Biotecnología Microbiana Microbiología Industrial

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE

INTERÉS INDUSTRIAL

INTRODUCCIÓN

El aislamiento y selección primaria de microorganismos de interés industrial

conjunta las técnicas usuales de aislamiento en microbiología bajo presión de
selección y algún fenómeno visible que corresponda a las características de
producción de microorganismo, de tal forma que el proceso de obtención de
microorganismos se logre en el menor tiempo posible.

El aislamiento y la selección generalmente se inician a partir de un hábitat

natural, pero también puede ser de un programa de selección o de mejoramiento
genético a partir de cepas.

Las técnicas de aislamiento deberán elegirse en función de la naturaleza de

la fuente, tipos de microorganismos deseados, posible densidad o carga microbiana
y disponibilidad de recursos experimentales. Entre las técnicas más usuales se
encuentran las diluciones seriadas y estría cruzada, éstas se utilizan cuando se
considera que la carga microbiana es alta en la fuente de aislamiento. También
puede llevarse a cabo por impronta, que es la aplicación directa y repetida de una
sola muestra de la fuente sobre el medio de cultivo de tal forma que la población
microbiana se va diluyendo en el medio. Esta última se considera apropiada cuando
la fuente de aislamiento pueda tener baja densidad microbiana o poca diversidad
de microorganismos.
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Cuando se intenta obtener microorganismos que degraden sustratos

complejos o de difícil asimilación como polímeros, sustratos poco solubles,
compuestos tóxicos o microorganismos que crecen en condiciones extremas de pH,
temperatura, fuerza iónica, etc., se parte de la premisa que estos microorganismos
se encuentran en menor abundancia en la fuente de aislamiento y se recomienda
un cultivo bajo presión de selección, en el que aumente la población de los
microorganismos de interés, previo al aislamiento en placa, a este cultivo se le
denomina de enriquecimiento.

En el uso del cultivo de enriquecimiento y posteriormente las técnicas de

aislamiento en placa, manteniendo la presión de selección, desplazará o inhibirá el
desarrollo de las poblaciones indeseables, permitiendo la proliferación y detección
de los microorganismos de interés.

La presión de selección implica el manejo de factores ambientales como el

pH, temperatura, fuentes únicas de C o N, presencia de compuestos tóxicos, tensión
de oxígeno, etc., pero para conformar el ambiente selectivo se requiere
predeterminar el proceso al que se dirigirán los microorganismos, además de
conocer las condiciones óptimas generales del desarrollo microbiano específico.

Al mantener la presión de selección en transferencias sucesivas del cultivo a

medios frescos en tiempos relativamente cortos, se espera que los microorganismos
mejor adaptados para desarrollarse presenten una velocidad más alta de
crecimiento y su población aumente considerablemente, desapareciendo las
poblaciones sin interés en los primeros cultivos. Generalmente se prepara una serie
de matraces con medio líquido y en agitación constante para tener muestras
homogéneas, pero no excluye otras variaciones.

Una forma de manejar la presión de selección y la velocidad de crecimiento

en un enriquecimiento puede ser mediante un cultivo continuo, esta técnica puede
ser útil especialmente en la selección de mutantes.
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A pesar de la aplicación de una presión de selección es posible que crezcan

otros microorganismos que no cumplan con las características de producción o
simplemente con el tipo de microorganismo de interés, por lo que se requieren
especificar los criterios de selección primaria para concluir la primera etapa del
aislamiento y selección.

Los criterios de selección primaria son los aspectos como morfología colonial
y microscópica, halos de vire de indicador de pH, halos de hidrólisis de sustratos y
en general de cualquier alteración física o química del medio que implique el
crecimiento de los microorganismos de prueba. En ocasiones sólo el crecimiento de
los microorganismos en medios altamente selectivos o restrictivos constituye el
único criterio de selección primaria.

OBJETIVO

Llevar a cabo el aislamiento y selección primaria a partir de fuentes naturales

de los siguientes microorganismos:

Levaduras para producción de biomasa y/o proteína

Productores de ácidos orgánicos
Degradadores de fenol
Productores de enzimas amilolíticas
Halófilos productores de amilasas y proteasas

MATERIALES Y MÉTODOS

Medios de Cultivo

a) Medio sólido para el crecimiento de levaduras.

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Medio Sabouraud Dextrosa Agar (SDA): bacto peptona 10 g/L, glucosa 40 g/L, agar
20 g/L, pH 5.5.
Criterio de Selección Primaria: morfología colonial y microscópica.

b) Aislamiento de microorganismos productores de ácido orgánicos.

