Manual de Procedimientos Laboratorio de Microbiologia Hospital Del Nio Peru

PERU Ministerio stituto Nacional de
de Salud alud dc! Niño • Breña "AÑO DE LA CONSOLIDADCION DEL MAR DE GRAU"
-2016-INSN-DG
RESOLUCIÓN DIRECTORAL
Lima, i de »o del 2016
Visto el Expediente con Registro DG Nº 23770-2015 y el Memorando Nº 213-SM-DIDAP-INSN-2015 de

fecha 26 de Mayo del año 2015; por el cual hace llegar el Manual de Procesos y Procedimientos Del
Servicio de Microbiología, remitido por el Departamento de Investigación, Docencia y Atención en
Patología; y solicita su aprobación mediante Resolución Directoral correspondiente;
CONSIDERANDO:
ue, la Ley Nº 26842 Ley General de Salud, establece que la protección de la salud es de interés público y
or tanto, es responsabilidad del Estado regularla, vigilarla y promoverla;
ue, con Memorando Nº 2194-OGC-INSN-2015, la Directora de la Oficina de Gestión de la Calidad, hace

llegar a la Dirección General del Instituto Nacional de Salud del Niño, el Manual de Procesos y
Procedimientos Del Servicio de Microbiología elaborado por el Servicio de Microbiología del
Departamento de Investigación; Docencia y Atención en Patología, contando con opinión favorable de la
Comité de Infecciones Intrahospitalarias con Memorando N°007-CII-INSN-2015,0ficina de Gestión de la
Calidad, para su opinión y aprobación con Resolución Directoral;
En uso de las atribuciones conferidas en el Manual de Organización y Funciones aprobadas por Resolución
Directoral Nº 041-DG-INSN-2011;
Con la visación de la Dirección Adjunta con Memorando N°675-DA-INSN-2015, Dirección de Ejecutiva de

Investigación Docencia y Apoyo al Diagnóstico y Tratamiento con Memorando N° 409-DEIDAT-2015,
Departamento de Investigación Docencia y Atención en Patología; Oficina de Gestión de la Calidad y la
Oficina de Asesoría Jurídica del Instituto Nacional de Salud del Niño;
De conformidad con los dispuesto por la Resolución Ministerial Nº 826-2005/MINSA y Leyes N.2. 26842 y
27657;
SE RESUELVE:
Artículo Primero.- Aprobar el Manual de Procesos y Procedimientos del Servicio de Microbiología, que
---'''- :- consta de 207 folios (CCVII) presentado por Departamento de Investigación Docencia y Atención en
e,9.:., \, , Patología del Instituto Nacional de Salud del Niño.
1
.3.. . \
:i-l-jIrtículo Segundo.- El Manual aprobado será publicado en la página Web del Instituto Nacional de Salud
, ;del Niño.
Regístrese y Comuníquese.
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DISTRIBUCIÓN: LFONSO JU BZLITIVZ
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Ministerio de Salud WM0~ SAUD al MCI
Pt.i5On7;a:¿,.tencfriaus Nonas
Depar .mento de
Manual de Procedimientos 101111~11
Versión N° 1
Investigación, Docencia
y Atención en Patología Técnicos del Servicio de
Servicio de
Microbiología Microbiología Página 1
" Año de la consolidación del Mar de Grau"
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DEL NIÑO
MANUAL DE PROCEDLMIENTOS
TÉCNICOS DEL SERVICIO DE
MICROBIOLOGÍA
JEFE DE SERVICIO: DRA. LILIAN PATIÑO GABRIEL
EQUIPO DE TRABAJO:
Bustamante Gonzales, Daniel

Carboneli Peraldo, Ivonne de María
Cruzado Risso, Norka Beatriz
Díaz Noche Maribel Roxana
Gonzáles Escalante, Edgar
Quispe Manco, María del Carmen
Rojas León, Roberto Eugenio
Vicuña Osorio, Raúl Honorio
MARZO, 2016
1
•
IMITO WALL U' SAIMI DE, 1'!1;
Nljtd9rrio de Salud
Manual de Procedimientos
ugei:denu, oco.orsa,
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
INDICE
PAGINA
1. PROCESO ANALITICO DEL EXAMEN DIRECTO

3
2. PROCESO ANALITICO DE COLORACION GRAM
7
3. PROCESO ANALITICO DEL CULTIVO MICROBIOLOGICO
11
4. PROCESO ANALITICO DEL CULTIVO DE ORINA
15
5. PROCESO ANALITICO DEL EXAMEN PARASITOLOGICO
40
6. PROCESO ANALITICO DEL EXAMEN COPROFUNCIONAL
55
7. PROCESO ANALITICO DEL METODO DE CONCENTRACION
64
8. CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO
71
9. CONTROL DE CALIDAD DE ANTIBIOGRAMA 89
10. PROCESO ANALITICO DEL CULTIVO DE HECES 106
1. PROCESO ANALITICO DEL HEMOCULTIVO 122

12. PROCESO ANALITICO DE MICOLOGIA 129
13. PROCESO ANALITICO DEL METODO INMUNOENSAYO INDIRECTO
175
14. PROCESO ANALITICO DE QUIMIOLUMISCENCIA 183
15. PROCESO ANALÍTICO DE DETECCIÓN DE PATOGENOS
RESPIRATORIOS POR INMUNOFLUORESCENCIA 187

16. PCR EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS. 195
2
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Departamento de
Investigación, Docencia Versión N° 1
Laboratorio de
PROCESO ANALÍTICO DE CODIGO: PRT-DIDAP-001

EXAMEN DIRECTO
N° DE FOLIOS: 4
ELABORADO POR: JEFE DE SERVICIO: Revisado por

LIC. TM NORKA CRUZADO RISS() DRA. LILIAN PATIÑO GABRIEL
LIC TM DANIEL BUSTAMANTE GONZALES
LIC.TM MAR' X DEL CARMEN QUISPE MANCO
LIC TM RO:,ERTO ROJAS LEON
Tecnólogo Médico
Jefe de Servicio de Microbiología
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Departr. nento de
Versión N° 1
Investigl.ion, Docencia
Laboratorio de
NOMBRE DEL FECHA:

PROCEDIMIENTO EXAMEN DIRECTO
CODIGO: PRT-DIDAP-001
PROPÓSITO Realizar el procedimiento de Examen Directo
Debe ser cumplido por el personal Tecnólogo Médico del Servicio de Microbiología
ALCANCE del INSN
Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud. Reglamento DS 013-

MARCO LEGAL 2012 AS
INDICES DE PERFORMANCE
UNIDAD DE
INDICADOR FUENTE RESPONSABLE
MEDIDA
1. % de veracidad de 1.- N° de
1.Registro de resolución de 1.Tecnólogos
resultados resultados vs el N°
alarmas Médicos del área
de alarmas
2. Frecuencia de 2- Registro de resultado de
2- 70 de resultados 2- Tecnólogo Medico
resultados de pánico pánico del área.
de pánico
NORMAS
1. Reglamento de organización y funciones del INSN.RMN 566-2003 AS/DM y sus modificaciones

2. Manual de Organización y funciones del departamento de Investigación y Docencia y Atención en
Patología RD N° 581-DG-IESN-2004
3. Resolución Ministerial N° 526-2011/MINSA, aprueba la Norma para la elaboración
de documentos normativos del Ministerio de salud.
4. IS015189-2003 Medical Laboratory ,particular requirements for quality and competence
e
•
Wilisierio de halo(' lijada/ DI SlIZ
orfNona,
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
INICIO: muestra condiciones adecuadas para el examen directo
FIN: reporte de resultado analítico validado
LISTA DE PROCEDIMIENTOS:
1- Muestra identificada para el procesamiento

2- Procesamiento del examen directo
'1- Registro de resultados
4- Si hay alarmas guiarse de la guía de resolución de alarmas
5- Pasar alerta de pánico y resolver con guía de resolución de pánico.
6- Reportar resultado de análisis validado.
ENTRADAS
NOMBRE FUENTE FRECUENCIA TIPO
Control de Análisis CPA Diaria Proceso analítico

Previos (CPA)
SALIDAS
NOMBRE DESTINO FRECUENCIA TIPO
Reporte de Resultado Historia clínica Diaria Proceso analítico

analítico validado por
TM
ANEXOS 1:
a• FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE EXAMEN DIRECTO

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
anical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology

• a_1111.1
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Mialslerlo de Salud
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXOS 1 : FLUJOGRAMA DE EXAMEN DIRECTO
INICIO CPA
CONFORME
EVALUACION DE CRITERIO
• PARA UNA MUESTA
NO POE DE
RECHAZO
SI
REGISTRO DE DATOS
SI
Procesamiento
•
GUÍA DE
SI
RESOLUCIÓN DE
ALARMAS
•
IISAU,-DI
F
'111110(410 ch.
Departamento de
Versión N° 1
Investigaci5n, Docencia
y AtenciC ,1 en Patología Técnicos del Servicio de
Laboratorio de
PROCESO ANALITICO DE CODIGO: PRT-DIDAP-002

COLORACION GRAM
N° DE FOLIOS: 4
ELABORADO POR: JEFE DE SERVICIO: Revisado por:

LIC.TM NORKA CRUZADO RISSO DRA. LILIAN PATINO GABRIEL
LIC.TM MARIA DEL CARMEN QUISPE MANCO
LIC TM ROBERTO ROJAS LEON
Tecnólogo Médico
Olk
11111.1
111ilistr1.io de Salud ILICOUAL 1.0.10 Dit 1:10
Departamento de
Manual de Procedimientos Traln10114

Laboratorio de
NOMBRE DEL FECHA: 22/3/2016

PROCEDIMIENTO COLORACION GRAM
PROPÓSITO Realizar el procedimiento de coloración Gram
ALCANCE del INSN

MARCO LEGAL 2012 AS
INDICADOR UNIDAD DE
MEDIDA FUENTE RESPONSABLE
1.- N° de
1.% de veracidad de 1.Registro de resolución de
resultados vs el N° 1.Tecnólogos
resultados alarmas
de alarmas Médicos del área
2.Frecuencia de
2- % de resultados 2- Registro de resultado de 2- Tecnólogo Médico
resultados de pánico pánico
de pánico del área.
NORMAS
r-atologia RD N° 581-DG-IESN-2004
e
•
ISTRITO MEV& PE 91.1%) Dit
yholsrerio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
INICIO: muestra condiciones adecuadas para la coloración
1. Muestra identificada para el procesamiento

2. Procesamiento de la coloración
3. Registro de resultados
4. Si hay alarmas guiarse de la guía de resolución de alarmas
5. Pasar alerta de pánico y resolver con guía de resolución de pánico.
6. Reportar resultado de análisis validado.
ENTRADAS
Previos (CPA)
SALIDAS
TM
ANEXOS:
b. FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE COLORACIONES

Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology,2010

•
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Manual de Procedimientos Tm:~■
NiZO
Departamento de
investiga-,ión, Docencia Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXOS:
FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE COLORACIONES
[ Inicio . CPA conforme
Procesamiento
• Registro de
resultados
SI
Guía de resolución
de alarmas
SI
FIN - Resultado
analítico Validado
•
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linislerin de Salud
orr,ona, nosirwits
Departamento de
Laboratorio de
CULTIVO MICROBIOLOGICO
N° DE FOLIOS: 4

LIC.TM NORKA CRUZADO RISSO DRA. LILIAN PATIÑO GABRIEL
LIC.TM MARIA DEL CARMEN QUISPE MANCO
Tecnólogo Médico
•
O'N
Ministerio de Salud
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de

Cultivo Microbiológico
PROCEDIMIENTO CODIGO: PRT-DIDAP-003
PF1(57
D )SITO Realizar el procedimiento de Cultivo Microbiológico
ALCANCE Debe ser cumplido por el personal Tecnólogo Médico del Servicio de Microbiología del INSN
Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud. Reglamento DS 013-2012 AS

MARCO LEGAL
UNIDAD DE
MEDIDA
1.- N° de
1.-Porcentaje de
veracidai interpretaciones
de 1-Registro de revisión de 1-Tecnólogos
versus N°
interpretación. limitación de procedimiento Médicos del área
limitaciones del
2- Frecuencia de procedimiento.
2- Registro de resultado de 2- Tecnólogo Médico
resultados de panico
2- % de resultados del área.
pánico
de pánico
NORMAS

3. Resolución Ministerial N° 526-2011/MINSA, aprueba la Norma para la elaboración de
documentos normativos del Ministerio de salud.
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Depaitmento de
Versión N° 1
Laboratorio de
INICIO muestra en condiciones adecuadas para el cultivo
FIN reporte de resultado analítico validado
1. Muestra adecuada para cultivo

2. Proceso de Examen Directo, Detección de antibióticos, Coloración Gram y Cultivo de la muestra
de acuerdo a sus respectivos PRT-DIDAP (001,002,003)
3. Se sigue con el procedimiento manual o automatizado para identificar y realizar la susceptibilidad
antibiótica
4. Se registran los resultados
5. Se procede a la interpretación según PRT-DIDAP-004
6. Si existe una disconformidad proceder con la Limitaciones del Procedimiento
7. Si existe una Acción de pánico proceder según guía de Resolución de pánico
8. Informe de resultado analítico validado por Tecnólogo Medico.
ENTRADAS
Control de Análisis • CPA Diaria Proceso analítico

Previos. (CPA)
SALIDAS
analítico validado
ANEXOS:
c. FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE CULTIVO

Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology,2010.

•
Departamento de
y Atención en Patología
Técnicos del Servicio de
Laboratorio de
Microbiología Microbiología
ANEXOS: FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE CULTIVO
Inicio CPA CO:\TORME

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bete‹ción Examen
Dilecto
Cultivo
G
PRT-D1DAP-009 PRT-
T- D1DA
DIDAP-001
D1DAP
P-003
vv2
• Automatizado
11.111,1
Proceso
automatizado
4111.••
Registro de Datos
Revisar las Limitaciones de

PRT-DIDAP-004
Revisar Quja de acciones

Accrones de Ink.O.
Pánko
w
Resultado Anal tico vaIrdado por
Tm
14
•
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llit!isterio «le Salud
r.^....egzOnlos o. r,,,s
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
CULTIVO DE ORINA
N° DE FOLIOS: 25
ELABORADO POR: JEFE DE SERVICIO: APROBADO POR:

LIC.TM MARTA DEL CARMEN QUISPE MANCO DRA. LILIAN PATINO GABRIEL
FIRMA:
FECHA:
Tecnólogo Médico
•
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Iliplsitrrio de
loinnirgoor
01,1,91145
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de

PROCEDIMIENTO Cultivo de Orina
PROPÓSITO Realizar el procedimiento de Cultivo de orina

MARCO LEGAL 2012 AS
UNIDAD DE
INDICADOR FUENTE
MEDIDA RESPONSABLE
1.- N° de
1.-Porcentaje de
veracidad interpretaciones
de 1-Registro de revisión de 1-Tecnólogos
versus N°
interpretación. limitación de procedimiento
limitaciones del Médicos del área
2- Frecuencia de 2- Registro de resultado de
procedimiento. 2- Tecnólogo Medico
panico
de panico
NORMAS


10. Proceso de Examen Directo, Detección de antibióticos, Coloración Gram y Cultivo de la muestra de
acuerdo a sus respectivos PRT-DIDAP( 001,002,003)
antibiótica
13. Se procede a la interpretación
16. Informe de resultado analítico validado por Tecnólogo Médico.
•
IUDOW. 1E 311U0 on k1.10
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Microbiologia Microbiología Página 17
ENTRADAS
Previos (CPA)
SALIDAS
analítico validado
ANEXOS:
ANEXO I DETERMINACIÓN DE SUSTANCIAS ANTIBACTERIANAS RESIDUALES EN ORINA

ANEXO 2 USO Y CALIBRACION DE ASAS MICROBIOLOGICAS
ANEXO 3 FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE CULTIVO
•
•
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Departamento de
Laboratorio de
FASE ANALITICA
MATERIALES
✓ Medios de cultivo
✓Agar Sangre
vAgar MacConkey
,
/Agar chocolate: empleado para muestras de orina de riñón o muestras colectadas
quirúrgicamente por cistoscopia.
v Medios cromogénicos para urocultivo que permite la detección rápida de los
uropatógenos más comunes, a su vez infecciones mixtas y hongos.
✓ Coloración de Gram
( Referido al Manual de Preparación de Medios de Cultivo y Tinciones)
/Cristal violeta
✓Lugol de Gram
v Alcohol acetona
vSafranina
✓ Suministros
v Método del asa:
Use asas de nicrom o de plástico descartables estériles.
Tamaños
Asa de 1 pl para detección de recuento de colonias mayores de 1,000 UFC/ml.
Asa de 10 pl para la detección de recuento de colonias entre 100 y 1,000
UFC/ml.
v Método de la micropipeta
✓ Usar una micropipeta calibrada de 1 a 10 pL
✓ Puntas de pipetas estériles
Comentario. Se recomienda utilizar micropipetas diferentes
para cada volumen, porque ir de un extremo al otro del rango,
tiende a descalibrar el instrumento.
PROCEDIMIENTO
v Métodos microscópicos y otros métodos directos

El laboratorio debe determinar cuál es el mejor método para la detección
de piuria, de acuerdo a la población que atiende y para lo cual se tiene
los varios procedimientos. La presencia de muchas células epiteliales
escamosas y diferentes morfotipos microbianos sugieren contaminación.
18
•
Milkierio de Salud "MIC VÁCUM 151.11)
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Departamento de
Laboratorio de
✓ Examen directo
✓ Colocar 10 pl de orina bien mezclada sin centrifugar
sobre una lámina portaobjetos, colocar un cubreobjetos y
observar a 400x
✓ La presencia de más de 5 leucocitos por campo es
considerado como indicativo de piuria.
Nota: este resultado tiene una especificidad de 90% para
predecir una infección urinaria asociada a catéter con
más de 105 UFC/mL, pero una sensibilidad de solo 37%.
✓Coloración de Gram:
✓ Colocar 10 pl de orina bien mezclada sin centrifugar
sobre una lámina portaobjetos, y deje que se seque al
aire sin extenderla.
✓ Determinar el número de organismos por campo de
aceite de inmersión. Un organismo observado a 1,000x
correlaciona con un recuento de colonias de 105/ml de
orina.
Comentario: La tinción de Gram es útil para determinar
rápidamente el tipo y el recuento de bacterias y células en la
orina . Para los pacientes hospitalizados, la coloración de
Gram de la orina puede ayudar a diagnosticar la causa de la
sepsis antes que los cultivos de sangre den positivos
• La presencia de una bacteria/campo de inmersión tiene buena correlación con

100.000 UFC/ml en — 85% de los casos.
• La presencia de muchas células epiteliales y morfotipos microbianos diferentes
sugieren contaminación.
✓ Métodos de cultivo
• Usar placas con Agar Sangre y Agar MacConkey
• Para orinas de chorro medio, recolector y catéter,
las muestras deben sembrarse
con asa de 1 pl en placas de un medio enriquecido como Agar Sangre y Agar Mac
Conkey. El desarrollo de una colonia en el cultivo debe multiplicarse por 1000.
• Para orinas obtenidas por cateterización vesical, las muestras pueden
sembrarse con asa de 10p (1 colonia = 100 ufo/mi) y 1 pl (1 colonia = 1000
ufo/mi).
Comentario: El recuento de colonias se debe realizar en el agar

sangre. Las demás placas deben ser estriadas de tal forma que
se obtengan colonias aisladas . Si el recuento de colonias no
puede ser realizado debido a una abrumadora propagación de
Proteus, una estimación del recuento se puede hacer de las
placas de aislamiento.
19
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Ministerio de Salta;
Va ~SE
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
✓Métodos de inoculación para el recuento de colonias

Método del asa calibrada
• Usando un asa calibrada flameada y enfriada o una descartable, mantener el asa
verticalmente, y sumergir solamente el aro por debajo de la superficie de la
muestra de orina, sin centrifugar y bien mezclada .
• Llevar una asada de la orina bien mezclada sobre la placa de agar sangre
haciendo una línea recta a lo largo y por el centro del agar y estriar la orina
mediante una serie de pases en ángulos de 90° a través del inóculo (método solo
para 1 pl). Ver figura 1y 2.
• Para el aislamiento de colonias usar Agar MacConkey siguiendo el procedimiento
anterior.
• Cuando se utilizan 10 pl de muestra tomar una asada de orina bien mezclada
para inocular y estriar en cuadrantes las placas de agar, como se indica en la
figura 3.
Figura 1. Usando un asa calibrada flameada y enfriada o una descartable, mantener el

asa verticalmente, y sumergir solamente el aro por debajo de la superficie de la
muestra de orina, sin centrifugar y bien mezclada
•
Ministerio de 'alud NSTirtíMUCINAI SALUMI
Departamento de
Laboratorio de
Figura 2. Llevar una asada de la orina bien mezclada sobre la placa de agar sangre
haciendo una línea recta a lo largo y por el centro del agar y estriar la orina mediante
una serie de pases en ángulos de 90° a través del inóculo (método solo para 1 NI).
Figura 3. Cuando se utilizan 10 pl de muestra tomar una asada de orina bien mezclada
para inocular y estriar en cuadrantes las placas de agar, como se indica en la figura.
Método de la micropipeta
✓ Con una pipeta y punta estéril, aspirar la cantidad necesaria de orina bien
mezclada y colocarlo en un extremo de la placa, dejar que la gota escurra hacia el
otro lado.
v" Estriar como en el caso anterior
•
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lila merla de Salud
111~11111
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Incubación
Una vez sembradas las placas deben incubarse durante 16 a 18 horas a 35 - 37° C,
ambiente aeróbico. Incube 48 horas aquellos urocultivos negativos con sedimento
urinario alterado y sembrar en Agar Sangre con estría.
Realizar cultivos anaeróbicos solamente cuando sea solicitado en aspiración

suprapúbica, cuando se sospecha en una fístula vesiculoentérica y cuando se
observen diferentes morfotipos bacterianos en el examen directo pero no crecen en
cultivo aeróbico.
Si es conveniente, incubar el Agar Sangre en 5% de CO2 para mejorar el desarrollo de
los organismos gram-positivos y bacterias dependientes de CO2.
Lectura de los medios de cultivo
Examinar los cultivos que han sido incubados durante toda la noche, pero hacer la
lectura final a las 24 hrs.
En los siguientes caso se debe incubar el cultivo hasta por 48 horas:
✓ La muestra ha sido obtenida por una técnica invasiva, como PSP o por
Cateterización.
✓ Pequeñas o pocas colonias que hacen una lectura discernible.
✓ Los resultados no correlacionan con la tinción gram o la sintomatología
clínica
✓ ( ejm: piuria o con sintomatología y cultivo negativo)
✓ Paciente inmunosuprimido incluye pacientes que han sido
transplantados.
✓ Se requiere cultivo para hongos o levaduras ( ejm: cultivos de UCI
neonata!)
✓ Comunicarse con el médico tratante ya que existen otras causas de
sedimento urinario alterado que no corresponden a ITU o para saber si
el paciente está recibiendo antibióticos.
Urocultivo positivo
Para los cultivos positivos, examinar los medios de cultivo para la cuantificación y tipo
morfológico de los organismos presentes.
0.001 mL 1 colonia = 1000 UFC/ml
0.01 mL 1 colonia = 100 UFC/ml
✓ Cuando las colonias son demasiado numerosos para contar.

El máximo recuento usando el asa de 1 pl es >105 UFC/ ml.
El máximo recuento usando el asa de 10 pl es >104 UFC/ml.
Estudio posterior de los cultivos positivos:
• Determine el recuento de colonias de cada morfotipo en el cultivo por separado
examinando el agar sangre.
• Usando las tablas 4 determinar la extensión del estudio para cada organismo.
22
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
o Para las pruebas de identificación mínima, consulte la Tabla 5.

• No identificar microbiota urogenital normal a nivel de género o de especie.
• Streptococcus agalactiae debe ser reportado de mujeres en edad fértil y de
diabéticos conocidos, independientemente del recuento.
• Debido a que E. coli representa el 80% de los patógenos en cultivos de orina,
utilice métodos de identificación rápida para identificar esta especie. Véase
Tabla 5.
• Para la identificación final proceder de acuerdo a métodos establecidos en el
laboratorio.
• Realizar pruebas de susceptibilidad de acuerdo a métodos establecidos en el
laboratorio.
• Mantenga las placas con cultivo positivo a temperatura ambiente hasta 48 h,
por si el médico solicitara algún estudio adicional.
• Mantenga las muestras de orina en refrigeración por lo menos 24 horas para
resolver cualquier problema con la muestra o resultados del cultivo.
• No informar recuento en levaduras.
CONTROL DE CALIDAD
,7 Inspeccione las asas calibradas no descartables periódicamente para
confirmar que siguen siendo redondas y están libres de dobleces,
abolladuras, corrosión, o material incinerado. En el anexo 2 están los
procedimientos de control de calidad de asas microbiológicas.
✓ Si utiliza asas descartables, chequear el certificado de validación de
recuento del fabricante con cada lote. El proveedor debe suministrar una
copia de este certificado con cada lote de asas que venda.
• ✓ Verificar que los medios de cultivo cumplan con la fecha de expiración y

los parámetros de control de calidad de cada laboratorio.
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
FASE POST-ANALITICA
REPORTE DE RESULTADO
a) Reporte de la Tinción Gram: resultados de bacterias y células.
b) Cultivos Negativos,
Reportar : de acuerdo al asa calibrada utilizada.
Negativo dil 1/100 UFC/ml o
Negativo dil 1/1000 UFC/ml. por 24 o 48 horas.
c) Cultivos positivos, reportar:
/Si solamente se observa microbiota urogenital o de la piel, reportar como cultivo

,
negativo y el recuento será de "10,000 UFC/ml de microbiota urogenital normal."

✓Como es especificado en la tabla 4 los cultivos mixtos son reportados con el
recuento en UFC/ml, seguido por "múltiple morfotipos bacterianos presente"
(Polimicrobismo); posible contaminación; se sugiere nueva muestra, con pronto envío
al laboratorio, si está clínicamente indicado."
/Reportar el recuento de colonias de cada patógeno por separado, seguida por la
identificación presuntiva, mínima, o definitiva y resultados de la prueba de
susceptibilidad, como se indica en la tabla 4 y 5. Reportar el recuento de colonias de
cada patógeno separadamente seguido por la identificación presuntiva o definitiva
con la susceptibilidad de acuerdo.
/Cuando se observa inhibición por antimicrobianos, reportar: Se detectó inhibidor
antimicrobiano con su recuento respectivo.
v Notificar al clínico posibles hallazgos inusuales ( Ejm: Salmonella tiphy, Burkholderia
pseudomallei, etc).
v Mantener copia de los resultados en sistema manual o electrónico.
INTERPRETACION
El criterio de .?.105 UFC/ml para significancia puede ser aplicado a la mayoría de las
muestras enviados para cultivo. Sin embargo, lo siguiente será cierto.
/ Un cultivo mixto en un paciente ambulatorio no complicado probablemente indica
contaminación.
,7 Recuentos menores (<104/ml) de bacterias comúnmente encontrados sobre la piel y
genital interno y externo son considerados ser contaminantes, pero en circunstancias
especiales, un recuento de Enterobacteriaceae de 102 UFC/ml o más, pueden ser
considerado significativo.
v Recuento de colonias <105 UFO/mi en muestras emitidas con presencia de disuria y
síntomas de ITU puede ser significativo.
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
/No realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana directamente de la muestra de

orina. Estos métodos no están estandarizados.
/EI urocultivo con removedor de antibióticos no está estandarizado ni validado.
Tener en cuenta los siguientes criterios para la interpretación de resultados:
a) En pacientes sin sonda vesical, la cuenta significativa de bacterias en

5
orina es la presencia de más de 10 UFC / ml de un solo gérmen, se
confirma en 92% de casos si el gérmen aislado es gram negativo y en
70%, si es gram positivo.
Recuentos entre 105 y 103 UFC/ml, si el paciente es sintomático o si el
gérmen es S. saprophyticus o Enterococcus spp. hacen diagnóstico de
ITU.
3 4
b) Los recuentos intermedios (10 - 10 UFC / ml) indican infección si el
procedimiento de recolección de orina fue realizado correctamente.
Gérmenes normalmente encontrados en la piel o genitales externos e
internos. Pero en ciertas circunstancias recuentos de 102 UCF/ml o
más especialmente por Salmonella o Shigella pueden ser considerados
significativos.
c) Generalmente, el aislamiento de tres o más especies bacterianas

indican que la muestra se ha contaminado por recolección inadecuada o
demora en la siembra.
d) En pacientes con sonda vesical, cuentas bacterianas menores de 105
UFC / ml pueden tener significado, así también se pueden encontrar
bacteriurias polimicrobianas hasta en casi 15% de enfermos.
e) En pacientes sin catéter se puede comprobar si el procedimiento de

obtención de muestra fue realizado correctamente observando la
frecuencia con la cual se informan recuentos de colonias intermedias
3 4
entre 10 - 10 UFC / ml. En pacientes sin infecciones del tracto urinario,
el recuento es nulo o se reduce a pocas colonias.
f) En muestras obtenidas por punción suprapúbica, el desarrollo de una
sola colonia en el medio de cultivo indica infección del tracto urinario.
g) Si en el urocultivo desarrolla flora polimicrobiana, sospechar
contaminación y repetir el estudio. Sin embargo hay situaciones en que
la flora puede ser polimicrobiana: portador de sonda vesical, vejiga
neurógena , fístula vésico-intestinal o vésico-vaginal
h) Cuando el urocultivo es positivo y el paciente está asintomático, es
necesario repetir el estudio.
i) Proceso del antibiograma de la orina directa no se recomienda.
NOTA 1: Se usará asas de siembra 0.001 mL para todas las muestras de orina
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excepción de aquellas procedentes de aspirados suprapúbicos, de infantes, de niños y
de pacientes con tratamiento antimicrobiano, las cuales se inocularán con asas de
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Departamento de
Manual de Procedimientos e."01111
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Laboratorio de
0.01 mL debido a que en dichos pacientes pueden haber infecciones del tracto urinario
asociados a recuentos menores de 105 UFC/ mL.
NOTA 2: De no contar con asa calibrada, utilizar tips estériles y micropipeta de lpt..
o 10pL.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

