Extracción y Cuantificación de Proteínas

Bioquímica. Universidad Tecnológica de Pereira.
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS
Brigith Cardona Restrepo, Alejandra Chávez Marín
Escuela de Química, Universidad Tecnológica de Pereira, Pereira, Colombia
Correo-e: [email protected], [email protected]
I. INTRODUCCIÓN
Las proteínas son moléculas orgánicas y se encuentran en gran abundancia en la célula, constituyendo
más del 50% del peso seco de la célula, siendo la composición proteica quien da la especificidad de
cada célula. Las proteínas cuentan con la posibilidad de tener alrededor de 20 aminoácidos diferentes
en su estructura los cuales pueden estar unidos en cualquier orden, de allí nace la gran cantidad de
variantes en su conformación. Por otra parte, la composición varía según el organismo del cual se
trate; es decir, una bacteria puede tener cerca de 1.000 proteínas diferentes, en una célula humana
pueden haber más de 10.000 clases de proteínas distintas. Dicha composición dependerá del conjunto
de genes que se estén activando y se relaciona de manera directa con las señales que recibe la célula;
es decir, el patrón proteico de una célula vegetal será distinto al de una célula animal. [1]
La extracción y cuantificación de una proteína se basa en las propiedades de la estructura proteica,

como la capacidad de reducir algunos iones, propiedades de enlace peptídico o el contenido de algún
aminoácido en particular; a partir de estos datos, se puede reducir la cantidad total de proteína
presente en la muestra. A lo largo de la historia se han desarrollado diferentes métodos para la
cuantificación de la proteína con el fin de conocer la actividad específica de una preparación
enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, entre otras. [2]
Uno de los métodos tradicionales para llevarse a cabo la cuantificación de una proteína es el ensayo
de Bradford, el cual se basa en la formación de un complejo entre el colorante azul brillante de
Coomassie G-250 y las proteínas en solución (ver figura 1). Para ello el colorante existe en cuatro
formas iónicas; la forma azul más aniónica se une a la proteína y absorbe a 590nm. Para determinar la
concentración de proteínas se puede realizar una evaluación mediante la determinación de la cantidad
de colorante en su forma iónica azul y midiéndose así la absorbancia de la solución a 595nm, el
colorante se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina. [3]
Figura 1. Representación esquemática del ensayo de Bradford. [3]
II. ANÁLISIS Y RESULTADOS
Para la experimentación se realizó la extracción de la proteína a partir de material vegetal, tejido

animal y un cultivo de bacterias. Posteriormente se realizó la cuantificación mediante el método de
Bradford realizándose una correspondiente curva de calibración y midiéndose mediante un
espectrofotómetro a 595nm.
Proteína a partir de material vegetal.

Las proteínas de origen vegetal son consideradas de bajo valor biológico puesto que son limitantes en
alguno de los nueve aminoácidos esenciales. Inicialmente se tomó una cantidad de espinaca al cual se
le adicionó buffer de extracción y arena para aumentar el contacto, posteriormente se somete a
centrifugación y se somete a frío para garantizar la conservación de la proteína. Se procedió de igual

forma para el blanco de la muestra.
Proteína a partir de tejido animal.

Las proteínas de origen animal son moléculas de gran tamaño y complejas puesto que estas contienen
mayor cantidad y diversidad de aminoácidos. Para el procedimiento experimental se tomó una
cantidad de tejido animal (hígado) al cual se le agrega buffer RIPA en frío, se trató de homogeneizar y
se sometió a centrifugación finalmente se somete a frío para llevar a cabo la conservación de la
proteína. Se procedió de la misma manera para el blanco de la muestra.
Proteína a través de cultivos de bacterias.

Se tomó una cantidad de cultivos de bacterias el cual se sometió a centrifugación durante 3minutos,
luego se tomó la misma cantidad de cultivo con la finalidad de duplicar el material de interés, se
adicionó buffer RIPA y posteriormente se sometió la muestra a sonicación con la finalidad de agitar
las partículas, se somete a centrifugación durante 15minutos y finalmente se conserva en frío para
conservar la proteína. De igual forma se realiza el procedimiento para el blanco de la muestra.
Cuantificación por el método de Bradford.

