1.4 REGULACIÓN EPIGÉNICA: METILACIÓN DE DNA
Regulación epigenética: Modificaciones del DNA que no implican un cambio de secuencia afectando el
fenotipo y la actividad de los genes.
Se metilan las citosinas, generalmente aquellas que van seguidas de guaninas (denominándose islotes CG).
La DNA metil transferasa metila el carbono 5 de la citosina. Esta enzima va a emplear como cofactor la 5 –
adenosilmetionina, que participa en las transferencias de grupos de un átomo de carbono en cualquier
grado de oxidación (excepto el máximo que es CO2).

a) Secuencias CG sin metilar: transcripción de genes. La transcripción se inicia libremente en presencia de los
factores de transcripción adecuados.
b) Secuencias CG con citosinas metiladas (5 – metilcitosina): no se transcriben los genes. La metilación en las
secuencias promotoras impide la unión de los factores de transcripción: el gen no se transcribe. La
metilación en la proximidad de origen de transcripción es reconocida por proteínas (MeCP1 y MeCP2) que se
unen al DNA metilado impidiendo la transcripción (por ejemplo, impidiendo el avance de la polimerasa).

En la embriogénesis ocurre una desmetilación total seguida de una desmetilación de novo en los sitios
adecuados de cada tejido.

2. INICIACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN
Es importante la unión del promotor a la RNA – polimerasa. Como ya sabemos, la secuencia consenso no es
una secuencia concreta, sino la de mayor probabilidad de que exista.

2.1 FUERZA DEL PROMOTOR:

Cuanta más parecida sea la secuencia del promotor a la
secuencia consenso con mayor afinidad se unirá a la
RNA polimerasa.
a) Promotor fuerte: su secuencia se acerca más a la
secuencia consenso, por lo que se unirá fuertemente.
tendremos muchos transcritos y por lo tanto muchas
copias de la proteína por promotor.
b) Promotor débil: su secuencia se aleja más de la
secuencia consenso. Hay más modificaciones y se parece
menos a la secuencia consenso. Habrá pocos transcritos
y por lo tanto pocas copias de la proteína.

- En procariotas vamos a tener el efecto de los factores de especificidad (factor σ) de la RNA polimerasa.
Hay distintos factores sigma según su peso molecular y cada uno va a tener una secuencia óptima.
 Ejemplo: σ70 reconoce genes constitutivos.
- En eucariotas tenemos el factor TBP que se une a la caja TATA y esta nos da la especificidad.

2.2 REGULACIÓN DEL PROMOTOR:

Los genes constitutivos se expresan continuamente y los genes facultativos no se expresan continuamente.
Dentro de los facultativos están los genes inducibles y los genes represibles.
● Gen inducible: normalmente inactivo pero por acción de una
sustancia o factor reguladora de la propia célula o externa va a hacer
que ese gen se exprese
● Gen represible: normalmente activo pero por acción de una
sustancia o factor de la propia célula o externa va a hacer que ese
gen se inactiven.

Ambas pueden ocurrir por regulación negativa (cuando la lleva a

cabo una proteína represora) o positiva (cuando lo lleva a cabo una
proteína accesible).

A) REGULACIÓN NEGATIVA
Mediada por proteína represora, que se une al DNA por los operadores. Los operadores impiden la
traducción de los genes.
Podemos tener tanto de un gen inducible como de uno
represible.
- En un gen inducible al represor se le une una señal
molecular disociandolo del operador. Se activa la expresión
génica.
- En un gen represible la señal molecular se une al represor
uniéndose al operador. Se inactiva la expresión génica.
El gen es inducible a la izquierda y a la derecha es un gen represible.

B) REGULACIÓN POSITIVA
Promueven la acción de la RNA-pol para que se una con
mayor afinidad a las proteínas reguladoras, se obtiene
más mRNA. Activador que promueve la actividad de la
RNA pol. Algunos activadores y represores son
capaces de interactuar directamente con la RNA
polimerasa y de activar o reprimir la transcripción de
genes. Además, hay muchos otros activadores y
represores que se tienen que unir a una molécula
señal para llevar a cabo su función.
- En un gen represible, una señal molecular se une al
activador, disociándolo del operador. Se inhibe la
transcripción.
- En un gen inducible, la señal molecular se une al
activador uniendo al operador. Se activa la transcripción.
2.3 OPERÓN LAC:

Un operón es un conjunto de genes y elementos reguladores que funcionan como una unidad. Codifican a
menudo proteínas de la misma vía metabólica, se regulan de la misma forma y pueden tener regulación tanto
positiva como negativa. Tiene un promotor, varios genes transcritos de ese promotor (DNA policistrónico) y
secuencias reguladoras.

En el operón lac hay genes de la beta-galactosidasa, permeasa y

trascetilasa. La permeasa permite que la lactosa entre en la célula
y la β -galactosidasa permite la hidrólisis de la lactosa. El operón
lactosa, que abreviadamente se denomina operón lac, es un
sistema inducible. La proteína reguladora, producto del gen
regulador, es un represor que impide la expresión de los genes
estructurales en ausencia del inductor. Por defecto, el represor está
unido al operador reprimiendo la transcripción casi totalmente. El
inductor en este caso es la lactosa (alolactosa) vale crack.

REGULACIÓN NEGATIVA: (la + común)

Cuando hay lactosa en el medio, está funciona como inductor pues

se une al represor cambiando su forma lo que evita que se pueda
unir al operador. De este modo la RNA – polimerasa puede transcribir los genes correspondientes.

Cuando NO hay lactosa en el medio, la proteína represora se encuentra unida al operador impidiendo la
transcripción de los genes para las enzimas que metabolizan la alolactosa; es decir, en ausencia del inductor
(la lactosa), la proteína represora (producto del gen regulador) se encuentra unida a la región operadora e
impide la unión de la RNA – polimerasa a la región promotora y, como consecuencia, NO se transcriben los
genes estructurales.

REGULACIÓN POSITIVA:
Necesitamos lactosa para obtener galactosa y así obtener energía pero si el organismo ya tiene suficiente
energía -tiene mucha glucosa- no va a haber lactosa y sin lactosa no va a haber expresión génica(caso a).

- Si hay poca glucosa, va a haber alto nivel de cAMP

que es la molécula señal de la proteína CRP y esta es la
proteína activadora que media la regulación positiva.
Se une al operador y promueve la expresión génica.
Cuando hay lactosa y poca glucosa y hay cAMP alto,
entonces la proteína represora no se une y va a haber
un máximo nivel de expresión génica.
El CRP puede intentar unirse cuando no hay lactosa,
pero el represor no permite la unión y la activación.

- Si hay glucosa y lactosa y cAMP bajo, hay baja expresión génica.

Como conclusión, necesitamos lactosa para que haya expresión sí o sí. Pero para que se de muchas
transcripción, necesitamos que haya cAMP y poco glucosa.

2.4 ATENUACIÓN EN EL OPERÓN TRP:

El operón triptófano es un ejemplo de operones reprimibles. En ellos cuando un producto del metabolismo
(el triptófano en este caso) está en cantidades suficientes la bacteria puede dejar de fabricar las enzimas
que los sintetizan. El operón TRP tiene los genes necesarios para la síntesis del Triptófano. El triptófano sirve
como molécula señal (co – represor) para la unión del represor al operador y la detención de la síntesis
proteica.
Se compone de 4 secuencias: 1, 2, 3 y 4
➢ Las secuencias 3 y 4 tienen bases complementarias – se emparejan formando una
horquilla → funciona como señal de término
➢ Las secuencias 2 y 3 también se pueden emparejar → no se interrumpe la transcripción y
los genes se transcriben.
➢ La secuencia 1 codifica 2 Trp → condiciona el emparejamiento de las secuencias 3-4 o 2-3

Cuando los niveles de Trp son altos, hay mayor facilidad para la traducción ya que hay más tRNATrp en el
medio. Como los niveles son altos no se necesita más Trp y el operón ha de ser inhibido. El Trp se une al
represor, activándolo, de modo que ya podrá unirse a la región operadora impidiendo la transcripción de los
genes estructurales. En esa situación, la secuencia 1 (secuencia líder con codones de Trp que codifica el
péptido líder) es traducida completa y rápidamente por el ribosoma (hasta STOP). La secuencia 2 se bloquea
al unirse al represor. La transcripción continúa, y las secuencias 3 y 4 se transcriben y se emparejan,
generando la estructura atenuante que es la señal para la finalización de la transcripción y es comparable
con la que se forma en la terminación independiente de ⍴ (rho).

Cuando los niveles de Trp son bajos, los genes del operón han de ser transcritos. Al empezar la traducción y
no haber Trp en el medio, no habrá tRNATrp en el medio por lo que la traducción se ralentiza. En esta
situación, el ribosoma se detiene en los codones de la secuencia 1 que queda incompleta. Las secuencias 2-3
se transcriben y se emparejan, evitando la formación de la estructura atenuante. En su lugar, se forma una
horquilla en la secuencia 2:3 que no es comparable con la de la terminación independiente de rho. Por
consecuencia, continúa la transcripción de los genes.

3. REGULACIÓN
POSTRANSCRIPCIONAL
SILENCIAMIENTO DE GENES POR
INTERFERENCIA DE RNA:
Es posible que un gen se transcriba
mucho pero que la concentración de la
proteína que transcribe se baja entre
otras cosas porque el mRNA se haya
degradado mediante RNA de
interferencia.
Corresponde con el control de la
degradación del RNA y el control de
traducción. Moléculas pequeñas de
mRNA (20 nucleótidos +-).
Los microRNA (miRNA/stRNA) parten
de una estructura de horquilla y los
siRNA parten de una dsDNA (DNAA).
Los miRNA son siempre sintetizados dentro de la propia célula y es posible que haya moléculas de miRNA
que han entrado a la célula habiendo sido creadas en el exterior.

1. Tenemos la transcripción de un RNA para dar un transcrito primario que tiene función reguladora,
Pri-miRNA.
2. Drosha y DGCR8 (2 vale crack) hacen el corte del transcrito primario y obtenemos una horquilla más
pequeña que se exporta fuera del núcleo gracias a las proteínas Exportinaa 5 y Ran, estas se unen al GTP que
se hidroliza y vuelve a entrar.
3. Gracias al GTP, se facilita la liberación del Pre-miRNA. Este es captado por la proteína Dicer
(endonucleasa) que corta la horquilla (con ayuda de las proteínas argonauta) y resulta un miRNA de doble
hebra, (actividad helicasa que desenrolla la doble hebra).
4. De estas nos quedamos con una que se incorpora a un complejo RISC y se empareja con un mRNA que es
complementario.
- Si la mayoría de los nucleótidos emparejan bien con el mRNA, se realiza la hidrólisis del mRNA de manera
irreversible y se para la expresión génica.
- Si el miRNA NO se empareja con tanta complementariedad al mRNA, se queda en un estado de represión
de traducción de manera que no se traduce y se silencia la expresión de estos genes, este caso es reversible.

4. REGULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN
4.1 ACCESO A mRNA:
Regulación de la ferritina: la ferritina es una proteína que almacena hierro en nuestras células. Si hay hierro
necesitamos que aumente la ferritina para almacenarlo, para ello tenemos un mecanismo que regula esto.

Esto ocurre gracias a la secuencia del mRNA en forma de horquilla, IRE que se une al IRP, ocurre en la región
5’ no traducida del mRNA (5’ UTR).

Si no hay hierro, la IRP se puede unir a la IRE. Si están unidas, no se puede unir el ribosoma por lo que no hay
síntesis de ferritina. Si hay hierro, se dan cambios de estructura en el IRP, soltándose de IRE y entonces el
mRNA está libre y se puede sintetizar la ferritina porque el ribosoma se puede unir.

Regulación de la transferritina: En caso de que estén los IRE en la región 3’ no traducida (3’ UTR) del mRNA,
sin hierro se une la IRP y lo que pasa es que la unión de la proteína aumenta la estabilidad del mRNA y este
se degradará más lentamente y por ello se sintetizarán más receptores de transferrina. En cambio, si
tenemos hierro la IRP se suelta y se hace una degradación más rápida y no necesitamos el receptor de
transferrina que se sintetizará menos.

