C.P. Ing. Agroindustrial. UNAMBA.

PRACTICA Nº 5 FROTIS BACTERIANO: COLORACIÓN SIMPLE, COLORACION DIFERENCIAL

(COLORACION GRAM) Y COLORACION DE ESPORAS.

I.- Introducción:

La morfología de los microorganismos puede examinarse de dos formas: Observando

microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando células muertas teñidas
con colorantes. El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas
de sus características (morfología, tamaño, movimiento, etc.). Sin embargo, las
microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fácilmente al
microscopio óptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de ahí que se
utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta
forma hacerlos visibles. Los colorantes son compuestos aromáticos solubles en agua
(generalmente en forma de sales), que contienen un ión orgánico coloreado y otro ión
inorgánico. Pueden dividirse en dos grupos: Ácidos y básicos.
El colorante es ácido si la porción coloreada tiene carga negativa, es decir, si tiene un
anión coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras de la célula que presenten
la misma carga, como es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se denomina
básico si la porción coloreada es el catión, cargado positivamente y con afinidad por
estructuras de la célula con carga negativa, como es la superficie celular. Las bacterias
toman mejor los colorantes básicos, como son el cristal violeta, el azul de metileno y la
safranina. La eosina es un colorante de tipo ácido, así como la nigrosina.

II.- Objetivo:

- Observar microorganismos en el microscopio.

- Observar su morfología y agrupación,
- Apreciar las diferencias de tamaño entre Organismos procarióticos y
eucarióticos.
- Aprender a diferenciar el movimiento browniano de la movilidad de los
microorganismos.

III.- Revisión bibliográfica:

Preparación de un frotis:

Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va
a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que
el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser
empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para
transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del
portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina
previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeñas
que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera
estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del
desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede
visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o
bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta
que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

TINCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

Existen distintos tipos de tinción:

1.-Tinción simple: Aquella en la que sólo se utiliza un colorante, que generalmente
tiñe a los microorganismos. Este tipo de tinción se denomina directa.

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Si el colorante proporciona una coloración al fondo, sin alterar el aspecto de las células,
que permanecen sin teñir, la tinción se denomina negativa.
La tinción simple permite observar morfología celular, tamaño y agrupación de los
microorganismos.

2.-Tinción diferencial: Es aquella que emplea secuencialmente dos colorantes que

permiten distinguir tipos de microorganismos en función de diferencias en su
estructura y composición química.
La tinción de Gram y la ácido-alcohol-resistente, basadas en las propiedades de la
pared celular bacteriana, son las más utilizadas.

3.-Tinción estructural: Se utiliza para identificar y estudiar determinadas

estructuras que pueden estar presentes en los microorganismos. En las tinciones
estructurales se colorea únicamente una parte de la célula.
Se utilizan este tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia de cápsulas,
endosporas, flagelos o inclusiones (almidón, polifosfato, etc.).

Morfología ultramicroscópica de las bacterias: estructuras internas:

Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas

mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato
contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rígida
que da forma a la célula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en
condiciones especiales. Constituyentes importantes de la pared celular son los
aminoácidos, amino azúcares, azúcares y grasas. Estas sustancias (proteínas, Hidratos
de carbono, grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared
celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las
bacterias gram-positivas contienen menos aminoácidos que la gram-negativa; el
contenido graso es mucho más elevado en las gram-negativas que en las gram-
positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al
gram (ver las dos imágenes juntas).

Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa

IV.- Materiales y Métodos.

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 Mechero Bunsen.
 Portaobjetos.
 Tubos con cultivos con cepas bacterianas.
 Cubetas para realizar la tinción.
 Fósforo.
 Asa de siembra.
 Agua destilada.
 Aceite de inmersión.
 Lápiz marcador de cera.
 Microscopio.

Reactivos y colorantes
 Cristal violeta.
 Lugól.
 Alcohol acetona.
 Safranina.
 Azul de lactofenol.
 Verde de malaquita.
 Agua destilada.
 Portaobjetos.
 Asas de kolle.

