UNIVERSIDAD

NACIONAL DEL CENTRO DEL

PERÚ
DETERMINACION DE PROTEINAS POR

ESPECTOFOTOMETRIA

DOCENTE: De la Cruz Carhumaca Mabel Cindy

ALUMNA: Chanco Canchanya Paola, Abregú Avila Stella, Cuba Uchasara

Vanesa

CURSO: Bioquímica general

SEMESTRE: Quinto

Huancayo-Junín

2021
I. INTRODUCCIÓN

La cuantificación de proteínas con Espectrofotometría es un método que usa la luz

ultravioleta y la espectroscopía visible para determinar de manera rápida la concentración de

proteínas. Es un paso importante en el control de calidad durante el flujo de trabajo de la

biología molecular, para asegurar que los pasos siguientes entreguen resultados certeros. Un

espectrofotómetro permite analizar muestras de proteínas como parte del control de calidad

de un lote e incluso como precursor previo a reacciones adicionales, cuantificar el

contenido proteico en muestras e identificar contaminantes que puedan impactar de manera

adversa los experimentos subsiguientes.

Vamos a estudiar las distintas técnicas que nos permiten analizar el contenido proteico de las

muestras. Tanto para cuantificar, como para calificar proteínas, se pueden usar técnicas de

medida directas e indirectas, calcularemos la concentración de proteínas basándose en la

absorción de la muestra en 280 nm y el coeficiente de extinción específico de la proteína y su

longitud de onda. Para las medidas indirectas, se puede utilizar un colorímetro. Existen

diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:

a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de

derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes,cada

uno de estos métodos tiene sus ventajas e inconvenientes

2.1. PROTEINAS:

(Benitez & García, 2013)Son moléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos.

El término proteína proviene de la palabra francesa protéine y esta del griego πρωτεῖος (proteios),

que significa 'prominente, de primera calidad'. Las proteínas son indispensables para la vida, sobre

todo por su función plástica (constituyen el 80% del protoplasma deshidratado de toda célula),

pero también por sus funciones biorreguladoras (forma parte de las enzimas) y de defensa (los

anticuerpos son proteínas). Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las

biomoléculas más versátiles y más diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del

organismo. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:

✓ Estructural. Esta es la función más importante de una proteína (Ej: colágeno)

✓ Inmunológica (anticuerpos)

✓ Enzimática (Ej: sacarasa y pepsina)

✓ Contráctil (actina y miosina)

✓ Homeostática: colaboran en el mantenimiento del pH (ya que actúan como un tampón

químico)

✓ Transducción o transporte de señales (Ej: rodopsina)

✓ Protectora o defensiva (Ej: trombina y fibrinógeno)

2.2. ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS

La estructura de las proteínas es la forma como se organizan éstas para adquirir una

determinada forma o presentar una disposición característica en condiciones fisiológicas

su conformación estructural y su función, proceso que es denominado “desnaturalización”. La

función de las proteínas depende de la conformación estructural y ésta viene determinada por la

secuencia de aminoácidos. La conformación estructural de las proteínas se divide en cuatro niveles

de organización, (aunque el cuarto no siempre está presente). (Benitez & García, 2013)

✓ Estructura primaria.

✓ Estructura secundaria.

✓ Estructura terciaria.

✓ Estructura cuaternaria.

a) Estructura primaria

Es la forma de organización más básica de las proteínas. Está determinada por la secuencia

de aminoácidos de la cadena proteíca, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en

que están enlazados por medio de enlaces peptídicos. Las cadenas laterales de los aminoácidos se

extienden a partir de una cadena principal. Por convención, el orden de escritura de este tipo de

estructura es siempre desde el grupo amino-terminal hasta el carboxi-terminal. (Benitez & García,

2013)

b) Estructura secundaria

Es el plegamiento regular local entre los residuos aminoacídicos cercanos de la cadena

polipeptídica. Se adopta gracias a la formación de enlaces de hidrógeno entre los grupos carbonilo

(-CO-) y amino (-NH-) de los carbonos involucrados en las uniones peptídicas de aminoácidos
cercanos en la cadena. Estos también se los encuentra en forma de espiral aplana. Esta contiene

básicamente dos conformaciones (Hélice alfa y hoja plegada beta), (Benitez & García, 2013)

c) Estructura terciaria

Es el modo en el que la cadena polipeptídica se pliega en el espacio. Es la disposición de

los dominios protéicos en el espacio. La estructura terciaria posee cantidades variables de helices-

alfa y beta y otras con una estructura flexible que puede cambiar al azar. En esta estructura,

generalmente los aminoácidos apolares se sitúan hacia el interior de la proteína y los polares hacia

el exterior, de manera que puedan interactuar con el agua circundante. (Benitez & García, 2013)

d) Estructura cuaternaria

Deriva de la conjunción de varias cadenas aminoacídicas que gracias a su unión realizan el

proceso de la disjunción, dando así un resultado favorable ante las proteínas ya incrementadas. A

través de la organización proteica cuaternaria se forman estructuras de gran importancia biológica

como los microtúbulos, microfilamentos, capsómeros de virus y complejos enzimáticos. También

las fibrillas colágenas encontradas en el espacio extracelular del tejido conjuntivo están

constituidas por la agregación de cadenas polipeptídicas de tropocolágeno. (Benitez & García,

