UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE

SAN MARCOS
FACULTAD DE QUÍMICA, INGENIERÍA QUÍMICA E INGENIERÍA
AGROINDUSTRIAL

PRÁCTICA DE ANÁLISIS DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

PRÁCTICA N° 7

Aplicación de métodos enzimáticos

DOCENTE: María Calixto Cotos

HORARIO: Viernes 14:00 a 16:00

INTEGRANTES:

Evans Morales, André David

López Zacarias, Angiela

Puertas Popayan, Lesli Kiran

Yataco Rojas, Sigrid Nicole

GRUPO:

N° 2

Lima, Perú

2021
POLIFENOL OXIDASA
La enzima Polifenol Oxidasa (PPO), también conocido como monofenol monooxigenasa, es
la enzima responsable del pardeamiento enzimático en plantas.
El pH y temperatura óptima para su análisis es de 7 y 30°C respectivamente.

PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD DE PPO

Pretratamiento
Se pesaron 200 g de rodajas de manzana, se cortaron en pequeños trozos y se les adiciona 250
ml de acetona fría (-20 °C). El preparado fue homogeneizado en una procesadora Waring
Blender durante 2 minutos a máxima velocidad. El homogenato fue filtrado a través de un
embudo Buchner, utilizando papel Whatman N.°1, y el residuo obtenido fue extraído
nuevamente con 200 ml de acetona fría y filtrado en las mismas condiciones. Este
procedimiento fue repetido tres veces más, obteniéndose finalmente un polvo de acetona que
se secó en estufa de vacío durante cuatro horas a temperatura ambiente, y posteriormente se
almacenó a -20 °C hasta su utilización.
Para la extracción de la PPO, se tomaron 2 g de polvo de acetona y se suspendieron en 120
ml de buffer fosfato de potasio 0,05 M y pH 6,8. La suspensión fue homogeneizada por
agitación durante 30 minutos a 4 °C. Luego, el extracto fue clarificado por filtración con
gasas y, posteriormente, la solución fue centrifugada a 3000 x g durante 10 minutos a 4 °C. El
sobrenadante obtenido, fue utilizado como fuente de enzima para todas las mediciones
realizadas.

TÉCNICA
La actividad de la PPO fue evaluada a 420 nm con el uso de un espectrofotómetro
UV-visible Perkin Elmer, modelo Lambda Bio 20. Los valores obtenidos fueron registrados
en varios intervalos de tiempo, durante tres minutos y el resultado de cada medición
enzimática correspondió al promedio de tres mediciones. Las condiciones del ensayo para la
determinación de la actividad de la PPO, fueron: 0,4 ml del extracto enzimático, 0,1 ml de
catecol (17 mM), buffer acetato de sodio 0.05 M, pH 5,2 obteniendo un volumen final de 2,5
ml. Todas las determinaciones se llevaron a cabo a 30 °C, por triplicado. Se definió la
actividad enzimática (UE) como la cantidad de enzima que cataliza el aumento de 0,1
unidades de absorbancia (UA), por minuto a 420 nm y a 30 ºC.
La actividad enzimática, fue calculada de la porción lineal de la curva y la concentración de
proteína del extracto enzimático fue determinada por el método de Lowry et al. (1951)
utilizando BSA (0,2 mg/l) como patrón. La actividad específica (AE), se definió como la
actividad enzimática por unidad de proteína (UE/mg proteína).

ESTUDIO REALIZADO POR VILLACRÉS Y CASAS (2015)

Las curvas de Michaellis-Menten del extracto de polifenol oxidasa a una longitud de onda de
395 nm. El pretratamiento químico y térmico utilizados en el estudio, no son los tratamientos
óptimos utilizados en la industria. Estos son tratamientos leves que se utilizan para comparar
las actividades residuales de la enzima posterior al tratamiento.

Figura 1
Curva de Michaellis-Menten del extracto de PFO a longitud de onda de 395 nm.

Nota. Fuente: Villacrés y Casas (2015).

La actividad de PFO a una concentración de ácido ascórbico de 5 mg/L, se vio afectada de tal
manera que tuvo un periodo inicial estático , donde la absorbancia no presentó un cambio ya
que la concentración de antioxidante era suficiente para evitar por completo la oxidación
enzimática. El ácido ascórbico reduce la cantidad de quinonas recién formadas evitando el
proceso de oxidación enzimática.

