UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y

BIOTECNOLOGÍA
CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA ANIMAL
Nivel: Quinto Paralelo: A
Docente: Danae Fernández
Ciclo Académico: Abril-Septiembre 2021
Integrantes: Gabriela González, Mónica Lema, Jennifer Lozada

DIGESTIÓN DE ADN CON ENZIMAS DE RESTRICCIONES

1. OBJETIVOS
a. Objetivo general
Analizar el proceso de digestión del ADN plasmídico para crear fragmentos de
ADN por medio de enzimas de restricción a través del simulador virtual.
2. RESULTADOS
Tabla 1. Materiales, reactivos y equipos empleados en el proceso de digestión de ADN
con enzimas de restricción.
Materiales Reactivos Equipos
Microtubos (A+, A-, K+, K-) Solución amortiguadora Microcentrífuga
(2,5 XB)
Caja de puntas de Solución de Gradilla flotante de tubos
micropipetas plásmido pKAN-R (R)/
Muestra
Solución del Congelador
plásmido pARA (A)
Enzimas de restricción Baño de agua
(RE)/ Muestra
Agua destilada (dH₂0) Recipiente de hielo
Micropipeta P20
Fuente: Simulador virtual Labxchange

Protocolo
 Digestión con
enzimas de
restricción

Ajustar la temperatura
Colocar el baño de
del baño de agua
agua a 37° C

Tomar la micropipeta P20 y Abrir la caja de puntas P20 y

Ajustar el volumen de
ajustar el volumen a 4 µL, y tomar con la micropipeta una
la micropipeta P20
seleccionar guardar volumen punta y cerrar la caja

Colocar el tubo de solución Colocar la solución Extraer la solución hasta que

amortiguadora de restricción (2,5XB) amortiguadora de la llegue al primer tope, luego
hacia la gradilla de tubos vacía y abrirlo reacción en la cerrar el tubo
micropipeta

Abrir el tubo K+ y dispensar el contenido Pipetear la solución

(2,5XB), hasta el segundo tope, una vez amortiguadora de Desechar la punta de la
colocada la muestra cerrar el tubo restricción en el tubo micropipeta en la basura
K+
Continuar con el proceso de micropipeteo
Pipetear la solución para dispensar 4 µL de la solución
amortiguadora de amortiguadora de restricción (2,5xB) en
restricción en el tubo el tubo A-, en el tubo A+ y el tubo K-.
K-, A+, A-
Configurar el volumen de la micropipeta
Continuar con el proceso de micropipeteo a 2 µL, y dispensar 2 µL de las enzimas
para dispensar 4 µL de plásmido pKAN-R Dispensar las otras
soluciones en los tubos de restricción (RE) en los tubos K+ y A+.
en el tubo K- y en el tubo K+. Y también Continuar con el proceso de
con el plásmido pARA en el tubo A+ y en K+, K-, A+, A-
micropipeteo para dispensar 2 µL de
el tubo A- agua destilada (tubo dH₂O) en los tubos
A- y K-
Abrir la tapa de la microcentrífuga, colocar los Girar los tubos
K+, K-, A+ y A- y equilíbralos en distancias Completado el proceso, abrir la
de solución microcentrífuga, disponer los tubos hacia la
iguales entre sí.
gradilla flotante y cerrarla.
cerrar la tapa de la microcentrífuga y poner un
Abrir el baño de agua, poner la gradilla
tiempo a 10 s Incubación de los
flotante con los tubos K+, K-, A+ y A- y Programar el temporizador a 1 h y
cerrar la tapa de la microcentrífuga y tubos de solución a pulsar “iniciar” una vez terminado el
poner un tiempo a 10 s 37° C tiempo, retirar la gradilla

