UNIVERSIDAD DE CUENCA

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

CARRERA DE LABORATORIO CLINICO
INFORME DE PRÁCTICAS
ESTUDIANTE: Henry Ortega
CATEDRA: Biología Molecular
CATEDRATICO: Lcdo. Gabriele Bigoni
CICLO: Sexto

TEMA: Extracción de ADN.

OBJETIVO:
FUNDAMENTO: La extracción y purificación de ácidos nucleicos es el primer paso en la mayoría de
los estudios de biología molecular y en diversas técnicas de ADN recombinante. Pueden obtenerse
ácidos nucleicos purificados de diversas fuentes induciendo la lisis celular e inactivando las
nucleasas celulares mediante extracción de ADN y finalmente se obtienen los ácidos nucleicos.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS:

MATERIALES REACTIVOS
o Tubos Eppendorf o Proteinasa K EQUIPOS
o Gradilla o RNAsa A
o Pipetas
o Puntas con filtro o Lysis/Binding Buffer
o Microcentrifuga
o Tubos Recolectores o Etanol al 100%
o Incubadora
o Muestra de sangre o Wash Buffer 1
o Refrigeradora
con EDTA o Wash Buffer 2
o Temporizador
o PureLink Spin o Genomic Elution
Column Buffer

PROCEDIMIENTO:
Fase 1 > LISADO DE SANGRE (Blood Lysate):
- Coloque 200 µl de sangre con EDTA en un tubo Eppendorf.
Añada 20 µl de proteinasa K al mismo tubo.
- Añadir 20 µl de RNasa A.
- Homogeneizar durante aproximadamente 2 minutos.
- Añada .200 µl de tampón de lisis / unión.
- Homogeneizar hasta obtener una solución uniforme.
- Incubar a 55 ° C durante 10 minutos (proteólisis).
- Añada 200 µl de etanol al 100%. Homogeneizar 5 segundos.
- Vaya al paso 2.

Fase 2 > UNION DE ADN (Binding DNA):

- A continuación, conecte la columna de centrifugado PureLink al tubo de recogida

 - Añadir 640 ul de tampón de lisis.
- Seguimos centrifugando a 10.000 rpm durante unos 2 minutos.
- Retire la Columna de Centrifugado PureLink y colóquela en otro tubo colector, se desechará el
tubo colector anterior.
- Entra en la tercera etapa.

Fase 3 > LAVADO DE ADN (Washing DNA):

- Añadir 500 ul de Wash Buffer 1 en el tubo que contiene el PureLink Spin Column.
- Centrifugar nuevamente a 10.000 rpm por aprox. 1 min.
- Retirar el PureLink Spin Column y colocarlo en otro tubo de recolección, el anterior tubo
de recolección se desecha.
- Luego, añadir 500 ul de Wash Buffer 2.
- Centrifugar a máxima velocidad por aprox. 3 min.
- Proceder a la fase 4.
Fase 4 > ELUCION DE ADN (Eluting DNA):
- Deseche el tubo colector y coloque la columna PureLink Spin Column en un tubo
Eppendorf de 1,5 ml.
- Añadir 50 ul de tampón de elución genómico PureLink. Incubar durante 1 minuto a
temperatura ambiente.
- Finalmente, centrifugar a velocidad máxima durante 1 minuto para obtener ADN
purificado.
- Quitar y desechar la columna de giro PureLink.
- -Entra en la quinta etapa.

Fase 5 > ALMACENAMIENTO DE ADN (Storing DNA):

- Se puede almacenar de la siguiente manera:

 -4 °C - Uso continuo.
 -20 °C - 6 meses a 1 año.
 -75 °C - 6 a 7 años.

RECOMENDACIONES/OBSERVACIONES:
- El área de trabajo debe estar limpia.
- Compruebe las cantidades exactas antes de usar.
- No use guantes de látex que contengan talco, ya que el talco interferirá con varias medidas.
- Sólo la punta de la pipeta está en contacto con el reactivo / muestra.
- Usar correctamente la pipeta en vertical.
- Al abrir el tubo de ensayo Eppendorf, sujete la tapa con los dedos para evitar derrames.
- Utilice la punta de la pipeta para empujar la tapa del tubo Eppendorf para un mejor acceso.
- Evite usar guantes para tocar el interior del tubo Eppendorf.
- Evite tocar la membrana PureLink Spin Column con la punta.
- Coloque la columna de centrifugado PureLink con la tapa hacia abajo y colóquela en la
microcentrífuga
- Coloque el tubo Eppendorf con tapa en el lateral de la centrífuga (etapa 4).
- Para observar mejor el contenido del tubo Eppendorf, sosténgalo con dos dedos (índice y
pulgar).
- No tener contacto con PureLink Spin Column cuando reemplace el tubo de recolección.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

1. Anderson, S., Bankier, A., Barrell, B., De Bruijn, M., Coulson, A., Drouin, J., Eperon,
I., Nierlich, D., Roe, B., Sanger, F., Schreier, P., Smith, A., Staden, R. & Young, I. 1981.
Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290: 457-465.