ACTIVIDAD DE LA PPO
Al comparar los resultados de los tratamientos entre sí, se observó que la actividad de la
enzima en tratamiento I fue significativamente menor (p<0,05) que la correspondiente a
los tratamientos II y III en todos los tiempos evaluados (0, 7 y 16 días) y que sugirió un
mayor grado de inhibición de la enzima. Al cabo de 16 días, la comparación de los tres
tratamientos demostró que las concentraciones de aditivos en el tratamiento II, no fueron
suficientes para inhibir la enzima en la totalidad de la fruta, en consecuencia, la AE de la
enzima aumentó, de forma similar a la AE obtenida en la fruta control.

Figura 2
Reacción de oxidación en manzanas.
REACCIONES
El pardeamiento enzimático se debe principalmente a una enzima llamada polifenol oxidasa
(PFO). Esta enzima reacciona con monofenoles o difenoles presentes naturalmente en la
manzana. La enzima cataliza una serie de reacciones que comienzan con la transformación de
un monofenol a un difenol, seguido por la transformación de éste en una quinona. A partir de
la formación de la quinona se forman trifenoles y posteriormente se oxidan a
hidroxiquinonas. Todas estas sustancias son muy reactivas y crean polímeros reaccionando
con sustancias que estén presentes en el alimento, generalmente proteínas. El producto final
se conoce como melanoidinas que son las que crean el color pardo, lo que hace a la manzana
y otras frutas y vegetales indeseables al consumidor, aun cuando éstos se procesan.

Figura 3
Reacción enzimática de PFO.

● EN EL CASO DE UN JUGO DE MANZANA

TÉCNICA:
Se determinó el efecto inhibidor del extracto sobre la PPO, y en consecuencia sobre el
pardeamiento enzimático, comparando las curvas de absorbancia a 420 nm en función del
tiempo de los tratamientos que se detallan oportunamente.

PRETRATAMIENTO
Al momento del ensayo, las manzanas Red Delicious se lavaron con agua destilada con 200
µg mL-1 de cloro, se partieron en cuartos y se le quitaron las semillas. Se extrajo el jugo con
un extractor eléctrico.
El extracto se aplicó en dos concentraciones: 0,1 mL y 0,5 mL de extracto en 10 mL jugo de
manzana. A modo de referencia, se aplicaron además antioxidantes comerciales en
concentración 0,18 mM en jugo de manzana: Ácido cítrico (AC), Ácido ascórbico (AA),
Resorcinol (Res) y Ácido etilendiaminotetracético (EDTA) que son reportados como buenos
inhibidores del pardeamiento enzimático en diferentes productos vegetales.
TRATAMIENTO
Las muestras de jugo recién extraído fueron recolectadas en vasos de precipitados
conteniendo los agentes antioxidantes en las cantidades necesarias para alcanzar las
concentraciones previstas en el ensayo. Cada uno de los sistemas se agitó, se centrifugó a
12.000 rpm durante 10 minutos y se filtró. Los análisis se realizaron por triplicado, midiendo
la absorbancia a 420 nm cada 10 minutos durante 90 min (Denoya et al., 2012). Se calculó el
porcentaje de inhibición del pardeamiento enzimático (% INH) de acuerdo a la ecuación
descrita en la Figura 4.

Figura 4
Fórmula para determinar el porcentaje inhibición del pardeamiento enzimático.

RESULTADOS

Figura 5
Gráfica Tiempo vs Longitud de onda (420 nm).

Los tratamientos que presentaron mayor inhibición de la actividad de la PPO del fue el
extracto OPT 0,5:10 (OPT 0,5) > ácido ascórbico 0,18 mM (AA) > extracto OPT 0,1:10
(OPT 0,1). La concentración del extracto incidió en el efecto de inhibición. En el jugo de
manzanas con el tratamiento OPT 0,5 la concentración en polifenoles totales (PFT) fue de
0,17 µg de ácido cafeico mL-1 de extracto y con el tratamiento OPT 0,1 de 0,03 µg mL-1
encontraron correlación entre la concentración de distintos antioxidantes y la inhibición del
oscurecimiento enzimático.
El ácido cítrico 0,18 mM (AC), el resorcinol 0,18 mM (Res) y el EDTA 0,18 mM mostraron
menor inhibición y curvas de absorbancia superpuestas lo que hace suponer un efecto similar
sobre la actividad de la PPO y el pardeamiento del jugo, al menos durante los 90 min en que
duró el ensayo.