4.2 REGULACIÓN DEL COMPLEJO DE INICIACIÓN (ocurre en eritrocitos)

Dependiendo de la cantidad de hemo que tengamos la síntesis de las proteínas hemoglobina se regula
mediante la fosforilación y desfosforilación de los complejos de iniciación.
La proteína HRI se inactiva al estar fosforilada.
Cuando hay hemo, la HRI fosforila la eIF2/eIF2B desactivándolos; no se sintetizan proteínas necesarias para
la síntesis de hemos. Cuando no hay hemo, la proteína HRI desfosforilará el eIF2/eIF2B.

5. REGULACIÓN EN EUCARIOTAS
5.1 GENES RNA POL II:
Hay regiones reguladoras y genes estructurales.

Vamos a tener caja TATA y elementos basales, más alejados, los elementos proximales formado por GC
intercaladas entre las base 30 y 200 corriente arriba (-). Además vamos a tener elementos distales hacia la
dirección 5’ a más de -1000.

Elementos basales tenemos:

- Secuencia TATA
-Secuencia Inr
-Promotores
-Secuencias Bre(reconocen el TF2B) : secuencia BREu y BREd que estan a los lados de la caja TATA
-Secuencias MTE y DPE, una vez iniciada la transcripción, colocadas hacia el lado 3’ y ambos se unen al
complejo de transcripción TFIID
-Elementos reguladores hacia 3.
Estos elementos van a estar dentro de la secuencia que se transcriben. En general, en un mRNA no vamos a
encontrar promotores porque van a estar en dirección 3’.

Elementos proximales se encargan de la expresión basal. Secuencia de C y G intercaladas metiladas, lo que le

da forma de ZDNA.

Elementos distales vamos a tener potenciadores y silenciadores que es donde vamos a encontrar por
ejemplo elementos de respuesta a hormonas.

5.2 PROMOTORES PARA GENES DE LA RNA POL II

Para que la unión del RNA polimerasa II al promotor de un gen sea eficaz, se necesita la acción unificada de 5
proteínas:
1. Factores de transcripción basales (TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIA)
2. Proteínas HMG: facilitan el plegamiento del DNA. Permite que los elementos distales estén cerca de los
elementos basales.
3. Activadores: reconocen y se unen en secuencias específicas del DNA
4. Co-activadores: unión indirecta al DNA
5. Remodeladores de la cromatina: regulan los cambios post-traduccionales de las histonas
Джонни Качок
Cómo funciona: Байа байа
1. Los activadores de transcripción que se unen a potenciadores o UAS (secuencias corriente arriba)y
facilitan la transcripción.
2. Los represores se unen a secuencias silenciadoras en el DNA
3. Los reguladores arquitectónicos (ej. HMG) facilitan la formación de bucles de DNA
4. Contribución de las modificaciones de cromatina, el remodelado de proteínas
5. Coactivadores: proteínas que median entre la RNApol II y los activadores. Ej. Mediator (complejo
multiproteico)
6. Correpresores: proteínas que median entre la RNApol II y los represores.
7. Factores transcripción basales

5.3 ELEMENTOS DISTALES DE LOS PROMOTORES DE LOS GENES DE RNA POL II

Receptores nucleares de unión a esteroides de tipo I
El receptor NR se encuentra en el citoplasma y forma un complejo con la Hsp70. Cuando se une la hormona,
se disocia el Hsp70 y el complejo migra hasta el núcleo donde se une al HRE, secuencia de DNA que actúa
como activador de la transcripción.
Receptores nucleares de unión a esteroides de tipo II
Estos receptores se encuentran siempre en el núcleo unidos al HRE y un co-represor los mantiene inactivos.
Cuando la hormona pasa por la membrana nuclear y se une al receptor. Ocurre un cambio conformacional
provoca la disociación del co-represor. Receptor actúa como activador de la expresión génica.

CUESTIONARIO

Para el comienzo de la transcripción en células eucariotas, antes que nada

a. Los factores iniciación de la transcripción tienen que unirse a la secuencia rut
b. La DNA polimerasa tiene que reconocer el sitio OriC
c. La RNA polimerasa tiene que unirse a la secuencia Shine Dalgarno
d. La proteína TBP tiene que reconocer la caja TATA
e. Todas las anteriores son incorrectas

El represor Lac
a. se une al operador y reprime el gen
b. dado que es parte del operón Lac se regula junto con los genes lacZ, lacY y lacA y se sintetiza cuando
estos genes (lacZ, lacY y lacA) se expresan.
c. no puede unirse al operador por sí mismo
d. se une a la molécula cAMP y activa la transcripción del gen

Los activadores interactúan directamente con la RNA polimerasa para activar los genes. Sin embargo, los
represores tienen que unirse a una molécula señal para impedir la activad de la RNA polimerasa
FALSO. Algunos activadores y represores son capaces de interactuar directamente con la RNA polimerasa y
de activar o reprimir la transcripción de genes. Además, hay muchos otros activadores y represores que se
tienen que unir a una molécula señal para llevar a cabo su función

La concentración de una proteína específica en una célula depende sólo de la transcripción del gen que
codifica a esa proteína. Es decir, si un gen se transcribe mucho, la cantidad de proteína que codifica estará en
gran concentración y si se transcribe poco, estará en baja concentración.
FALSO. Es posible que un gen se transcriba mucho pero que la concentración de la proteína que transcribe se
baja entre otras cosas porque el mRNA se haya degradado mediante RNA de interferencia.

La atenuación del operón Trp

a. ocurre cuanto hay mucho Trp
b. es producido por el represor Trp
c. ocurre cuando el represor Trp se une a Trp
d. es el único mecanismo que regula el operón Trp
e. Todo lo anterior es incorrecto

Las proteínas HMG tienen una función importante en la regulación de genes bacterianos dado que es su
cometido el aumentar la afinidad de los factores de transcripción de iniciación y la RNA polimerasa
Falso. Las proteínas HMG se encuentran en eucariotas. Su función es la de plegar el DNA para que los
elementos reguladores lejanos al punto de inicio de la transcripción puedan interactuar con la maquinaria
necesaria para el inicio de la transcripción.
TEMA 8: Variabilidad genética

MUTACIONES
Tipos de mutaciones

Según el tipo celular → Germinal // Somática

Según cromosoma afectado → Autosomas // Cromosomas sexuales
Según el tamaño:
- Mutaciones grandes o anomalías cromosómicas
- Mutaciones intermedias (en secuencias repetidas)
- Mutaciones puntuales:
▪ Sustituciones: transiciones / transversiones
▪ Deleciones
▪ Inserciones
Según su efecto → Silenciosas // Dañinas o beneficiosas
Según el mecanismo
- Endógeno (intrínseca) → Errores de replicación
- Exógenas (producidas por mutágenos externos) → Agentes químicos, físicos o
biológicos
Mutaciones cromosómicas (anomalías estructurales)

Afectan a la estructura de los cromosomas. Durante la meiosis los cromosomas

homólogos se emparejan adoptando unas formas específicas.
● Deleción: falta un segmento cromosómico intermedio (un gen)
● Duplicación: aparece un segmento cromosómico más de una vez en el mismo
cromosoma
●Inserción: aparece un segmento cromosómico en otro cromosoma distinto.
●Translocación: cambio de localización de un segmento cromosómico..
● Inversiones: segmento cromosómico que ha girado 180º, por lo que su secuencia
génica queda invertida con respecto a la del resto del cromosoma.

Mutaciones genómicas (anomalías numéricas)

También llamadas mutaciones cromosómicas numéricas, estas son variaciones en el número de
cromosomas.
● Aneuploidía: presenta algún cromosoma de más o de menos con respecto a su dotación
normal. Por ejemplo: Trisomía (2n+1) // Monosomía (2n-1) Jajaja Insertar sticker de BALDIMIR
VALE CRACK MEMEO excelentes apuntes. he ¨cambiado¨ cosas en algunos temas. vale mas
que cambiar completar has mirado los examenes? no son dificiles lounico que el de 2014-15 la
segunda parte sobre técnicas ni pu . yo creo que si porq hay preguntas de esas q salen en los
cuestionarios de egela como lo sabia Jaajajajaj te imaginas? nah tendra fotocopias Pregunta
corta define aneuploidia: leones y baldimirs jajajaja Baia Alguno he mirado si y uf. pero esos
no son de felix. Inserto sticker del leon. Es mi sticker por excelencia. A ver si cielo se va a
estudiar esto sin darse cuenta. OjaLa. ojala se hubiese impreso todo coN esta conversacion.
Excelente respuesta. Saca10 OBVIO inserta a ramon dice felix: como supiste q mi segundoo
nombre es baldimir? 10 directamente jejejsjsjs me partose pone en posicion baldimir adoro
esa pose ( rta: vas a odiarla cuando llevemos otro cuatri con el) mañana cuando no me
sepa una pregunta me pondré asi para mayor inspiracion jajajaj ay q genial me gusta la
idea *se pasa todo el examen así. Uf que duro possi:( voy a seguir que ya pelotudié
mucho perfe a mi me faltan este tema y los tres primeros por repasar maldita ARN POL II
a mi 4.5 Y 6 lo odio lo decía por corregirme :)))). Jejtejeje adios amigo ten un buen viaje

💖
celular . Hasta el Nucleolo y mas alla*empieza a llorar* gracias compañera <3 que la
Dicer te viaje bien
● Poliploidía: alteración de la ploidía, es decir, cambios en el número normal de dotaciones
cromosómicas. En este caso, contienen más de un juego completo de cromosomas, pudiendo
ser triploides (3n), tetraploides (4n), etc. Es invariable en humanos.

Mutaciones puntuales
Las mutaciones génicas son las que alteran la secuencia de nucleótidos de un solo gen, y
también se denominan puntuales, ya que afectan a un único par de bases de un gen. Existen
dos tipos: las sustituciones de bases (transiciones y transversiones) y las mutaciones por
pérdida o inserción de bases (inserción y deleciones).
Sustituciones de bases
Cambio de una base del ADN por otra.
● Transiciones: si se sustituye una base púrica por otra púrica, o bien una pirimidínica por otra
pirimidínica. Siempre hay cambio de bases.(W↔S)
● Transversiones: si se sustituye una base púrica por otro
pirimidínica, o viceversa. A veces no hay cambio de bases:
Mutación tipo A → T no tiene mucho efecto pero una de
A → C sí (W↔S).
W=weak
S=strength

Pérdida o inserción de
bases
Pérdida o adición de un nucleótido en la molécula de ADN.
● Deleciones
● Inserciones

Nomenclatura de variaciones de secuencia

La diferencia entre ADN codificante y ADN genómico, es que el DNA genómico tiene intrones y
secuencias no traducidas que son no codificantes

Efectos de mutaciones puntuales

Los efectos causados por las mutaciones pueden variar en cantidad, estructura, actividad y
función.

➔ Mutaciones silenciosas: las transiciones y transversiones afectan a uno solo de los

nucleótidos y, por tanto, solo un triplete de bases es el que se ve alterado. Como el
código genético es degenerado, el triplete puede sustituirse por otro que codifique al
mismo aminoácido (triplete sinónimo), de modo que la mutación no afecta al
individuo y se sintetiza la proteína correcta. Nomenclatura (=)
➔ Mutaciones nonsense: da lugar al codón STOP de forma prematura y la proteína
sintetizada no tiene la longitud correspondiente por lo que no es funcional (Efecto
grave). Nomenclatura (Ter) (*)
➔ Mutaciones missense:
- Conservadora: da lugar a una proteína con propiedades fisicoquímicas
similares a la proteína que originalmente se debía codificar (Efecto leve).
- No conservadora: da lugar a una proteína con propiedades muy distintas a la
original (Efecto grave).

➔ Desplazamiento del marco de lectura: al ocurrir una inserción o deleción, varían

todos los tripletes de bases por lo que se produce una proteína completamente
distinta. Nomenclatura (fs) En el caso de que la cantidad de aminoácidos afectados
sea múltiplo de 3, se estaría quitando o añadiendo codones enteros por lo que sólo
se pierden o agregan algunos aminoácidos pero los demás originales se mantienen
ya que el marco de lectura no cambia.
 Mutaciones endógenas

Errores de replicación: 1 de cada 10^9-10^11 nucleótidos

Mutaciones espontáneas

- Desaminación: consiste en la
pérdida de grupos amino. La
desaminación de la citosina la
transforma en uracilo y la de la
adenina, en hipoxantina. Cuando el
ADN se replica, se incorporan bases
incorrectas, pues el uracilo se
aparea con la adenina y la
hipoxantina, con la citosina. La
desaminación provoca una
transición de bases.