Medio Foster con indicador: glucosa 50 g/L, peptona 5 g/L, KH2PO4 1 g/L,
MgSO47H2O 1 g/L, agar (de ser necesario) 20 g/L, verde de bromocresol 14 mL
(disolver 1 g de bromocresol en 14 mL de NaOH 1 N y aforar a 250 mL con agua
destilada).
Una prueba positiva estará indicada por un vire del indicador (azul-amarillo). Criterio de selección

Medio Foster con carbonato. Composición del medio anterior, sustituyendo el

indicador verde de bromocresol por CaCO3, 1.5 g/L).
Una prueba positiva serán halos de solubilización del carbonato.

c) Enriquecimiento y aislamiento de microorganismos degradadores de fenol.

Medio mínimo mineral con fenol: (NH4)2SO4 0.5 g/L, KH2PO4 0.25 g/L, MgSO4 * 7
H2O 0.075 g/L, CaCl2 0.075 g/L.

Medio sólido para aislamiento (agar con fenol): Sales empleadas en el medio
líquido, adicionado de agar bacteriológico al 2 % y después esterilizado y enfriado
a 45 ºC, se adiciona el fenol (grado reactivo analítico).
El criterio de selección primaria es el crecimiento del microorganismo.

d) Enriquecimiento y aislamiento de microorganismos amilolíticos.

Medio Castañeda – almidón: (NH4)2HC6H5O7 0.625 g/L, NaCl 0.250 g/L, KH2PO4
0.375 g/L, Na2CO3 0.375 g/L, extracto de levadura 0.5 g/L, MgSO47H2O 0.125 g/L,
almidón soluble 10 g/L. El almidón se mezcla en una parte de agua fría y se disuelve
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en agua hirviendo, antes de adicionarlo al resto del volumen en el que se han

solubilizado los minerales. Ajustar pH (6-7). Adicionar agar 20 g/L para medio sólido.
La producción de amilasas se confirma por halos transparentes de hidrólisis o halos
revelados con lugol (ver técnica de revelado).

e) Enriquecimiento y aislamiento de microorganismos halófilos amilolíticos.

Medio líquido para el enriquecimiento. NaCl 81.0 g/L, MgSO4 * 7 H2O 9.7 g/L, MgCl2
7.0 g/L. CaCl2 3.6 g/L, KCl 2.0 g/L, NaHCO3 0.06 g/L. NaBr 0.026 g/L, extracto de
levadura 0.5 g/L, pH 7.3, adicionado con almidón al 2%. El pH se ajusta al preparar
el medio con sales y después se adiciona el almidón. El almidón se mezcla en una
parte de agua fría y después se disuelve en agua hirviendo, antes de adicionarlo al
resto del volumen en el que se han solubilizado los minerales.

Medio sólido para aislamiento: al medio líquido de sales se adiciona agar

bacteriológico al 1.5%, primero se adiciona el almidón y después el agar. Se
esteriliza 15 lb/15 min. La producción de amilasas se confirma por halos
Criterio de selección
transparentes de hidrólisis o halos revelados con lugol (ver técnica de revelado).

Técnica de revelado con lugol. Reactivo de lugol; Yoduro de potasio 2.0 g, yodo
metálico 1.0 g, agua destilada 100 mL. Mezclar el yodo con el yoduro de potasio en
un mortero, triturar hasta obtener un polvo fino, añadir un poco de agua y transferir
a un matraz, adicionar el resto de agua, agitar y mezclar completamente, diluir la
solución de lugol con agua destilada (1:2).

Para llevar a cabo esta prueba es necesario tener un duplicado de sus placas.
Agregar 10 mL de la solución de lugol diluido (1:10) directamente sobre la superficie
del medio sólido con el crecimiento microbiano. Tirar el exceso; la prueba positiva
se observa como zonas claras alrededor de las colonias.
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f) Enriquecimiento y aislamiento de microorganismos halófilos proteolíticos.

Medio líquido para enriquecimiento: NaCl 81.0 g/L, MgSO4 * 7 H2O 9.7 g/L, MgCl2
7.0 g/L. CaCl2 3.6 g/L, KCl 2.0 g/L, NaHCO3 0.06 g/L. NaBr 0.026 g/L, extracto de
levadura 0.5 g/L, pH 7.3 adicionado con Skim-milk 50 g/L. La leche se adiciona a la
base de sales una vez ajustado el pH. Se esteriliza a 7 lb/10 min.

