Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Facultad de Ciencias Químicas

Licenciatura: QFB
Curso: Genética Microbiana
Código: QFBS 264
Créditos: 3

Responsable: M. C. Laura Martínez Pérez

e-mail: [email protected]
 UNIDAD 11
Tecnología del ADN recombinante.
TECNOLOGIA DEL ADN
RECOMBINANTE
Genética Microbiana
M. C. Laura Martínez Pérez
 Historia

1969 – Enzimas de restricción tipo II identificadas por

Hamilton O. Smith. Daniel Nathans.

Premio Nobel en Fisiología/Medicina 1978.

También conocidas como endonucleasas (proteínas)
con acción catalítica que tienen la propiedad de
cortar los enlaces fosfodiéster de secuencias de
nucleótidos de ADN.

Cortan de unos cuatro a ocho pares de bases en el

ADN de doble hebra que reconocen.

Cortan en todos los puntos donde se encuentre dicha

secuencia.
 Clasificación de ER
ER Tipo I Tipo II Tipo IIs Tipo III

Estructura proteica Bifuncional, 3 Unifuncional, endonucleasa Unifuncional, Bifuncional, 2

subunidades y metilasa en enzimas endonucleasa y metilasa subunidades distintas
separadas en enzimas separadas

Sitio de reconocimiento Asimétrico y bipartito Secuencia palindrómica Asimétrico y continuo Asimétrico,

(simétrica), 5-7 pb.
4-6 pb (tb de 8pb) R: secuencia duplicada en
direcciones opuestos

Sitio de clivaje No específico En el mismo sitio de A distancias fijas del 24-26 pb río abajo del
› 1000pb del sitio de reconocimiento o sitio de reconocimiento sitio de reconocimiento
reconocimiento adyacente a este (fuera del mismo)

Requerimientos ATP para moverse del No ATP Mg2+, (la M requiere ATP para moverse del
sitio de reconocimiento Mg2+, (la M requiere SAM) sitio de reconocimiento al
al de clivaje, Mg2+, SAM) No ATP de clivaje, Mg2+, SAM
SAM

Ejemplo EcoKI EcoRI AwlI EcoP15

AACN6GTGC CAGCAG(N)CTGCTG
TTGN6CACG GTCGTC(N)GACGAC
Uso en biología molecular No generan fragmentos Generan fragmentos de Generan fragmentos de No generan fragmentos
de tamaño definido tamaño definido, se usan tamaño definido de tamaño definido
en el laboratorio!!!

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 SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

Nomenclatura:

Tres letras: 1a letra de género de la bacteria donde se encontró

2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontró

Letra de la cepa donde se produce la enzima de restricción (si es alguna

cepa especial)

Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restricción, se especifica

por números romanos.
Eco RI
E = Género: Escherichia
co = Especie: coli
R = cepa: RY13
I = Orden de descubrimiento: primera en ser aislada

HindII Haemophilus influenzae, cepa d, 2 a enzima de restricción

HindIII Haemophilus influenzae, cepa d, 3 a enzima de restricción

SmaI Serratia marcescens, 1a enzima de restricción

BamHI Bacilus amyloliquefaciens, cepa H, 1a enzima

 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Extremos cohesivos Extremos romos

Tipo II (las que se emplean en el laboratorio)
Las secuencias de reconocimiento pueden ser:
sec palindrómicas y continuas (reconocidas por homodímeros)
Ejemplo: EcoRI

Secuencias simétricas y discontinuas (reconocidas por homodímeros)

Ejemplo: BglI

sec asimétricas y continuas (reconocidas por heterodímeros)

Ejemplo: BbvCI

Código de una letra

N = A or C or G or T 10
Extremos:
Romos:
SmaI
5´----CCCGGG ---- 3´ 5´----CCC GGG ---- 3´
3´----GGGCCC ---- 5´ 3´----GGG CCC ---- 5´

Cohesivos:
•5’ protruyente
EcoRI
5´---- GAATTC ---- 3´ 5´---- G AATTC ---- 3´
3´---- CTTAAG ---- 5´ 3´---- CTTAA G ---- 5´

•3’ protruyente
PstI
5´----CTGCA G ---- 3´
5´---- CTGCAG ---- 3´
3´----G ACGTC ---- 5´
3´---- GACGTC ---- 5´