✓ Mujeres con ITU no complicada para las cuales la etiología microbiana
está establecida (p. ej. E. coli o S. saprophyticus) pueden ser tratados
empíricamente con una sola dosis alta o una de curso corto (3 días) de
agente antimicrobiano. El cultivo de orina para identificación y prueba de
susceptibilidad del organismo causante deben ser realizados en el caso
donde hay fracaso en el tratamiento y recaída, sospecha clínica de
pielonefritis o infección recurrente.
✓ En casos de piuria estéril, la coloración Gram es importante. Si son
vistos organismos pero no cultivables y el hallazgo persiste, puede ser
indicado un cultivo anaeróbico.
✓ Resultado falso negativo es debido, en parte, a sustancias interferentes,
orina diluida, bajo pH e interpretación subjetiva del criterio de trabajo
adicional del cultivo.
✓ El síndrome uretral agudo debido a uretritis deben ser sospechado en
mujeres sexualmente activas, quienes tienen disuria y piuria pero
urocultivo negativo. Se debe realizar investigación para detectar la
presencia de N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Ureaplasma
urealyticum.
✓ Disuria también ocurre en pacientes con vulvovaginitis y el hisopado
vaginal debe ser enviado para la detección de vaginosis bacteriana,
candidiasis y Trichomoniosis.
✓ En caso de piuria estéril, debe sospecharse también de TBC renal. La
muestra para cultivo debe ser la primera orina de la mañana por tres
días consecutivos. No se recomienda orina de 24 h.
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Laboratorio de
ANEXO I
DETERMINACIÓN DE SUSTANCIAS ANTIBACTERIANAS RESIDUALES EN
ORINA
I. Principio
Determinar la presencia de sustancias antibacterianas residuales en orina. Este
procedimiento se aplica en todos los casos en los que se solicite urocultivo.
II. Materiales
• Pinzas
• Discos de papel de filtro estériles de Papel filtro Whatman N° 3 o similar
• Placa de Agar Mueller Hinton 100 x 15 mm
• Tubo con solución salina estéril x 2 mL
• Alicate sacabocados para 6 mm de diámetro o perforador
• Cepa de Bacillus subtilis ATCC 6633.
III. Procedimiento
• Hacer una suspensión de Bacillus subtilis en un tubo con solución salina estéril
que sea similar al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland
• Sembrar la placa de agar Mueller Hinton con la suspensión de bacterias de
manera similar a un antibiograma.
• Dejar secar a temperatura ambiente aproximadamente 15 min.
• Tomar con la pinza un disco de papel filtro y colocarlo en la placa sembrada
según una plantilla numerada o colocando el número en la parte posterior de la
placa.
• Colocar 10 µL de orina con una asa calibrada o una micropipeta
• Se debe colocar el número correspondiente a la muestra.
• La placa será incubada a 35°C por 18 horas en aerobiosis.
IV. Interpretación
Se buscará la presencia de un halo de inhibición alrededor del disco con la orina.
Cualquier diámetro de halo se considerará como prueba positiva. La ausencia de halo se
considera como prueba negativa.
V. Reporte de resultados
El resultado se informa como "Actividad antimicrobiana: Positiva o Negativa"
VI. Comentario
• El medio de cultivo debe estar a temperatura ambiente y la superficie debe estar
seca.
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Departamento de
Laboratorio de
• No se ha determinado cual es el efecto de la demora en colocar los discos sobre

el medio de cultivo sembrado.
• Mantener la cepa de Bacillus subtilis en un tubo o placa de agar Mueller Hinton,
todas la semanas hacer una resiembra para la prueba. No utilizar el cultivo de
una placa donde se haya realizado la prueba.
VIL Referencias
1. Maturin LJ. Bacteriological Analytical Manual, Inhibitory Substances in Milk,
FDA, 2001.
2. Ghosh HK. Role of bacterial growth inhibitors in urine in diagnostic culture. J Clin
Pathol. 1970. 23: 627-628.
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Slinisterio de Salud
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Departamento de
Laboratorio de
ANEXO 2
USO Y CALIBRACION DE ASAS MICROBIOLOGICAS
PRINCIPIO
El volumen de fluido transferido por una asa calibrada depende del volumen y la forma del
recipiente que contiene el líquido y la dirección y profundidad del asa cuando es introducido en
el líquido. La variabilidad de los resultados es por la tensión superficial y la superficie
humedecida del asa. Líquidos en recipientes con diámetros pequeños (<1 cm) tienen alta tensión
superficial, el cual resulta en una menor transferencia, dado que la fuerza vidrio-liquido y
plástico-liquido (fuerza adhesiva) son mayores que las fuerzas liquido-liquido (fuerza cohesiva).
Cuando el alambre por encima del aro del asa es humedecido por la inmersión profunda en el
líquido, exceso de líquido drena por el alambre y aumenta el volumen transferido.
Las asas cuantitativas son usadas comúnmente para realizar cultivos cuantitativos y verificar el
inoculo de las pruebas de susceptibilidad. Las asas cuantitativas son menos exactas que las
pipetas, estas todavía son una excelente manera para realizar cultivos semicuantitativos o
diluciones. Las asas cuantitativas son usadas cuando el error < 20% es aceptable. Las asas son
calibradas por método colorimétrico o por método de la broca.
II. TIPOS DE ASAS
A. El volumen es 1 o 10 pi
B. Las asas reusables son hechos de alambre, usualmente platino o nicrom
C. Las asas descartables son hechos de plásticos
III. MATERIALES
Método colorimétrico
A. Agua destilada
B. Colorante solución de azul de Evans al 0.75% (CAE)
i. Solución Stock
1. Adicionar 0.75 g de CAE a 100 ml de agua.
2. Filtrar la solución con papel filtro Whatman N° 40
3. Guardar a temperatura ambiente en frasco oscuro por 6 meses
C. Colorante Violeta de Genciana solución comercial al 1 — 2 %, solución stock
(opcional)
i. Soluciones de trabajo
1. Prepare diluciones del colorante (azul de Evans o violeta de
genciana) en agua destilada para obtener las diluciones 1:500,
1:1000, 1:2000, y 1:4000, diluyendo 1 ml de la solución stock del
colorante en 49 ml de agua destilada.
2. Diluya 1 ml de la dilución 1:50 en 9 ml de agua destilada. Esta es
una dilución 1:500.
31
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
3. Realizar diluciones seriada al doble empezando con 5 ml de la

dilución 1:500 y 5 ml de agua destilada, para preparar el resto de las
diluciones.
4. Guardar las 4 diluciones hasta por 6 meses pero prepare nueva
diluciones si la lectura de algunos de ellos difiere el 3% de la
lectura previa.
D. SUMINISTROS
i. Cubetas de vidrio cuadradas con 1 cm de trayectoria de luz. Use la misma
cubeta para todas las medidas.
ii. Cristalería: varias tubos limpios de 15 ml de volumen, varias pipetas de 1 y
10 ml.
iii. Espectrofotómetro de buena calidad con las siguientes especificaciones:
lineal hasta 2.0 de unidades de absorbancia a 350 nm; ancho de banda
espectral, < a 2nm (348 a 352 nm); precisión de < 0.001 A/h; exactitud de
longitud de onda seleccionada, < 1 nm.
IV. CONTROL DE CALIDAD
A. Consideraciones generales
i. Asas reusables
1. Inspeccionar las asas calibradas regularmente para confirmar que
ellos permanecen redondas y están libres de curvas, abolladuras,
corrosión o material incinerado.
2. Verificar mensualmente las asas para garantizar que el volumen
transferido es exacto.
ii. Verificar el volumen transferido del asa descartable tras recibir un nuevo
lote de asas. El desempeño satisfactorio de varios lotes, y el certificado del
fabricante de un control de calidad hecho en casa elimina la necesidad de la
calibración de rutina.
B. Métodos para la calibración de asas
Procedimiento de calibración por el método colorimétrico

i. Colocar el espectrofotómetro en modo absorbancia, usando una longitud de
onda de 600 nm.
ii. Calibrar a cero con agua destilada
iii. Medir y anotar la absorbancia de cada dilución del colorante (1:500, 1:1000,
1:2000, 1:4000)
iv. Graficar la densidad óptica (eje vertical) contra cada una de las
concentraciones de las diluciones (eje horizontal) en la hoja de trabajo (ver
32
•
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Departamento de
Laboratorio de
grafica ). Dibujar una sola línea que más se acerque a los cuatro puntos para
construir la curva de calibración.
v. Usando el asa de 1111, transferir 10 asadas de la solución colorante stock
elegido a 10 ml de agua destilada. Después mezclar completamente, medir y
anotar la absorbancia de esta solución. La absorbancia debería corresponder
a la dilución 1: 1000 en la curva de calibración.
vi. Preparar y evaluar tres soluciones de prueba adicionales para un total de
cuatro lecturas. Anotar las lecturas en la hoja de trabajo y determinar el
promedio. Luego calcular el porcentaje de inexactitud siguiendo las
instrucciones de la hoja de trabajo.
vii. Si el promedio de las lecturas es mayor de ± 20% de la dilución de la
solución stock 1:1000, el asa es inexacta. Seguir con la acción correctiva.
viii. Para calibrar el asa 10 transferir 10 asadas de la solución stock del
colorante elegido en 100 ml de agua destilada usando el asa de 10 121.
Después mezclar completamente, medir y anotar la absorbancia de esta
solución. Prepare y evalúe tres soluciones de prueba adicional para un total
de cuatro lecturas. Luego calcule el porcentaje de inexactitud siguiendo las
instrucciones de la hoja de trabajo. La lectura final debería ser la misma que
la del asa de 1111, por ejemplo f 20% de la dilución 1:1000 de la solución
stock.
C. Acción correctiva
i. Si la carga del asa no cae dentro del límite de tolerancia especificado, el asa
puede ser descartado y reemplazado o reparado y calibrarlo nuevamente.
ii. Reparar mediante inmersión en arena fina para remover depósitos, y
limpiarlo humedeciendo con alcohol y luego flamearlo.
iii. Las asas pueden ser retornados a su diámetro calibrado usando brocas de 1.5
mm de diámetro para asas de 1u.1 y brocas de 4 mm de diámetro para asas
de 10ia1. Las asas arregladas deben ser calibradas antes de ser puesto en
servicio nuevamente.
iv. Para las asas descartables inexactas, contactar con el proveedor para
reemplazarlos.
V. PROCEDIMIENTO PARA EL USO DEL ASA
A. Para asas reusables, flamear e y enfriar antes de la primera y después de cada
transferencia. Use una nueva asa descartable no humedecida para cada transferencia.
B. El líquido debería estar en un recipiente de boca ancha (diámetro >1 cm).
C. Rotar la muestra en el recipiente para mezclar la suspensión bacteriana de manera
uniforme.
D. Mantener el asa verticalmente, e introducirlo el aro del asa justo por debajo de la
superficie del líquido. Evitar alguna burbuja en el menisco del líquido.
33
•
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Nlinimerio de Saltad
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
E. Verificar para asegurar que ninguna burbuja están dentro del asa.
F. Mover el asa hacia arriba y hacia abajo solamente.
G. Transferir el contenido del asa a la placa contactando el líquido sobre la superficie
del agar en la placa, hasta que el líquido ya no sea visible en el asa. Diseminar con
el asa o, para una mayor exactitud, diseminar con una varilla doblada (asa de
"Drigalski").
VI. LIMITACIONES
Asas cuantitativa, tanto descartables y reusables, serian groseramente inexactas si burbujas
están presentes en la película del líquido transferido. Evitar la formación de burbujas cuando
se agita el líquido. Inspeccionar cuidadosamente que el asa cargada no presente burbujas.
Remover las burbujas por flameo (asas reusables), reemplazando (asas descartables) o por
reinmersión (para cualquiera de las asas).
VII. REFERENCIAS
1. Albers AC, Fletcher RD. 1983. Accuracy of calibrated-loop transfer. J Clin Microbiol.
18:40-42.
2. Clarridge JE, Pezzlo MT, Vosti KL. Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of urinary tract
infections. 1978. Weissfeld AS (Coordinating ed.). American Society for Microbiology,
Washington, D. C.
•
•
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
HOJA DE TRABAJO 1
Calibración colorimétrica de asas cuantitativa
Volumen del asa Fecha

Fecha de puesto en uso Iniciales del operador
Fabricante del asa N° de lote
Muestra Absorbancia Cálculos

N°
1 Promedio menos la (a)
Absorbancia estándar diluida
1:1000
2 Divide (a) por la estándar de (b)
absorbancia 1:1000
3 % de inexactitud: multiplicar (c) %
(b) por 100
4 El valor (c) debe ser + 20%: Es aceptable?
SI / NO
Suma de las 4
lecturas
•
Promedio
(dividir entre
4)
Acción Correctiva:
Revisado por:
Fecha:
35
•
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Departamento de
Laboratorio de
Curva de Calibración:
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DILUCION
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Departamento de
Laboratorio de
REFERENCIAS
I. Albers, A. C, Fletcher. R. D. 1983. Accuracy of calibrated-loop transfer. J Clin Microbio!. 18:

40-42
2. Andreu, A., J. Cacho, A. Coira y J. A. Lepe. 2011. Diagnostico microbiológico de las

infecciones del tacto urinario. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 29:52-57
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Pediatrics. 125:335-341.
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Infecc. Microbiol. Clin. 23 (Supl. 4): 9-14
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Pathol. 54: 911-919.
12. Heldrich, F. J., M. A. Barone. E. Spiegler. 2000. UTI: diagnosis and evaluation in syntomatic
pediatric patients. Clin. Pediatr. (Philadelphia) 39:461-472
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Venezol. Microbiol. 30:37-42.
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Infect. Dis. Clin. N. Am. 1997. 11:551-581
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linistrrit) de• Salud SSTUTOI*XILIESkal
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Laboratorio de
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Diagnosis of coliform infection in acute dysuric women. N. Engl. J. Med. 307: 463-468.
20.Stark, R. P., and D. G. Maki. 1984. Bacteriuria in the catheterized patient: what quantitative
level of bacteriuria is relevant? N. Engl. J. Med. 311:560-564.
21. Tambyah, P. A, and D. G. Maki. 2000. Catheter-associated urinary tract infection is rarely
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22. Tamtlyah, P. 4. and D. G. Maki. 2000. The relationship between pyuria and infection in
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Med. 160:ó73-611
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•
il
ISTArre gILIM Sub efk SIC
Ministerio de Salud
10111"111111
Departamento de
Laboratorio de
Microbiolog í a Microbiología Página 39
ANEXO 3 : FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE CULTIVO
Inicio — CPA CONFORME
Detección
Examen
antibiótico Gram Cultivo
Directo
•
PRT- PRT-
PRT- PRT-
DIDAP DIDAP
DIDAP DIDAP
002 003
009 001
SI
Proceso
Automatizado
Automatizado
Nn
Proceso Manual
Registro de Datos
Revisar limitaciones
NO
Conformidad de procedimiento
e SI
51
Revisar Guía de
Acción de Pánico
Acciones de Pánico
NO
Resultado validado
39
•
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MINTOIXIgal
aülIDa
ivirm k-NO
Al Misterio de Salud
4;••¿,;:z, Que atenite.,.....s
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
EXAMEN PARASITOLOGICO
N° DE FOLIOS: 15

LIC.TM NORKA CRUZADO RISSO DRA. LILIAN PATIÑO GABRIEL FECHA :
LIC. IVONNE CARBONELL PERALDO
FIRMA :
Tecnólogo Médico
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hSTITUTO Mal MUI.15 NEL VIO
Departamento de
Manual de Procedimientos Iff".111.

Laboratorio de

PROCEDIMIENTO EXAMEN DIRECTO PARASITOLOGICO
PROPÓSITO REALIZAR PROCEDIMIENTO DE EXAMEN PARASITOLÓGICO
ALCANCE del INSN
MARCO LEGAL Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud. Reglamento DS 013-2012 AS
UNIDAD DE
INDICADOR FUENTE
MEDIDA RESPONSABLE
1. % de veracidad de 1.- N° de
resultados vs el N° 1.Registro de resolución de 1.Tecnólogos
resultados alarmas
de alarmas Médicos del área
2. Frecuencia de 2- Registro de resultado de
2- % de resultados 2- Tecnólogo Medico
resultados de pánico pánico
de pánico del área.
NORMAS
1.Reglamento de organización y funciones del INSN.RMN 566-2003 AS/DM y sus modificaciones

5.13015189-2003 Medical Laboratory ,particular requirements for quality and competence
41
•
II inislerio (Ii• Salud
0.0 f1.5 aur dirndemn1 or,nte4.
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
INICIO: muestra condiciones adecuadas para el examen

2- Procesamiento del examen directo
3- Registro de resultados
ENTRADAS
Previos (CPA)
SALIDAS

Tecnólogo Médico
ANEXOS:
ANEXO 1 DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA DE ENTEROPARASITOS ENCONTRADOS EN HECES
ANEXO 2 FIJADORES MÁS UTILIZADOS PARA PRESERVAR MUESTRAS FECALES
ANEXO 3 FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE EXAMEN DIRECTO PARASITOLOGICO
42
Ministerio de Salud im
inaw
aaulia
Yes Solt,i piat: atendemos
anni,
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
OBJETIVO: El objetivo fundamental del examen parasitológico es identificar la morfología de los

parásitos con importancia clínica, divulgando los métodos de diagnóstico más apropiados y de fácil
uso para la detección de los parásitos intestinales, los cuales son realizados por el personal
profesional Tecnólogo Médico.
1. MATERIALES:
Exámen directo:
• Laminas portaobjetos rotuladas para el examen directo y la coloración de Ziehl Neelsen

para Coccideas.
• Laminillas cubreobjetos.
• Suero Fisiológico (S.F) y Solución de Lugol.
• Baguetas de vidrio o bajalenguas.
• Microscopio.
• Bocales para descartar las baguetas, láminas y laminillas.
• Set de coloración de Ziehl Neelsen
• Aceite de Inmersión.
Test de Graham
• Lamina portaobjetos preparadas con cinta adhesiva.
2. PROCEDIMIENTO:
2.1 .Exámen parasitológico directo:

Sobre una lámina portaobjetos se coloca una gota de S.F y otra de Lugol y con la bagueta se toma
una porción de materia fecal equivalente a la cabeza de un fósforo y se prepara una emulsión
homogénea tanto con el suero como con el lugol. Se coloca una laminilla sobre la emulsión y se
lleva al leer al microscopio con lente de menor aumento. Con el S.F. se observa el movimiento de
trofozoitos y larvas de los parásitos cuya desventaja es que por falta de coloración puede
confundirse algún elemento con parásitos (fitoparasitos).
El lugol permite ver los elementos normales coloreados de color pardo amarillento, el citoplasma de
los trofozoitos y la cromatina nuclear de color pardo oscuro; pero su desventaja es que inmovilizan
a las larvas y trofozoitos. En el caso de localizarse ejemplares adultos de parásitos, a veces basta
para su identificación con la observación a simple vista.
Con los gusanos chatos, puede lograrse una aclaración (los vuelve trasparentes) con glicerina y
hasta una coloración con tinta china, para la identificación de especie. En la identificación de
Coccideas se utiliza la coloración de Ziehl Neelsen (misma técnica utilizada para la coloración del
Mícobacterium tuberculoso) para el hallazgo de Criptosporidium, Ciclospora cayetanensis, e
lsospora belli. Esto se realiza a las muestras de todos los pacientes con HIV o con sospecha de
HIV.
43
•
111/111
JISTRUIO kW». «3ü1.0 Gít 4A0
!linisierio de Salud 10111,111101111111
erltose.se que menden., yeaeriiiia
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
2.2 Coloración de de Ziehl-Neelsen (modificado para observación de coccidias:

Cryptosporidium y otros): Se basa en el comportamiento ácido-resistente de la cubierta de estos
parásitos, los cuales se tiñen de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul, dependiendo del
colorante de contraste usado.
-Colocar las láminas portaobjetos sobre el soporte de las varillas de vidrio.

- Fijar la lámina con alcohol metílico de 2 a 5 minutos y dejar secar.
- Cubrir la lámina con la fucsina fenicada (previa agitación del frasco) por 5 minutos, diluida
previamente en agua al tercio (1 mL colorante y 2 mL de agua).
- Lavar suavemente la lámina portaobjeto con agua corriente.
- Decolorar con alcohol-ácido, cubriendo el portaobjeto por unos segundos hasta quitar el
colorante.
- Lavar suavemente el portaobjeto con agua.
- Colocar como colorante de contraste verde de malaquita 1% o azul de metileno 1-1,4% durante 5
minutos, diluidas previamente al tercio.
- Lavar la lámina suavemente con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente.
- Observar el microscopio.
Los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora aparecen de un color rojo fucsia sobre
un fondo verdoso (con verde de malaquita) o azul (con azul de metileno). En algunos casos, no se
colorean bien, pero la refringencia característica permite diferenciarlos.
2.3 Test de Graham: Es el procedimiento de elección para la búsqueda de Enterobius vernicularis,

ya que la hembra del parásito, pone en los pliegues anales del huésped. Recordar que lo mejor
es realizarlo inmediatamente luego de dormir y antes del aseo. El método consiste en tocar con el
lado engomado de una cinta adhesiva transparente sobre el ano del paciente permitiendo que se
adhieran los huevos, pudiéndose ver ocasionalmente ejemplares adultos de E. vermicularis y
huevos de otros parásitos
NOTA: El Servicio de Microbiología como entidad docente realiza la conservación de las muestras
parasitológicas positivas, para lo cual son conservadas por diferentes preservantes.
44
•
a Ala
NIMIO XACIUM. «SALO DEL PE
11i:tisk:do de„ Salud 1011"1111111
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO I
DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA DE TROFOZOITOS DE AMEBAS ENCONTRADOS EN

HECES
NÚCLEO CITOPLASMA
ESPECIE TAMAÑO NUMERO CARIOSOMA APARIENCIA INCLUSIONES
Entamoeba 10 - 60 um 1 no visible en Central y Finamente Hematíes
hystolítica coloraciones pequeño granular
Entamoeba 5 -12 um 1 no visible en Excéntrico y Finamente Bacterias
hartmanni coloraciones pequeño granular
Entamoeba 15 - 50 um 1 Excéntrico y Grueso y Bacterias,
COli frecuentemente alargado vacuolado levaduras y otro
visible en material
coloraciones
Endolimax 6 - 12 um 1 Alargado de Granular y Bacterias
nana ocasionalmente forma irregular vacuolado
visible en como una
coloraciones mancha
lodamoeba 8 - 20 um 1 no visible en Alargado y Granular grueso Bacterias,
butschilli coloraciones usualmente y vacuolado levaduras y otro
central material
DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA DE QUISTES DE AMEBAS ENCONTRADOS EN HECES
NÚCLEO CITOPLASMA
ESPECIE TAMAÑO FORMA NUMERO CARIOSOMA CUERPOS
CROMATOIDALES
Entamoeba 10 - 20 um Usualmente 4 en quiste Pequeño y Presente como
hystolítica esférico madura central barras con bordes
redondeados
Entamoeba 5 - 10 um Usualmente 4 en quiste Pequeño y Presente, similar a
hartmanni esférico maduro excéntrico E. hystolítica
Entamoeba 10 - 35 um Esférico, 8 en quiste Alargado y Presente como una
coli triangular u maduro excéntrico astilla puntiaguda
ovalado
Endolimax 5 - 10 um Esférico, oval 4 en quite Alargado No presente
nana o elipsoidal maduro irregular
lodamoeba 5 - 20 um Ovalado, 1 en quiste Alargado y No presente
butschilli ellipsoidal o maduro usualmente
triangular excéntrico
45
NIMIA() tuca smo Del151.
Nlinislerio dr sa lud Wirignit
PMO., 0114,
Departamento de Versión N° 1
Laboratorio de
GENARALIDADES
ESPECIE LOCALIZACIÓN FORMA VIA DE MECANISMO DE
(AMEBAS) INFECTANTE INFECCION INFECCION
Entamoeba Intestino grueso Quiste maduro Oral Ingesta de agua y alimentos
tetranucleado contaminados
hystolítica
Entamoeba Intestino grueso Quiste maduro Oral Ingesta de agua y alimentos
contaminados
hertmanni
Entamoeba coli Intestino grueso Quiste maduro Oral Fecalismo y por ingesta de
de 8 núcleos alimentos contaminados
Endolimax Intestino grueso Quiste Oral Ingesta de agua y alimentos
contaminados
nana
lodamoeba Intestino grueso Quiste Oral Ingesta de agua y alimentos
contaminados.
bütschilli
DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA DE TROFOZOITOS DE PROTOZOARIOS FLAGELADOS

ENCONTRADOS EN HECES
ESPECIE TAMAÑO FORMA MOVILIDAD NUCLEOS #DE FLAGELOS OTROS

Trichomona 11 - 12 De pera Nerviosa y 1 3-5 anteriores y 1 Membrana ondulante
um sacudiendose posterior que se extiende a lo
s hominis
largo del cuerpo
Chilomastix lo - 15 De pera Rotatorio 1 3 anteriores y 1 en Prominente citostoma
um el citosoma que se extiende 1/3 /
mensnilli
1/2 de la long. Del
cuerpo.
Giardia 12 — 15 De pera Como caída 2 4 laterales 2 Disco succionador 1/3
um de hoja ventrales 2 —3/4 de la superficie
lamblia
caudales ventral.
Enteromona 8 — 9 um Oval Sacudiendose 1 3 anteriores 1 Aplastado por un lado
posterior con flagelo posterior
s hominis
extendido libre
Retortamon 6 — 7 um Pera u Sacudiendose 1 1 anterior 1 Prominente citostoma
oval posterior que se extiende
as
aprox. 1/2 del cuerpo.
intestinalis
Dientamoeb 9 — 12 um ameboide Pseudopodos 2 1 posterior Citoplasma granular y
presenta inclusiones
a fragilis
como bacterias y
ocasionalmente
hematíes.
46
• :tata
Nlinisterio de Salud 11.11,111,111111
[11.111 que atendmn1 peannze
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA DE QUISTES DE PROTOZOARIOS FLAGELADOS

ENCONTRADOS EN HECES
ESPECIE TAMAÑO FORMA NUCLEOS

Trichomonas No presenta forma
hominis quística
Chilomastix 8 — 9 um De limón con botón 1 no visible en Coloraciones
mensnilli hialino anterior
Giardia lamblia 11 — 12 um Ovalado o elipsoidal Usualmente 4
Enteromonas 6— 8 um Alargado u ovalado Usualmente de 1 a 4
hominis
Retortamonas 4 — 7 um De pera o ligeramente 1 no visible en coloraciones
intestinalis como limón
Dientameeba No presenta forma
fragilis quística
GENERALIDADES
ESPECIE LOCALIZACION FORMA VIA DE MECANISMO DE INFECCION

(FLAGELADOS) INFECTANTE INFECCION
Tricomonas Luz del intestino Trofozoito Oral Ingesta de agua y alimentos
hominis grueso contaminados
Chilonastix Luz del intestino Quiste Oral Ingesta de agua y alimentos
mensnilli grueso contaminados
Giardia lamblia Duodeno Quiste Oral Ingesta de agua y alimentos
contaminados
Enteromonas Intestino grueso Quiste Oral Ingesta de agua y alimentos
hominis contaminados
Retortamonas Intestino grueso Quiste Oral Ingesta de agua y alimentos
intestinalis contaminados
Dientamoeba Intestino grueso Trofozoito Oral Ingesta de agua y alimentos
fragilis contaminados
47
%linisterio Salud
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Versión N° 1
Laboratorio de
DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA DE PROTOZOARIOS CILIADOS, COCCIDIAS Y

BLASTOCYSTIS ENCONTRADOS EN HECES
ESPECIE TAMAÑO FORMA MOVILIDAD NUCLEOS OTROS

CILIADO 50 - 60um Ovoide Rotatorio 1 macronúcleo Vacuola contráctil,sup.
Balantidium 1 micronúcleo Del cuerpo rodeada de
coli (trofozoito) cilios
Balantidiun coli 45 — 65um Esférico u - 1 macronúcleo Estructura interna
(Quiste) ovalado aparentemente granular
COCCIDIA Ooquiste 28 Con una No móvil Ooquiste maduro con 2
Isospora belli - 30 um membrana esporoquistes con 4
delgada y de esporoziotos c/u
forma oval.
Cyclospora Ooquiste 8 Esférico No móvil Ooquste maduro con 2
cayetanensis - 10 um esporoquistes y c/u con
2 esporozoitos
Criptosporidiu Ooquiste 4 Esférico u No móvil Ooquiste maduro con 4
m parvum - 5 um ovalado esporozoitos sueltos en
el ooquiste.
Sarcocystis Sporoquiste Ovalado No móvil Ooquiste maduro con 2
hominis 14 - 16 esporoquistes con 4
esporozoitos c/u
BLASTOCYSTIS 5 — 10 um Ovalado,esféri No móvil 2-4 núcleos Con vacuola central,
Blastocystis co, ameboide localizados en citoplasma periférico en
hominis la periferie. forma de banda
GENERALIDADES
ESPECIE LOCALIZACION FORMA VIA DE MECANISMO DE INFECCION

INFECTANTE INFECCION
Balantidium coli Intestino grueso Quiste Oral Ingesta de agua y alimentos
contaminados
Isospora belli Intestino delgado Ooquiste maduro Oral Ingesta de alimentos
contaminados
Cyclospora Duodeno Ooquiste maduro Oral Ingesta de agua y vegetales
cayetanensis contaminados (hortalizas), NO
de persona a persona ni
animales.
Criptosporidium Yeyuno Ooquiste maduro Oral Ingesta de agua y verduras
sp contaminadas o de persona a
persona o procedente de
animales.
Blastocystis Intestino grueso Blastocystis Oral Ingesta de alimentos
hominis contaminados con heces.
48
II
• t. 11
NSTTIUTO XtZGLL CULO Uf. zdt
Nlinislerio de Salud 1101111"11111111
Yelst111. que atrnole,n111
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Laboratorio de
DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA DE HUEVOS DE HELMINTOS PARA EL DIAGNOSTICO EN

MUESTRAS DE HECES
CESTODES
ESPECIE TAMAÑO FORMA COLOR CARACTERÍSTICAS ESPECIFICAS
Taenia saginata 35 um Esférico o semiesférico Marrón nuez El embrión hexacanto esta dentro
Taenia solium con cápsula gruesa del embrióforo con sus radiaciones
carcterísticas
Hymenolepis 40-60um Ovalado o esférico. Se Transparente El embrióforo u Oncósfera encierra
nana x 30-50 observan 2 membranas o translúcido al embrión hexacanto observándose
um diferentes. Una interna 6 ganchos.
llamada embrióforo con
2 mamelones polares
de donde salen 4 u 8
filamentos polares y se
extienden en medio de
las 2 menbranas.
Hymenolepis 70-80 um Redondo o ligeramente Pardo Similar a H. nana
diminuta ovalado. amarillento
Dypilidium 30 — 40 Esférico u ovalado. 5-
Transparente La cápsula que encierra a los
caninum um 15 huevos encerrados huevos se denomina Cápsula
en una cápsula. Ovígera.Cada huevo presenta 2
membranas, una externa y una
interna que encierra al embrión
hexacanto y entre las 2 membranas
se observa un espacio con burbujas.
Diphylobotrium 68 um x Ovalado o elipsoidal Amarillo oro El huevo presenta un opérculo en el
pacificum 44 um polo más angosto y una pequeña
prominencia quitinosa(botón) en el
polo más ancho.
GENERALIDADES
ESPECIE LOCALIZACION FORMA VIA DE MECANISMO DE
(CESTODES) INFECTANTE INFECCION INFECCION
Tenias (león Cysticercus Oral, autoinfección Consumo de carne de cerdo
cellulosae interna y externa o vacuna infectada cruda o
malcocida.
Hymenolepis (león Huevo Oral (directa), Ingesta de agua y alimentos
nana autoinfección contaminados.
interna y externa;
indirecta
Hymenolepis Ileon Larva Oral Consumo de granos y
diminuta cisticercoide harinas malcocidos
infectados con huevos.
Dipylidium Ileon Larva Oral Ingestión accidental de
caninun cisticercoide pulgas.
Dyphylobotrium (león Larva Oral Consumo de pescado marino
_pacificum plerocercoide crudo o mal cocido infectado.
49
90100 MON! ntiODEt
Ministerio de salud W11~.11
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Versión N° 1
Laboratorio de

MUESTRAS DE HECES
NEMATODES
ESPECIE TAMAÑO FORMA COLOR OTRAS CARACTERISTICAS

Enterobius 55 um x 26 Alargado Transparente A veces se puede observar en el interior del
vernicularis um asimetrico con huevo el desarrollo de una larva
un aplanado y
otro convexo
Ascaris 60 um x 45 Ovalado Pardo Presenta 3 catas, la externa que es gruesa,
lumbricoides amarillento albuminoide, mamelonada( no presente en
um huevo decorticado);la media es gruesa,
huevo fértil hialina y de naturaleza hidrocarbonada y la
más interna que es delgada y de naturaleza
lipídica que protege al óvulo fecundado
Ascaris 90 um x 40 Alargado o Marrón Puede carecer de la capa mamelonada y la
lumbricoides deformes capa hialina es delgada. Estos huevos
um
presentan una sustancia amorfa que llena
huevo infértil toda la cavidad interna del huevo.
Trichuris 25 um x 50 Alargado Amarillo o Ocasionalmente los huevos son orientados
trichura um forma de barril marrón y verticalmente o inclinados y son
con tapones tapones reconocidos con dificultad. Muy raramente
polares. incoloros puede encontrarse los huevos sin tapón
polar.
Ancylostoma 60 um x 40 Ovalado o Transparente Se observa la presencia de una capa o
duodenale y elipsoidal con o ligeramente cubierta delgada transparente. En el interior
um
una delgada gris. pueden observarse de 2 a 8
Necator cápsula células(mórulas) y en personas estreñidas
americanus pueden desarrollarse larvas de primer
estadio en su interior antes de ser
excretadas.
Strongyloides Ligeramente Ovalado o Transparente En el interior del huevo pueden observarse
stercoralis más elipsoidal más de 8 células (mórulas). Raramente
pequeño encontrados en heces y se pueden observar
que el de en biopsias intestinales.
Uncinarias
DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA DE LAS LARVAS DE STRONGYLOIDES
LARVA RABDITOIDE LARVA FILARIFORME

TAMAÑO 200 um — 300 um 400 um — 500 um
CAVIDAD BUCAL Corta con extremo anterior romo No se observa y presenta en la parte
anterior un estilete.
LONGITUD DEL ESOFAGO 1/3 de la longitud del cuerpo 1/2 de la longitud del cuerpo
COLA Termina en punta Termina cortada
50
•
Nlinislerio h Szluil
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Versión N° 1
Laboratorio de

MUESTRAS DE HECES
TREMATODES
ESPECIE TAMAÑO FORMA COLOR OTRAS CARACTERISTICAS

Paragonimus 85 um x 53 Ovalado Pardo Puede encontrarse en esputo
westwrmani um asimétrico con amarillento
cáscara ondulada
y opérculo en uno
de sus polos.
Fasciola 145 um x 80 Ovalado alargado Pardo La cubierta del huevo es delgada y lisa; el
hepática um con un opérculo amarillento contenido del huevo se ve como acúmulos
en uno de sus de células no definidas
extremos
GENERALIDADES
ESPECIE LOCALIZACION FORMA VIA DE MECANISMO DE

INFECTANTE INFECCIÓN INFECCION
Enterobius Ciego y colón Huevo larvado Vías respiratoria y Inhalación e ingesta
vernicularis descendente oral alimentos contaminados.
Ascaris Luz del intestino del Huevo larvado Oral Ingesta de alimentos
lumbricoides yeyuno, hígado y en 2° estadio ( contaminados y tierra.
pulmón (Ciclo de L2)
Loos)
Trichuris trichura Colón Huevo larvado Oral Ingesta de alimentos
contaminados y tierra.
Uncinarias Superficie de la Larva Cutánea Fecalismo humano.
mucosa del yeyuno filariforme Larvas se encuentran en
(Ciclo de Loos) la tierra .
Paragonimus sp Pulmón Metacercaria Oral Cangrejos de agua
dulce crudos o mal
cocidos infectados.
Fasciola hepática Conductos biliares Metacercaria Oral Ingesta de plantas
contaminadas
Strongyloides Intestino delgado Larva Cutánea, Larvas se encuentran en
(duodeno yeyuno) y filariiforme autoinfección la tierra .
pulmón (Ciclo de
Loos)
51
• :1111in.
1aCI3M.f 5.0.W Da 10
11inisterio ele Salud
11011.11‘111111111
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 2
Fijadores más Utilizados para Preservar Muestras Fecales
Fijador Ventajas Desventajas

*Fijador más utilizado *No recomendable para
*Fácil de preparar tinciones permanentes como la
*Estable por mucho tiempo tricrómica de Gomoris
*Buena preservación de la
morfología de huevos, larvas y *Mala preservación de
quistes trofozoítos de protozoarios
Formalina al 10% *Conveniente para procedimientos
de concentración *Puede interferir con el PCR,
*Conveniente para las coloraciones sobre todo después del tiempo
de Kinyoun, Safranina y de fijación del extendido
Chromotrope
*Compatible con los kits de
inmunoensayo
*Fija y tiñe a los organismos *No recomendable para algunas

*Estable por mucho tiempo tinciones permanentes como la
MIF *Fácil de preparar Tricrómica de Gomoris
*Útil para los estudios de campo *Inadecuada preservación de
*Conveniente para procedimientos algunos trofozoítos de
(merthiolate-yodo-
de concentración protozoarios
formaldehído
*El yodo interfiere con otras
tinciones y Fluorescencia
*El yodo pude causar distorsión
del protozoario
*Conveniente para procedimientos *Requiere aditivos (como

de concentración y tinciones albúmina-glicerina) para la
permanentes adhesión de la muestra a la
SAF *Fácil de preparar lámina
*Buena estabilidad *La tinciones permanentes de
(acetato de sodio-ácido *Conveniente para tinciones de las muestras no son tan buenas
acético-formalina) Kinyoun, Safranina y Chromotrope como cuando son fijadas con
*Compatible con Kits de PVA o Schaudinn
inmunoensayo
52
eti
\ linisterio de Salud
Ei$1111110 UCteüt 511Mit h/C
Pemsollat Que Atendemógy...anna,
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Laboratorio de
Fijador Ventajas Desventajas
*Buena preservación de Quistes y *Inadecuada preservación de

trofozoítos de protozoarios. Huevos, larvas, coccidios y
microsporidios
*Fácil preparación de frotices para *Contiene Bicloruro de Mercurio
tinciones permanentes como la (VENENOSO)
PVA Tricrómica (preserva y adhiere los *Dificultad para preparar en el
organismos a las láminas). laboratorio
*Poco conveniente para
(polyvinyl-alcohol)
*La preservación es buena durante procedimientos de
varios meses concentración
*No puede usarse en Kits de
inmunoensayo
*Inadecuado para coloraciones
de Kinyoun, Safranina y
Chromotrope
*Buena preservación de Quistes y *Poco conveniente para

trofozoítos de protozoarios. procedimientos de
concentración.
*Fácil preparación de frotices para *Contiene Bicloruro de Mercurio
tinciones permanentes (VENENOSO)
de Schaudinn
*Inadecuada preservación de
huevos, larvas y coccidios y
microsporidios
*Poca adhesividad de las
muestras líquidas y mucosas a
las láminas
53
•
isozie
,mouco rwim
llinisterio de salud
'clame.. ye., ate.... yrlann,,
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 3
FLUJOGRAMA DE EXAMEN DIRECTO
EVALUACION DE CRITERIO PARA

UNA MUESTA PARASITOLOGICA
POE DE
RECHAZO
REGISTRO DE DATOS
SI
Procesamiento
GUÍA DE
RESOLUCIÓN DE
conforme
ALARMAS (anexo 2)
FIN -RESULTADO
ANALITICO
VALIDADO
54
• mut
'111{,i10 KICIall DE SAM Cit SSC
Nlinisierin ik Salud
/Si "Paill
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Versión N° 1
Laboratorio de
PROCESO ANALITICO DEL CODIGO: PRT-DIDAP-006

EXAMEN
COPROFUNCIONAL N° DE FOLIOS: 9

LIC.TM NORKA CRUZADO RISSO DRA. LILIAN PATIÑO GABRIEL
FECHA :
FIRMA :
Tecnólogo Médico
55
•
tn
mamalaüSiaLtitsi
ia
Ilínislerio di. Salud
110111F111~11-1111-
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
COPROFUNCIONAL

PROCEDIMIENTO COPROFUNCIONAL
PROPÓSITO REALIZAR PROCEDIMIENTO DE COPROFUNCIONAL
ALCANCE del INSN
MARCO LEGAL Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud. Reglamento DS 013-2012 AS
UNIDAD DE
MEDIDA
1.- N° de
1. % de veracidad de 1.Registro de resolución de 1.Tecnólogos
resultados resultados vs el N°
alarmas Médicos del área
de alarmas
NORMAS

56
• •Ik
:átala
Nlinislerio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
1- Muestra identificada para el procesamiento CPA

2- Procesamiento de los exámenes: pH, Thevenon, Sustancias Reductoras,
Sudan III, Reacción Inflamatoria y Examen Parasitológico (POE 06-15)
ENTRADAS

Previos (CPA)
SALIDAS

Tecnólogo Médico
ANEXOS:
ANEXO 1 TABLA DE INTERPRETACION DE REACCIONES BIOQUIMICAS
ANEXO 2 FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE COPROFUNCIONAL
57
•
W.1.9 fk
Nlinisterio Saltad
Vetsuna, qm. utendrinns pertmia.
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
COPROFUNCIONAL
OBJETIVO: El objetivo fundamental de este examen es realizar procedimientos para demostrar
problemas de mala digestión y malabsorción cualitativamente mediante los exámenes de : pH,
Thevenon, Sustancias Reductoras y Sudan III. . Este examen debe incluir exámenes tanto
macroscópicos como microscópicos y estos últimos deberán hacerse usando tinciones apropiadas.
MATERIALES:
CoprofuncionaL
• Tubos cónicos y tubos 16 x 150 mm.