Métodos:

 Muestra de carne.
 Muestra de queso.
 Muestra de células eucariota (levaduras).

- Se selecciona las colonias con que se va a trabajar, en la palca petri.

- Marcar las laminas (1, 2,3 colonias).

Primeramente se realizó con el procedimiento del frotis, el cual consiste en la

extracción de una colonia de microorganismos ya cultivados y seleccionados, con una
aguja de kolle frotar suavemente en un porta objetos limpio, y previamente se haya
añadido en el centro del porta objeto una gota o menos de agua para colocar la pequeña
parte de la colonia seccionada y haciendo unos movimientos circulares con la aguja de
kolle, haciendo que se expanda y su secado.

Pasos para la coloración:

Una vez seca de cada muestra extraída de las colonias con la que se va a trabajar,
procedemos una a una a colorear.
- Primeramente se utiliza el cristal violeta colocándole sobre el frotis que se realizó, de
cada muestra, después de unos minutos enjuagar con agua destilada o agua a chorro.
- Luego se le a cubre de igual forma que la anterior con Lugól, también se espera unos
minutos y se procede a el enjuague con agua a chorro.
- Se coloca el siguiente reactivo, que es el alcohol acetona, de igual forma se enjuaga
con agua a chorro.
- Y por ultimo se le coloca safranina, esto para las bacterias gram negativa, en caso de
que retengan este colorante y si no es así no serán gram negativas, y se enjuaga
también con agua a chorro.
- Dejar secar al medio ambiente los porta objetos que hemos coloreado.
- Preparar los microscopios para poder observar nuestras muestras.
- Ya teniendo seco las laminas porta objetos se cubren con las laminas cubreobjetos y se
llevan al microscopio, para su respectiva observación esto a 40x.

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- También se trajo otras láminas ya anteriormente coloreadas que a simple vista eran
de color azul, pero que también se llevó al microscopio, pero para esto se utilizó aceite
de inmersión y a 100x.
- Hubo también otra muestra en donde solo se utilizó como reactivo el azul de lactofeno
(este reactivo es usado para las células eucariotas en este caso levaduras).

V.- Resultados:

Se pudo observar en el microscopio que la coloración que realizamos estuvo bien hecha
ya que fue posible una clara observación de los microorganismos que en su mayoría
eran gram negativos ( las que coloreamos) y las otras muestra que se trajeron y que
fueron coloreadas anteriormente eran gram positivas, lo interesante fue cuando se
trajeron otras laminas porta objetos que a las cuales se les añadió azul de lactofenol, y
se observo la diferencia de tamaños que hay entre una procariota y una eucariota.

VI.- Discusiones:

En el trabajo realizado, en esta practica de laboratorio los resultados que se obtuvieron

fueron favorables por en la mayoría de trabajos que consisten en esta practica hay
buenos resultados, quizás nos hubiera gustado probar con otros tipos de colonias pero
el tiempo nos fue un tanto corto, pero las bases ya están puestas para en cualquier otro
momento realizarlo y obteniendo también buenos resultados.

VII.- Conclusiones:

Esta presente practica fue de suma importancia para cada uno de nosotros, ya que es
uno de los primeros pasos para el estudio de microorganismos, que nos mostrará la
forma el tamaño y en algunos casos su motilidad, con la practica realizada no creó que
haya sido suficiente a pesar que se obtuvieron buenos resultados, por tanto concluyo
que deberíamos darnos un tiempo para realizar mas pruebas de este tipo.

VIII.- Bibliografías:

- Biblioteca encarta 2007.

- PECAZR, Michael y E. Chan. Elementos de Microbiología. México McGraw Hill. 1988.
Anexos.

PRACTICA Nº 6 METODOS DE CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS (DILUCION Y SIEMBRA POR

INCORPORACION EN PLACA).