•La ligación de extremos cohesivos requiere complementariedad de secuencia

• La ligación de extremos romos no requiere de secuencias complementarias: dos extremos romos cualquiera
pueden ser unidos por la DNA ligasa.
• La eficiencia de ligación de extremos cohesivos es mayor que la de extremos romos.
11
 Cómo generar nuevas secuencias de corte
1- Corte, filling in/trimming back, religación:
Filling in (5’ protruyente)
EcoRI
5´---- GAATTC ---- 3´ 5´---- G AATTC ---- 3´
3´---- CTTAAG ---- 5´ 3´---- CTTAA G ---- 5´
fill in (con DNApol +
ligasa dNTPs)
5´---- GAATTAATTC ---- 3´ 5´---- GAATT AATTC ---- 3´
3´---- CTTAATTAAG ---- 5´ 3´---- CTTAA TTAAG ---- 5´
XmnI (GAANN/NNTTC)

PstI
5´---- CTGCAG ---- 3´ 5´----CTGCA G ---- 3´
3´---- GACGTC ---- 5´ 3´----G ACGTC ---- 5´
Trimming back (3’protruyente)
3´-5´exonucleasa

5´----C G ---- 3´
3´----G C ---- 5´

Ligados entre sí o a otros fragmentos con extremos

romos 12
2- Ligación de extremos complementarios:

5´----G GATCC ---- 3´ 5´----GGATCT---- 3´

BamHI
3´----CCTAG G ---- 5´ 3´----CCTAGA ---- 5´
Ligasa
BglII 5´----A GATCT ---- 3´ 5´----AGATCC ---- 3´
3´----TCTAG A ---- 5´ 3´----TCTAGG ---- 5´

MboI (/GATC)

3- Ligación de extremos romos:

5´----AG CT---- 3´ 5´----AGATC---- 3´

AluI
3´----TC GA---- 5´ 3´----TCTAG---- 5´
Ligasa MboI (/GATC)
EcoRV 5´----GAT ATC---- 3´
5´----GATCT---- 3´
3´----CTA TAG---- 5´
3´----CTAGA---- 5´

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• Se denomina ADN recombinante al ADN
que se ha formado al intercalar un segmento
de ADN extraño un ADN receptor.

Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en

un ADN celular.
 Tecnología del ADN recombinante
• Se refiere a un grupo de tecnologías usadas
para cambiar la composición genética de las
células: aislar genes, modificarlos,
introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos.
 La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas
biotecnológicas, entre las que destacan:

 La tecnología del ADN recombinante: con la que es posible

aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para
introducirlo en otro.

 La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o

secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.

 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se

consigue aumentar el número de copias de un fragmento
determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de
muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite
para un determinado estudio.
Clonado de fragmentos
Vectores de clonado utilizados para
secuenciación de genomas

Fago λ

YAC

Cósmido
Clonación.

Proceso por el cuál se consiguen copias

idénticas de un organismo (clónicos), en este
caso hablamos de un gen recombinado de
forma natural o provocada.
Secuenciación automática
Fragmentos de hasta 700 pb
 PCR
100
Desnaturalización Desnaturalización 30ciclos
94 oC Elongación 94 oC

Temperatura Alineación 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
5’
5’

5’
5’
Cámara de electroforesis
 INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS
DEL
ADN RECOMBINANTE (ADNr)
TÉCNICA PROPÓSITO
Enzimas Restricción Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN
ADN Ligasa Une fragmentos de ADN
Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación
Plásmidos Clase común de vector
Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas
PCR Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeñas
ADNc Copia de ADN a partir de ARN mensajero
Sondas de ADN Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta
secuencia
Síntesis Génica Para hacer un gen de una base de datos
Gel Electroforesis Para separar fragmentos de ADN
Secuenciación ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN
Principios La tecnología del
ADN recombinante
se puede agrupar en
dos áreas principales

técnicas de métodos de
clonado del ADN análisis del ADN

clonado de ADN clonado de ADN Hibridación de Técnicas de

Sondas de ácidos Secuenciación del
in vivo in vitro ácidos nucleícos búsqueda de
nucleícos ADN
mutaciones

Southern blot Northern blot

Mapas de
restricción
 Etapas de la tecnología del ADN recombinante

En términos simples, el procedimiento generalizado consiste en:

1. La rotura específica del ADN mediante nucleasas de restricción o

enzimas de restricción que facilita el aislamiento y la manipulación
de los genes individuales.