• Gradilla para tubos.
• Indicador de pH ( azul de bromotimol)
• Reactivos para Thevenon (ácido acético, agua oxigenada y Piramidón 2%
• Reactivo de Benedict (para sustancias reductoras)
• Reactivo de Sudan III
• Colorante Azul de Metileno
• Mechero de Bunsen.
• Solución Salina 0.85%
• Lugol
• Laminas portaobjetos.
PROCESAMIENTO:
Las muestras deben de ser frescas, recién emitidas, si es posible de la primera deposición de la
mañana para que las alteraciones de orden químico y enzimático sean mínimas. Las heces no
deben estar mezcladas con orina. Evitar el uso de supositorios, laxantes de contenido aceitoso o
sustancias colorantes previamente al examen ya que alteran la visibilidad y dan falsos resultados.
• Este examen consta de 2 partes :
• El examen macroscópico o estudio de las características físicas de las heces.

• El examen microscópico.
Examen macroscópico: Debe considerarse las siguientes características físicas de las

heces: Forma , consistencia, color, moco, reacción (pH y sustancias reductoras), Sangre oculta y
elementos anormales.
a. Forma: Normalmente las heces son cilíndricas y de superficie lisa. Pueden presentarse
acintadas por disminución de la luz rectal, por proceso orgánico como el cáncer, por
espasmo anal. Unión de pequeñas bolas ó escíbalos en el estreñimiento crónico y en las
diarreas las heces han perdido su forma y adoptan la del recipiente que las contiene.
58
•
111,111.
Mni10 »Mal DE SAIL1 Da h
Ilinisterio de Salud
11
11111rNMIX
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
b. Consistencia: Depende del tipo y cantidad de alimento ingerido y sobre todo del agua que
contienen. El contenido de agua en las heces es de 70 a 80%. Pueden ser heces duras,
blandas, pastosas, líquidas.
c. color: Está dado esencialmente por los pigmentos normales: Estercobilina y

estercobilinógeno. Cuando hay predominio de estercobilina las heces son de color marrón y
si predomina el estercobilinógeno son de color amarillo claro. Variaciones: Gris masilla
(acolia), negras (melena), amarillo claro (dieta láctea), verdosa (ingestión excesiva de
verduras).
d. Moco: Normalmente no hay presencia de moco en las heces. Su existencia refleja un

estado de irritación intestinal.
e. Reacción (Ph) : El pH normal de las heces varía entre 6.8 y 7.3. Las variaciones son
debidas por lo general al tipo de dieta. En una dieta a base de carne la reacción es alcalina
y en una dieta vegetariana es ácida al igual que con la excesiva ingestión de grasas. El
estudio del pH debe practicarse lo mas pronto posible después de recibida la muestra ya
que las heces ácidas debido a la fermentación tras un tiempo prolongado, puede virar
fuertemente a alcalina; para esta prueba utilizamos el indicador de azul de bromo timol
agregándose 2 gotas a una emulsión de heces en tubo de prueba.
f. Sustancias Reductoras: La hidrólisis incompleta de los hidratos de carbono provocan

fermentación que continúa en el colon con formación de ácidos grasos inferiores tales
como ácido láctico y butírico dando heces ácidas con un pH menor de 5.5. En este caso se
deben investigar las "sustancias reductoras" en las heces utilizando el método de Benedict
donde las sustancias reductoras en las heces en presencia de sulfato de cobre en caliente
reducen los iones cúpricos en iones cuprosos evidenciándose un cambio de color que va
desde el color azúl, verde, amarillo, naranja o rojo según las cantidades de glucosa y de
otras sustancias reductoras presentes. Para esta prueba se adiciona 2m1 de reactivo de
benedict en un tubo de ensayo 18 x 100mm que se mezcla con 0.5 ml de una suspensión
de heces, se hace hervir por 5 min en baño maría o sobre una llama durante 2 min; se
retira el tubo y se lee de inmediato.
g. Sangre Oculta: La pérdida de sangre por el tubo digestivo se manifiesta en las heces de
modo característico dependiendo de la cantidad de la pérdida, del segmento del tubo
digestivo afectado y de la motilidad intestinal. La eliminación de heces negras o melena
habla a favor de hemorragia del tracto superior. La sangre roja, fresca, sin mezclarse con
las heces cubriéndolas solamente, suele proceder del recto por cáncer, pólipos o del ano
por hemorroides internos erosionados.
En los casos en que la presencia de sangre es dudosa y se desea determinar su existencia

se pueden realizar varias técnicas de examen que por su simplicidad son practicadas
rápidamente. Entre las más importantes consideramos: Thevenon, Bencidina, Hematest y
Guayaco. Nosotros utilizamos la técnica de Thevenon que consiste en colocar un poco de
heces en un tubo cónico disueltas con solución salina, adicionar 2 0 3 gotas de ácido
acético y mezclar. Luego agregar el agua oxigenada por las paredes del tubo y por último el
59
11111111
liSTWO NUM DE sko Da wls
Minislerio de Salud
1,,soims yyt• niquirwra
,arrsol;..is
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
alcohol piramidón y observar la formación de un halo en la interfase formada. Se informa el

resultado por cruces de acuerdo a la intensidad de la reacción.
h. Elementos anormales: la presencia de alimentos anormales sin digerir en las heces, pus o
sangre es manifestación de la existencia de algún proceso patológico en el tubo digestivo,
pues normalmente no debe estar presentes. El hallazgo de abundantes restos alimentarios
es prueba de insuficiencia digestiva. La pus por lo general se presenta en disentería bacilar
en caso de los niños.
Examen microscópico:
Comprende la investigación de quistes y trofozoitos de Protozoarios, huevos y larvas de

Helmintos, leucocitos (PMN) y piocitos,hongos ,grasas, fibras musculares, almidón, celulosa,
flora lodófila etc.
a. Investigación de grasa fecal: se realiza mediante la técnica de Drummey con el Sudán

III.(Investigación cualitativa de esteatorrea). Técnica: se toman las heces de la parte más
espesa con bagueta o gotero si está líquida .Se echa aproximadamente 0.5 cc heces
sólidas, o tres gotas de heces líquidas. Añadir ac. Acético al 36 % y homogenizar las
heces, añadir cuatro gotas de Sudán III y volver a homogenizar. Calentar suavemente con
un mechero. Observar al microscopio en 100 aumentos y 400 aumentos.
Interpretación: las grasas neutras presentes en las heces se colorean directamente con el
Sudán. Los jabones presentes son hidrolizados por el ácido acético liberándose ácidos
grasos que se colorean con el Sudán. Tanto las grasas neutras como los ácidos grasos
liberados toman el examen microscópico el aspecto de globulitos coloreados de rosado o
rojo. Se considera normal cuando los glóbulos de grasa son de 4 a 14 micras y con un
número máximo de 100 por campo de alto poder. Cifras mayores demuestran la existencia
de esteatorrea.
b. Investigación de leucocitos: indicado en los procesos diarreicos agudos y crónicos. Para la

investigación de leucocitos en heces se utiliza la coloración de Ziehl Nielzen como rutina ,
se observa los leucocitos (PMN) y captamos las coccidias si las hay. La presencia de
leucocitos indica la sospecha de gérmenes patógenos invasivos tales como Shigella,
Salmonella, Campylobacter, etc, los cuales deben ser comprobados mediante el
coprocultivo ( ver manual). La ausencia de leucocitos indica enfermedad viral o por
toxinas.
c. Almidón: Puede encontrarse como almidón intracelular o incluido (células de feculento) y

como almidón libre (gránulos). Su número depende de la cantidad de ingesta de cereales
frutas o tubérculos. Estos aparecen casi negros o azul al colorearse con lugol. Su
presencia en las heces no tiene significación clínica.
60
e
Ministerio de Salud
PeJsonal yur Jtendmans perennivc
Departamento de
Laboratorio de
d. Celulosa, flora yodófila, hematíes: La presencia de celulosa en las heces indica la ingesta
de alimentos que la contienen en regular cantidad como las frutas, verduras, cereales, etc.
Se observa al microscópio como restos vegetales de diversa morfología. La flora yodófila
está constituida por bacterias, cocos, clostridios, leptotrix, etc. De gran capacidad
fermentativa por lo que está presente en toda diarrea por fermentación. Se tiñe con el
Lugol de color azul negruzco. Los hematíes son fáciles de reconocer y reflejan pérdida
sanguínea microscópica en algún tramo del tubo digestivo. Deben ser observados en
heces recientemente emitidas, pues luego de un tiempo se deforman.
e. Hongos: Pueden encontrarse en el tubo digestivo como saprofitos y ocasionalmente como

patógenos , como en el caso de la Cándida albicans, hallándose por lo general en
pacientes que han recibido tratamiento antibiótico prolongado, quimioterápico o en los
estados de inmunosuficiencia. Al microscopio se observan los elementos levaduriformes
característicos con gemación o sin gemación (blastosporos), pseudohifas, etc .
f. Examen Parasitologico directo: (POE-15)
61
11111
Híoiaerio 414. Salud 1110~11/1111
1
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 2
INTERPRETACION DE SUSTANCIAS REDUCTORAS
RESULTADO (PRESENCIA DE CONCENTRACION

COLOR GLUCOSA) APROX.
NEGATIVO Ogr/dI
AZUL
TRAZAS 0.25gr/d1
AZUL VERDOSO
1(+) 0.5gr/dI
VERDE
2(++) 0.75gr/dI
CASTAÑO - MARRON
3(-H-+) 1gr/dI
AMARILLO
NARANJA -
4(++++) 2gr/d1
ROJO LADRILLO
REACCION pH
pH COLOR
ACIDO AMARILLO
NEUTRO VERDE
ALCALINO AZUL
62
Nliid lt io de salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 3
FLUJOGRAMA DE EXAMEN COPROFUNCIONAL
INICIO CPA
CONFORME

UN EXAMEN COPROFUNCIONAL
NO
POE DE
RECHAZO
REGISTRO DE DATOS
Procesamiento
SI GUÍA DE
RESOLUCIÓN DE
ALARMAS (anexo 2)
NO
V
FIN -RESULTADO
ANALITICO
VALIDADO
63
•
Nlinislerio de Salad
Persor. pue alcndrinoq
Departamento de
Laboratorio de

METODO DE
CONCENTRACION N° DE FOLIOS: 7

LIC.TM NORKA CRUZADO RISSO DRA. LILIAN PATIÑO GABRIEL FECHA :
FIRMA :
Tecnólogo Médico Jefe de Servicio de Microbiología
64
• NUICtill CE $1.10 Da 16i5
Ilín i,lerio de Sis lutl
arkenil
01.4.
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
METODO DE CONCENTRACION

METODOS DE CONCENTRACION
PROPÓSITO REALIZAR PROCEDIMIENTO DE METODOS DE CONCENTRACION
ALCANCE del INSN
Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud. Reglamento DS 013-2012 AS

MARCO LEGAL
UNIDAD DE
MEDIDA
1.- N° de
1. % de veracidad de 1.Registro de resolución de 1.Tecnólogos
resultados vs el N°
resultados alarmas Médicos del área
de alarmas
2. Frecuencia de 2- Registro de resultado de 2- Tecnólogo Medico
2- °/ci de resultados
resultados de pánico pánico del área.
de pánico
NORMAS

65
•
islerio de Salud
Departamento de
Laboratorio de

2- Procesamiento del método de concentración.
ENTRADAS

Previos (CPA)
SALIDAS

Tecnólogo Médico
ANEXOS:
ANEXO 1 FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN
66
•
‘linslerio de h¿litid
Departamento de
Laboratorio de
OBJETIVO: El objetivo fundamental de los métodos de concentración es conocer las diferentes

técnicas utilizadas en la identificación de parásitos intestinales de importancia clínica en el hombre
, lo cual permite corroborar el hallazgo del método directo y conocer la intensidad del
enteroparasitismo.
1. MATERIALES:
• MiniParasep:
-Sistema miniparasep de concentración para parasitos fecales.
-Suero Fisiológico.
-Baguetas o bajalenguas.
- Pipetas descartables de plástico.
-Láminas y laminillas.
-Centrífuga para 3000 rpm.
• Método de Baerman:
-Suero fisiológico a 37° C.
-Copas.
-Rejillas de alambre 10x4.
-Gasa.
-Bagueta de vidrio.
-Pipetas de plástico Pasteur.
• Método de Sedimentación espontánea:

- Suero fisiológico (S.F).
- Tubos cónicos con tapa.
- Gasa.
-Gradilla.
- Lugol.
- Laminas y laminillas.
- Baguetas
-Pipetas de plástico.
• Técnica de Sedimentación rápida de Lumbreras:
-Colador de plástico.
- Frascos grandes de boca ancha (300cc) o vasos cónicos de aprox. 250cc.
de capacidad,
-Agua potable filtrada o destilada.
67
d(•'alud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
2. PROCEDIMIENTOS:
2.1 Miniparasep:
El Método del Concentrador Fecal de Parasitos Miniparasep emplea el

principio de la Técnica de la Sedimentación del Formol-Eter de Ridley-Allen.
Es un sistema cerrado que consiste en un compartimiento en el que se
mezclan las heces con Suero Fisiológico el cual es sellado con el cono filtro-
dedal de sedimentación sobre el compartimiento de la mezcla. El sellado es
mediante un sistema aire líquido que previene el lanzamiento del material
biodesechable. Se agita manualmente o con un Vortex para emulsionar la
muestra, después el tubo concentrador se invierte y se centrifuga a 3000
r.p.m. por 1 min.
La mezcla es filtrada a través del filtro — dedal, que está hecho de polietileno
de alta densidad con dos etapas de filtración, la primera es un filtro 3D que
retiene las partículas grandes evitando la oclusión de los poros del otro filtro
que son de 425um. Después de la centrifugación el compartimiento de
mezcla es destornillado cuidadosamente junto con el filtro-dedal y es
desechado. Se decanta el líquido sobrenadante del sedimento y se procede
a la identificación microscópica.
2.2 Método de Baerman:
Aprovecha la capacidad de migración de trofozoítos y larvas, como

Balantidium y Strongyloides, hacia el fondo de la copa (hidrotropismo,
geotropismo, termotropismo).
• Colocar 5-10 g de heces en una copa que contiene rejilla y gasa doblada.
• Verter por las paredes de la copa, solución salina a 37°C, hasta cubrir las
heces. Dejar en reposo a T° ambiente por 30 a 45 minutos.
• Retirar rejilla y heces, absorbiendo luego con pipeta, parte del sedimento del
fondo y depositándolo en una lámina excavada de Adams o en un 68stereo.
• Observar al microscopio, con menor aumento (25x, 100x) o un microscopio
68stereoscópico.
Super Baermann : Es la prueba de Baermann pero con la diferencia que la

copa se lleva a estufa de 37°C y la lectura se hace en 1 hora.También
puede ser empleada usando esputo pero la lectura se hace en 2 horas.
68
•
Nlinisterip de Salud
pe,snnas
Departamento de
Laboratorio de
Estas técnicas se utilizan en los casos sospechosos o de control de

autoinfestación por Strongyloides stercoralis .
2.3Método de Sedimentación Espontánea:
Este método fue ideado por el Dr.Tello que se basa en el uso de Suero
fisiológico a 37°C, detectando con alta sensibilidad diversos enteroparásitos,
desde amebas hasta huevos y larvas.
• Homogenizar 2-5g de heces con 10-20m1 de solución salina fisiológica.

• Verter la mezcla en un tubo cónico de centrífuga de 50m1 de capacidad,
filtrándola a través de gasa.
• Completar el volumen del tubo con más solución salina y tapar el mismo,
herméticamente. Agitar y dejar reposar por 45 minutos como mínimo.
• Tomar con una pipeta dos alícuotas: una de la mitad del sedimento y otra
del fondo del tubo. Colocarlas en portaobjetos diferentes y a la alícuota del
fondo agregarle gotas de Lugol, luego cubrirlas con laminillas .
• Observar al microscopio (100x, 400x) .
2.4Técnica de Sedimentación rápida de Lumbreras
Para detección de huevos de enteroparásitos de mayor densidad (Fasciola,

Paragonimus, etc.).
• Homogenizar 4-8 g. de heces con 10-20 ml. De agua corriente filtrada o

destilada.
• Trasvasar la mezcla a un recipiente de 200-300m1 de capacidad,
tamizándola con un colador.
• Completar el volumen con agua corriente filtrada y dejar reposar por 20
minutos.
• Decantar los 2/3 del sobrenadante y volver a completar el volumen con más
agua corriente filtrada o destilada. Repetir lo mismo hasta que el
sobrenadante quede limpio, a intervalos de 5 minutos.
• Verter el último sedimento a una placa petri. Observar al estereoscopio .
69
•
llinhderio de Salud
Departamento de Manual de Procedimientos

Laboratorio de
ANEXO 1
FLUJOGRAMA DE MÉTODOS DE CONCENTRACION
INICIO CPA
CONFORME
r-

UNA MUESTA PARA METODOS DE
CONCENTRACION
NO POE DE
RECHAZO
SI
REGISTRO DE DATOS
Procesamiento
51 GUÍA DE
RESOLUCIÓN DE
ALARMAS
FIN -RESULTADO
ANALITICO
VALIDADO
70
0
4rIN Lit
Nlinislerio de Salud oarauTolamileamun rai Y*.
IN"
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
CONTROL DE CALIDAD DE CODIGO: PRT-DIDAP-008

MEDIOS DE CULTIVO
MICROBIOLOGICOS N° DE FOLIOS: 17
Aprobado por: Revisado por:

Elaborado por: Dra. Lilian Patiño Gabriel FECHA:
Lic. TM María del Carmen Quispe Manco FIRMA:
Lic.TM Roberto Rojas León
71
Nlinisterio de timad
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

NOMBRE DEL Control de Calidad Medios de FECHA: 25/05/2015
PROCEDIMIENTO Cultivo Microbiológicos CODIGO: PRT-DIDAP-008
PROPÓSITO Realizar el procedimiento de Control de calidad de Medios De cultivo

MARCO LEGAL 2012 AS
UNIDAD DE
INDICADOR FUENTE
MEDIDA RESPONSABLE
1.- N° de
1.-Porcentaje de interpretaciones
veracidad de versus N° 1-Registro de revisión de 1-Tecnólogos
interpretación. limitaciones del limitación de procedimiento Médicos del área
procedimiento.
NORMAS

72
•
Nlini,lerio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de

2. Proceso Cultivo de la Cepa de referencia o de trabajo
5. Si existe una disconformidad proceder con los Anexos 3
ENTRADAS
Previos (CPA)
SALIDAS

analítico validado
ANEXOS:
ANEXO I LISTADO DE CEPAS

ANEXO 2 USO Y CALIBRACION DE ASAS MICROBIOLOGICAS
ANEXO 3 FALLAS Y CAUSAS EN LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
73
Nlini,lerio <le Salud
Departamento de
Versión N' 1
Laboratorio de
Objetivo y alcance
El objetivo de este documento es normalizar las actividades que deben realizarse en el

laboratorio de Microbiología para controlar la idoneidad de los medios de cultivo y
reactivos utilizados, antes de su puesta en uso. Este control abarca tanto a los preparados
en el propio laboratorio como los preparados listos para su uso por las casas comerciales.
La verificación de los medios y reactivos, indicación de uso y seguimiento debe estar
adecuadamente documentada.
FUNDAMENTO
El control de calidad de los medios de cultivo y reactivos forma parte del programa de
control de calidad interno del laboratorio de microbiología para asegurar que la
información generada por el laboratorio es exacta, segura y reproducible.
La elaboración y control de los medios y reactivos deben ser realizados por personal
tecnólogo médico con experiencia en Microbiología.
Como norma general es conveniente seguir estos principios:
• El personal tecnólogo médico de la sección de control de calidad es responsable de
rellenar los registros de control de calidad en los formatos apropiados .
• Es responsable de mantener los registros de una forma organizada que facilite el acceso
y la inspección de los mismos.
• Los registros deben guardarse durante un periodo mínimo de 2 años.
411, Control de Análisis Previos (CPA)
1. Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo

deshidratados deben almacenarse siempre en lugares frescos, a temperatura
ambiente y protegidos contra la humedad y la luz.
2. Utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios elaborados en
polvo tienen una vida útil de al menos 3 años. El material que ha sufrido cambios
substanciales, tales como hidratación, endurecimiento y cambio de color, deben
descartarse.
3. El grado de disolución de un medio deshidratado, así como la eficacia del mismo
ya preparado, depende en gran medida del procedimiento empleado en la
74
•
NH111.4(410 dr S:dud
V< al out atmiclemo,érso.s
Departamento de
Laboratorio de
rehidratación. Se recomienda utilizar agua desionizada, recién destilada o de

osmosis inversa..
4. La mayoría de los suplementos se guardan en refrigeración.
5. Se debe mantener:
• un registro o número de lote de cada frasco de medio de cultivo deshidratado
• con el nombre del producto
• nombre y número telefónico de la casa proveedora
• fecha de recibido
• fecha de expiración
6. Cuando se va a esterilizar, debe asegurarse en seguir las instrucciones de tiempo,
presión y temperatura para la obtención de medios de cultivo óptimos. Una
temperatura de 121 °C , presión de 15 libras y un tiempo de esterilización de 15
minutos, son suficientes para la mayoría de los medios.
7. El medio esterilizado debe ser enfriado a 45°-60°C en un baño maría, para evitar la
formación de agua de condensación. Al ser vertidos en las placas Petri, evitar la
formación de burbujas y coágulos. Durante el proceso de reparto, debe tomarse
una muestra del medio para realizar el control de calidad por apariencia, esterilidad
y eficiencia.
8. El medio de cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea de
inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su
utilidad durante un periodo de tiempo. El almacenamiento a 4°C es el mejor para
la mayoría de los medios. Sin embargo, aquellos que contienen Tioglicolato, deben
guardarse a temperatura ambiente.
9. Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz
puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecación se aconseja
que se guarden en bolsas plásticas bien cerradas. Las placas Petri almacenados
así, deben mantenerse con el fondo hacia arriba.
10.Dado que los medios almacenados en refrigeración, cuando pasan a temperatura
ambiente tienden a formar agua de condensación en la superficie, se recomienda
poner las placas Petri en la incubadora a 35°C por 30 minutos, colocándolos con
el fondo hacia arriba para obtener una superficie seca. Esto es particularmente
importante para que el agua no afecte la individualidad de las colonias en el
aislamiento o en los casos de pruebas de sensibilidad a los antibióticos en los que
el exceso de agua puede afectar la dilución de las colonias y por ende la lectura
del halo de inhibición.
11.Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por
eficiencia o calidad, mediante la inoculación de microorganismos cuyo
comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas.
Puede utilizarse para ello cepas de trabajo o cepas control comerciales ( ATCC ).
Se debe realizar el registro de los resultados obtenidos en las cartillas
correspondientes a cada medio.
12.Rotular todos los medios preparados, tanto en placas Petri como en tubos,
indicando además, la fecha de preparación y expiración.
75
•
Nlinislerio dr Salud
Departamento de
Laboratorio de
13.Al colocar en la refrigeradora los medios preparados, debe colocar los de más
reciente preparación al fondo y los mas viejos adelante. Evite el congela miento de
los medios preparados o la sangre de carnero.
14.Se debe mantener:
• un registro o número de lote de cada frasco de medio de cultivo
deshidratado
• con el nombre del producto
• nombre y número telefónico de la casa proveedora
• fecha de recibido
• fecha de expiración
PRUEBAS BASICAS DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS PREPARADOS:
❖ Ph ( registrar de cala lote de medio preparado, indicado en las instrucciones de

cada frasco de medio de cultivo comercial.)
❖ Esterilidad:
Tomar una muestra del 5% de los lotes de 100 o menos placas/tubos y una
muestra de 10 de los lotes de más de 100 placas/tubos.
Incubar durante 48h a la T° a la que va a ser incubado en el uso con muestra
clínicas y posteriormante otras 48 h a Ta ambiente.
❖ Apariencia :( observar cambio de color, coágulos, no uniformidad, líquido de
condensación abundante, hemólisis, burbujas)
❖ Performance: Capacidad de crecimiento y reacción ( con las capas ATCC y las
cepas de trabajo)
PROCESAMIENTO
Preparación del inóculo

(Método semicuantitativo: es el más usado)
• Para controlar las propiedades nutritivas:

Hacer una suspensión de la cepa al 0,5 Mcfarland en solución salina. Diluir de aquí
al 1/100 (0.1 mi de suspensión + 9,9 ml de solución salina). Inocular el medio con
10 microlitros de esta suspensión.
• Para controlar las propiedades selectivas:
Hacer una suspensión de la cepa al 0,5 Mcfarland en solución salina. Diluir de aquí
al 1/10 (0.1 ml de suspensión + 0,9 ml de solución salina). Inocular el medio con 10
microlitros de esta suspensión.
• Para controlar los medios líquidos:
Hacer una suspensión de la cepa al 0,5 Mcfarland en solución salina. Inocular el
medio con 10 microlitros de esta suspensión.
• Para controlar las propiedades bioquímicas:
Hacer como en el uso con muestras clínicas
76
Nlínisterio de Salud
nwi
ata
NrnimactA Eskoomm
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Siembra de los medios
• Medios en tubo : se inocularán con la técnica habitual utilizada en la práctica con

muestras clínicas
• Medios en placa:
Método semicuantitativo: se sembrarán con asa calibrada (10 microlitros) en estría
Incubación de los medios
Incubar en las condiciones de tiempo, atmósfera y 7 indicadas para cada medio.
Pruebas de control de calidad de rendimiento en medios de cultivo de rutina :
❖ Bile Esculin agar

❖ Brilliance agar
❖ Campylobacter agar
❖ Chocolate agar
❖ Citrato agar
Chrome agar
❖ Haemophilus Isolation agar
• Haemophilus Test Medium
❖ LIA agar
❖ Manitol agar
❖ MacConkey agar
77
i
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
❖ MacConkey- Sorbito! agar

❖ Mueller Hinton agar
❖ Butzler Campylobacter agar
❖ SIM agar
❖ Salmonella Shigella agar
❖ TCBS agar
❖ TSI agar
❖ Tripticasa soya agar
❖ Urea agar
❖ XLD agar
ANEXO 1
Listado de cepas para control de algunos Medios de Cultivo más comunes
CEPAS ATCC
CODIGO Microorganismo ATCC Modo de T° Fecha de Lote Cantidad Consum
Conservación Vencimiento o
B30 Klebsiella 70060 Liofilizad 4 jul-15 784- 12

pneumoniae 3 o 37-1
B31 Streptococcu 49619 Liofilizad 4 may-15 947- 6
s o 43-3
pneumoniae
B35 Haemophilus 49766 Liofilizad 4 mar-15 919- 5
influenzae o 48-4
B36 Pseudomona 27853 Liofilizad 4 mar-15 353- 12
s aeruginosa o 147-
2
B38 Issatchenkia 6258 Liofilizad 4 ago-15 227- 6
orientalis o 26-1
B40 Candida 22019 Liofilizad 4 may-15 726- 6
parapsilosis o 34-3
78
•
Nlinislerio de Salud
reisolta pm, atendrum,
Departamento de
Laboratorio de
CEPAS DE TRABAJO
CODIGO MICROORGANISMO Tipo Microorg. Conservación T° Caracteristica
B50 Klebsiella pneumoniae BGN TSB+glicerol -20 PEED 2014- KPC
B51 Proteus vulgaris BGN TSB+glicerol -20
B52 Proteus ~bilis BGN TSB+glicerol -20
B53 Morganella morganii BGN TSB+glicerol -20
B54 Providencia stuarttií BGN TSB+glicerol -20 PNCQ LT 363
B55 Shigella flexneri BGN TSB+glicerol -20
B56 Salmonella enteritidis BGN ' TSB+glicerol -20 _grupo C1
B57 Enterobacter cloacae BGN TSB+glicerol -20
B58 Citrobacter freundii BGN TSB+glicerol -20
B59 Escherichia coli 0 157 BGN TSB+glicerol -20
B60 Staphylococcus epidermidis CGP TSB+glicerol -20
B61 Staphylococcus hominis CGP TSB+glicerol -20
B62 Shigella sonnei BGN TSB+glicerol -20
B63 Acinetobacter iwoffi BGN TSB+glicerol -20
B64 Stenotrophomonas maltophilia BGN TSB+glicerol -20
B65 Vibrio cholerae BGN curvo Triptona Ambiente
B66 Vibrio parahaemolyticus BGN Triptona Ambiente
B67 Aeromona sobria BGN Triptona Ambiente
B68 Aeromona caviae BGN Triptona Ambiente
B69 Yersinia enterocolitica BGN TSB+glicerol -20
B70 Serratia liquefaciens BGN TSB-Fglicerol -20
B71 Listeria monocytogenes BGP corto ASC 35-37
B72 Streptococcus pyogenes CGP cadena ASC 35-37
B73 Streptococcus agalactiae CGP cadena ASC 35-37
B74 Neisseria sp DCGN ASC 35-37
79
•
.11.111
4i~
Ministerio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 2
USO Y CALIBRACION DE ASAS MICROBIOLOGICAS
I. PRINCIPIO
El volumen de fluido transferido por una asa calibrada depende del volumen y la forma del
recipiente que contiene el líquido y la dirección y profundidad del asa cuando es
introducido en el líquido. La variabilidad de los resultados es por la tensión superficial y la
superficie humedecida del asa. Líquidos en recipientes con diámetros pequeños (<1 cm)
tienen alta tensión superficial, el cual resulta en una menor transferencia, dado que la
fuerza vidrio-liquido y plástico-liquido (fuerza adhesiva) son mayores que las fuerzas
liquido-liquido (fuerza cohesiva). Cuando el alambre por encima del aro del asa es
humedecido por la inmersión profunda en el líquido, exceso de líquido drena por el
alambre y aumenta el volumen transferido.
Las asas cuantitativas son usadas comúnmente para realizar cultivos cuantitativos y
verificar el inoculo de las pruebas de susceptibilidad. Las asas cuantitativas son menos
exactas que las pipetas, estas todavía son una excelente manera para realizar cultivos
semicuantitativos o diluciones. Las asas cuantitativas son usadas cuando el error 20%
es aceptable. Las asas son calibradas por método colorimétrico o por método de la broca.
II. TIPOS DE ASAS
a. El volumen es 1 o 10 pl
b. Las asas reusables son hechos de alambre, usualmente platino o nicrom
c. Las asas descartables son hechos de plásticos
III. MATERIALES
Método colorimétrico
a. Agua destilada
b. Colorante solución de azul de Evans al 0.75% (CAE)
i. Solución Stock
1. Adicionar 0.75 g de CAE a 100 ml de agua.
2. Filtrar la solución con papel filtro Whatman N° 40
3. Guardar a temperatura ambiente en frasco oscuro por 6
meses
c. Colorante Violeta de Genciana solución comercial al 1 — 2 %, solución stock

(opcional)
80
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Laboratorio de
i. Soluciones de trabajo
1. Prepare diluciones del colorante (azul de Evans o violeta de
genciana) en agua destilada para obtener las diluciones
1:500, 1:1000, 1:2000, y 1:4000, diluyendo 1 ml de la
solución stock del colorante en 49 ml de agua destilada.
2. Diluya 1 ml de la dilución 1:50 en 9 ml de agua destilada.
Esta es una dilución 1:500.
3. Realizar diluciones seriada al doble empezando con 5 ml de
•
la dilución 1:500 y 5 ml de agua destilada, para preparar el
resto de las diluciones.
4. Guardar las 4 diluciones hasta por 6 meses pero prepare
nueva diluciones si la lectura de algunos de ellos difiere el
3% de la lectura previa.
d. SUMINISTROS
i. Cubetas de vidrio cuadradas con 1 cm de trayectoria de luz. Use la
misma cubeta para todas las medidas.
ii. Cristalería: varias tubos limpios de 15 ml de volumen, varias pipetas
de 1 y 10 ml.
iii. Espectrofotómetro de buena calidad con las siguientes
especificaciones: lineal hasta 2.0 de unidades de absorbancia a 350
nm; ancho de banda espectral, 5 a 2nm (348 a 352 nm); precisión
de 5 0.001 A/h; exactitud de longitud de onda seleccionada, 5 1 nm.
IV. CONTROL DE CALIDAD
a. Consideraciones generales
111 i. Asas reusables

1. Inspeccionar las asas calibradas regularmente para
confirmar que ellos permanecen redondas y están libres de
curvas, abolladuras, corrosión o material incinerado.
2. Verificar mensualmente las asas para garantizar que el
volumen transferido es exacto.
ii. Verificar el volumen transferido del asa descartable tras recibir un
nuevo lote de asas. El desempeño satisfactorio de varios lotes, y el
certificado del fabricante de un control de calidad hecho en casa
elimina la necesidad de la calibración de rutina.
b. Métodos para la calibración de asas
81
•
Minislerio de Salud
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Laboratorio de
Procedimiento de calibración por el método colorimétrico

i. Colocar el espectrofotómetro en modo absorbancia, usando una
longitud de onda de 600 nm.
ii. Calibrar a cero con agua destilada
iii. Medir y anotar la absorbancia de cada dilución del colorante (1:500,
1:1000, 1:2000, 1:4000)
iv. Graficar la densidad óptica (eje vertical) contra cada una de las
concentraciones de las diluciones (eje horizontal) en la hoja de
trabajo (ver grafica ). Dibujar una sola línea que más se acerque a
los cuatro puntos para construir la curva de calibración.
v. Usando el asa de 1p1, transferir 10 asadas de la solución colorante
stock elegido a 10 ml de agua destilada. Después mezclar
completamente, medir y anotar la absorbancia de esta solución. La
absorbancia debería corresponder a la dilución 1: 1000 en la curva
de calibración.
vi. Preparar y evaluar tres soluciones de prueba adicionales para un
total de cuatro lecturas. Anotar las lecturas en la hoja de trabajo y
determinar el promedio. Luego calcular el porcentaje de inexactitud
siguiendo las instrucciones de la hoja de trabajo.
vii. Si el promedio de las lecturas es mayor de ± 20% de la dilución de
la solución stock 1:1000, el asa es inexacta. Seguir con la acción
correctiva.
viii. Para calibrar el asa 10 pl, transferir 10 asadas de la solución stock
del colorante elegido en 100 ml de agua destilada usando el asa de
10 pl. Después mezclar completamente, medir y anotar la
absorbancia de esta solución. Prepare y evalúe tres soluciones de
prueba adicional para un total de cuatro lecturas. Luego calcule el
porcentaje de inexactitud siguiendo las instrucciones de la hoja de
trabajo. La lectura final debería ser la misma que la del asa de 1p1,
por ejemplo ± 20% de la dilución 1:1000 de la solución stock.
c. Acción correctiva
i. Si la carga del asa no cae dentro del límite de tolerancia
especificado, el asa puede ser descartado y reemplazado o
reparado y calibrarlo nuevamente.
82
• Ata
laCINAL SAIO DEL
11inisterio de Salud
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Laboratorio de
ii. Reparar mediante inmersión en arena fina para remover depósitos,

y limpiarlo humedeciendo con alcohol y luego flamearlo.
iii. Las asas pueden ser retornados a su diámetro calibrado usando
brocas de 1.5 mm de diámetro para asas de 1p1 y brocas de 4 mm
de diámetro para asas de 10p1. Las asas arregladas deben ser
calibradas antes de ser puesto en servicio nuevamente.
iv. Para las asas descartables inexactas, contactar con el proveedor
para reemplazarlos.
V. PROCEDIMIENTO PARA EL USO DEL ASA
a. Para asas reusables, flamear e y enfriar antes de la primera y después de
cada transferencia. Use una nueva asa descartable no humedecida para
cada transferencia.
b. El líquido debería estar en un recipiente de boca ancha (diámetro >1 cm).
c. Rotar la muestra en el recipiente para mezclar la suspensión bacteriana de
manera uniforme.
d. Mantener el asa verticalmente, e introducirlo el aro del asa justo por debajo
de la superficie del líquido. Evitar alguna burbuja en el menisco del líquido.
e. Verificar para asegurar que ninguna burbuja están dentro del asa.
f. Mover el asa hacia arriba y hacia abajo solamente.
g. Transferir el contenido del asa a la placa contactando el líquido sobre la
superficie del agar en la placa, hasta que el líquido ya no sea visible en el
asa. Diseminar con el asa o, para una mayor exactitud, diseminar con una
varilla doblada (asa de "Drigalski").
VI. LIMITACIONES
Asas cuantitativa, tanto descartables y reusables, serian groseramente inexactas si
burbujas están presentes en la película del líquido transferido. Evitar la formación de
burbujas cuando se agita el líquido. Inspeccionar cuidadosamente que el asa cargada
no presente burbujas. Remover las burbujas por flameo (asas reusables),
reemplazando (asas descartables) o por reinmersión (para cualquiera de las asas).
VII. REFERENCIAS
3. Albers AC, Fletcher RD. 1983. Accuracy of calibrated-loop transfer. J Clin Microbiol.
18:40-42.
4. Clarridge JE, Pezzlo MT, Vosti KL. Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of urinary
tract infections. 1978. Weissfeld AS (Coordinating ed.). American Society for
Microbiology, Washington, D. C.
83
Nlifdsterio de Salud
AMI
Qiio atrntlegnon
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Laboratorio de
HOJA DE TRABAJO 1
Calibración colorimétrica de asas cuantitativa
Volumen del asa Fecha

Fecha de puesto en uso Iniciales del operador
Fabricante del asa N° de lote
Muestra Absorbancia Cálculos

N°
1 Promedio menos la (a)
Absorbancia estándar
diluida 1:1000
2 Divide (a) por la estándar de (b)
absorbancia 1:1000
3 % de inexactitud: multiplicar (c) %
(b) por 100
4 El valor (c) debe ser ± 20%: Es aceptable?
SI/NO
Suma de las
4 lecturas
Promedio
(dividir entre
4)
Acción Correctiva:
84
•
de talud
Departamento de
Laboratorio de
Revisado por:
Fecha:
Curva de Calibración:
VIDNVAMOSff V
1/4000 1/2000 1/1000 1/500
DILUCION
85
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Laboratorio de
ANEXO 3
FALLAS Y CAUSAS EN LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO :
Valor de Ph incorrecto:
4- Medir el Ph por encima de los 25°C.