2013)

2.3. Métodos para la cuantificación de proteínas:

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina

básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere

conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de

enfermedades, así como para otros muchos propósitos. Existen diferentes métodos para la

cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de

capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. (Fernández & Galván, 2016)

2.4. Método de Biuret

Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los

enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración

es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es

bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy

baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por

ejemplo, en suero). (Fernández & Galván, 2016)

Uno de los primeros métodos colorimétricos para la determinación de proteína y que aún

hoy día es de uso frecuente es el método de Biuret, el cual se utiliza cuando se necesitan medidas

rápidas y no muy precisas. Es un método apropiado en los primeros pasos de la purificación de

proteínas debido a que las sales de amonio no interfieren en la formación de la coloración para la

determinación espectrofotométrica Hasta hoy la estructura del complejo coloreado es desconocido,

se supone solamente que la formación del complejo se lleva a cabo por interacción entre el cobre

con el N de las estructuras peptídicas de la proteína y con los restos de tirosina en medio alcalino.

Entre las sustancias que interfieren en la determinación están: las soluciones amortiguadoras como

tris, tampón de Goodsche, las que dan reacciones coloreadas. Otra interferencia se presenta con

iones de cobre, los cuales forman un precipitado rojo en la reacción. Las sales de amonio no

interfieren en la reacción. (Zamora, 2008)

2.5. Espectrofotómetro
 La espectroscopia ultravioleta-visible o espectrofotometría ultravioleta-visible (UV/VIS)

es una espectroscopia de fotones, que utiliza la radiación electromagnética (luz) de las regiones

visible, ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana (IR) del espectro electromagnético. La

radiación absorbida por las moléculas desde esta región del espectro provoca transiciones

electrónicas que pueden ser cuantificadas. En este tipo de técnica se suelen utilizar las radiaciones

del campo UV de 80 a 400 nm, del UV cercano de 200 a 400 nm y de la luz visible de 400 a 800

nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar y cuantificar las soluciones de sustancias en la

región ultravioleta-visible del espectro. (Benitez & García, 2013)

III. MATERIALES
IV. MÉTODOS
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES

5.1. RESULTADOS

Solución Inicial de 20g/ml 1ml=0.02mg/ml

proteína

Tubos 1(bla 2 3 4 5 6

nco) (muestr

a)

volumen ml ml ml ml ml m

en l

Solución 2 4 5 8

proteica

agua 8 6 5 2

Concentr 0. 0. 0. 0.

ación (mg/ml) 04 08 1 16

Toma de 100 10 10 10 10 1

muestra para 0 0 0 0 00

reaccion(ul)
 Concentr 0 0. 0. 0. 0. ?

ación (mg/ml) 004 008 01 016

Rx. 4 4 4 4 4 4

Biuret (ml)

Absorvan 0 0. 0. 0. 0. 0

cia 139 265 393 46 .35

Solución Absorbancia Concentración de la

solución (mg/ml)

Tubo 0 0

N°1: Blanco

Tubo 0.139 0.004

N°2

Tubo 0.265 0.008

N°3

Tubo 0.393 0.01

N°4

Tubo 0.450 0.016

N°5
 Tubo 0.350 ?

N°6:x1

0.018
0.016

0.014
CONCENTRACION

0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
ABSORVANCIA
 POR
FORMULA:

A=C.E.L E=28.125
A=0.350
L=1
ENTONCES
C=0.012

5.2. DISCUSIONES

✓ (Del Puerto, 2013) El método de Biuret se basa en la formación de un complejo coloreado

entre el ion Cu+2 y los grupos NH4 de los enlaces pépticos en medio básico (NaOH o

KOH), es una reacción específica se pone color violeta y se lee a 540nm contra curva

estándar BSA, la intensidad del color es proporcional a la cantidad de proteína y tiene una

baja sensibilidad alta concentración de proteína, con lo que podemos discutir con la autora

ya que en nuestra determinación de proteínas mediante espectrofotometría usamos el

espectrofotómetro a unos 550nm que son 10 nanómetros más de lo que nos indica la autora,

sin embargo en nuestro experimento pudimos obtener buenos a resultados a pesar de que

usamos 10 nanómetros más de lo que nos indica. (Del Puerto, 2013).