- Tautomerización de bases: las bases nitrogenadas del ADN pueden coexistir bajo dos
formas tautoméricas: la cetónica/enólica o imino/amino, afectando el emparejamiento de
Watson y Crick.
Las formas enólicas de las bases (A*, T*, G* y C*) se aparean de manera distinta: A*-C,
T*-G, G*-T y C*-A (Emparejamiento no Watson-Crick). Las dos formas tautoméricas se
encuentran en equilibrio, pudiendo pasar de una a otra de manera espontánea; si durante la
replicación, en la hebra molde se produce una de estas alteraciones, por ejemplo, la G
cambia a G*, en la nueva hebra que se sintetice no aparecerá la C, sino que en su lugar lo
hará la T. Estos cambios tautoméricos dan lugar a transiciones si es que no son corregidos
por la ADN polimerasa.

- Depurinación: consiste en la hidrolización del enlace glucosídico que une la base

nitrogenada con el correspondiente azúcar, generando en la hebra de ADN un nucleótido
sin base (residuo abásico) por lo que la información en una de las hebras se pierde. Sin
embargo, si están las dos hebras, esa información se puede recuperar.

Especies reactivas del oxígeno (ROS)

Las mutaciones endógenas también son producidas por productos o intermediarios

metabólicos, radicales libres de oxígeno (ROS). O2- y OH- son muy reactivos. La reducción
de estos ocurre con la adición de electrones, secuestrados de los lípidos o proteínas y la
oxidación con radiación ionizante. Los radicales libres de oxigeno trabajan en vías de
señalización celular y aumentan
con el estrés.
Estas especies pueden afectar al
ADN en…
- Expresión genética (sin
afectar los genes)
- Reducción telomérica
- Anormalidades epigenéticas
- Uniones entre distintas
hebras
- Daño y fragmentación del
ADN mitocondrial
- Daño en proteínas
- Microdeleciones
Mientras más se oxide, las partes
hidrofóbicas de la proteína se
empiezan a exponer cada vez más. Al estar expuestas, impide que la proteína se pliegue
correctamente. Con un plegamiento incorrecto, se reconocen como defectuosas y son
degradadas, pero en el caso de que estén muy oxidadas, varias proteínas se entrecruzan entre
sí y se unen formando precipitados que son resistentes a proteasas (hidrolasas) y no las
pueden eliminar.

Mayor oxidación → Proteínas más expuestas

La presencia de ROS también son la razón del envejecimiento por el daño que van
generando y acumulando en el ADN porque los mecanismos de reparación ya no
lo soportan y se produce el desgaste de los telómeros.
 Mutaciones exógenas

Los agentes exógenos pueden producir lesiones en el ADN.

Pérdida de una base → El calor y los ácidos pueden acelerar la depurinacion (~10^4
purinas/día por célula en humanos). Se obtiene una forma abásica

Deleciones/Inserciones → por sustancias químicas como acridinas, se incorporan moléculas

externas y producen una mutación.

Modificación de bases → Radiación ionizante y agentes alquilantes

Desaminación: da lugar a la hipoxantina, la cual puede emparejarse con la C, el U o la A.
Se ve favorecida por la presencia del HNO2 y sus precursores (Nitrosamina,NaNO3 y
NaNO2).

Metilación (alquilación): la guanina en su forma enol (dos formas tautoméricas) reacciona

con un agente alquilante (S-adenosilmetionina, dimetilnitrosamina, dimetilsulfato, mostaza
nitrogenada). La metilguanina formada, se empareja con la T en lugar de la C. Luego la
base de guanina puede normalizarse pero el emparejamiento ya ha quedado incorrecto y
con solo dos puentes de hidrógeno en lugar de tres.

Corte de cadenas → Radiación ionizante (rayos X

o Ɣ) y substancias químicas (bleomicina)
• Cortes de cadena sencilla (SSB: Single Strand Break)
• Cortes de cadena doble (DSB: Double Strand Break)

Formación de dímeros → Radiación UV

Si las pirimidinas (sobretodo timinas) son expuestas a radiación no ionizante, se forman
enlaces covalentes entre las 2 T adyacentes y forman un dímero que producirá que el ADN
se retuerza y ocurran cambios en su estructura, formándose una retorcedura.

MECANISMOS DE REPARACIÓN DEL ADN

● Reparación de emparejamientos erróneos: Durante la replicación
● Reparación por escisión de bases:
Desaminación
Formamidopirimidina
8-hidroxiguanina
Hipoxantina
Xantina
Bases alquiladas como 3-metiladenina o 7-metilguanina
 ● Reparación por escisión de nucleótidos: Distorsiones más extensas
● Reparación directa: Dímeros de ciclobutano de pirimidinas O6 -metilguanina

Reparación de bases mal emparejadas dirigida por metilación

Se tiene una secuencia palindrómica. La hebra que se acaba de replicar se mantiene
durante un periodo de tiempo. Durante un breve periodo después de la replicación la hebra
molde está metilada y la nueva hebra no, se le denomina DNA hemimetilado. Luego se
metila la hebra nueva y se hacen indistinguibles. Una metilasa marca las cadenas y ayuda a
reconocer las que hay que reparar.

Cuando hay una hebra metilada y otra no metilada -DNA hemimetilado-, las proteína MutL
y MutS se unen (requiere ATP) a la zona donde se tienen al par de nucleótidos mal
emparejados y forma el complejo MutL-MutS. Luego se une la MutH con ATP y se forma
un bucle. El ADN pasa por el complejo MutL-MutS hasta llegar a la MutH más cercana que
catalizará el corte de la hebra no metilada. Dependiendo de qué lado esté la MutH más
cercana, el proceso de reparación será distinto ya que tendrá un tipo de exonucleasa u otro:
- Si el corte se encuentra hacia el extremo 5’ desde el par de bases mal emparejadas, la
acción de la ADN helicasa II separa las dos hebras. La exonucleasa VII (5’-3’ y 3’-5’) y la
RecJ nucleasa (5’-3’) hidrolizan la hebra en dirección 5’-3’.
- Si el corte se encuentra hacia el extremo 3’ desde el par de bases mal emparejadas, se
necesita una hidrolisis 3’-5’ que la realizan las exonucleasas I y X.
En ambos casos, la hebra se vuelve a sintetizar gracias a la ADN polimerasa III y la ADN
ligasa (SSB) une los fragmentos.

Procariotas Eucariotas

MutS MSH2, MSH6 → Un solo par de bases mal emparejada

MSH2,MSH3 → Más de un par de bases

MutL MLH, RMS1

 Reparación por escisión de bases

Reparación por escisión de nucleotidos

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA

En la replicación, se replica todo excepto el centrómero, dejando cada cromosoma con dos
cromátidas hermanas. En profase I, los cromosomas homólogos se unen por medio de
uniones covalentes formando tétradas. Se unen a través de los quiasmas, que son los puntos
donde ocurrirá la recombinación homóloga. Luego se distribuyen los cromosomas hacia los
extremos y se da la primera división meiótica (2n). Para la meiosis es necesario que el huso
meiótico tire de las cromátidas hacia los centriolos, en la primera división se separa todo el
cromosoma por una parte y el otro por el otro lado, para que esto ocurra de manera correcta es
necesario que ocurra con cierta tensión. Tras la división de las cromátidas, se obtienen 4
células hijas (n). **No puede haber reorganización de material genético durante la mitósis.
1-Tenemos dos cromosomas homólogos con duplex aa bb cc en una de las moléculas, y en
otra, AA, BB, CC.
2- Ocurre un corte de ssDna; es decir, se corta una de las hebras de cada cromosoma.
3- Va a haber un entrecruzamiento (desplazamiento de las de arriba abajo y viceversa), esta
estructura entrecruzada se llama Unión Holliday (quiasma).
4- Esta estructura se puede desplazar a un lado u otro, es posible que se emparejen. No todas
las bases están emparejadas correctamente (no se trata de una mutación), aún así si la
mayoría de las secuencias son complementarias se pueden emparejar. Cuando se desplaza la
unión se le denomina migración de ramas. En este paso se forman heteroduplex (Bb).
5- Se forma el intermediario de holliday que puede recibir un corte horizontal o vertical:
6- Si el corte es vertical por un lado tendremos una hebra que tiene secuencias A b c (abajo) , y
la de arriba A B c y por otra parte la otra secuencia a b c (abajo) y A B C (arriba), de esta forma
vamos a obtener una molécula con una combinación de las iniciales: heteroduplex y duplex. La
hebra comenzará con un dúplex de mayúsculas y un dúplex de minúsculas. En el centro habrá
heteroduplex. Si el corte ocurre en esta dirección decimos que tenemos una
reorganización/recombinación.
7-Si ocurre en horizontal vamos a obtener duplex y heteroduplex, pero en este caso en un
cromosoma, en los dos extremos tendremos duplex de mayúsculas y en el otro cromosoma
duplex de minúsculas. NO hay recombinación. Empieza con mayúscula y acaba con minúscula.

El intercambio de información genética ocurre entre zonas con homología

 Dirección opuesta: 1 molécula de
ADN en equilibrio con otra molécula
de ADN
Misma dirección: 1 molécula ADN
en equilibrio con 2 moléculas de
ADN.

RECOMBINACIÓN POR TRANSPOSICIÓN

Secuencias de DNA que se pueden mover de un sitio a otro en el mismo cromosoma o en
diferentes. Hay dos tipos de elementos transponible: secuencias de inserción, secuencias
necesarias para la transposición o trasposones complejos, genes adicionales para la
resistencia a antibióticos y antibacteriano.

Dos mecanismos de transposicion (en ambos casos hay un corte en el dna diana):
- Transposición directa o no replicativa: El elemento transponible salta de un sitio a
otro. Hay un corte donde se inserta el elemento transponible. El hueco se rellena.
- Transposición replicativa: en el caso de la replicativa en el corte se inserta el elemento
transponible, se extienden y la dna ligasa une los fragmentos. En la replicativa el corte
inicial es comparable, sin embargo al unir el extremo 3’ quedan dos pequeñas hebras
sobresalientes. Al extenderse las hebras ocurre la replicación del transposón, tenemos
que eliminar el transposón sobrante para poder ligar. A veces se da por recombinación
específica de sitio.
La transposasa permite que se hagan cortes en la secuencia flanqueantes, que son las que
están repetidas en los extremos del transposón.

Polimorfismo genético↔ secuencias codificantes

Polimorfismo de secuencia↔ cualquier secuencia
TEMA 9: TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS.
1. Extracción del DNA
2. Hibridación de ácidos nucleicos.
2.1 Hibridación en fase líquida
2.2 Hibridación en soporte sólido
2.3 Hibridación in situ
2.4 Microarrays (chips de DNA)
3. Endonucleasas de restricción.
- Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP).

1. EXTRACCIÓN DEL DNA

- Disrupción mecánica de células: agresivo; vale cuando hay muchas células.
Se usa cuando las células son de plantas, con pared celular.
- Extracción orgánica: mejor para cuando hay pocas células frágiles
1. Solubilización de componentes celulares: con una
disolución de lisis + medio hipotónico(para que la
célula explote) + detergentes
2. Desnaturalización e hidrólisis de proteínas: gracias
a los detergentes, agentes caotrópicos, proteasas,
para romper la proteínas y que no puedan interferir
en la recogida del DNA
3. Eliminación de proteínas desnaturalizadas:
fenol/cloroformo
4. Purificación del DNA : precipitación por EtOH.

Se puede hacer un proceso parecido para el RNA.

NaOAc, NH4OAc , LiCl, NaCl son las sales que se usan.

2. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Lo que queremos saber es si ese DNA que hemos extraído
tiene esa secuencia que estamos buscando. Para ello
podemos crear en el laboratorio un DNA con la secuencia
contraria, y juntarlos. Si se hibridan, será que tiene la
secuencia.

Definición: Emparejamiento de ácidos nucleicos de distintas

fuentes. La hibridación requiere dos hebras de ácidos
nucléicos que son complementarias y antiparalelas
(DNA-DNA, DNA-RNA o RNA-RNA).
Para hibridar, primero hay que desnaturalizar el DNA.