Medio sólido para aislamiento. La leche se adiciona a la base de las sales para
halófilos, ajustando el pH a 7.3 y por separado se prepara el agar. Esterilizar por
separado los componentes en la mitad del volumen de agua cada uno a 7 lb/10 min
la leche y 15 lb/15 min el agar, permitir que se enfríen un poco antes de mezclarlos
para el vaciado en placa.

La actividad proteolítica se detecta por halos claros de hidrólisis.

g) Medios para conservación de cepas.

Levaduras: Agar Dextrosa Sabouraud (SDA)

Hongos filamentosos: Agar Papa Dextrosa (PDA): infusión de papa 15 g/L, bacto
dextrosa 20 g/L, agar 15 g/L, pH 5.
Microorganismos degradadores de fenol, amilolíticos, halófilos amilolíticos y
proteolíticos: tubos con medio sólido empleados durante el aislamiento de los
mismos y en el caso de degradadores de fenol en el frasco con medio líquido.
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DESARROLLO EXPERIMENTAL

Aislamiento y selección por técnicas directas

1. Elección de fuentes de aislamiento.

Dependiendo del tipo de microorganismo de interés se debe elegir una fuente

natural adecuada, considerar el tipo de sustratos disponibles y las condiciones en
las que se encuentra, las cuales deben corresponder a las condiciones de desarrollo
microbiano, pero existen hábitats generales como el suelo y aguas residuales en
donde la diversidad y abundancia de microorganismos puede ser mayor.
Las muestras se deben colectar de forma aséptica, tanto en manejo de
utensilios como recipientes con tapón de algodón o malla. A continuación, se
muestran algunos ejemplos de diferentes fuentes de aislamiento:

a) Levaduras: frutos, hojas tiernas, néctar de flores, agua corriente,

alimentos y bebidas tradicionales.
b) Productores de ácidos orgánicos: diferentes tipos de suelo, tortilla, pan
o frutos con aparente crecimiento de hongos.
c) Productores de enzimas: Considerar la actividad enzimática y posible
hábitat natural.
d) Degradadores de hidrocarburos: Suelos de terrenos aledaños a pozos
petroleros o refinerías de petróleo, y aguas contaminadas con
compuestos aromáticos (fenol, tolueno, antraceno, etc.).
e) Microorganismos halófilos. Suelo o sedimento de zonas que hayan sido
lagos con altas concentraciones de sales, como el exlago de Texcoco;
alimentos conservados en sal como pescado, mariscos, verduras, etc.
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2. Acondicionamiento de fuentes de aislamiento

Dependiendo del estado de la fuente y el tipo de microorganismo por aislar se

determina el acondicionamiento de la muestra antes del aislamiento. Este
acondicionamiento puede ser las condiciones de incubación (aerobiosis o
anaerobiosis), temperatura, secado a temperatura ambiente (recomendable para
muestras de suelo y aislamiento de hongos), mantenimiento con humedad (agua
estéril directa a la muestra), refrigeración, choque térmico (para microorganismo
esporulados), etc.

3. Elección de técnica de aislamiento

Diluciones: Las diluciones decimales se recomiendan para muestras con alta carga
microbiana, principalmente en muestras de suelo; y en este caso puede emplearse
esta técnica para el aislamiento de microorganismos productores de ácidos
orgánicos. Lo recomendable es utilizar las diluciones altas para el aislamiento de
bacterias, las diluciones intermedias se usan frecuentemente para aislar levaduras
y las diluciones más bajas para el aislamiento de hongos. De la dilución
seleccionada se toma una alícuota de 0.1 mL y se coloca sobre el medio sólido, se
distribuye sobre la superficie de manera homogénea empleando una varilla acodada
o perlas de vidrio estériles con suaves movimientos rotatorios. Permitir la absorción
de agua antes de voltear las cajas para su incubación.

Estría Cruzada. Para cualquier tipo de fuente húmeda o líquida, excepto suelo. La
muestra para aislamiento tomada directamente con el asa se aplica al medio y se
realiza estría cruzada. Esta técnica se recomienda para el aislamiento de levaduras.

Impronta. Utilizar como impronta la fuente de aislamiento cuando se trate de hojas

tiernas o néctar de flores para el aislamiento de levaduras y en el caso de
productores de ácidos orgánicos a partir de suelo, la impronta será un cilindro de
material poroso ligeramente humedecido con agua o solución salina estéril. En
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cualquier caso con una sola toma de muestra sembrar de 3 a 6 placas con 6 o 7
aplicaciones por placa, de tal forma que la población disminuya en las últimas placas
y se puedan lograr colonias aisladas.