La cuantificación se realizó mediante una curva de calibración la cual se puede observar en la tabla 1
y la figura 2, para ello se midió la absorbancia de cada uno de los patrones a 595nm en un
espectrofotómetro.
Tabla 1. Curva de calibración cuantificación de proteínas.

Concentració Absorbanci
n [mg/mL] a
0,03 0,208
0,06 0,214
0,1 0,223
0,16 0,262
0,2 0,271
Curva de calibració n, cuantificació n de proteíinas.

0.3
0.25 f(x) = 0.4 x + 0.19
R² = 0.96
Absorbancia
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22
Concentració n [mg/mL]
Figura 2. Curva de calibración cuantificación de proteínas.
Cada una de las muestras tenía su blanco respectivo, se les adicionó reactivo de Bradford que se
encontraba previamente diluido a las muestras y cada blanco se deja en ausencia de dicho reactivo.
Posteriormente, se midió la absorbancia en el espectrofotómetro a 595nm, los resultados obtenidos se
encuentran en la tabla 2.
Tabla 2. Lectura en espectrofotómetro para muestras de proteínas.

Absorbancia
Fuente proteica Blanco Muestra Valor resultante
Material Vegetal 0,061 0,269 0,208
Material Animal 0,206 0,469 0,263
Cultivo de Bacterias 0,118 0,371 0,253
Teniéndose en cuenta la curva de calibración, se pude obtener la concentración de proteína en cada

una de las muestras, tomándose la ecuación de dicha curva:
A=0,4041 [ concentración ] + 0,1912
En donde se despeja la concentración:
A−0,1912
[ Concentración ] =
0,4041
Se reemplaza el valor resultante de cada una de las muestras, en este caso para el cultivo de bacterias:
[ Concentración ] = 0,253−0,1912 =0,1529 mg

0,4041 mL
De igual forma se realiza el procedimiento para cada una de las muestras, los resultados obtenidos se
registran en la tabla 3.
Tabla 3. Concentración resultante de las muestras proteicas.

Absorbanci Concentració
Fuente proteica
a n [mg/mL]
Material Vegetal 0,208 0,0415
Material Animal 0,263 0,1777
Cultivo de
0,253 0,1529
Bacterias
El método de Bradford es una técnica colorimétrica, que tiene como características la sensibilidad,
rapidez y economía para la cuantificación de proteínas. [4] La reacción evidenciada durante el proceso
se puede observar en la figura 3.
Figura 3. Reacción cuantificación de proteínas método Bradford. [5]

La formación del complejo coloreado se puede asociar a la presencia de ciertos aminoácidos básicos
(principalmente la arginina, lisina e histidina) presentes en la proteína analizada. El número de
ligandos del colorante que se une a cada molécula de proteína es aproximadamente proporcional a la
cantidad de cargas encontradas en la proteína.
III. CUESTIONARIO
a) ¿Cuáles son los principales métodos que se utilizan para purificar proteínas a nivel
industrial?
La purificación de proteínas implica aislarlas a partir de una fuente en base a diferentes propiedades
físicas. En la industria los principales métodos que se emplean para la purificación de las proteínas
son: solubilidad diferencial, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de absorción,
cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de afinidad, electroforesis, isoelectroenfoque,
entre otras. [6]
Para el proceso de purificación es recomendable empezar por técnicas de alta capacidad y seguir con
técnicas de baja capacidad ya que se desea obtener una gran pureza junto con un gran rendimiento.
b) Describa el procedimiento que aplicaría para purificar las proteínas de la espinaca

teniendo en cuenta los elementos que dispone en la escuela de química.
Para obtener la purificación de la proteína de la espinaca se hace un ensayo específico, sensible y