A) DESNATURALIZACIÓN DEL DNA

La desnaturalización del DNA: separación de ambas hebras de una molécula de dsDNA.
1º Queremos que las hebras del DNA se abran, el proceso contrario sería la hibridación, es
decir la unión de dos hebras complementarias y antiparalelas.
2º Una vez que tenemos la molécula medio desnaturalizada, necesitamos romper los
puentes de hidrógeno que son los que mantienen las dos hebras juntas, para ello usamos
agente químicos como la urea, formamida, formaldehído, un ph alto o CALOR (el más
común).

3º Tendremos las dos hebras separadas, pasaremos de dsDNA a ssADN. Este proceso de
desnaturalización lo podemos ver en esta gráfica:

X es la temperatura e Y es el porcentaje
de desnaturalización. En la otra gráfica
tenemos en le eje X la tm, la temperatura
de desnaturalización y en el eje y G+C (el
porcentaje del total de nucleótidos)
La temperatura de desnaturalización
esta controlada por la cantidad de
enlaces C+G, si tenemos más enlaces,
como son triples, las hebras están más
unidas, por lo que se necesita más
energía para separarlas.

● Un aumento de temperatura hace que

aumente la absorción a 260 nm.
● Un aumento de temperatura hace que haya menos viscosidad.

B) EMPAREJAMIENTO DE DNA
Si tenemos dos muestras de DNA (una de ellas será la sonda, la creada por nosotros),
las calentamos para que se desnaturalicen y las mezclamos, esperamos a que se
enfríen. En la mezcla encontramos un duplex de cada muestra y un dúplex híbrido.

El emparejamiento de 1 y 2 dependerá de la temperatura, tiempo, longitud de

cadena, complementariedad (homología).

La complementariedad: es posible hibridar dos hebras de distinto DNA que no sean

del todo complementarias, para ello necesitaremos variar el resto de factores.
Cuanta mayor complementariedad mayor posibilidad de emparejamiento.
Si dejamos las muestras más tiempo hay más emparejamiento.
A menor temperatura se dará un mayor emparejamiento.
Cuanto mayor sea la longitud de la cadena, más posibilidad de que los nucleótidos
encajen entre sí, mayor emparejamiento.
Cuando uno de los factores aumenta, el resto pueden variar, para que se de el
emparejamiento. Vamos a tener que ir modificando, jugando con los factores para
obtener esa cadena.
EJEMPLO: si dejamos más tiempo la mezcla se dará un mayor emparejamiento aunque
las cadenas no sean muy largas.
C) PASOS BÁSICOS

Las hebras de nuestro DNA tiene una secuencia que queremos ver si tiene la secuencia diana
o no. Por eso queremos que se una a la del DNA marcado con sonda que hemos creado.
Vamos a tener las dos hebras, vamos a desnaturalizarlas con calor o con factores químicos,
las mezclamos y esperamos a que ocurra la renaturalización, también llamado templado o
annealing. Aparece una heteroduplex del DNA marcado y la secuencia diana.

D) MARCAJE DE SONDAS
Para ello necesitamos un marcador, que pueden ser:
- Isótopos radioactivos en átomos de fósforo
- Fluorocromos con componente fluorescente (los más comunes)
- Enzimas.
Estos se van a unir a la secuencia diana del DNA que hemos
creado. Hay dos tipos de marcaje:
Marcaje directo: el marcador está unido directamente a la sonda y se puede visualizar
directamente. Se utilizan isótopos radiactivos y fluorocromos.
Marcaje indirecto: el marcador no se puede visualizar directamente. Se utilizan enzimas.

En ambos casos se emplea una técnica instrumental para detectar la señal.

- En el caso de los fluorocromos, tendremos una molécula unida a la

secuencia. Esta molécula es muy grande, y puede añadir impedimento
estérico. Pero es directo, no necesitamos nada para unirlo.

- En cambio para una enzima, no podemos visualizarlo directamente, lo que

vamos a tener que hacer es añadir un sustrato para poder ver la señal del
producto. Las enzimas van a necesitar una mayor manipulación.

En cuanto al tamaño, radioactivos< fluorocromos < enzimas

En cuanto a la manipulación, radioactivos =fluorocromos < enzimas

2.1 HIBRIDACIÓN EN FASE LÍQUIDA

Queremos sacar una secuencia determinada de una cadena de DNA:
1. Rompemos las células, sacamos el DNA, desnaturalizamos e hibridamos con
los DNA marcados con sondas. Aquí obtenemos el híbrido.

2. Tenemos que separar todos los híbridos, para obtener solo el híbrido en el que está
nuestra secuencia diana que queremos obtener, del resto de híbrido que no la tienen.

- Se hace la digestión (eliminación) de las hebras de la hélice mediante la nucleasa S1,

que solo degrada hebras sencillas. Tenemos que precipitar el DNA con el TCA (ácido
tricloroácetico).

- También se puede hacer por una cromatografía de adsorción sobre hidroxiapatita, lo

que hace es pasar las secuencias por una columna con Ca2+, PO32-, OH… El sólido
adsorbe solo los duplex, mientras que las hebras sencillas no se retienen. La fracción
retenida es la que interesa.

Luego se mide la señal, obteniendo la longitud de onda de nuestro híbrido con

nuestra secuencia diana.
2.2HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO
Consiste en poner un papel sobre el soporte donde tenemos el DNA
y que quede un rastro.

HIBRIDACIÓN DE COLONIAS:
1. Se hace una hibridación de colonias.
2. Hay microorganismos con el mismo contenido genómico
creciendo en un placa de Petri, ponemos un papel de
nitrocelulosa encima donde se quedarán pegadas algunas
células.
3. Después las romperemos con tratamiento alcali.
4. Una vez que quede el DNA expuesto, lo marcaremos con una
sonda radioctiva y se incuba.
5. Expondremos el papel en una película de rayos X, donde
podremos ver qué células tienen la secuencia marcada. Se hace una
marca en el papel para saber cuáles fueron las colonias positivas.

DOT-BLOT and SLOT-BLOT:

1. Cogemos un papel de nitrocelulosa, donde aplicaremos una gota
o raya de la muestra de DNA.
2. Lo que tenemos que hacer es bloquear la capacidad de absorción de (esta manera
evitamos que la muestra se quede pegada) para ello vamos a añadir otra sustancia
que se una a la membrana (ovoalbúmina)
3. También añadiremos álcali para lisar las células y desnaturalizar el DNA.
4. Y ahora añadiremos una sonda marcada (sonda radioactiva) que hibridará con las
muestras que contengan DNA o RNA diana.
5. Lo lavamos para quitar la sonda que no se haya añadido, secamos y detectamos por
autorradiografía.

Es IMPORTANTE saber que cuanta más secuencia diana tengamos, mayor intensidad
de señal obtendremos, por ello podemos comparar dos muestras, según la intensidad
recogida.
 ELECTROFORESIS:
Es una técnica analítica.
En electroforesis tenemos un potencial
eléctrico que hace que las moléculas cargadas
se mueven y un soporte eléctrico que se le
resiste al movimiento de las moléculas. Hay
electroforesis vertical (poliacrilamida) y
horizontal (agarosa).
Con la electroforesis no vemos dónde están
los ácidos nucleicos, lo que podemos hacer es
utilizar una sonda para encontrar el par de
bases con una secuencia complementaria.
Para la formación del gel se calienta el
polímero y se forman enlaces no covalentes,
luego se deja enfriar (madurar).
- Electroforesis horizontal: Lo que vamos a
hacer es una disolución de agarosa (no
necesario otros componentes para formar el
polímero porque ya lo es), esta se calentará
para que pase a estado gel, para que se quede este gel tenemos que dejar que se
enfríe.
Este gel va a ser una especie de red por la que se van a mover los ácidos nucleicos. Si
aumentamos masa de agarosa, aumentaremos la red, es decir, reduciremos los
espacios entre los que se mueven los ácidos nucleicos.

- Electroforesis vertical: La poliacrilamida (polímero) puede formar el gel uniendo

acrilamida, N,N’-metilenebisacrilamida y TEMED y persulfato de amonio. El
persulfato de amonio ayuda a que se de la reacción aportando radicales libres y el
TEMED facilita la creación de los radicales libres. La poliacrilamida, aunque sea un
polímero, se forma a partir de otros componentes.

Todo esto crea una especie de red.

La red, la estructura por la que pasan los ácidos nucleicos, depende de la cantidad de
agarosa o de poliacrilamida.
Otra consideración a tener en cuenta es la seguridad de manipulación.

Agarosa Poliacrilamida

% (Si el % aumenta, tendremos una mayor resolución, es 0,5-4 0,5-30

decir, vamos a poder diferenciar tamaños más pequeños)

resolución 50kb-50b 1kb-1b ↑RESOLUCIÓN

riesgos ninguno tóxico

La resolución en el caso de la agarosa dependiendo de la fuente pueden haber unas 50kb-50 b (nos
permite utilizar una muestra más grande) y la poliacrilamida 1kb-1b es decir podemos ser capaces de
diferenciar unas secuencias en las que solo varía una base.
SOUTHERN BLOT:
Cogemos muestra de ADN.
En este caso se hace la digestión con endonucleasas de restricción (DNA
fragmentado).
1. Introducimos la muestra en
pocillos del gel de agarosa.
2. Hacemos la electroforesis,
desnaturalizamos el DNA.
3. Colocamos la membrana de
nitrocelulosa o nylon sobre el
gel de agarosa y se transfiere
ssDNA a la membrana.
4. A su vez, la sonda se marca,
se desnaturaliza y se añade a
la membrana con la muestra.
5. Después, se limpia el exceso
de sonda, se pone un film
sobre la membrana y se revela
el film.

NORTHERN BLOT:
La principal diferencia con Southern Blot es que se hace con una muestra de RNA. Es
prácticamente el mismo proceso pero omitiendo el paso de hacer la digestión con
endonucleasas de restricción.
Los dos procesos se pueden hacer después de haber hecho la electroforesis
habiendo separado el ADN por tamaño. Con esta técnica se consigue revelar las
marcas dejadas por esos fragmentos de ADN separados por la electroforesis.

WESTERN BLOT:
Con proteínas.

2.3 HIBRIDACIÓN IN SITU:

En este tipo de hibridación, las sondas se añaden a muestras naturales como células o
tejidos. No se utiliza calor para la desnaturalización sino agentes químicos.
● Hibridación en el tejido: es relevante en la detección de infecciones virales,
células cancerígenas (debido a mutaciones) y RNA (para estudiar expresión
génica).
● Hibridación de cromosomas: sirve para la localización de genes, aberraciones
cromosómicas o compatibilidad de trasplantes. En esta hibridación se usa la
técnica FISH (Fluorescent “in situ” hybridization).

El FISH es una técnica que detecta secuencias de ADN en células o tejidos

preservados mediante el empleo de una sonda (fragmento de ADN homólogo a la
secuencia blanco) marcada con un fluorocromo, la cual va dirigida hacia un lugar
específico del ADN y que emite fluorescencia que puede ser observada por medio
de un microscopio de epifluorescencia.
Esta se fundamenta en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse
entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN, que resulta
complementaria con otra secuencia

La técnica se usa para cariogramas espectrales donde cada cromosoma es marcada

por un fluoróforo diferente, o para hibridación con dos sondas, una para cada brazo
del cromosoma para ver si falta alguno.

En la técnica FISH los cromosomas metafásicos humanos son hibridados con dos
sondas.
- La sonda que contiene la secuencia complementaria a la región subtelomérica
18p está marcada en rojo.
- La sonda que contiene una secuencia complementaria a la región 18q
subtelomérica está marcada en verde.

2.4 DNA MICROARRAYS (DNA CHIPS): Marcadores DE ENFERMEDADES. Se usa

para estudiar la expresión de genes en diferentes muestras y detectar
enfermedades.
Antes se usaban proteínas, hormonas, antígenos, enzimas, en líquidos corporales, pero
ahora podemos hacerlo en los ácidos nucleicos.