Sobrecalentamiento en la esterilización, vuelta a fundir o calentamiento
prolongado a 50°C.
4- Solución incompleta del medio.
4- Mala calidad del agua.
Recipiente mal lavado o con residuos químicos.
4- Mala conservación del medio deshidratado o vencido.
Turbidéz o precipitación :
4- Mala calidad del agua.

Sobrecalentamiento.
Ph incorrecto.
4- Solución incompleta.
Oscurecimiento :
Sobrecalentamiento.
4- Solución incompleta.
4 Alteración del Ph.
Gel blando :
4 Bajo porcentaje de agar en el medio.

4- Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos.
4- Sobrecalentamiento.
4- Mala homogenización del medio.
4 Exceso de agua.
Crecimiento bacteriano pobre :
4- Exceso de calentamiento.
4- Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente.
4 Alteración en el Ph.
86
buliona, out atenartnn,
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ACCIONES CORRECTIVAS
Informes deficiencias identificadas por el usuario. El usuario debe realizar lo siguiente:
• Identificar y / o corregir la causa de una falla del medio de cultivo.
Documentar todas las actividades.
• Notificar al fabricante y / o distribuidor. Documentar la respuesta del
fabricante / del distribuidor y la acción correctiva.
• Reemplazo de los medios de cultivo depende de la naturaleza del problema
87
i
(4,
Ilinisterio de salud
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Conformidad Revisar Anexo 3 y 4
Resultado validado
88
gri III
Nlinislerio tic Salud
j's"'1°~1"
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CONTROL DE CALIDAD DE CODIGO: PRT-DIDAP-009

ANTIBIOGRAMA POR
DISCO DE DIFUSION N° DE FOLIOS: 17
ELABORADO POR: REVISADO POR: APROBADO POR:

Dra. Lilian Patiño Gabriel
Lic. TM María del Carmen Quispe Manco FECHA:
Lic.TM Roberto Rojas León FIRMA:
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CONTROL DE CALIDAD DE ANTIBIOGRAMA POR DISCO DE DIFUSION
NOMBRE DEL Control de Calidad de I FECHA: 25/05/2015

PROCEDIMIENTO Antibiograma por Disco Difusión CODIGO: PRT-DIDAP-009
PROPÓSITO Realizar el procedimiento de Control de calidad de Antibiograma por Disco Difusión
Debe ser cumplido por el personal Tecnólogo Médico del Servicio de Microbiología del INSN
ALCANCE
MARCO LEGAL 2012 AS
UNIDAD DE
MEDIDA
1.- N° de
interpretaciones
1.-Porcentaje de veracidad 1-Registro de revisión de 1-Tecnólogos
versus N°
de interpretación. limitación de procedimiento Médicos del área
limitaciones del
procedimiento.
NORMAS

90
•
evN lit ~di
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Ministerio (14 salud M ~LDE illiilO
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Laboratorio de
INICIO cepa en condiciones adecuadas para el cultivo

2. Procedimiento: Proceso de Cultivo de la Cepa de referencia o de trabajo
5. Si existe una disconformidad proceder con los Anexos 2
ENTRADAS
Control de Análisis Previos • CPA Diaria Proceso analítico

(CPA)
SALIDAS

analítico validado
ANEXOS:
ANEXO 1 : CEPAS CONTROL - CEPAS ATCC

ANEXO 2: ACCIONES CORRECTIVAS PARA CONTROL DE CALIDAD DE DISCOS DE SENSIBILIDAD
ANEXO 3: FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DEL ANTIBIOGRAMA POR EL METODO DE DISCO DIFUSION DE
SENSIBILIDAD
91
•
NrIttli011ACKU. 1,11,11541 kiht
Ministerio de salud
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Laboratorio de
Objetivo: Realizar los diferentes exámenes para un correcto control de calidad del Agar
Mueller Hinton medio standarizado para la susceptibilidad antimicrobiana por el método
de Disco Difusión y de los discos de sensibilidad.
Control de Calidad del Mueller Hinton

Los métodos descritos aquí deben ser seguidos detalladamente para obtener resultados
reproducibles. El método que actualmente recomienda el Sub Comité de Ensayos de
Susceptibilidad de CLSI está basado en el método originalmente descrito por Bauer et al.,
(método de Kirby-Bauer). Este es el método de difusión en disco en que se han
desarrollado estándares para su interpretación y está apoyado por datos clínicos y de
laboratorio.
MEDIO AGAR MUELLER - HINTON

De los muchos medios disponibles, se considera el Agar Mueller - Hinton como el mejor
para pruebas de susceptibilidad de rutina de bacterias no fastidiosas por las siguientes
razones:
-Reproducibilidad aceptable lote a lote para ensayos de susceptibilidad.
-Es bajo en inhibidores de sulfonamida, trimetoprim, y tetraciclina.
-Crecimiento satisfactorio para la mayoría de los patógenos no fastidiosos.
Sólo las formulaciones del medio Mueller - Hinton que han sido controladas con la cepa
de referencia de acuerdo al CLSI pueden ser usados.
PROCESAMIENTO
(1) El agar Mueller - Hinton debe ser preparado a partir del reactivo comercial
deshidratado y de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
(2)Inmediatamente después de autoclavar dejar enfriar en un baño de agua a 45 - 50°C.
(3) Verter el preparado fresco y tibio a una placa petri de vidrio o plástica, de fondo plano
en un nivel, superficie horizontal para dar un fondo uniforme de aproximadamente 4 mm.
Esto corresponde a 60 - 70 ml de medio por placa de diámetro de 150 mm y 25- 30 ml
para placas de 100 mm de diámetro.
(4) El medio de agar debe dejarse que enfríe a temperatura ambiente, y a menos que la
placa se use el mismo día, debe guardarse en refrigerador (2 - 8° C).
5) Las placas deberían usarse en un lapso de 7 días después de la preparación a menos
que se hayan tomado adecuadas precauciones, tal como envolver en plástico, para
minimizar el secado del agar y que al menos hayan mostrado correcto funcionamiento con
los organismos de control de calidad .
(6) Una muestra representativa de cada lote de placas debería ser examinada para
esterilidad por incubación a 30 - 35°C por 24 horas o más.
92
•
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X Control de crecimiento
x E. coli ATCC 25922
x S. aureus ATCC 25923
x S. pneumoniae ATCC 49619 (MH sangre)
x H. influenzae ATCC 49247 (HTM)
x N. gonorrhoeae ATCC 49226 (GC + suplemento)
Controlar:
• Apariencia de los medios:

Observar cualquier signo de deterioro, como: evidencias de deshidratación, cambio de
color, escaso, volumen, etc.
• Control de calidad de desarrollo bacteriano:

Controlar el crecimiento de las bacterias a evaluar y que muestre resultados aceptables
en pruebas de sensibilidad. Utilizar cepas referenciales.
• Control de esterilidad:
Tomar el 5-10% del total del lote producido, e incubar en estufa de 35°C durante 48 h.
Luego, observar cualquier presencia de contaminación, si éste fuera significativo (>10%
del medio controlado) descartar el lote completo. Además se debe descartar todo medio
utilizado.
• pH
El pH de cada lote de agar Mueller - Hinton debería ser chequeado cuando el medio es
preparado. El agar debe tener un pH entre 7,2 y 7,4 después de gelificar a temperatura
ambiente. Si el pH es muy bajo, ciertas drogas parecería que pierden potencia (por ej.
aminoglicósidos, quinolonas y macrólidos), mientras otros agentes pueden presentar
excesiva actividad (por ej. tetraciclinas). Si el pH es muy alto, puede esperarse efectos
opuestos.
El pH puede ser controlado por ejemplo macerando una cantidad suficiente de agar para
sumergir la punta del electrodo
• Humedad
Un exceso de humedad justo antes del uso se presenta en la superficie del agar, las
placas deberían ponerse en un incubador (35°C) o una cámara de flujo laminar con las
placas entreabiertas hasta que el exceso de humedad se haya perdido por evaporación
(usualmente 10 a 30 minutos). La superficie debe ser húmeda, pero sin gotas de
humedad en la superficie del medio o en la tapa de la placa antes de ser inoculada.
93
111.111
fflnuno lactuut SAIL) 1151) ,
.14.
1111~'
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Laboratorio de
• Efectos de Timidina y Timina

El medio que contiene excesiva cantidad de Timidina o Timina puede invertir los efectos
inhibitorios de sulfonamidas y trimetoprim, dando zonas más pequeñas, menos nítidas o
ninguna zona., lo que podría resultar en un falso informe de resistencia.
El agar Mueller - Hinton a usar debe ser de tan bajo contenido en Timidina como sea
posible.
Para evaluar un nuevo lote de agar se utiliza la cepa :
Enterococcus faecalis ATCC 29212, o alternativamente; Enterococcus faecalis ATCC
33186 con discos de trimetoprim / sulfametoxazole.
Un medio satisfactorio dará esencialmente zonas nítidas de inhibición de > 20 mm. Los
medios con alto contenido de timidina se observarán zonas de inhibición con colonias
dentro del halo, zonas menores de 20 mm o sin zona de inhibición.
• Efectos de cationes divalentes
La variación en cationes divalentes, principalmente Magnesio y Calcio, afecta los
resultados de ensayo de aminoglicosidos y tetraciclinas con cepas de Pseudomonas
aeruginosa. Un contenido excesivo de cationes reduce el tamaño de las zonas, mientras
que el bajo contenido podría resultar en un tamaño mayor de lo esperado.
Se prueba con la cepa P. aeruginosa ATCC 27853 con gentamicina y debe dar una
lectura de 16 - 21 mm.
Control de Calidad de los Discos de Sensibilidad

Periodicidad del control:
• Cada vez que llega un nuevo lote de discos de sensibilidad

• Cada 15 dias los discos de rutina
Hemos querido resaltar los aspectos de control de calidad de la prueba de sensibilidad a

los antibióticos por difusión simple en agar, utilizando discos de sensibilidad, ya que es la
prueba de mayor utilidad en nuestro medio.
Es importante tener presente que ésta prueba ha sido designada exclusivamente para
examinar microorganismos de rápido crecimiento, utilizando la normativa CLSI ( Clinical
Laboratory Standard Insitute) M100
El método de difusión simple en agar es sin lugar a dudas el sistema de mayor uso para la
realización de la sensibilidad bacteriana. Hay que tener en cuenta el gran valor de ésta
prueba en la detección temprana de multiresistencia y valoración de un antibiótico frente a
un microorganismos patógeno, protección de infección, estudios epidemiológicos, etc .
La prueba de sensibilidad a los antibióticos consta de varios elementos que deben ser
tenidos en cuenta: El medio de cultivo, inoculo, incubación, lectura e interpretación y el
reporte.
94
~ 1
11 11i
Minislerio Salud
1
Departamento de
Versión N' 1
Laboratorio de
ESTÁNDAR DE TURBIDEZ PARA PREPARACIÓN DEL INÓCULO
Para estandarizar la densidad del inóculo para una prueba de susceptibilidad, se utiliza
estándar de turbidez de BaSO4, equivalente a un estándar 0.5 McFarland o su equivalente
óptico. Un estándar de 0.5 McFarland de BaSO4 se prepara como sigue:
(1) Una alicuota de 0,5 ml de 0,048 m/L de BaCl2 (1,175% p/v BaCl2 x 2H20) se agrega a
99,5 ml de H2SO4 de 0,18 mol/L (1% v/v) con agitación constante para mantener la
suspensión.
(2) La densidad correcta del estándar de turbidez USAR un espectrofotómetro para

determinar la absorbancia. La absorbancia a 625 nm , 0.08 a 0.10 para el estándar de
0,5 McFarland.
(3) La suspensión de Sulfato de Bario debe transferirse en alicuotas de 4 a 6 ml a tubos

con tapa atornillada del mismo tamaño que aquellos que se usan para el crecimiento o
dilución del inóculo de bacterias.
(4) Estos tubos deben ser bien sellados y almacenados en la obscuridad a temperatura
ambiente.
(5) El estándar de turbidez debe ser bien agitado en un vortex mecánico antes de usar y
se debe revisar que haya una apariencia turbia uniforme. Si aparecen partículas
grandes debe ser reemplazado. Suspensiones de partículas de latex pueden
agregarse para agitar invirtiendo el tubo suavemente sin usar vortex.
(6) El estándar de Sulfato de Bario debe ser reemplazado o verificado su densidad
mensualmente.
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DEL INÓCULO
Existen dos métodos para la preparación de inóculo: suspensión directa de colonias y

fase logarítmica de crecimiento. Las suspensiones así ajustadas deben utilizarse como
inóculo dentro de los 15 minutos siguientes.
Suspensión Directa de Colonias

Para el método de suspensión directa de colonias, las colonias no deben sobrepasarlas
18-24 horas de aislamiento. Suspenda las colonias en solución salina o caldo (eje.
Mueller-Hinton o soya tríptica). Luego, ajuste el inóculo a una turbidez equivalente al
95
Minislerio de Salud
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micia eakuna
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Laboratorio de
estándar 0,5 de McFarland. Puede comparar la turbidez de las suspensiones poniendo los
tubos frente a un papel blanco o una tarjeta de archivo con líneas negras.
Use suspensión directa de colonias para los siguientes organismos:
• Todos los estafilococos
• Bacterias fastidiosas que tienen crecimiento impredecible en caldo: eje., estreptococos
Método de Fase Logarítmica

El método de fase logarítmica se usa con la mayoría de organismos que crecen
rápidamente excepto estafilococos. Una vez que se han inoculado las colonias en un
caldo, incube a 35 °C para lograr un crecimiento en fase logarítmica. Una curva de
crecimiento para una bacteria típica se muestra a continuación. El crecimiento de fase
logarítmica ocurre después de 2-8 horas de incubación. Después de la incubación, ajuste
la turbidez para que sea igual al estándar 0,5 de McFarland. Asegúrese de conocer como
ajustar y estandarizar el inóculo.
Curva de Crecimiento
en
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I Faso Est4ctlitunoria
i
Fut* Luy i .
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R
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96
Minislerio de Saltad
Pe,gonas out emodemos
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Laboratorio de
INOCULACIÓN DE LAS PLACAS
(1) En un lapso de tiempo óptimo de 15 minutos después de ajustar la turbidez de la

suspensión del inóculo, una torunda de algodón se sumerge en ella. La torunda debe
ser rotada varias veces y presionada firmemente contra la pared interna del tubo
sobre el nivel de líquido. Esto remueve el exceso de inóculo.
(2) Se inocula la superficie de una placa de agar Mueller —Hinton por rayado con la
torunda sobre toda la superficie. Este procedimiento es repetido rayando dos o más
veces, rotando la placa aproximadamente 60° C cada vez para asegurar una
distribución constante del inóculo.
(3) La tapas de la placa pueden quedar entreabiertas por 3 a 5 minutos, pero no más de
15, para permitir que un exceso de humedad de la superficie se absorba antes de
aplicar el disco con la droga impregnada.
(4) Se debe evitar excesos en la densidad del inóculo. Nunca usar caldos de cultivo de la
noche anterior sin diluir u otro inoculo no estandarizado.
APLICACIÓN DE LOS DISCOS A LAS PLACAS INOCULADAS
(1) Los discos de sensibilidad se dispensan sobre la superficie del agar. Cada disco debe
sea- presionado para asegurar contacto pleno con la superficie del agar. Ya sea que el
disco se ponga individualmente o con un dispensador, deben ser distribuidos en
forma constante y no debe quedar a menos de 24 mm de distancia entre centros. No
más de 12 discos se deben poner por placa de 150 mm o no más de 5 en placas de
97
O
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100 mm. Debido a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no
debe ser relocalizado una vez que haya tomado contacto con la superficie del agar.
(2) Las placas son invertidas y puestas en un incubador a 35°C en el lapso de 15 minutos
después de aplicados los discos. Las placas no se deben incubar en un ambiente de
002 porque los estándares de interpretación fueron desarrollados usando aire
ambiente y el CO2 alterará significativamente el tamaño de las zonas de inhibición de
algunos agentes.
LECTURA DE LAS PLACAS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Luz Reflejada
Después de retirar la placa de la incubadora:

• Examine detenidamente la placa para verificar que el crecimiento sea uniforme y
confluente de tal modo que pueda identificar zonas sin crecimiento bacteriano. Para medir
las zonas de inhibición desde la parte posterior de la placa usando luz reflejada:
• Sostenga la placa unos pocos centímetros sobre una superficie de color negro que no
refleje la luz.
• Mida redondeando al milímetro más cercano con una regla o un calibrador.
• La luz reflejada es usada para Enterobacteriaceae, como E. coli, otros bacilos gram
negativos, estafilococos y enterococos (excepto para oxacilina y vancomicina).
• La luz reflejada también es usada cuando se miden zonas de inhibición en agar Mueller-
Hinton sangre
98
•
Ministerio de Salud
1
Departamento de
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Laboratorio de
Luz Transmitida
Use luz transmitida, en vez de luz reflejada, cuando mida zonas de:
• Estafilococos con oxacilina
• Enterococos con Vancomicina
• El margen de las zonas debe ser tomado como el área donde no se observa
crecimiento visible. Un crecimiento pobre de pequeñas colonias, las que se
detectan con lente de aumento al borde de la zona de crecimiento inhibido, son
ignoradas.
• Sin embargo, colonias discretas creciendo dentro de la zona clara de inhibición
deben ser identificadas y probadas nuevamente. Con Proteus spp., el delgado velo
de población (fenómeno de swarming) en una obvia zona de inhibición debe ser
ignorado.
• Con trimetoprim y las sulfonamidas, pueden aparecer zonas de crecimiento leve;
por lo tanto, no se considera y se mide los márgenes más obvios para determinar
el diámetro de la zona. Cuando se usa medio suplementado con sangre para
probar Streptococcus spp., se debe ser cuidadoso en medir la zona de inhibición y
no la de hemólisis.
99
•
Nlínislerio de Salud
Departamento de
Laboratorio de
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA PRUEBA DE DIFUSIÓN EN DISCO
1. ESTÁNDARES DE INTERPRETACIÓN DE ZONAS DE DIÁMETRO
Usar las tablas específicas (como las del CLSI) las que indican los criterios para
interpretar los diámetros de zonas para categorizar exactamente los niveles de
susceptibilidad de los microorganismos a diferentes agentes antimicrobianos.
Las tablas CLSI utilizadas deben ser las vigentes, ya que son periódicamente publicadas
y pueden contener variaciones.
100
•
lata
d4. Salud RSTIIII1~1110
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G
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
2. CATEGORÍAS INTERPRETATIVAS
Sensible
La categoría "sensible" implica que una infección debido a una cepa puede ser
apropiadamente tratada con la dosis de agente antimicrobiano recomendado para ese tipo
de infección y especie infectante.
Intermedio
La categoría "Intermedio" incluye aislamientos con agentes antimicrobianos con un CIM
que se aproximan usualmente a nivel de tejido y sangre disponible y para los cuales su
velocidad de respuesta puede ser más lenta que la de los aislamientos susceptibles. La
categoría "Intermedia" implica eficacia clínica en sitios del cuerpo donde la droga es
fisiológicamente concentrada (por ej. quinolonas y G-lactámicos en orina) o cuando una
dosis mayor que lo normal de una droga puede ser usada (por ej. G-Iactámicos).
Resistente
Las cepas resistentes no son inhibidas por la concentración sistémica usualmente
alcanzable de un agente cuando los esquemas de dosificación normal son usados.
Pueden tener CIM que caen dentro del rango donde están disponibles mecanismos de
resistencia específicos (por ej. G-lactámicos) y la eficacia clínica no ha sido confiable en
tratamientos estudiados.
Control de calidad de los discos de sensibilidad:
Las metas de un programa de control de calidad van destinadas a monitorear: La

precisión y exactitud del procedimiento de la prueba de susceptibilidad, el comportamiento
de los reactivos utilizados en la prueba y la actuación de las personas que llevan a cabo
las pruebas y sus resultados.
1. Los discos deben ser almacenados a un temperatura entre —20 y +8°C.

Algunos discos, especialmente los de antibióticos f3-lactámicos deben
guardarse congelados a -20°C. Solo los viales en uso deben mantenerse a
temperatura de refrigeración.
2. Al sacarlos de la refrigeradora para su uso, espere a que los viales
alcancen la temperatura ambiente por 1 a 2 horas.
3. Siempre utilice primero los viales con fecha de caducidad más próxima.
4. Siempre que un cartucho a sido extraido del paquete, éste debe guardarse
en un desecador que cierre perfectamente.
5. Cuando se utilice el aparato dispensador que contiene los discos deberá
mantenerse siempre refrigerado.
6. Los discos son colocados en el medio a una distancia de más de 24 mm del
centro de uno al centro del otro. En todo caso no colocar más de 12 discos
en una placa de 150 mm, ni más de 5 discos sobre la placa de 100 mm.
101
•
111
Nliidsierio de salud tAliD DEL til4
Departamento de
Manual de Procedimientos W1
1~
Versión N° 1
Investigación. Docencia
Laboratorio de
7. Procurar no colocar discos de antibióticos bactericidas ( Ej. Penicilina,

Cefalosporinas, Aminoglicósidos, Vancomicina ) al lado de antibióticos
bacteriostáticos ( Ej. Cloranfenicol, Tetraciclina, Sulfonamidas ) para evitar
el antagonismo antibiótico.
8. Colocar las placas en la incubadora dentro de los 15 primeros minutos
después de su aplicación.
9. Para verificar el estado de los discos de sensibilidad, utilice cepas control
ATCC, las cuales son seleccionadas por su estabilidad genética y por su
utilidad en el método utilizado. Estas cepas se corren como una muestra
más y se correlaciona el tamaño de los halos de inhibición con las medidas
expresadas en los Manuales CLSI M100
• HABITUALES CAUSAS DE ERROR EN LA PRUEBA CON DISCO:
a. Error administrativo en la transcripción de los datos del control de calidad.

b. Lectura errónea al medir el diámetro de la zona.
c. Contaminación u otros cambios en la cepa control.
d. Suspensión del inóculo demasiado fuerte o demasiado débil.
e. Mala agitación del estándar McFarland o estándar dañado.
f. Incorrecta temperatura, tiempo o atmósfera de incubación.
g. Perdida de la potencia del disco durante su transporte, su manejo o su
almacenaje en el laboratorio.
Verificación de antibiogramas atípicos :
a. Examine primero por errores de trascripción.

b. Reexamine la placa de sensibilidad.
c. Evalué reportes previos del paciente para observar su patrón de
sensibilidad anterior.
d. Repita los test de identificación y sensibilidad a los antibióti
102
Ministerio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 1 : CEPAS CONTROL - CEPAS ATCC
Cepa Género y Función de monitoreo

especie
ATCC E.coli Actividad de antimicrobianos para Gram

25922 negativos.
Control de pH del medio Mueller Hinton.
ATCC S.aureus Actividad de antimicrobianos para Gram

25923 positivos.
ATCC E.coli Actividad de antimicrobianos con inhibidores de

35218 betalactamasas.
ATCC E.faecalis Concentración de timina timidina del medio

29212 Muller Hinton.
ATCC P.aeruginos Concentración de cationes bivalentes del medio

27853 a Muller Hinton (Ca,Mg,Zn)
Actividad de antimicrobianos para
Pseudomonas.
ANEXO 2: ACCIONES CORRECTIVAS PARA CONTROL DE CALIDAD DE DISCOS DE

SENSIBILIDAD
Los halos de sensibilidad según tabla del CLSI M100 , si la lectura no esta en
esos rangos aplicar la acción correctiva correspondiente, estas tablas son
actualizadas cada año:
Acción correctiva inmediata:

• Probar la combinación bacteria/antimicrobiano el día que se observó el error y
monitorear . Documentar los resultados.
• Si para cada combinación bacteria/antimicrobiano, se debera repetir el
procedimiento y deberan cumplir los roles establecidos ,no se necesitan más
acciones correctivas.
• Si uno o más de los diámetros permanecen fuera de los rangos aceptables
entonces se requiere de acción correctiva adicional.
103
•
Ministerio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Acción correctiva adicional:

• Cuando las acciones correctivas no resuelven el problema, probablemente se deba
al sistema o un error al azar.
• Entonces, verificar lo siguiente:
1. Si los diámetros fueron medidos o transcritos correctamente.
2. Examinar la turbidez estándar antes de ser usados, las fechas de
vencimiento de los insumos, condiciones de almacenamiento y
homogeneización.
3. Verificar que los medios y discos empleados no estén fuera de la fecha de
expiración.
4. Verificar la temperatura y atmósfera de la incubadora.
5. Verificar el correcto funcionamiento de otros equipos empleados.
6. Verificar el correcto almacenamiento de los discos (con desecadores y a
temperatura adecuada).
7. Verificar la pureza de la cepa y que no haya cambiado.
8. Verificar la preparación y ajuste de la suspensión del inoculo.
9. Una vez que el problema sea corregido, para volver al control de calidad
mensual.
104
•
ea/
Mitaislerio di. Salud
4111111h.
Departamento de
Investigación, Docencia Versión N' 1
Laboratorio de
ANEXO 3
FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DEL ANTIBIOGRAMA POR EL

METODO DE DISCO DIFUSION
Procesamiento
Registrod€Ntos
Revisar Anexo 2
NO
Conformidad
SI
Resultado validado
105
•
%línisterio de Salud munn nc~ cummodio
liotir
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
CULTIVO DE HECES
N° DE FOLIOS: 16

Lic. TM Edagr Gonzáles Escalante FIRMA:
Lic.TM Raúl Vicuña
106
Nlinislerio de ',alud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
CULTIVO DE HECES

PROCEDIMIENTO Cultivo de Heces
PROPÓSITO Realizar el procedimiento de Cultivo de Heces
ALCANCE Debe ser cumplido por el personal Tecnólogo Médico del Servicio de Microbiología del INSN -
MARCO LEGAL 2012 AS
UNIDAD DE
INDICADOR FUENTE
MEDIDA RESPONSABLE
1.- N° de
1.-Porcentaje de
interpretaciones
veracidad de 1-Registro de revisión de 1-Tecnólogos
versus N°
interpretación. limitación de procedimiento
limitaciones del Médicos del área
2- Frecuencia de 2- Registro de resultado de
procedimiento. 2- Tecnólogo Medico
panico
de panico
NORMAS

5.IS015189-2003 Medical Laboratory ,particular requirements for quality and competence
107
414• Salud
Departamento de
Versión N' 1
Laboratorio de

18. Proceso de Examen Directo, Coloraciones y Cultivo de la muestra de acuerdo a sus respectivos
PRT-DIDAP (001,002,003)
antibiótica
ENTRADAS

Previos (CPA)
SALIDAS

analítico validado
ANEXOS:
ANEXO 1 TABLAS DE LECTURA

ANEXO 2 FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE CULTIVO
108
•
Nlioisterio de Salud
1111 Mit
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Objetivo: Establecer los procedimientos para realizar el examen Cultivo de heces.
Campo de aplicación: Este manual se seguirá para cualquier muestra de heces que
ingrese al servicio de Microbiología del ISN con solicitud del examen Cultivo de heces.
Medidas de bioseguridad: El personal involucrado en la ejecución de este examen debe

cumplir los requisitos y aplicar las medidas establecidas en el Manual de Normas de
Bioseguridad (Serie de Normas Técnicas N° 18 - INS).
La bioseguridad es responsabilidad del jefe de laboratorio y este tiene la

obligación de capacitar a su personal.
Manipular con guantes la obtención, recepción y tratamiento de las muestras
frescas.
Cambiar los guantes de látex toda vez que hayan sido contaminados, lavarse
las manos y ponerse guantes limpios.
Considerar como material de alto riesgo las muestras frescas y de pacientes
con VIH.
Vestir siempre mandil dentro del laboratorio y quitárselo para transitar por otras
áreas.
El área de trabajo debe ser una sola dentro del laboratorio.
Informar inmediatamente a su superior de cualquier accidente ocasionado con
elementos del laboratorio.
CONDICIONES PREVIAS AL ANALISIS (CPA)

Obtención de la muestra: El paciente debe estar sin tratamiento antimicrobiano,
antidiarreicos (sales de bismuto), sustancias de contraste (Bario) enemas o laxantes por
lo menos de 3 a 5 días antes de hacer el cultivo.
La muestra debe ser fresca (no más de 3 horas de emitida) y no contaminada con orina,
cremas y/o talco. Si la deposición es diarreica enviar no menos de 2 a 5 ml; si es pastosa
no menos de 3 a 5 gr. En niños pequeños con diarrea colocarles el pañal al revés (por la
zona no absorbente) y un colector de orina para no contaminar la muestra. Colocarla en
medio de transporte (Cary Blair) en caso de no poder entregarla dentro de las primeras 3
horas.
Materiales:
• Medio XLD
• Medio Salmonella Shigella
• Medio TCBS
• Medio para Campylobacter ( Butzler) o filtros de 0.45um
• Medio mac Conkey Sorbitol
109
• imk
atitift
,NSIMAO Süi,97Ft 105'3
~Pira
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
• Caldo Selenito
• Agua peptonada alcalina
• Medios Diferenciales: TSI,LIA
• Reactivos: Indo', Oxidasa, Catalasa
• Sueros polivalentes y monovalentes : Salmonella, Shigella, Yersinia, Escherichia
coli, Vibrio Cholerae
• Placas Petri
• Laminillas Portaobjeto y Cubreobjeto
I) Procedimiento del Cultivo:
Siembra primaria
•
• Sembrar la muestra inmediatamente.
• Preparar una lámina con azul de metileno y suero fisiológico para la Reacción
Inflamatoria .
• Hacer un extendido delgado y homogéneo sobre una lámina portaobjeto, para
su posterior coloración de vago o Gram interrumpido.
• A partir de la muestra fresca o Cary Blair, en los medios selectivos:
• Agar XLD, sembrar por estría-agotamiento e incubar por 18-24 horas a 35 -
37°C.
• Agar Salmonella-Shigella, sembrar por estría-agotamiento e incubar por 18-24
horas a 35 - 37°C.
• Agar Mac Conkey Sorbitol, sembrar por estría-agotamiento e incubar por 18-24
horas a 35 - 37°C.
• Agar TCBS, sembrar por estría-agotamiento e incubar por 18-24 horas a 35-
37°C.
Agar Selectivo para Campylobacter (Butzler) / Filtración, sembrar por el método
de palmera (esterilla) e incubar a 42°C por 48 horas, en microaerofilia.
Caldo Selenito F, inocular aprox. una asada de la muestra e incubar por 18-24
horas a 35-37°C. A partir de medio de enriquecimiento, Caldo Selenito F,
sembrar por estria-agotamiento en Agar Salmonella-Shigella e incubar a 37°C
por 24 horas.
NOTA: En caso de no procesar la muestra inmediatamente, inocular con un hisopo

en un tubo con Cary-Blair y refrigerarla hasta su procesamiento.
110
•
Ministerio 411. salud
JA/111
Pri Van. 1411, 411,1,4414141 414
nourarmffir
, 11141ml
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Características de las colonias sospechosas
Bacterias Características de la colonia