Figura 6
Gráfica Tiempo (min) vs Inhibición del pardeamiento enzimático (%).

Se puso en evidencia que el extracto hidrotérmico 0,5:10 resulta mejor inhibidor de la

actividad de la PPO y en consecuencia del pardeamiento enzimático que el ácido ascórbido
0,18mM de reconocida actividad inhibitoria , con diferencia estadísticamente significativa (p
< 0,05). El porcentaje de inhibición de OPT 0,1. fue significativamente menor al del OPT 0,5
y al del ácido ascórbico, pero no mostró diferencias con inhibidores empleados
comercialmente como el ácido cítrico, el EDTA y el resorcinol.

CUESTIONARIO
1. ¿Qué métodos pueden ser utilizados para cuantificar la actividad enzimática en las
reacciones catalizadas?
Tabla 1
Análisis de métodos continuos empleados en la cuantificación de actividad enzimática

MÉTODOS CONTINUOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Características
Método
Principio Ventajas Desventajas
 Medición de la -Costo es reducido -Sensibilidad baja
variación de -Método sencillo (no identifica
Colorimetría absorción, en el -Resultados diferencias entre
rango visible, pueden ser muestras)
después de una interpretables -Inexactitud.
reacción química. rápidamente.

Medir la diferencia -Alta sensibilidad -Aplicable solo a

de fluorescencia comparada con partículas
entre el producto y análisis fluorescentes
el sustrato. espectrométricos. -La posibilidad de
Fluorimetría interferencia de
impurezas es
mayor
-El compuesto es
inestable cuando
se le expone a luz
visible.

El -Alta sensibilidad -Alto consumo del

desprendimiento -Estabilidad reactante.
de luz confirma la -No produce
Quimioluminiscencia actividad residuos
enzimática que peligrosos.
cataliza una
determinada
reacción.

Se encarga de -Sensibilidad -Alto costo de los

Termoforesis a medir la afinidad -Puede evaluar la equipos
microescala enzima-sustrato, actividad de varias requeridos.
competencia entre enzimas
enzimas y simultáneamente.
constantes de
disociación.

Cuantifica el calor -Está capacitado -Pruebas genéricas

Calorimetría absorbido o para medir y propensas a un
liberado por las ensayos mayor porcentaje
reacciones enzimáticos muy de error.
químicas. complejos.

CONCLUSIONES
➔ El pretratamiento en los métodos enzimáticos es de gran importancia para
acondicionar a la muestra y de esta manera obtener un resultado óptimo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
● Denoya, G.; Ardanaz, M.; Sancho, A.; BENÍTEZ, C.; Gonzáles, & Guidi, S. (2012).
Efecto de la aplicación de tratamientos combinados de aditivos sobre la inhibición del
pardeamiento enzimático en manzanas cv. Granny Smith mínimamente procesadas.
CONICET. Revista de Investigaciones Agropecuarias, 38(3), 263 - 267.
https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/4168728.pdf

● Gomez, P. (2010). Procesamiento mínimo de manzana: efecto de la radiación UV-C y

la luz pulsada de alta intensidad sobre la calidad.[Tesis para optar el título de Doctor
en Química Industrial, Universidad de Buenos Aires].
● Procesamiento mínimo de manzana: efecto de la radiación UV-C (yumpu.com)

● Seidel, S., Dijkman, P., Lea, W., Van den Bogaart, G., Jerabek, M., Lazic, A., Joseph,
J., Srinivasan, P., Basske, P., Simeonov, A., Katritch, I., Melo, F., Ladbury, J.,
Scheiber, G., Watts, A., Braun, D. & Duhr, S. (2013). Microscale thermophoresis
quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.
Methods, 59(3), 301–315. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.12.005

● Villacrés, S & Casas, D. (2015). Efectos de pretratamientos en la actividad de

polifenol oxidasa extraída de manzana (Malus domestica). [Tesis para optar el título
de Ingeniero en Agroindustria Alimentaria en el Grado Académico de Licenciatura,
Escuela Agrícola Panamericana].
Efectos de pretratamientos en la actividad de polifenol oxidasa extraída de manzana
(Malus domestica) (zamorano.edu)