PROCESO:
Queremos ver qué genes se expresan en cada muestra, por eso es normal comparar
sano con enfermo.
1. Creamos cDNA (DNA complementario) a partir de RNA de la muestra, gracias a
la transcriptasa inversa.
2. Ahora marcamos las moléculas con fluorocromos, cada células, de la A y de la B,
con distinto color.
3. Ahora mezclamos los dos y se colocan en el chip (pequeñas placas en las que
tenemos pocillos).
4. En cada pocillo va a haber un oligonucleótido (secuencias
complementarias de genes relacionados con el tipo de enfermedad que
se está analizando), hibridamos y obtendremos distintos colores.
VERDE lo que se ha hibridado es la
secuencia A (el gen se expresa en A).

ROJO lo que se ha hibridado es la

secuencia B (el gen se expresa en B).

AMARILLO se han hibridado los dos

(el oligonucleótido se expresa en A y
B).

NEGRO no se ve nada, es porque esos

genes no se expresan ni en A ni en B.

Los resultados de los microrrays se

realizan con un software
especializado.

3. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN:
3.1 SISTEMAS DE RESTRICCIÓN-MODIFICACIÓN.
Endonucleasas de restricción: polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP). Catalizan el corte dentro de la secuencia, se denominan de restricción ya que
catalizan la hidrólisis dentro de una secuencia determinada. Son parte de un sistema
de restricción-modificación que aparecen en bacterias. Estas secuencias suelen ser
cortas y palindrómicas.

Estos sistemas están formados por una endonucleasa y una metilasa, los dos
reconocen la misma secuencia y catalizan cada una su reacción:
- Endonucleasa el corte de la secuencia
- Metilasa la metilación.

La actividad endonucleasa NO funciona si la metilación está hecha por lo que se realiza

la hidrólisis siempre que la molécula no esté metilada; los grupos metilo impiden la
interacción con la endonucleasa. La endonucleasa actúa en sitios no metilados y la
metilasa en sitios no cortados reconociendo ambas la misma secuencia.
3.2 EN LA NATURALEZA
En bacterias es un sistema de protección. El
DNA bacteriano está metilado por lo que no
se da el corte.
El DNA del fago (de un determinado
organismo) no está metilado o tiene un patrón
de metilación distinto por lo que la
endonucleasa de la bacteria realiza el corte y
esto inactiva el DNA del fago.

Hay varios tipos de restrictasas, 3 tipos. La más común es la tipo II, se caracteriza por
tener la metilasa y restrictasa en distintas unidades y en la I Y III están en la misma
unidad. Las tres primeras letras de los nombres corresponden a las especies de las que
provienen.

3.3 TIPO II
Características de tipo II :
- Reconocen secuencias cortas (4 – 8 pb) y
palindrómicas.
- Algunas cortan por la mitad de la secuencia,
dejando extremos denominados romos.
- Otras se cortan dejando extremos cohesivos de
2-4 nucleótidos.
3.4 ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS.
- Según la secuencia
- Polimorfismo de secuencia: en cualquier secuencia
- Poliformismo génica: en secuencias codificantes
- Según el número de nucleótidos:
- Variabilidad de nucleótido único
- Múltiples nucleótidos
- Según la frecuencia:
- Frequencia < 1% → Mutación
- Frequencia > 1% → Polimorfismo
- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism)
- Las muestras de DNA se cortan con un enzima de restricción y producen fragmentos
de longitud determinada.
- La variación (polimorfismo) en la secuencia del DNA produce un patrón de corte
distinto.

3.5 CAUSAS DE POLIMORFISMOS.

1) Cambios en la propia secuencia reconocida por los enzimas de restricción: mutación
puntual (Inserción).

2) Cambios entre los sitios de reconocimiento (sitios de restricción) de los enzimas:

mutación puntual (Inserción).

3.6 RFLP.
PARA DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES:
Si el gen que se va a analizar para el diagnóstico está entre dos sitios de restricción, se
puede hibridar una sonda marcada para la detección.
Si hay una mutación y falta un sitio de restricción, la muestra mutada tendrá una
longitud diferente a la secuencia sana al hacer el análisis.
- Si es homocigótico para la secuencia sana; es decir, tiene todos los sitios de corte la
secuencia va a ser corta, y en la electroforesis vamos a tener una sola banda que se ha
movido.
- Si es heterocigótico para la mutación, tendrá una hebra corta y otra larga, en la
electroforesis avanzara una hebra (corta) y la otra no.
- Si es homocigótica para la secuencia mutada, las dos hebras largas, en la
electroforesis tendremos una banda al principio.
PARA TEST DE PATERNIDAD
PARA ANÁLISIS FORENSE:
Se puede usar para obtener la huella de ADN (identificación de individuos). Se coge un
cromosoma, se corta, se desnaturaliza, se pone en electroforesis y ponemos una sonda
que reconozca algún fragmento, con exposición radioactiva obtendremos los
resultados. para el análisis, se realiza una hibridación Southern Blot.
TEMA 10.1 AMPLIFICACIÓN DEL DNA

1. CLONACIÓN MOLECULAR IN VITRO: PCR.

AMPLIFICACIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR. La PCR es el proceso de clonación de
moléculas, es una reacción de cadena de la ADN polimerasa muchas utilidades:
- Secuenciar (necesitamos más ADN)
- Detección de genes o secuencias específicas.
- Análisis de polimorfismos.
- Detección de mutaciones.
- Detección de enfermedades hereditarias.
- Medicina forense, arqueología…
- Clasificación y detección de virus, microorganismos…

LOS PRINCIPIOS DE LA PCR: Partimos de una molécula de ADN, el objetivo es tener más copias.
MATERIAL: DNA polimerasa, dNTPs, termociclador, cebadores, disolución tampón (con Mg).
1. A partir de una molécula de DNA, con calor vamos a separar completamente las dos hebras del
DNA (termociclador).
2. Vamos a poner una temperatura adecuada para que se de la hibridación de los cebadores
(solamente con su secuencia complementaria) y no haya hibridación inespecífica, al enfriarse se van a
unir.
3. Como la doble hebra se separa totalmente, la DNA polimerasa termoestable va a catalizar la
síntesis de 5’-3’ del DNA en las dos hebras. La DNA polimerasa extiende los cebadores hasta donde
le permita su procesividad.
4. Repetir esto múltiples veces (25 ciclos por ejemplo).

La secuencia diana va a estar determinada por el sitio al que se unan los nucleótidos que queremos
amplificar.
Vamos a necesitar también un termociclador que regula la temperatura a lo largo del proceso.
2. PROPIEDADES DE LA PCR.
DURACIÓN:
El tiempo de duración puede variar en función de la longitud que la secuencia que queremos copiar.
Duración de cada ciclo depende de la secuencia y el número de ciclos depende de los cebadores
que tenga, o del límite de detección (sensibilidad) y la precisión de la ADNPol (Taq Pol; velocidad de
1kb/min, termoestable (75ºC – 95ºC), sin actividad 3´exonucleasa, con un error por cada 1-20x105
nucleótidos). Si queremos amplificar una cadena más larga, necesitaremos un ciclo más largo,
además si tenemos cierta cantidad de cebador no podemos poner más ciclos de los que va a hacer, si
queremos tener mucha cantidad, tendremos que hacer más ciclos.

ESPECIFICIDAD:
Si se aumenta el número de ciclos, aumenta la probabilidad de error. La especificidad de la PCR
depende de los cebadores y de la temperatura.
Cebadores:
- Tamaño: Los cebadores tienen un tamaño de 18-24 nucleótidos.
- Composición: El 45%-55% de su composición es GC.
- Temperatura: Su temperatura de hibridación es de 56-62ºC (los dos cebadores se unen a la misma
temperatura, no es la óptima para los dos).
- Secuencia: Debido a la secuencia, tenemos dos problemas que queremos evitar:
● Autoemparejamiento, la secuencia que esté libre para el cebador no sería la que nos
interesa.
● Dímeros de cebadores, se hibridan entre ellos (frecuente).

TEMPERATURA DE EXTENSIÓN
La temperatura de extensión depende de la DNA polimerasa. La temperatura se mantiene durante
un tiempo para que acabe totalmente la extensión.
Cuando estamos replicando, esto se realiza de manera
secuencial en cada ciclo y de repente llegamos a una meseta,
lo que ocurre es que se están acabando los cebadores. El nº de
ciclos están relacionados por el nº de cebadores, ya que si no
hay cebadores no hay replicación.

3. HOT START PCR

Para evitar las variaciones, la Taq
polimerasa, va a estar inactivada por la
unión de anticuerpos, modificaciones
químicas o por aptámeros (moléculas de
ácido nucleico, que tienen la capacidad de
unirse de forma específica a una
secuencia diana).
Con esto conseguimos que en
temperatura ambiente (temperatura menor
a la de hibridación de los cebadores) la
Taq polimerasa NO se una a los
cebadores que se han unido entre ellos, y
NO extenderlos. Cuando se calienta, el
dsDNA se desnaturaliza y el pol se activa
4. PCR ASIMÉTRICA
Vamos a obtener más de una hebra que de la otra.
1. Se va a calentar la mezcla para separar las hebras.
2. Añadir cebadores, pero uno en mayor cantidad que el otro
3. Añadir la DNA polimerasa para catalizar la síntesis.
4. Obtendremos más de una hebra que de la otra.
NO añadiremos solo un cebador, porque es menos “rápido”

5. PCR MULTIPLEX
Se usa para la detección de microorganismos y para el diagnóstico
de enfermedades infecciosas poco frecuentes.
Consiste en utilizar varios cebadores.Vamos a utilizar cebadores para más de un sitio en el genoma,
para conseguir una amplificación en más de un sitio a la vez.
Aunque tengamos 3 cebadores hay que buscar una temperatura óptima para los 3, de manera que es
mucho más fácil obtener productos no específicos. Hay que tener mucho cuidado para que NO se den
productos no específicos.
Para que se puedan ampliar las tres secuencias a la vez, hay que ver que no se van a dar productos
no específicos. Como la muestra va a dar diferentes longitudes, se puede comprobar mediante
electroforesis; es decir, revisamos antes si se van a dar productos no específicos antes de llevarlo a
cabo.
Utilizando los mismos cebadores se hace una PCR a distintos microorganismos, y estos no se
modifican. Se comparan las señales de las especies puras y de otros patógenos con la muestra
problema para ver si no hay productos inespecíficos.

6. PCR ANIDADA
Aumenta el límite de detección y se utiliza para aumentar la especificidad de la PCR, para reducir los
productos no específicos.
La especificidad de un PCR reside en los cebadores, que a su vez depende de la secuencia que
queremos amplificar, cosa que no controlamos por eso utilizamos este método.
1. Hacemos la primera PCR.
2. Obtendremos artefactos no específicos y dímeros de cebadores, o unión del cebador en
secuencias que no queremos amplificar .
3. Para reducir el efecto de estos productos no específicos, se van a usar cebadores (anidados)
en una segunda PCR, que van a estar en la secuencia que se ha amplificado anteriormente. En la
segunda PCR (con un segundo par de cebadores que están dentro de la secuencia), vamos a obtener
productos más específicos. Los cebadores secundarios/ anidados van a estar dentro de la
secuencia amplificada previamente, pero no dentro de los dímeros.
EJEMPLO:
Tenemos la detección del virus Epstein-Varr y se ve la comparación entre PCR normal y PCR anidada,
demostrando que la PCR anidada es más sensible que la PCR normal. En la anidada se puede
llegar a 10-2 pg de virus.

7. PCR EN BOLAS DE EMULSIÓN

Si hay múltiples secuencias de ADN, pueden hibridarse entre ella; por ello, una forma de minimizar los
productos no específicos es usar bolas de emulsión.Se usa una mezcla de 2 líquidos no miscibles y
heterogéneas (agua y aceite), de forma que tengamos una fase oleosa y gotas de disolución acuosa.

1. Se diluye la muestra, los reactivos de forma que como máximo tengamos una molécula molde y los
reactivos para conseguir amplificación en cada gota.
2. Se obtiene la emulsión y nos va a interesar obtener en cada gota solamente una molécula de ADN
molde y una bola (bola microscópica) que tiene uno de los cebadores unidos.
3. Tendremos un cebador libre en disolución y otro unido a la bola.
4. Según ocurre la PCR los
cebadores se van extendiendo.