Aeromozas Colonias amarillas grandes
Escheríchía coli Colonias amarillas anaranjadas
Plesiomonas shigelloides Colonias incoloras pequeñas
Salmonella Colonias incoloras veces con punto negro o completamente
negras
Shigella Colonias incoloras translucidas

Escherichía coli Colonias rojas
Plesiomonas shigelloides Colonias incoloras pequeñas
Salmonella Colonias incoloras, algunas con bordes incoloros y centro negro
Shigella , Colonias incoloras
Yersinia Colonias puntiformes, incoloras

Escherichia coli Colonias rojas
Salmonella Colonias incoloras
Shigella Colonias incoloras
Yersinia Colonias puntiformes, incoloras

Aeromonas Colonias incoloras, redondas, convexas (en forma abonbada)
Escherichia coli
Enterohemorragica 0157 Colonias incoloras transparentes
Escherichia coli
No Enterohemorragica Colonias rojas opacas
Proteus Colonias incoloras
Shigella Colonias incoloras
111
de salud
mut
15171101tInnk 114,0 DEL tilk
111111111N1111111111
Departamento de
Laboratorio de

Aeromonas Colonias amarillas, redondas, convexas (en forma abonbada)
Vibrio cholerae Colonias amarillas, redondas cremosas, ligeramente convexas
(en forma de carpa de circo) de 2-4 mm de diámetro
Vibrio parahaemolyticus Colonias verde azuladas
1- •,.
r
Colonias puntiformes de color grisáceas hemolíticas o no
Campylobacter hemolíticas a las 24 horas, son de tamaño pequeño (1-2 mm) a
las 48 horas. A veces tienden a extenderse como vela derretida
en placas húmedas
II) Identificacion bioquímica preliminar:

Las colonias sospechosas en las placas de siembra directa y las de enriquecimiento,
excepto las colonias que provengan de medios selectivos para Campylobacter, se
inoculan en medios de identificación bioquímica preliminar.
Triple ~pay Hierro (1,11); Color rojo ladrillo, pH 7.4, sembrar por puntura y estría,
iNtroduolndo el asa por ocentro haSte tocar 01 fondo del tubo, terminando en estría en la
át4:51111..inélinadl.-4139.hibar Los.tU :a, 11-3 ?..por,-4124. horas
A/A Lactosa y/o sacarosa positivo
K/A Lactosa y sacarosa negativo
K/K Bacteria no fermentadora
KIN Bacteria no fermentadora
H2S Presencia de hidrogeno sulfurado
Gas Presencia de gas por metabolismo de carbohidratos
A: Acidez del medio, cambia al color amarillo

K: Alcalinidad del medio, cambia al color rojo
N: Neutralidad del medio, sin cambio de color
H2S: Precipitado negro, indicar intensidad (1+ a 4+)
Gas: Presencia de burbujas o rajadura del medio (1+ a 4+)
112
!linislerio (le Salud
.1111111
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Agarlyi# o Hierro (LIA); Color lila, pH 6.7, sembrar por doble puntura y estría, introduciendo
erlge por e'ej ro, bele tocar él 'tdn.0 'Oí tubo dos veces, terminando en estríe, en la
Sttle. . . i
iie. t ra - ' 1.40.,4' del tubo de LIA, sin tocar. el altar.
billi. ,. 9or, .1,,,,, , i.,,,,?,:;•
KIK Lisina descarboxilasa positivo
KIN Lisina descarboxilasa positivo
R/A Lisina desaminasa positivo
K/A Lisina descarboxilasa negativo
A/A Lisina descarboxilasa negativo
N!N Lisina descarboxilasa negativo. No Enterobacteria
H2S Presencia de hidrogeno sulfurado
Indo' Metabolosimo del triptofano
A: Acidez del medio, cambia al color amarillo

K: Alcalinidad del medio, se intensifica el color
N: Neutralidad del medio, sin cambio de color
R: Presencia de Ac. Cetocarboxilico, cambia al color rojo vinoso
H2S: Precipitado negro, indicar intensidad (1+ a 4+)
Indo!: Aparición de color rojo violáceo en papel indol.
III) Identificación bioquímica final: Sembrar en los 7 medios diferenciales según

el orden y como se indica a continuación:
1. Citrato de simmon's: medio de color verde, pH 6.8, sembrar por estría
sobre la superficie inclinada del medio. Incubar a 35-37 °C por 18-24 horas.
2. Triple Azucar Hierro (TSI): medio de color rojo ladrillo, pH 7.4, sembrar
por puntura y estría, introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo
del tubo, terminando en estría en la superficie inclinada. Incubar a 35-37 °C
por 18-24 horas.
3. Agar Lisina Hierro (LIA): medio de color lila, pH 6.7, sembrar por doble
puntura y estría, introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del
tubo dos veces, terminando en estría en la superficie inclinada. Colocar la
tira de papel indol en la boca del tubo de LIA, sin tocar el agar. Incubar a
35-37 °C por 18-24 horas.
113
1/4
111.11
It11111011(COIÁL IZ Ut
Ministerio tic Salud
tnv,nax num menden', norw.Nivanit
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
4. Movilidad Indol Ornitina (MIO): medio semisolido de color lila, pH 6.5,

sebrar por puntura hasta el fondo del tubo. Incubar a 35-37 °C por 18-24
horas.
5. Agar Urea de Christensen's: medio de color amarillo claro, pH 6.8,
sembrar por estría sobre la superficie inclinada. Incubar a 35-37 °C por 18-
24 horas.
6. Voges-Proskauer (VP): caldo color amarillo claro, pH 6.9, inocular en el
caldo. Incubar a 35-37 °C por 18-24 horas.
7. Gelatina: medio de color amarillo claro, pH 6.8, sembrar por puntura hasta
el fondo del tubo (cuatro veces). Incubar los tubos a 35-37 °C por 18-24
horas.
ANEXO 1 TABLAS DE LECTURA

_
. .. "<Mz.,..
' - - :N4,.,),'.
CIT Citrato sódico Utilización de citrato Verde Azul
LAC Lactosa Beta-galactosidasa IVA o K/K A/A 1
1 GAS Glucosa Producción de gas de glucosa Burbujas-
Sin burbujas
rajaduras
H2S Tiosulfato sódico Producción de H2S Sin Precipitado
precipitado negro
LDC Lisina Lisina descarboxilasa K/K o K/N
K/A o A/A
< LDA Lisina Lisisna desaminasa o N/N R/A
Z1
IND Triptofano Producción de indo) Papel sin Papel rojo
cambios violaceo
MOV Medio semisolido Movilidad en el medio En el trazo de Plumoso o
O siembra turbio
1
--
ODC Ornitina Ornitina descarbixilasa Amarillo Lila
URE Urea Ureasa Amarillo Rojo
VP Glucosa Producción de acetoina Amarillo Rojo
GEL Gelatina Gelatinasa Gelatina
Sin cambios
licuada
1 Los resultados deben correlacionar con los del cultivo en Mac Conkey, colonias lactosa
positivas (colonias rojo-rosadas).
2 Luego de la incubación añadir al caldo 20 gotas de VP1 (Alfanaftol) y 4 gotas de VP2
(KOH 40%), dejar que repose al aire un mínimo de 10 minutos. Luego observar la
formación de un color rojo.
3 Después de la incubación, refrigerar por 10 minutos, si la gelatina permanece licuada se
considera la prueba positiva.
114
•
wrronuotaletswani.
Nlinh.terio de Slim'
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
IV) Identificación
Identificación por especie patógena
1. Shigella:
Luego de la identificación bioquímica confirmar con la serológica.
Identificación serológica: Método de aglutinación en lámina.
• Si la bioquímica corresponde al género Shigella.
• Tomar una asada del cultivo de TSI o TSA y disolver en una gota de solución
salina hasta obtener una suspensión lechosa.
• Agregar una gota del antisuero correspondiente B, D, C1, C2, C3, Al o A2
• Mezclar ambas gotas realizando movimientos en vaivén (aproximadamente 20
veces)
• Se considera positivo (+) al apreciar la reacción de aglutinación
• La bacteria también puede ser una Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC)
probar con los antisueros polivalente A y B de EIEC.
NOTA:
Si no aglutina con los antisueros. Se prepara en un tubo una suspensión lechosa de la
colonia con suero fisiologico. Colocar en baño María a 100°C por 30 minutos y
nuevamente probar con los antisueros.
En nuestro laboratorio el serogrupo más frecuente es el B, seguido de D, C y A. Iniciar la
prueba de uno en uno en el orden indicado anteriormente y de acuerdo a la bioquímica
correspondiente
Serología Shigella
C3.
_Shigella dysenteriae *
Shigella flexneri
Shigella boydii *
Shigella sonnei
* aglutina con solo serogrupo
2.- Salmonella:
Luego de la identificación bioquímica confirmar con la serológica.
• Si la bioquímica corresponde al género Salmonella.
• Agregar una gota del antisuero polivalente anti-salmonella A-E.
Mezclar ambas gotas realizando movimientos en vaivén (aproximadamente 20
veces)
115
e
Ministerio ole saltad
v ona, Que
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Se considera positivo (+) al apreciar la reacción de aglutinación

Si no aglutina con los antisueros. Puede estar presente un antígeno de
envoltura. Se prepara en un tubo una suspensión lechosa de la colonia con
suero fisiologico.
Colocar en baño María a 100°C por 30 minutos y nuevamente probar con los
antisueros.
Los serogrupos mas frecuentes son el D y el B, seguido de A, C1, C2 y E. Iniciar la
prueba de uno en uno en el orden indicado anteriormente y de acuerdo a la bioquímica
correspondiente.
Polivalente A B Cl C2 D E Vi
S typhi + (+)
S. paratyphi A + +
S. paratyphi B + +
Salmonella spp * + + + + + +
* aglutina con un solo grupo
3.- Escherichia coli enteropatogena (EPEC): Luego de la identificación bioquímica

confirmar con la serológica.
• Si la bioquímica corresponde Escherichia coli se prepara un pool de cepas a
partir del TSA en un tubo hasta obtener una suspensión lechosa de la colonias
con suero fisiologico.
• Colocar luego sobre una lamina tres gotas de la suspensión y agregar una gota
del antisuero polivalente anti- EPEC A, B y C.
• Mezclar realizando movimientos en vaivén (aproximadamente 20 veces)
• Se considera positivo (+) al apreciar la reacción de aglutinación.
4.- Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC): Luego de la identificación bioquímica

• Si la bioquímica corresponde Escherichia coli con sospecha de ser
enteroinvasiva.
• Agregar una gota del antisuero anti-EIEC.
veces)
• Se considera positivo (+) al apreciar la reacción de aglutinación
Posteriormente, los tubos que muestren una aglutinación positiva se confirman con
pruebas convencionales, ya que hay descritas reacciones cruzadas con otras bacterias
116
rama
; eilo
IRRO~Ititete
lti~ td0
Ministerio de 'alud
1,1,11.1115
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
como Yersinia enterocolitica 09, Escherichia hermanii y algunos serotipos de Salmonella

serogrupo N (Lior et al.).
5.- Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC): Luego de la identificación bioquímica

• Si la bioquímica corresponde Escherichia coli con sospecha de ser
enterohemorragica (sorbitol negativo).
Tomar una asada del cultivo de TSI o TSA y disolver en una gota de solución
• Agregar una gota del antisuero anti-EHEC, 0: 157.
veces)
Enviar PARA CONFIRMACION A LABORATORIO DE REFERENCIA
6.- Yersinia enterocolitica: Luego de la identificación bioquímica confirmar con la

serológica.
Si la bioquímica corresponde a Yersinia enterocolitica.
Agregar una gota del antisuero anti-Yersinia enterocolitica.
veces)
7.- Vibrio cholerae: Luego de la identificación bioquímica confirmar con la serológica.

Identificación serológica
Si la bioquímica corresponde a Vibrio cholerae.
Agregar una gota del antisuero polivalente 01.
veces)
PRUEBA DEL CORDON (String test o de la cuerda):

Sobre un portaobjetos se coloca una gota de desoxicolato de sodio al 0.5% y se hace una
suspensión con el cultivo en evaluación. La prueba será positiva si la suspensión se
vuelve viscosa y se aprecia la formación del cordón al levantar suavemente el asa de
siembra. Si sólo se observa turbidez que persiste más de un minuto la prueba es
negativa.
117
•
dalia
!I haisierio de Salud
1,1,011.110. per smi,
wr igoAleaunes
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
8.- Vibrio parahaemolyticus: Identificación bioquímica.
9.- Aeromonas spp: Identificación bioquímica.
9.- Plesiomonas shigelloides: Identificación bioquímica.
IDENTIFICACION DE CAMPYLOBACTER
Examen microscópico directo
Tinción Gram-Vago: Las muestras de materia fecal pueden ser examinadas a través de
una tinción de Gram, utilizando solo cristal violeta y lugol como colorantes, para identificar
leucocitos y formas bacilares curvas.
Cultivo en medios selectivos
El medio de cultivo
Método directo: Las placas se siembran en forma directa con hisopo o con 2-3 gotas de
deposiciones acuosas, se disemina por estría. Se incuban por 72 horas con una
atmósfera microaerófila que tenga 5-10% de oxígeno y 3 a 10% de dióxido de carbono.
Método de enriquecimiento: Dado que en una diarrea el número de Campylobacter es
alto, no es necesario realizar enriquecimiento. Se recomienda solo en caso de esperar un
bajo número de microorganismos (manipuladores, convalecientes)
Cultivo por el método de filtración
Fundamento: El método se basa en la separación de Campylobacter del resto de la flora

microbiana presente en las heces, como por ejemplo los coliformes, que quedan retenidos
en la superficie de una membrana de celulosa de 0,45 o 0,66 pm; los bacilos que logran
penetrar o transponer la membrana van a depositarse sobre un medio rico con sangre que
actuará como sustrato para el crecimiento del microorganismo. De esta manera se
obtiene un cultivo selectivo, situación que reemplaza a la adición de antibióticos, para
eliminar la flora acompañante.
Este método se recomienda para el aislamiento de las especies emergentes (ej.
Campylobacter upsaliensis)
Procedimiento: atemperar el medio de cultivo en placa de Petri por una hora a 37°C,
acomodar con una pinza los filtros estériles de celulosa de 0,45 pm, esperar a que se
adhieran al medio. Realizar una suspensión de materia fecal en solución fisiológica o
caldo nutritivo y con una micropipeta o pipeta Pasteur, depositar aproximadamente 100 pl
sobre la membrana, tratando que no se derrame sobre el medio de cultivo. Dejar que se
filtre por un tiempo mínimo de 30 minutos, luego levantar el filtro con la pinza y
desecharlo. Estriar el filtrado con asa (esto es opcional). Acondicionar las placas en jarras
para incubar en microaerofilia a 42°C durante 48-72horas.
Si la diarrea es acuosa, no es necesario realizar una suspensión en solución fisiológica.
118
•k
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íti
\ Salud
P•rsolla.
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Atmosfera de incubación
Existen varios métodos para obtener una atmósfera adecuada para el desarrollo de estos
microorganismos. Se utilizaran 2 métodos párale aislamiento de Campylobacter
Sobres generadores de gases especiales para Campylobacter: son sobres que se
consiguen en el comercio (Oxoid, Merck) que aportan una atmósfera aproximada de 5-
10% de oxigeno y 5-12% de dióxido de carbono.
Jarra con vela: la combustión de la vela aporta una atmósfera aproximada de 17-19% de
oxígeno y de 2-4% de dióxido de carbono que mejora el aislamiento de Campylobacter si
se incluye al medio de cultivo el suplemento FBP que aumenta alrededor de 10 veces la
aerotolerancia del microorganismo. Se postula que el rendimiento de este método es
mayor a 42-43°C que a 37°C.
Nota: C. hyointestinalis, requieren de la presencia de hidrógeno para crecer.
Temperatura de incubación
Las especies termófilas de Campylobacter crecen mejor a 42-43°C que a 37°C. La mayor
temperatura actúa como inhibición de la flora fecal.
Si no se cuenta con una estufa a esa temperatura, se puede utilizar una de 37°C con las
consideraciones del caso.
Examen de las placas

El tiempo de incubación ideal es de 48 horas, aunque si el caso lo requiere, se pueden
examinar a las 18-24 horas. Algunos autores recomiendan 72 horas para aumentar la
recuperacion.
Las colonias sospechosas pueden observarse planas, no hemolíticas de aspecto acuoso,
grisáseas, con bordes irregulares y con tendencia a diseminarse (como vela derretida).
Muchas veces se pueden ver incoloras. Se les debe realizar una identificación presuntiva
para su posterior confirmación y tipificación.
Identificación presuntiva
Tinción de Gram: debido a que este microorganismo no se tiñe bien con safranina, se
recomienda el uso de la tinción Gram interrumpido. Teniendo en cuenta la morfología
característica, es posible realizar solo la coloración simple con este colorante.
Catalasa: se debe colocar sobre un portaobjetos limpio una colonia de un cultivo fresco,
agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3 %. Una reacción positiva se evidencia por
la formación de burbujas producto de la liberación de oxigeno a partir de la reducción del
peróxido de hidrógeno.
Oxidasa: sobre un papel embebido con el reactivo de oxidasa y sobre una lamina, se
coloca un poco de colonia sobre el papel y se espera por 10 segundos.
Una reacción positiva se evidencia por el desarrollo de color azul oscuro.
Identificación final
119
luN
9'1`111110 Kl" nuo DEI V!iO
Sa heti
IMINInn
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Prueba de Sensibilidad a los Antimicrobianos (ANTIBIOGRAMA)
a) Medios de cultivo a utilizar

Agar Mueller Hinton
Agar Mueller Hinton con sangre al 5% (solo para Campylobacter)
b) Preparación del inoculo

Tomar con un asa de alambre una porción de cultivo puro y colocar en el tubo con suero
fisiológico.
Agregar las colonias bacterianas hasta obtener una turbidez comparable al standard 0.5
de Mac Farland . Si la suspensión está muy concentrada diluir con suero fisiológico.
c) Inoculación de las placas

Introducir un hisopo estéril en el suero fisiológico.
Elevar el hisopo sobre la superficie del suero fisiológico y rotar contra la pared del tubo
para eliminar el exceso del inóculo.
Frotar la superficie del agar con el hisopo en tres direcciones.
Dejar secar por 15' con la placa cerrada.
Colocar los discos de sensibilidad con pinza estéril. Los discos deben estar
suficientemente separados para hacer la lectura (máximo 6 por placa, excepto para
Campylobacter en que se colocaran 2 disco por placa).
Presionar suavemente los discos para asegurar su implantación en la superficie.
Incubar a 37 °C por 18-24 horas.
d) Medición de halos.
Las zonas de inhibición se miden con una regla sobre un fondo oscuro y por la parte
posterior de la placa sin abrirla (excepto en el caso de Campylobacter)
Después de la medida proceder a comparar con la tabla de interpretación Ver Tabla en
Anexo
e) Discos que se colocaran en el antibiograma

Ampicilina
Sulfametoxazol-trimetoprim
Ciprofloxacina (también para Campylobacter)
Ceftriaxona
Furazolidona
Cloramfenicol
Eritromicina (solo para Campylobacter)
120
xsmmoorwwoa muc
\l nititerio tlesítIud 11.11111~11111
Departamento de
Versión N' 1
Laboratorio de
ANEXO 2 : FLUJOGRAMA DE PROCESO DE CULTIVO DE HECES
Detección
Examen
antibiótico Cultivo
Directo
PRT- PRT- PRT-
PRT-DIDAP DIDAP DIDAP
DIDAP
001 002 003
009
e
SI
Proceso
Automatizado Automatizado
nin
Proceso Manual
Registro de Datos
NO Revisar tabla de lectura

Conformidad
((Anexo 1)
SI
SI
Revisar Guía de
Acción de Pánico
Acciones de Pánico
NO
Resultado validado
121
•
%linisterio Sztltid
:hita
2157110 IIKX11,11 SALO
Ye, to,...f sic... veo amii.
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
HEMOCULTIVO
N° DE FOLIOS: 7

122
•
Atta
MT¿1}10 !áOXii 9.L9
Ministerio de !salud
Peolpooms que acoden.
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
HEMOCULTIVO
NOMBRE DEL FECHA:25/205/2015
Hemocultivo
PROPÓSITO Realizar el procedimiento de Hemocultivo
Debe ser cumplido por el personal Tecnólogo Médico del Servicio de Microbiología del INSN
ALCANCE
MARCO LEGAL 2012 AS
UNIDAD DE
MEDIDA
1.- N° de
1.-Porcentaje de
interpretaciones
versus N°
limitaciones del
2- Frecuencia de 2- Registro de resultado de 2- Tecnólogo Medico
procedimiento.
resultados de panico del área.
2- % de resultados
panico
de panico
NORMAS

123
%I in ist ASMION,1101.1DE1110 Del vlo
salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
INICIO muestra en condiciones adecuadas para el cultivo ( CPA )
1. Muestra adecuada para cultivo (CPA)

2. Programación de muestras en el equipo ( Anexo 1)
3. Interpretación de datos obtenidos por el equipo
4. Se sigue con el procedimiento manual o automatizado para identificar al gérmen y realizar la
susceptibilidad antimicrobiana
6. Se procede a la interpretación de los resultados
8. Informe de resultado analítico validado por Tecnólogo Médico
ENTRADAS

Previos (CPA)
SALIDAS

analítico validado
ANEXOS:
ANEXO I EQUIPO BACTEC

ANEXO 2 FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE HEMOCULTIVO
124
•
eall>
35`11110 1112elk 1111Z
Nlitaisterio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
PROCESO ANALITICO DEL HEMOCULTIVO
Objetivo: El hemocultivo o cultivo microbiológico de la sangre constituye en los casos

de septicemia, el único examen que permite su confirmación. Se define como
hemocultivo al cultivo microbiológico de una muestra de sangre obtenida por una
punción independiente
INDICACIONES PARA LOS HEMOCULTIVOS
•
La indicación clásica de obtener hemocultivos, es la sospecha de bacteriemia en
pacientes con o sin foco aparente de infección. Los factores clásicos asociados a la
presencia de bacteriemia verdadera, son la presencia de calofríos y fiebre mayor a
38.3°C, existencia de enfermedades subyacentes severas (usualmente mortales a un
plazo no mayor a 5 años), cuadros de abdomen agudo y el antecedente de
drogadicción intravenosa . También todas aquellas infecciones que producen
bacteriemias continuas, como la endocarditis infecciosa y en general, las infecciones
endovasculares . En los casos en que no existe alguno de estos marcadores de
bacteriemia o cuando el paciente ya está recibiendo antimicrobianos, la probabilidad
de aislar agentes infecciosos en hemocultivos disminuye en forma muy significativa.
CLASIFICACIÓN DE LOS HEMOCULTIVOS

Se pueden clasificarse según el tipo de microorganismos que se esté investigando,
ya que se requieren distintos sistemas de hemocultivos según si se sospechan
bacterias aeróbicas, anaeróbicas, fastidiosos, micobacterias u hongos.
Por último, se pueden clasificar según la metodología de los distintos sistemas de
hemocultivos en métodos convencionales (manuales), en sistemas
semiautomatizados como BACTEC.
Procesamiento de Hemocultivos
111/ Materiales:
Agar Sangre de Carnero
Agar Chocolate
Agar Manitol
Agar Mac Conkey
Tinción Gram
Mueller Hinton
Discos de Sensibilidad
Paneles de Identificación y Sensibilidad ( Automatizado Vitek)
Placas Petri,Laminillas cubre y portaobjeto
Botella de Medio cultivo (aeróbico-anaeróbico) BACTEC TM Peds Plus
(Contiene resinas para la neutralización antibiótico. )
125
*011a
!Ministerio d , Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Seguridad
Cuando se trabaja con Hemocultivos, mantener los frascos dentro de una cabina
de bioseguridad o ponerse escudo o usar máscaras de cara.
Siempre usar guantes, debido a que los Hemocultivos contienen material de
pacientes que pueden contener patógenos transmitidos por sangre.
Programación e muestras en el equipo ( Anexo 1) Incubar por 5 días, en

circunstancias especiales (por ejemplo, cultivos de Brucella), incubar 21
días.
Interpretación de datos obtenidos por el equipo
Tinción de Gram
Resiembra ciega detección primaria
Se sigue con el procedimiento manual o automatizado para identificar al
gérmen y realizar la susceptibilidad antimicrobiana
En circunstancias especiales cuando los cultivos parecen ser negativos,
realizar una coloración gram, montaje húmedo del cultivo o el sedimento
para determinar la presencia de organismos.
• Descartar frascos negativos de forma segura en los recipientes de
desechos infecciosos.
126
•
11inislerio di. Salud
astil
WfiliTO /41:8-11 SAIW
nomirkenra
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Anexo 1
SISTEMA BACTEC FX
El BD BACTECTM FX se ha desarrollado en base a una tecnología probada y superior

de detección por fluorescencia, un rendimiento excepcional de los medios y la fiabilidad
de los instrumentos de los sistemas de hemocultivos BD BACTECTM 9000
Principio: los microorganismos están presentes en los frascos de cultivo, que
metabolizan los nutrientes en la cultura medio, la liberación de dióxido de carbono en el
medio. Un colorante en el sensor en la parte inferior de el vial reacciona con CO2. Este
modula la cantidad de luz que es absorbida por un material fluorescente en el sensor. Un
detector de foto en cada estación mide el nivel de fluorescencia, que corresponde a la
cantidad de CO2 liberado por los organismos. Entonces la medida es interpretada por el
sistema de acuerdo con preprogramado positividad.
En el inicio del sistema, el ordenador de a bordo realiza autodiagnóstico y descargas,

instrucciones de funcionamiento a las filas de cajones. A continuación, el
instrumento (s) se inicia automáticamente la prueba. Diodos emisores de luz
(LEDs) detrás de los viales iluminan las filas, la activación de la sensores
fluorescentes viales.
Después de un período de calentamiento, foto-detectores del instrumento después
tomar las lecturas. Un ciclo de pruebas de todas las filas se completa cada diez
minutos. Los cultivos positivos se marcan inmediatamente por una luz indicadora
en la parte frontal del instrumento, una audible alarma, y se muestran en la
pantalla LCD.
Cuando se identifican viales positivos, el técnico de laboratorio les empuja desde
el instrumento para confirmación de los resultados, y para el aislamiento e
identificación del organismo.
127
Departamento de
Laboratorio de
ANEXO 2: FLUJOGRAMA PROCESAMIENTO DE PRUEBAS DE HEMOGRAMA EN

AUTOANALIZADOR HEMATOLOGICO
CPA conforme
Programación de muestra
en el equipo (Anexo 1)
Interpretación de los datos

obtenidos del equipo
SI Proceso
automatizado
NO
Proceso manual
llegislokOts
SI
Acción de
Guía de Pánico I
pánico
N/
NO
•
Resultado analítico validado
128
•
Departamento de
Laboratorio de
MICOLOGIA
N° DE FOLIOS: 50

129
• mala
saaviOxitaib
leur u
itumuilt
11ini•lerio de Salud
Departamento de
Laboratorio de

PROCEDIMIENTO CULTIVO DE HONGOS
CODIGO PRT-DIDAP-12
PROPÓSITO Realizar el procedimiento de Cultivo de hongos

MARCO LEGAL 2012 AS
UNIDAD DE
MEDIDA
1. - N° de
1.-Porcentaje de
interpretaciones
versus N°
limitaciones del
2- Frecuencia de 2- Registro de resultado de 2- Tecnólogo Medico
procedimiento.
resultados de valores críticos del área.
2- % de resultados
valores críticos
de valores críticos
NORMAS

2. Proceso de Examen Directo, Coloración y Cultivo de la muestra de acuerdo a sus respectivos
PRT-DIDAP (001,003)
antibiótica
130
• intik
erl)
!linisteriode Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ENTRADAS

Previos (CPA)
SAL DAS

analítico validado
ANEXOS:
ANEXO I Medios de Cultivo del Laboratorio de Micología

ANEXO 2 Preparación de colorantes y reactivos del Laboratorio de Micología
ANEXO 3 Procedimientos especiales para la identificación de hongos del Laboratorio de Micología
ANEXO 3 Elementos fúngicos característicos vistos en el examen directo de especímenes clínicos
ANEXO 5 Flujograma de procesamiento de muestras micologías e identificación de levaduras
ANEXO 6 : Flujograma de proceso analítico de cultivo
131
dallan
axmn UCEMCES
mep ILta
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
RUTINA DIARIA DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

MICOLOGIA
1. Chequear y registrar las temperaturas de todas las incubadoras,

refrigeradoras y congeladoras todas las mañanas. Si hay una lectura
anormal, reportarla al coordinador.
2. Nuevos cultivos son ordenados, y accesados en el cuaderno de trabajo de
forma numérica y correlativa. Las placas de cultivo fúngico son examinados
y sellados con banda de jebe y luego incubados en la estufa de 28 °C.
Cualquier medio de cultivo que muestre desarrollo fúngico es removido para
iniciar el trabajo de identificación.
3. Los frotices y preparaciones en fresco deben ser leídos dentro de las 24
horas.
4. Lectura de los cultivos:
a. Cultivos de LCR, sangre y biopsias de pulmón (y solicitudes
especiales) son leídos diariamente durante las primeras dos semanas
y dos veces por semana por el restante periodo de incubación.
Muestras positivas son trabajadas inmediatamente.
b. El screening de rutina para los otros cultivos fúngicos es hecho tres
veces por semana en las primeras dos semanas y dos veces por
semana por el restante periodo de incubación. Preparaciones con
ALF (azul de lactofenol) son hechas al menos dos veces por semana
o diariamente dependiendo del volumen. Cualquier moho o levadura
referida de la sección de secreciones, hemocultivos o urocultivos es
procesado y trabajado el mismo día excepto domingos y feriados.
FASE ANALITICA
MATERIALES
✓ Medios de cultivo
/Agua agar
✓Alpiste agar
✓Arroz granos medio
✓Avena agar
✓BHI sangre cloranfenicol agar
✓Cáscara semilla de girasol agar
Y Cromogénico agar para levaduras
Y Esculina agar
✓Girasol semilla agar
✓Harina de 132ran agar
✓Harina de 132ran tween 80 agar
✓Leeming y notman agar modificado
132
•
idUn
MITCYAC1011.~71100a*;
Ilinkierio de Salud
Departamento de
Técnicos del Servicio de Versión N° 1
Laboratorio de
w Mueller hinton suplementado agar

wSistema de identificación de levaduras (api 20c aux o Vitek2-compact)
w Papa dextrosa agar
wSabouraud dextrosa caldo
w Sabouraud dextrosa cloranfenicol agar
wSabouraud dextrosa cloranfenicol cicloheximide agar (micobiotic, micosel, fungi
selective)
w Tabaco agar
w Urea agar
w V8 jugo agar
w Hemocultivo automatizado
,/ Coloraciones y Reactivos
w Colorante de Kane
w Lactofenol de Amman
w Azul de lactofenol
w Coloración acido alcohol resistente de Kinyoun
/ Coloración de Giemsa
w Coloración Gram
w Tinta china
w Hidróxido de potasio 20%
w Solución antibiótica
,/ Suministros
1Método del asa:
Use asas de nicrom o de plástico descartables estériles de las siguientes
capacidades:
Asa de 1 pl.
Asa de 10 pl.
PROCEDIMIENTO
v Métodos microscópicos y otros métodos directos
Especímenes de cualquier naturaleza clínica deben examinarse
microscópicamente en busca de hongos que el médico solicite o a
iniciativa del laboratorio. Todos los especímenes en cantidad suficiente
enviados para cultivo de hongos deben examinarse microscópicamente
en busca de hongos. Cuando no hay una suficiente cantidad de un
espécimen tanto para cultivo y examen directo, el cultivo toma prioridad
por encima del frotis por cuanto este es más sensible que el examen
microscópico. La observación de un hongo en un espécimen clínico es,
sin embargo, valioso en el establecimiento de su significancia
y en la propoedWálai formación temprana que pueda ser crucial para
determinar la ttle0ae4 ropiada para el paciente.
teresado.
133
IAVEZ PASTRANA
10
•
Imre ,LICQUI ni"
Nliaimerio dt• Saltad
111101111111111111
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Preparación del Espécimen para el Examen Microscópico:

El tejido debe desmenuzarse completamente con un bisturí. El
KOH penetra lentamente o nada en el interior de trozos
inadecuadamente desmenuzados. Los fluidos (LCR, pleural, peritoneal,
articular) debe ser concentrados por centrifugación a 1500-2000 g.
Recortes de uñas pueden rasparse progresivamente con un bisturí y
pueden pulverizarse con la ayuda de un mortero.
✓ Métodos de Examen Microscópico
PROCEDIMIENTO HIDROXIDO DE POTASIO 20%
La demostración de estructuras fúngicas se logra utilizando el hidróxido de

potasio, como aclarante a partir de especímenes enviados al laboratorio para
investigación de hongos comprometidos.
Espécimen
Pueden ser cualquiera de las muestras clínicas procedentes de pacientes afectados
con micosis.
Control de Calidad
Chequear el reactivo antes de usar, si la solución está carbonatada desecharla. Usar
una porción de esputo o raspado de piel, para confirmar que el espécimen se
disuelve.
Procedimiento
• Colocar una porción del material a ser examinado sobre una lámina
portaobjetos limpia.
• Adicionar una gota de KOH 20% al material y mezclar.
• Colocar una laminilla cubreobjetos sobre la preparación, presionando
suavemente.
• Permitir que la solución ejerza su acción aclarante, por espacio de 10-20
minutos a temperatura ambiente y con la ayuda de papel filtro retirar el
exceso de KOH, por cuanto este deteriora los lentes del microscopio, si
llegaran a tocarlo. Las láminas pueden ser calentadas ligeramente
pasándola dos a tres veces por el mechero, con el objeto de acortar el
tiempo de aclaramiento, evitar hervir el preparado.
• Observar el preparado con objetivos de 20x y 40x para la observación de
estructuras fúngicas, cuidando que la iluminación del microscopio sea
ajustada apropiadamente
PREPARACIONES CON TINTA CHINA
Una preparación con tinta china puede ser usada para la detección rápida de
levaduras encapsuladas basadas en una coloración negativa. La cápsula repela las
partículas de carbón de la tinta china, dando un halo claro bien demarcado alrededor
de la célula encapsulada.
134
ei
•
N
Nlinimerio de tialud
:ate
117170 ruar X SX40
r'"'"",,17nalerno,
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Control de Calidad
Realizarlo diariamente.
Una gota de tinta china es colocada sobre un portaobjetos con una gota de agua
destilada.
La preparación es examinada para detectar contaminación bacteriana o por esporas
de hongos.
Procedimiento
Colocar una gota de sedimento (fluidos corporales, orina) sobre un
portaobjetos.
Colocar un cubreobjetos sobre la gota de sedimento.
Colocar una gota de tinta china al costado del cubreobjetos.
Permitir que la tinta china difunda bajo la laminilla y cree una gradiente de
tinta.
Examine a 10x y 40x. Leer en la región donde la densidad de las
partículas de tinta china sean ni tan escasas ni tan concentradas.
Procedimiento Alternativo
Colocar una gota de sedimento (fluidos corporales, orina) sobre un
portaobjetos.
Adicionar una pequeña gota de tinta china y mezclar con el sedimento
usando una esquina de un cubreobjetos.
La preparación debe ser de un color parduzco, no negro.
Si la preparación está bien negra, adicionar 1 a 2 gotas de agua destilada
estéril, mezclar, y montar con un cubreobjetos.
Examine a 10x y 40x.
Resultados esperados
• Prueba Positiva
La presencia de levaduras con halo claro alrededor de estas indica material capsular.
Levaduras encapsuladas en sedimento de LCR son sugestivos de C. neoformans,
pero cultivos o prueba de detección de antígenos son necesarios para confirmar la
identificación de tal levadura.
• Prueba Negativa
Ausencia de halo.
Los leucocitos también pueden repeler partículas de carbón pero tienen un halo muy
difuso e irregular en la periferia. No confundir leucocitos con levaduras. Observar los
halos claros y levaduras. Algunos contenidos internos pueden ser visibles.
IMPRONTAS CON CINTA SCOTCH
Este método usualmente usado para la demostración de estructuras fúngicas

provenientes de raspados de piel y cuero cabelludo.
Control de calidad
Se deben visualizar células epiteliales en cantidades apreciables, signo de que se
han desprendido células de la superficie de la piel a muestrear.
Procedimiento
135
•
Ministerio de Saltad
1n
WiNTONICIMMAZOMM,
iiI111~111
Promminqur Menclem*, ,ev5on,
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Las láminas portaobjetos con cinta scotch que fueron presionadas

firmemente sobre la superficie de la lesión del paciente, por el lado
adhesivo, son despegadas suavemente.
Colocar 3 a 4 gotas de colorante de Kane o azul de metileno al 1% sobre
la lámina portaobjetos y volver a pegar completamente la cinta scotch para
que tome el colorante.
Dejar colorear 5 minutos y retirar el exceso de colorante con papel toalla
• Observar el preparado con objetivos de 20x y 40x para la observación de
estructuras fúngicas, cuidando que la iluminación del microscopio sea
ajustada apropiadamente
COLORACION KINYOUN MODIFICADA
Utilizada para colorear material clínico sospechoso de nocardiosis o para teñir

cultivos sospechosos de Nocardia spp. Las levaduras ascógenas producen
ascosporas las cuales pueden también ser coloreadas.
Control de calidad
• Control positivo: Frotis conteniendo Ascosporas, Nocardia asteroides o
micobacteria de crecimiento rápido.
Control negativo: Frotis conteniendo levaduras, bacteria diferente de
micobacteria o nocardia.
Procedimiento
Preparar un frotis y fijar al mechero o con un fijador de láminas a 56 °C.
Cubrir el frotis con carbolfucsina de kinyoun por 5 min. A temperatura
ambiente, no calentar.
Remover el exceso de colorante.
Cubrir la lámina con alcohol etílico 50% e inmediatamente lavar con agua.
Decolorar el frotis con ácido sulfúrico 1% acuoso, aproximadamente 3
minutos.
Lavar la lámina con agua.
• Contracolorear con azul de metileno durante 1 min.
• Lavar con agua, secar y examinar con objetivo de inmersión.
• Interpretación
• Las ascosporas y los filamentos de Nocardia spp. y algunos Rhodococcus
spp. típicamente aparecen parcialmente ácido resistentes.
COLORACION DE GIEMSA
Es utilizada para examinar estructuras intracelulares y es aplicado

principalmente a especímenes como médula ósea y leucocitos en los cuales sea
sospechada la presencia de H. capsulatum, así como también de Pneumocystis
jiroveci.
Control de calidad
Frotis sanguíneo
136
•
1,111n 1:111011
1littisit.rio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Microbiolog la Microbiología Página 137
Procedimiento
• Fijar el frotis con metano! absoluto por 3-5 min.
• Escurrir inmediatamente el alcohol y dejar que el frotis seque
espontáneamente.
• Cubrir el frotis con la solución colorante de Giemsa previamente diluido (1m1
de solución stock con 3 ml de solución tampón Ph 7.2), preparado
momentos antes, por 15 min.
• Lavar la lámina con agua de caño y dejar secar.
Nota: En la práctica se consigue buenos resultados dispensando 6 gotas de la
solución de Giemsa en 4 ml de PBS.
Resultados esperados
Citoplasma de células necróticas de color rosadas, a diferencia de las células
normales de color azul pálido a violeta-lavanda.
Levaduras fagocitadas colorean de azul claro a azul oscuro y cada una puede tener un
halo claro alrededor. Observar levaduras pseudoencapsuladas de color púrpura de H.
capsulatum dentro de monocitos y polimorfonucleares.
,/ Métodos de cultivo
La recuperación de hongos de importancia médica de especímenes clínicos,

depende de muchos factores. El primero está referido al espécimen en sí, debe ser de
reciente colección y que sea considerada propia de una infección micótica.
También la calidad del espécimen debe ser tomada en cuenta. En general hay pocos
elementos fúngicos en el sitio de la infección que bacterias en una infección
bacteriana, por ello debemos cultivar una cantidad adecuada de espécimen, para
asegurar una óptima recuperación, siendo de regla general cultivar aproximadamente
0.5 ml de muestra. Muchos hongos no sobreviven al tratamiento con NaOH 2% usado
para la recuperación de micobacterias.
Otro factor importante es el medio usado, ya que no existe un medio que satisfaga el
aislamiento de todos los hongos de importancia médica, por ello en el laboratorio
micológico existe una amplia variedad de medios de cultivo, cuyos usos están
condicionados al espécimen y hongo a investigar.
La incorporación de agentes antibacterianos como cloranfenicol (16 ug/ml),
gentamicina (5-100 ug/ml), penicilina (20 ug/ml)- estreptomicina (40 ug/ml),
norfloxacina (5 ug/ml), y ciprofloxacina (5ug/ml), incrementan considerablemente la
posibilidad de obtener cultivos libres de presencia bacteriana como contaminante.
También se puede usar la cicloheximida (actidione, 0.5 ug/ml), para inhibir el
desarrollo de hongos saprófitos de rápido crecimiento, pero este es además capaz de
inhibir el desarrollo de algunas levaduras como C. neoformans, Candida spp., T.
beigelii, Aspergillus spp., P. boydii, entre otros; por esta razón el uso de cicloheximida
debe ser cuidadosamente empleada en los medios usados. También se emplea
137
•
d111/111
Sliniswrio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
compuestos específicos o indicadores para poner de manifiesto caracteres

bioquímicos esenciales distintivos de géneros y especies.
Para incrementar la recuperación de algunos hongos dimórficos se emplea
Agar Infusión de Cerebro-Corazón con 10-20% de sangre de carnero. En la Tabla 1 se
listan algunos medios micológicos empleados y su propósito.
También son importantes la temperatura y el tiempo incubación, así como también
los contenedores de los medios de cultivo (placas o tubos). Generalmente se
recomienda como temperatura de incubación de 25-30 °C, así como también a
teraperatura ambiente. Para el reparto de los medios de cultivo es preferible usar
placas, por cuanto ofrecen mayor superficie en donde pueda diseminarse el
espécimen, pudiendo evitarse la deshidratación dispensando aproximadamente 40 ml.
de medio de cultivo por placa. El uso de tubos de gran calibre, usualmente no presenta
el problema de deshidratación, debiendo si, incubárseles al menos 24 horas. En
posición horizontal, para asegurar que el inoculo tome toda la superficie, no debiendo
dejarse la tapa rosca totalmente cerrada, sino ligeramente abierta, para permitir una
adecuada aireación, porque el desarrollo será anormal o inhibido, retardando así la
identificación.
Incubar todos los especímenes al menos cuatro semanas, pudiendo incluso
alargarse hasta seis, cuando se sospeche de H. capsulatum y P. brasiliensis. Todos
los cultivos deben ser manipulados en una cabina.
Tabla 1. Medios empleados más comunes y su propósito
Medio Propósito
Agar Sabouraud Dextrosado 2% Aislamiento primario de hongos saprófitos y
(ASD 2%) patógenos.
A. Mycosel o Mycobiotic Aislamiento primario de dermatofitos.
A. Infusión Cerebro-Corazón Aislamiento primario de hongos saprófitos y
Patógenos.
A. Harina de Maíz (AHM) Identificación de dermatofitos.
AHM-Tween 80 Identificación morfológica de levaduras.
A. Czapek Identificación de especies de Aspergillus.
A. Urea Detección de especies de Cryptococcus y
Trichosporon.
Diferenciación de T. mentagrophytes de
T. rubrum.
Medio Asimilación para Levaduras Identificación de levaduras por asimilación de
(Auxonograma) carbohidratos.
A. Mycobiotic con Rojo de Fenol Aislamiento primario de dermatofitos.
138
• nn
Ilinimerio Salud
1ounnipu
.3,0 EStUDDRW.0
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Incubación
Rutinariamente los cultivos fúngicos deben ser incubados a 27 °C durante 3-4
semanas antes de descartarse. Los cultivos no deben ser descartados cuando un
hongo se aísla primero. Ellos deben mantenerse por el periodo completo de
incubación para asegurar que hongos de crecimiento lento no sean sobrecubiertos.
Los cultivos vaginales de rutina son probados para detectar la presencia de levaduras
y de acuerdo con esto, se incuban a 35 °C durante 2 días solamente. Los cultivos de
Sangre se incuban a 35 °C hasta durante tres semanas. Los cultivos de tejidos son
incubados durante 3 semanas a 27 °C. Todos los otros 139especímenes de rutina se
incuban a 27 °C durante 3 semanas.
Incubación extendida, solo si Histoplasma capsulatum u otro hongo dimórfico
es sospechado.
Para la identificación de hongos en el laboratorio de micología se usan
diferentes esquemas de identificación apropiados dependiendo de la morfología de la
colonia de los organismos aislados. Si un moho es aislado su identificación se
realizará haciendo el estudio macroscópico y microscópico de las colonias que
desarrollan, mientras que para la identificación de levaduras de importancia clínica se
usa el flujograma del anexo 5.
Lectura de los medíos de cultivo

Cultivos de LCR, sangre y biopsias de pulmón (y solicitudes especiales) son
leídos diariamente durante las primeras dos semanas y dos veces por semana por el
restante periodo de incubación. Muestras positivas son trabajadas inmediatamente.
El screening de rutina para los otros cultivos fúngicos es hecho tres veces por
semana en las primeras dos semanas y dos veces por semana por el restante periodo
de incubación. Preparaciones con ALF (azul de lactofenol) son hechas al menos dos
veces por semana o diariamente dependiendo del volumen. Cualquier moho o
levadura referida de la sección de secresiones, hemocultivos o urocultivos es
procesado y trabajado el mismo día excepto domingos y feriados.
139
•
el>de Salud
nn
AOttllek0
nr
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
FASE POST-ANALITICA
REPORTE DE RESULTADO
b) Cultivos Negativos,
Reportar: Negativo a Hongos
c) Cultivos positivos: Reportar según hongo aislado.
/Notificar al clínico posibles hallazgos inusuales (Ejm: C. neoformans, cualquier hongo
dimórfico, entre otros).
/Mantener copia de los resultados en sistema manual o electrónico.
INTERPRETACION
/Cualquier hongo aislado de material clínico debe ser identificado y de ser pertinente
también se realizará la prueba de susceptibilidad antifúngica, los cuales serán
reportados y almacenados en el software de uso en el laboratorio.
/No realizar pruebas de susceptibilidad directamente de la muestra de orina. Estos
métodos no están estandarizados.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

,/ Son consideraos en los procedimientos citados en el anexo 3.
140
Departamento de
Laboratorio de
ANEXO I
AGAR INFUSION DE CEREBO CORAZON (BHIA)
Este medio es recomendado para el cultivo de hongos patógenos de difícil aislamiento

tales como Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis, mantenimiento de la fase
de levadura de hongos dimórficos. La adición de sangre de carnero al 10% incrementa la
posibilidad de aislar hongos dimórficos, así también adicionar cloranfenicol de la misma
manera que en el agar Sabouraud lo hace selectivo, suprimiendo el desarrollo bacteriano.
1. COMPOSICION
a. Agar infusión cerebro corazón 52 g
b. Agua destilada 1000 ml
2. PREPARACION
a. Tubos
i. Adicionar el agar al agua. Mezclar.
ii. Calentar hasta hervir, para disolver el medio completamente.
iii. Dispensar 20 ml. En tubos tapa rosca limpios de 25 x 150 mm.
iv. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
v. Inclinar los tubos sobre el rack de enfriamiento hasta que el agar se
solidifique.
vi. Ajustar las tapas, rotular los tubos y guardarlos dentro de los recipientes de
almacenamiento.
vii. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada recipiente de almacenamiento.
b. Frascos para hemocultivos (bifásico)
i. Adicionar el agar al agua. Mezclar.
ii. Calentar hasta hervir para disolver el medio completamente.
iii. Dispensar 20 ml. En frascos de hemocultivos limpios.
iv. Poner tapón de goma, cubrir la tapa con papel aluminio y atravesar el tapón
con una aguja de extracción de sangre.
v. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
vi. Retirar las agujas, inclinar los frascos sobre el rack de enfriamiento hasta
que el agar se solidifique hasta 24 hr. Aproximadamente.
vii. Agregar asépticamente a cada frasco aproximadamente 15 ml de caldo
infusión cerebro corazón estéril.
viii. Rotular los frascos y guardar.
3. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO: 4 °C (cuarto frío).
4. TIEMPO DE CADUCIDAD
a. Tubos 3 meses.
b. Frascos 6 meses.
5. CONTROL DE CALIDAD
a. Esterilidad
b. Performance: buen crecimiento de Cryptococcus neoformans.
141
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de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
AGAR SABOURAUD CON CLORANFENICOL Y CICLOHEXIMIDA (MICOBIOTIC, MICOSEL)
Para recuperación de hongos patógenos a partir de muestras muy contaminadas con

hongos saprófitos y bacterias, como dermatofitos y hongos dimórficos. Su utilización
requiere de algunas consideraciones por cuanto en capaz de inhibir hongos de importancia
médica (Candida no albicans, especies de Aspergillus, Zygomycetes, Cryptococcus
neoformans, T. beigelii, P. boydii entre otros).
1. COMPOSICION
a. Agar micobiotic o micosel 36 g
2. PREPARACION
a. Adicionar el agar al agua. Mezclar.
b. Hervir hasta disolver el medio completamente.
c. Ajustar el Ph a 6.5 ± 0.2.
d. Dispensar alícuotas de 20 ml. En tubos tapa rosca limpios de 25 x 150 mm.
e. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
f. Inclinar los tubos sobre el rack de enfriamiento hasta que el agar se solidifique.
g. Ajustar las tapas, rotular los tubos y guardarlos dentro de los recipientes de
almacenamiento.
h. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada recipiente de almacenamiento.
4. TIEMPO DE CADUCIDAD: 3 meses.
c. Esterilidad
d. Performance
i. Pobre o ausencia de desarrollo de Staphylococcus aureus.
ii. Pobre o ausencia de desarrollo de Aspergillus flavus.
iii. Buen desarrollo de Trichophyton mentagrophytes.
AGAR AVENA
Usado para la obtención de ascosporas y ascocarpos de los hongos Gymnoascaceae.
1. COMPOSICION
a. Avena 40 g
b. Agar 20 g
c. Agua destilada 1000 ml
2. PREPARACION
a. Hervir la avena a fuego lento en el agua por 1 h.
b. Filtrar a través de gasa.
c. Restituir el volumen a 1 I, agregar el agar y hervir hasta disolver.
d. Dispensar alícuotas de 20 ml. En tubos tapa rosca limpios de 25 x 150 mm.
f. Inclinar los tubos sobre el rack de enfriamiento hasta que el agar se solidifique.
g. Ajustar las tapas, rotular los tubos y guardarlos dentro de los recipientes de
almacenamiento.
h. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada recipiente de almacenamiento.
a. Esterilidad
b. Performance: producción de ascosporas de Saccharomyces cerevisiae.
142
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
AGAR PAPA DEXTROSA
Medio que estimula la formación de conidias, pigmento (rojo en T. rubrum, rosa salmón en
M. audouinii y amarillo en M. canis). También utilizado en la realización de microcultivos o
cepario.
1. COMPOSICION
a. Papa 200 g
b. Glucosa 10 g
c. Agar 15 g
d. Agua destilada 1000 ml
2. PREPARACION
a. Lavar, pelar y cortar la papa en dados pequeños, adicionar el agua.
b. Autoclavar por 10 min. A 121 °C para hacer la infusión de papa.
c. Filtrar la infusión a través de gasa.
d. Adicionar el agar y hervir hasta disolverlo.
e. Agregar la glucosa.
f. Llevar el volumen total a 1000 ml con agua destilada si fuera necesario.
g. Para tubos:
i. Dispensar alícuotas de 5 ml en tubos tapa rosca de 16 x 125 mm.
ii. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
iii. Inclinar los tubos sobre el rack de enfriamiento hasta que el agar se
solidifique.
iv. Ajustar las tapas, rotular los tubos y guardarlos dentro de los recipientes de
almacenamiento.
v. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada recipiente de almacenamiento.
h. Para placas:
i. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
ii. Dispensar 18 ml en placas petri estériles de 15 x 100 mm.
Rotular las placas.
iv. Embolsar para reducir contaminación y deshidratación.
3. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO: 4 °C (cuarto frío)
4. TIEMPO DE CADUCIDAD:
a. Tubos: 3 meses.
b. Placas: 6 semanas en bolsas
a. Esterilidad
b. Performance: buen crecimiento de C. albicans.
143
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ISMITCWICILl
Ilitaiswrit) de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
MEDIO GRANOS DE ARROZ
Utilizado en la diferenciación de aislamientos atípicos de Microsporum audouinii Y

Microsporum canis.
1. COMPOSICION
a. Granos de arroz blanco no enriquecido 8g
2. PREPARACION
a. En frascos tapa rosca de 125 ml, colocar el arroz y el agua destilada.
b. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
c. Ajustar las tapas, rotular los frascos y guardar.
d. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada frasco.
3. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO: 4 °C (cuarto frío)
4. TIEMPO DE CADUCIDAD: 1 mes.
a. Esterilidad
b. Performance
i. Buen desarrollo de Microsporum canis.
ii. No desarrollo de Microsporum audouinii.
AGAR SABOURAUD DEXTROSA (Modificado por Emmons)
Medio estándar para el aislamiento, esporulación y conservación de muchos hongos.

1. COMPOSICION
a. Peptona 10 g
b. Glucosa 20 g
c. Agar 15 g
2. PREPARACION
a. Mezclar los componentes y hervir hasta disolución completa.
b. Para tubos:
solidifique.
almacenamiento.
c. Para placas:
ii. Dispensar 20 ml en placas petri estériles de 15 x 100 mm.
iii. Rotular las placas.
4. TIEMPO DE CADUCIDAD
a. Tubos: 3 meses.
b. Placas: 6 semanas en bolsas.
a. Esterilidad
b. Performance: Buen desarrollo de Candida albicans.
144
• A
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Manual de Procedimientos volttoya

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Departamento de
Versión N° 1
investigación, Docencia
Laboratorio de
CALDO SABOURAUD DEXTROSA
Para la observación de la manera en que las levaduras desarrollan, pudiendo servir

para la identificación de estas.
1. COMPOSICION
a. Peptona 10 g
b. Glucosa 20 g
c. Agua destilada 1000 ml
2. PREPARACION
a. Mezclar los componentes completamente.
b. Dispensar alícuotas de 7 ml en tubos tapa rosca limpios de 16 x 125 mm. Ó 3 ml.
En crioviales de vidrio.
c. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
a. Esterilidad
b. Performance: Buen desarrollo de Cryptococcus neoformans.
AGAR HARINA DE MAIZ
Para estimular la producción de pigmento rojo vinoso de Trichophyton rubrum.
1. COMPOSICION
a. Harina de maíz 40 g
b. Glucosa 20 g
c. Agar 15 g
2. PREPARACION
a. Mezclar la harina de maíz con el agua.
b. Calentar por 1 h a 52 °C o autoclavar por 10 min a 121 °C.
c. Filtrar a través de gasa y luego con papel de filtro Whatman n° 2.
d. Completar a 1000 ml con agua destilada si fuese necesario.
e. Agregar el agar, hervir hasta disolverlo.
f. Adicionar la glucosa y mezclar.
g. Dispensar alícuotas de 7 ml en tubos tapa rosca limpios de 16 x 125 mm.
h. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
a. Esterilidad
b. Performance:
i. Producción de pigmento rojo vino difusible en el agar por Trichophyton
rubrum.
ii. Ausencia de pigmento rojo vino difusible en el agar por Trichophyton
mentagrophytes.
145
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
AGAR HARINA DE MAIZ — TWEEN 80 (Agar morfología)
Para la identificación morfológica de levaduras.
1. COMPOSICION
a. Harina de maíz 40 g
b. Agar 20 g
c. Tween 80 10 ml
2. PREPARACION
a. Mezclar la harina de maíz con el agua.
b. Calentar por 1 h a 65 °C.
c. Filtrar a través de gasa y luego con papel de filtro Whatman n° 2.
d. Agregar el agar, hervir hasta disolverlo.
e. Completar a 1000 ml con agua destilada si fuese necesario.
f. Adicionar el tween 80 y mezclar.
g. Alternativamente agregar 1.5 ml de azul de tripano 1% y mezclar.
h. Para frascos stock:
i. Dispensar alícuotas de 30 ml en frascos tapa rosca limpios de 50 ml.
iii. Dejar solidificar al agar.
iv. Ajustar las tapas, rotular los tubos y guardar.
v. Llenar los datos sobre la etiqueta de los frascos.
vi. Licuar y verter en placas cada vez que se use.
i. Para placas:
vii. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
viii. Dispensar asépticamente 20 ml en placas petri estériles de 15 x 100 mm.
ix. Rotular las placas.
x. Embolsar para reducir contaminación y deshidratación.
a. Esterilidad
b. Performance: Producción de clamidosporas por Candida albicans.
AGAR UREA DE CHRISTENSEN
Utilizado para evidenciar la producción de ureasa por parte de hongos del género
Trichophyton, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula entre otros.
1. COMPOSICION
a. Peptona 1g
b. Cloruro de sodio 5g
c. Fosfato monopotásico 2g
d. Rojo de fenol 0.012 g
e. Agar 20 g
f. Urea 20 g
g. Agua destilada 1000 ml
146
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MOS
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de Salud
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
2. PREPARACION
a. Esterilizar la urea por filtración en 100 ml de agua destilada
b. Disolver y hervir los restantes componentes en 900 ml de agua destilada hasta su
completa disolución.
d. Enfriar a 50 °C.
e. Agregar asépticamente los 100 ml de la urea estéril.
f. Dispensar alícuotas de 3 ml en crioviales tapa rosca estériles de vidrio.
a. Esterilidad
b. Performance:
i. Ureasa negativo Candida albicans.
Ureasa positivo Rhodotorula sp.
MEDIO PARA CONSERVACION DE HONGOS
Se utiliza para la conservación de levaduras y otros hongos, congelados a -20 °C.
1. COMPOSICION
a. Skim milk o Leche en polvo 10 g
2. PREPARACION
a. Mezclar la leche en polvo con el agua.
b. Dispensar alícuotas de 3 ml en crioviales tapa rosca estériles de plástico.
d. Ajustar las tapas, rotular los tubos y guardarlos dentro de los recipientes de
almacenamiento.
e. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada recipiente de almacenamiento.
a. Esterilidad.
b. Performance: viabilidad de hongos hasta por 1 año.
AGAR LEEMING Y NOTMAN MODIFICADO
Utilizado para el aislamiento y cultivo de especies de Malassezia.
1. COMPOSICION
a. Peptona 10 g
b. Glucosa 10g
c. Extracto de levadura 2g
d. Bilis de buey desecada 8g
e. Glicerol 10 ml
f. Glicerol monoestearato 0.5 g
g. Tween 60 5 ml
h. Aceite de oliva 20 ml
i. Agar 15g
j. Agua destilada 1000 ml
147
• dila
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de Salud 1111111"1/1111.
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
2. PREPARACION
b. Para tubos:
solidifique.
almacenamiento.
c. Para placas:
ii. Dispensar asépticamente 20 ml en placas petri estériles de 15 x 100 mm.
e d. Para viales:
i. Dispensar asépticamente 3 ml en viales de vidrio y tapar con tapón de
goma y con papel platina.
ii. Colocar una aguja de vacío.
iii. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
iv. Retirar las agujas de vacío.
v. Rotular los viales y guardarlos dentro de los recipientes de
almacenamiento.
vi. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada recipiente de almacenamiento.
a. Tubos y viales: 3 meses.
b. Placas: 6 semanas en bolsas.
a. Esterilidad
b. Performance:
i. Buen crecimiento de Malassezia furfur.
AGAR V8
Utilizado para la producción de ascosporas.

•
1. COMPOSICION
a. Jugo vegetal V8 (Campbell Soup Co.) 350 ml
b. Levadura seca 5g
c. Agar 14 g
2. PREPARACION
a. Disolver la levadura seca con 10 ml de agua destilada y mezclar con el jugo
vegetal.
b. Ajustar el Ph con KOH 20%
c. Mezclar con los otros componentes y hervir hasta disolución completa.
d. Para frascos stock:
i. Dispensar alícuotas de 30 ml en frascos de vidrio limpios de 50 ml y tapar con
tapón de goma y papel platina.
ii. Colocar una aguja de vacío
148
•
NliPh(crio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de

v. Dejar solidificar al agar.
vi. Llenar los datos sobre la etiqueta de los frascos.
vii. Licuar y verter en placas cada vez que se use.
e. Para placas:
ii. Dispensar asépticamente 20 ml en placas petri estériles de 15 x 100 mm.
f. Para tubos:
solidifique.
almacenamiento.
g. Para viales:
i. Dispensar asépticamente 3 ml en viales de vidrio y tapar con tapón de
goma y papel platina.
ii. Colocar una aguja de vacío.
v. Inclinar los viales sobre el rack de enfriamiento hasta que el agar se
solidifique.
vi. Rotular los viales y guardarlos dentro de los recipientes de
almacenamiento.
vii. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada recipiente de almacenamiento.
a. Tubos y viales: 3 meses.
b. Frascos stock: 6 meses.
c. Placas: 6 semanas en bolsas.
a. Esterilidad
b. Performance:
i. Buen crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.
AGAR GLUCOSA 50%
Utilizado en la identificación y aislamiento de cepas osmófilas y osmotolerantes.
1. COMPOSICION
a. Glucosa 500 g
b. Extracto de levadura 5g
c. Agar 13 g
2. PREPARACION
b. Dispensar asépticamente 3 ml en crioviales de vidrio y tapar.
c. Esterilizar en autoclave por 10 min. A 115 °C (10 psi), si el medio se sobrecalienta
durante el autoclavado este se torna de color marrón y debe ser descartado.
149
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11i°ieg•rio de Sadiud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
d. Rotular los viales y guardarlos dentro de los recipientes de almacenamiento.

a. Esterilidad
b. Performance:
1. Cepa osmófila y osmotolerante, buen o débil crecimiento de C. albicans
AGAR GLUCOSA 60%
•
Utilizado en la identificación y aislamiento de cepas osmófilas y osmotolerantes.
1. COMPOSICION
a. Glucosa 600 g
b. Extracto de levadura 5g
c. Agar 13 g
2. PREPARACION
c. Esterilizar en autoclave por 10 min. A 115 °C (10 psi), si el medio se sobrecalienta
durante el autoclavado este se torna de color marrón y debe ser descartado.
d. Rotular los viales y guardarlos dentro de los recipientes de almacenamiento.
a. Esterilidad
b. Performance:
ii. Cepa osmófila y osmotolerante, buen o débil crecimiento de C. albicans
AGAR TABACO
Utilizado para la diferenciación entre Candida albicans de C. dubliniensis, basado en

•
características fenotípicas.
1. COMPOSICION
a. Tabaco de cigarrillos 50 g
b. Agar 20 g
c. Agua destilada 1I
2. PREPARACION
a. Mezclar el tabaco con el agua y hervir por 30 minutos.
b. Filtra a través de gasa.
c. Agregar el agar y completar con agua a 1 I, hervir hasta disolver.
d. Llevar el Ph a 5.4
f. Dispensar 20 ml de medio en placas petri estériles de 15 x 100 mm.
g. Rotular las placas.
h. Embolsar para reducir contaminación y deshidratación.
150
• 111111
eti 1119
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de

5. CONTROL DE CALIDAD:
a. Esterilidad
b. Performance: Producción de colonias marrón-amarillentas, hifas flemosas alrededor
de las colonias y abundantes clamidosporas por C. dubliniensis.
AGAR ARROZ
Utilizado para la identificación morfológica de levaduras
1. COMPOSICION
a. Arroz no fortificado 200 g
b. Agar 20 g
c. Agua destilada 1I
2. PREPARACION
a. Mezclar el arroz con el agua y hervir por 5 minutos.
b. Filtrar a través de gasa.
c. Agregar el agar y completar con agua a 1 I, hervir hasta disolver.
d. Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
c. Dispensar 20 ml de medio en placas petri estériles de 15 x 100 mm.
d. Rotular las placas.
e. Embolsar para reducir contaminación y deshidratación
a. Esterilidad
b. Performance: Producción de clamidosporas por C. albicans.
CALDO SABOURAUD HIPERTONICO
Utilizado para la diferenciación entre Candida albicans de C. dublíniensis, basado en

características fenotípicas.
1. COMPOSICION
a. Peptona 10 g
b. Glucosa 20 g
c. Cloruro de Sodio 65 g
d. Agua destilada 1I
2. PREPARACION
a. Mezclar los componentes completamente.
b. Dispensar alícuotas de 1 ml en crioviales de vidrio.
a. Esterilidad
b. Performance: Desarrollo de C. albicans.
151
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
MEDIO CICLOHEXIMIDA 0.01%
Utilizado para la identificación de hongos que toleran la presencia de cicloheximida.
1. COMPOSICION
a. Cicloheximida 0.1 g
b. Acetona 2.5 ml
c. Base Nitrogenada de levaduras 6.7 g
d. Glucosa 10 g
e. Agua desionizada 100 ml
2. PREPARACION
a. Disolver la cicloheximida en la acetona y los otros ingredientes en el agua.
b. Mezclar las soluciones y esterilizar por filtración.
c. Para usar, adicionar asépticamente 0.5 ml a 4.5 ml de agua estéril.
a. Esterilidad
MEDIO CICLOHEXIMIDA 0.1%
1. COMPOSICION
a. Cicloheximida 1g
b. Acetona 2.5 ml
c. Base Nitrogenada de levaduras 6.7 g
d. Glucosa 10 g
e. Agua desionizada 100 ml
2. PREPARACION
a. Disolver la cicloheximida en la acetona y los otros ingredientes en el agua.
b. Mezclar las soluciones y esterilizar por filtración.
c. Para usar, adicionar asépticamente 0.5 ml a 4.5 ml de agua estéril.
a. Esterilidad
MEDIO CICLOHEXIMIDA 0.01% MODIFICADO
1. COMPOSICION
a. Agar Micobiotic 0.9 g
b. Extracto de levadura 0.67 g
c. Glucosa 0.75 g
d. Agar 1.25 g
e. Agua destilada 100 ml
2. PREPARACION
152
•
1,1"-T% 94D Da .0,
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10111/111111111.
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
a.
Mezclar los componentes y hervir hasta disolución completa.
b.
Dispensar asépticamente 3 ml en crioviales de vidrio y tapar.
c.
Esterilizar en autoclave por 15 min. A 121 °C.
d.
Inclinar los tubos sobre el rack de enfriamiento hasta que el agar se solidifique.
e.
Ajustar las tapas, rotular los tubos y guardarlos dentro de los recipientes de
almacenamiento.
f. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada recipiente de almacenamiento.
a. Esterilidad
MEDIO CICLOH EXIMIDA 0.1% MODIFICADO
1. COMPOSICION
a. Agar Micobiotic 9g
b. Extracto de levadura 0.67 g
c. Glucosa 0.75 g
d. Agar 0.125 g
e. Agua destilada 100 ml
2. PREPARACION
d. Inclinar los tubos sobre el rack de enfriamiento hasta que el agar se solidifique.
e. Ajustar las tapas, rotular los tubos y guardarlos dentro de los recipientes de
almacenamiento.
f. Llenar los datos sobre la etiqueta de cada recipiente de almacenamiento.
a. Esterilidad
3. Performance: Desarrollo de C. albicans.8.
153
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Departamento de
investigación, Docencia
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Versión N° 1
deo
Laboratorio de
ANEXO 2
Preparación de colorantes y reactivos del Laboratorio de Micología
COLORANTE DE KANE
Empleado en la demostración de estructuras fúngicas en raspados de piel,

especialmente en lesiones provenientes de la pitiriasis versicolor.
Glicerina 10.0 ml
Tween 80 10.0 ml
Fenol 2.5 g
Azul de metileno 1.0 g
Agua destilada 480.0 ml
Disolver la glicerina, el Tween 80 y el fenol en el agua destilada calentando
ligeramente, luego añadir el azul de metileno hasta disolver. Conservar en frasco color
caramelo.
LACTOFENOL DE AMMAN
Este aclarante se emplea preferentemente para la observación microscópica de

los cultivos y de algunas muestras en las que se quiere mantener la estructura de sus
elementos.
Fenol 20 g
Acido láctico 20 ml
Glicerina 40 ml
Agua destilada 20 ml
Primero se mezcla el ácido láctico y la glicerina con el agua destilada, y
seguidamente se añaden los cristales de fenol, previamente fundido a 60 °C en baño
maría, bajo agitación hasta la disolución de los mismos.
AZUL DE LACTOFENOL
Es usado como colorante y líquido de montaje. El ácido láctico actúa como

agente aclarante y ayuda en la preservación de estructuras fúngicas, el fenol actúa
como agente fungicida, la glicerina previene la deshidratación y el azul de algodón da
el color a las estructuras.
Fenol 20 g
Acido láctico 20 ml
Glicerina 40 ml
Azul de algodón 0.05 g
(o sol. Acuosa 1%, 2 ml)
Fundir el fenol previamente a 60 °C en baño maría y mezclar con el ácido
láctico, glicerina y el agua, luego agregar el azul de algodón (azul de Poirrier y azul de
anilina son análogos al azul de algodón).
154
eiN
Ministerio dr S41111(1
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
HIDROXIDO DE POTASIO 20%