En el caso de fuentes líquidas con baja carga microbiana se recomienda concentrar

los sólidos en suspensión por sedimentación y de esta zona tomar las muestras,
también se pueden concentrar los sólidos filtrando al vacío en membrana de nylon
o acetato de celulosa de 0.45 µm de poro y colocar membrana directamente sobre
las placas.

Selección por cultivo de enriquecimiento previo al aislamiento

Este medio de selección de microorganismo se inicia con la elección de la fuente

y/o el acondicionamiento de la muestra.

En el primer frasco serológico de una serie de 3 con medio líquido selectivo se

adiciona una fracción de 0.5 – 1.0 g de la fuente de aislamiento; si es necesario,
homogenizarla previamente. Incubar el frasco serológico a 28 o 37ºC en agitación
durante 72 h. Transcurrido el tiempo transferir el primer cultivo (2 mL) al segundo
frasco serológico e incubar bajo las mismas condiciones que el anterior, pero
reduciendo el tiempo de incubación a 48 h, y finalmente repetir el procedimiento
para el tercer frasco serológico, ahora con una incubación de 24 h. A partir del último
frasco serológico sembrar por estría cruzada placas con el mismo tipo de medio e
incubar en condiciones ambientales semejantes, observar cada 24 h hasta
desarrollo y manifestación de la producción esperada, siguiendo los criterios de
selección primaria. Estos cultivos de enriquecimiento se emplean para el
aislamiento de microorganismos halófilos productores de amilasas y proteasas.

En el caso de enriquecimiento para el aislamiento de microorganismos

degradadores de fenol se utilizará un frasco serológico para depositar la muestra y
se permitirá el desarrollo durante 7 días a 28 ºC en condiciones aerobias sin
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transferencias. Se considera como prueba positiva la observación de

microorganismos al microscopio. Se siembra una placa con medio sólido de la
misma composición, dejando incubar por 48 h y si el crecimiento es distinguible y
predominante por algún microorganismo se procede a resembrar nuevamente en
placa para purificación. El microorganismo se inocula un segundo frasco que servirá
como inóculo para la selección secundaria. Si de la observación en placa resulta
una población escasa, se inoculará el segundo frasco con 2 mL del primer cultivo,
considerando que podría tratarse de un consorcio. Se incuba en las mismas
condiciones, confirmando desarrollo microbiano y reservarlo para la práctica de
selección secundaria.
Los tiempos de incubación pueden modificarse, dependiendo de la dificultad que
exista para utilizar las fuentes de carbono.

Purificación de aislados

En subsecuentes resiembras por estría cruzada para bacterias y levaduras,

y por picadura para hongos, se debe purificar lo aislados que cumplan con las
características de producción, verificando la pureza por morfología colonial y
microscópica, utilizando los medios adecuados para cada microorganismo.

Conservación de los aislados

Los aislados puros se siembran en tubos con agar inclinado de acuerdo al

medio específico de cada microorganismo. Las bacterias y levaduras se siembran
por estría y se incuban a 28ºC durante 24 h; los hongos se siembran por picadura,
se incuban a 28ºC durante 72 a 96 h.

Entrega de aislados microbianos

Etiquetar los tubos que contienen los aislados y cultivos en frascos

serológicos para el caso de los microorganismos degradadores de fenol, con los
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siguientes datos: microorganismo, características relevantes, fuente de aislamiento,

temperatura de incubación, equipo, grupo y fecha.

REGISTRO DE RESULTADOS EN EL MANUAL

Desarrollar diagramas de flujo de cada tipo de aislamiento realizado a partir

de la elección de la fuente de aislamiento manteniendo el orden cronológico,
registrar condiciones de incubación y microorganismos obtenidos.

Elaborar un cuadro con el resumen de los resultados obtenidos mencionando

la fuente natural de aislamiento, técnica empleada, medios empleados, criterios de
selección primaria, presión de selección y características de los microorganismos
aislados.

INFORME
El informe constará de los siguientes puntos:

i. Resultados (colocar detalladamente sus resultados)

ii. Discusión y conclusión
iii. Referencias (anexando una copia de alguno de los artículos utilizados como
referencia para su reporte)
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BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

Demain A. L. (1986). Manual of Microbiology and Biotechnology. Ed. ASM

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Panchal C.J. (1990). Yeast strain selection. Ed. Marcel, NY.
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