Al final el ADN que obtenemos es

extensión de los cebadores. Si
tenemos un cebador unido a las
bolas, cuando se haga el proceso y
al hibridar, una de las hebras molde se va a hibridar con el
cebador unido a la bola. Se hace el proceso muchas veces.
Las copias de ADN que conseguimos están todas unidas a la
bola que sirve para purificar el ADN.
Se puede hacer con bolas en emulsión de sílice.

8. PCR EN TIEMPO REAL (qPCR)

No solo amplifica el ADN si no que también se cuantifica.
Lo vamos a hacer midiendo una señal de ese adn usando sondas fluorescentes (más segura, pero
más costosa). Según vamos obteniendo más ADN la señal fluorescente va a aumentar. Tendremos un
aumento exponencial hasta que se acaben los cebadores. Según va aumentando la PCR, aumenta la
fluorescencia y en un momento dado pasa un umbral. Lo que se mide es en qué ciclo sobrepasa la
fluorescencia ese umbral. A ese ciclo se le llama ciclo umbral Ct.

Si tenemos más ADN inicial, el ciclo umbral será menor, es decir, menos ciclos vamos a necesitar
para que nos den la señal. Cuanto más ADN tengamos antes vamos a llegar al umbral.
Los parámetros son los siguientes:
● Rn: fluorescencia de la sonda reportera normalizada con respecto al fluoróforo pasivo de referencia.
● Fluoróforo pasivo de referencia: fluoróforo que no se una al DNA y que proporciona una referencia
interna de la fluorescencia.
● ΔRn = Rn - línea de base
● Línea de base: fluorescencia de los ciclos iniciales de la PCR.

La fluorescencia es más segura pero suelen ser caras. Las formas para calcular la cantidad de ADN:

● Sondas que se unen directamente al dsDNA: SYBRGreen se une a la doble hebra.Suelen ser
sondas intercalante de manera que se puede unir al DNA entre las dos hebras. La añadimos a la
mezcla y según vamos obteniendo más ADN de doble hebra esa sonda nos va a dar señal. La sonda
NO tiene dependencia con la secuencia. Se mide la secuencia total.
● Sonda auto-complementaria doblemente marcada: en el fenómeno FRET se utilizan dos
moléculas sondas ligadas a una secuencia horquilla que absorben luz y una de ellas va a emitir
fluorescencia (sonda fluorescente) y la otra no (sonda quencher). Sonda quencher desactiva la
fluorescencia de la otra. Por lo que no tendremos fluorescencia. El efecto FRET depende de la
distancia: cuando están cerca se quenchean, es decir, no hay fluorescencia.
Cuando se hibrida con la secuencia diana, la horquilla se aplana y las sondas se alejan por lo que no
ocurre el efecto FRED y se da la fluorescencia.
● Sondas doblemente marcadas no van a tener estructura autocomplementaria pero van a tener una
sonda fluorescente y una sonda quencheante. Cuando la TaqPol (actividad 5’-3’ exonucleasa) llegue
al punto de la sonda fluorescente va a hacer que se liberen y al estar libres en disolución y alejadas,
no habrá efecto FRED por lo que la sonda fluorescente podrá volver a emitir fluorescencia. En este
caso también estamos midiendo la cantidad de DNA diana.

9. PCR DE TRANSCRIPTASA INVERSA (RT-PCR)

A partir de una molécula de RNA y mediante la transcriptasa inversa obtendremos DNA de doble
hebra. Vamos a tener una molécula de dsDNA que teníamos inicialmente en el RNA ya que
directamente no podemos amplificar el RNA. Con el DNA replicado, sí se puede amplificar el ARN. Se
utiliza una RNAsa para quitar el RNA inicial.

Podemos utilizarla para muchas APLICACIONES:

- Análisis de genomas retrovirales.
- Medición de niveles de transcripción de genes.
- Obtención de CDS de un gen.
- Cualquier objetivo que implique medida o amplificación de RNA.

Hay que normalizar la expresión del gen que se quiere analizar con respecto a la expresión de un gen
que sirva de control de extracción (de RNA de la muestra) y carga (de RNA en la reacción y el gel
para análisis). Para el control positivo, se usa un gen constitutivo; es decir, donde se sabe que ese
gen se va a expresar.
RT-PCR EN TIEMPO REAL (qRT-PCR)
¿Se pueden comparar los resultados del mismo gen entre las cuatro muestras? Si porque el control
positivo (gen constitutivo) tiene valores parecidos.
¿Quién tiene mayor expresión de gen CK19, el paciente 1 o el paciente 3? El paciente 1 tiene un ciclo
umbral de 11 y el paciente 3 uno de 17: cuanto menor sea el ciclo umbral hay más ADN inicial. Como
el paciente 1 tiene un ciclo umbral menor, tendrá más ADN y por tanto mayor expresión del gen CK19.

Para poder comparar los genes entre distintos pacientes vamos a utilizar un control de extracción y
carga. También se utiliza para diagnosticar infecciones por Sars-CoV-2. Se extrae una muestra
biológica y se extrae el RNA. En este caso se amplifican genes de proteínas del núcleo de este virus.

10. AMPLIFICACIÓN DEPENDIENTE DE HELICASA (HDA)

Se añade una helicasa y por tanto NO se necesita cambiar la temperatura, es isoterma.
1. La enzima helicasa cataliza la separación de hebras que hacen que el DNA se separe poco a poco
pero aquí la síntesis depende de los cebadores que ponemos, aunque las hebras molde se separen
poco a poco la síntesis ocurre de manera continua, no se necesitan ligasas porque no hay síntesis
de fragmentos.
2. Los cebadores se van extendiendo a la vez que se separan las dos hebras.
En resumen, se desenrolla el DNA por la helicasa y se hibrida el cebador, se desnaturaliza el DNA y
se amplifica.
TEMA 10.2 SECUENCIACIÓN DEL DNA

SECUENCIACIÓN POR EL MÉTODO SANGER.

Se usa un análogo ddNTP, se les llama didesoxirribonucleótidos (tiene H en vez de OH en 3’).
Es necesario para que se dé la extensión del DNA un 3’OH.
Si añadimos este ddNTP al cebador en la cadena creciente, la cadena no se va a poder extender más
y en el nucleótido análogo se parará y el cebador no se extenderá más.
Para secuenciar, en un tubo se añaden 4 desoxirribonucleótidos (monómeros normales) y un ddNTP.
En otros 3 tubos se añaden los otros 3 ddNTPs.
Al tener una T en el molde, ahí puede entrar un desoxirribonucleótido normal con adenina o un dd con
adenina, entonces a veces se va a poder extender y otras veces no.
Si entra un ribonucleótido normal, se puede extender la reacción sigue hasta que vuelva a darse este
suceso. En caso de que entre un dd, se para de extender.
Al cargar los productos en la electroforesis, (el más pequeño más se mueve, se acerca al extremo 5’).
La secuencia que obtenemos se refiere al cebador que se extiende, si queremos la secuencia del
DNA molde, hay que poner el complementario de esta que hemos obtenido.
Las muestras se han cargado arriba
(5’ está abajo).
La muestra que obtenemos es la muestra
complementaria obtenida, la del cebador:
5’ GATTCGAGCTGA 3’
Secuencia del DNA molde:
3’ CTAAGCTCGACT 5’
3’-5’ es el sentido del DNA si no se indican los 3 y 5.
Se han hecho marcadores fluorescentes (para los
ddNTPs) para automatizarlo y así al hacer
electroforesis se obtiene una separación nucleótido
a nucleótido
con color distinto para cada base. Para Sanger es
necesario utilizar un cebador, si no conocemos la
secuencia molde podemos añadir una mezcla de
cebadores y utilizar aquel que se hibride. Aquí
marcamos el cebador que se ha extendido.

1.1 AUTOMATIZACIÓN.
Se usan nucleótidos marcados con sondas fluorescentes
Vamos a poder ver el cebador que se ha extendido porque está marcado, el último nucleótido, según
diferentes colores.
1. Se añaden ddNTPs marcados (se pueden añadir
todos juntos) para la replicación del DNA en una base
nitrogenada determinada
2. La electroforesis capilar revela una escalera de
hebras de DNA con solo un nucleótido de diferencia
3. Se pueden detectar los nucleótidos gracias a su
marcaje. En el gráfico aparecen picos de los
nucleótidos marcados, pero también la señal de los
nucleótidos incorrectos.
4. Se puede deducir la secuencia de la hebra
complementaria a partir del gráfico.
 A partir de unos cuantos cientos de bases no vamos a poder seguir secuenciando con este método.
Para secuenciar el genoma de todo el organismo necesitamos hacer este método muchas veces, ya
que esta solo nos permite una muestra por reacción. Las técnicas de las siguientes generaciones
intentan secuenciar más muestras de forma simultánea.

2. SECUENCIACIÓN MASIVA DE DNA

2.1 SECUENCIACIÓN DE 2ª GENERACIÓN:

PROCEDIMIENTO COMÚN:
1. Se produce una librería de secuencias uniendo adaptadores, para secuenciar un genoma entero
necesitamos fragmentar el DNA del organismo de forma que tengamos tamaños más manejables. Por
ello necesitamos adaptadores (para poder identificar los segmentos).
2. Amplificar el DNA a secuenciar, es decir, crear más DNA para tener más señal.
3. Aplicar la muestra al chip de secuenciación. Los chips, son como los de microarray, con pocillos
4. Realizar reacciones de secuenciación (cada tipo tiene una distinta).
5. Compilar múltiples lecturas mediante software (saber el orden), aquí van a ayudar los
adaptadores porque ayudar a identificar las secuencias.

1. Producir librería de secuenciación.

● Para estas técnicas también necesitaremos cebador -cebadores de secuenciación-. Para tener la
secuencia conocida (donde se une la secuencia que es reconocida por el cebador), añadiremos una
secuencia adicional en los extremos. CSEC 1 y CSEC 2: secuencias conocidas.
● Vamos a necesitar una secuencia que identifique la lectura (ID 1 ID 2), también se les llama índices
o códigos de barras. Son secuencias cortas, conocidas que nos van a permitir identificar la lectura
de la secuencia, para saber luego si las distintas lecturas vienen de una muestra o de distintas
muestras; es decir, si se han hecho varias copias de una misma secuencia o si habían varias copias
con la misma secuencia en el organismo.
● También necesitamos unas secuencias soporte (US1 US2) que van a unir todo el constructo a un
soporte.

La adicción de estas secuencias adaptadoras se

puede dar:
- mediante una DNA ligasa, catalizando la unión
de los adaptadores y la secuencia.
- mediante ligación +PCR, añadiremos las
secuencias adicionales parte con ligasas y otras
con PCR.
- mediante PCR para poder hibridar las dos
partes necesitaremos una secuencia. Para
poder hibridar necesitamos una secuencia aleatoria.
2,3. Amplificar el dna y aplicar chips en el instrumento de detección.
unión de molde:
Es isoterma. Normalmente es una PCR sobre bolas de emulsión o una amplificación sobre un
soporte sólido. Los moldes libres se unen a adaptadores unidos a la placa o a las bolas de emulsión.

Amplificar el DNA directamente en un soporte sólido: en este caso los cebadores están unidos a una
placa sólida y gracias a los adaptadores se van a hibridar y vamos a amplificarlo. Obtendremos grupos
de moléculas con la misma secuencia. Esta amplificación ocurre en chips de secuenciación, hay unos
canales donde van a pasar los reactivos para la síntesis (todas ellas con la misma secuencia).
Si se hace en soporte sólido, el ADN ya está aplicado al chip de secuenciación. Si se hace con bolas
en emulsión, la muestra se tiene que añadir a los pocillos

4. Reacciones de secuenciación
- Polimerización(Illumina): método que utiliza la DNA polimerasa, capaz de detectar el nucleótido que
tiene que entrar para la hebra molde. Funciona con la técnica de terminación reversible. Hay una
sonda fluorescente unida al nucleótido que se añade. La sonda fluorófora impide la extensión del
cebador. Se elimina la sonda dejando el extremo 3’ OH libre y se repite, con otro nucleótido también
marcado. Cóntigos: Secuencias contiguas
- Adición de dNTP individuales: añade un dNTP a la vez y observa la señal para ver si han salido
pirofosfato o protones. Si se libera pirofosfato o protones, el nucleótido se une y sino, no.
(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi + H+
Pirosecuenciación (454): se libera pirofosfato cuando se incorpora el nucleótido correspondiente.
Semiconductor de iones (ion torrent): se libera un protón cuando se incorpora el nucleótido
correspondiente. Si disminuye el pH, el nucleótido se ha añadido, por eso esta técnica consiste en
medir el pH y es la mejor en coste instrumental.
- Ligación (SOLID): se necesita una secuencia inicial para utilizar como cebador. Utiliza una ligasa, los
oligonucleótidos van a tener un color fluorescente que dependerá de los dos primeros nucleótidos que
hay en la hebra y finalmente se corta la parte que contiene la parte fluorescente. Se pierde información
de la secuencia ya que la sonda solo proporciona la información de los 2 primeros nucleótidos, para
obtener la secuencia completa utilizamos oligonucleótidos cada vez más cortos. Es la mejor
técnica en el número de lecturas.