Usado en la detección de estructuras fúngicas en muestras clínicas por
examen microscópico. Su concentración varía entre el 10 y 40%.
Hidróxido de potasio 20 g
Glicerina 10 ml
Los cristales de KOH se añaden lentamente en agitación hasta su completa
disolución.
SOLUCION ANTIBIOTICA
Usado como inhibidor bacteriano de medios de cultivo.
Cloranfenicol (cápsula) 500 mg
Etanol 95% 10 ml
Disolver el contenido de la cápsula en el alcohol y utilizar 1 ml por litro de
medio de cultivo a preparar.
155
•
10 ~
IIMKt 1
11190
linimerie de Silll1(1
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 3
Procedimientos especiales para la identificación de hongos del Laboratorio
de Micología
HIDROLISIS DE LA UREA
La hidrólisis de la urea en el Medio de Christensen causa una elevación del pH

por la formación de amonio. Esta característica es algunas veces variable por lo que no
puede ser usado como criterio concluyente en la identificación de dermatofitos. Esto es
usado principalmente para distinguir a T. rubrum de T. mentagrophytes.
1. MATERIALES
a. Inclinados de agar urea de Christensen.
b. Colonia fúngica sobre medio sólido.
a. T. mentagrophytes, (Cryptococcus neoformans) reacción positiva (rojo).
b. T. rubrum, (Candida albicans) reacción negativa (amarillo).
3. PROCEDIMIENTO
a. Inocular al agar urea inclinado de Christensen con una porción de la colonia.
b. Incubar a 25 °C por 7 días.
4. RESULTADOS ESPERADOS
a. Una reacción positiva es vista en un cambio del color original amarillo del medio
a un color rojo.
PRUEBA DEL MEDIO DE ARROZ
La prueba del grano de arroz estéril es utilizada en la distinción de aislamientos

atípicos de M. canis de aislamiento de M. audouinii.
1. MATERIALES
a. Frascos conteniendo granos de arroz estériles.
b. Asa de inoculación en aguja de espiga larga.
2. PROCEDIMIENTO
a. Con la aguja de inoculación, transferir una pequeña porción del aislamiento a
un frasco conteniendo granos de arroz estériles.
b. Incubar el frasco a 30 °C y examinar si hay crecimiento hasta 8-10 días.
a. Aislamientos conocidos de M. canis y M. audouinii deben ser corridos cada vez
que se corre la prueba.
4. INTERPRETACION
a. Positivo
Rápido crecimiento sobre el grano de arroz, típicamente con muchas conidias
y con fuerte pigmento amarillo: M. canis.
b. Negativo
Ausencia de crecimiento con o sin decoloración marrón del grano de arroz en
el sitio de inoculación: M. audouinii.
156
•
0.
5
Nlini,terio de Salud ISTJTC WIVrie SkIll
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
PROCEDIMIENTO TINTA CHINA MODIFICADA
El empleo de mercurio cromo al 2% como modificación a la técnica

convencional de la tinta china, permite la observación de algunas estructuras externas e
internas de la levadura encapsulada C. neoformans, provenientes de LCR u otros
especímenes biológicos.
1.- Espécimen
Especímenes líquidos y suspensiones acuosas de hongos provenientes de cultivos a
ser examinados.
2.- Preparación de la Tinta China Modificada
a) Tinta China.
b) Mercurio Cromo 2%:
Mercurio Cromo 2g
3.- Control de Calidad
A. Asegurarse que la tinta china no esté contaminada en el momento de usarse,
siguiendo la técnica pero sin adicionar muestra.
B. Emplear una suspensión acuosa de C. neoformans capsulada, para la
demostración de la cápsula.
4.- Procedimiento
A. Sobre una lámina portaobjetos colocar una pequeña gota del espécimen a
investigar.
B. Adicionar una pequeña gota de mercurio cromo 2% y mezclar con el espécimen.
C. Adicionar inmediatamente una pequeña gota de tinta china y mezclar. La
preparación debe ser rojizo parduzco, no negro. Finalmente colocar una laminilla
sobre la preparación.
D. Observar la preparación con un microscopio de campo claro a 100x, 400x y 1000x.
5.- Resultados
La tinta china modificada crea un halo claramente demarcado alrededor de la levadura,
además de otras estructuras, contra un fondo oscuro rojizo, dado por las partículas de
carbón y el mercurio cromo.
Fig. Nº 1, Cryptococcus
neoformans en líquido
céfalo-raquídeo.
157
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO

Prueba simple y rápida para la identificación presuntiva de Candida albicans y Candida
dubliniensis, donde hay producción de tubos germinativos en plasma de carnero.
I. MATERIALES
a. Plasma de carnero estéril
i. Obtener plasma de carnero de la Sección de Esterilización y
Preparación de Medios y Reactivos del Servicio de Microbiología.
Alícuotas de 0,5 ml son almacenados a -20 °C (refrigeradora sección
secreciones)
iii. La fecha de caducidad es de 6 meses desde el día en que el plasma de
carnero fuera alicuotado.
iv. El recipiente de alícuotas en uso están almacenados de 2-8 °C.
b. Organismos control
i. C. albicans ATCC 14053 ó C. albicans N° (micoteca)
ii. C. tropicales ATCC 66029 ó C. tropicales N° (micoteca)
iii. Mantenidos sobre ASD a T° Amb.
c. Asas de Khole
d. Baño maría a 35 °C. ± 1 °C
e. Láminas portaobjetos.
f. Laminillas cubreobjetos.
II. CONTROL DE CALIDAD
a. Las siguientes levaduras deben ser incluidas cada vez que la prueba se realice:
i. Tubo germinativo positivo, C albicans ATCC 14053 ó C. albicans N°
ii. Tubo germinativo negativo, C. tropicales ATCC 66029 ó C. tropicales
N°
III. PROCEDIMIENTO
a. Tocar ligeramente una colonia con el asa de Khole.
b. Suspender las levaduras en un tubo con plasma de carnero, previamente
rotulado con el número de la muestra.
c. Incubar en baño maría a 35 °C ± 1 °C de 2.5 a 3 h.
d. Colocar 2 a 3 asadas de la suspensión sobre un portaobjetos rotulado con el
número de muestra.
e. Cubrir la suspensión con laminilla cubreobjetos.
f. Examinar a 40x y 100x para la detección o ausencia de tubos germinativos. El
tubo germinativo es una extensión sin constricción originada por una levadura,
si hay constricción es una pseudohifa o un brote de la misma. Un mínimo de 5
tubos germinativos deben ser observados para dar como positivo el
aislamiento.
IV. LIMITACIONES
a. Un sobreinóculo inhibe la producción de tubos germinativos.
MORFOLOGIA DE LEVADURAS - CULTIVO EN PLACA DE DALMAU

El método de Dalmau es recomendado para el estudio de la morfología de las
levaduras.
PROCEDIMIENTO
1. Preparar placas con Agar Harina de Maiz con Tween 80 (AHM-T80).
1. Con un lápiz para vidrio dividir la placa en 4 sectores y utilizar cada sector rotulando
con el número de muestra de cada levadura aislada.
2. Con una aguja de inoculación tocar ligeramente la colonia a probar, practicar dos
estrías de aproximadamente 1.5 cm. de longitud separadas por 1 cm., sin excavar el
medio.
158
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Departamento de
Versión N° 1
Investigaci3n, Docencia
Laboratorio de
3. Después de flamear y enfriar la aguja de inoculación, practicar una estría en forma de

"S" cruzando las dos estrías realizadas anteriormente, el aspecto final del preparado es
similar al signo de dólares "$".
4. Finalmente cubrir el preparado con una laminilla cubreobjetos previamente flameada y
enfriada (Fig 1).
5. Incubar la placa a 28 °C y examinar a 24, 48 y 72 h. bajo el microscopio retirando la
tapa, empleando objetivo de bajo (10x) y alto (40x) poder.
CONTROL DE CALIDAD
1. C albicans ATCC 10231, desarrollo con formación de clamidosporas (Fig. 2.)

2. C pseudotropicalis ATCC 8553, desarrollo con ausencia de clamidosporas
Fig. Nº 1. Preparación
del método de Dalmau
Fig. 2. Observación microscópica (40x) de C.

albicans, mostrando formación de clamidosporas,
hifas, pseudohifas y blastosporas.
PROCEDIMIENTO HIDROXIDO DE POTASIO 20%
La demostración de estructuras fúngicas se logra utilizando el hidróxido de potasio,

como aclarante a partir de especimenes enviados al laboratorio para investigación de hongos
comprometidos.
I. Espécimen
Pueden ser cualquiera de las obtenidas entre los alumnos así como muestras clínicas
procedentes de pacientes afectados con micosis superficiales.
II. Control de Calidad

Chequear el reactivo antes de usar, si la solución está carbonatada desecharla. Usar
una porción de esputo o raspado de piel, para confirmar que el espécimen se disuelve.
159
•
Mini,lorio de tialud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
III. Procedimiento
a. Colocar una porción del material a ser examinado sobre una lámina portaobjetos limpia.
b. Adicionar una gota de KOH 20% al material y mezclar.
c. Colocar una laminilla cubreobjetos sobre la preparación, presionando suavemente.
d. Permitir que la solución ejerza su acción aclarante, por espacio de 10-20 minutos a
temperatura ambiente y con la ayuda de papel filtro retirar el exceso de KOH, por
cuanto este deteriora los lentes del microscopio, si llegaran a tocarlo. Las láminas
pueden ser calentadas ligeramente pasándola dos a tres veces por el mechero, con el
objeto de acortar el tiempo de aclaramiento, evitar hervir el preparado.
e. Observar el preparado con objetivos de 20x y 40x para la observación de estructuras
fúngicas, cuidando que la iluminación del microscopio sea ajustada apropiadamente
MONTAJE POR FRAGMENTACION DEL TALO
Una preparación por fragmentación es la técnica mas común y rápida para montaje de hongos
y su examen microscópico. Desde que el crecimiento de los mohos, fragmentado con agujas
de disección, conidias o esporas pueden ser dislocadas de las células conidiógenas o
esporógenas. Puede ser necesario el uso de técnicas de microcultivos si la identificación no
puede ser realizada de los montajes con cinta scotch.
I. MATERIALES
a. Agujas de inoculación de mango largo.
b. Dos agujas de disección.
c. Azul de lactofenol.
d. Porta y cubre objetos limpios.
e. Esmalte de uñas claro.
II. PROCEDIMIENTO
f. Colocar una gota de azul de lactofenol justo por fuera del centro de la lámina
portaobjetos limpia.
g. Con la aguja de inoculación, remover suavemente un fragmento del crecimiento
entre la mitad del centro y borde de la colonia. Colocar el material en el
lactofenol.
h. Con las dos agujas de disección, fragmentar suavemente la porción de colonia
hasta diseminarla finamente en el azul de lactofenol.
i. Colocar el cubreobjetos por el borde del azul de lactofenol, y presionar
suavemente con un objeto punteagudo.
j. Evitar la formación de burbujas de aire bajo el cubreobjetos. Remover el exceso
de azul de lactofenol de los bordes del cubreobjetos por secado con papel
toalla.
k. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas para preservar el
montaje.
141. REFERENCIAS
I. McGinnis, M. R., and L. Pasarell. 1992. Yeast identification using morphology,
p. 6.9-1 — 6.9-2. In H. lsenberg (ed.), Clinical Microbiology Procedures
Handbook, vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
160
•
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Ministerio de Salud wi
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
MONTAJE CON CINTA SCOTCH
Este Método usualmente mantiene la posición original de las estructuras fúngicas

características. Sin embargo, el organismo debe crecer sobre medios plaqueados además de
ser examinados por este método.
MATERIALES
a. Cinta scotch.
b. Azul de lactofenol.
c. Láminas portaobjetos.
d. Cultivo fúngico crecido sobre medio sólido.
II. PROCEDIMIENTO
a. Doblar una cinta adhesiva transparente con el lado adhesivo hacia fuera, de
aproximadamente 4 cm.
b. Mantener la punta asegurada con una pinza y presionar firmemente la superficie de la
colonia con el lado adhesivo.
c. Retirar la cinta suavemente. Hifas aéreas quedan adheridas a la cinta.
d. Separar las puntas de la cinta y colocarla sobre una pequeña gota de azul de
lactofenol sobre una lámina portaobjetos gasta que se adhiera completamente sobre
la lámina.
e. Examinar bajo el microscopio.
III. REFERENCIA
Larone, D. L., 1995. Medically Important Fungi. A Guide to Identification. ASM Press,
Washington, D.C.
MICROCULTIVOS
Exacta identificación de hongos filamentosos basada sobre examen microscópico de

estructuras de esporulación de una colonia. Mientras que la fragmentación del talo es útil, ella
tiene 2 principales desventajas: 1) Si demasiado desarrollo es removido o no es bien
desmenuzado, o si el material es tomado de un área sin esporulación, será dificultoso discernir
estructuras de esporulación. 2) Esporas y conidias son a menudo separadas durante la
preparación del montaje. El sistema de microcultivo consiste de una mini cámara de incubación
diseñara para producir condiciones óptimas de esporulación. Permite examinar la colonia en
varios estadios de desarrollo y mejora las oportunidades de observar la configuración natural
de las esporas y conidias sobre las estructuras fructíferas.
1. Especimenes. Cultivos viables son necesarios para su elaboración.

2. La calidad de la preparación se asegura con la presencia de desarrollo del hongo lo cual
verifica la realización apropiada del microcultivo.
3. Procedimiento.
a. Preparación del sistema estéril

(1) Encaje en el fondo de la placa petri, papel filtro del mismo diámetro.
(2) Poner una varilla de vidrio doblada en forma de V sobre el papel de filtro,
colocar encima una lámina portaobjetos. Sobre el papel de filtro depositar
además 2 cubreobjetos de 22x22 mm (si el moho es de rápido crecimiento
emplear cubreobjetos de 24x40 mm).
(3) Volver a poner la tapa, envolver con papel señalando la parte de arriba,
horneara 180 °C x 1 h.
161
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
(4) Varios sistemas para microcultivos pueden ser ensamblados,

preesterilizados y almacenados en un tambor de metal. Las placas petri
son preferidos porque mantienen mejor la humedad y permiten mas
maniobrabilidad.
b. Seleccionar un medio conocido para estimular la esporulación del moho en estudio.
Se recomiendan medios como Agar Cereal Pablum (ACP) y Agar Papa Dextrosa
(APD), entre otros, debido a que ellos estimulan la esporulación de los
Hyphomycetes. ACP tiene consistencia blanda que permite buena adherencia a la
superficie de vidrio. Cuando presione ligeramente los bloques de agar hágalo
retirando las burbujas de aire hacia fuera. Muchos medios sólidos como APD deben
ser cortados en bloques muy delgados. El exceso de presión en el bloque de agar
puede causar fragmentación.
c. Verter una capa delgada de agar en una placa de petri estéril y cortar bloque de
agar de 2 mm de lado y aproximadamente 1 mm de espesor, Depositar un bloque
de agar sobre el portaobjetos.
d. Usando en todo momento una técnica aséptica, remover con un asa en ángulo
recto, una parte de material esporulante de la colonia e inocular 2-3 áreas del
bloque. Con la ayuda de una pinza, colocar el cubreobjetos encima del bloque y
presionar ligeramente.
e. Adicionar 1-2 ml de agua destilada estéril al papel de filtro, volver a tapar la placa
petri, incubar y observar esporulación a intervalos regulares examinando la
preparación bajo el microscopio. Mantener la preparación húmeda agregando agua
adicional de ser necesario. La interacción del vidrio y el agar además de la
atmósfera húmeda en la placa, estimula el desarrollo de hifas a lo largo del porta y
cubreobjetos. Evitar mucha agua, lo cual permitiría su condensación sobre la tapa
del petri, pudiendo gotear sobre el portaobjetos. Realizar el montaje cuando el
hongo esporule antes que sobre desarrolle en el cubreobjetos, lo cual sucede
usualmente entre 7-21 días.
f. Montajes permanentes pueden ser realizados usando un medio de montaje tal
como gelatina de glicerina o PVA. Montajes preparados en estos medios deben ser
calentados ligeramente sobre un fijador por calor para asentar los cubreobjetos,
remover las burbujas de aire y esparcir el medio de montaje hacia los bordes de la
lámina. Montajes semipermanentes pueden ser preparados en lacto fucsina y el
cubreobjetos sellado por el borde con esmalte para uñas. Remover
cuidadosamente burbujas de aire.
g. Patógenos sistémicos deben ser inactivados por exposición con formaldehído antes
del montaje. Esto no debe ser realizado sin aprobación del encargado de la
sección.
h. Para montar el cubreobjetos, remover este del bloque de agar con una pinza. Cubrir
el área de crecimiento con agente humectante, secar y montar, con el hongo boca
abajo sobre una gota de medio de montaje colocada sobre un portaobjetos limpio.
Cuando monte el cubreobjetos, alinearlo cuidadosamente sobre el medio de
montaje para prevenir el rompimiento del preparado.
i. Para montar el portaobjetos, sostenerlo con pinzas, levantar el bloque de agar con
un asa de inoculación en punta, cubrir el área de crecimiento con agente
humectante y secar. Limpie el reverso del portaobjetos con papel toalla embebido
con solución desinfectante sin alterar el preparado. Coloque una gota de medio de
montaje en el centro del crecimiento y aplicar un cubreobjetos.
j. Rotular la lámina, con número de identificación y otros detalles pertinentes tales
como medio usado, tiempo, etc. del microcultivo.
4. Resultados: La esporulación del hongo es evidente por el tipo de conidiogénesis, siendo
claramente visible para su estudio.
162
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51,1,0
Nlinisierio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
PRODUCCION DE ASCOSPORAS (ESPORULACION)
Una de las características usadas para identificar muchos hongos es el método de

esporulación, disposición y morfología de las esporas producidas. En algunos hongos,
su reproducción sexual produce esporas en un ascocarpo. Este contiene pequeños
sacos, ascos, los cuales contienen ascosporas. El medio usado para demostrar la
producción de ascosporas en las levaduras depende sobre cual especie de levaduras
es sospechada, por ejemplo, Saccharomyces, Schizosaccharomyces y Candida
notvegensis producen ascosporas sobre agar acetato (ascosporas), pero las demás
levaduras producen ascosporas más fácilmente sobre agar jugo V-8.
I. MATERIALES
a. Medios stock de agar ascosporas o agar avena y agar jugo V-8. Frascos x 30
ml para 2 placas)
b. Organismos control
i. S. cerevisiae (micoteca)
ii. Mantenidos sobre ASD a T° Amb.
c. Asas de Khole
d. Estufa 25-28 °C.
g. Set de coloración método de ácido-resitentes de Kinyoun.

a. Ascosporas positivo, S. cerevisiae (micoteca)
III. PROCEDIMIENTO
a. Para las levaduras que producen ascosporas sobre agar ascosporas o agar
avena.
i. Licuar el agar ascosporas o agar avena y enfriarlo a 45 — 50 °C.
ii. Mezclar y verter en placas petri estériles de 15 x 100 mm. Dejar que el
agar solidifique.
iii. Inocular el medio con la levadura a ser identificada.
iv. Incubar a 25 — 30 °C. por 3 a 10 días.
v. Después de 3 días de incubación, realizar un montaje húmedo para
verificar la presencia de ascosporas.
vi. Si las ascosporas son vistas o sospechadas, preparar una suspensión
de las levaduras en una gota de agua sobre un portaobjetos.
vii. Dejar que el fortis seque, fijarlo al calor y colorear con el método ácido-
resistente de Kinyoun.
viii. Examine microscópicamente las ascosporas ácido-resistentes (rojo).
ix. Si no se observan ascosporas, reincubar y reexaminar diariamente por
siete días más. Si el control (S. cerevisiae) es positivo y la prueba es
negativa al final del sétimo día, el resultado es considerado negativo.
b. Para las levaduras que producen ascosporas sobre agar jugo V-8
i. Licuar el agar jugo V-8 y enfriarlo a 45 — 50 °C.
ii. Mezclar y verter en placas petri estériles de 15 x 100 mm. Dejar que el
agar solidifique.
iii. Seguir el procedimiento anterior para levaduras que producen
ascosporas sobre agar ascosporas o agar avena.
163
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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
PROCEDIMIENTO DE MANTENIMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE CULTIVOS DE

LEVADURAS
Las levaduras ascomicetas son mantenidas por lo general sobre agar glucosa-peptona-
extracto de levadura (GPYA). Muchas levaduras basidiomicetas no sobreviven mucho
tiempo sobre ASD aunque desarrollen sobre este. Tales levaduras son mantenidas sobre
agar papa dextrosa (APD) entre 4 y 12 °C y subcultivadas a intervalos de 6 meses. Otras
levaduras como por ejemplo las del género Arxiozyma y Malassezia deben ser
subcultivadas mensualmente. Las levaduras del género Dekkera y Brettanomyces producen
excesivas cantidades de ácido acético, por lo cual la adición de carbonato de calcio 2 % al
medio para neutralizar el ácido se hace necesario, sin embargo estas levaduras necesitan
ser subcultivadas cada dos meses.
Los cultivos por congelación son mantenidos por largos períodos con buenos resultados
además de ser simples y rápidos.
IV. MATERIALES
c. Cepas de levaduras desarrolladas sobre APD.
d. Crioviales con 3 ml de Caldo Sabouraud.
e. Glicerol 60% en agua, estéril.
f. Puntas estériles.
g. Pipeta automática.
h. Rotular con tinta indeleble.
V. PROCEDIMIENTO
c. La cepa a ser congelada es inoculada en 3 ml de caldo Sabouraud.
d. Rotular el criovial con el código correspondiente al index numérico de la micoteca.
e. Incubar el criovial a 28 °C por 24 hr.
f. Luego agitar.
g. Adicionar 1 ml de una solución de glicerol 60 % en agua.
h. Guardar por 1 hora a 4 °C.
i. Luego congelar y mantener las cepas a -20 °C, hasta su uso.
API 20C AUX

El sistema comercial API 20C AUX consiste de 20 pocillos conteniendo substratos
deshidratados en la cual 19 pruebas de asimilación son realizadas. Después de la
inoculación e incubación, las reacciones son interpretadas por comparación de controles de
crecimiento y luego reportadas al software de identificación provisto por el proveedor.
I. Material
Tiras de API 20C AUX
Cubeta de incubación
C Medium
Pipeta repetitiva
Solución salina estéril
II. Procedimiento
1. Crear una cámara húmeda con la cubeta de incubación por distribución de 5 ml de
agua destilada en el fondo de la cubeta.
2. Hacer una suspension de la levadura a investigar en solución salina estéril
correspondiente al tubo 2 McFarland.
3. Transferir 100 pi de la suspensión a una ampolla de C médium y homogenizar.
4. Transferir 200 µI llenando cada pocillo con la suspensión del C médium y levaduras.
5. Ponga la tapa e incube a 28°C x 48-72 hs.
6. Después de 24, 48 (y 72 hs si fuera necesario) chequear si hay crecimiento.
7. Registrar los resultados sobre los formularios suministrados e introduzca los mismos en
el software de identificación de levaduras.
8. Imprima el resultado y registre en el cuaderno de trabajo y el software WHONET.
164
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Departamento de
Laboratorio de
III. Control de Calidad
Las cepas de control de calidad son usadas con cada nuevo lote de tiras.
Usar los siguientes aislamientos:
1. C. albicans ATCC 14053
2. C. guilliermondii ATCC 6260
3. C. pseudotropicalis ATCC 4135
IV. Referencias
Inserto dentro del empaque de API 20C AUX #20210.
PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO PARA DIFERENCIAR HONGOS DEMATEACEOS
La formación del tubo germinativo juega un rol importante en la identificación del género
de hongos demateáceos que forman macroconidias con septos transversales, por
ejemplo, especies de Bipolaris, Drechslera y Exserohilum.
I. MATERIALES
b. Agua destilada estéril
c. Organismos control
i. Especies de Bipolaris y Drechslera (micoteca)
ii. Mantenidos sobre ASD a T° Amb.
d. Asas de Khole
Las siguientes demateáceos deben ser incluidas cada vez que la prueba se
realice:
i. Tubo germinativo orientado a lo largo del eje de la conidia, Bipolaris sp.
N° (micoteca)
ii. Tubo germinativo orientado perpendicularmente al eje de la conidia,
Drechslera sp. N° (micoteca)
III. PROCEDIMIENTO
• Colocar una gota de agua sobre un portaobjetos.

• Inocular la gota de agua con una pequeña porción del crecimiento activo del
hongo. Examinar microscópicamente para confirmar la presencia de conidias.
• Colocar un cubreobjetos sobre la suspensión.
• Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente por 8 — 24 h.
• Examinar la lámina microscópicamente para determinar el origen y orientación
del tubo germinativo.
IV. INTERPRETACION
Ver siguiente tabla:
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Departamento de
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ANEXO 4
ELEMENTOS FUNGICOS CARACTERISTICOS VISTOS EN EL EXAMEN DIRECTO DE
ESPECIMENES CLINICOS
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dentro del eje del pelo. indican infección fálica.

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Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 5
FLUJOGRAMA PROCESAMIENTO DE MUESTRAS MICOLOGICAS
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Departamento de
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FLUJOGRAMA DE IDENTIFICACION DE LEVADURAS
o
o 3
INCUBARA27 'CHASTA 3
INCUBARA35`CX24hrs
INCUBAR35 'CX24hrs
AGARCROMOGENICO
o a:
o
CO
11.
1
o
FLUJOGRAMA DEIDENTIFICACIONDE LEVADURAS
•
LEVAD URA AISLADA
e
pS
ID ENTI FICAC ION
2
e
AGARCROMOGENICO
O
a
B 1:
uy
9
e58
38 1
19 9
11
1
1
171
%ama
IIIVF010"0"111.110
I i II Ie rio d v Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
REFERENCIAS
25. Atlas, R. M. 1993. Handbook of Microbiological Media. CRC Press, Boca Raton, Fla.
26. Larone, D. L. 2002. Medically Important Fungí: a Guide to Identification, 4th ed. ASM Press, Washington, D.C.
27. Freydiere, A.-M., R. Guinet, and P. Boiron. 2001. Yeast identification in the clinical laboratory: phenotypic
methods. Med. Mycol. 39:9-33.
28. McGinnis, M. R. 1980. Laboratory Handbook of Medical Mycology. Academic Press, New York, N.Y.
29. De Hoog, G. S., J. Guarro, J. Gene, and M. J. Figueras. 2000. Atlas of Clinical Fungí, 2nd ed. Centraalbureau
voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands.
30. lsenberg H. D. 2010. Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbiology, Washington,
D.C.
172
el> rtlign
mmirouivateatmolo
Nilinisterio de SaIU(I
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 6: FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE CULTIVO
Examen
Directo Cultivo
PRT-DIDAP- PRT-DIDAP-
001 003
SI
Proceso
1 Automatizado Automatizado
NO
Proceso Manual
Registro de Datos
NO Revisar limitaciones
Conformidad
de procedimiento
SI
SI
Revisar Guía de
Acción de Pánico
Acciones de Pánico
NO
Resultado validado
173
e
mmumucauxsoloncucki
Ministerio de Salud
Departamento de
Laboratorio de
REGISTRO DE REVISIÓN DE EDICIONES

Nombre del Manual: Manual de Micología
Número de Página/ Item Fecha de Firma de

Revisión Aprobación
Revisión Anual Dra. L Patiño
174
•
Ln
1111áir
~11ly4
Minimerio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
METODO INMUNOENSAYO
ENZIMATICO INDIRECTO N° DE FOLIOS: 7
Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

LIC.TM MARIBEL ROXANA DIAZ NOCHE Dra. Lilian Patiño Gabriel
FECHA:
FECHA DE ELABORACION :26/05/2015 FIRMA:
175
e
Saitad
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
PROCESO ANALITICO
METODO INMUNOENSAYO ENZIMATICO INDIRECTO
FECHA: 26 de Mayo 2015

PROCESAMIENTO DE
NOMBRE DEL PRUEBAS POR
PROCEDIMIENTO INMUNOENSAYO CODIGO: PRT-DIDAP-014
ENZIMATICO INDIRECTO
PROPÓSITO
Estandarizar elproceso de las pruebas que se analizan por la
metodología de Inmunoensayo Enzimático Indirecto.
Debe ser cumplido por el personal Tecnólogo Médico de la Sección

ALCANCE de Inmunología del Servicio de Microbiología del INSN.
1. Ley N° 26842 - Ley General de Salud.

MARCO LEGAL 2. Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud
UNIDAD DE
MEDIDA
Personal
Porcentaje de resultados Porcentaje (%) Registro de Solicitudes
Tecnólogo Médico
patológicos vs N° de del Área de
Inmunología
exámenes analizados
NORMAS
1. Resolución Ministerial N° 526-2011 / MINSA, aprueba la "Norma para la Elaboración
de Documentos Normativos del Ministerio de Salud".
2. Resolución Ministerial N° 519 — 2006 / MINSA, aprueba el documento técnico:
"Sistema de Gestión de la Calidad en Salud"
3. Resolución Ministerial N° 676 - 2006 / MINSA, aprueba el documento técnico "Plan
Nacional para la Seguridad del Paciente 2006-2008"
176
•
Minh:tefio detialud
Departamento de
Laboratorio de

I. INICIO Condiciones previas al análisis del Inmunoensayo Enzimático Indirecto
conforme.
2. Recibir las muestras de la sección de separación de muestras.
3. Registrar en el cuaderno de trabajo correspondiente.
4 Registrar las muestras a procesar en la platilla de trabajo de pruebas
manuales.(Ver anexo3)
5. Sacar el número de pocillos necesarios para el número de muestras que se vayan
a procesar incluyendo por duplicado los controles positivos, negativo y suero cut
off (de ser necesario)
6. Diluir la muestra fuera o dentro del pocillo según lo indique el test. (ver anexo 2)
7. Cargar 100 ul de los controles, suero Cut off y muestras diluidas en los pocillos.
8. Tapar mediante lámina adhesiva y llevar la placa al rotador por 2 minutos.
9. Incubar la placa a 37 °C o temperatura ambiente según lo indique el test. (ver
anexo 2).
10.Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada
uno de los pocillos con 350 uL del buffer de lavado del kit.
11.Añadir inmediatamente 100 uL de conjugado, cubrir con lámina adhesiva e
incubar igual que en el paso 10.
12.Retirar la lámina adhesiva y repetir el paso 11.
13.Añadir inmediatamente 100 uL de sustrato e incubar a temperatura ambiente en
oscuridad el tiempo que indique el test. (Ver anexo 2)
14.Añadir inmediatamente la solución de parada a todos los pocillos.(ver anexo 2)
15.Valorar espectrofotométricamente a 450/620nm, antes de 1 hora de acabado el
ensayo
16.Si se presenta algún rechazo en la corrida analítica revisar Guía de alarmas y
rechazos.
17.Realizar la validación de la corrida analítica según los parámetros del test. (ver
anexo 2)
18.Hallar el índice de anticuerpos y reportarlo en la hoja de trabajo y cuaderno.
19.FIN Reporte de resultado analítico validado.
177
.,701~11. 3E103 01140
Nlinimerio Ele Salud
1
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ENTRADAS
CPA CPA Diaria Proceso analítico
SALIDAS

analítico validado
ANEXOS:
1. FLUJOGRAMA DEL PROCESAMIENTO DE PRUEBAS POR MÉTODO DE INMUNO

ENSAYO ENZIMATICO INDIRECTO.
2. CUADRO DE ESPECIFICACIONES DE ENZIMO INMUNO ENSAYO POR
PRUEBA
3. PLANTILLA DE TRABAJO DE PRUEBAS MANUALES
178
•
.111/111
WITC Wall MIDE:
11inimerio de Salud rr
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 1: FLUJOGRAMA DEL PROCESAMIENTO DE PRUEBAS POR EL MÉTODO DE INMUNO ENSAYO ENZIMATICO INDIRECTO.
CPA CONFORME
DILUIR MUESTRA CON DILUYENTE
AGREGAR 100 uL DE MUESTRA DILUIDA EN POCILLOS E

INCUBAR
LAVAR CON SOLUCION DE LAVADO DEL KIT
AGREGAR 100 uL DE CONJUGADO E INCUBAR
LAVAR CON SOLUCION DE LAVADO DEL KIT
AGREGAR 100 uL DE SUSTRATO E INCUBAR
AGREGAR SOLUCION DE PARADA
LEER A 450/620 nm
REVISAR GUIA DE
ALARMA Y RECHAZOS
REPORTE DE RESULTADO ANALÍTICO VALIDADO
179
•
nn
111n110‘CONIDEUItt DEL 110
Ilinisierio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 2: CUADRO DE ESPECIFICACIONES DE ENZIMO INMUNO ENSAYO POR PRUEBA
MARCA DE TIEMPO DE VOLUMEN

DILUCION DE LA
REACTIVO
PRUEBA r DE TRABAJO UDE LAVADOS TIEMPO DE 3RA DE CRITERIO DE
MUESTRA
TIEMPO DE IRA 2DA INCUBACIO SOLUCION VALIDACION DE LA
INCUBACION INCUBACION N DE PARADA PRUEBA
HERPESIIgG
HERPES II IgG
CHLAMYDIATRACHOMATIS IgG
CHLAMYDIA PNEUMONIAE IgG CP >0.9 0.0

100 ul de diluyente
MYCOPLASMA PNEUMONIAE IgG 5 LAVADOS CON CN <0.5 D.O.
de Muestra +5 ul de 37 ° C ± 1 °C 45 MINUTOS 30 MINUTOS 20 MINUTOS 50 uL
300u1 DE BUFFER
VIRUS RESPIRATORIO SINCMAL lgo muestra CUT OFF >0.55
ADENOV1RUS RESPIRATORIO IgG CUT OFF <1.5
EPSTEIN BAR R VCA IgG
VARICELLA ZOSTER IgG

VIRCELL
HIDATIDOSIS IgG
HERPES I IgM
HERPES II IgM
CHLAMYDIATRACHOMATIS IgM CP >0.9 D.0
CHLAMYD1A PNEUMONIAE IgM 25 ul de Sorbente+5

CN <0.5 D.O.
ul de Muestra+75 ul 5 LAVADOS CON
MYCOPLASMAPNEUMONIAE IgM 37 ° C ± 1 °C 45 MINUTOS 30 MINUTOS 20 MINUTOS 50 (fi_
de diluyente de 300u1DE BUFFER CUT OFF >0.55
VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL1gM muestra.

CUTOFF <1.5
ADENOVIRUS RESPIRATORIO IgM
EPSTEIN BARR VCA IgM
VARICELLA ZOSTER IgM
7 AMBIENTE (20- 5 LAVADOS CON 0.0. C.N <0,3, D.O.