Guardar los tubos de Colocar la gradilla flotante que contiene

solución en el congelador las muestras a -20 °C en el congelador y
cerrarlo para el almacenamiento de las
muestras y su futuro análisis
3. CONCLUSIONES
Tras haber desarrollado el simulador virtual Labxchange se estudió el proceso de
digestión del ADN plasmídico, en el cual se emplearon dos tipos de
plásmido pARA y pKAN-R que contienen los genes de interés, para crear dos
fragmentos de ADN por medio de enzimas de restricción los cuales
fueron RE BamHI e HindIII que son las encargadas de cortar en sitios específicos o
también se las conoce como tijeras moleculares, que está basado en el mecanismo de la
unión nucleótidos a secuencias específicas que son los sitios de restricción presentando
una secuencia palindrómica donde las enzimas ya nombradas realizan un corte de
cohesivo en lugares determinados de la secuencia, con el fin de crear un plásmido
recombinante.
4. CUESTIONARIO
• Qué son las enzimas de restricción tipo I, II y III.
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas
que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que
reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen
secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
 Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un
mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la
célula.  Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir
entre el DNA extraño y el DNA propio.  Las enzimas de restricción no pueden cortar
DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
 Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
Tipo I y Tipo III: Se las incluyen en el mismo grupo ya que comparte muchas
similitudes.
a.      Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
b.      Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos
de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo.  Las Tipo III cortan de
5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen.
c.      Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio del corte. 
Tipo II:
a.      Sólo tienen actividad de restricción.
b.      Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
 c.      Sólo requieren Mg++ como cofactor.
d.      No necesitan ATP.
(Carrasco, 2016).

• Investigue 3 ejemplos de enzimas de restricción que realicen cortes generando

extremos cohesivos y 3 ejemplos de enzimas que realicen cortes generando
extremos romos.
Tabla 2. Ejemplos de enzimas de Restricción.
Enzimas de Restricción con cortes Enzimas de Restricción con cortes
cohesivos Romos
• Acc 65I • Alu I
• Bam HI • Hae III
• BgI II • Pvu II
Fuente: Lunt, 2018

• Investigue sobre la nomenclatura usada para nombrar enzimas de restricción y

coloque 2 ejemplos.
La nomenclatura para nombrar una enzima de restricción está formada por 4 pasos:
1. En primera estancia se identifica las tres letras que corresponden al nombre
científico del microorganismo
(ejemplo Escherichia coli (Eco), Haemophilus influenzae (Hin)) y por ello las tres
primeras letras del nombre se escriben en cursiva.
2. Posteriormente identificar la cepa o estirpe si la hubiese (ejemplo EcoR,
aislada de la cepa "RY13" de E. coli)
3. Seguidamente en números romanos, un número para distinguir si hay más
de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima
de restricción.
4. Finalmente distinguir el paso en el que todas deberían llevar al frente una
R de restricción o un M de metilasa según la función de la enzima, pero generalmente se
omite (Medina, 2019).
 Tabla 3. Construcción del nombre de la enzima de restricción EcoRI
Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:
E Escherichia Género de la bacteria
co coli Especie de la bacteria
R RY13 Cepa de la bacteria
I La primera enzimaOrden de identificación de la enzima en la
identificada bacteria
Fuente: López, 2000

Tabla 4. Construcción del nombre de la enzima de restricción BamHI

Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:
B Bacillus Género de la bacteria
am amyloliquefaciens Especie de la bacteria
H H Cepa de la bacteria
I La primera enzimaOrden de identificación de la enzima en la
identificada bacteria
Fuente: Guerrero et al., 2012

• Explique la reacción que catalizan las enzimas de restricción para generar cortes
en la secuencia de ADN.
Las enzimas de restricción efectúan algunos procesos de hidrolisis entre los enlaces
fosfodiésteres para que se produzca la separación de los nucleótidos que conforman cada
una de las cadenas de ADN, aunque también es posible que se efectúen determinados
procesos de metilación mediante los grupos metilos que van desde el 8- adenosil-
metionina hasta la base de uno de los nucleótidos (Toala Arias, 2020).

¿Por qué estaba usando enzimas de restricción necesaria en esta simulación?