2.2 SECUENCIACIÓN DE 3ª GENERACIÓN:

No es necesario la PCR porque se obtienen señal de moléculas individuales de ADN mediante señal
fluorescente → Secuenciación de moléculas individuales.
- Guía de onda de modo zero (Single Molecule Real Time sequencing): en el soporte se fija una ADN
pol y un ADN molde en cada pocillo. El volumen de estos pocillos es de 10e-21 L = 1 felilitro Con esta
técnica vemos la fluorescencia del nucleótido que se va a incorporar, al mismo tiempo que se añade
se va a medir la fluorescencia. La emisión y la detección ocurre por debajo del soporte. Esta técnica es
la mejor en el tiempo de reacción.
- Secuenciación nanoporo: separamos una disolución en dos partes por una membrana, en esta
insertamos un poro con una toxina y se aplica una diferencia de potencial, de manera que los iones
van a atravesar estos poros, si tenemos nucleótidos unidos a ac. nucleicos en la disolución, al estar
cargados se van a mover por la disolución. Dependiendo del nucleótido que este pasando va a
generar un bloqueo de corriente por el tamaño del nucleótido, cada bloqueo es característico
de cada nucleótido esto nos permite identificar la secuencia de nucleótidos a partir de los
bloqueos. Un problema es que el DNA pasa demasiado rápido por el poro para ello utilizan
moléculas adaptadoras como enzimas para ralentizar el paso de nucleótidos por el poro.
Esta técnica es la mejor es longitud de lectura y en extensión.
 Oncogenes

Oncosupresor
Tema 12: Tecnología del DNA Recombinante
12.1 Clonación celular in vivo
12.2 Elementos de la clonación celular

12.1 Clonación celular in vivo:

Clon: Una copia idéntica.​

● Clonación molecular in vitro:​​PCR. (tema 10).

● Clonación celular in vivo​​: replicación de células con contenido genético idéntico.​
12.2 Elementos de la clonación celular:
1. Preparación del DNA:​ Endonucleasas de restricción
reconocen secuencias determinadas y cortan los
fragmentos de ADN de interés.
2. Seleccionar un vector​ de clonación
(típicamente DNA viral o de un plásmido).
Son transportadores​ moleculares que pueden
transportar fragmentos de ADN de interés a la célula
diana.
3. Ligar (Ligasas) el DNA diana al vector de clonación:
DNA recombinante (rDNA)​.​
4. Introducir el rDNA en la célula
hospedadora:​ clonación. Rendimiento muy variable.
Muy difícil de elaborar.
5. Todos estos pasos tienen un rendimiento​ menor del
100% y​ al final se obtiene una mezcla de células,
algunas con el constructo que queremos, otras con
constructos diferentes, y otras simplemente
sin él constructo. Para eso se identifica o se selecciona
las​células hospedadoras que contengan el rDNA.

Estos principios también se pueden

utilizar para la terapia génica,
organismos transgénicos, industria
alimentaria y farmacéutica.

Podemos utilizar esta técnica para obtener

múltiples copias del ADN y sin las limitaciones
de la PCR ya que el gen está dentro de la célula.
Podemos obtener proteínas codificadas por el
gen de interés y ser utilizadas en múltiples
investigaciones. También podemos obtener
enzimas, biopolímeros,etc. También podemos
obtener múltiples copias del gen de interés.
Es posible insertar un DNA específico de las
células para que produzcan unas proteínas
determinadas.

1
 Proceso de la Clonación

1. Preparación del DNA:

→ Digestión del DNA genómico completo usando endonucleasas de restricción. Se​
utilizan dos​endonucleasas diferentes.​Lo más probable es que obtengamos un lado cortado
por uno de los enzimas de restricción (​Bam HI​) y el otro lado cortado por la otra enzima (Pvu​
I​). Así podemos orientar​el​fragmento de forma apropiada. Si solo se usase un enzima de
restricción, los dos lados de la
secuencia a clonar tendrían la misma
secuencia y serían comparables.
Entonces a la hora de unir este
fragmento al vector se puede unir de
una forma o de la otra, porque los
extremos de la secuencia es la misma.
Pero si utilizamos dos endonucleasas
de restricción, los dos extremos son
diferentes y nos permite orientar el
fragmento de ADN en una dirección
determinada (apropiada) respecto al
vector. Esto nos sirve para expresar
proteínas.

→ Clonaje de productos de PCR: Se​pueden diseñar cebadores​que​introduzcan secuencias

reconocidas por endonucleasas de restricción durante
la PCR, lo que puede usarse para producir extremos
adecuados para la clonación, ya que puede darse el
caso de que tengamos una secuencia de DNA que
queremos clonar y no tengamos la secuencias
apropiadas para cortar con enzimas de restricción
(los sitios de reconocimientos de restricción tienen
que estar en los extremos de las secuencias que
queremos clonar). Se puede utilizar una PCR para
añadir estos sitios de reconocimiento ⇔ Es
comparable con la adición de adaptadores para la
secuenciación masiva.
Cebadores→​ Las secuencias verdes​y​azules​(​son
las secuencias que se hibridan) son​ cebadores que
van a introducir secuencias reconocidas (no se
hibridan) por endonucleasas de restricción. En este
caso se añaden la secuencia 5’GGATCC3’ y
3’TTCGAA5’ que se utilizan para producir
extremos adecuados para la clonación.
En el ciclo 3, encontramos las secuencias diana
palindrómicas. que van a ser reconocidas por BamHI​​
site y HindIII site.​
Después de otros 20 ciclos de PCR, se cortan las
secuencias con enzimas de restricción, quedando así
dos extremos distintos, los extremos cohesivos diferentes.​
2
→ Clonación de cDNA- para la sobreexpresión de un gen. (Ejemplo) Si queremos ver en
un tejido patológico que tipos de proteínas se expresan, se puede empezar extrayendo una
secuencia de de mRNA de interés (desconocida). Para obtener el cDNA​ ,​ necesitamos
cebadores para que la transcriptasa inversa para convertir el mRNA en DNA.
Sabiendo el hecho de que el mRNA eucariótico tiene un extremo poli A 3’:
- Se puede utilizar el mRNA eucariótico con un extremo de cola poliA​ 3’ para
hibridarlo con un cebador poli-dT​y extenderlo (1), así se puede obtener la primera
hebra de ADN (2).
- Después se pueden utilizar otras enzimas para añadir la cola poli-dG en el otro
extremo (3). Y luego se puede utilizar un cebador poli-dC​(4). Y así se consigue la
segunda hebra de ADN (5).
- Luego hay que cortar
el ADN en los dos
extremos. Hay que
proteger el cDNA
metilándola (metilasa,
enzimas de tipo II:
Actividad enzimática
endonucleasa) para
protegerla (6).
- Mediante ligación se
le añade una
secuencia que va a ser
reconocida por una
enzima de restricción
(7) y luego se corta
con la misma metilasa
(8).

Así obtenemos la secuencia que queremos clonar, que corresponde al mRNA original, pero
en forma de cDNA y añadiendoles los extremos cohesivos formados por las secuencias que
son reconocidas por las enzimas de restricción.

Sabías que…?
Sistema metilación-restricción: Para cada enzima de restricción, una metilasa reconoce la
misma secuencia que constituye el sitio de restricción y une covalentemente grupos metilo
a determinadas bases del DNA en dicha secuencia. En el caso de enzimas de tipo II, la
metilasa es una proteína independiente, mientras que las de tipo I y III poseen las
actividades nucleasa y metilasa en una misma molécula oligomérica.
➔ Utilizando enzimas de tipo II: La metilación de las bases impide la unión de la
enzima de restricción, con lo que el DNA propio no es hidrolizado.

2. Vectores de clonación:
Vector (Transportador): Molécula​ de DNA que se replica de forma autónoma en​ una
célula hospedadora y a la que se le ha insertado un segmento de DNA a replicar.

3
Los vectores empleados para la clonación de insertos de DNA son muy variados. Pueden clasificarse
según criterios, tales como:
● Su procedencia procariótica o eucariótica.
● El tamaño de inserto que admiten.
● El gen de resistencia incluidos en el vector para su posterior detección o selección.
● El tipo de molécula a partir de la que se preparan

Funciones:​
- Transportar el fragmento de DNA deseado dentro de la célula para obtener múltiples
copias de ese fragmento.
- Modificar algunas características de la célula u organismo.

Elementos necesarios:
- Origen de la replicación.
- Gen (es)/ Marcador(es) de selección/ identificación. Genes que permiten
seleccionar al final del proceso aquellas células que hayan introducido el vector con
nuestro constructo (rDNA).
➢ Gen (es)/ Marcador(es) de selección: Permiten que unas células sobrevivan y
otras no.
➢ Gen (es)/ Marcador(es) de identificación: Permiten sobresaltar alguna
característica de las células que tienen rDNA o no.
- Secuencia(s) reconocida(s) por enzima(s) de restricción. Las mismas que para
obtener el cDNA, para facilitar su unión con el fragmento de DNA que se quiere
clonar.
- Se usan vectores de expresión para proteínas: promotor, operador, secuencia de
unión al ribosoma adecuada al tipo de la célula hospedadora.
Elementos accesorios:
- Linker:​inserto que contiene un sitio de restricción.
- Polylinker o​Sitio de multiplicación (MCS​):​inserto que
contiene varios sitios de restricción.

PLÁSMIDOS:​DNA circular ​presente en bacterias y que se

replica de forma ​autónoma​.​ Incluyen genes marcadores cuya
expresión confiera a la célula anfitriona portadora del rDNA alguna propiedad especial.
- Tamaño: < 100kb
- Tamaño de inserto: < 10kb
- Mecanismos de amplificación: Los plásmidos se replican con la célula y se pueden
recuperar fácilmente lisando las células y purificando el DNA. (Múltiples copias de
plásmidos en una misma célula).
Las bacterias que contienen plásmidos se pueden mantener de forma indefinida a
-70ºC en glicerol. Nos permite tener una genoteca de ADN. Podemos coger el genoma
de un organismo, partirlo e introducirlo en plásmidos y luego en células y finalmente
congelarlas.

4
 -Nombre: pBR322
-Origen de replicación (ori)​

-EcoRI/BamHI/SalI/PstI/PvuII: Sitios de reconocimiento de enzimas de

restricción.
​ : Gen de resistencia a la Tetraciclina (antibiótico).
-Tet​R​
​ : Gen de resistencia a la Ampicilina (antibiótico).
-Amp​R​

Si este vector entra en una

bacteria, y ponemos la
bacteria en un medio que
tenga estos antibióticos, la
bacteria va a sobrevivir.

Edited by Imanol Merino ♥️ Vale crack

Si utilizamos uno de los sitios de restricción para introducir nuestro ADN, estamos
rompiendo el gen y entonces el vector ya no tendrá el gen de resistencia a la Ampicilina,
pero sí a la Tetraciclina. Esto nos permite distinguir células que contienen nuestro constructo,
con las que no.

BACTERIOFAGOS: viruses que infectan bacterias.​

- El más común es el fago lambda (​ƛ).​
- Mecanismo de amplificación: replicación del fago.
- El uso de virus es especialmente adecuado para la clonación en células de mamíferos,
por su elevada eficacia de introducción del rDNA.
- Elevada eficacia de introducción del rDNA en las células anfitrionas.