2. Altschul, S., Gish, W., Miller, W., Myers, E. & Lipman, D. 1990. Basic local alignment
search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.

3. Bernstein, F. Koetzle, T, Williams, G. Meyer, E. Brice, M. Rodgers, J., Kennard, O,

Shimanouchi, T. & Tasumi, M. 1977. The ProteinData Bank: A computer-based archival
file for macromolecular structures. J. Mol. Biol. 112: 535-542.

4. Brown, W., George, M. & Wilson, M. 1979. Rapid evolution of animal mitochondriai
DNA. Proc . Natl. Sci. USA. 76(4): 1967-1971.

5. Brown, W. 1980. Polymorphism in mitochondrial DNA of humans as revealed by

restriction endonuclease analysis. Proceeding of the National Academy of Sciences of the
USA. 77: 3605-3609.

6. Cann, R., Stoneking, M. & Wilson, A. 1987. Mitochondrial DNA and human evolution.
Nature. 325(1): 31-36.

7. Genbank (INTERNET): http://ncbi.nlm.nih.gov

8. Higuchi, R., Bowman, M., Freiberger, O. Ryder, 0 & Wilson, A. 1984. DNA sequence
from the quagga member of the horse family. Nature. 312: 282-284.

ANEXO:

- UTILIDAD/FUNCION
RNAsa A Reactivo que puede degradar el ARN presente en la muestra, además
de minimizar la contaminación del ARN en el ADN purificado.
Proteinasa K Es un reactivo que congela de manera eficiente muestras como tejidos y
células y logra la actividad enzimática óptica del tampón de digestión del
genoma PureLink.
Lysis/Binding Este reactivo permite la citólisis y convierte las impurezas a un estado
Buffer soluble o estabiliza las impurezas para separarlas de los ácidos nucleicos.
Además, mantiene el pH y une el ADN a la columna de centrifugación
PureLink, especialmente en la membrana.
Etanol al 100% Reacción de precipitación del ADN. El ADN se expande y se precipita.
Wash Buffer 1 y 2 La solución tampón de detergente puede eliminar todas las impurezas
como sales, enzimas, aceites y detergentes.
Genomic Elution El reactivo de separación de ADN se adhiere a la membrana de la
Buffer columna PureLink Spin y se puede filtrar fácilmente mediante
centrifugación.
Tubos Eppendorf y Los tubos permiten la separación o separación de muestras o reactivos
Tubos Recolectores frente a fuerzas centrífugas relativamente muy altas.
Gradilla Herramienta que brinda soporte tanto a tubos (de ensayo o de muestra).
Puntas con filtro Su función principal es evitar todo tipo de contaminaciones, están
preesterilizados y están libres de ADNasa y RNasas.
Tubo con EDTA El tubo de extracción de sangre al vacío se puede utilizar para analizar
sangre completa que contiene EDTA (ácido etilendiaminotetraacético),
que se une a los iones de calcio y previene la coagulación de la sangre.
PureLink Spin Permite la elución rápida de ADN de rodajas de gel de agarosa,
Column electrolizado, microcentrifugado, libre de ADNasa y ARNasa, el ADN se
prensa / filtra a través de una membrana de tubo de recogida.
Pipetas Herramienta que permite la transferencia de un volumen especifico, estas
pueden tener volumen fijo (1000 ul) o variable (10 – 1000 ul)
Microcentrifuga Equipo que permite separar componentes en dos fases (liquida-solida),
poseen una alta velocidad.
Incubadora El dispositivo mantiene las constantes de temperatura deseadas / óptimas
(como 37 ° C), así como las condiciones óptimas de humedad, dióxido de
carbono y oxígeno.
Refrigeradora Un dispositivo puede almacenar varios reactivos / muestras a bajas
temperaturas de a 70 ° C.
Temporizador Una herramienta que te permite comprobar la hora exacta (segundos,
minutos, horas).