✓ Según (Castillo, 2019)en su informe utilizo el kit Erba lachema SRO y nos dice que éste

método se relaciona con en el método de Biuret y éste método le permitió determinar la

lectura de los valores de absorbancia, en el que pudo obtener la concentración de proteína

que presenta un huevo de gallina, en este proceso se evidencio diferentes factores que

afectaron a la medición de las absorbancias, como fue la presencia de impurezas en el

equipo de espectrofotometría UVVis al momento de medir dichos datos, de acuerdo al Kit

Erba lacherma SRO las muestras debían ser sometidas a la oscuridad por un tiempo
 determinado en el que también fue un factor que afecto a la medición, debido a los errores

presentados se pudo obtener cuantificar de la mejor manera la concentración total de las

proteínas, nosotros como grupo decimos que en nuestro caso no usamos calorimetría para

la determinación de proteínas como lo usó (Castillo, 2019) sino que nosotros después de

hacer la disoluciones seguidamente agregamos lo que es el reactivo de Biuret ya que

nosotros utilizamos este método, por lo que discutimos con el autor ya que con su método

obtuvo valores en su concentración y en su absorbancia muy elevadas a comparaciones

nuestras, por ejemplo en su primer tubo de ensayo obtuvo una concentración de 3.16 con

una absorbancia de 0.030 y nosotros obtuvimos una concentración de 0.004 con una

absorbancia de 0.139, sin embargo en lo que podemos estar de acuerdo con (Castillo, 2019)

es en el gráfico que hace a continuación:

0.02
CONCENTRACION

0.015

0.01

0.005

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
ABSORVANCIA

Estamos de acuerdo con (Castillo, 2019) puesto que el grafico en comparación de la

autora nos sale una relación directamente proporcional.

e NaOH), y una solución de albúmina de huevo de concentración 1000 ppm, muestra

como resultado la obtención de un color violeta claramente perceptible (Ver figura 6.3) lo

que indica que la reacción entre la proteína y el ión cobre fue cuantitativa, formándose

exitosamente el complejo cobre-proteína esperado. Por esta razón decidimos utilizar ésta

formulación para la realización de la cuantificación de las proteínas totales en las claras

de huevos de nuestro estudio, según nuestra experiencia realizada estamos de acuerdo

con (Benitez & García, 2013) puesto que al añadir el reactivo de Biuret se tornó nuestra

solución a color violeta que según el autor nos indica que la reacción entre la proteína y

el ión cobre fue cuantitativa, formándose exitosamente el complejo cobre-proteína

esperado.

VI. CONCLUSIONES

✓ Se logró determinar la concentración de proteínas de la albumina de huevo por

espectrofotometría, obteniendo una mayor concentración de solución en el tubo de

ensayo número 5 (0.016 mg/ml) con una absorbancia de 0.450.

✓ Se logró aplicar los principios de la espectrofotometría para la determinación de proteínas

mediante el método de Biuret, obteniendo una mayor absorbancia en el tubo número 5

(0.450) con una concentración de 0.016 mg/ml de solución.

Benitez, M., & García, K. (2013). MONOGRAFÍA PARA OPTAR AL TILULO DE

LICENCIADO EN QUIMICA. Obtenido de

http://riul.unanleon.edu.ni:8080/jspui/bitstream/123456789/6015/1/222956.pdf

Castillo, J. (2019). Estudio del perfil de aminoácidos del huevo de gallina (gallus domesticus) y

pre-diseño deuna planta de producción de huevo líquido. Obtenido de

http://www.dspace.uce.edu.ec/bitstream/25000/20267/1/T-UCE-0017-IQU-072.pdf

Del Puerto, M. (2013). Determinación de proteínas. Obtenido de

http://www.fagro.edu.uy/~nutrical/ensenanza/AVI%20WEB/cursoema/detdePC.pdf

Fernández, E., & Galván, A. (2016). Métodos para la cuantificación de proteínas. Obtenido de

https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-

mol/pdfs/27%20METODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACION%20DE%20PR

OTEINAS.pdf

Zamora, H. (2008). MÉTODOS SELECTOS DE BIOQUIMICA EXPERIMENTAL. Obtenido de

http://ciencias.bogota.unal.edu.co/fileadmin/Facultad_de_Ciencias/Publicaciones/Archiv

os_Libros/Libros_Quimica/Metodos_selectos/MSBE.pdf

Alcázar MCD, Rosas RJ, Jaramillo ACJ, Peña BSD (2000) Detección de

glucomacropeptido (GMP) como indicador de adulteración con suero de quesería en

leche deshidratada. Vet. Méx. 31: 217-222

Proveniente de la perforación de Pozos de Petróleo por Espectroscopía Visible

(turbidimetría) (Bachelor's thesis, PUCE).