Porque efectúan una función de tijeras moleculares para cortar fragmentos específicos de
ADN de manera que no se aíslen genes como rfp que es obtenido a partir del genoma de
la medusa y que es pegado en un plásmido mediante las enzimas ligasas con el fin de que
el vector permita la expresión de una proteína de color rojo fluorescente recombinante
(Ángeles, 2018).

• ¿Cuál es el propósito del tampón de restricción?

Proveer un entorno de pH óptimo para la enzima ya que el Tris se encarga de la regulación
de este y por su parte el acetato ajusta y mantiene el pH finalmente el EDTA actúa como
un agente quelante para evitar la degradación de ácido nucleicos por acción de las
nucleasas y de esta forma obtener un ambiente óptimo de trabajo (Álvarez, 2020).

• ¿Por qué se utiliza electroforesis en gel después de una digestión de restricción

experimento?
Es utilizado debido a que permite separar y verificar el tamaño que tienen los fragmentos
generados por las enzimas de restricción ya que usualmente esta técnica se utiliza
para separar fragmentos de ADN según su tamaño. Esta clasificación se realiza
aprovechando la carga negativa que posee el fosfato. La densidad de gel determina la
mayor o menor porosidad debido a que se relacionan de esta forma con los fragmentos
más pequeños y pasaran a los más grandes (Universidad de Granada, 2020).

• ¿Por qué se añade agua destilada al control de tubos (K- y A-), pero no en los
tubos del experimento (K + y A +)?
El agua destilada se agrega en los tubos K-, A- ya que estos son utilizados como control,
mientras que en los tubos K+, A+ se les añade las enzimas de restricción por lo tanto no
se adiciona agua destilada (Carrasco, 2016).

• ¿Por qué utilizamos las mismas dos enzimas de restricción para ambos
plásmidos?
Porque cada enzima de restricción suele reconocer la secuencia de nucleótidos del
ADN por lo tanto al utilizar la misma enzima permite que se asegure que tengan en sus
fragmentos extremos cohesivos complementarios, de tal manera que se puedan unir
entre los plásmidos (Carrasco, 2016).

4. BIBLIOGRAFÍA
Álvarez, M. (2020). Biología Molecular. 13.

Ángeles, F. (n.d.). LA PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA DE ADN.

Carrasco, L. (2016). Introducción a las Enzimas De Restricción. Bioted, 1, 11.

https://www.bioted.es/protocolos/INTRODUCCION-ENZ-RESTRICCION.pdf
Guerrero, C., Pedras, C. M. G., Gambelas, C. De, Ciências, I. De, Mediterrânicas, A.,
Évora, U. De, Engenharia, C. De, Ajuda, T., Investigação, C. De, & Cima, A.
(2012). 3. Resultados. 75(Figura 1), 8005.

López, M. (2000). Digestión de DNA usando Enzimas de Restricción.

Lunt, G. G. (1976). Fisiología vegetal. Biochemical Education, 4(3), 59–

60. https://doi.org/10.1016/0307-4412(76)90121-7

Medina, A. (2019). Las enzimas de restricción: las " tijeras moleculares " de los
ingenieros genéticos. El Cuaderno de Porque Biotecnología.
https://www.porquebiotecnologia.com.ar/Cuadernos/El_Cuaderno_34.pdf

Toala Arias, F. J. (1390). ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. 99–117.

Universidad de Granada. (2020). Manual De Problemas, Prácticas De Laboratorio Y

Simulación De Genética Ii.

5. ANEXOS

Figura 1. Regulación de la temperatura del baño

de agua.

Figura 2. Ajuste de la micropipeta P20 a 4µL y colocar la punta.

Figura 3. Colocar la solución amortiguadora en la micropipeta.

Figura 4. Pipetear de la solución amortiguadora en los tubos

de muestra en el tubo K+.

Figura 5. Pipetear la solución amortiguadora de restricción

en los tubos K-, A+ y A-.
 Figura 6. Dispensar las otras soluciones
en los tubos K+, K-, A+ y A

Figura 7. Centrifugación de las muestras.

Figura 8. Incubación de las muestras.

Figura 9. Congelación de las muestras para

su respectivo análisis