2. La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento

purificado de ADN, que posibilita determinar los límites de un gen
y la secuencia de aminoácidos que codifica.

3. La hibridación de los ácidos nucleicos que hace posible localizar

secuencias determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad
que tienen estas moléculas de unirse a secuencias
complementarias de otros ácidos nucleicos.
4. La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir
que un fragmento de ADN se integre en un elemento génico
autorreplicante (plásmido o virus) y que posteriormente sea
aceptado por una bacteria; de tal manera que una molécula
simple de ADN puede ser producida dentro de la bacteria,
generando miles de millones de copias idénticas.

5. Comprobación de la técnica.

6. Una vez aislado poderlo expresar fuera de su localización

natural, lo cual tendrá una enormidad de otras aplicaciones
Vectores.
Vectores
Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA
transportadoras.

Se caracterizan por:

 Poder replicarse independientemente junto con el segmento de

DNA que transporta.

 Contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción,

presentes sólo una vez en el vector.

 Tener algún marcador de selección para distinguir las células

huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.

 Fácil de recuperar (de célula huésped).

Actualmente se utilizan cinco tipos principales
de vectores:

 Plásmidos
 Bacteriófagos
 Cósmidos.
 BACs
 YACs
 PACs
 Tipos de vectores
Vector Cel. huesped Tamaño inserto

Plasmids Bacteria Hasta 15 kb

Fagos Bacteria Hasta 25 kb

(lambda)
Cosmid Bacteria 30-45 kb
BAC (bacterial
artificial Bacteria
chromosome) 100-500 kb

YAC (yeast
artificial Yeast 250-1000 kb
chromosome)
Plásmidos

Son DNA circular de doble cadena que existen en bacterias y en el

núcleo de algunas células eucarióticas. Se pueden replicar
independientemente de la célula hospedera. El tamaño de un plásmido
oscila entre unas pocas kilobases hasta 100 kb.
Clonación en plásmidos
Clonación Extremos Clonación Modificando
Cohesivos Extremos
Bacteriófago

También llamados fagos, son virus que infectan exclusivamente a

bacterias.

La principal ventaja de estos vectores es su alta eficiencia de transformación,

alrededor de 1000 veces mas que un vector tipo plásmido.
Cósmidos

Son vectores híbridos de clonación, que han sido ampliamente usados en la elaboración
de genotecas de DNA genómicos de gran tamaño, ya que permiten la introducción de
insertos de DNA de hasta 45 kb.

Realmente un cósmido consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos

segmentos del genoma de un bacteriófago filamentoso, como el fago λ.
Procedimiento para clonar DNA en cosmidos
BACs

Los BAC basan su origen de replicación en el

plásmido F de 7kb de E. coli y pueden llevar
insertos de 300 kb, aunque el promedio es de
100 kb. Los PAC son equivalentes en cuanto a
capacidad. Aunque los BAC y los PAC aceptan
fragmentos menores que
los YAC.

Es uno de los tipos de vectores de clonación

conocidos como "vectores de alta capacidad«;
que incluye cósmidos, BACs (cromosoma
artificial de bacteria), PACs (cromosomas
artificiales basados en el fago P1) y YACs
(cromosoma artificial de levadura).
Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el DNA
recombinante, creándose una población de células idénticas, que llevan todas la
secuencia clonada.
YACs

Los cromosomas
artificiales de levaduras
(Yeast Artificial
Chromosome) (YAC) es
capaz de llevar
fragmentos de DNA muy
largos (hasta 2 Mb), pero
la eficiencia de
transformación es muy
baja.
 Centrómeros (CEN)

 Telómeros (TEL).

 Secuencias replicantes autónomas (ARS.

para proliferación en la cel. hospedera.

 ampr para amplificación selectiva

 Marcadores de selección tales como TRP1

y URA3.

 Sitios de clonación para ER (p.e. EcoRI y

Bam HI)