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I.- Introducción:

En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados

en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus
propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo
cultivos axénicos o puros.
Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede
generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de
células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia.
Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan
las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un
principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia
de contaminación, es decir, de microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La
escuela de Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados con agar, y las placas de
Petri en Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie del
medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar
distintas especies microbianas.

II.- Objetivo:

- Obtener colonias separadas, utilizando uno o más métodos.

- Conocer la morfología de las colonias que se obtengan.
- Conocer forma de recuento de colinas de microorganismos (NMP).

III.- Revisión bibliográfica.

Técnicas
Pueden utilizarse distintas técnicas:

a) Extensión en superficie con cayado

Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo 0,1 ml de la muestra problema y de
una serie de diluciones decimales obtenidas a partir de ésta. Después se procede como se ha
expuesto en el apartado de Aislamiento.
Para realizar el recuento, se cuentan las colonias y se expresa el resultado en UFC/ml de
muestra.

b) Dilución en masa
Mediante esta técnica se pueden realizar recuentos tanto en placa de Petri como en tubo. Para
ello, se inoculan los medios atemperados con 1 ml de la muestra problema y de una serie de
diluciones decimales de ésta, como se ha expuesto anteriormente (pág. 22). Para realizar el
recuento, se cuentan las colonias y se expresa el resultado en UFC/ml de muestra.

c) Filtración
Se utiliza para la determinación del número de microorganismos a partir de una muestra líquida
(ej., agua de consumo humano, bebidas) o alimentos sólidos solubles en agua (ej., azúcar, sal...)
mediante filtración de volúmenes determinados de la muestra a analizar a través de filtros de
membrana e incubación de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.
Utilizaremos la técnica de filtración para la determinación de coliformes totales y
Escherichia coli, en un agua de consumo humano.

d) Método de los tubos múltiples

MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

Mediante el método de los tubos múltiples o número más probable (NMP) se puede determinar
el número de microorganismos a partir de diferentes tipos de muestras (aguas, suelo, etc.) a
partir de una muestra sembrando distintos volúmenes de la muestra a analizar o diluciones
decimales obtenidas a partir de ésta, en series de tres o cinco tubos que contienen medio de
cultivo líquido.

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Aplicaremos esta técnica al recuento de coniformes totales en una muestra de agua de bebida
envasada.

IV.- Materiales y Métodos.

Equipos y Materiales

 Incubadora.
 Contador de colonias
 Placas petri, estériles.
 Pipetas serológicas de 10 ml estériles
 Pipetas serológicas de 1 ml estériles

Medios de cultivo

 Agua peptonada al 0.1% en tubos (9 ml)

 Agar plate count
 Azul de lactofenol

Métodos:

Se empezará con la preparación de del agua peptonada y el agar Plate count:

Preparando agua peptonada:

25.5 gr. ------------------ 1000ml.

X gr. ------------------ 130ml.

X = 3.315gr. Para 130ml.

Preparación de agar plate count:

23.55gr. ------------------ 1000ml.

X gr. ------------------ 45ml.

X = 1.05gr. Para 45ml.

Una vez obtenido las cantidades con las que se va a trabajar, se procederá a mezclar con
agua destilada, con una correcta mezcla ya se para el agua peptonada y para el agar, en
su respectivo matraz.

Luego de mezclarlos se llevaran al auto clave para su respectiva esterilización, esto se

puede realizar junto con los materiales que también se piensan esterilizar, para realizar
la practica. El auto clavado se realiza a 15 lb de presión 121°C por 15 min.

En el momento que se esta esterilizando los materiales y preparados, se puede estar

pesando la muestra de donde se va obtener o se quiere obtener el control de
microorganismos del alimento (muestra de causa rellena). Para luego trozarlo en
partículas mucho más pequeñas.

Una vez ya obtenido las mezclas esterilizadas y al igual los instrumentos se procede a
enfriar solo un poco mas o menos a una temperatura por los 32°C.