Dos tipos de vectores:

● Vectores de inserción: el DNA a clonar se inserta en el genoma del fago. Admiten
solo insertos pequeños ya que sino no se podrían empaquetar en las cápsidas víricas.
Tamaño del inserto: <10kb. Tamaño del vector: <10kb.
● Vectores de sustitución o de reemplazamiento: se elimina una parte del genoma del
fago (virus) usando enzimas de restricción y se reemplaza por el DNA a clonar.
Tamaño de inserto: 9-23kb. Se consigue más espacio para el el DNA a clonar en el
genoma. La enzima de restricción corta una región no esencial para la supervivencia
del virus, dejando más espacio para el rARN.
Dependiendo de nuestro objetivo a conseguir, se pueden prescindir de diferentes
secuencias. Pero no se puede eliminar los​ sitios de corte cos​ (​cohesivas)​​. Estas
secuencias cos ​ ​son necesarias para empaquetar el ADN dentro de la cápside del
virus. *Secuencia att: Para​la recombinación específica del sitio.

5
CÓSMIDOS:​Molécula de DNA sintética que contiene secuencias​cos​ ​de fagos,​pero que
son estructuralmente similares a plásmidos.
- Secuencias cos: secuencias cohesivas de fagos que se necesitan para el
empaquetamiento del DNA del fago. Permite introducir los plásmidos dentro de las
partículas de virus.
- Mecanismo de amplificación: como los plásmidos. Lo que da alta capacidad de
propagación.
- Tamaño del inserto 30-46 kb (mayores que en los bacteriofagos).
- Propiedades de fagos y plásmidos (Ventajas):
➢ El fago permite la incorporación en la célula hospedadora.
➢ No se codifican proteínas del fago.
➢ Se puede mantener y recuperar como los plásmidos.
La introducción del DNA en la célula sea por la vía por la que lo hace un virus (muy eficaz),
y dentro de la célula se replican como si fuesen un plásmido.
En este caso el paso limitante (mayor dificultad) es la introducción del plásmido dentro de
la partícula del virus en vez de la introducción del DNA del virus en la célula que tiene un
rendimiento cercano al 100%.
Es decir el paso limitante y el que tiene menor rendimiento es el previo al paso de introducir
el fago en la célula.

Cosmid Vector: Permite obtener proteínas.​

-Origen de replicación (ori)
-Genes de Resistencia: Amp​R​ / NeoF​
-Secuencias cos​
-MCS: inserto que contiene varios sitios de restricción.
T3​↓ / T7 ↑:​Sitios de comienzo de la transcripción.

6
CROMOSOMAS ARTIFICIALES: Vectores plasmídicos​ especiales​ que permiten la
clonación de segmentos muy largos.​Tienen pocas copias del plásmido en las células lo que
puede evitar fenómenos de recombinación natural. : Este tipo de vectores se ha diseñado en
especial​para adaptarse al gran tamaño de insertos requeridos en el caso del genoma humano
y de otros mamíferos, y para la clonación en células eucarióticas.
● Bacterianos (BAC)
- Tamaño del inserto: <300 kb.​
-Se trata de vectores sintéticos derivados del plásmido F.
-Acepta grandes insertos de DNA, entre 100 y 300 kb.​
- Los BAC contienen genes que reducen su capacidad de copia; es decir, de replicación en la célula
anfitriona del rDNA formado. Como resultado, se consigue mayor estabilidad de los insertos de
DNA de origen eucariótico.
-Los BAC son vectores adecuados para la elaboración de genotecas eucarióticas.

● Eucariotas (YAC-Yeast artificial chromosome):

-Origen de la replicación (ori​)​
-Centrómero (CEN​):​ Para que cuando se dividan las
células, el DNA quede distribuido equitativamente en las
células hija.
- Dos telómeros (TEL​):​Para cuando ocurra la replicación,
no se degrade la secuencia que tenemos.
- Tamaño de inserto: 0,2-1 Mb
-Marcadores seleccionables (​X e Y).​
-Se utilizan en particular para preparar genotecas de
genomas muy grandes, o para mantener un gen completo
en un único clon.

*Digestión enzimática de la pared celular: Facilita la

introducción del ADN.
*Transformar = Introducir el DNA dentro de la célula.

VECTORES DE EXPRESIÓN:
Una vez que tenemos múltiples copias del ADN nos puede
interesar obtener la proteína que codifica un gen → ​Vector
de expresión
Necesitan tener elementos para la replicación, transcripción
y traducción.
● Transcripción:
- Promotor fuerte: Muchas síntesis de la proteína.
- Factor de regulación: Inducir la proteína.
- Secuencia de terminación.
● Traducción:
- Secuencia de unión a ribosoma (RBS).
➢ Procariotas: Secuencia Shine-Dalgarno.
➢ Eucariotas: Secuencia Kozak.

7
Dificultades para la síntesis de proteínas:
Puede darse el caso de querer expresar una proteína eucariota usando células procariotas. En
un entorno industrial es más fácil trabajar con células eucariotas. Dependiendo en qué tipo de
células se realiza la síntesis de proteínas:
● Bacterias:
Aparecen varios problemas:​
- Eliminación de intrones: Es distinta a la de los eucariotas. Puede darse el caso de que
no se eliminen en procariotas.
- Distintas preferencias en el código genético: Aunque el código genético es universal,
no en todas las células hay las mismas preferencias. Puede dificultar la expresión de
genes eucariotas en procariotas. Es posible que en la célula que queremos expresar la
proteína, haya un codón distinto que tenga preferencia por un aminoácido. Sigue
siendo el mismo codón para el mismo aminoácido pero las cantidades pueden ser
distintas.
- Distinto procesamiento postraduccional.
➢ Glicosilación.
- Plegamiento inapropiado de cadenas proteicas.
➢ Cuerpos de inclusión (Precipitado de proteínas): Puede que no se obtenga la
proteína deseada.
- Degradación de proteínas recombinantes: Las células hospedadoras pueden que
rechacen a las proteínas expresadas.
● Eucariotas:​
- Se usan levaduras y hongos filamentosos.
- Pueden crecer en medios continuos: Reactivos industriales. Producir la proteína
deseada de manera continua.
- Menos problemas de expresión para proteínas eucarióticas.

Antes de empezar a introducir el vector en eucariotas, primero se inserta el vector en

procariotas, y se obtienen muchas copias.

Para S. cerevisiae (organismo unicelular):

Una vez introducidos los vectores en eucariotas, hay

que emplear algún método para seleccionar las células
que nos interesan:
- Plásmido de levadura de 2 µm: Utilizar cepas de
levaduras deficientes en el gen LEU2​(​necesario para
sintetizar leucina). No son capaces de producir la
leucina por lo que necesitan crecer en un medio donde
sí haya leucina.
- Plásmido de levadura episómico YEp13: Se pueden
utilizar vectores que sí contienen LEU2, insertarlos en
la cepa de levaduras. Las células que consigan insertar
el vector van a sobrevivir en un medio sin leucina. Esto
nos permite seleccionar aquellas células eucariotas que
sí contengan el vector.
En células procariotas el proceso de selección se hace mediante genes de resistencia a los antibióticos.

8
RETROVIRUSES:​

-LTR​:​Long Tandem Repeats. Necesarias para que el genoma del retrovirus se pueda insertar
dentro del genoma de la célula hospedadora.
-Ψ Secuencia necesaria para el empaquetamiento del RNA viral en el virión.
Estas dos secuencias son las secuencias mínimas que se necesitan para insertar el DNA.
-gag​: Antígeno (ag) de grupo procesada para obtener la matriz y otras proteínas retrovirales
del núcleo retroviral.
-pol​: Transcriptasa inversa viral.
-env​: Proteína de envoltorio, determina el tropismo viral.

-Los genes del medio (gag​ /pol/ env), ​son

sustituidos por los genes que nos interesa
expresar. (Vector de sustitución).
Con las secuencia Ψ conseguimos​ que el
constructo se una a partícula vírica.

Se puede hacer por un cultivo celular: Se

mezclan partículas del virus que tengan todo el
constructo (gag​ /pol/ env)​ con el DNA
deseado.

El resultado será una mezcla de partículas

víricas que sí han incorporado el rDNA por el
gen foráneo (gag​/pol/ env) + ​partículas víricas
que no hayan presentado ningún cambio.

3. Preparar el rDNA.
VECTORES DE CLONACIÓN: El​vector es
un portador, una molécula de DNA cuya misión
es unirse con el fragmento de DNA que se
quiere clonar.
Los

vectores de clonación también hay que cortarlos y

se tratan a menudo con el mismo​ enzima de
restricción usado para el DNA a clonar; de ese
modo, sus secuencias complementarias pueden
asociarse y ser unidos por la ligasa, dando lugar a
una sola molécula de DNA bicatenario, que recibe
el nombre de DNA recombinante (rDNA).
Así se consigue que el plásmido tenga dos extremos
que van a tener la misma forma que los dos
9
extremos del ADN que​hemos preparado. Así se consigue la ligación de las dos secuencias.

-Extremo​romo (b): Se puede ligar con cualquier extremo romo. Da cierta libertad a la
hora de usar las enzimas de restricción, se pueden utilizar dos enzimas de restricción
cualesquiera. Sin embargo, la eficiencia de ligación de los extremos romos es menor
que la de los extremos cohesivos.

-Los​extremos cohesivos (a): La complementariedad de bases en los extremos cohesivos

facilita la hibridación de los fragmentos.

-El rendimiento de la reacción no es muy alto.

VECTORES DE EXPRESIÓN:
Se necesitan todos los elementos de
expresión.

Se corta el vector por los sitios de

restricción. Si el vector no tiene sitios de
restricción, se puede unir un Polylinker
(sitios para varios enzimas de restricción)
para que coincidan los sitios de restricción
del vector y el DNA preparado. Mediante la
ligasa se consigue que el gen se integre en el
vector. El gen tiene que estar en un lugar
determinado, entre el sitio de unión al
ribosoma y el terminador.

Inserto de DNA a clonar + Vector → Ligación (ligasa) → Múltiples productos.

Si solo se utiliza un enzima de restricción, los dos extremos del DNA serían iguales y se
podrían hibridar consigo mismo -solo el inserto intra/intermolecular; concatenaciones del
inserto-. Lo mismo puede pasar con el
vector, y que se cierre consigo mismo
-solo vector intra/intermolecular;
concatenaciones del vector-. Si se
consigue ligar el inserto con el vector
se pueden conseguir vectores
recircularizados, otras asociaciones o
el rDNA buscado.

Importante:​ Usando dos enzimas de

restricción distintas podemos orientar
del inserto con respecto al vector. Este
proceso minimiza la producción de los
productos no deseados.

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Para distinguir el rDNA deseado y purificarlo respecto con el resto de productos se puede
usar una electroforesis​.​ Porque sabemos que la concatenación del inserto va a dar
secuencias más pequeñas que el rDNA. Y así mismo la concatenación del vector va a dar
productos más grandes que rDNA. Mediante la electroforesis podemos separar por tamaños
los productos secundarios no deseados y el rDNA buscado.

4.Introducir el rDNA en la célula hospedadora.

● Transformación: Cuando introducimos el DNA en bacterias.​
● Transfección: Cuando introducimos el DNA en eucariotas.​
● Transducción: Cuando introducimos el DNA usando viruses.​

Normalmente nos interesa la célula que tenga solo un vector

➔ Métodos pasivos:
-Liposomas:​Muchos de ellos son artificiales. Algunos son neutrales y otros catiónicos. El hecho de
utilizar liposomas catiónicos​ multilamelares (CLs) es que la ​carga positiva​va a​interactuar con el
DNA (carga negativa) y captura el DNA entre capas de lamelas y las células van a incorporar los
lisosomas con el DNA dentro de la célula.

-Sustancias químicas:​
➢ Ca​2+​ / PEG (polietilenglicol)
➢ Es un método más común.
➢ Para plásmidos pequeños
➢ Para células fáciles de transfectar.

Célula competente: Células que son tratadas para que el DNA

tenga mayor facilidad para entrar.

- CaCl​2 (carga positiva) + DNA = El DNA

precipita en la superficie de la célula, se calienta​
(𝛥​)​la célula para producir pequeños poros en la
membrana y así entre el DNA.

- Ca3(PO4)2 se precipita y la pared celular se

deforma para que se pueda meter con más
facilidad.
Puede que después de precipitar, el DNA sea
fagocitado​por​las células y entren en la célula.

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