rápido para identificar la proteína, luego se realiza una extracción de la proteína, pero se bebe hacer
una estabilización de la molécula para llevar a cabo este procedimiento y tener la concentración final
para poder determinar la pureza y la calidad del producto.
El primer paso es la liberación de la proteína y se hace una homogeneización del tejido en un tampón
de extracción adecuado (este tampón estabiliza la proteína y evita la acción de las proteasas) para la
proteína de la espinaca. Las proteínas hidrosolubles pueden ser separadas de las proteínas liposolubles
mediante centrifugación. Estas proteínas asociadas a la membrana pueden liberarse mediante el
empleo de fosfatasas como se observa en la figura 1. o por alguna técnica cromatográfica y para hacer
una identificación se utiliza métodos como el análisis por mRNA como también un análisis peptídico
por MALDI-TOF. [7]
Figura 4. Purificación de proteínas asociadas a membrana.
BIBLIOGRAFÍA
[1] Quilmes, U. N. de. (2008). TP2: Extracción y cuantificación de proteínas. Manual de Prácticas:
Introducción a La Biología Celular y Molecular, 1–5. Retrieved from
http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf
[2] Hernández, A. G. (2017). Tratado de nutrición. Madrid: Panamericana. 3.a. Edición.

[3] Carbajal, A. (2020). CuantificaciÃ³n de proteÃnas. Retrieved 17 March 2020, from

http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html
[4] Cuantificación Proteínas, B. DE, Cabra, T., Rubiano, P., & Constanza, C. (2013). TOTAL
PROTEIN OF CRUDE EXTRACTS AND QUANTIFICATION THE NATIVE Bacillus
thuringiensis STRAINS ISOLATED FROM BOYACÁ AND CUNDINAMARCA. 3(2), 37–43.
[5] García, S. (2010). Informe sobre la cuantificación de proteínas totales en hemolinfa de abejas
melíferas (Apis Mellífera L) en época invernal. 19.
[6] Donald Voet, J. G. (2006). Bioquímica. Argentina: Panamericana. 3.a.Edición.
[7] Pratt, C.W. (2012). Bioquímica esencial. EE. UU: Manual moderno. 2.a.Edición.

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La extracción y cuantificación de una proteína se basa en las propiedades de la estructura proteica,

Figura 1. Representación esquemática del ensayo de Bradford. [3]

II. ANÁLISIS Y RESULTADOS

Para la experimentación se realizó la extracción de la proteína a partir de material vegetal, tejido

Proteína a partir de material vegetal.

centrifugación y se somete a frío para garantizar la conservación de la proteína. Se procedió de igual

Proteína a partir de tejido animal.

Proteína a través de cultivos de bacterias.

Cuantificación por el método de Bradford.

Tabla 1. Curva de calibración cuantificación de proteínas.

Curva de calibració n, cuantificació n de proteíinas.

Figura 2. Curva de calibración cuantificación de proteínas.

Tabla 2. Lectura en espectrofotómetro para muestras de proteínas.

Teniéndose en cuenta la curva de calibración, se pude obtener la concentración de proteína en cada

A=0,4041 [ concentración ] + 0,1912

En donde se despeja la concentración:

[ Concentración ] = 0,253−0,1912 =0,1529 mg

Tabla 3. Concentración resultante de las muestras proteicas.

Figura 3. Reacción cuantificación de proteínas método Bradford. [5]

b) Describa el procedimiento que aplicaría para purificar las proteínas de la espinaca

Para obtener la purificación de la proteína de la espinaca se hace un ensayo específico, sensible y

Figura 4. Purificación de proteínas asociadas a membrana.

[2] Hernández, A. G. (2017). Tratado de nutrición. Madrid: Panamericana. 3.a. Edición.

[3] Carbajal, A. (2020). CuantificaciÃ³n de proteÃnas. Retrieved 17 March 2020, from

[6] Donald Voet, J. G. (2006). Bioquímica. Argentina: Panamericana. 3.a.Edición.

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