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Para el AGUA PEPETONADA:

Repartir o extraer en 3 tubos de ensayo 9 ml. De agua peptonada para luego introducir
la muestra de alimento ya trozado y pesado dentro del matraz que con tiene al agua
pectonada (con teniendo ahora 63ml.).

Luego se procede a repartir 1 ml. De muestra extraída del matraz donde se colocó el
alimento trozado, al primer tubo de ensayo ( 10* ), luego de ese tubo de ensayo extraer
1 ml. De muestra al siguiente tubo de ensayo ( 10 ), y por ultimo de ese tubo de ensayo
extraer 1 ml. De muestra al siguiente tubo de en sayo que contiene los 9 ml. De agua
peptonada ( 10 ). Este proceso se realiza con el fin de reducir la carga bacteriana que
puede existir en la muestra del matraz o el tubo de ensayo de ( 10 ).

De cada tubo de ensayo que contienen las siguientes cantidades ( 10 ), (10 ), ( 10 ), de

cada una se extrae 1 ml. A una respectiva placa petri. Luego se homogenizará un
movimientos circulares.

Para el AGAR PLATE COUNT:

Teniendo el agar todavía caliente se procede a colocar sobre las 3 placas petri que
contienen ya el agua peptonada, introduciendo al calculo una cantidad a cada uno de
ellas de agar plate count antes que llegaran a solidificarse.

Una vez ya derramadas sobre el agua peptonada y ya sólidas se procede a voltear las
placas petri. Y proceder a envolverlas en papel craft para llevarlas a la incubadora.

Nota: todos los materiales con los que se trabajo estaban estériles.

V.- Resultados:

Los resultados de la práctica realizada se muestran en el siguiente cuadro:

MUESTRA:
CAUSA COLOR FORMA ELEVACION BORDE CANTIDAD
RELLENA DESARROLLADA
DE COLONIAS

Dilución en Cremoso Circular Convexa Entero 221 colonias

10

Dilución en Crema Puntiforme Convexa Entero 562 colonias

10

El recuento final que se llego a realizar utilizando la formula para ello es de:

Para la dilución en 10 es:

No = 221 . No = 221 x 10 No = 2210000 UFC/ ml. de muestra.

10 x 1 ml.

Para la dilución en 10 es:

No = 562 No = 562 x 10 No = 562000 UFC/ml. de muestra.

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10 x 1 ml.

VI.- Discusiones: comparaciones con otras bibliografías.

En la práctica realizada que quizás no se realizo sobre las debidas condiciones de

trabajo pero los resultados fueron, en su mayoría óptimos, a su vez llegándose aun
recuento de ellas en una cantidad que quizás no nos hubiéramos imaginado de
encontrar en un alimento de estos con unas características de colonias circulares y
puntiformes con colores y tamaños muy distintos y de repente de especies muy
diversas. En comparación con otros trabajos donde se examinaron las membranas y se
cuentan como bacterias lactosa-positivas todas las colonias, sin tomar en consideración
el tamaño, que originen un viraje de color a amarillo del medio por debajo de la
membrana, consecuencia de la acidificación del medio tras la fermentación de la
lactosa.

Las características de los distintos coliformes en este medio son:

- Klebsiella y Enterobacter: Colonias rojo ladrillo o naranja.

- Escherichia y Citrobacter: Colonias amarillas con centro naranja.

VII.- Conclusiones:

La presente practica dedicada a la cuantificación microbiana, que nos enseña conocer

un poco mas mediante la técnica de incorporación en placas el cultivo de
microorganismos ya se en su forma pura o mixta de un determinada colonia de
microorganismo, que quisiéramos estudiarla y/o utilizarlas para otros fines. Este
practica nos podrá servir de mucho para que a futuras sepamos utilizar en el control
de alimentos u/o otras labores donde nos desempeñemos ya sea haciendo nuestras
practicas o trabajos encomendados.

VIII.- Bibliografías:

- Biblioteca encarta 2007.

- PECAZR, Michael y E. Chan. Elementos de Microbiología. México McGraw Hill. 1988.

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