RIDASCREEN TOXOCARA IgG 15 MINUTOS 15 MINUTOS 15 MINUTOS 50 ul
490 ul de diluyente + 25°C) 300u1 DE BUFFER C.P >0,8
lOul de muestra
BORDETEL LA PERTUSSIS IgG 50Oul Diluyente de 7 AMBIENTE (20- 3 LAVADOS CON
60 MINUTOS 30 MINUTOS 20 MINUTOS 100 ul
BORDETELLA PERTUSSIS IgM Mx. + 5U1 de Mx 25°C) 300u1 DE BUFFER 0.0. DE CONTROL Y
ANTICUERPOS ANTINUCLEARES CALIBRADORES

DEMEDITEC ANTICUERPOS DS DNA DENTRO DE LOS
990 uL de diluyente 7 AMBIENTE (20- 3 LAVADOS CON RANGOS INDICADOS
ANTICARDIOLIPINAS Ig G/M 30 MINUTOS 15 MINUTOS 15 MINUTOS 100 ul
de Mx+ lOuL de Me 28°C) 300u1 DE BUFFER EN CERTIFICADO DE
ANTICUERPOS ANT1SM ANALISIS DEL TEST.
ANTIBETA 2 CLICOPROTEINA
180
•
41111,11
KIZOat. S Sta9 `X
de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 3: PLANTILLA DE TRABAJO DE PRUEBAS MANUALES
NOMBRE DE LA PRUEBA
FECHA
RESPONSABLE
LOTE DE REACTIVO
1.CP 9.MX 17.MX

2.CP 10. M X 18.MX
3.CN 11.MX 19.MX
4.CN 12.MX 20. M X
5.C.O. 13. M X 21. M X
6.C.O. 14. MI X 22. M X
7.MX 15.MX 23.MX
8.MX 16. M X 24-M X
181
•
~Ii
KSINTOWICW i
i
Nlinisierio de Salud
Ate.cfroo,c,aanul
1,154.45.<
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de

MÉTODO DE
QUIMIOLUMINISCENCIA N° DE FOLIOS: 5
Elaborado por:
Revisado por : Aprobado por:
LIC.TM MARIBEL ROXANA DIAZ NOCHE
FECHA DE ELABORACION : 26/05/2015 FECHA:
Dra. Lilian Patiño Gabriel
FIRMA:
Tecnólo o Médico Jefe de Servicio de Microbiolo la
182
:Ata
t$
Minisierio de Sailtad
fiarn i
CESItt
Departamento de
Manual de Procedimientos ur
Versión N° 1
Laboratorio de
FECHA: 26 de Mayo 2015

NOMBRE DEL PROCESAMIENTO DE
PRUEBAS POR MÉTODO DE
QUIMIOLUMINISCENCIA
PROPÓSITO Estandarizar el proceso de las pruebas que se analizan por la

metodología de quimioluminiscencia.
i Debe ser cumplido por el personal Tecnólogo Médico de la Sección

ALCANCE
' de Inmunología del Servicio de Microbiología del INSN.
1. Ley N° 26842 - Ley General de Salud.

MARCO LEGAL
2. Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud
UNIDAD DE
MEDIDA
Porcentaje de Porcentaje (%) Personal

resultados Registro de Solicitudes Tecnólogo Médico
exámenes analizados Inmunología
NORMAS
1. Resolución Ministerial N° 526-2011 / MINSA, aprueba la" Norma para la Elaboración
de Documentos Normativos del Ministerio de Salud" .
183
•
4" .11111114 1111
11~"
l'húmedo de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
1. INICIO Condiciones previas al análisis para quimioluminiscencia conforme.

2. Recibir las muestras de la sección de separación de muestra e ingresar los
datos del paciente al cuaderno correspondiente.
3. Programación de muestras en el equipo.(ver anexo 1)
4. Ingreso de muestras en el equipo según programación.
5. Procesamiento de las pruebas programadas en el equipo.
6. Si se presentan excepciones visualizar el código de la excepción y remitirse al
Manual del equipo o revisar la Guía de alarmas y rechazos.
7. Revisión de resultados emitidos por el equipo.
8. Escribir los resultados del análisis en la hoja de trabajo y cuaderno.
9. Reportar resultados de análisis.
10.FIN Reporte de resultado analítico validado
ENTRADAS
SALIDAS
Reporte de Historia clínica Diaria Proceso analítico
Resultado analítico
validado
ANEXOS:
1. FLUJOGRAMA DEL PROCESAMIENTO DE PRUEBAS POR MÉTODO DE
QUIMIOLUMINISCENCIAEN EQUIPO ARQUITEC I2000SR
2. PRUEBAS QUE SE REALIZAN POR EL EQUIPO ARQUIRTEC I2000SR
184
•
linimerio de Salud
Departamento de
Laboratorio de
ANEXO 1: FLUJOGRAMA DEL PROCESAMIENTO DE PRUEBAS POR MÉTODO DE QUIMIOLUMINISCENCIA EN EQUIPO

ARQUITEC 12000SR
CPA CONFORME )
SELECCIONAR PETICION DE PACIENTE
IDENTIFICACIÓN DE LA GRADILLA EN EL CAMPO G
COLOCAR POSICIÓN DE LA MUESTRA EN LA GRADILLA

CAMPO P
r IDENTIFICAR LA MUESTRA CAMPO IDM
COLOCAR APELLIDOS DEL PACIENTE EN DETALLES DE

MUESTRA
SELECCIONAR LAS PRUEBAS A REALIZAR Y AÑADIR
SELECCIONAR REANALIZAR LAS

PRUEBAS
INTRODUCIR LA GRADILLA EN EL EQUIPO SI
REVISAR MANUAL
CAPITULO 10
1 REPORTAR RESULTADOS DE ANALISIS
NO
REPORTE DE RESULTADO ANALÍTICO VALIDADO
LLAMAR AL SERVICIO TECNICO
185
Ntinisierio de Saltad
ruta
W171,0 UCIOSAL 1 SAL 110 Da 011
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 2: PRUEBAS QUE SE REALIZAN POR EL EQUIPO ARQUITEC I2000SR
• HEPATITIS Ig G
• HEPATITIS Ig M
• HEPATITIS B Antígeno de Superficie
• HEPATITIS B Anticuerpo contra el antígeno del Core
• HEPATITIS 13 Anticuerpo contra el antígeno de Superficie
• HEPATITIS B Anticuerpo contra el antígeno del Core 1g M
• HEPATITIS B Antígeno Epsilon
• HEPATITIS B Anticuerpo contra el antígeno Epsilon
• HEPATITIS C Anticuerpos totales
• HIV Antígeno - Anticuerpo
• ANTI -CCP
• TOXOPLASMA Ig G
• TOXOPLASMA IgM
• CITOMEGALOVIRUS Ig G
• CITOMEGALOVIRUS Ig G
• RUBEOLA Ig G
• RUBEOLA Ig M
186
•
If
í 1K0111 XII1U)C k1140
Ntinkierio de tillud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de

DETECCCIÓN DE PATÓGENOS
RESPIRATORIOS POR N° DE FOLIOS: 8
INMUNOFLUORESCENCIA

DRA. LILIAN PATINO GABRIEL
Dra. Lilin Patiño Gabriel
FIRMA:
FECHA:
Patólogo Clínico Jefe de Servicio de Microbiología
187
1 l'Un
r
olui
t"(4110di
t
Minimerio (le Saltad
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
NOMBRE DEL DETECCCIÓN DE PATÓGENOS FECHA: 23 de Marzo 2016

PROCEDIMIENTO RESPIRATORIOS POR CODIGO: PRT-DIDAP-016
INMUNOFLUORESCENCIA
Investigación de virus respiratorios: adenovirus, Influenza A, Influenza B,

PROPÓSITO parainfluenza 1, parainfluenza 2, parainfluenza 3 y virus sincitial
respiratorio en cultivo celular y en muestras clínicas mediante técnica de
inmunofluorescencia.
ALCANCE Debe ser cumplido por el personal Tecnólogo Médico de la Sección de

Inmunología del Servicio de Microbiología del INSN.
MARCO LEGAL 1. Ley N° 26842 - Ley General de Salud.

INDICADOR UNIDAD DE FUENTE RESPONSABLE

MEDIDA
Porcentaje de resultados Porcentaje (%) Registro de Solicitudes Personal Tecnólogo Médico del
patológicos vs N° de Área de Inmunología
exámenes analizados
NORMAS
1.Resolución Ministerial N° 526-2011 / MINSA, aprueba la "Norma para la Elaboración

de Documentos Normativos del Ministerio de Salud".
188
•
1371701AWII: MUJA t,?.
Vlinisierio de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
A) DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA TINCIÓN
1. En muestras de Hisopados, éstas deben ser transportadas en medio de transporte. Agitar en un
Vortex el tubo que contiene el hisopado para desprender las células.
2. Transferir las muestras a un tubo de centrifuga cónico y centrifugar a 300 — 500 g. durante 10
minutos a 2-8°C.
3. Retirar y descartar el sobrenadante, incluido el moco que puede rodear el botón de células.
4. Golpear el tubo suavemente para soltar las células, añadir el PBS y resuspender las células
pipeteando nuevamente.
5. Repetir la centrifugación.
6. Retirar y descartar el sobrenadante.
7. Golpear el tubo y añadir suficiente PBS para obtener una suspensión celular opalescente.
8. Poner aproximadamente 25u1 del sedimento en un pocillo de un portaobjetos de múltiples
pocillos, y observar al microscopio para asegurar que la concentración celular es adecuada.
9. Dejar secar el portaobjetos completamente a temperatura ambiente.
10. Fijar las células introduciendo el portaobjetos en un baño de acetona durante 10 minutos a 2-
8°C
11. Sacar los portaobjetos de la acetona y dejar secar completamente a temperatura ambiente.
12. Los portaobjetos pueden conservarse durante 2 o 3 días a 2-8°C en un recipiente hermético
con desecante o a temperatura inferior a -20 °C para almacenamientos más prolongados. Antes
de sacar el portaobjetos del recipiente dejar que alcance la temperatura ambiente
Las muestras de hisopados deben transportarse en 1 -2 ml de medio de transporte. No preparar
portaobjetos a partir de hisopados secos.
- Las muestras fluidas deben recogerse en contenedores estériles.
- Si las muestras no son procesadas inmediatamente, conservar entre 2°C y 8°C hasta máximo de
48 horas. Para periodos más prolongados conservar entre -70°C y 90°C.
189
•
11iaisierio de Salud
Departamento de
Laboratorio de
1. Añadir una gota del reactivo para screening o una gota del reactivo para identificación, a cada
pocillo o cubreobjetos de la técnica de cultivo tradicional. Asegurarse de que el reactivo recubra
toda la superficie de células.
"Utilizar primero el reactivo de screening para determinar la presencia de un virus respiratorio.
En el caso de positividad las muestras deben ser investigadas para cada virus individual con el
reactivo para su identificación especifica".
2. Incubar durante 30 minutos a 36- 38°C en cámara húmeda
3. Enjuagar brevemente el portaobjetos con PBS. Sumergir el portaobjetos durante 10 minutos en
PBS. Dar un ligero lavado con agua desionizada.
4. Secar y añadir una gota de medio de montaje.
5. Colocar un cubreobjetos y presionar suavemente para eliminar burbujas.
6. Observar al microscopio de fluorescencia a 400 x.
7. El control positivo y Negativo debe incluirse para comprobar el correcto funcionamiento del test
cada vez que un nuevo kit es abierto.
8. El modelo de fluorescencia que debe observarse será: Control Positivo: células fluorescentes
verde manzana y aspecto característico. Control Negativo: patrón celular rojo.
9. Una muestra Positiva es aquella en que dos o más células intactas muestran un patrón de
fluorescencia verde manzana característica con una intensidad igual o superior da 2+.
Una muestra Negativa es aquella que contiene un adecuado número de células típicas (al
menos 20) y en la que todas ellas muestran una mínima fluorescencia (< 1) o ausencia de
fluorescencia (0).
Las muestras con una tinción débil y/o una sola célula positiva deben ser consideradas
dudosas.
190
1,III ier i o de Salud ax
ata, 41a.711,
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ENTRADAS
SALIDAS

analítico validado
ANEXOS:
1. FLUJOGRAMA DEL PROCESAMIENTO DE PRUEBAS POR MÉTODO DE

INMUNOFLUORESCENCIA.
2. CUADRO DE ESPECIFICACIONES DE LOS VIRUS RESPIRATORIOS POR EL METODO DE
INMUNOFLUORESCENCIA.
191
•
»VIO VÁCWICESCUM
Ilinimeda de• Szdtad
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 1: FLUJOGRAMA DE INVESTIGACIÓN DE VIRUS RESPIRATORIOS POR EL

MÉTODO DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA.
CPA CONFORME
Obtención de la Muestra
Homogenizar el tubo que contiene el Transferir la Mx. a un tubo

hisopado en un vortex. de centrifuga cónico
Centrifugar a 300-500 g. x 10 min. a Descartar el sobrenadante

2-8° C
Añadir el PBS y resuspender las células Repetir la centrifugación.

pipeteando suavemente.
Golpear el tubo y añadir PBS para Descartar el sobrenadante

obtener una suspensión de células
opalescente.
Poner aprox. 25 ul del sedimento en

un pocillo de un portaobjeto de
multiples pocillos.
Dejar secar el portaobjetos a T° ambiente
Fijar las células introduciendo el Sacar el portaobjetos de la acetona

portaobjetos en acetona x 10 min. a y dejar secar a T° ambiente.
2-8°C.
192
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
Añadir una gota del

Screening de los virus respiratorios
reactivo a cada pocillo.
POSITIVO NEGATIVO
Identificación específica Añadir una gota del

de cada virus reactivo de identificación a
respiratorio cada pocillo.
Incubar x 30 min. a 36-

38°C en cámara húmeda.
Enjuagar el portaobjetos
en PBS, sumergiéndolo por
10 min.
Secar y añadir una gota de

medio de montaje
Colocar el cubreobjetos
POSITIVO
Observar al Microscopio
de Fluorescencia a 400 x.
193
•
"itilst4:rio (11:Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 2: CUADRO DE ESPECIFICACIONES DE VIRUS RESPIRATORIOS POR

INMUNOFLUORESCENCIA
MARCA DE VIRUS RESPIRATORIOS MUESTRA T° DE NUMERO Tiempo Criterio de

REACTIVO TRABAJO CENTRIFUGACI incubación validación
óN
-ADENOVIRUS T° 2 veces: 30 min. Positivo:

VIRCELL -INFLUENZA A ambiente >= 2+
-INFLUENZA B Hisopado Nasal y (20-25°) 300 -500 g36-38° C Fluoresc.
Faringeo o Aspirado X 10' a 2-8°C
-PARAINFLUENZA 1
Nasofaringeo Negativo:
-PARAINFLUENZA 2
-PARAINFLUENZA 3 Fluoresc.
-VIRUS SINCITIAL <1+ o (0)
RESPIRATORIO
194
e
Nlittherio de Salud
~di
Laboratorio de
PCR EN TIEMPO REAL PARA

AGENTES INFECCIOSOS N° DE FOLIOS: 15
ELABORADO POR: JEFE DE SERVICIO: REVISADO POR:

Dra. Ana Zapata Calderon DRA. LILIAN PATIÑO GABRIEL
Patólogo Clínico Jefe de Servicio de Microbiología
195
• •14
~11
115,41
,Ti
‘litd•Icrio de s'alud
Laboratorio de
FECHA: 26 de Marzo 2016

NOMBRE DEL PROCESO ANALITICO DE
PCR EN TIEMPO REAL PARA
PROCEDIMIENTO AGENTES INFECCIOSOS CODIGO: PRT-DIDAP-017
Estandarizar el proceso de las pruebas que se analizan por la

PROPÓSITO
metodología de Reacción en Cadena de la Polimerasa.
Debe ser cumplido por el personal Tecnólogo Médico de la Sección

ALCANCE
de Inmunología del Servicio de Microbiología del INSN.
MARCO LEGAL 1. Ley N° 26842 - Ley General de Salud.

UNIDAD DE
MEDIDA
Porcentaje de Porcentaje (%) Personal

resultados Registro de Solicitudes Tecnólogo Médico
exámenes analizados Inmunología
NORMAS
1. Resolución Ministerial N° 526-2011 / MINSA, aprueba la" Norma para la Elaboración

de Documentos Normativos del Ministerio de Salud" .
3. "Sistema de Gestión de la Calidad en Salud"
196
•
~ft
MTInnütiMX910103.0
de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
1. INICIO Condiciones previas al análisis para PCR en tiempo real conforme al

inserto.
2. Recibir las muestras conforme al instructivo de Recogida y Transporte de
Muestras.
3. Realizar los Procedimientos del Ensayo.
4. Programación de muestras en el equipo.(ver anexo )
5. Ingreso de muestras en el equipo según programación.
6. Procesamiento de las pruebas programadas en el equipo.
7. Si se presentan excepciones visualizar el código de la excepción y remitirse al
Manual del equipo o revisar la Guía de alarmas y rechazos.
8. Revisión de resultados emitidos por el equipo.
9. Escribir los resultados del análisis en la hoja de trabajo y cuaderno.
10.Reportar resultados de análisis.
11.FIN Reporte de resultado analítico validado.
ENTRADAS
SALIDAS
Reporte de Historia clínica Diaria Proceso analítico
Resultado analítico
validado
197
•
("5
11inimerio de Salud
Imi
faltRILICIOX
411100
111
Priwnaa
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
PROCESO ANALITICO DE
PCR EN TIEMPO REAL PARA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
1. PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO

El sistema GeneXpert Dx., integra y automatiza el procesamiento de muestras,
la amplificacion de acidos nucleicos y la deteccion de las secuencias diana en
muestras sencillas o complejas mediante ensayos de PCR y PCR de
transcriptasa inversa en tiempo real.
El sistema consta de un instrumento, un ordenador personal, un lector de

codigos de barras y un software precargado para la realizacion de pruebas con
las muestras recogidas y la visualizacion de los resultados.
El Xpert MTB/RIF incluye reactivos para la deteccion de MTB y la resistencia a

RIF, asi como un control de procesamiento de la muestra (SPC, por sus siglas
en ingles) para controlar el procesamiento adecuado de las bacterias diana y
detectar la presencia de inhibidores en la reacción PCR. El control de
comprobacíon de la sonda (PCC, por sus siglas en ingles) comprueba la
rehidratacion de los reactivos, el llenado del tubo de PCR en el cartucho, la
integridad de la sonda y la estabilidad del colorante.
Los cebadores del Xpert MTB/RIF Assay amplifican una parte del gen rpoB que
contiene la región «central» de 81 pares de bases. Las sondas son capaces
de distinguir entre la secuencia natural conservada y las mutaciones de la
region central que se asocian a la resistencia a RIF.
2. RECOGIDA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
Este ensayo permite procesar muestras de sedimento resuspendido o esputo

fresco. VER Tabla 1 para determinar el volumen adecuado de la muestra.
Tabla 1. Volumen de muestra requerido
Tipo de muestra Volumen mínimo para una Volumen total mínimo para
prueba una prueba y su repetición
Sedimento de esputo 0.5 ml 1 ml
Esputo fresco 1 ml 2 ml
3. CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
198
• ¡Mita
MINIO
»TM 11~1~
Laboratorio de
Microbiología
Microbiología Página 199
Las muestras deben conservarse a 2 °C — 8 °C antes de su procesamiento

siempre que sea posible. No obstante, si es necesario, las muestras pueden
conservarse a un máximo de 35 °C durante 3 días y entre 2 — 8 °C durante 4 a
10 días.
4. PROCEDIMIENTO DE RECOGIDA DE MUESTRAS

i. Pida al paciente que se lave la boca dos veces con agua sola.
ii. Abra la tapa del recipiente para recogida de esputo.
iii. Haga que el paciente inspire profundamente, tosa con fuerza y
expectore el material dentro del recipiente. Evite que el
material salpique o manche el exterior del recipiente.
iv. Tape bien el dispositivo de recogida y luego envíe el recipiente
al área de procesamiento
5. PROCEDIMIENTOS DEL ENSAYO

I. PROCEDIMIENTO CON SEDIMENTOS DE ESPUTO
Nota importante: Rechazar las muestras con partículas visibles de comida u

otras partículas sólidas.
Requisitos de volumen: los sedimentos de esputo preparados según el

método de Kent y Kubica y resuspendidos en tampón fosfato 67 mM/agua)
pueden analizarse con el Xpert MTB/RIF Assay. Después de la resuspensión,
conserve al menos 0,5 ml del sedimento resuspendido para el Xpert MTB/RIF
Assay.
1) Etiquete cada cartucho con la identificación de la muestra. Nota: Escriba

en los laterales del cartucho o pegue una etiqueta identificativa. No ponga
la etiqueta en la tapa del cartucho ni tape el código de barras
bidimensional que tiene el cartucho.
2) Con una pipeta de transferencia, transfiera al menos 0,5 ml del total del
sedimento resuspendido a un tubo cónico con tapón de rosca para realizar
el Xpert MTB/RIF. Otra posibilidad es procesar toda la muestra en el tubo
original. Nota: Conserve los sedimentos resuspendidos a 2 °C — 8 °C si no
van a procesarse inmediatamente. No los conserve durante más de 12
horas.
3) Con una pipeta de transferencia, transfiera 1,5 ml del reactivo de la
muestra Xpert MTB/RIF a 0,5 ml del sedimento resuspendido.
199
•
:941blerie de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
4) Agite enérgicamente 10 a 20 veces o utilice un mezclador vórtex durante

10 segundos como mínimo. Nota: Cada movimiento adelante y atrás se
cuenta como una vez.
5) Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego agite la
muestra enérgicamente 10 a 20 veces o utilice un mezclador vórtex
durante 10 segundos como mínimo.
6) Incube la muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos más.
II. PROCEDIMIENTO CON UNA MUESTRA DE ESPUTO

EXPECTORADO
Nota: No acepte muestras con partículas visibles de comida u otras partículas

•
sólidas.
1) Etiquete cada cartucho Xpert MTB/RIF con la identificación de la muestra.

Nota: Escriba en los laterales del cartucho o fije una etiqueta identificativa.
No ponga la etiqueta en la tapa del cartucho ni tape el código de barras
bidimensional que tiene el cartucho.
2) En un recipiente hermético para recogida de esputo:
A. Abra con cuidado la tapa del recipiente para recogida de esputo.
B. Vierta aproximadamente 2 veces el volumen del reactivo de la muestra
en el esputo (dilución 2:1, reactivo: esputo).
Ejemplo 1: 8 ml de reactivo y 4 ml de esputo
Ejemplo 2: 2 ml de reactivo y 1 ml de esputo
Nota: desechar el reactivo de la muestra sobrante y el frasco en un
recipiente para residuos químicos.
C. Tape y cierre bien.
D. Agite enérgicamente 10 a 20 veces o utilice un mezclador vórtex durante
10 segundos como mínimo. Nota: cada movimiento adelante y atrás se
cuenta como una vez.
3) Incube la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente, y luego
agítela enérgicamente 10 a 20 veces o utilice un mezclador vórtex durante
10 segundos como mínimo.
4) Incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.
III. PREPARACIÓN DEL CARTUCHO

Nota: Inicie la prueba en un plazo de 4 horas después de añadir la muestra al
cartucho.
1) Abra la tapa del cartucho y luego abra el recipiente de la muestra.
200
l
ata
O
(.
5 IIMTO ~1405 5E1
de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
2) Con la pipeta de transferencia suministrada, aspire la muestra líquida

hasta la línea de la pipeta. No siga procesando la muestra si el volumen
es insuficiente.
3) Transfiera la muestra al interior de la cámara de muestra del cartucho
Xpert MTB/RIF. Dispense la muestra lentamente para reducir al mínimo el
riesgo de formación de aerosol.
4) Cierre firmemente la tapa del cartucho. Importante: Asegúrese de cargar
el cartucho en el instrumento GeneXpert Dx e iniciar la prueba en un
plazo máximo de 5 horas después de preparar el cartucho.
IV. COMIENZO DE LA PRUEBA

1)Encienda el instrumento GeneXpert:
i. Si está utilizando el instrumento GeneXpert Dx, encienda

primero el instrumento GX Dx y luego encienda el
ordenador. El software GeneXpert se iniciará
automáticamente. o
ii. Si está utilizando el instrumento GeneXpert lnfinity, ponga
en marcha el instrumento. En el escritorio de Windows®,
haga doble clic en el icono de acceso rápido del software.
2) Inicie una sesión en el software del GeneXpert Dx System con su nombre
de usuario y su contraseña.
3) En la ventana GeneXpert Dx System, haga clic en Create Test (Crear
prueba). Aparece el cuadro de diálogo Scan Sample ID (Escanear Id. de
muestra)
4) En el cuadro Sample ID (Id. de muestra), escanee o escriba la Id. de la
muestra. Asegúrese de que escribe la identificación correcta de la
muestra. La Id. de muestra se asocia a los resultados de la prueba y se
muestra en la ventana View Results (Ver resultados) y en todos los
informes. Aparecerá el cuadro de diálogo Scan Cartridge Barcode
(Escanear código de barras del cartucho).
5) Escanee el código de barras del cartucho Xpert MTB/RIF. Aparecerá la
ventana Create Test (Crear prueba). Utilizando la información del código
de barras, el software rellenará automáticamente los cuadros de los
siguientes campos: Select Assay (Seleccionar ensayo), Reagent Lot ID
(Id. del lote de reactivos), Cartridge SN (N.° de serie del cartucho) y
Expiration Date (Fecha de caducidad).
6) Haga clic en Start Test (Iniciar prueba). Introduzca su contraseña si se le
solicita.
201
•
alUn.
N51,115/ II" ItO tX1
Nlini.krio de ',alud 1101fingillrer
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
7) Abra la puerta del módulo del instrumento que tiene la luz verde
intermitente y cargue el cartucho.
8) Cierre la puerta. La prueba se inicia y la luz verde deja de parpadear. Una
vez finalizada la prueba, la luz se apaga.
9) Espere hasta que el sistema desbloquee el cierre de la puerta al final de
la prueba; entonces, abra la puerta del módulo y saque el cartucho.
6. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

TABLA 2.
RESULTADO I NTERPRETACION
MTB DETECTED; Rif Resistance DETECTED La muestra contiene la secuencia diana de MTB:
(MTB DETECTADO; Resistencia a RIF - Se ha detectado una mutación en el gen rpoB
DETECTADA) que está dentro del intervalo válido para delta Ct.
- SPC: NA (no aplicable). No se requiere una señal
de SPC porque la amplificación de MTB puede
competir con este control.
- Comprobación de la sonda: PASS (CORRECTO).
Todos los resultados de la comprobación de
sonda son aceptables.
MTB DETECTED; Rif Resistance La muestra contiene la secuencia diana de MTB:
NOT DETECTED (MTB - No se ha detectado ninguna mutación en el gen
DETECTADO; Resistencia a RIF rpoB.
NO DETECTADA) - SPC: NA (no aplicable). No se requiere una señal
MTB DETECTED; Rif Resistance La muestra contiene la secuencia diana de MTB:

INDETERMINATE (MTB - No se pudo determinar la resistencia a RIF debido
DETECTADO; Resistencia a RIF a una detección insuficiente de la señal.
INDETERMINADA) - SPC: NA (no aplicable). No se requiere una señal
MTB Not Detected (MTB no No se ha detectado la secuencia diana de MTB en la

detectado) muestra:
- SPC: PASS (CORRECTO). El SPC cumplió los
202
•
(11/ it11111A
itnimil
enc
:1'1111:11(2:14Stalul
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
criterios de aceptación.
INVALID (NO VÁLIDO) No se puede determinar la presencia o ausencia de MTB.

El SPC no cumple los criterios de aceptación, la muestra
no se ha procesado correctamente o se ha inhibido la
PCR. Repita la prueba. Consulte el apartado
Procedimiento de repetición de la prueba de este
documento.
- MTB INVALID (MTB NO VÁLIDO): No se puede
determinar la presencia o ausencia de ADN de
MTB.
- SPC: FAIL (INCORRECTO). El resultado para la
secuencia diana de MTB diana es negativo y el Ct
del SPC no está dentro del intervalo válido.
ERROR No se puede determinar la presencia o ausencia de MTB.

Repita la prueba. Consulte el apartado Procedimiento de
repetición de la prueba de este documento.
- MTB: NO RESULT (SIN RESULTADO)
- SPC: NO RESULT (SIN RESULTADO)
- Comprobación de la sonda: FAIL (INCORRECTO).
Uno o todos los resultados de comprobación de
la sonda han fallado. Nota: Si la comprobación de
la sonda es correcta, el error se debe al fallo de
un componente del sistema
NO RESULT (SIN RESULTADO) No se puede determinar la presencia o ausencia de MTB.

Repita la prueba. Consulte el apartado Procedimiento de
repetición de la prueba de este documento. Un resultado
NO RESULT (SIN RESULTADO) indica que no se han
obtenido suficientes datos. Por ejemplo, si el usuario
detiene una prueba en curso.
- MTB: NO RESULT (SIN RESULTADO)
- SPC: NO RESULT (SIN RESULTADO)
- Comprobación de la sonda: NA (no aplicable)
203
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,-.7.-
Departamento de
rhersona,
Versión N° 1
Laboratorio de
PROCESO ANALITICO DE
PCR EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN DE INFLUENZA
1.- PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO.

Prueba diagnóstica in vitro automatizada para la detección cualitativa de la gripe A, la
gripe B y la gripe A subtipo 2009 H1N1.
Los sistemas de instrumentos GeneXpert automatizan e integran la purificación de las
muestras, la amplificación del ácido nucleico y la detección de la secuencia diana en
muestras simples y complejas mediante ensayos de RT-PCR y PCR en tiempo real.
Los sistemas constan de un instrumento, una computadora personal y software
precargado para realizar las pruebas y ver los resultados.
2.- PROCEDIMIENTO.
a. PREPARACIÓN DEL CARTUCHO:
Para muestras de exudados nasofaríngeos:
1. Retire el cartucho y los reactivos del envase.
2. Invierta el tubo de UTM cinco veces para mezclar la muestra.
3. Abra la tapa del cartucho. Con una pipeta de transferencia limpia (suministrada),
transfiera 300 pl del tubo de UTM a la cámara que tiene la abertura grande en el
cartucho.
4. Añada el reactivo de unión 1 en la cámara del cartucho con la abertura pequeña.
Apriete la ampolla hasta que todo el contenido pase al cartucho.
5. Cierre la tapa del cartucho.
Para muestras de lavados/aspirados nasales:

1. Con una pipeta de transferencia limpia de 300 pl (suministrada), transfiera 600 pl
de la muestra (cargando la pipeta con
300 pl dos veces) al tubo de UTM de 3 ml y luego tape el tubo.
2. Invierta el tubo de UTM cinco veces para mezclar la muestra.
3. Retire el cartucho y los reactivos del envase.
4. Abra la tapa del cartucho. Con una pipeta de transferencia limpia de 300 pl
(suministrada), transfiera 300 pl de la muestra
diluida a la cámara que tiene la abertura grande en el cartucho.
5. Añada el reactivo de unión 1 en la cámara del cartucho con la abertura pequeña.
Apriete la ampolla hasta que todo el
contenido pase al cartucho.
204
•
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1517111C g.tCSKI &Lig
Minkie-io de Salud 1110•1rielrilt
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
b. DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO:

1. Tome un cartucho Xpert para cada muestra.
2. Invierta el tubo de UTM 5 veces.
3. Abra la tapa del cartucho.
4. Usando una pipeta limpia de 300 ul (suministrada), transfiera 300 ul (una vez el
volumen de la pipeta) del tubo de UTM a la abertura para muestras del
cartucho.
6. Inicie la prueba dentro de límites de tiempo especificados en el prospecto
ENTRADAS
SALIDAS

analítico validado
ANEXOS:
1. FLUJOGRAMA DEL PROCESAMIENTO DE INFLUENZA POR PCR EN TIEMPO REAL
2. CUADRO DE ESPECIFICACIONES DE LA PRUEBA POR EL METODO DE PCR EN TIEMPO REAL
205
• dita
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WINTOILCO
de viii,
Vlinisrcriu de Salud
Departamento de
Versión N° 1
Laboratorio de
ANEXO 1: FLUJOGRAMA DE PROCESAMIENTO DE INFLUENZA POR EL MÉTODO DE PCR EN TIEMPO

REAL
Obtención de la Muestra
Hisopa do Aspirado:
Nasofaringe lava do nasal
Rompa elhisopo en el interior del Transfiera 600 ul de la muestra al interior

tubo de UTM3rrily tape eltubo. del tubo de UTY13m1; tape el tubo.
Tome un cartucho Xpert para

cada muestra.
Invierta el tubo de In 5
veces.
Abra la tapa del cartucho.
Dansfiera 300 tkl luna vez el volumen de la pipeta) del

tubo de UTNE a la abertura para rruestras del cartucho
Cierre la tapa del cartucho
Inicie la prueba dentro de los limites de

ampo especificados en el prospecto.
206

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PERU Ministerio stituto Nacional de

Visto el Expediente con Registro DG Nº 23770-2015 y el Memorando Nº 213-SM-DIDAP-INSN-2015 de

ue, con Memorando Nº 2194-OGC-INSN-2015, la Directora de la Oficina de Gestión de la Calidad, hace

Con la visación de la Dirección Adjunta con Memorando N°675-DA-INSN-2015, Dirección de Ejecutiva de

" Año de la consolidación del Mar de Grau"

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DEL NIÑO

JEFE DE SERVICIO: DRA. LILIAN PATIÑO GABRIEL

Bustamante Gonzales, Daniel

1. PROCESO ANALITICO DEL EXAMEN DIRECTO

1. PROCESO ANALITICO DEL HEMOCULTIVO 122

RESPIRATORIOS POR INMUNOFLUORESCENCIA 187

Minisleek) lie SIIitili

PROCESO ANALÍTICO DE CODIGO: PRT-DIDAP-001

ELABORADO POR: JEFE DE SERVICIO: Revisado por

111bill.Irrlo de Salud wsirtnc ko," 9110

NOMBRE DEL FECHA:

Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud. Reglamento DS 013-

1. Reglamento de organización y funciones del INSN.RMN 566-2003 AS/DM y sus modificaciones

DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

INICIO: muestra condiciones adecuadas para el examen directo

FIN: reporte de resultado analítico validado

1- Muestra identificada para el procesamiento

Control de Análisis CPA Diaria Proceso analítico

Reporte de Resultado Historia clínica Diaria Proceso analítico

a• FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE EXAMEN DIRECTO

anical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology

ANEXOS 1 : FLUJOGRAMA DE EXAMEN DIRECTO

• PARA UNA MUESTA

PROCESO ANALITICO DE CODIGO: PRT-DIDAP-002

ELABORADO POR: JEFE DE SERVICIO: Revisado por:

Investigación, Docencia Versión N° 1

NOMBRE DEL FECHA: 22/3/2016

Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud. Reglamento DS 013-

DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

INICIO: muestra condiciones adecuadas para la coloración

FIN: reporte de resultado analítico validado

1. Muestra identificada para el procesamiento

b. FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE COLORACIONES

Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology,2010

FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE COLORACIONES

[ Inicio . CPA conforme

PROCESO ANALÍTICO DE CODIGO: PRT-DIDAP-002

ELABORADO POR: JEFE DE SERVICIO: Revisado por:

NOMBRE DEL FECHA: 25/5/2015

Ley N° 27657 - Ley del Ministerio de Salud. Reglamento DS 013-2012 AS

1. Reglamento de organización y funciones del INSN.RMN 566-2003 AS/DM y sus modificaciones

DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

INICIO muestra en condiciones adecuadas para el cultivo

FIN reporte de resultado analítico validado

1. Muestra adecuada para cultivo

Control de Análisis • CPA Diaria Proceso analítico

c. FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE CULTIVO

Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology,2010.

ANEXOS: FLUJOGRAMA DE PROCESO ANALITICO DE CULTIVO

Inicio CPA CO:\TORME

Revisar las Limitaciones de

Revisar Quja de acciones

PROCESO ANALÍTICO DE CODIGO: PRT-DIDAP-004

ELABORADO POR: JEFE DE SERVICIO: APROBADO POR: