Informe #5, 6, 7, 8

Universidad de Guayaquil
Facultad de Ciencias Químicas

Carrera: Química y Farmacia
Laboratorio de Microbiología II
Práctica COLIFORMES TOTALES. NMP
#5, 6, 7, 8 Nombre: Nayeli Angélica Chain Tumbaco. Grupo 3
Objetivos de la práctica de laboratorio
1. Determinar la Calidad Microbiológica del alimento.
2. Determinar la presencia de Indicadores de contaminación fecal.
3. Determinar la eficiencia de un proceso de producción.
Marco teórico
Uno de los grupos de microorganismos recomendados en guías y normas como indicadores de la calidad del
agua potable e importantes para su valoración en términos sanitarios, es el grupo de las bacterias coliformes,
el cual está formado por los coliformes totales y fecales o termotolerantes, estos últimos relacionados con la
posible presencia de contaminación fecal.
Los coliformes son indicadores de contaminación del agua y los alimentos. La determinación y concentración
de estas bacterias en el agua condensada para usos tecnológicos en los centrales azucareros proporciona una
herramienta de control indispensable para conocer su calidad. (Fernández-Santisteban, 2017)
La presencia de Escherichia coli indica contaminación fecal
en agua, ya que este microorganismo es habitante normal del
tracto digestivo de animales de sangre caliente y rara vez se
encuentra en agua o suelo que no haya sufrido algún tipo d
contaminación fecal, por ello se considera como indicador
universal. Este microorganismo genera una alerta a cualquier
sistema de suministro de agua ya que su presencia por si sola puede generar gastroenteritis y causar la muerte
como el caso de la cepa E coli O157:H7 o puede sugerir la presencia de otros microorganismos altamente
patógenos como son la Salmonella, Shigella, Klebsiella, Listeria etc.
La identificación de Coliformes totales es más difícil ya que estos pueden provenir de suelo, y de superficies
de agua dulce por lo que no siempre son intestinales. La presencia de Coliformes sugiere fallas en la eficacia
del tratamiento y la integridad del sistema de distribución. La identificación de las cepas aisladas puede a veces
dar una indicación sobre el origen. (Romero & García, 2019)
La filtración por membrana es el mecanismo mediante el cual se atrapan en la superficie de la membrana
microorganismos cuyo tamaño es mayor que el tamaño del poro 0.45 um, esto gracias a que una bomba eléctrica
ejerce una presión diferencial sobre la muestra de agua haciendo que se filtre. Los contaminantes de tamaño
menor que el específico del poro atraviesan la membrana o se quedan retenidos en su interior, las bacterias
quedan en la superficie de la membrana y luego está es llevada a un medio de enriquecimiento selectivo, en el
IDEAM se utiliza el medio de cultivo Chromocult el cual promueve el crecimiento y la identificación. (Navarro
Roa, 2007)
Los controles microbiológicos rutinarios para determinar la
inocuidad de un alimento se basan en la búsqueda de
microorganismos indicadores cuya presencia nos aporte
información sobre la posibilidad de encontrar
microorganismos patógenos.
Los microorganismos indicadores son microorganismos que
generalmente se encuentran en la materia fecal del hombre y
los animales, su presencia en los alimentos es una evidencia
de que están contaminados con materia fecal de humanos u otros animales de sangre caliente y por consiguiente
con el microorganismo patógeno.
El grupo de microorganismos coliformes es adecuado como indicador de contaminación bacteriana ya que los
coliformes,
✓ Son contaminantes comunes del tracto gastrointestinal tanto del hombre como de los animales de sangre
caliente.
✓ Están presentes en el tracto gastrointestinal en grandes cantidades.
✓ Permanecen por más tiempo en el agua que las bacterias patógenas.
✓ Se comportan de igual manera que los patógenos en los sistemas de desinfección.
Los coliformes fecales y E. coli en particular, se han seleccionado como indicadores de contaminación fecal
debido a su relación con el grupo tifoide-paratifoide y a su alta concentración en diferentes tipos de muestras.
Los coliformes fecales son un subgrupo de los coliformes totales, capaz de fermentar la lactosa a 44.5ºC.
Aproximadamente el 95% del grupo de los coliformes presentes en heces fecales, están formados por
Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los coliformes fecales se encuentran casi
exclusivamente en las heces de animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de
contaminación fecal. Otro de los aspectos negativos del uso de los coliformes totales como indicador es el
hecho de que algunos coliformes son capaces de multiplicarse en el agua.
Los coliformes fecales se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas.
Esta denominación está ganando más adeptos actualmente, pues sería una forma más apropiada de definir este
subgrupo que se diferencia de los coliformes totales por la característica de crecer a una temperatura superior.
La presencia de coliformes totales debe interpretarse de acuerdo con el tipo de aguas: deben estar ausentes en
85% de las muestras de aguas potables tratadas. En caso de estar presentes, su número no puede ser superior a
2-3 coliformes. Esta contaminación a pesar de ser baja, no puede ocurrir en tres muestras recolectas en días
consecutivos. (Red Iberoamericana de Potabilización y Depuración del Agua, 2016)
Reactivos de laboratorio
• Caldo Bilis verde brillante.
• Caldo EC
• Agar EMB
• Agua de peptona
• Caldo RM – VP
• Agar SIM
• Agar Urea
• Agar Citrato de Simmons
Materiales de laboratorio
• Pipetas automáticas
• Tubos de vidrio
• Campanas durhann
• Cajas petri
• Puntas
Equipos de laboratorio
• Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.
• Incubadora a 35° ± 2,0ºC
• Horno para esterilizar material de vidrio
• Potenciómetro
Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento
PRUEBA PRESUNTIVA
Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de Asepsia
1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una distribución uniforme de los
microorganismos.
2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar diluciones.
3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estéril tomar una alícuota de 1 mL de la muestra original y
llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9 ml de agua de peptona estéril, obteniendo de esta manera una
dilución de 10−1
4. Agitar el tubo de la dilución 10−1 y con otra pipeta estéril tomar una alícuota de 1 mL y llevarlo a otro
tubo con 9 mL de agua de dilución estéril para obtener una dilución de 10−2
5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilución de 10−3 o hasta donde sea necesario.
6. Inocular asépticamente con 1 mL de muestra por triplicado tubos de fermentación conteniendo caldo
lactosado o caldo lauryl-triptosa, a partir de las últimas 3 diluciones y conservar todas las anteriores en
refrigeración por si se requieren su utilización posterior.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24 horas.
8. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos,
es decir, con producción de ácido, si el medio contiene un indicador de pH, turbidez y producción de
gas en el interior de la campana Durham.
9. Al hacer esta verificación es importante asegurarse que la producción de gas sea resultado de la
fermentación de la lactosa, en cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo, y no confundir
con burbujas de aire.
10. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas Durham antes de proceder a
la inoculación y desechar aquellos tubos cuyas campanas contengan burbujas de aire o de alguna manera
eliminar éstas y así poder utilizarlos.
11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas confirmatorias para
coliformes totales y coliformes fecales.
12. En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos, continuarán en incubación 24 horas más.
13. Después de 48 horas (± 2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni producción de gas, los tubos se toman como
negativos.
INTERPRETACIÓN:
• Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA DE
COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
• Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán convenientemente y se
procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para
homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB).
2. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 °C.
3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas.
INTERPRETACIÓN:
1. Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el
número de tubos positivos para
2. Posteriormente hacer el cálculo del NMP.
3. Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se consideran
NEGATIVOS, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP
4. Si todos los tubos dan negativos o todos dan positivos, con base en los grados de dilución analizados,
considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución menores (mayores volúmenes
de muestra) o mayores (menores volúmenes de muestra), respectivamente.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:

1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para
homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44.5 ± 0.2 °C. y después de este período,
3. Observar presencia de turbidez y gas.
INTERPRETACIÓN:
1. Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, Si se observa
producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos y
establecer el código para posteriormente hacer el cálculo del NMP,
2. Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez:
3. Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP.
4. Si todos los tubos dan negativos o todos dan positivos, con base en los grados de dilución analizados,
considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución menores (mayores volúmenes
demuestra) o mayores (menores volúmenes de muestra), respectivamente.
Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras, fotos y otros que
así se consideren)
De acuerdo con los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes Totales y Fecales,
establecer los códigos correspondientes para calcular por referencia en las tablas estadísticas el NMP de
Coliformes Totales y Fecales en 10 g o mL de muestra.
En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear para los cálculos la
siguiente ecuación:
Se puede hacer uso de la tabla de NMP, para obtención de los resultados.
Conclusiones
N/A
Recomendaciones
• Trabajar en condiciones de asepsia, cumpliendo todas las medidas de bioseguridad.
• Todo el material para utilizarse en la determinación debe estar perfectamente limpio y estéril.
• Usar los equipos de bioseguridad para evitar algún accidente.
• Al tomar la muestra de su recipiente no olvidarse de taparla al instante que se deja de utilizar.
• Asegurarse de que no permanezcan burbujas de aire en la placa, puesto que esto puede confundirse con
las colonias de microorganismos fermentadores de lactosa.
• Etiquetar debidamente las soluciones preparadas y que se usan en al laboratorio.
• No reutilizar envases para otros productos sin quitar la etiqueta original.
Bibliografía
Norma INEN
AOAC Official Methods of Analysis (Laboratorio de Microbiología) www.fda.gov
www.foodsafey.gov
www.consumaseguridad.com.es
Fernández-Santisteban, M. T. (2017). Determinación de coliformes totales y fecales en aguas de uso
tecnológico para las centrífugas. ICIDCA. Sobre Los Derivados de La Caña de Azúcar, 51(2), 70–73.
https://www.redalyc.org/pdf/2231/223154251011.pdf
Navarro Roa, M. O. (2007). Determinación de escherichia coli y coliformes totales en agua por el método de
filtración por membrana en agar Chromocult. Ideam, 3, 17. http://www.ideam.gov.co/documents
Red Iberoamericana de Potabilización y Depuración del Agua. (2016). Indicadores de contaminacion fecal en
aguas. Ripda Cyted, 224–229. http://tierra.rediris.es/hidrored/ebooks/ripda/pdfs/Capitulo_20.pdf
Romero, D., & García, D. (2019). ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS (COLIFORMES TOTALES Y
FECALES), EN AGUAS RESIDUALES GENERADAS EN PUERTO LIBERTAD QUE
DESCARGAN EN EL ESTERO LIBERTAD. Repositorio Institucional de La Universidad de
Guayaquil, 2, 283. http://repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/44926/1/Articulo cientìfico - Denisse
Romero.pdf

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