Ramírez Ayala, A., Vega y León, S., Prado Flores, G., Gutiérrez Tolentino, R.,

& Pérez González, C. (2008). Detección de suero de quesería en leches ultrapasteurizadas

mexicanas mediante la cuarta derivada del espectro de absorción. Veterinaria México, 39(1), 17-

27.

VIII. CUESTIONARIO

a.Si pretendiera cuantificar la concentración de proteínas en una muestra de suero ¿Qué

método emplearía?

Si se realiza un análisis espectroscópico cuantitativo basado en la dispersión de grasa y

proteína total en la región de 400-1100 nm en presencia de glóbulos de grasa de tamaño variable.

De igual modo aproxima el valor de proteína total a estándares cuya concentración puede diferir

de la real y, por tanto, de la absorbancia real.

Aunque existen propuestas para la determinación de proteínas del suero lácteo tanto de

manera total como individual, hasta la fecha ninguna de ellas permite obtener resultados fiables

cuando se trata de proteínas con contenidos en aminoácidos similares, así como tamaños y
propiedades poco diferenciables que implican la imposibilidad de su medida mediante la lectura

simple de los espectros de absorción o en su aislamiento por tamaño. Los métodos de

determinación de la concentración total de proteínas (Kjeldahl y absorción, fundamentalmente)

solo pueden determinar aproximaciones en la concentración de proteínas cuando se encuentran

en mezclas que toman como referencia una proteína modelo. Difiriendo los valores de absorción

con respecto a las proteínas reales en algunos casos con incertidumbres superiores al 30%

RAMIREZ et,al.(2008)El método que se usaría seria la ELECTROFORESIS ya que En un

estudio realizado en México por Alcázar et al. (2000) empleando la técnica de electroforesis y la

presencia del GMP como indicador de adulteración, encontraron que el 14,81% de las muestras

de leche en polvo comercial (n= 108) analizadas estaban adicionadas con suero de quesería,

mientras que en este estudio para leche UHT el porcentaje de pruebas positivas fue de 70% (n=

30).Se reitera con los resultados ahora obtenidos que se sigue contraviniendo lo establecido en la

legislación sanitaria mexicana que descarta el uso de lactosuero en leche aún en época de lluvia,

cuando se observa disminución del contenido de proteína.

b. ¿Podría utilizar la espectrofotometría con luz U.V. para cuantificar proteínas?

Las técnicas para la cuantificación de proteínas pueden dividirse en dos tipos:

• Técnicas para la determinaci6n de la concentración total de proteínas, tales como los

métodos Kjeldahl, Sorensen-Walker, la reacción Folinciocalteau, espectrofotometría UV-Vis,

refractometría, técnicas turbidimetrícas y nefelometrías, método Bradford, Lowry o de fijación

de colorante (BCA).
 • Técnicas para la detección individual de proteínas: electroforesis, cromatografía y

técnicas de inmuno ensayo (ELISA).

Así que por lo tanto se puede usar la espectrofotometría con luz U.V. para cuantificar

proteínas.

c. ¿Qué mide la turbidimetría?

Mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión de partículas

utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se mide

A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de

la luz transmitida)

La Turbidimetría es una técnica analítica basada en la dispersión de la luz causada por

partículas en suspensión en el seno de una disolución. Como consecuencia de la interacción entre

la radiación y las partículas, el sistema no se eleva a un nivel energéticamente excitado, sino que

la radiación incidente induce un dipolo eléctrico oscilante, que actúa como una nueva fuente

emisora de radiación. La intensidad de radiación que se presenta en cualquier ángulo depende del

número de partículas, de su tamaño y forma, de los índices de refracción relativos de las

partículas y del medio y de la longitud de onda de la radiación incidente. A pesar de que es

factible un tratamiento teórico que relacione las distintas variables debido a su gran complejidad,

normalmente se utilizan procedimientos que son empíricos. Puede observarse el rayo transmitido

en el mismo sentido que el incidente, denominándose turbidimetría cuyo modo de operar es

esencialmente análogo a la espectrofotometría. Sin embargo, si se trabaja con una suspensión

que es muy diluida o posee partículas relativamente pequeñas, la relación entre la intensidad de
radiación transmitida e incidente será prácticamente la unidad, por lo que no podrá realizarse la

medición como en el caso de la turbidimetría. Arias de Prada,E.M.(2015)