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U n iversid ad Nacional de la P la ta

F acu ltad de C ien cias Exactas

R E G U L A C I O N D E L A S C O N C E N T R A C I O N E S

I N T R A T I S U L A R E S y L A P R O D U C C I O N

DE ANDROGE NOS E N T E S T I C U L O

HUMANO Y D E RATA.

T E S I S

MARIA OLGA SUESCUN

D ir e c to r : D r. Ricardo Saúl C alan d ra.


Asesor C ie n t íf ic o : D r. H e lv io Galdeano.

19 8 6
El presente trabajo de Tesis para optar al titulo

de Doctor en Ciencias Bioquímicas ha sido reali­

zado en el Instituto de Biología y Medicina

Experimental, Obligado 2490, Capital Federal.


A mis padres.

A mi esposo.

A mis hijos:

Gimena, Matías y Agustina.


AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Ricardo Calandra quien dirigió esta investiga­


ción, por haber compartido verdaderamente mis esfuerzos
y haberme brindado sus vastos conocimientos, que junto al
constante apoyo y estimulo permitieron la realización de
este trabajo de Tesis.

Al Dr. Helvio Galdeano por su colaboración como Asesor


Científico.

Al Dr. Héctor Chemes por los estudios histológicos,


a la Lic . Violeta Chiauzzi por las determinaciones de hormo­
nas proteicas y al Dr. Carlos Scorticatti por su cooperación
en la obtención de las muestras utilizadas.

A mis compañeros de Laboratorio, Lie. Silvia González,


Lic . Marcelo de las Heras, Dra. Isabel Lüthy, Dra. Mónica
Ritta y Lie. Beatriz Campos por su colaboración en algunas
de las experiencias que componen esta Tesis y valiosa discu­
sión de resultados. A la Sra. Diana Bas por su excelente
apoyo técnico. A todos ellos y a las Lie. Déborah Tasat
y Laura Altschuler por el clima de cooperación y amistad
en que este trabajo fué realizado.

Al Dr. Marco Rivarola, Dra. Stella Campo y a todos


los integrantes del Servicio de Endocrinología del Hospital
de Niños "Dr. Ricardo Gutiérrez" por haberme permitido la
realización en ese lugar de las tareas correspondientes
a los dos primeros años de este estudio, brindándome siempre
su experiencia y desinterasada colaboración.
En forma muy especial a la Dra. Selva Cigorraga por
sus valiosos consejos en la realización de esta tarea, quien
siempre estuvo incondicionalmente dispuesta a ayudarme tanto
en el aspecto laboral como humano.

Al Dr. Virgilio Foglia y a cada uno de los integrantes


del Instituto de Biología y Medicina Experimental por haber­
me facilitado la cooperación necesaria para la realización
de este estudio y por la cordialidad del trato diario.

A mi esposo y a todos aquellos quienes con su pacien­


cia y colaboración hicieron posible que este trabajo de
Tesis pudiera finalmente concretarse.
i

I N D I C E

INTRODUCCION

APARATO GENITAL MASCULINO................................. 1

Desarrollo y diferenciación............................... 1

EL TESTICULO............................................... 5

Barrera hematotesticular.................................. 6

La célula de Leydig..................................... 6

Biosintesis y metabolismo de esteroides.................. 8

REGULACION HORMONAL DE LA FUNCION TESTICULAR............. 14

Eje hipotálamo-hipóf iso-gonadal. . ;....................... 14

Efectos hormonales sobre las células intersticiales..... 17

Efectos hormonales sobre los túbulos seminíferos........ 23

TRANSPORTE DE ESTEROIDES SEXUALES EN LA CIRCULACION..... 28

MECANISMO DE ACCION DE ANDROGENOS........................ 31

PAPEL DEL CINC EN LA FUNCION REPRODUCTIVA................ 33

INFLUENCIA DE LA PRL EN LA FUNCION GONADAL MASCULINA 37


- 11 -

OBJETIVOS................................................. 44

PRIMERA PARTE

MATERIALES Y METODOS I

MATERIALES................................................ 45

Reactivos utilizados....................................... 45

Pacientes y tratamientos................................. 47

METODOS................................................... 50

Obtención del tejido..................................... 50

Procesamiento del tejido................................. 50

Dosaje de andrógenos testiculares y epididimarios...... 52

- Extracción y particiones con diferentes solventes.... 52

- Cromatografía en microcolumnas de celita.............. 53

- Radioinmunoensayo (RIE)................................ 55

Determinación de Zn por absorción atómica............... 60

- Preparación de muestras y soluciones estandars....... 60

Control histológico del tejido........................... 61

Determinaciones hormonales en el suero de los pacientes. 62

- Medición de PRL y LH séricas........................... 62

- Medición de andrógenos séricos........................ 63

Otros métodos............................................. 64

Análisis estadístico de los resultados.................. 64


111

RESULTADOS I

NIVELES DE ANDROGENOS Y CINC EN TEJIDO TESTICULAR Y E P I

DIMARIOS HUMANOS.......................................... 65

Controles metodológicos.................................. 65

- Validación del método.................................. 65

- Variación Ínter e intraensayo......................... 70

- Evaluación de pérdidas durante la extracción y purifi­

cación de esteroides................................... 70

- Transporte y homogeneización de los tejidos.......... 71

- Concentración de testosterona y DHT en testículo..... 73

Concentraciones de testosterona y DHT en epididimo..... 78

Concentraciones de andrógenos en diferentes segmentos e-

pididimarios.............................................. 79

Concentraciones de cinc en testículo yepididimo........ 83

Correlación entre andrógenos testiculares y cinc........ 84

Concentraciones de 3 a -Diol en testículo yepididimo..... 86

EFECTO DE LA HIPOPROLACTINEMIA SOBRE EL EJE HIPOFISO-GO

NADAL...................................................... 93

Niveles de LH y PRL en suero.............................. 94

Niveles de testosterona, D 4 -Adiona y 3 a -Diolen suero,. 94

Concentraciones intratesticulares de testosterona, DHT

y 3 a -Diol en suero...................................... 99

Concentraciones de testosterona, DHT y 3 a -Diol en el epi-

d idimo .................................................... 100


- iv -

Concentraciones de cinc en testiculo y epididimo....... 100

Morfología del testiculo durante lahipoprolactinemia... 107

DISCUSION 1 ..................... 112

SEGUNDA PARTE

MATERIALES Y METODOS II

MATERIALES................................................ 129

Reactivos utilizados......................... ............ 129

Animales y tratamientos.................................. 130

- Animales................................................ 130

- Inducción de hipoprolact inemia........................ 130

- Inyección intratesticular de bromocriptina............ 131

METODOS................................................... 132

Dosaje de hormonas en suero.............................. 132

- Determinación de PRL y LH séricas..................... 132

- Determinación de testosterona y 3 a -Diolséricos...... 134

Dosaje de andrógenos en tejido testicular y epididiitario... 134

Producción de andrógenos y AMPc "in vitro". Efecto de la

hipoprolact inemia......................................... 135

- Testículos enteros decapsulados....................... 135

- Células de Leydig dispersas............................ 136

Medición de andrógenos en los medios de incubación...... 139


V

Determinación de AMPciclico.............................. 139

- Aislamiento de quinasa de proteínas de la adrenal

bovina.................................................. 139

- Ensayo.................................................. 140

Producción de andrógenos "in vitro".................... 141

- Efecto directo de la bromocriptina.................... 141

- Efecto directo de la PRL............................... 142

Análisis estadístico de los resultados................... 143

RESULTADOS II

EFECTO DE LA HIPOPROLACTINEMIA INDUCIDA SOBRE LA FUNCION

TESTICULAR DELA RATA..................................... 14 4

Peso corporal, testicular y epididimario................ 14 5

Niveles de LH y PRL en suero............................. 14 5

Niveles de testosterona y 3 a -Diol en suero............. 148

Concentraciones intratesticulares de testosterona, DHT y

3 a -Diol.................................................. 14 8

Producción de andrógenos "in vitro" por testículo total. 153

AMP cíclico liberadoal medio de incubación.............. 162

Producción de andrógenos "in vitro" por células de Leydig

aisladas.................................................. 164

POSIBLES EFECTOS DIRECTOS DE BROMOCRIPTINA Y PROLACTINA. 168


- vi -

Efecto local de bromocriptina............................ 169

Efecto local de la PRL................................... 173

DISCUSION II.................... 182

CONCLUSIONES.................... 194

BIBLIOGRAFIA.................... 199
vii

ABREVIATURAS.

ABP protelna ligadora de andrógenos.

ADN ácido desoxirribonucleico.

AMPc 3 1-5'-adenosina monofosfato cíclico

D -Adiona D -Androstenodiona, 4-androsteno-


4
3,17 diona.

ARN ácido ribonucléico.

ATP Adenosina-trifosfato.

Br bromocriptina 2-Br- a -ergocriptina.

BSA albúmina sérica bovina.

C control.

Ci curie•

CoA coenzima A.

col colesterol.

CP carcinoma de próstata.

cpm cuentas por minuto.

dpm desintegraciones por minuto.

DHT dihidrotestosterona; 5 a -androstano

17 b ol-3-ona.

3a
OV-Diol
-Diol 5 a -androstrandiol; 5 a -androstano

3 a , 17 b -diol.
viii

3 b -Diol 5 a - androstano-3B , 17 B -diol.


DS desviación estándar.

EDTA ácido etilendiamino tetraacótico.

ED50 dosis efectiva 50.

ES error estándar.

FSH hormona estimulante de los folículos

GABA ácido gamaaminobutirico.

GLAE globulina ligadora de andró ge nos y

estrógenos.

3H tritio.

hCG gonadotrofina coriónica humana.

3 (b -HSD 3 ^ hidroxiesteroide deshidrogenasa.

H-E hematoxilina-eosina.

H MG-CoA hidroximetil-CoA reductasa.

H hormona.

HR hormona-receptor.

hs horas.

i.p. intraperitoneal.

K constante de asociación.
a
ix

LAN lanosterol.
LH hormona luteinizante•
LHRH factor liberador de gonadotrofinas•
LP lipoproteinas.

M molar,

min minutos.

Mix metil-isobutil-xantina.

mUI miliunidad internacional.

NAD nicotinamida-adenina-dinucleótido.

ng nanogramos.

P pendiente.

PIF factor inhibidor de la secreción de PRL

PLT proteina ligadora de testosterona.

PREG pregnenolona.

PRF factor liberador de la secreción de PRL

PTC proteina transportadora de colesterol.

PTP proteina transportadora de pregnenolona

pg picogramos.

PRL prolactina.

PRLo prolactina ovina.

PRLr prolactina de rata.

p/v peso en volúmen.


X

r coeficiente de correlación.

RIE radioinmunoensayo.

rpm revoluciones por minuto.

SHBG globulina humana ligadora de esteroides

sexuales.

T testosterona?4-androsten 17 (3-ol-3-ona.

TEBG globulina ligadora de testosterona y

estrógenos.

tfm síndrome de feminización testicular.

TRH hormona liberadora de tirotrofina.

Tris tri (hidroxi-metil)-amino-metano.

yuCi microcurie.

microgramo.
F*
ui unidades internacionales.

v/v volumen en volumen.

VIP póptido intestinal vasoactivo.


INTRODUCCION
1

APARATO GENITAL MASCULINO.

En los mamíferos el aparato genital masculino está cons­

tituido por: a) Los testículos, ubicados en el escroto y recu­

biertos por una cápsula de tejido conectivo la cual se denomi­

na albugínea. Sus funciones primordiales son secretar hormonas

esteroideas que intervienen en la regulación de la espermato­

génesis y en el control de los caracteres secundarios y produ­

cir espermatozoides que aseguren una provisión de gametas

masculinas en calidad y cantidad adecuadas; b) un sistema

eferente, que nace en la rete testis y desemboca en el epidi-

dimo, órgano adosado a la cara externa lateral del testículo

y que morfológicamente se puede dividir en tres segmentos

principales: cabeza, cuerpo y cola. Este sistema eferente

está involucrado en el transporte, maduración y almacenamiento

de los espermatozoides; c) las glándulas accesorias: vesícu­

las seminales, próstata y glándulas bulbouretrales o de Cow-

per, cuyas secreciones (ácido cítrico, fosfatasa ácida y alca­

lina, fructosa, prostaglandinas, mucopolisacáridos, cinc y

algunas enzimas) contribuyen a la composición del semen.

DESARROLLO Y DIFERENCIACION.

La diferenciación de la gonada tiene lugar principalmen­

te en el periodo fetal. Los factores que regulan el desarrollo

del testículo se basan según estudios recientes en la presen-


2

del antlgeno de membrana H — Y que es en los mamíferos

de sexo masculino, un componente habitual de la superficie

celular. El primer hecho importante que conduce a la menciona­

da diferenciación, es la formación de agregados de células

germinales y de Sertoli. A través de los antigenos H-Y, ubica­

dos en las células de Sertoli, se desencadenan los cambios

iniciales que finalmente conducirán a la diferenciación testi-

cular (Ciccarese y Ohno, 1978).

Una vez establecida la diferenciación, aparecen en el

testículo las células de Leydig que separan los agregados

de células germinales -Sertoli. Los factores que regulan la

transformación de las células del mesénquima en células de

Leydig permanecen aún desconocidos.

El testículo fetal elabora dos tipos de sustancias:

una de naturaleza no esteroidea que conduce a la involución

del ductus de Müller y la otra, identificada como un andróge-

no, que es la responsable del desarrollo del tracto reproduc­

tivo masculino. La primera sustancia es una glicoproteina

secretada por los túbulos seminíferos, específicamente por

las células de Sertoli, ya que la destrucción de las células

germinales no anula su efecto inhibitorio (Blanchard y Josso,

1974). La regulación de este factor inhibitorio es todavía

incierta, aunque la FSH pareciera inhibir su síntesis.

El otro factor elaborado por el testículo es, como se


3

ha señalado de naturaleza androgénica. En la rata, conejo

y el hombre el andrógeno predominante es la testosterona,

mientras que en el ratón, cordero y el cerdo se producen tanto

testosterona como androstenodiona (Gier y col. 1970).

La involución del ductus de Mílller acontece alrededor

del dia 15 en la rata y el dia 60 en el hombre. Como conse­

cuencia de ello, crece y se desarrolla el ductus de Wolff,

dando origen al epididimo, vas deferens y vesículas seminales.

Todas estas estructuras son sensibles a la acción de la testos­

terona. Por otra parte, a partir del seno y tubérculo urogeni­

tal, derivan la uretra, glándula prostética y genitales exter­

nos. Estas últimas estructuras dependen de la acción de la

dihidrotestosterona (DHT) durante un periodo critico del desa­

rrollo embriológico (Wilson, 1978).

El inicio de la sintesis de testosterona se correlacio­

na con la diferenciación de las células de Leydig, las que

involucionarán al final de la gestación. Durante la vida fetal

luego de haber alcanzado su nivel máximo de producción de

andrógenos, las células de Leydig se transforman en fibroblas­

tos o bien se desintegran. Posteriormente, estas células al

recibir el estimulo de la LH/hCG se reactivan y diferencian

en células de Leydig. Asi en el conejo, a las 5-6 semanas

del nacimiento, las células adquieren nuevamente su morfología

típica para alcanzar un nivel máximo de producción de andróge-


4

nos entre la 9-10 semana (Gondos y col., 1976). En este caso,

se observa por lo tanto, paralelismo entre la capacidad este-

roidogénica y la diferenciación celular.

Es oportuno mencionar que en humanos se han hallado

células mesenquimatosas en testículos inmaduros, capaces de

responder a la estimulación con hCG. Esta observación indica

que los fibroblastos humanos poseen capacidad esteroidogénica.

Por consiguiente, podría inferirse además que la activación

de dichas células precede a la diferenciación de las células

de Leydig (Chemes y col., 1985).


5

EL TESTICULO.

En la mayoría de los mamíferos el testículo se encuentra

ubicado en el escroto y está compuesto básicamente por dos

comportamientos: el sector intersticial y tubular. Pese a

que en cada uno de ellos ejercen su efecto diferentes trotinas

hipofisarias (LH y FSH respectivamente), ambos están intimamen­

te relacionados.

El intersticio, está integrado por las células de Ley-

dig rodeadas por tejido conectivo, vasos sanguíneos y linfá­

ticos. La función principal de dichas células es desarrollar

y mantener la esteroidogénesis y circundar a los túbulos con

un liquido rico en andrógenos.

Los túbulos seminíferos, donde tiene lugar la espermato­

génesis, están integrados por las células germinales y de

Sertoli. Estas últimas mediante "uniones estrechas" dan lugar

a la formación de un sector basal y de otro contiguo a la

luz tubular. En el primero se hallan las espermatogenias (Tipo

A, intermedias y B) que se dividen por mitosis. En el segundo

sector residen los espermatocitos secundarios de vida corta,

originados por la primera división meiótica, que posteriormen­

te y luego de una segunda división originan las espermátides.

Mediante un proceso de diferenciación denominado esper-

miogénesis, las espermátides se transforman en espermatozoides

los que son expulsados a la luz del túbulo.


6

BARRERA HEMATOTESTICULAR.

Las células de Sertoli se extienden desde el sector

basal al lumen y las uniones establecidas entre ellas consti­

tuyen lo que se denomina la barrera hemato-testicular (Dym

y col., 1970). Esta barrera no sólo divide en dos sectores

a los túbulos seminíferos sino que también selecciona el pasa­

je de sustancias presentes en la sangre o en el liquido del

compartimiento intersticial. Los andrógenos y en especial

la testosterona, son las sustancias que con mayor facilidad

traspasan dicha barrera. El establecimiento de la misma es

previo al desarrollo de los estadios iniciales de la esperma­

togénesis y una vez formada origina un medio con caracterís­

ticas bien definidas, el cual es esencial para alcanzar algu­

nos estadios de la meiosis. Dicha barrera determina, además,

que el sistema inmunológico del organismo no reconozca las

células germinales haploides como propias y las preserve de

ser neutralizadas inmunológicamente (Setchell, 1980).

Rodeando a los túbulos se encuentran las células peritu-

bulares, que en forma semejante a las del tejido muscular

liso intervienen en la contracción de los mismos (Clermont,

1958).

LA CELULA DE LEYDIG.

Las células de Leydig ocupan, según las especies, entre


7

el 2 y el 37% del volumen testicular (Christensen, 1975).

En testículo de rata y humano hay aproximadamente 25

x 106 y 700 x 106 células intersticiales, respectivamente(Mori

y col., 1980; Kaler y col., 1978). En el caso especial del

hombre, las células de Leydig son de forma poligonal con un

diámetro aproximado de 15 - 20 pm. Presentan núcleos gran­

des, ovales o redondeados, con uno o dos nucléolos excéntricos.

Se caracterizan por poseer un abundante retículo endoplásmico

liso, aparato de Golgi bien desarrollado, numerosas gotas

de lipidos y lisosomas. Todas estas estructuras son indicati­

vas de su función esteroidogénica con actividad secretora

(Pelliniemi y col., 1980).

El citoplasma presenta regular cantidad de mitocondrias

con crestas preferentemente laminares y también es caracterís­

tica la presencia de cristales de Reinke(Christensen, 1975).

Dentro de las células de Leydig,, tanto las mitocondrias como

el retículo endoplásmico liso, contienen complejos enzimáticos

que intervienen en la biosintesis de esteroides.

La actividad esteroidogénica de la célula de Leydig

está por consiguiente Íntimamente correlacionada con su estruc­

tura. Recientemente Ewing y col., (1983) utilizando técnicas

de perfusión "in vitro" y ultramicroscopia, describieron que

parte del efecto trófico de la LH sobre las células de Leydig

se efectúa a través del control de la biogénesis y recambio

del retículo endoplásmico liso.


8

BIOSINTESIS Y METABOLISMO DE ESTEROIDES.

El colesterol es la molécula precursora a partir de

la cual se sintetizan los distintos esteroides en las células

de Leydig (Figura 1).E1 pool de dicho precursor puede derivar

des 1) síntesis de novo a partir de acetato; 2) ésteres de

colesterol almacenados como gotas lipidicas en el citoplasma

y 3) colesterol proveniente del plasma sanguíneo que es trans­

portado dentro de la célula por lipoproteinas de alta o baja

densidad, que se unen a receptores específicos ubicados en

la membrana de la célula de Leydig (Brown y col., 1976).

Los ácidos grasos constituyen, probablemente, los prin­

cipales precursores de la bioslntesis del colesterol testicu-

lar. El sistema enzimático para la degradación de los ácidos

grasos ( [ó -oxidación) se localiza en las mitocondrias y el

producto de dicho metabolismo, acetil-CoA, es transformado

en el citoplasma en 3 -hidroxi 3metil-glutaril-CoA y poste­

riormente reducido a ácido mevalónico en el retículo endoplás-

mico. Los pasos sucesivos incluyen la formación de farnesil

pirofosfato, escualeno y lanosterol. Este último compuesto

es convertido a colesterol a través de enzimas presentes en

el retículo endoplásmico. Es importante señalar que la acetil-

CoA, puede provenir también de la oxidación aeróbica de la

g lu c o s a .

In d e p e n d ie n te m e n te de su o r ig e n , e l c o le s te r o l lib r e
9

Figura 1.

/
Organización espacial del aparato biosintetico de la

testosterona en la célula de Leydig.


10

Figura 1 .

Organización espacial del aparato biosintético de la testos-


M «
terona en la célula de Leydig. El pool activo de colesterol

(col) proviene des a) sintesis "de novo", b) ésteres de

colesterol almacenado en gotas de lipidos, o c) colesterol

del plasma sanguíneo, que es transportado por lipoproteinas

(LP) de alta o baja densidad, las cuales pueden unirse a

receptores de membrana en la célula de Leydig. Con la excep­

ción del hidroximetil-CoA reductasa (HMG-CoA) que se localiza

en el retículo endoplásmico, la mayoría de las reacciones

iniciales de la síntesis del colesterol tienen lugar en

el citoplasma celular. El escualeno requiere una proteina

transportadora (SCP) para su conversión a lanosterol (LAN),

ya que es insoluble en agua. El colesterol es probablemente

transportado dentro de la mitocondria por una proteina (PTC)

y la misma facilita la unión del colesterol al componente

P-450 de la enzima que rompe la cadena lateral del colesterol

produciendo pregnenolona (PREG) e isocaproaldehido (C ^ ).

El transporte de PREG hacia el retículo endoplásmico está

facilitado por una proteina transportadora de PREG (PTP),

donde es convertida a testosterona (T). La T es secretada

fuera de la célula de Leydig y su transporte facilitado

por proteínas tales como: ABP (proteina transportadora de

andrógenos), albúmina y principalmente GLAE (globulina liga-

dora de andrógenos y estradiol) (Reproducido de Ewing y

col., 1983, con modificaciones).


11

en el citoplasma debe movilizarse hacia la membrana mitocon-

drial externa y probablemente es transportado por una proteina

especifica (Kan y col., 1973).

El complejo enzimático que rompe la cadena lateral del

colesterol se halla situado en la membrana interna mitocon-

drial. Una amplia serie de reaciones, catalizadas por las

20 y 22 hidroxilasa, introduce grupos hidroxilos en las posi­

ciones respectivas, previa ruptura del enlace entre los carbo­

nos 20 y 22 catalizada por la 20 y 22 liasas. El sistema enzi­

mático, acoplado al citocromo P 450, actúa como oxidasa final

de las hidroxilaciones. Numerosos estudios han demostrado

que la conversión de colesterol a pregnenolona por este comple

jo enzimático intramitocondrial constituye el paso limitante

para la biosintesis de testosterona(Hall, 1970).

La pregnenolona formada y probablemente unida a una

proteina ligadora (PBP), llega hasta el retículo endoplásmico

donde es convertida a andrógenos. Este proceso se esquematiza

en la Figura 2 y requiere la intervención de 5 reacciones

enzimáticas catalizadas por las siguientes enzimas: 17 o( -


-hidroxilasa, 17-20 liasa o desmolasa, 3 ^-hidroxiesteroide-

deshidrogenasa, A 5 -3 cetohidroxiesteroide isomerasa, y 17

- — hidroxiesteroide-deshidrogenasa. Como se muestra en el

diagrama, las reacciones enzimáticas se pueden realizar con

diferentes secuencias, dando lugar a varios caminos alternati-


12

Figura 2.
Reacciones involucradas en la conversión de 5-pregnenolona a tess
tosterona.
A + B = 3 ^ hidroxiesteroide-deshidrogenasa + Z ^ - 3 cetohidroxi-
esteroide-isomerasa.
C = 17 -hidroxilasa.
D = C 17 - 20 liasa o desmolasa.
E = 17 -hidroxiesteroide-deshidrogenasa.
13

vos para la síntesis de testosterona a partir de pregnenolona.

El camino de la progesterona, o bien via/\^ , es la que predo­

mina en la rata (Samuels, 1975), mientras que en el hombre,

la via parece tener una mayor importancia (Axelrod, 1965).

En la célula de Leydig, por la presencia de la 5 o( -

reductasa y a partir de diferentes sustratos se elaboran an-

drógenos 5 X -reducidos, siendo la DHT el metabolito

5 0( -reducido de la testosterona. Este andrógeno biológicamen­

te muy activo, es reconocido en algunos tejidos efectores

por presentar una mayor afinidad por el receptor de andrógenos

que la testosterona misma. La testosterona puede ser metaboli-

zada a otros compuestos reducidos como el 5 C< -androstan-

3 C< , 17 (3 diol (3 C< -DIOL) y el 5 0<-androstan-3 (3 ,17^>

diol(3 ^3 -DIOL) a partir de DHT en una reacción reversible

por la acción de las enzimas 3 0( y 3 -hidroxiesteroide-

deshidrogenasa respectivamente.

En la célula de Leydig, tanto la testosterona como la

androstenodiona pueden ser convertidas a estrógenos por acción

de la "aromatasa", que en realidad comprende a una serie de

enzimas. A través de estas reacciones enzimáticas la testoste­

rona es transformada a estradiol, la androstenodiona a estrona

y la enzima 17 e -hidroxiesteroide-deshidrogenasa puede inter­

convertir la estrona a estradiol. Si bien el sector inters­

ticial es ©1 lugar principal de producción de esteroides


14

en el testículo hay numerosas evidencias que demuestran que

el túbulo también posee capacidad para la biosintesis de andró-

genos y estrógenos.

En la rata, se ha demostrado que las células de Serto-

li y los espermatocitos tienen gran capacidad para metabolizar

testosterona a andrógenos 5 o( -reducidos.

En determinadas edades del desarrollo este sector tes-

ticular posee muy altas actividades de las enzimas 5 0( -reduc-

tasa y 3 (h -hidroxiesteroide-deshidrogenasa (Dorrigton y col.,

1975) .

Las células de Sertoli también poseen capacidad aromata-

sa y dicha actividad es estimulada por FSH (Amstrong y col.,

1975). Aún no se ha establecido cual es la estructura celular

predominante en la elaboración de estrógenos y probablemente

ello tenga una relación temporal con el estadio del desarrollo.

Asi por ejemplo, en la rata las células de Sertoli prepubera-

les elaboran 17 (i -estradiol antes que se manifieste la prime­

ra onda de la espermatogénesis, sugiriendo que en este periodo

la sintesis de estrógenos en el sector tubular podría ser

de importancia fisiológica.

REGULACION HORMONAL DE LA FUNCION TESTICULAR.

EJE HIPOTALAMO-HIPOFISO-GONADAL.

El hipotálamo es una estructura integradora de los impul­


15

sos que llegan al sistema nervioso central y elabora factores

propios (LH-RH, factor liberador de gonadotrofinas) que ejer­

cen su efecto en la hipófisis anterior. Estos factores llegan

a través de los vasos portales a las células gonadotróficas

de la hipófisis donde estimulan la síntesis y secreción de

LH y FSH. Las gonadotrofinas controlan la función testicular

constituyendo lo que se denomina el eje hipotálamo-hipófiso-

gonadal. Tanto los esteroides sexuales como la inhibina, sin­

tetizados en el testículo, son capaces de interaccionar a

nivel hipotálamo-hipofisario, regulando la secreción de LHRH,

LH y FSH.(Franchimont y col., 1978).

El inicio de la secreción de testosterona por el testí­

culo fetal parece ser independiente de la presencia de gonado­

trof inas. En el periodo neonatal, y especialmente en el humano

la testosterona, androstenodiona y estradiol se elevan proba­

blemente debido al alto tenor de gonadotrofinas existentes.

A partir de los 10-11 años comienza la testosterona a ascen­

der, alcanzando los valores del adulto entre los 15 y 17 años

de edad (Winter y col., 1972).

En la rata, en cambio, los niveles de testosterona al­

canzan su pico en el dia 18 de la gestación (Weisz y col.,

1980). Este andrógeno declina al nacimiento alcanzando un

nivel mínimo entre los días 20-21,momento que marca la finali­

zación del periodo infantil del desarrollo (Ojeda y col.,


16

1980). La testosterona se mantiene en niveles bajos hasta

el dia 35, momento en que comienza a elevarse (periodo juvenil)

(Piacsex y col. 1978). Estas variaciones en los niveles séri­

cos de testosterona se acompañan de cambios concomitantes

en los andrógenos 5 -reducidos tal como se ha descripto

anteriormente.

Ha sido clásicamente aceptado que el comienzo de la

pubertad se debe a un progresivo aumento en la secreción de

gonadotrofinas, que resultarla de una menor sensibilidad

del eje hipotálamo-hipofisario al efecto inhibitorio de los

esteroides sexuales (Kaplan y col., 1976).

Entre algunas de las diferencias existentes entre el

hombre y la rata en el inicio de la pubertad, puede mencionar­

se que el ascenso en los niveles de LH que se observa en

la rata es más lento y progresivo. En el periodo juvenil,

el aumento rápido del número de receptores de LH en el testí­

culo Ketelslegers y col., 1978) es seguido por un manifiesto

ascenso en la testosterona sérica, sugiriendo que en la rata

macho, la maduración de la gonada es más importante que la

disminución de sensibilidad del hipotálamo a los esteroides

sexuales (Odell y col., 1976). El control de la secreción

de FSH no puede ser explicado a través de una modificación

en la sensibilidad del hipotálamo a los esteroides, ya que

los niveles de FSH alcanzan un nivel máximo entre los 35 y


17

40 días de edad y luego van disminuyendo al alcanzarse la

pubertad completa. Resultados recientes indicarían que la

secreción de FSH es regulada por la inhibina sintetizada en

las células de Sertoli(Franchimont y col., 1978).

El inicio de la pubertad en las diferentes especies

en general es un proceso que conduce al control de la función

testicular y comprende la interacción de LH, FSH, PRL, LHRH

y probablemente póptidos opioides originados en el sistema

nervioso central (Blank y col., 1979).

En el humano, dicho comienzo se deberla preferencialmen-

te a un cambio de sensibilidad del hipotálamo al efecto inhibi­

torio de los esteroides sexuales. En la rata, en cambio, se

basarla principalmente en una maduración de la gonada por

mecanismos aún desconocidos.

EFECTOS HORMONALES SOBRE LAS CELULAS INTERSTICIALES.

La LH es la principal hormona regulatoria del desarrollo

y función de las células de Leydig (Hooker, 1970). Esta hormo­

na ejerce efectos regulatorios sobre la esteroidogénesis y

al mismo tiempo produce una acción trófica para mantener

la función de las células intersticiales. LH al igual que

otras hormonas peptldicas, produce sus efectos interactuando

inicialmente con sitios específicos de unión localizados en

la superficie de la membrana de las células efectoras (Means,

1975). El complejo hormona-receptor formado es capaz de pene­


18

trar en la célula a través de un proceso conocido bajo el

nombre de endocitosis. Hasta el momento, no se ha dilucidado

si el complejo receptor-LH es reciclado a la superficie de

la membrana celular o si la hormona libre es degradada en

los lisosomas (Ascoli y col., 1977).

En preparaciones de células de Leydig de diferentes

especies se han descripto sitios específicos de unión para

LH (Charreau y col., 1974; Sunby y col., 1982). A partir de

la unión de la LH a estos sitios, se estimula rápidamente

la actividad adenilato ciclasa (AAC) y la producción de tes-

tosterona (Catt y col., 1974). La activación de la AAC en

el testículo en presencia de iones Mg+ + , origina la conversión

de ATP en AMPciclico (AMPc). Este nucleótido cíclico que puede

ser degradado por una fosfodiesterasa a 5'AMP, se une a la

subunidad regulatoria de una proteina quinasa (PK) y da lugar

a la liberación de la subunidad catalítica libre. La PK testi-

cular es estimulada entonces por LH, favoreciendo la fosforita

ción de proteínas que pueden estar involucradas en la biosin-

tesis de esteroides (Charreau y col.,1985).

En la rata, el número de receptores de LH por célula

de Leydig es aproximadamente igual a 20.000. Realizando estu­

dios de unión de LH a sus sitios receptores y correlacionándo­

los con la esteroidogénesis, se vió que cada célula de Leydig

contiene un exceso de sitios específicos de unión para LH,


19

ya que con una ocupación del 1% de los receptores se obtiene

una respuesta esteroidogónica máxima. La estimulación en la

producción de AMPc no se detecta hasta que el andrógeno alcan­

za su producción máxima (Moyle y col.# 1975). Esta observación

llevó por mucho tiempo a cuestionar el carácter de segundo

mensajero del AMPc en el mecanismo de la acción hormonal.

Sin embargo, en la actualidad existen claras evidencias del

papel desempeñado por el AMPc en la estimulación de la sín­

tesis de andrógenos por LH. Asi, se ha observado un incremento

en la producción "in vitro" de testosterona en respuesta

a AMPc ó dibutiril-AMPc y también a toxina colérica, aunque

en este último caso es necesaria una mayor ocupación de los

sitios receptores de AMPc en la quinasa de proteínas (Dufau

y co l ., 197 7) .

El sitios regulatorio más importante sobre la esteroido-

génesis por acción de la LH es, como ya se ha mencionado,

la escisión de la cadena lateral del colesterol (Van der

Vusse y col., 1975).

El mantenimiento de los receptores de LH en la célula

de Leydig depende, al menos en parte, de la acción trófica

de la propia hormona y de otras hormonas hipofisarias, en

especial FSH y PRL. Sin embargo FSH no afecta en gran medida

la esteroidogénesis testicular y no existen en la célula de

Leydig sitios específicos de unión para esta gonadotrofina


20

(Charreau y col., 1985). Su b efectos en el sector tubular

se describirán en una próxima sección.

La hormona hipofisaria PRL, es considerada un importante

regulador de la función testicular. Charreau y col., (1977)

demostraron la presencia de sitios receptores específicos

en el sector intersticial del testículo. Dada la estrecha

relación del tema con este trabajo de Tesis, la importancia

de la PRL en la función gonadal será tratada "in extenso "en

otra sección.

Volviendo a las acciones de LH sobre la célula de Leydig

es oportuno mencionar que a partir de estudios realizados

administrando una única o múltiples dosis de hCG, en diferen­

tes modelos experimentales, se han obtenido los siguientes

resultados: a) altas dosis de esta hormona producen un aumento

en la secreción de testosterona, originándose posteriormente

un periodo refractario en el cual el testículo no responde

a la subsecuente administración de hCG; durante este proceso,

se ha observado que existe una pérdida de receptores para

LH y alteraciones en la sintesis de testosterona (Purvis,

1977); b) el proceso de regulación del receptor de LH se diso­

cia de las alteraciones que se producen en la biosintesis

de esteroidesy c) los cambios en la esteroidogénesis inducidos

por la administración de hCG son diferentes según la via de

administración y d) una máxima producción de testosterona


21

se obtiene luego de pequeñas dosis de hCG (Cigorraga y col.,

1978) .

En otro estudio estos mismos autores (Cigorraga y col.,

1979) señalaron cierta semejanza entre el proceso de desensi­

bilización testicular y la inhibición de la secreción de tes-

tosterona luego de administrar estradiol.

Desde hace tiempo es conocida la inhibición de la fun­

ción testicular inducida por estrógenos(Moore y col., 1932).

Este efecto fué clásicamente atribuido a una acción inhibito­

ria sobre la secreción de LH hipofisaria (Verjans, 1974).

Sin embargo, la disminución de dicha función puede ocurrir

sin cambios en los niveles séricos de LH (Chowdhury, 1974).

De estos resultados surgió entonces que los estrógenos ejerce­

rían también un efecto directo sobre el testículo. Al adminis­

trar ^i-17 ^ -estradiol “in vivo" se ha observado una clara

localización del esteroide radiactivo en los núcleos de la

célula de Leydig, mientras que no se detecta captación del

esteroide en las células de Sertoli, germinales o peritubula-

res. A través de métodos autoradiográficos o bioquímicos(Stumpf t

1969; Mulder y col., 1973), se evidencia que el tejido inters­

ticial contiene macromoléculas capaces de ligar estrógenos

con alta afinidad y limitada capacidad.

Por otra parte, los andrógenos principal producto sinte­

tizado por las células de Leydig, pueden interactuar con di-


22

chas células. Al respecto, se ha demostrado una nítida acumu­

lación nuclear especifica de 3 H-testosterona ó ^H-DHT (Sar

y col., 1975). Además en ratas portadoras del síndrome de

feminización testicular (tfm), con resistencia a la acción

androgónica como consecuencia de un número reducido o ausen­

cia de receptores para andrógenos, no ha podido evidenciarse

la presencia especifica del andrógeno tritiado en células

de Leydig (Sar y col., 1975).

Con relación a la presencia de estos sitios de unión

para andrógenos en células de Leydig y su posible significado

fisiológico, debe mencionarse que Purvis y col. (1979) postu­

laron que estas hormonas esteroideas estarían involucradas

en un mecanismo de retroalimentación negativa ultra— corto en

relación al fenómeno de desensibilización testicular.

Finalmente,Le Febvre Y col. (1980) describieron la pre­

sencia en las células intersticiales de sitios receptores

para LH-RH. El efecto agudo de su unión a los receptores,

es aumentar la esteroidogénesis mientras que la administra­

ción crónica produce una inhibición de la misma.

Más recientemente ha sido de considerable interés la

descripción de un factor con actividad LH-RH simil presente

en extractos testiculares, el cual es capaz de desplazar al


•loe
LH-RH-I de dichos sitios receptores (Sharpe y col., 1981).

Posteriormente se estableció que este factor es segregado


23

por las células de Sertoli y es regulado por la acción de la

FSH (Sharpe y col., 1984).

EFECTOS HORMONALES SOBRE LOS TUBULOS SEMINIFEROS.

El sector tubular del testículo se halla regulado por

la acción conjunta de FSH y andrógenos.

La única localización de sitios de unión específicos

para FSH, ha sido la célula de Sertoli (Means, 1975; Scban-

bacher, 1979). Por acción de la gonadotrofina ocurren impor­

tantes cambios morfológicos y bioquímicos en la célula de Ser­

toli, los que proveen el medio hormonal necesario para el

desarrollo y diferenciación de las células germinales.

La interacción de la FSH con su célula efectora resulta

en la estimulación de la adenilato ciclasa y la disminución

de la actividad fosfodiesterasa con el subsecuente aumento

en los niveles de AMPc. Estas observaciones han sido realiza­

das tanto "in vivo" como en cultivo de células de Sertoli

(Conti y col., 1982; Verhoeven y col., 1981).

Gonjuntamente con el aumento del AMPc, la FSH desencade­

na otros efectos sobre la célula de Sertoli tales cornos a)

producción de lactato y piruvato (Le Gac y col., 1982); b)

secreción de liquido tubular (Sharpe y col., 1979); d) secre­

ción de LH-RH simil (Sharpe y col., 1981); e) producción de

inhibina que regula la sintesis y liberación de FSH (Steinber-

ger y col., 1979) y f) como ya se ha mencionado la metaboli-


24

zación d© andrógenos y aumento ©n la actividad aromatasa.

(Dorrington y col., 1978). Se han dado pruebas concluyentes

que las células germinales requieren energía para su desarro­

llo y ésta es provista por las células de Sertoli de la vecin­

dad, las que la obtienen a partir de glucosa, lactato y piru-

vato; esta producción es estimulada por FSH via AMPc. Ambos

productos (lactato y piruvato) son indispensables para la

sintesis de proteínas y ARN en las células germinales (Jutte

y col., 1981), como asi también para la provisión de niveles

adecuados de ATP y glucosa-6-fosfato en espermatocitos primarios

y espermátides (Le Gac y col., 1982).

Además de estimular la secreción de liquido tubular,

la FSH también regula la elaboración de proteínas especificas

en las células de Sertoli; entre ellas se encuentra la denomi­

nada proteina ligadora de andrógenos (ABP) (French y col.,

1973). El ABP es una glicoproteina constituida por dos sub­

unidades con pesos moleculares de 41.000 y 45.000 daltons

(Musto y col., 198 2). El ABP es secretado en respuesta a la

FSH, aunque los andrógenos constituyen un muy importante esti­

mulo para su sintesis (Hansson y col., 1976). El efecto causa­

do por los andrógenos resulta de su interacción con sitios

específicos de unión y descriptos en la célula de Sertoli

(Sar y col., 1975). Estos sitios presentan características

fisicoquímicas muy similares a las de los hallados anterior-


25

mente en la próstataventral y epididimo (Hansson y col., 1976).

Volviendo a las acciones conjuntas de FSH y andrógenos

sobre la célula de Sertoli, se ha establecido que en ausencia

de FSH (hipofisectomia), diferentes andrógenos y en particular

DHT, son capaces de mantener una producción de ABP normal,

siempre que el tratamiento sustitutivo sea iniciado inmediata­

mente (Hansson y col., 1975). Al respecto, la FSH puede reindu­

cir la producción de ABP aún transcurrido cierto tiempo luego

de la hipofisectomia (Purvis y col., 1977). Entre las funcio­

nes atribuidas al ABP, la más relevante es el transporte de

andrógenos desde el intersticio al túbulo, que a través del

lumen acceden, asi al epididimo. De esta manera se proveerla

al epididimo de un tenor elevado de andrógenos, necesarios

para la maduración de los espermatozoides (Blaquier y col.,

1972).

Existen evidencias que indican que el ABP además de

ser secretado al lúmen de los túbulos seminíferos y via rete

testis al epididimo, en cierta proporción seria liberado desde

el sector basal de las células de Sertoli hacia los linfáticos

y la sangre. Si bien se ha demostrado la secreción bidirec-

cional de ABP, aún no ha sido establecida en forma precisa

la funciónn del ABP en la circulación general (Gunsalus y

c o l ., 1980).

La célula de Sertoli elabora también el péptido LHRH


26

símil, como ya se ha mencionado anteriormente, y la inhibina,

que es una proteina con un peso molecular mayor de 12.000

daltons. Esta proteina inhibe la síntesis y secreción de FSH,

actuando a nivel hipofisario, aunque también se ha postulado

al hipotálamo como sitio adicional de acción, siendo su secre­

ción independiente de las células germinales y peritubu-

lares pero influenciada por la testosterona sintetizada en

las células de Leydig (Verhoeven y col., 1983).

El sitio principal de la acción hormonal (FSH-andrógenos)

en la regulación de la espermatogénesis se halla localizado

en la célula de Sertoli. Sin embargo, aunque en mucho menor

proporción también se han descripto receptores de andrógenos

en células germinales (espermatogonias y espermatocitos) (Wil-

son y c o l ., 1975).

Finalmente, se ha postulado también alguna acción de

los andrógenos en las células peritubulares, comprobándose

que son capaces de concentrar dichos esteroides(Hansson y col,1976).


i

Comunicación intercelular:

Además de la regulación primordial que ejercen las gona-

dotrofinas hipofisarias sobre el testículo, en los últimos

años se han presentado evidencias que avalan el concepto rela­

cionado al control de la función testicular a través de facto­

res elaborados en la misma gonada (Bergh, 1982). Algunas de

las observaciones más importantes realizadas por distintos


27

grupos y que apoyan estos conceptos son los siguientes:

1) las características de las células de Leydig ubicadas

en la proximidad de los túbulos seminíferos varían en

relación al estadio del ciclo espermatogénico (Bergh,

1982); 2) las células de Sertoli producen factores que

influencian la función de las células de Leydig (Grotjan

y col., 1982; Parvinen y col., 1984) y 3) las células

de Sertoli son los mediadores a través de los cuales

la FSH induce receptores de LH en las células de Leydig


t

y modifica la capacidad esteroidogénica de las mismas

(Reventos y col., 1983; Bergh, 1984).

Todos estos datos destacan la importancia de las

interacciones entre las células germinales, Leydig y

Sertoli, a través de factores elavorados fundamentalmen­

te en estas últimas. Este mecanismo regulatorio, que

está actualmente en pleno estudio, es conocido como

regulación paracrina del testículo (Steinberger y col.,

1984) .
- 28 -

TRANSPORTE DE ESTEROIDES SEXUALES EN LA CIRCULACION.

Una vez que los esteroides sexuales han sido sinteti­

zados en la gonada, estas hormonas pueden seguir tres cami­

nos: a) interactuar dentro del mismo testículo; b) transpor­

tarse al epididimo donde contribuirán a la maduración de

los espermatozoides y c) secretarse a la corriente sanguínea.

En la circulación general los esteroides sexuales

se unen a diferentes proteínas con las que pueden asociarse

o disociarse y solo una pequeña fracción de la hormona cir­

cula libre, mientras que la mayoría es transportada como

complejo esteroide-protelna.

El pequeño porcentaje de esteroide no ligado es el

biológicamente activo ya que puede atravesar la membrana

celular de diferentes tejidos efectores y ejercer allí su

efecto biológico. En apoyo de esta idea se debe mencionar

que la tasa de depuración metabólica, que está en relación

directa con la cantidad de hormona libre circulante, descien

de significativamente en situaciones donde se producen ele­

vaciones en la unión de estas proteínas transportadoras.

En el humano la testosterona circulante se halla fun­

damentalmente unida a dos proteínas del suero y solo un

pequeño remanente, menor del 3%, permanece en estado libre

(Vermeulen y col., 1971; Rivarola y col., 1968). Una de

estas proteínas es la albúmina, a la cual se une con baja


- 29 -

5 -1
afinidad (K : 10 M ) y alta capacidad, tratándose de una
el
unión inespecifica ya que la albúmina es capaz de ligar

distintos esteroides. La otra proteina es una globulina

que liga andrógenos y estrógenos con mayor afinidad (K:


a
9 - 1
10 M )y ha recibido varias denominaciones a partir de

su descripción original (PLT, SHBG, TEBG, GLAE) (Mercier

y col., 1968, Murphy, 1968).

La GLAE tiene la particularidad de unir, además de

la testosterona y el estradiol, otros andrógenos como la

DHT, (.-androstenodiol y 3 o(-DIOL. La proteina transportado

ra se ha descripto en el hombre, conejo, bovinos, reptiles

y anfibios, estando aparentemente ausente en el gato y los

roedores; sin embargo, Susuki y col. (1981) la detectaron

también en suero de rata macho a partir de los 15 dias de

eda d .

Los niveles sanguíneos de GLAE en el humano son más

altos en la mujer y en los niños de ambos sexos antes de

la pubertad, estando los mismos regulados por diversas hormo

ñas. Asi mientras los estrógenos y las hormonas tiroideas

los incrementan, los andrógenos y derivados de la progestero

na los disminuyen (Forest y col., 1968; Clark y col., 1971).

Las posibles acciones de la GLAE son: a) transporte

de la hormona en forma inactiva; b) protección del esteroide

a su ataque por enzimas, captación y metabolismo hepático


30

e c) integración de un reservorio hormonal, que a través

de cambios relativamente rápidos en su asociación/disocia-

ción con el esteroide, permiten que el organismo disponga

de hormona libre con el fin de mantener la homeostasis reque

rida.

En la actualidad la mayoría de los autores sostienen

que los niveles de testosterona en la circulación disminuyen

con el envejecimiento (Horton y col. 1975); Pirke y col.,

1975? Rubens y col., 1974; Stearns y col. 1974; Vermeulen

y col. 1972), exteriorizándose de forma más evidente la

calda en la testosterona libre (Vermeulen y col., 1971) y

el ascenso en la GLAE (Vermeulen y col., 1972).

También se ha observado en hombres en la senectud,

una menor secreción de testosterona (Pirke y col., 1973)

y respuesta gonadal al test de estimulo con hCG (Pirke y

col., 1977; Rubens y col., 1974).

Por otra parte, los estrógenos aumentan con la edad

y probablemente sean responsables de los mayores niveles

de GLAE durante el envejecimiento, pues los mismos son capa

ces de estimular su síntesis por el hígado. Sin embargo,

los niveles totales de testosterona en la senectud no se

modifican sustancialmente. Este hecho puede explicarse por

el aumento de unión de la GLAE y la disminución de la tasa

de depuración metabólica de esteroide (Horton, 1978).


31

MECANISMO DE ACCION DE ANDROGENOS.

Los andrógenos ejercen su acción biológica en los

denominados tejidos efectores cuya característica es la

capacidad de retener en forma especifica la hormona (H).

Una de las características de un tejido efector para

andrógenos es su capacidad de retener en forma especifica

la hormona (H ).

Los trabajos de Bruchovsky y col, (1968) y Anderson

y col. (1968), demostraron la captación y retención de


3
H-testosterona en la próstata, vesículas seminales y glándu

las coagulantes de rata. En estos tejidos asi como en el

epididimo que poseen alta actividad de la enzima 5 o(-reduc-

tasa, la testosterona es reducida a dihidrotestosterona

(D H T ) y este producto es el principal andrógeno captado.

La hormona se une especificamente a macromoléculas

propias del tejido, los receptores hormonales (R), y forma

el complejo hormona-receptor (HR). Las principales caracte­

rísticas fisico-químicas de dichos complejos son: termola-

bilidad, sensibilidad a enzimas proteoliticas, dependencia

de grupos sulfhidrilos, vida media (T 1/2) a 0-4QC mayor

de 24 hs, movilidad electroforética en geles de poliacrila-

mida agarosa con Rf = 0.45; punto isoeléctrico = 5,8; preci­

pitación por sulfato de amonio (30-40 % de saturación),

capacidad de unión limitada, alta afinidad (Ka - 2-5 x

10^M~*) y unión a celulosa acoplada a ADN.


32

Una vez formado el complejo H-R en la fracción soluble

(HRW<*), se activa mediante un cambio de conformación especial

y lu ego se transporta al interior del núcleo celular (HR )


n
incorporándose a sitios aceptores de la cromatina donde

estimula la transcripción genética.

La unión del andrógeno al R se realiza de tal forma,

que esféricamente la H está "envuelta" por el R, ya que

no puede ser reconocida por un anticuerpo anti-DHT. Esto

indicarla que el sitio aceptor solo reconoce a la porción

proteica del complejo H-Rn . Por lo tanto, la H en lugar de

ser la portadora del mensaje para su tejido efector, sólo

servirla para producir un cambio conformacional del H-R^

que transformado en H-R activo,se trasloca al núcleo y actúa

sobre la cromatina.

Como resultado de estudios mas recientes llevados

a cabo con R de estrógenos (King y col., 1984; Welshons

y col., 1984), se ha propuesto que la activación tendría

lugar en el núcleo, ya sea interactuando la H con el R de

origen en su mayoría nuclear o bien con el complejo origina­

do en el citoplasma. Es precisamente este aspecto el que

merece la mayor atención últimamente, es d e c i r #el estado

del R nativo o inactivo y el activo, que es el que se une

firmemente a los sitios aceptores de la cromatina y es capaz

de desencadenar las acciones bioquímicas subsecuentes y

que expresarán un efecto biológico determinado (Jensen, r 1984;

Gorski y col., 1968).


33

PAPEL DEL CINC EN LA FUNCION REPRODUCTIVA.

El estudio de la importancia fisiológica del cinc

(Z n ) en la reproducción se inicia con los trabajos de Bert-

rand y Vladesco (1921), quienes encontraron elevadas concen­

traciones del metal en el tracto genital masculino. En el

semen humano se detectan entre 5 y 22 mg de cinc/100 mi,

en tanto que la próstata contiene también niveles muy eleva­

dos, especialmente en la porción dorso-lateral (Mawson y

col., 1951).

El cinc seminal parece ser fundamentalmente de origen

prostético y al respecto se ha informado que sus concentra­

ciones no difieren sustancialmente en plasma seminal de

pacientes normo, oligo o azoospérmicos (Mann, 1964). No

obstante, Mawson y col. (1953) demostraron que las gametas

masculinas también contienen considerable reservas del metal.

El cinc presente en los espermatozoides es probablemente

incorporado a las proteínas espermáticas en los túbulos

seminíferos durante el desarrollo de la espermatogénesis.

Algunas evidencias avalando esta idea se han presentado

en la rata (Wetterdal, B, 1958).

Tanto la captación de ^ Z n como el contenido endógeno

de este catión en el tejido prostético, parecen estar suje­

tos a una cierta regulación hormonal. Asi en la rata, la

castración provoca una calda en los niveles de cinc pros-


34

tát icos , mientras que la administración de testosterona

los restituye (Rosoff B. y col., 1968).

El testículo es un órgano que también manifiesta una


65
preferencial captación de Zn. Por técnicas autorradiográ-

ficas se ha demostrado una distribución irregular de la

radioactividad, siendo máxima la densidad en el túbulo semi­

nífero (Wetterdal, 1958).

Estos estudios y los de otros grupos de trabajo sugie­

ren que el espermatozoide serla el responsable de la acumula

ción de cinc en el sector tubular del testículo (Millar

y c o l ., 1961).

Ha sido propuesto que la captación del cinc por el

testículo es un mecanismo sensible a ciertas hormonas pepti-

dicas tales como PRL,LH y FSH y en este sentido se comprobó

que la hipofisectomia en ratas adultas disminuye en un 40 A

la captación de cinc por el testículo (Gunn y col., 1961).

Se ha demostrado una captación diferencial de cinc

por el testículo y la próstata, comprobándose que son necesa

rias concentraciones menores de cinc para mantener la es­

permatogénesis que para preservar el tamaño de las glándulas

sexuales accesorias. Además, mientras el cinc prostático

parece no ser esencial para la fertilidad (Gunn y Gould,

1958), la presencia de cantidades suficientes del mismo

es necesaria para un completo desarrollo de las gametas


35

y el mantenimiento del epitelio germinal (Millar y

c o l ., 1960).

El cinc es requerido para todas las fases del ciclo

celular, hecho indudablemente ligado a su participación

en la sintesis de ADN, ya que tanto las polimerasas del

ácido ribonucleico comolas correspondientes al ácido desoxi-

rribonucleico son catalogadas como metaloenzimas. Resulta

entonces,que una de las principales funciones del cinc con­

siste en su papel de cofactor enzimático. Hoy se sabe que

existen alrededor de 70 metaloenzimas que requieren cinc

para sus funciones (Prasad, 1976), Entre ellas se encuentran

la 5 Of -reductasa prostática y la 3 ^ -hidroxiesteroide-

deshidrogenasa, involucradas ambas tal cual ha sido menciona

do previamente,en el metabolismo de la testosterona (Prasad


j

y col., 1967; Habib, 1978). Con respecto a estas enzimas

esteroidogénicas se ha demostrado un efecto bifásico del

cinc sobre la 5 o( -reductasa prostática (de Larminat y col.,

1981) y un efecto inhibitorio sobre la epididimaria (Monsal-

ve y Blaquier, 1977).

Pese a todas estas observaciones ©1 verdadero papel

que desempeña el cinc no ha sido completamente esclarecido

y su importancia fisiológica se manifiesta por las a l t e rado

nes funcionales que determinan deficiencias de dicho metal,

tanto a nivel clínico como experimental.


36

El hipogonadismo primario en el sexo masculino se

considera asociado a cuadros de deficiencia de cinc. Esta

alteración se manifiesta en los casos de disminuciones

severas o leves del metal (Prasad# 1983).

Tanto en la rata como en humanos las deficiencias

de cinc están asociadas a un incremento en los niveles

séricos de FSH y LH, disminución en los niveles de testoste

roña circulante y alteración de la espermatogénesis (Abbasi

y col., 1980; Lei y col./ 1976; Prasad, 1983). Es además

interesante puntualizar que en ratas tfm se hallaron nive­

les muy reducidos de cinc en el testículo (Chan y col.,

1981).

Pacientes con hemodiálisis crónica por uremia, los

cuales presentan una deficiencia en cinc, desarrollan dis­

función testicular y se ha demostrado que dicha alteración

puede ser revertida por la administración del metal en

la dieta (Antoniou y col., 1977). Asimismo, en ciertos

tipos de oligospermias la terapia con cinc, restaura los

niveles de andrógenos plasmáticos y el número de espermato­

zoides (Hartoma y col., 1977).

Considerables cantidades de este metal han sido detec

tadas en el testículo de rata (Prasad y col., 1967). Sin

embargo, en el hombre el contenido de cinc en testículo

y epididimo no ha sido documentado.


37

INFLUENCIA DE LA PRL EN LA FUNCION GONADAL MASCULINA,

La PRL es sintetizada por las células acidófilas

de la adenohipófisis denominadas lactotropos. Esta hormona

es la única entre las elaboradas por la hipófisis anterior,

cuya secreción está sometida a un control inhibitorio hipo-

talámico dominante.Actualmente se acepta que fisiológicamen

te el factor inhibitorio (PIF) más importante es la dopami-

na, la cual es sintetizada en las neuronas tuberoinfundibu-

lares del hipotálamo medio basal (Meites y col., 1972).

La dopamina es liberada en la eminencia media y transporta­

da hasta la hipófisis anterior por el sistema porta.

En algunas condiciones experimentales en los mamífe­

ros y también en otras especies, coexistiría además un

factor liberador de la secreción de esta hormona (PRF).

Al respecto, la TRH ha sido preferentemente considerada

como la hormona liberadora de PRL (Vale y col., 1977).

Muchos otros agentes pueden además modificar su secre

cións la temperatura, stress, estradiol, algunos neurotras-

misores como por ejemplo la serotonina y el ácido gamma-

aminobutIrico (GABA), péptidos como endorfinas y el péptido

intestinal vasoactivo (VIP), sustancia P y otros.

En general todas las influencias que desde el medio

externo o interno modifican la secreción de PRL, lo hacen

fundanantalmante a través de los distintos factores hipotalámicos.


38

(Libertun y col., 1980; Me Cann y col., 1984).

Entre las numerosísimas acciones biológicas adjudica­

das a la PRL en diferentes sistemas biológicos, los efectos

relacionados con la reproducción son los que predominan

claramente en los mamíferos (Nicoll, 1971).

Desde el año 1941 se conoce la importancia de la PRL

en la regulación de la función reproductiva en la hembra

comprobándose su capacidad para regular la función ovárica

y en especial la del cuerpo lúteo (Astwood, 1941; Evans

y col., 1941). Es innegable además, su importancia en el

crecimiento y desarrollo de la glándula mamaria como asi

también en la secreción de gonadotrofinas durante la lacta­

ción (Turkington, 1972).

La importancia de la PRL en la función reproductiva

masculina, se ha establecido, sin embargo, a partir de estu

dios más recientes.

Huggins y col. (1946) observaron que la hipofisectomia

ocasiona en perros atrofia testicular y prostática. Más

tarde, Wood y Simpson (1961) comprobaron que la administra­

ción de PRL a ratas hipofisectomizadas es capaz de revertir


é

la involución gonadal post-hipofisetomia.

La capacidad de la PRL en influenciar la función gona­

dal fué también establecida por estudios realizados en rato­

nes enanos deficientes genéticamente en PRL. Estos animales

son infértiles pese a mantener normales los niveles de gona-


39

dotrofinas (Bartke, 1965), pero son capaces de responder

al tratamiento con dicha hormona restaurando la espermatogé­

nesis (Bartke, 19 77).

La PRL es particularmente importante también en los

cambios reproductivos que acontecen en animales que presen­

tan variaciones estacionales en su ciclo reproductivo.

Interesantes evidencias de la participación de esta

hormona en la función gonadal se establecieron en el hámster.

Cuando estos animales son expuestos a cortos periodos de

luz se observa atrofia testicular (Turek y col., 1975),

disminución en los niveles séricos de PRL y también en la

LH, FSH y testosterona circulantes (Bex y col., 1978).Cuando

estos roedores son sometidos a cortos periodos de luz se

les administra PRL ovina, recuperan el tamaño testicular,

elevan los niveles de testosterona y restauran la espermato­

génesis (Bartke y col., 1979).

En los últimos años se ha ido sosteniendo cada vez

con mayor énfasis la idea de que la PRL tiene una acción

directa sobre la función testicular (Hansson y col., 1976).

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que existen importantes

diferencias entre los niveles de PRL alcanzados, las distin­

tas especies estudiadas y los modelos experimentales utiliza

dos •

Al igual que otras hormonas peptidicas, la PRL ejerce­

rla sus efectos, interactuando con receptores específicos


40

localizados en la membrana celular de numerosos tejidos

entre los que se incluyen las células de Leydig del intersti

ció testicular y el tubo epididimario (Charreau y col.,

1977; Aragona y col., 1975). Es interesante consignar que

dichos sitios específicos de unión para PRL en el testículo

son modulados por los niveles periféricos de LH y por la

hormona homóloga (Morris y col., 1980; Huhtaniemi y col.,

1981). Entre las múltiples acciones de la PRL sobre la fun­

ción testicular, probablemente la más importante es el efec­

to estimulatorio sobre el número de receptores de LH en

las células intersticiales y su acción sinérgica con esta

hormona. Esta observación ha sido realizada en diferentes

modelos experimentales (Bex y col., 1977; Zipf y col., 1978).

Además de sus efectos sobre los receptores de LH,

la PRL puede favorecer el contenido de colesterol esterifi-

cado en el testículo y las actividades de las enzimas 3

(i y 17 & -hidroxiesteroide-deshidrogenasa (Hafiez y col.,

1972; Bartke, 1971). Estas acciones podrían ser consecuen­

cias de sus efectos sobre los receptores de LH o representar

puntos independientes de acción de la hormona.

La inducción de hipo e hiperprolactinemias de manera

crónica en ratas prepuberales, por la administración de

agonistas o antagonistas de la dopamina (bromocriptina o

sulpirida respectivamente), demuestra una correlación positi


41

va entre el número de sitios de unión de LH en el testícu­

lo y los niveles de PR1 circulantes (Calandra y col., 1982).

Morris y col. (1980) describieron que la administra­

ción crónica de 100 pg de PRL/dia a ratas adultas provoca

una disminución en los receptores de LH. Esta observación

fué la primera evidencia de que la PRL puede ejercer, según

la dosis utilizada, efectos facilitatorios o inhibitorios

sobre la función testicular.

Se han presentado también algunas evidencias relaciona

das a un efecto agudo de la PRL sobre la función testicular.

Luego de dos horas de la administración de una única dosis

de PRL a ratas adultas, se observa un aumento significativo

en los niveles séricos e intratesticulares de andrógenos

(Belanger y col., 1981),

A pesar de existir numerosos trabajos relacionados

a la acción de esta hormona en el eje hipotálamo-hipófisogo-

nadal en distintas especies en la adultez, son relativamente

escasos los estudios relacionados con los niveles de PRL

circulantes y el funcionalismo testicular durante el desarro

lio puberal. A este respecto, es interesante destacar que

en la rata macho los niveles de PRL aumentan a partir de

los 20-25 dias de edad manteniéndose elevados hasta cerca

de los 50 dias, habiéndose sugerido que dicha hormona podria

jugar algún papel en el desarrollo de los órganos sexuales

(Negro Vilar y col., 1977).


42

En el hombre la PRL puede también ejercer efectos

opuestos dependiendo de los niveles existentes. Mientras

que una elevación crónica en los niveles de PRL se acompañan

de hipogonadismo (Perryman y col., 1981), hipoprolactinemias

inducidas por breves periodos de tiempo incrementan los

niveles de testosterona sérica luego del estimulo con hCG

(Ambrosi y col., 1976). Con relación a lo primero, existe

unanimidad de criterio en cuanto a que las hiperprolactine­

mias patológicas inhiben la función gonadal en el hombre.

Los síndromes de deficiencia de prolactina, aunque sumamente

raros en el hombre, podrían también asociarse a alteraciones

reproductivas (Turkington y col., 1972).

Los mecanismos de acción para estos fenómenos se han

asentado tanto a nivel central como periférico. A nivel

superior se ha constatado que el sistema opiode se halla

involucrado, y asi por ejemplo la administración de naloxona

recupera la pulsatilidad en la descarga de LH. A nivel peri­

férico se ha encontrado una respuesta disminuida de la gona-

da al test de estimulo con hCG (Faglia y col., 1983).

Por otra parte ,se ha encontrado que la PRL se halla

presente en el plasma seminal en niveles considerablemente

más elevados que en el suero periférico (Sheth y col., 1975).

Además, esta hormona se une específicamente a la membrana

de los espermatozoides (Bartke, 1980). La información exis­


43

tente sobre el rol de la PRL a este nivel es contradictoria.

Sin embargo, la mayoría de los autores indican que niveles

elevados de PRL resultan en una menor concentración y moti-

lidad de los espermatozoides. Recientemente se ha postulado

además que la PRL ejerce un efecto negativo sobre la capaci­

dad funcional de las gametas masculinas, pues espermatozoides

humanos provenientes de pacientes hiperprolactinémicos mues­

tran una capacidad anormal de penetración a ovocitos de

hámster (Sueldo y col., 1985).


44

O B J E T I V O S.

En la sección anterior se ha tratado de resumir la

información actualizada referente a ciertos aspectos de

la regulación hormonal de la gonada masculina, habiéndose

dedicado especial interés al papel desempeñado por la PRL

y el cinc en la función reproductiva.

Los objetivos fundamentales de las experiencias presen

tadas a continuación fueron los siguientes:

1. - Establecer las concentraciones intratisulares de andróge

nos y cinc en tejido testicular y epididimario humano

y estudiar las modificaciones en el eje hipófiso-gonadal

luego de la inducción de la. hipoprolactinemia.

2. - Analizar la posible participación de la PRL en la fun­

ción testicular durante la maduración sexual de la rata.


PRI ME RA PARTE
MATERIALES Y METODOS I
45

M A T E R I A L E S .

REACTIVOS UTILIZADOS.

Los compuestos radiactivos


utilizados se obtuvieron
3
de New England Nuclear Corp, EE.UU.: 1,2 H-Testosterona,
3
actividad especifica 41.2 Ci/mmol, 1,2- H-Dihidrotestos-
. 3
terona, actividad especifica 50.6 Ci/mmol, 1,2- H-Androstan-

3 o( , 17 0( , actividad especifica 40.9 Ci/mmol,


3 125
1,2,6,7 H-Androstenodiona 90 Ci/mmol y ( I) INa.

Las placas de silica gel utilizadas para el control

de pureza de los esteroides radiactivos fueron de 20 x 20

cm (Kieselgel 60 F 254) de Merck.

Los esteroides no radiactivos utilizados: testosterona,

dihidrotestosterona (DHT), 5 O Í -androstandiol (3 o( -Diol)

y ^ -Androstenodiona (/\^Adiona) fueron de Sigma Chemical

Comp. y Steraloids (EE.UU).

Los solventes fueron todos de calidad analítica, provi­


niendo según los casos de Merok, Mallinokrodt o Sintorgan.

La celita empleada para la separación de esteroides

fué de grado analítico Filter-aid, Johns-Mansville (EE.UU).

El antisuero utilizado para el RIE de testosterona,


obtenido por la inmunizacion a conejos con testosterona conjuga-*
da en posicion x con sinomina y hrmantonina fue
gentilmente provisto por el Dr. Missenide (Dusseldorf, R.F.A.) El
46

antisuero especifico para DHT cedido por el Instituto Pasteur

de París fue obtenido en conejos con DHT conjugada en posi­

ción 1 con albúmina y carboximetiloxima. El antisuero utili

zado para el RIE de 3 o( -DIOL fue obtenido por inmunización

en conejos con 3 O^-DIOL conjugado en posición 15 con albúmi­

na y carboximetiloxima (Immunotech, Montreal, Canadá).

El anticuerpo anti-Adiona fue obtenido por inmunización

a conejos con A^androstenodiona conjugada en posición 6 con

albúmina y hemocianina, cedido gentilmente por el Dr. Karl

Pirke, (Max-Planck Institut für Psychiatrie, Munich, Ale­

mania Federal). Para la determinación de LH se utilizó un

anticuerpo cedido por National Pituitary Agency (batch NQ

2 ). Para la marcación y como estándar de referencia se

utilizó en este RIE, hCG altamente purificada (31079;

20.000 IU IRP-2 h MG/mg) provisto por The Hormone and Iso

tope Laboratory, Aker Hospital Oslo, Noruega. El kit utiliza­

do en la determinación de PRL por RIE fué provisto por la

National Pituitary Agency (NIH-NPA, batch h-PRL-I-6). El

carbón Norit A y el Dextran T-80 de Calbiochem utilizados

en la separación de la fracción libre y unida en los RIE

de esferoides fueron de Amend Drug Chem. Co. y de Pharmacia

Fine Chem. respectivamente.

Todos las otras drogas y reactivos utilizadas se obtu­

vieron de Sigma Chem. Company (St. Louis, Missouri).


47

PACIENTES Y TRATAMIENTOS.

Las muestras de tejido testicular y epididimario utili­

zadas en este estudio fueron obtenidos de 31 pacientes que

debieron ser orquidectomizados como terapia módica debido

a diferentes patologías. La causa más frecuente de la indica­

ción de la cirugía fué la presencia de un carcinoma de prós­

tata y por ese motivo la mayoría de los pacientes tenían

una edad superior a los 50 años. Ninguno de los pacientes

estudiados hablan recibido previamente tratamiento radiante

y hormonal, con excepción de tres de ellos que fueron trata­

dos con estrógenos. Dichos pacientes recibieron 5 mg de dieno-

estrol oral por dia, por periodos de tiempo comprendidos

entre 2 y 6 meses.

En un grupo de 12 pacientes, previo consentimiento,

se indujo una hipoprolactinemia mediante la administración

de bromocriptina (Parlodel, Sandoz, Suiza) durante 7 días

consecutivos, a una dosis de 7.5 mg por dia distribuidos en

tres tomas diarias. Dicha droga ha sido utilizada por algunos

grupos de trabajo en el tratamiento de esta patología prostáti^

ca (Coune y col., 1975).

En las Tablas 1 y 2 se detallan las características

de todos los pacientes estudiados, indicándose, edad, diagnós­

tico, tratamiento en caso de haberse efectuado y forma de

obtención del tejido.


48

T a b 1 a 1.

Edad Obtención del


Paciente Diagnóstico Tratamiento
(años) tejido

KJ 76 CP —
Qrquidectomia
FV 59 CP n
LC 71 CP — N
AM 61 CP — n
LG 62 CP — ii
JJ 60 CP — M
FU 63 CP ii

FE 64 CP — n
GJ 72 CP — n
BG 76 CP — n
LM 67 CP — n
GR 61 CP — M
MD 64 CP — ii

dienoestrol 5mg/dia
SM 68 CP ii ii

FJ 39 CP n ii

PF 69 CP n ii

SJ 55 CPe — M
AB 18 CT — N
JY 34 CT — M

CP : carcinoma de próstata.

CFe: carcinoma de pene.

CT : turar de testículo
49

Tabla 2.

Edad Obtención del tejido


Paciente Diagnóstico Tratamiento
(años)
testicular °rquidectanía

0 52 CP
- — + -

bromocriptina +

P 58 CP

+ -

bromocriptina — +

Q 59 CP

+ -

bromocriptina — +

R 62 CP

+ -

bromocriptina — +

S 63

+ -
CP
bromocriptina — +

T
-— + -
64 CP
bromocriptina — +

— + -
U 65 CP
bromocriptina — +
— -
V 66 CP
bromocriptina — +
— + -
X 69 CP
bromocriptina — +
— + -
K 70 CP
bromocriptina — +

— + -
Z 71 CP
bromocriptina — +

—— + -
M 73 CP
bromocriptina — +

CP: carcinoma de próstata.


bromocriptina: tratamiento por 7 dias (7,5 rtig/dia).
50

M E T O D O S

OBTENCION DEL TEJIDO.

Respecto a la obtención del tejido debe consignarse

que este fué obtenido mediante orquidectomia bilateral y

por biopsia testicular en el caso de la muestra basal en

los pacientes en que se indujo hipoprolactinemia, al momento

de realizar la toma biópsica para el diagnóstico anatomopato-

lógico del carcinoma. En ambos casos las operaciones se rea­

lizaron bajo anestesia peridural y el tiempo transcurrido

entre la inyección del anestésico y la cirugía fué en todos

los casos de 20 minutos aproximadamente.

Cuando se obtuvieron muestras de sangre, las extrac­

ciones se efectuaron siempre previo a la anestesia y alrede­

dor de las 8 horas.

PROCESAMIENTO DEL TEJIDO.

Luego de la obtención, las piezas quirúrgicas fueron

enfriadas rápidamente y trasladadas al Laboratorio en forma

inmediata. En 2 casos, diferentes muestras provenientes del

mismo paciente fueron mantenidas en hielo seco y en hielo

común para evaluar la conservación de las mismas durante

el transporte

Cada una de las muestras de tejido fueron fraccio-


51

nadas en 3 alícuotas diferentes, adecuadas a la realización

de las determinaciones que se detallan a continuación:

a) Dosaje de andrógenos: Se pesaron 100 a 300 mg de tejido

testicular o epididimario y se colocaron en viales de vidrio

con 5 mi de acetona, conservándose a -20QC hasta su procesa­

miento .

En 9 casos el tejido epididimario fue cuidadosamente

separado en sus tres segmentos principales cabeza (Ca), cuer­

po (Cu) y cola (Co) y separaron fracciones de cada segmento

independientemente. En los restantes casos los estudios se

realizaron en fracciones de Ca del epididimo. En los estudios

de paralelismo para las determinaciones de testosterona y

DHT en los tejidos considerados, se pesaron fracciones de

36, 52, 112 y 194 mg de tejido testicular de un paciente

y 48, 70, 108 y 212 mg de porción de la cabeza del epididimo

correspondiente. Con el mismo objetivo, y para el dosaje

de 3 0( -Diol se tomaron 103, 165 y 309 mg de tejido testicu­

lar y 70.8, 122 y 192.3 mg de tejido epididimario de otro

paciente.

Con el objeto de evaluar una posible metabolización, se

obtuvieron muestras de tejidos correspondientes a 3 pacien­

tes las que fueron procesadas inmediatamente siendo homogenei

zadas en acetona y buffer fosfato.

b) Dosaje de Cinc: Se pesaron porciones de tejido de aproxi-


52

madamente 100 mg y se colocaron en tubos de polietileno con­

servándose, a -20QC, hasta el momento de su determinación

por espectroscopia en absorción atómica.

c) Control histológico del tejidos En todos los casos es­

tudiados una pequeña porción de tejido fue fijada en solución

de Bouin y posteriormente procesada para realizar el estudio

histológico.

POSAJE DE ANDROGENOS TESTICULARES Y EPIDIDIMARIOS.

- EXTRACCION Y PARTICIONES CON DIFERENTES SOLVENTES.*


3

Para poder determinar los niveles de andrógenos en

el tejido fué necesario realizar una preparación previa del

tejido con el objeto de eliminar interferencias. Las muestras

una vez descongeladas, se homogeneizaron en 5 mi de acetona

en un homogeneizador Ultra-Turrax (IKA Werk, Breisgau) me­

diante 4 golpes de 15 segundos con intervalos de 30 segundos

de enfriamiento cada vez. Previamente se hablan agregado


3
a las muestras los esteroides radiactivos ( H-Testosterona
■i 3
H-DHT y H-3 -Diol) en calidad de estandart internos

para evaluar las pérdidas ocurridas durante el procesamiento.

Los esteroides tritiados se prepararon en acetona, se agregó

a cada tubo 6000 dpm en 100 jul, se incubó durante 10 minutos

y se centrifugó a 4QC durante 10 minutos• El sobrenadante

se trasvasó a tubos -cónicos, dividiendo cada muestra en

dos partes y se evaporó a sequedad.


53

El extracto, obtenido se resuspendió con 1 mi de agua

bidestilada, se calentó a 50QC durante 10 minutos y se agitó

en un agitador "Vortex" durante 1 minuto.

La extracción se realizó con éter, agregándose 10 mi

de solvente por tubo. Los tubos fueron agitados durante 2

minutos y se congeló la fase acuosa en una mezcla de hielo

seco y acetona. Se trasvasó la fase etérea a otro tubo cónico

y luego una vez evaporada a sequedad, se retomó con 1.4 mi

de metanol. Luego de agitar los tubos durante 1 minuto se

les agregó 0,6 mi de agua y se agitó nuevamente durante

1 minuto.

Para eliminar interferencias de lipidos en los tejidos

se realizó una segunda partición con hexano. Se agregó a

cada tubo 2 mi, se agitó durante 2 minutos y se descartó

la capa superior. Posteriormente se agregaron 6 mi de diclo-

rometano a cada tubo, agitándose durante dos minutos. La

capa superior fué descartada, evaporándose a sequedad la

fase de diclorometano.

Finalmente se redisolvió el extracto con 1 mi de iso-

octano. Las muestras fueron luego cromatografiadas en micro-

columnas de celita para separar los distintos andrógenos.

- CROMATOGRAFIA EN MICROCOLUMNAS DE CELITA:

Entre las diferentes metodologías utilizadas para ais-


54

lar esteroides,la cromatografía en columnas de celita presen­

ta varias ventajas. Constituye un soporte inerte adecuado

para la fase fija en una cromatografía de reparto y no presen

ta blancos detectables en la curva estándar del RIE. Para

conseguir un perfil de elución de buena reproducibilidad

fue necesario evitar la variabilidad en el contenido de agua

de la celita influenciada en gran medida por el medio ambien­

te. A tal fin y previo al armado de las columnas se realizó

la activación de la celita a 400QC durante 6 horas y se con­

servó en estufa a 100QC hasta su utilización.

La fase estacionaria en esta cromatografía está consti­

tuida por los solventes etilenglicol-propilenglicol en rela­

ción 2x1 V/V. La celita se mezcló cuidadosamente con los

solventes (1:1 p/v) hasta obtener una pasta homogénea y espon

josa (20-30 minutos). Luego se llenaron las columnas de vi­

drio de 0.5 cm de diámetro y 50 cm de largo de manera de

obtener una altura de llenado de 5 cm. En la parte inferior

se colocó un pequeño disco de teflón poroso y las columnas

se compactaron de manera uniforme. Una vez armadas las colum­

nas, se realizó un lavado de las mismas con 10 mi de isoocta-

n o . Las muestras que hablan sido resuspendidas en 1 mi de

isooctano se sembraron en cada columna y posteriormente se

eluyeron los asteroides utilizando como fase móvil mezclas

de solventes de diferentes polaridad para cada hormona.


55

La elución se llevó a cabo con Nitrógeno a presión

constante de manera de obtener un goteo de aproximadamente

20 gotas por minuto. La temperatura ambiente se mantuvo

siempre alrededor de 20QC.

El diagrama de elución de las columnas fué el siguien­

tes

a) 1 mi de muestra disuelta en isooctano (siembra).

b) 5 mi de isooctano (lavado).

c) 4 mi de isooctano: tolueno 70 :30 (eluye DHT).

d) 2 mi de isooctano* tolueno 60 :40 (lavado).

e) 4 mi de isooctano: tolueno 60 :40 (eluye testosterona).

f) 6 mi de ciclohexano: acetato de etilo 85 : 15 (eluye

3 OC -Diol).

Los volúmenes recogidos se evaporaron a sequedad y

se resuspendieron en el buffer utilizado en el RIE. Luego

del agregado de solución centellante, una fracción de cada

tubo fué contada en un Contador de Centelleo Liquido. Las

recuperaciones obtenidas por este método se calculan compa­

rando la actividad (cpm) en cada una de las muestras con

la del estándar original agregado.

- RADIOINMUNOENSAYO (R I E ).

La composición del buffer en que se resuspendieron

las muestras para dosarlas mediante RIE fue la siguiente:

Para un litro de solución: PO^NajH.Ví^O 10.8 g.


56

P04NaH2 .H20 4.7 g

Azida sódica 1 g
CINa 9 g
Gelatina 1 g
Este buffer ajustado a pH 7> fue además utilizado para

la preparación de las soluciones estandars, la dilución de

los antisueros y trazadores y la preparación de la suspensión

del carbón.

Las curvas estandars se prepararon con asteroides no

marcados en un rango de 12.5 a 800 pg/ 100 j i l de buffer a

partir de soluciones madres de 16 pg/ml en etanol. Las dilu­

ciones se renovaron mensualmente y se conservaron 4QC. La

solución madre se preparó anualmente y se aguardó a -20QC.

Los andrógenos radiactivos se guardaron en etanol o

bencenos etanol 9 s 1 de acuerdo a su polaridad y se conser­

varon a 4QC.

La pureza de los esteroides radiactivos fué controlada

mensualmente por cromatografía en capa delgada en placas

de silica gel 20 x 20 (Kieselgel 60 F 254, Merck). Se uti­

lizó como solvente de desarrollo el sistema cloroformo/meta-

nol 98x2 y los Rf para cada andrógeno fueron: testosterona:

0.41, dihidrotestosterona: 0.53 y 3 o(— androstandiol: 0.28.

Para su utilización en el ensayo los andrógenos tritiados

se prepararon en buffer fosfato (12.000 a 15.000 dpm/100


57

pl) y utilizados siempre dentro de los tres dias de haber

sido preparados.

Los antisueros empleados para dosar testosterona, DHT

y 3 0( -Diol se diluyeron en el momento de realizar el ensayo

en buffer fosfato a una concentración previamente establecida

que unia aproximadamente el 40% del andrógeno marcado.

A continuación se detalla el porcentaje de reacción

cruzada con una serie de esteroides y que fué calculada como

la relación entre la masa de esteroides necesaria para produ­

cir un desplazamiento del 50% en la curva, con respecto a

la masa del esteroide en estudio necesaria para produc

mismo desplazamiento.

Ant i-Testosterona.

testosterona 100 %

dihidrotestosterona 100 %

epitestosterona 0.1 %

androstandiol 1.6 %

androstandiona 0.3 %

dehidroepiandrosterona 0.002 %

estradiol 0.003 %

estriol 0.001 %

estrona 0.001 %

progesterona 0.05 %

1 7 (X-hidroxiprogesterona 0.003 %

desoxicorticosterona 0.001 %
58

Anti-DHT

dihidrotestosterona 100 %
testosterona 23 %

5 Of-androstan-17^-ol-3-ona 1.5 %

androstenediona

O
VO
%


androstenediol 0.3 %

androsterona 0.17 %

Anti-3 -Diol

Androstan-3 0(-,17 -diol 100 %

pregnan-30( -ol-20-ona 5 %

dihidrotestosterona 0.3 %

testosterona 0.2 %

progesterona 0.1 %

pregnenolona 0.1 %

17 o(-OH-progesterona 0.1 %

dehidroepiandrosterona 0.1 %

androstenediona 0.1 %

estrona 0.1 %

estradiol 0.1 %

La suspensión de carbón utilizada para la separación

de las fracciones libres de la unida se preparó en buffer

al 0.5% con el agregado de dextrán (0.05%) y se guardó a 4QC


59

por periodos de tiempo no mayores de 15 dias. En el momento

de utilizarlo se agitó durante 15 minutos a 4QC.

Los ensayos se realizaron en un volumen final de 0.5

m l , las muestras y la curva estándar se ensayaron por dupli­

cado, y las alícuotas requeridas para cada una de las muestras

se llevaron a 300 pl con buffer fosfato. Los estandars de

cada andrógeno se agregaron en cantidades de 12.5 a 800 pg,

en alícuotas de 300 pl en el mismo buffer. El anticuerpo fuó

agregado en un volumen de 100 pl. Finalmente, se agregó la

solución del andrógeno radiactivo, 100 pl por tubo (12.000-

15.000 dpm). Anticuerpos, trazadores y estandars o desconoci­

dos, se incubaron a 4QC durante 16 a 20 horas. Las fracciones

libres y unidas al anticuerpo se separaron con el agregado

de 200 pl de la solución de carbón-dextrán. Luego de mez­

clar cada tubo, estos se mantuvieron a 4QC durante 10 minutos

y se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos en una cen­

trifuga refrigerada.

El sobrenadante que contenia la fracción unida al anti­

cuerpo fuó trasvasado a viales de polietileno que contení­

an 0.3 mi de dioxano y a los cuales se agregó 2.4 mi de solu­

ción de centelleo. La radiactividad presente se determinó

en un Contador de Centelleo Liquido.

Cálculos: Se realizó una transformación logit-log de

los datos para la evaluación de curvas estandars y cálculo


60

de desconocidos. La regresión lineal fue calculada luego de


truncamiento.

Los datos fueron corregidos de acuerdo a la alícuota

tomada, recuperación calculada y mg de tejido utilizados,

de manera que las concentraciones de los andrógenos se expre­

saron en ng de andrógeno presente por gramo de tejido.

DETERMINACION DE Zn POR ABSORCION ATOMICA.

Es un método muy sensible capaz de detectar cantidades

del orden de nanogramos del elemento en cuestión.

Se debe obtener el metal en estado de vapor atómico,

lo cual se logra vaporizando la solución de muestra sobre

una llama oxidante (generalmente de aire-acetileno) y produ­

ciendo luego transiciones electrónicas del metal mediante

procesos excitatorios propios de una lámpara de cátodo hueco.

- PREPARACION DE MUESTRAS Y SOLUCIONES ESTANDARS.

Se utilizó una solución patrón preparada a partir de

un estándar de sulfato de cinc en solución 0.1 M Tritisol

que se llevó a 2 litros con CLH 1% (V/v). A partir de esta

solución y en el momento de realizar las determinaciones,

se realizaron diluciones para lograr concentraciones de 0.5

jag/ml que se usaron como testigos.

Los tejidos a analizar, (testículos y epidídimos) una

vez descongelados, se homogeneizaron en agua bidestilada (2.5

mi), se guardaron 200 /al para determinar proteínas, y el


61

volumen restante fue sometido a la técnica "Wet Ashing" para

destruir la materia orgánica.

A cada homogenato se le agregó 1 mi de mezcla HNO^:

HC1C>4 (1*1) v/v y se calentó a ebullición durante 2-3 horas.

Al cabo de este periodo, se verificó que la solución resultan­

te fuera límpida y sin resto de tejido alguno. Se dejó enfriar

y se llevó a 10 mi con agua bidestilada.

Se preparó también un blanco de reactivos consistente

en agua bidestilada con el agregado de 1 mi de HNO^iHClc^.

Este se sometió al mismo tratamiento que las muestras, calen­

tamiento y dilución a 10 mi con agua bidestilada.

Las muestras asi preparadas se sometieron a la determi­

nación de Zn por triplicado en el espectrómetro de absorción

atómica que funciona en el Instituto de Neurobiologia (Ser­

vicio del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas

y Técnicas).

CONTROL HISTOLOGICO DEL TEJIDO. El tejido testicular fresco

se fijó en Bouin y luego de embeberlo en parafina, secciones

de 5 Jim fueron teñidos con hemotoxilina/éosina y ácido perió­

dico de Schiff /hemotoxilina. En todos los casos se evaluó el

estado del intersticio y los tubos seminíferos de cada prepa­

rado en un Microscopio Zeiss Standard 18 con accesorios de

microfotografia automático.
62

DETERMINACIONES HORMONALES EN EL SUERO DE LOS PACIENTES.

Las muestras de sangre fueron obtenidas por punción

venosa de la vena antecubital de cada paciente pre y post

tratamiento con bromocriptina y mantenidas a temperatura ambi­

ente hasta su coagulación. Luego de centrifugados, los sueros

obtenidos fueron guardados a -20QC hasta el momento de ser

utilizados para la determinación de PRL, LH y hormonas este-

roideas.

- MEDICION DE PRL Y LH SERICAS.

Para la determinación de PRL y LH séricas se utilizaron

técnicas de RIE de doble anticuerpo. El ensayo se efectuó

en alícuotas de 50 y 200 j i l de suero respectivamente y por

duplicado. Sobre los sueros alicuotados se agregó el primer

anticuerpo y se incubó a 4QC durante 24 h s . Se agregó luego

la hormona marcada y al cabo del tercer dia el segundo anti­

cuerpo. Luego de mantener las muestras a 4QC entre 48-72 hs.,

se separó la hormona unida de la libre mediante centrifuga­

ción. Se aspiró el sobrenadante de cada muestra y en los pre­

cipitados correspondientes a los complejos hormona-anticuerpo

se contó la radiactividad en un Contador Gama Automático Beck-

man modelo 4000.

Los resultados para PRL y LH humanas se expresaron en

ng/ml y mUI/ml respectivamente.


63

“ MEDICION DE ANDROGENOS SERICOS.

Para la determinación de andrógenos plasmáticos se rea­

lizaron tres extracciones previas con éter etílico, siendo

la relación volumen total de óter/suero de 10 a 1. Luego de

evaporarse la fase orgánica se resuspendieron las muestras


en buffer fosfato.

La testosterona se determinó sobre alícuotas equivalen­

tes a 40 f i l de suero. No se realizó separación previa de es-

teroides en columnas de celita y debido a que el antisuero

utilizado cruza con DHT? los niveles de testosterona evaluados

en suero corresponden a la suma de testosterona + DHT.

Las alícuotas utilizadas para la determinación de

^androstenodiona y 3 0( -Diol correspondieron a 80 y 300

jil de suero original respectivamente.

Los ensayos para testosterona y 3 0( -Diol fueron idén­

ticos a los descriptos anteriormente y el método utilizado

para la medición de androstenodiona fue realizado con


4
el mismo protocolo experimental.

Los resultados obtenidos para testosterona y ^androste-

nodiona se expresaron en ng/100 mi y los correspondientes

a 3 -Diol plasmáticos en pg/ml.

El limite de sensibilidad del método para todos los

ensayos en suero fué 12.5 pg y los errores intra e interensa­

yo fueron en todos los casos inferiores al 10%.


64

OTROS METODOS.

Las mediciones de proteínas fueron hechas por el método

de Lowry y col.(1951) empleando albúmina sérica bovina (BSA)

como estándar.

ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS.

Para el análisis de los datos se utilizó el test de

Student no apareado y cuando se comparó el efecto del trata­

miento con bromocriptina para los distintos parámetros se

utilizó el test apareado. De este modo, en el presente estudio

cada paciente resultó ser su propio control.


RESULTADOS I
65

NIVELES DE ANDROGENOS Y CINC EN TEJIDO

TESTICULAR Y EPIDIDIMARIO HUMANO,

CONTROLES METODOLOGICOS.

- VALIDACION DEL METODOi

Los andrógenos presentes en el testículo y epididimo

se midieron por radioinmunoensayo (RIE) luego de homogeneiza-

ción en acetona, extracción con éter, partición con diferentes

solventes y posterior aislamiento en microcolumnas de celita.

Para realizar una evaluación adecuada de esteroides en tejido

por dicho método fue necesario demostrar que no existían in­

terferencias en el ensayo.

Dos criterios han sido clásicamente utilizados para

validar el dosaje de esteroides por RIE, en primer lugar au­

sencia de blancos de reactivos y en segundo lugar existencia

de paralelismo entre la curva estándar y una curva construi­

da con cantidades crecientes de tejido. En todos los ensayos

realizados los blancos de reactivos fueron no detectables.

El test de paralelismo se llevó a cabo aplicando crite­

rios desarrollados por Rodbard y col.(1974).

Una vez obtenidos los órganos, se disecaron inmediatamen

te 4 muestras de cada tejido de un mismo paciente y se procesa

ron en idénticas condiciones experimentales. Luego de la ex­

tracción y purificación del esferoide tal como se describió


66

en la sección Materiales y Métodos, todas la muestras utiliza­

das para el test se evaluaron en un mismo RIE.

Al procesar los datos mediante análisis de regresión

y transformación logit-log (Figura 3) se obtuvo una pendiente

(p - ES) para la curva estándar de testosterona de 2.30 -

0.03, mientras que las correspondientes a dicha hormona en

testículo y epididimo fueron 2.62 - 0.06 y 2.09 í 0.07 res­

pectivamente. Los mg de tejido utilizados están corregidos

por la recuperación calculada luego del agregado de un estándar

interno a cada muestra y se indican en el eje de las abcisas.

Como puede observarse, existe un claro paralelismo en

los ensayos de testosterona testicular y epididimaria sin

diferencias significativas entre las pendientes.

Respecto a la determinación de DHT en ambos tejidos

también se observó paralelismo (Figura 4). En este caso la

pendiente que se obtuvo fue 2.19 - 0.01 para la curva estándar

y 2.30 - 0.08 y 2.43 - 0.06 las pertenecientes a la concentra­

ción de DHT en testículo y epididimo respectivamente. La Fi­

gura 5 representa el resultado del test de paralelismo para

concentración de 3 o(-Diol tisular. En este caso tampoco hubo

diferencias significativas entre las pendientes de la curva

estándar y aquellas correspondientes a los tejidos (curva

estandard 2.43 - 0.01; testículo» 2.20 - 0.08 y epididimo»

2.00 - 0.09).
67

Figura 3 .

Test de paralelismo entre la curva estándar de T y dos curvas

construidas con cantidades crecientes de tejido testicular

y ep id id imar io.

(Se representa la función logit del porcentaje de unión en

función del logaritmo de la concentración de testosterona)•


68

Figura 4 .

Test de paralelismo entre la curva estándar de DHT y dos curvas

construidas con cantidades crecientes de tejido testicular

y epididimario

(Se representa la función logit del porcentaje de unión en

función del logaritmo de la concentración de DHT).


69

iFigura 5 .

Test de paralelismo entre la curva estándar de 3 0(-Diol y dos

curvas construidas con cantidades crecientes de tejido testi-

cular y epididimario

(Se representa función logit del porcentaje de unión en función

del logaritmo de la concentración d e 3 -Diol).


70

- VARIACION INTER E INTRAENSAYOi

El siguiente paso fue establecer las variaciones intra

e interensayo en los tejidos a estudiar. La primera se deter­

minó a través de las diferencias de duplicados de muestras

de tejido procesadas en un mismo ensayo y fueron para testos-

terona, DHT y 3 0( -Diols 9,8%; 11,1% y 11,8% respectivamente.

En relación al epididimo y los mismos andrógenos las variacio­

nes fueron 10,8%; 11,3% y 11,9%.

Para analizar la variación interensayo se calculó el

coeficiente de variación de los valores obtenidos de un pool

de tejido testicular y otro epididimario medidos en circuns­

tancias diferentes. Luego del análisis de los datos los resul­

tados obtenidos en testículo fueron: 13,2%; 13,5% y 13,6%

y en epididimo: 12,8%; 13,8% y 14,1% para testosterona, DHT

y 3 -Diol respectivamente.

Por lo tanto, puede concluirse que el método empleado

para la determinación de los 3 andrógenos tisulares, en ambos

tejidos, presenta una buena reproducibilidad.

- EVALUACION DE PERDIDAS DURANTE LA EXTRACCION Y PURIFICACION

DE ESTEROIDESi

La complejidad del método utilizado para la extracción

de andrógenos tisulares y que permite su posterior dosaje

por RIE, resulta en diferentes pérdidas en cada una de las

muestras. Con el objeto de evaluar las mismas, se agregaron


71

6.000 dpm de cada andrógeno tritiado como estándar interno

previo a la homogeneización.

En el eluido correspondiente a cada andrógeno, al final

de la cromatografía en microcolumnas de celita, se determinó

la radiactividad remanente. Los porcentajes de recuperación

asi calculados fueron los siguientes (X + ES): testículo;

n = 35, testosterona: 63,8 - 12,4%; DHT: 50,0 + 8,6% y 3 0{ -

Diol: 64,1 + 9.0% y epididimo; n =* 20, testosterona: 59,5

- 8,5%; DHT> 50,1 - 6,3% y 3 0< -Diol 57,1 - 6,5%.

- TRANSPORTE Y HOMOGENEIZACION DE LOS TEJIDOS:

Se determinó si existían diferencias en las concentrado

nes de los diferentes andrógenos tisulares que dependieran

de las condiciones de transporte de las muestras luego de

la extracción del tejido. Con ese fin, muestras de tejido

correspondientes a un mismo paciente, fueron transportadas

al Laboratorio en hielo común (0 - 4QC)o hielo seco(-76QC).

Como se muestra en la Tabla 3, no se detectaron diferencias

significativas al transportar el tejido por uno u otro método.

Se han descripto importantes diferencias en los dosajes

de andrógenos tisulares tanto en humanos como en la rata al

homogeneizar los tejidos en buffer o en solventes orgánicos

(Hammond y col., 1978; Campo y col., 1979). Teniendo en cuenta

este antecedente, se homogeneizaron segmentos de una misma

muestra en buffer o en acetona tal como se detalló en la sec-


Paciente Transporte Homogenización Tejido (mg) Testosterona (ng/g) DHT (mg/g)

B 0-4QC buffer 71,6 583 23,0

B 0-4QC acetona 51,0 699 18,0

B -76QC acetona 72,5 689 16,5


72

H 0-4QC buffer 96,8 542 21,0

H 0-4QC acetona 87,9 589 19,6

H -76QC acetona 85,4 551 20,0

C 0-4QC buffer 227,0 339 21,4

C 0-4QC acetona 222,0 419 17,9

Concentraciones de testosterona y DHT en biopsias de testículo de tres pacientes


(B, H y C).E1 tejido fue alternativamente transportado a 0QC - 4QC ó a -76QC
(hielo seco) y homogeneizado en buffer o acetona.
73

ción Materiales y Métodos Ira. Parte. Asi pudo comprobarse


(
que homogeneizando los tejidos en un medio acuoso se obtienen

concentraciones de testosterona levemente menores y que en

cambio las correspondientes a DHT son incrementadas. En vista

de estos resultados se decidió transportar los tejidos entre

0-4QC, disecarlos a dicha temperatura y homogeneizarlos en

acetona. Cuando las mediciones de andrógenos no se realizaron

en forma inmediata las muestras en acetona se conservaron

a -70QC hasta su procesamiento.

- CONCENTRACION DE TESTOSTERONA Y DHT EN TESTICULO.

La medición de andrógenos y sus metabolitos ha sido

habitualmente realizada en muestras de sangre y orina,obtenién

dose asi cierta información respecto de la producción y

metabolismo de dichas hormonas. Sin embargo, los niveles peri­

féricos no siempre reflejan las concentraciones presentes

en los tejidos, ya que ésta depende de numerosos factores

tales como: metabolismo propio del tejido, proteínas que unen

específicamente andrógenos, formación "in situ" de estas hormo

ñas y la depuración del esteroide en el propio tejido.

La información existente hasta el presente en relación

a las concentraciones intratesticulares de andrógenos en huma­

nos es relativamente escasa (Ruokonen y col., 1972; Morse

y col., 1973; Steinberger y col., 1974). Con el propósito

de ampliar dicha información, se dosaron los andrógenos endó­


74

genos en testículos provenientes de un grupo de pacientes

que debían ser orquidectomizados como parte de su plan terapéu

tico.

Con el objeto de establecer si el nivel de andrógenos

en cada testículo era representativo del par, se estudiaron

las concentraciones de testosterona y DHT en las gonadas dere­

cha e izquierda simultáneamente. Los resultados obtenidos,

representados en la Tabla 4, muestran que no hubo diferencias

en las concentraciones de andrógenos entre una y otra gonada

en ninguno de los casos estudiados, siendo los cambios ex­

perimentados menores que el coeficiente de variación intraensa

yo. A partir de ese momento se obtuvieron siempre muestras

correspondientes a testículo derecho.

En la Figura 6 se muestran los resultados obtenidos

al estudiar la concentración testicular de testosterona y

DHT en un grupo de pacientes (n = 25), con edades comprendidas

entre 52 y 76 años (Promedio: 65 años), portadores de carcino­

ma de próstata. Estos pacientes no hablan recibido tratamiento

hormonal o radiante, previo a la orquidectomia. El nivel de

testosterona resultó claramente superior al de su metabolito

5 o l -reducido DHT. Los resultados expresados en ng/g de tejido

fueron: (3T + ES) (testosterona: 501 - 41 versus DHT: 15,5

- 10,0) y la relación T/DHT fué 47,3 - 29,9. Si bien en

la población estudiada, la relación T/DHT fue variable entre


T a b l a 4

Gonada Tejido (mg) Testosterona (ng/g) DHT (ng/g)

Derecha^ 122,5 335,4 14,0

Izquierda^ 246,5 347,9 12,0


75

Derecha2 162,0 613,0 24,5

Izquierda2 194,0 652,0 26,0

Niveles de DHT y testosterona determinados simultáneamente en testi^


culo derecho e izquierdo de dos pacientes con carcinoma de próstata.
76

Figura 6 .
Concentración de andrógenos testiculares determinados por RIE
previa extracción, purificación y aislamiento en microcolumnas
de celita. Las barras vacias corresponden a las concentraciones
de T y DHT en pacientes con carcinoma de próstata sin tratamien
to previo. Las barras sombreadas muestran las concentraciones
de ambos andrógenos en pacientes con carcinoma de próstata
tratados con dienoestrol, 5 mg/dia durante más de 2 meses.
77

cada uno de los pacientes, la concentración de testosterona

fue siempre por lo menos quince veces superior a la del andró-

geno reducido.

Con fines comparativos se analizó además el contenido

testicular de andrógenos en pacientes que presentaban otras

patologías. Un paciente portador de un carcinoma de pene mos­

tró niveles gonadales de testosterona x 253 y DHTs 31 ng/g

(T/DHT i 12). Dos pacientes que presentaban un tumor de test leu

lo mostraron concentraciones de testosterona: 862 y 765 ng/g;

D HT: 17,7 y 12,8 ng/g y una relación T/DHT: 49 y 59,7 respec­

tivamente .

Como puede observarse en las patologías estudiadas,

tanto los niveles de andrógenos como la relación T/DHT resulta

ron en el rango de valores encontrados en los pacientes con

carcinoma de próstata.

Los estrógenos son utilizados en el tratamiento del

carcinoma de próstata por su conocido efecto inhibidor de

la función testicular (Alder, 1968). Resultó entonces también

de interés estudiar la concentración intratesticular de testos^

terona y DHT en un grupo de tres pacientes con carcinoma de

próstata que hablan recibido estrógenos (dienoestrol, 5 mg/dia

via oral) durante un periodo promedio de 4 meses previo a

la orquidectomia. En la Figura 6 se resumen los efectos de


78

dicho tratamiento/ y puede observarse que mientras la concentra

ción gonadal de testosterona descendió en un 85%, la correspon

diente a DHT lo hizo en un 55% (p ^ 0.001).

Estos resultados confirman que la concentración de los

dos andrógenos más importantes en la gonada masculina se ha­

llan profundamente disminuidos durante la estrogenoterapia.

CONCENTRACIONES DE TESTOSTERONA Y DHT EN EPIDIDIMO.

Los andrógenos son sintetizados fundamentalmente en

el sector intersticial del testículo y llegan a través de

la rete testis o por via sanguínea y linfática al epididimo.

Se sabe que la función epididimaria es andrógeno - depen­

diente, habiéndose demostrado en el epididimo proteínas recep­

toras de andrógenos en el citosol y núcleo ,como asi también

una glicoproteina soluble que une específicamente andrógenos

(A B P ) (Blaquier, 1971; Blaquier y col., 1973; Ritzen y col.,

1973). Ambos tipos de proteínas estarían involucradas en el

mecanismo de acción de andrógenos en el tejido epididimario

y por consiguiente en el proceso de maduración de los esperma­

tozoides (Hansson y col., 1975).

Las concentraciones endógenas de testosterona y DHT

en el epididimo humano han sido poco investigadas (Purvis

y col., 1978; Leionen y col., 1980).

Con el objeto de estudiar los niveles propios del tejido

epididimario y relacionarlos a los de la gonada correspondían­


79

te; se midieron las concentraciones endógenas de testosterona

y DHT en porciones de cabeza de epididimo en 18 muestras perte

necientes a los mismos pacientes descriptos previamente. Los

resultados obtenidos están representados en la Figura 7. Como

puede observarse la concentración de testosterona resultó

significativamente mayor que la de DHTj ( X + ES); 38,58 -

2,96 ng/g versus 18,37 - 1,96 ng/g (p < 0.01). La relación

T/DHT en este tejido fué 2,32 - 1,59. Los datos muestran

en el epididimo una mayor proporción del andrógeno reducido

respecto de la testosterona cuando se lo compara con los nive­

les presentes en el testículo (Figura 7).

En el paciente con carcinoma de pene la concentración

de testosterona fue 37,6ng/g;la de DHT 18,7 ng/g y la relación

T/DHT 2,01. En un paciente con tumor de testículo la testos­

terona fue 33,8 ng/g, la DHT 23,5 ng/g y la relación T/DHT

1,43. Como se puede notar las concentraciones halladas para

los andrógenos epididimarios en esta dos últimas patologías

no presentan diferencias sustanciales con las halladas para

los carcinomas de próstata.

CONCENTRACIONES DE ANDROGENOS EN DIFERENTES SEGMENTOS EPIDIDI-

MARIOS.

En varias especies animales, se ha descripto un gradien­

te de concentración de DHT desde la cabeza a la cola del epidi


80

Figura 7 .
Concentración de T y DHT determinados por RIE en la cabeza
del epididimo, en pacientes con carcinoma de próstata sin trata
miento previo (barras vacias) y luego de la administración
de dienoestrol (5 mg/dia)por periodos superiores a 2 meses (ba­
rras sombreadas).
81

dimo (Frankel y col. 1970; Aafjes y col., 1972). En la rata,

los niveles de DHT se han correlacionado con un gradiente

similar de ABP a lo largo de dicho tubo (Purvis y col., 1978).

Con el propósito de investigar la distribución de andró-

genos en el epididimo humano, se evaluaron los mismos en tres

segmentos diferentes del órganos cabeza, cuerpo y cola. Las

muestras fueron obtenidas de 9 pacientes con carcinoma de

próstata, 3 de los cuales hablan sido tratados previamente

con estrógenos. La Figura 8 resume las concentraciones encon­

tradas en los diferentes segmentos epididimarios. La concentra

ción de testosterona hallada (X + ES) fuex cabeza 37,8 - 5,4

ng/g; cuerpo: 40,9 - 7,7 ng/g y colas 40,2 - 6,7 ng/g mientras

que los niveles correspondientes a la DHT fueron; cabezas

21,0 - 4,4; cuerpos 20,8 - 5,1 y colas 17,7 - 3,0. Las rela­

ciones T/DHT fueron: 1,9 - 0,4; 1,9 - 0,3 y 2,2 - 0,5 respec­

tivamente. Como puede observarse ambos andrógenos se distribu­

yeron uniformemente desde la porción proximal a la distal

del epididimo, no constatándose un gradiente de concentración

semejante al que ha sido demostrado en varios modelos animales

(Frankel y col., 1970). El tratamiento con estrógenos disminu­

yó significativamente los niveles de testosterona y DHT en

cada uno de los segmentos epididimarios y los porcentajes

de disminución fueron; testosterona: cabeza 73% (p 0.005);

cuerpo 76% (p 4* 0.001) y colas 88% (p K, 0.005); DHT, cabeza


82

Figura 8 .
Concentración de T y DHT en los diferentes segmentos epididima-
rioss cabeza (Ca) cuerpo (Cu) y cola(Co) en 6 pacientes con car
cinoma de próstata sin tratamiento previo (CA) (barras lisas) y
3 pacientes que hablan recibido dienoestrol (CA + estrógenos)
durante 2 meses antes de la orquidectomia (barras sombreadas).
83

79% (p < 0.01); cuerpo 84% (p <0.02) y cola 79% (p < 0.01)

(Figura 8).

Las concentraciones de proteínas (Media - DS) en el

tejido testicular y en los diferentes segmentos del epididimo

fueron: testículo; 50 - 10 mg/g epididimo; cabeza: 56 - 12

mg/g; cuerpo: 54 - 11 y cola: 5 7 - 9 mg/g de tejido. Como

se puede observar el contenido de proteínas está uniformemente

distribuido entre los diferentes segmentos epididimarios y

en este órgano con relación a la gonada. Por consiguiente

los resultados de las concentraciones de andrógenos y cinc,

mostrados y que se detallarán a continuación, no se modifican

relativamente al expresarlos por gr de tejido o por mg de

proteínas.

CONCENTRACIONES DE CINC EN TESTICULO Y EPIDIDIMO.

Se sabe que el cinc se encuentra en altas concentracio­

nes en los órganos sexuales accesorios y es particularmente

importante en el estudio de las diferentes patologías de la

próstata (Maan y col., 1964). Por otra partease han descripto

frecuentemente asociaciones de deficiencias de cinc con cua­

dros clínicos de hipogonadismo (Prasad, 1983).

Algunos autores han descripto concentraciones elevadas

de este metal en testículo de rata; no existiendo hasta el

presente,estudios simultáneos de andrógenos y cinc en testicu-


84

lo y epididimo humano. Con el propósito de obtener este tipo

de información y en el mismo grupo de pacientes anteriores

se determinaron las concentraciones de cinc en biopsias de

tejido testicular o epididimario. Luego de destruir la materia

orgánica, el cinc fue determinado por espectroscopia en absor­

ción atómica tal como se detalla en la sección Materiales

y Métodos. La Figura 9 resume los resultados obtenidos, y como

puede observarse las concentraciones de cinc fueron muy seme­

jantes en los dos órganos analizados (Media ± ES) testículos


4* -f-
62,2 - 7,6 ug/g y epididimo 67,2 - 11,1 ug/g de tejido.

En el grupo de pacientes bajo tratamiento con estró-

genos, sólo se observó una tendencia a disminuir los niveles

de cinc en cada órgano pero el efecto no fué estadísticamente

significativo (Figura 9).

CORRELACION ENTRE ANDROGENOS TESTICULARES Y CINC.

El cinc influencia la actividad de numerosas enzimas

incluyendo la 5 oC -reductasa prostética, enzima responsable

de transformar la testosterona a DHT. Habib y col. (1976),

establecieron en pacientes con carcinoma e hiperplasia benigna

de la próstata, algunas correlaciones entre el cinc y los

andrógenos. En base a estos hallazgos es que resultó entonces

de interés tratar de establecer si existía alguna correlación

entre las concentraciones de andrógenos y el cinc en testículo

y epididimo.
85

Figura 9.
Concentraciones de Zn en biopsias de tejido testicular y epididi^
mario determinados por espectroscopia de absorción atómica
previa destrucción de la materia orgánica. Las barras vacias
corresponden a pacientes con carcinoma de próstata (CP) sin
tratamiento previo y las sombreadas a 3 pacientes bajo trata­
miento con estrógenos (CP + estrógenos).
86

En las Figuras 10 y 11 se muestran los niveles de tes­

tos terona y DHT versus cinc en la gonada. Como se observa, se

obtuvo una correlación positiva que resultó estadísticamente

significativa en ambos casos. El coeficiente de correlación

calculado para testosterona versus cinc fué r= 0.53 (p < 0.05)

y para la DHT versus cinc este resultó r= 0.78 (p < 0.01).

El análisis de correlación para los mismos parámetros en el

tejido epididimario de estos pacientes mostró una tendencia

totalmente opuesta. Se obtuvo una correlación negativa para

ambos andrógenos y el cinc, resultando estadisticamente signi­

ficativa sólo para testosterona versus cinc, con un coeficien­

te de correlación r= 0,65 (p < 0.05) (Figura 12). El coefi­

ciente de correlación para DHT versus cinc fué r= 0,37 (Figura

13) .

CONCENTRACIONES DE 3C*-DIOL EN TESTICULO Y EPIDIDIMO.

En algunos de los pacientes con carcinoma de próstata

se evaluó conjuntamente con la testosterona y DHT, el 3 c{

-DIOL que resulta de la metabolización de esta última por

acción de la enzima 3 cA -hidroxiesteroide-deshidrogenasa.

En las Figuras 14 y 15 se muestran los resultados obtenidos

en el tejido testicular (n= 16) y epidimario (n= 10). Las

concentraciones de 3 o( -Diol en ambos órganos fueron muy bajas

y sensiblemente menores que las de DHT •Dichos valores fueron


87

Figura 10.
Relación entre las concentraciones de T y Zn en tejido testi-
cular humano. Coeficiente de correlación r = 0.53 (p < 0 05) .
88

Figura 11.

Relación entre las concentraciones de DHT y Zn en tejido


testicular humano de pacientes con carcinoma de próstata. Coe
ficiente de correlación r = 0.78 (p 4. 0.01).
89

Figura 12.

Relación entre las concentraciones de T y Zn en tejido epididi-


mario en pacientes con carcinoma de próstata. Coeficiente de
correlación r = 0,65 (p 0.05).
90

Figura 13.

Relación entre las concentraciones de DHT y Zn en tejido epididi


mario de pacientes con carcinoma de próstata. Coeficiente de
correlación r = 0,37 (NS).
91

Figura 14.

Concentraciones intratesticulares de T, DHT y 3 -Diol determi


nados por RIE en pacientes con carcinoma de próstata.
92

Figura 15.

Concentraciones de T, DHT y 3 0< -Diol determinados por RIE


en cabeza de epididimo de pacientes con carcinoma de próstata.
93

los siguientes; testículos 2,45 - 0,44 ng/g; epididimo: 2,22

- 0,64 ng/g de tejido.

EFECTO DE LA HIPOPROLACTINEMIA SOBRE EL EJE HIPOFISO-GONADAL.

En los últimos años se ha demostrado que la PRL partici­

pa activamente en el control de la función gonadal masculina.

En el hombre/ la hiperprolactinemia se asocia con importantes

alteraciones en la función reproductiva, normalizándose esta

función luego de disminuir los niveles elevados de PRL median­

te la administración de un agonista dopaminérgico (Perryman

y col., 1981, Koening y col., 1977). Entre los neurofármacos

existentes, la bromocriptina ha sido el más extensamente

utilizado (Fossati y col., 1976). Esta droga tiene la capaci­

dad de normalizar los trastornos sexuales referidos y dicho

efecto ha sido atribuido en parte al descenso en los niveles

circulantes de PRL.

Aplicando la metodología desarrollada anteriormente,

se estudiaron los efectos de la administración de bromocripti-

na durante un breve periodo de tiempo en pacientes portadores

de un carcinoma de próstata, sobre la distribución de distin­

tas hormonas periféricas e intratesticulares.


94

NIVELES DE LH Y PRL EN SUERO.

Se seleccionó un grupo de pacientes con carcinoma de

próstata en estadios C y D, los cuales recibieron durante

7 dias bromocriptina (Parlodel, 2,5 mg, 3 veces por día, por

vía oral). En cada paciente se realizaron dos extracciones

de sangre de la vena antecubital; basal y luego de 7 dias

de tratamiento y en todos los casos las muestras fueron anali­

zados en forma simultánea por RIE. Los niveles de PRL obteni­

dos para cada paciente están representados en la Figura 16.

Como puede observarse, en condiciones básales, únicamente

3 de los 12 pacientes (25%) mostraron niveles de PRL levemente

superiores al rango normal (8-28 ng/ml),mientras que el valor

promedio para la totalidad de los pacientes resultó ser (Media

- ES) 23,75 - 2,5 ng/ml.

Luego del tratamiento con bromocriptina durante 7 dias

se observó una marcada disminución (73%) en los niveles de

PRL, resultando el valor promedio en los 12 pacientes ( X

- ES) 6,41 - 1,0 ng/ml.

En el mismo grupo de pacientes, los niveles de LH pre

y post tratamiento (8,33 - 1,5 y 8,91 - 2,1 mUI/ml respec­

tivamente) permanecieron en el rango de la normalidad (5-

18 mUI/ml) (Figura 16).

NIVELES DE TESTOSTERONA, A ¿-ADIONA Y 3 OC -DIOL EN SUERO.

Se evaluaron los niveles séricos de testosterona,


95

Figura 16.

Niveles individuales de PRL y LH séricos determinados por RIE


en 12 pacientes con carcinoma de próstata en condiciones
básales (c) • y luego de 7 dias de tratamiento con BrO(2,5
mg, 3 veces por dia)
96

3 o(-Diol y ^-Adiona básales y post tratamiento con bromocrip-

tina en el mismo grupo de pacientes que se describió anterior­

mente. Los resultados obtenidos fueron analizados estadística

mente por el test de Student apareado,demostrándose una dismi­

nución significativa (p < 0 . 0 6 ) en la testosterona circulante

como consecuencia del tratamiento con el agonista dopaminérgi-

co (Figura 17). Los niveles de / \ 4~Adiona y 3 o(-Diol plasmá­

ticos no mostraron cambios significativos luego del tratamiento.

En la Figura 18 se ilustran las modificaciones observadas

en los tres andrógenos para cada paciente en particular, en

función de la edad de los mismos. Los niveles básales de

A^-Adiona resultaron en el rango normal (63 a 237 ng/100

mi) y como puede observarse, con la excepción de un solo paci­

ente (Z); la bromocriptina no modificó sustancialmente este

andrógeno.Los niveles básales de testosterona en todos los

casos estudiados estuvieron dentro del rango normal (300 a

730 ng/100 mi). Luego del tratamiento, 5 de 12 pacientes (P,

Q, T, U y K) evidenciaron un franco descenso en los niveles

de testosterona en la periferia, mientras que en los 7 restan­

tes no hubo modificaciones. En lo concerniente al 3 OÍ -Diol

circulante, tampoco se observaron cambios entre sus niveles

básales y durante la hipoprolactinemia, con la excepción de

2 pacientes (P y T), que mostraron un moderado aumento en

relación al limite superior normal (rango normal 50 a 200

pg/ml).
-97

Figura 17

Niveles séricos de T + DHT, /\4-Adiona y 3 C< -Diol en suero


de pacientes con carcinoma de próstata en condiciones básales
(c) y luego de 7 dias de tratamiento (Br) como se indicó
en la Figura 16. Cada barra representa el valor medio - el
error estándar (n = 12).
* Datos significativamente diferentes del control (p ^ 0.05),
test de Student apareado. NS:no significativo.
98

Figura 18.

Niveles séricos individuales de / \ 4-Adiona, T + DHT y 3


o(-Diol en 12 pacientes con carcinoma de próstata en condicio
nes básales (c) y luego del tratamiento especificado en la
Figura 16 (Br).
99

CONCENTRACIONES INTRATESTICULARES DE TESTOSTERONA, DHT Y

3 O^-DIOL.

En muestras de tejido obtenidas antes y al finalizar

el periodo de tratamiento con bromocriptina, se determinó

en el mismo grupo de pacientes anteriormente mencionados,

las concentraciones intratesticulares de testosterona, DHT

y 3 0( -Diol por RIE específicos tal como se detalla en la

sección Materiales y Métodos. Luego de analizar los datos

mediante el test de student apareado, pudo observarse una

elevación significativa en la testosterona (32%, p ^ 0,01),

DHT (35%, p < 0.001) y andrógenos totales (27%, p < 0,02).

El aumento observado en el 3 -Diol (11%) no fué significati­

vo (Figuras 19 y 20).

Al analizar cada caso individualmentey es interesante

remarcar la homogeneidad en la respuesta fundamentalmente

para el principal andrógeno, la testosterona, que luego de

la inducción de la hipoprolactinemia por bromocriptina se

elevó en 11 de los 12 casos analizados (Figura 21). Como puede

observarse en dicha figura, los cambios en la DHT fueron muy

semejantes a los experimentados por la testosterona. Sólo

en 2 casos (P y S), se observó un pequeño descenso/ y uno de

ellos fué precisamente el único paciente en que la testostero­

na habla disminuido (Figura 21).

La figura 22 muestra el perfil de cambios correspon­


100

dientes a las concentraciones de 3 OÍ -Diol testicular, donde

8 de 12 pacientes incrementaron las mismas luego de la adminiss

tración de bromocriptina. Puede observarse además que aumentos

marcados en 2 de los pacientes (P y T) se correlacionaron

con incrementos en este mismo andrógeno reducido, en sus nive­

les plasmáticos (Figuras 18 y 22).

CONCENTRACIONES DE TESTOSTERONA, DHT Y 3 -DIOL EN EL EPIDI-

DIMO,

En un número reducido de pacientes se pudo estudiar

en forma conjunta con las determinaciones en testículo, la

influencia de la hipoprolactinemia sobre las concentraciones

de andrógenos en el tejido epididimario. La Figura 23 refle­

ja la variación detectada para los diferentes andrógenos.

La testosterona aumentó en el 75% de los pacientes, la DHT

únicamente en el 25% y el 3 -Diol en el 100% de los mismos

Los aumentos en los valores absolutos de las medias fueron:

testosterona 30% (p < 0.01) DHT 15% y Diol 20%(p < 0.05).

CONCENTRACIONES DE CINC EN TESTICULO Y EPIDIDIMO.

El tratamiento con bromocriptina durante 7 dias no modi­

ficó los niveles de cinc en el tejido testicular (Figura 24)

ni epididimario en ninguno de los pacientes estudiados. Los

niveles encontrados en el testículo antes y después del trata­

miento fueron: 80,7 - 8,07 y 83,7 - 4,91 f ig / g .


Figura 19.

Concentraciones intratesticulares de T y andrógenos totales


en pacientes con carcinoma de próstata en condiciones básales
(c) y luego de 7 dias de tratamiento como se indicó en la
Figura 16 (Br). Los andrógenos fueron determinados por RIE
previa extracción, purificación y aislamiento en microcolumnas
de celita. Cada barra representa el valor medio - error
estándar (n = 12).
* Datos significativamente diferentes del control (p C 0.001) #
test de Student apareado.
102

Figura 20.

Concentraciones intratesticulares de DHT y 3 o( -Diol en pa­


cientes con carcinoma de próstata en condiciones básales
(c) y luego de 7 dias de tratamiento como se indicó en la
Figura 16 (Br). Lo6 andrógenos fueron determinados por RIE
previa extracción, purificación y aislamiento en microcolum-
nas de celita. Cada barra representa el valor medio - error
estándar (n = 12), * Datos significativamente diferentes
del control (p < 0.02), test de Student apareado, NS : no
significativo .
103

Figura 21.

Concentraciones intratesticulares de T y DHT en pacientes


con carcinoma de próstata en condiciones básales (c) y luego
de 7 días de tratamiento como se indicó en la Figura 16 (Br).
104

Figura 22.

Concentraciones intratesticulares de 3 oC-Diol en pacientes


con carcinoma de próstata en condiciones básales (c) y luego
de 7 dias de tratamiento como se indicó en la Figura 16 (Br).
105

Figura 23.

Variaciones observadas en las concentraciones de T, DHT y


3 OÍ -Diol en tejido epididimario de 4 pacientes en condicio­
nes básales y luego del tratamiento especificado en la Figura
16 (Br).
106

Figura 2 4 ,

Concentraciones intratesticulares de Zn determinadas por


espectroscopia de absorción atómica previa destrucción de
la materia orgánica, en pacientes con carcinoma de próstata,
en condiciones básales (c) y luego del tratamiento especifica
do en la Figura 16 (Br). Cada barra representa el valor medio
- error estándar n = 12) .
107

MORFOLOGIA DEL TESTICULO DURANTE LA HIPOPROLACTINEMIA.

Mediante microscopía óptica se realizó el análisis his­

tológico de dos biopsias testiculares para cada uno de los

pacientes, tomadas al principio y al final de los 7 dias de

tratamiento con bromocriptina. Las biopsias pre-tratamiento

en el grupo de pacientes estudiados mostraron un aspecto he­

terogéneo, con histología normal en algunos de los casos mien­

tras que en otros se hallaba notablemente alterada.

Las células de Leydig maduras se observaron formando

pequeños racimos, vecinos a capilares sanguíneos, mostrando

citoplasma eosinófilo y en algunos casos con presencia de

vacuolas.

Teniendo en cuenta el aspecto del intesticio los pacien­

tes estudiados se pudieron ubicar en tres grupos diferentes.

El primero, integrado por 4 de los 12 pacientes mostró un

intersticio con escaso número de células de Leydig y la concen­

tración de testosterona en este grupo fué (X - ES) 325

í 112 ng/g de tejido. En un segundo grupo con aspecto del

intersticio considerado normal pudo ubicarse el mayor número

de los pacientes y en este caso la testosterona testicular

fué (n= 7, X - ES) 507,5 - 158 ng/g de tejido. La concentra­

ción de testosterona en el único paciente que presentaba seu-

dohiperplasia nodular fué la más alta medida en condiciones

básaless 793 ng/g de tejido.


108

Se comprobó entonces una correlación positiva entre

la testosterona tisular y la cantidad relativa de células

de Leydig presentes (Figuras 25, 26 y 27).

Por otra parte, se observó una amplia gama de variacio­

nes en el aspecto de los túbulos seminíferos. Pudieron diferen­

ciarse en algunas biopsias espermatogénesis completas mientras

que en otros casos se observaron diversos grados de involución

del órgano. Asi estuvieron presentes hipoespermatogénesis

de variable intensidad, espermatogénesis detenida, síndrome

de Sertoli solo y pequeños focos de hialinosis tubular. Los

niveles de testosterona intratesticulares no se correlaciona­

ron con la histología de los túbulos seminíferos, observándose

valores normales de testosterona testicular en pacientes con

marcado daño tubular (Figura 26).

Se compararon las biopsias pre y post tratamiento en

cada uno de los pacientes tratados con bromocriptina. No se

detectaron cambios en el aspecto de los túbulos seminíferos

ni en la morfología o número relativo de las células de Leydig,

pese al claro incremento observado en la concentración intra-

testicular luego de los 7 días de administración de la droga.


109

* Figura 25.

Microfotografla de un corte de testículo de un paciente con


carcinoma de próstata y niveles bajos de testosterona intra-
testicular.
Se observa una disminución numérica de las células germinales
con detención madurativa. En el área intersticial ilustrada
no se visualizan células de Leydig maduras, distinguiéndose
sólo células mesenquimáticas (H-E x 370).
110

. Figura 26.

Microfotografia de un corte de testículo de un paciente con


carcinoma de próstata y niveles de testosterona muy cercanos
al valor medio de la población total.
Se observa aplasia germinativa ("Sertoli solo") y un engrosa-
miento de la pared de algunos túbulos. En el área intersticial
se distinguen dos grupos pequeños de células de Leydig maduras
con características normales (H-E.x 370).
111

Figura 27.

Microfotografia de un corte de testículo de un paciente con


carcinoma de próstata con niveles elevados de T testicular.
Se observa espermatogénesis completa y en el intersticio
se visualiza un área de hiperplasia de células de Leydig
maduras (H-E.x 370).
DISCUSION I
11 2

Los niveles séricos de andrógenos han sido habitualmente

utilizados en el hombre para evaluar la función endócrina

testicular. Sin embargo dichos niveles periféricos muchas

veces no representan exactamente la actividad esteroidogénica

del tejido intersticial. Factores tales como metabolismo

periférico, tasa de depuración y sintesis extragonadal están

también involucrados en la regulación de los niveles séricos

de andrógenos.

La concentración de andrógenos en el tejido puede refle

jar más acertadamente la producción de andrógenos testicula-

res.

La limitación fundamental en este tipo de determinacio­

nes es la posibilidad de obtener valores para un grupo con­

trol normal, sin indicación de biopsia testicular. Por ese

motivo los resultados presentados provienen exclusivamente

de una población cuya indicación terapéutica principal inclu­

ía la orquidectomia y que en su mayoría era portadora de

carcinoma de próstata (65 años de edad promedio). Al respecto

debe remarcarse que la patología prostética sin tratamiento

previo no se acompaña de cambios esenciales en la función

testicular (Bartsh y col., 1977), aunque durante el envejeci­

miento se ha descripto una considerable disminución en el

número de células de Leydig. Luego de alcanzar un máximo

de 700 x 10^ células intersticiales a los 20 años, dichas


113

células disminuyen.con un ritmo aproximado de 8 x 106 células

por gonada por cada década de vida (Kaler y col., 1978).

Algunos autores (Hammond y col., 1978) han indicado

ciertas recomendaciones en la determinación de las concentra­

ciones de esteroides tisulares, referentes a la recolección

y conservación del material con el fin de evitar una activi­

dad metabólica "in vitro". En nuestras condiciones de trabajo

el enfriamiento a 0-4QC y la posterior homogeneización en

acetona fue suficiente para prevenir dichos cambios y única­

mente observamos una pequeña modificación relativa en los

niveles de testosterona y DHT cuando el tejido fue homogenei-

zado en buffer, aún a bajas temperaturas, sugiriendo cier­

ta actividad de la enzima 5 o( -reductasa. Sin embargo,

Hammond y col. (1978), detectaron aumentos importantes en

la concentración de testosterona en muestras gonadales intac­

tas mantenidas a temperatura ambiente durante 2 horas, sin

cambios en la DHT. Estos últimos resultados sugieren por

un lado actividad biosintética de testosterona y por otro

baja actividad enzimática de la enzima 5 -reductasa en

las condiciones "in vitro" mencionadas. Esta discrepancia,

si es que verdaderamente puede considerarse como tal,podría

ser atribuida a cambios inducidos durante la homogeneización,

como por ejemplo la pérdida de la compartamentalización origj.

nal de la enzima.
114

Cuando se utiliza este tipo de metodología resulta

indispensable una adecuada extracción y purificación de las

muestras para poder obtener datos que sean reproducibles.

A partir de los resultados presentados se evidencia claramen­

te que la combinación de particiones con solventes y cromato­

grafía en microcolumnas de celita, constituye un procedimien­

to satisfactorio, que permite obtener buenas recuperaciones

y blancos no detectables. Finalmente el paralelismo entre

curvas estandars y muestras desconocidas demostró la validez

del ensayo utilizado.

El "pool" de esteroides de cada tejido es el resultado

del balance entre la velocidad de entrada y de salida al

mismo; la primera involucra captación de la hormona por el

tejido y sintesis local, y la segunda comprende metaboliza-

ción de la misma y liberación a la circulación.

El valor medio obtenido para testosterona testicular

(501 - 41 ng/g), coincide con los niveles presentados por

Ruokonen y col., (1972), Hammond y col. (1979) y Purvis y

col. (1978), pese a que los dos primeros autores utilizaron


4

metodologías tales como espectrometría de masa asociada a

un cromatógrafo de gases y radiocompet ición proteica respecti.

vamente.

Dado que el testículo es un órgano complejo con dos


115

compartimientos anatómica y funcionalmente diferentes es

lógico suponer que los andrógenos no estén uniformemente

distribuidos. Por lo tanto, es razonable que la concentración

elevada de testosterona sea fundamentalmente reflejo del

contenido del tejido intersticial, donde es sintetizada.

El metabolito 5 oC -reducido de la testosterona, la

DHT, fué detectada en el tejido testicular en concentraciones

variables en los distintos pacientes. No obstante, su valor

promedio resultó casi 40 veces más bajo que el de testostero­

na. Estos datos concuerdan con los presentados por Leionen

y col. (1980) y son algo más elevados que los informados

por Purvis y col. (1978). Recientemente, en pacientes con

pubertad precoz se han descripto niveles considerablemente

más altos del andrógeno 5 o( -reducido (Rivarola y col., 1983).

Resulta más difícil especular sobre la posible distribu

ción compartamental de la DHT. En la rata, la localización

de la 5 0(-reductasa testicular es preferencialmente detecta­

da en el túbulo o en el intersticio, dependiendo del estadio

puberal del animal (Dorrington y col., 1975).

En el hombre, la 5 -reductasa testicular ha sido

escasamente estudiada, aunque hoy se acepta que su actividad

es relativamente baja. Pese al limidado número de estudios

realizados y a la imposibilidad de obtener muestras que

puedan ser consideradas completamente normales, los resulta­


116

dos en la bibliografía también indican una cierta variación

en la actividad de la enzima cuando se comparan pacientes

con diferentes edades. Asi, mientras no se ha logrado detec­

tar actividad de la misma en el testículo fetal, se observa

un aumento en la gondada juvenil y de adultos, con cierta

tendencia a disminuir durante la senectud (Kelch y col.,

1971; Rivarola y col., 1973; Nayfeh y col., 1975).

En relación a su localización, algunas evidencias indi­

carían que la actividad se focaliza fundamentalmente en el

sector tubular (Rivarola y col., 1973; Payne y col., 1973).

Por otra parte, los niveles de 3 (X -Diol testicular

detectados en nuestras condiciones experimentales, resultaron

sensiblemente menores que los de DHT, aunque ellos no fueron

despreciables. Al respecto debe señalarse que otros autores

utilizando metodologías semejantes no han logrado detectar

dicho andrógeno en el testículo humano (Leionen y col., 1980;

Purvis y col., 1978).

En apoyo de estos resultados, debe señalarse que estu­

diando el metabolismo, algunos grupos de trabajo presentaron

evidencias a favor de una pequeña formación de 3 o^-Diol y

en ambos compartimientos del testículo (Rivarola

y col., 1973; Payne y col., 1973).

Cuando se comparan los resultados obtenidos en el testi^

culo y epididimo de cada paciente, se evidencia claramente


117

que la concentración de testosterona en el tejido epididima-

rio es aproximadamente un 10% de la hallada en la gonada

correspondiente, mientras que las concentraciones de DHT

y 3 C<-Diol detectadas en ambos órganos son muy similares.

Ha sido descripto por varios autores que el epididimo

de rata y ratón puede formar testosterona a partir de distin­

tos precursores (Hamilton y col., 1969; Hamilton, 1975).

En el caso particular del epididimo humano, los bajos

niveles de testosterona que encontramos se hallan en amplio

acuerdo con los descriptos por Leionen y col., (1980), quie­

nes a la vez también detectaron bajos niveles de sus precurso

res inmediatos. Nuestros datos, junto a estas últimas observa

ciones, parecieran indicar que probablemente la mayor parte

del andrógeno no se originaria Min situ" sino que podria

llegar al epididimo por via sanguinea y más probablemente

desde la gonada via rete testis.

La mayor proporción de andrógenos reducidos en el epidi^

dimo, donde la relación T/DHT + 3 O í -Diol disminuye 18 veces

en relación a la gonada, es precisamente una consecuencia

de la importante actividad de la 5 0( -reductasa y en menor

medida de la 3 -hidroxiesteroide-deshidrogenasa detectadas

en dicho tejido (Gloyna y col., 1969; Sulkova y col., 1973;

de Larminat y col., 1981). Cierta contribución al aumento

del"pool"epididimario de andrógenos reducidos es probablemen­

te la retención de dichas hormonas por el receptor de andróge


118

nos presente en el epididimo cuya afinidad por DHT es mayor

que por testosterona.

Los presentes resultados apoyan entonces, previas demos

traciones relacionadas al papel de la DHT como intermediario

importante en la acción de los andrógenos en el epididimo

humano.

Las concentraciones de andrógenos epididimarios corres­

ponden fundamentalmente a segmentos proximales del órgano

(cabeza), sin embargo ,los datos podrían considerarse represen

tativos del epididimo total, ya que al analizar los niveles

de andrógenos en sus distintos segmentos (cabeza, cuerpo

y cola), no se detectaron diferencias entre los mismos.

Estas observaciones y otras previas (Purvis y col.,

1978; Leionen y col., 1980), remarcan una importante diferen­

cia con el testículo de la rata, donde la DHT disminuye gra­

dualmente desde la porción proximal hacia la distal del túbu-

lo en correlación con los niveles de ABP (Purvis y col.,

1978). La presencia de esta proteina en el epididimo humano,

ha sido cuestionada por algunos grupos de trabajo (Purvis

y col., 1978), mientras que otros han presentado algunas


i

evidencias a favor de su existencia (Hsu y col., 197 8)

(Vigersky y col., 1976; Burke y col., 1977; y Lipschultz,

y col., 1977). Las características de dicha proteina parecen

ser muy similares a la GLAE y no se ha descripto aún si exis­

te, como en la rata, un gradiente de la misma a lo largo


119

del epididimo.

El presente estudio muestra además las concentraciones

tisulares de cinc en testículo y epididimo humano. Como ya

se ha mencionado, este metal se localiza preferencialmente

en el tracto reproductivo de los mamíferos y sus niveles

se relacionan estrechamente con la función sexual. En los

vertebrados y especialmente en el hombre, el cinc se halla

presente en la totalidad de los tejidos, oscilando su concen­

tración entre 20 y 30 jig/gm de peso húmedo (Vallee y col.,

1949).

Los datos obtenidos en testículo y epididimo, demues­

tran que las concentraciones de cinc en ambos tejidos son

algo más de 2 veces superiores a dichos valores, semejantes

al contenido hepático, óseo y muscular e inferiores a los

más ricos del organismo como la próstata y los ganglios linfá

ticos (Vallee y col., 1949).

Al comparar las concentraciones de cinc en estos teji­

dos del tracto reproductivo humano y de la rata, se evidencia

que mientras en los primeros el contenido de cinc en testícu­

lo y epididimo es muy semejante, en la rata los niveles epidi


«
marios del metal duplican prácticamente el valor testicular,

pudiendo atribuirse la diferencia a una característica propia

de cada especie (Parizek y col., 1956).

Como se mencionó anteriormente, el sector tubular y


120

los espermatozoides podrían constituir un importante aporte

de cinc a dichos órganos, modificándose eventualmente durante

la senectud cuando es frecuente encontrar alteraciones de

la espermatogénesis.

El análisis conjunto de las concentraciones de andróge-

nos y cinc en cada tejido estudiado mostró una alta correla­

ción positiva entre la testosterona, DHT y los niveles de

cinc testicular. Aunque las evidencias fueron menos concluyen

tes, el caso inverso se presentó en el epididimo, donde se

observó una correlación negativa entre la testosterona y

el cinc.

Posibles explicaciones para la aparente dependencia

entre el "pool" tisular de andrógenos y el contenido de cinc,

podrían ser, por un lado la influencia del metal sobre la

actividad de ciertas enzimas involucradas precisamente en

el metabolismo de los esteroides. Por otra parte, el cinc

es capaz de estimular "in vitro" la unión de los andrógenos

a sus receptores específicos (Douglas y col., 1984). Sin

embargo, deberán realizarse estudios adicionales para lograr

comprender el verdadero papel del cinc en la función sexual


4

masculina.

Otro de los aspectos analizados en este trabajo fue

la respuesta al tratamiento con estrógenos por periodos supe­

riores a 2 meses, en términos de concentraciones tisulares


121

de andrógenos. De acuerdo a los resultados obtenidos se obser

vó una clara inhibición en los niveles de testosterona y

DHT tanto en testículo como en cada uno de los segmentos

del epididimo. Existen por lo menos 3 mecanismos propuestos

para explicar dicho efectos 1) una acción sobre la sintesis

y secreción de gonadotrofinas hipofisarias (Sawing, 1978);

2) un efecto directo sobre enzimas involucradas en la biosin-

tesis de esteroides en el testículo y 3) una disminución

en la capacidad de unión de LH a sus sitios receptores espec_i

ficos en la gonada (Huhtaniemi, 1980).

Hammond y col., (1978) demostraron que la administra­

ción de estradiol durante 5 dias, no modifica las concen­

traciones testiculares de esteroides y si los niveles de

los mismos en la vena espermática. Los presente resultados,

en acuerdo con los de Purvis y col. (1978), indican que el

tratamiento con estrógenos durante periodos de tiempo prolon­

gados disminuye la concentración intratesticular de andrógenos.

Como consecuencia de un menor aporte, también se observó

una menor concentración de andrógenos en el tejido epididima-

r io.

Pese a la importante diferencia observada en los andró-

genos tisulares entre los pacientes tratados con estrógenos

respecto a los no tratados, sólo pudimos detectar una pequeña

disminución en los niveles promedio de cinc en ambos órganos.

Sin embargo, debido al bajo número de pacientes estudiados


122

y a las diferencias individuales entre ellos, el efecto aun­

que estadísticamente no significativo, no se opone a la corre­

lación encontrada entre los andrógenos y el cinc.

Otro aspecto interesante del presente estudio fueron

las observaciones realizadas en pacientes con carcinoma de

próstata en los que se indujo hipoprolactinemia por adminis­

tración de bromocriptina. En dichos sujetos se evaluó

la función hipófiso-gonadal en respuesta al descenso en la

PRL circulante, mediante el dosaje de los niveles de hormonas

periféricas y tisulares y el estudio de la morfología de

la gonada.

Los niveles séricos promedio de PRL previos al trata­

miento en este grupo de pacientes no fueron superiores al

valor normal para la edad, sin entoargo se pudo constatar que

alrededor de un 25% de los mismos estaban levemente elevados.

Estos resultados están de acuerdo con los demostrados previa­

mente por Harper y col. (1976) y Bartsh y col. (1977).

Se observó una disminción importante póst-tratamiento

e n ‘ los niveles de PRL sérica en todos los casos estudiados

Este descenso se debe al efecto dopaminérgico de la bromocrip-

tina, habiéndose demostrado previamente su efectividad tanto

en pacientes normales como portadores de carcinoma de prós­

tata (Jacobi y col., 1978; Martikainen y col., 1982).


123

Los niveles básales de LH no mostraron diferencias

con los considerados normales para esa edad y no se modifica­

ron durante la hipoprolactinemia, tal como describieron Jaco-

bi y col. (1978). Demostramos también que una disminución

en la PRL sérica durante un breve periodo de tiempo,ocasiona

un descenso concomitante en la testosterona sérica total,

sin cambios aparentes en los niveles y 3 0< -


Diol.

En la interpretación de estos resultados deben tenerse

en cuenta algunas consideraciones. En primer lugar, la deter­

minación de la testosterona periférica es en este caso la

suma de testosterona + DHT circulantes, ya que las determina­

ciones en el suero se realizaron sin previa separación croma-

tográfica.

En el hombre, el principal andrógeno en la circulación;

la testosterona,se sintetiza fundamen taimen te en el testículo,

mientras que se origina no sólo en la gonada

sino que en parte es también secretada por la corteza supra­

rrenal (Gurpide y col., 1965). La DHT plasmática en el hombre

proviene esencialmente de la conversión periférica de la

testosterona (Saez, 1972); una pequeña fracción es secretada

directamente por el testículo y alrededor de un 15% de la

producida en sangre proviene de l a ^ ^-Adiona (Tremblay col.,

1972). Este último andrógeno puede ser convertido a testoste-


124

roña reversiblemente por la enzima 17 0< -hidroxiesteroide-

deshidrogenasa. Además, se ha demostrado también una conver­

sión reversible de DHT a 3 y 3 (^-Diol en el plasma perifé­

rico (Mahaudeau y col., 1971).

Existe cierta controversia en la literatura en relación

al efecto del agonista dopaminérgico empleado en este estudio

sobre los niveles circulantes de testosterona. Asi, Jacobi

y col. (1978) observaron un descenso, mientras otros autores

como Nakagawa y col. (1982), describieron niveles más eleva­

dos de testosterona en individuos normales luego de la admi­

nistración de bromocriptina (2.5 mg/dia) durante 3 dias.

Sin embargo, Martikainen y col. (1982) no detectaron cambios

en los distintos esteroides luego de un periodo breve de

tratamiento antes y después de la administración de una única

dosis de 5.000 mUI de hCG. Estos resultados contradictorios

podrían ser en parte debidos a una diferencia en la respuesta

testicular a la LH/hCG, según se trate de una hipoprolactine-

mia de evolución breve o prolongada (Martikainen y col.,

1982; Martikainen y col., 1983). Ha sido descripto por dife­

rentes
4
grupos, que la bromocriptina reduce el número de

sitios receptores para LH en las células de Leydig.Huhtaniemi

y col. (1981) observaron que en la rata adulta dicho trata­

miento afecta sólo la unión de LH al receptor y no la respuets

ta esteroidogénica. Los resultados obtenidos en el presente


125

trabajo en cuanto a la disminución de los niveles de testoste

roña sérica# podrian ser compatibles con una disminución

en el número de sitios receptores para LH/hCG, aunque induda­

blemente muchos otros factores deben ser considerados.

La observación más remarcable en este estudio fué la

modificación en la concentración de andrógenos tisulares,

principalmente a nivel testicular. Las concentraciones de

testosterona y DHT, asi como el total de los andrógenos eva­

luados, aumentaron significativamente en el testículo luego

de la hipoprolactinemia inducida por bromocriptLna. Estos datos

podrian sugerir un aumento en la biosintesis local, aunque

alternativamente también podrian ser explicados como resulta­

do de una disminución en la liberación de andrógenos a la

circulación. Cualquiera de las dos posibilidades son concilia

bles con las variaciones observadas en el epididimo donde

los cambios fueron muy semejantes a los hallados en el testí­

culo. En el epididimo el incremento más pronunciado se observó

en la testosterona, resultado que concuerda con el hecho

de que si bien este andrógeno puede originarse Min situ"

el aporte más importante proviene de la gonada.

El aumento en la concentración de andrógenos intratisu-

lares podría ser como se mencionó anteriormente reflejo de

una mayor actividad esteroidogénica. Ya que la concentración

de LH sérica se mantuvo dentro de valores normales, si exis­

tiera tal incremento en la actividad biosintética de testos-


126

terona, este, podría ser mediado por una disminución de los

niveles de PRL séricos, un efecto directo de la bromocriptina

en la gonada o una combinación de ambos efectos.

Con relación a la aparente discrepancia entre las con­

centraciones de andrógenos séricos y testiculares, cabe men­

cionarse que estos resultados serian compatibles por un lado

con la disminución de la secreción de andrógenos testiculares

y por el otro con un aumento en la metabolización periférica

como describieron Jacobi y col. (1978). Estos autores compro­

baron una disminución en la vida media biológica de la testóos

terona en pacientes normoprolactinémicos tratados con bromo­

cript ina. A este respecto, es oportuno mencionar que la admi­

nistración de bromocriptina es capaz de modificar las concen­

traciones de GLAE en el suero (Vermeulen y col., 1982). Dado

que los niveles de GLAE influencian la tasa de depuración

metabólica y por consiguiente la producción de testosterona,

cambios en los niveles plasmáticos de esta hormona no refle­

jan modificaciones similares en la producción de la misma

a menos que los niveles de GLAE permanezcan constantes

(Vermeulen y col., 1969; Clark y col., 1971).

Por otra parte al evaluar el contenido de cinc en el

tejido testicular y epididimario antes y durante la hipopro-

lactinemia no se detectaron modificaciones pese al aumento

observado en los niveles tisulares de andrógenos luego de


127

la administración d© bromocriptina.

Al analizar el aspecto histológico individual de las

gonadas, en condiciones básales, resultó claro que en rela­

ción a las características del sector tubular, se trataba

de una población heterogénea, observándose desde espermatogé­

nesis normales a diferentes grados de alteraciones de la

misma. Estas modificaciones no se correlacionaron con los

niveles intratesticulares de andrógenos.

Al comparar en estos mismos pacientes el aspecto del

intersticio testicular con las correspondientes concentracio­

nes de testosterona se comprobó una correlación directa.

La concentración intratesticular de testosterona depende

no sólo de la actividad de las células de Leydig, sino tam­

bién del número y volumen relativo de las mismas . En este

estudio el valor de testosterona más elevado se halló en

un paciente con pseudohiperplasia de las células de Leydig.

Tejido intersticial de aspecto normal se asoció generalmente

a concentraciones medias de testosterona y las escasas

muestras con niveles descendidos de andrógenos, mostraron

zonas del intersticio notablemente alteradas.

El estudio histológico no reveló cambios detectables

por microscopía óptica en el aspecto de los túbulos seminífe­

ros o el intersticio antes y durante la hipoprolactinemia.

En conclusión, estos resultados señalan de manera origi.


128

nal que la administración de bromocriptina a pacientes normo-

prolactinémicos induce un considerable aumento en los andró-

genos de la gonada masculina sin modificar los niveles de

LH sérica.

Finalmente, debe mencionarse que en pacientes hiperpro-

lactinémicos con alteraciones en la motilidad de los esperma­

tozoides, se han observado mejorías ostensibles al ser trata­

dos por cortos periodos de tiempo con bromocriptina (Lanfer

y col., 1981). A pesar de que de manera casi unánime se aso­

cia a la hiperprolactinemia con un descenso en los niveles

de LH circulantes (Fossati y col., 1976), los aumentos obser­

vados en las concentraciones de testosterona y DHT testi-

culares y epididimarios en los casos estudiados en este traba

jo, podrían en parte, explicar el rápido restablecimiento

de la función gonadal en pacientes con PRL elevada.


SEGUNDA PARTE
MATERIALES Y METODOS II
129

M A T E R I ALES.

REACTIVOS UTILIZADOS.

Los reactivos utilizados para la extracción y purifica­

ción de testosterona y 3 -Diol en testículo y epididimo de

rata, fueron idénticos a los descriptos previamente (Materia­

les y Métodos, la. Parte). Asimismo, las drogas y reactivos

empleados en los RIE correspondientes para el dosaje de estas

hormonas en tejido, suero o medios de incubación también coin­

ciden con los detallados en la sección mencionada.

Los reactivos utilizados para la determinación de PRL

y LH sérica en rata fueron provistos por NIAMDD (N.I.H.,EE.UU)

La bromocriptina empleada para la inducción de hipopro-

lactinemia en la rata y en las incubaciones "in vitro", fue

provista gentilmente por Sandoz (Basilea, Suiza). La PRL ovi­

na (PRLo) y de rata (PRLr) utilizadas en las incubaciones

"in vitro"^ fueron provistas por NIAMDD (EE.UU). Otros reac-


3
tivos utilizados fueron: 2,8 H adenosina-315 1-fosfatociclico,

sal de amonio, 42.5 Ci/mmol de New England Nuclear Corp. EE.UU

Í-metil-3 isobutilxantina (MIX), obtenido de Aldrich Chemical

Company, Milwakee, WIS .(EE.UU); Medio 199 de Difeo Laborato­

ries (Detroit, Mich. (EE.UU); colagenasa tipo I de Worthing-

ton; Permablend de New England Nuclear Corp.; gonadotrofina

coriónica humana (hCG, APL: actividad biológica 3000 Ul/mg


130

de Ayerst Laboratories (Montreal, Canadá), teofilina, Adenosi-

na 3*,5* monofosfato cíclico (AMPc) y restantes drogas y reac­

tivos fueron de grado analítico y provistos por Sigma Chemical

Comp. (E E .U U ),

ANIMALES Y TRATAMIENTOS.

— ANIMALES• ^ j. • i • a_ on * f\ ^
--------- Se utilizaron ratas entre 30 y 40 dias de edad

pertenecientes a (Rathus norvegicus albinus) variedad Wistar

provenientes del criadero del Instituto de Biología y Medicina

Experimental. Las ratas fueron mantenidas con periodos de

luz de 14 horas (de 6 a 20 hs), con temperatura controlada

de 23°C ± 1.5 y provisión de agua y alimento balanceado (puri-

ad libitum.

- INDUCCION DE HIPOPROLACTINEMIA. La bromocriptina se preparó

disolviendo cantidades iguales de bromocript ina y ácido tartá­

rico en etanol absoluto-solución fisiológica (30:70 vol/vol)

a las dosis de 0.75; 1.5 y 3.0 mg/kg de peso corporal/dia

en dos dosis diarias (8.00 y 18.00 h s ) y por vía subcutánea.

Los animales controles recibieron la misma cantidad de ácido

tartárico disuelto en etanol absoluto-solución fisiológica.

El tratamiento se extendió por espacio de diez días y los

animales fueron sacrificados por decapitación aproximadamente

quince horas después de la última inyección.


131

En diferentes grupos de animales sometidos al tratamien­

to anteriormente descripto se analizaron los siguientes pará­

metros :

1) En el momento de sacrificar por decapitación se recogió

la sangre del cuello y se la dejó coagular a temperatura ambi­

ente. Luego de la retracción del coágulo las muestras se cen­

trifugaron y los sueros se almacenaron a -20QC hasta el momento

de ser utilizados para la determinación de PRL, LH y esteroi-

des por RIE;2)Los testículos se disecaron rápidamente, se

colocaron en acetona fria y congelaron a -20QC hasta la de­

terminación de las concentraciones intratesticulares de andró-

genos; 3) Los testículos provenientes de otros grupos de

animales con idéntico tratamiento fueron decapsulados e incu­

bados ^n vitro" para evaluar la producción de andrógenos y

AMPc en el medio de incubación; 4) En animales tratados tam­

bién con vehículo o con distintas dosis de bromocriptina,

se disecaron los testículos y luego se realizó colagenización

para la obtención de una suspensión de células de Leydig

que se incubaron "in vitro" para evaluar la producción de

andrógenos.

- INYECCION INTRATESTICULAR DE BROMOCRIPTINA.

A un grupo de animales intactos se les inyectó por via


_i
intratesticular 10 jil de solución de bromocriptina (8 x 10
132

Molar) en el mismo vehículo descripto en el punto anterior.

Como existia la posibilidad de que la bromocriptina pudiera

ejercer sus efectos a través, de modificaciones en la libera­

ción de PRL hipofisaria se procedió en la siguiente manera:

las ratas fueron anestesiadas levemente con éter y la bromo­

criptina inyectada en el testículo derecho de cada animal

mientras que el contralateral se inyectó con vehículo. Al

cabo de 18 hs se sacrificaron los animales por decapitación

y se evaluaron los niveles de andrógenos producidos "in vitro"

por ambas gonadas. De esta forma, cada animal representa su

propio control, habiéndose demostrado que con este diseño

se evalúa únicamente el efecto local de la droga (Sharpe,

1984) .

M E T O D O S .

DOSAJE DE HORMONAS EN SUERO.*


4

- DETERMINACION DE PRL Y LH SERICAS.

Para la determinación de PRL y LH séricas se utilizó


4

un RIE por doble anticuerpo. El primer antisuero contra PRL

de rata fue obtenido en conejos (NIAMDD anti-rat prolactina

suero 4-7). El mismo se diluyó en buffer (fosfato 0.01 M,

CINa 0.15 M, merthiolate 0.01%, pH 7,4) con 0.05 M de EDTA


133

y 2% de suero normal de conejo.

El estándar de referencia fué PRL de rata (NIAMDD rat

P 2 ) con 30 Ul/mg de actividad biológica y el segundo anticuer­

po fue obtenido en ovejas contra globulina de conejo.

Para la determinación de LH se utilizó un método hete-

rólogo. Como primer antisuero se utilizó el obtenido por Nis-

wender y col. (1968), inmunizando conejos con LH ovina emul­

sionada con adyuvante de Freund completo. Este antisuero reac­

ciona con la LH ovina y de numerosas especies incluyendo la

rata. La hormona trazadora fue en este caso LH purificada

obtenida de hipófisis ovina. Como preparación de referencia

se utilizó la LH purificada proveniente de hipófisis de rata

(Rat LH RPl).

Las muestras se evaluaron por duplicado en alícuotas

de 50 y 100 j i l respectivamente utilizándose los mismos proto­

colos para las dos hormonas. Luego se agregó el primer anti­

cuerpo a los sueros e incubaron 24 hs a 4QC, se colocó la

hormona marcada y el tercer dia el segundo anticuerpo. Luego

de
i
4 8 a 72 hs a 4QC, se separó la hormona unida de la libre

mediante centrifugación. Se aspiró el sobrenadante de cada

muestra y en los precipitados correspondientes a los comple­

jos hormona-anticuerpo se contó la radioactividad en un conta­

dor Gamma Automático Beckman modelo 4000.


134

Los resultados se expresaron en ng/ml.

- DETERMINACION DE TESTOSTERONA Y 3 o(-DIOL SERICOS.

Para determinar la cantidad de andrógenos presentes

en el suero, se descongelaron los sueros y se realizaron 2

extracciones con éter etílico. Se evaporó luego la fase orgá­

nica y las muestras se resuspendieron en buffer de RIE.

La testosterona se evaluó sin separación previa y como

el antisuero utilizado cruza con DHT el valor corresponde

a testosterona + DHT.

Los ensayos empleados para los dosajes de testosterona

y 3 0( -Diol fueron idénticos a los descriptos en la sección

Materiales y Métodos la. Parte.

DOSAJE DE ANDROGENOS EN TEJIDO TESTICULAR Y EPIDIDIMARIO.

En 4 grupos de ratas (12 animales por grupo) tratados

con vehículo o con 3 dosis diferentes de bromocriptina se

determinaron los niveles de andrógenos en testículo y epididi-

mo. Para cada grupo se procedió en la siguiente formas 1 tes­

tículo o 2 epididimos de 4 animales diferentes se homogeneiza-

ron conjuntamente en 10 mi de acetona, agregando al mismo

tiempo 10.000 dpm de cada asteroide tritiado para evaluar

las pérdidas durante el procesamiento. Luego de 10 min. los

tubos se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min. y en una

fracción del sobrenadante equivalente a 200 mg de tejido se


135

realizó la extracción con éter y las diferentes particiones

con solventes tal cual se describió en detalle para los teji­

dos humanos.

En otro caso se reiteraron los mismos tratamientos y

se evaluaron los niveles de andrógenos testiculares procesando

separadamente las gonadas de cada animal. En este caso se

pesaron aproximadamente 200 mg de cada testículo y se homoge-

neizaron en 5 mi de acetona continuando luego con los mismos

pasos descriptos anteriormente. Cada andrógeno fue separado

mediante cromatografía en microcolumnas de celita y posterior­

mente evaluado por RIE específicos.

PRODUCCION DE ANDROGENOS Y AMPc "IN VITRO". EFECTO DE LA HIPO-

PROLACTINEMIA.

- TESTICULOS ENTEROS DECAPSULADOS.

Se estudió la producción de andrógenos y AMP cíclico

en incubaciones de testículos enteros provenientes de animales

controles e hipoprolactinémicos. Los animales se mataron por

decapitación, los testículos se decapsularon e inmediatamente

se colocaron en viales de plástico de 20 mi, donde se realiza-

ron las incubaciones. Cada vial contenía 3 mi de Medio 199

y l-metil-3 isobutil x a n t i n a ( M I X *, 0,1 mM) . En estas experien­

cias siempre se utilizó un testículo como control y se lo

incubó en ausencia de hCG, mientras que el testículo contra­


136

lateral fué incubado en presencia de diferentes concentracio­

nes de hCG para evaluar la sensibilidad y capacidad de res­

puesta a la hCG. Según el caso se agregó a cada vial 0.004,

0.01, 0.04, 0.1, 0.4, 1, 4, 10, 40 y 100 mUI de hCG en 50

p l de medio y los controles fueron equilibrados con 50 p 1

de medio 199.

Las incubaciones se realizaron en un incubador Dubnoff

con agitación constante de 100 ciclos/min. bajo atmósfera

de carbógeno (95% de O 2 y 5% de C C ^ ). Al cabo de este perio­

do de tiempo se detuvo la incubación introduciendo los viales

en un baño de hielo, se separó el medio, se centrifugó a

2000 rpm durante 10 min. y el sobrenadante se congeló a

-20QC hasta el momento de la determinación de andrógenos.

Alícuotas de 500 pl de cada muestra fueron previamente

separadas, colocadas en tubos de vidrio y calentadas a ebulli­

ción durante 10 minutos. Luego de enfriar, se centrifugaron

las muestras a 3000 rpm durante 10 minutos y en alícuotas

de 10 jul se evaluó el AMPc.

- CELULAS DE LEYDIG DISPERSAS.

Para el aislamiento de células de Leyding se utilizó

la técnica descripta por Catt y col. (1974), utilizando cola-

genasa para la dispersión del tejido testicular.

Los testículos fueron decapsulados y luego suspendidos


137

en tubos de plástico conteniendo Medio 199 con 0.1% de albúmi­

na sérica bovina (BSA). Las incubaciones se realizaron en

la relación de 1 gr de testículo por mi de medio y se colageni-

zaron, según el caso, hasta un máximo de 10 testículos por

vial,conteniendo 0.3 mg de colagenasa/ml de Medio.

Las incubaciones se realizaron a 34QC, durante 10-15

min. en un incubador Dubnoff con agitación constante, bajo

atmósfera de carbógeno. Finalizada la incubación, la reacción

se detuvo por dilución con Medio 199 frió (8 mi por cada mi

de incubación).

Con el objeto de dispersar mejor el tejido, se agitó

en forma rotatoria el tubo incubado, durante 3 min., dejándolo

reposar otros 3 min. Cuando los túbulos decantaron el sobrena­

dante fué aspirado con una jeringa de plástico y filtrado

a través de una malla Nitex recogiéndose el liquido filtrado

en otro tubo de plástico. La resuspensión se realizó una vez

más y el liquido filtrado se colectó junto con el filtrado

anterior. Este filtrado, conteniendo las células intersticia­

les, se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min. y el precipitado

asi obtenido, se resuspendió en Medio 199-0.1% BSA.

La determinación del número de células se realizó sobre

100 jjlI de suspensión, determinándose la viabilidad de las

mismas por el método de exclusión del Azul Tripan, que colorea

específicamente las células muertas. La tinción se realizó


138

utilizando una solución de colorante 0.4% en buffer fosfato

y las células se contaron en una cámara de conteo, comprobán­

dose en todas las preparaciones una viabilidad mayor que el

95%.

Para determinar la proporción de células de Leydig se

investigó en la suspensión celular obtenida la actividad de

la enzima 3 ^ -hidroxiesteroide-deshidrogenasa (3 -HSD) según

la técnica descripta por Levy y col.(1959). Para ello se incu­

bó una suspensión celular en presencia de ^3 NAD, nitro azul

de tetrazolium y ^ -androsten-3 ol-17-one o etiocolanolo-

na en propilenglicol como sustrato de la reacción. Como se

ha descripto la positividad de esta enzima se halla predomi­

nantemente en las células de Leydig.

Para evaluar la producción de andrógenos se incubaron

alícuotas de lml de la suspensión de células de Leydig (1 x

10^ células/ml) en viales de plástico (20 mi), en presencia

de l-metil-3-isobutil-xantina (MIX, 0.125 mM) . Las incubacio­

nes de células se realizaron siempre por triplicado en ausen­

cia (basal) o en presencia de diferentes concentraciones de


4

hCG (0.1, 0.2, 0.4, 1.0 or 10 m U I ). Las incubaciones se reali­

zaron durante tres horas a 34QC bajo carbógeno y con agitación

constante de 100 ciclos/min. Al cabo de dicho periodo, la

incubación se detuvo transfiriendo los viales a un baño con


139

hielo y las células más el medio de incubación, se transfirie­

ron a tubos de plástico y se centrifugaron a 800 x g durante

10 min. El sobrenadante fue congelado a -20QC hasta la medi­

ción de andrógenos por RIE.

MEDICION DE ANDROGENOS EN LOS MEDIOS DE INCUBACION.

Para las determinaciones de andrógenos en los medios

de incubación de testículos enteros, estos se diluyeron 1:

10 en buffer fosfato y la testosterona y el 3o{-Diol se evalúa

ron en alícuotas de 100 y 50 jal respectivamente sin separación

previa mediante RIE.

En los medios de incubación de las células de Leydig

la determinación de testosterona y 3 0(-Diol se realizó direc­

tamente en 50 y 100 jal respectivamente.

DETERMINACION DE AMPclclico.

El AMPc fue determinado en el medio de incubación de

los testículos enteros utilizando la técnica original de Brown

y col. (1971)

- AISLAMIENTO DE QUINASA DE PROTEINAS DE LA ADRENAL BOVINA.

La guinasa de proteínas fue aislada de glándulas adrena­

les bovinas. Luego de la separación de la médula, las cortezas

adrenales fueron homogeneizadas en un homogeneizador tipo


140

Polytron a OQC, con 1.5 volúmenes de buffer Tris-CIH 50 mM,

pH 7.4 que contenia sacarosa 0.25 M; KC1 25 mM y MgCl2 5mM.

Este homogenato se centrifugó a 2000 x g durante 5 min y el

sobrenadante a 5000 x g durante 15 min. El sobrenadante de

esta última centrifugación se fraccionó en alícuotas de 0.5

mi, que se almacenaron a -2OQC. Esta preparación fue desconge­

lada y diluida en el buffer de ensayo (Tris-CIH 50 mM, pH

7.4), que contenia teof ilina 8 mM y 2-mercaptoetanol 6 mM

en el momento de cada determinación. Este buffer se utilizó

en todos los pasos posteriores.

- ENSAYO.
Cada tubo contenia 50 Mi de la dilución apropiada de

la enzima (ls8), 100 pl de una cantidad conocida de AMPc (en­

tre 0.039 y 20 pmoles) o Medio de incubación y 50 pl de AMPc-


3
H (aproximadamente 5000 dpm). La cantidad de enzima era tal

que unia aproximadamente el 40% del AMPc marcado.

La incubación se realizó a 4QC durante 90 min. y el

AMPc libre se separó por el agregado de 200 jal de una suspen­

sión de carbón-BSA (500 mg de carbón: 100 mg de BSA, para

10 mi de buffer de ensayo). La radiactividad se determinó

en un Contador de Centelleo Liquido, utilizando tolueno cente­

llante con 30% de Tritón X-100 (v/v).


141

PRODUCCION DE ANDROGENOS "IN VITRO".

- EFECTO DIRECTO DE LA BROMOCRIPTINA.

Testículos provenientes de ratas de 40 dias de edad

muertas por decapitación, fueron decapsulados e incubados

en viales de plástico con 3 mi de Medio 199, 0.1 mM de Mix

y 5 concentraciones diferentes de bromocriptina. En cada expe­

rimento se realizaron 4 incubaciones (1 testiculo/incubación)


_q
para cada concentración de bromocriptina (1,3 x 10 a
-5
1,3 x 10 Molar) y los testículos contralaterales correspon­

dientes se incubaron en ausencia de droga. Las incubaciones

se llevaron a cabo durante 3 horas a 34QC bajo carbógeno y

con agitación constante de 100 ciclos por minuto. Otros dos

grupos de testículos fueron incubados en idénticas condiciones

(con y sin bromocriptina) pero en presencia de 0.5 y 50 mUI

de hCG.

Células de Leydig aisladas de testículos de ratas de

40 días de edad se incubaron "in vitro" en presencia de dife­

rentes concentraciones de bromocriptina. Suspensiones con

1 x 106 células en 1 mi de Medio, se incubaron por triplica­

do con 0.1 mM de Mix y en ausencia o en presencia de dife-


_7
rentes concentraciones del neurofármaco ( 6 , 5 x 1 0 al,3x

10~5 Molar). En otras incubaciones, las células en presencia


142

__5
de bromocriptina (1.3 x 10 M) fueron estimuladas con 0.25

y 100 mUI de hCG.

En los medios de incubación provenientes de testículos

enteros y suspensión de células aisladas se dosaron los nive­

les de 3 CX -Diol y testosterona, por las técnicas previamente

descriptas.

- EFECTO DIRECTO DE LA PRL.*


5

Testículos provenientes de ratas de 40 dias de edad

fueron decapsulados e incubados en 3 mi de Medio 199, 0.1

mM de Mix y 3 concentraciones diferentes de PRL ovina (PRLos


—8 —7 —6
5 x 10 , 5 x 10 , y 5 x 10 Molar). En cada experimento

se realizaron 6 incubaciones (1 testiculo/incubación) para

cada concentración de PRL y los testículos contralaterales

correspondientes se incubaron en ausencia de la hormona.

Las incubaciones se llevaron a cabo durante 3 horas

a 34QC bajo carbógeno y con agitación constante. Otros dos

grupos de testículos fueron incubados en idénticas condiciones

(con y sin PRL) pero en presencia de 0.5 y 100 mUI de hCG.

Se estudió la respuesta de células de Leydig a la PRL

incubando por triplicado suspensiones de 1 x 10^ células en

1 mi de Medio en ausencia y en presencia de 5 concentraciones

(2.5 x 10 “8 , 5 x 10-8 y 5x 10_7,2.5 x 10-7y 5 x 10 6 Molar)

de dicha hormona.
143

En otros casos las células fueron incubadas con cada

una de las tres concentraciones menores de PRL mencionadas


y estimuladas con 0.25 y 100 mUI de hCG.

Finalmente, suspensiones de células de Leydig fueron

incubadas con 5 x 1 0 -7 Molar de PRL de rata (PRLr), en ausen-

cia o presencia de 0.25 y 100 mUI de hCG.

En los medios de incubación provenientes de testículos

enteros y suspensión de células de Leydig se determinaron

los niveles de 3 O^-Diol y testosterona por RIE.

ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS.

El análisis estadístico de los resultados fue realizado

según los casos, mediante la aplicación de los tests de Stu-

dent apareado y no apareado. En los casos en que se realizaron

comparaciones múltiples se aplicaron los tests de Dunnett

y Tukey (Tukey 1949; Snedecor y col., 1967)


RESULTADOS II
144

EFECTO DE LA HIPOPROLACTINEMIA INDUCIDA SOBRE LA FUNCION

TESTICULAR DE LA RATA.

Como ya se ha mencionado la PRL participa en el control

de la función reproductiva masculina no solo en el hombre,

sino que también interviene activamente en diferentes especies

de roedores tales como la rata, ratón y hámster (Bartke, 1971;

Bartke, 1973 y Bex y col., 1977). Se ha descripto que la PRL

ejerce sus efectos a distintos niveles del eje hipotálamo-

hipófiso-gonadal, regulando la secreción de gonadotrofinas,

modificando la respuesta del testículo a las gonadotrofinas

y/o modulando la acción de los andrógenos en los órganos efec-

tores.

Niveles circulantes de PRL en exceso o defecto pueden

ocasionar alteraciones gonadales en diferentes especies.

Los efectos de esta hormona en una especie determinada

parecen depender además del estadio en que se encuentre el

animal considerado, asi en la rata algunas evidencias indica­

rían su importancia durante el desarrollo sexual en el macho.

Con el propósito de esclarecer el rol de la PRL en el

proceso madurativo de la rata en desarrollo, se investigó

el efecto de la hiperprolactinemia inducida en el animal intac­

to. Se utilizó como modelo ratas prepúberes de 30 dias de

edad, a las que se les administró un agonista dopaminérgico,

la bromocriptina, durante 10 dias consecutivos, al cabo de


145

los cuales los animales fueron sacrificados realizándose los

estudios detallados en la sección Materiales y Métodos y cuyos

resultados se exponen a continuación.

PESO CORPORAL, TESTICULAR Y EPIDIDIMARIO.

A cuatro grupos diferentes de ratas se les administró

durante 10 dias (s.c.) bromocriptina a las dosis de 0.75,

1,5 y 3,0 mg/kg peso/dia y evaluó al final del tratamiento

el peso corporal, testicular y epididimario.

La Figura 28 muestra los resultados obtenidos en los

parámetros determinados y como puede observarse no hubo

diferencias en el peso corporal entre los 4 grupos de animales

Por el contrario, los pesos testiculares y epididimarios

disminuyeron significativamente en los 3 grupos tratados con

bromocriptina respecto del control (p < 0.05, test de Dunnet).

El mantenimiento del mismo peso corporal pareciera indicar

que no se trata de un retardo en el crecimiento general sino

de un efecto especifico sobre el testículo y epididimo.

NIVELES DE LH Y PRL EN SUERO.

Los efectos del tratamiento con bromocriptina sobre

los niveles séricos de PRL y LH se muestran en la Tabla 5.

Puede observarse, que luego de 10 dias de administración de

dicho fármaco a 3 dosis diferentes (0,75, 1,5 y 3,0 mg/kg

peso/dia) la concentración media de PRL ha descendido a valores


146

Figura 28

Efecto de diferentes dosis de Br en ratas tratadas entre los 30


y 40 dias de edad sobre el peso corporal, epididimario y testi-
cular. Cada valor representa la media + error estándar n= 6.
* Datos significativamente diferentes del control ,test de Dunnett.
T a b l a ____ 5^

Tratamiento n PRL LH
ng/ml ng/ml

Control 12 9,4 - 1,9 11,8 - 1,8

Br

0,75 mg 12 no detectable 10,8 - 2,1

1,50 mg 12 no detectable 11,5 - 2,8


147

3,00 mg 12 no detectable 10,6 - 1,9

Efecto del tratamiento con distintas dosis de Br en ratas entre los 30 y 40 dia¡

de edad, sobre los niveles circulantes de PRL y LH.

n = número de animales.

Los datos representan el valor medio - error estándar.


148

indetectables.

Por otra parte, los niveles de LH permanecieron cons­

tantes en todos los casos a lo largo del tratamiento.

NIVELES DE TESTOSTERONA Y 3 Q( -DIOL EN SUERO.

En la Figura 29 se muestran los resultados encontrados

para los niveles circulantes de testosterona y 3 o( -Diol

en el grupo de animales tratados con vehículo o las diferen­

tes dosis de bromocriptina. Cada barra representa el valor

medio de 12 determinaciones y los niveles en el grupo con­

trol fueron (X - ES): testosterona, 450 - 70 pg/ml; 3 o(-

Diol, 1670 - 200 pg/ml. Como consecuencia del tratamiento,

ambos andrógenos séricos resultaron significativamente dismi

nuidos correspondiendo a las distintas dosis de bromocripti^

na (Br 0,75 mg kg peso/dia; : 1/5 mg/kg peso/dia;

Br^ s 3 mg/kg peso/dia) los siguientes valores (X - ES):

3 <X -Diol, Br. ¡ 920 - 90; Br2 : 830 - 100; Br3 : 7 30 - 80

pg/ml; testosterona: Br 190 - 30; 200 - 30 y 190 - 20

pg/ml. El análisis estadístico de los datos mediante el

test de Tuckey no evidenció diferencias significativas en

los niveles de andrógenos correspondientes a las 3 dosis

utilizadas.

CONCENTRACIONES INTRATESTICULARES DE TESTOSTERONA, DHT Y

3 CX-DIOL.

Con el propósito de investigar si las modificaciones


149

Figura 2 9 .

Efecto del tratamiento con distintas dosis de Br en ratas


entre los 30 y 40 dias de edad, sobre los niveles de T y 3
o(-Diol séricos. * Datos significativamente diferentes del
grupo control (c) (p < 0.05, test de Dunnett).
150

en los andrógenos circulantes reflejaban también cambios

en las concentraciones testiculares de las mismas hormonas f

se determinaron dichos adnrógenos en 3 pooles de testículo

correspondientes a cada uno de los 4 grupos estudiados.Cada

'toolM estuvo integrado por 4 testículos diferentes y los

resultados obtenidos utilizando RIE específicos para el

dosaje de testosterona y DHT fueron los que se detallan

en la Tabla 6. Como puede observarse, el tratamiento con

el agonista dopaminórgico, evidenció una tendencia a disminu

ir el contenido de andrógenos durante la hipoprolactinemia

pero los cambios no resultaron estadísticamente significati­

vos. Con relación a las concentraciones de andrógenos en

el epididimo, se emplearon pooles" compuestos de 8 órganos

correspondientes a 4 animales diferentes, y los resultados

obtenidos no mostraron diferencias significativas en los

tres grupos con respecto al grupo control (Tabla 7).

Los datos anteriormente referidos y otros datos no

mostrados señalaron sólo una tendencia a disminuir las con­

centraciones testiculares de testosterona, DHT y 3 o(-Diol

durante la inducción de una severa hipoprolactinemia.

Debido a que en algunos casos se observaron importantes

variaciones individuales en los pesos testiculares,se deci­

dió realizar la misma experiencia procesando los testículos


T a b l a 6.

Tratamiento Testosterona DHT


ng/g ng/testiculo ng/g ng/testículo

Control 12,7 - 1,5 6,9 í 0,8 18,8 í 1,6 10,1-1,0

bromocript ina

mg/kg peso/dia
151

0,75 17,2 - 3,0 6,9 - 1,2 21,9 - 8,1 8,9 - 3,3

1,5 13,4 - 3,8 5,6 - 1,6 23,5 i 6,9 9,8 - 2,8

3,0 11,4 - 3,4 4,2 í 1,3 30,3 - 9,8 11,2 - 3,6

Influencia del tratamiento con diferentes dosis de bromocriptina durante 10 dias


sobre las concentraciones (ng/g) y el contenido (ng/testiculo) de testosterona y
DHT en testículos de ratas de 40 dias de edad.
T a b l a 7.

Tratamiento Testosterona DHT


ng/g ng/epididimo ng/g ng/epididimo

Control 1,9 - 0,2 1,2 - 0,1 6,4 - 0,6 4,0 - 0,4

bromocript ina

mg/kg peso/dia
152

0,75 2,9 - 0,9 1,6 - 0,4 8,9 - 1,0 4,6 - 0,5

1,5 1,4 - 0,5 0,8 - 0,3 11,2 - 1,6 5,8 - 0,8

3,0 2,8 - 0,8 1,4 - 0,4 8,4 - 0,9 4,2 - 0,5

Influencia del tratamiento con diferentes dosis de bromocriptina durante 10 días


sobre las concentraciones (ng/g) y el contenido (ng/epididimo) de testosterona y
DHT en epid Id irnos de ratas de 40 días de edad.
153

individualmente y expresando las concentraciones por gramo

de tejido o por peso de testículo (contenido). La Figura 30

ilustra los resultados obtenidos en ng/testiculo (barras lisas)

Y ng/g (barras sombreadas). La disminución observada con res­

pecto al control para el grupo tratado con 3 mg de bromocripti

na resulta estadísticamente significativa para 3 o( -Diol cuan­

do los resultados se expresan en ng/testiculo (X - ES; 64

- 15 versus 35#2 - 10,9, p < 0,02) y para testosterona cuando

ellos se expresan en ng/g de tejido (X - ES; 23,26 í 3,31

versus 18,48 - 4,88 (p < 0,05).

PRODUCCION DE ANDROGENOS "IN VITRO" POR TESTICULO TOTAL.

Las modificaciones ocasionadas a través de la inducción

de hipoprolactinemia en los niveles séricos y concentraciones

intratesticulares de andrógenos, parecerían indicar cierto

grado de alteración de la capacidad esteroidogénica del testí­

culo. Se decidió entonces investigar la producción de andróge­

nos "in vitro" antes y después de la administración del agonis

ta dopaminérgico.

En primer lugar se estudió en animales de 4 0 dias de

' edad, la producción basal de andrógenos "in vitro" y la es­

timulada con distintas dosis de hCG. En el medio de incubación

se midieron por RIE los niveles de 3 -Diol y testosterona

producidos.

La Figura 31 muestra las curvas dosis -respuesta que


154

Figura 30 .

Efecto del tratamiento con 3 mg de Br/kg peso/dia en ratas


entre los 30 y 40 días de edad sobre las concentraciones intra
testiculares de T y 3 C* Diol. Ambos andrógenos fueron aislados
por cromatografía en microcolumnas de celita como se describe
en Materiales y Métodos. Cada barra representa el valor medio
í error estándar (n = 6). * Datos significativamente diferen­
tes del control (c) (p < 0 . 0 5 ) , test de Student).
155

Figura 31,

Curvas dosis-respuesta a la hCG "in vitro" para la produc­


ción de 3 Oí -Diol y T por testículos enteros decapsulados
de ratas de 40 dias de edad. Cada punto representa ©1 valor
medio - error estándar (n= 6).
156

se obtuvieron para los dos andrógenos medidos. Los niveles

básales de 3 OC-Diol y testosterona producidos fueron (x

- ES, n= 24), 75 í 6 ng/g y 25 í 3 ng/g respectivamente. La

respuesta en la producción de andrógenos comenzó a evidenciar­

se en presencia de 0,1 mUI / hCG y se incrementó notablemente

a partir de 0,4 m U I .

En las incubaciones realizadas en presencia de 4 mUI

de hCG la producción de 3 0( -Diol y testosterona se elevó

5,6 y 5,2 veces respectivamente. No se logró incrementar la

producción de andrógenos al aumentar las dosis de hCG utiliza­

das (10 y 100 m U I ^ y por consiguiente las incubaciones reali­

zadas en presencia de 4 o más mUI de hCG se consideraron en

condiciones de estimulo máximo.

Cuando se estudió la producción"in vitroMde andrógenos

por testículos provenientes de ratas de 4 0 dias de edad que

hablan sido tratadas con vehículo o con 0,75 y 1,5 mg de bromo

criptina/kg peso/dia durante 10 días consecutivos se obtuvie-

los resultados que se grafican en la Figura 32. Como puede

observarse, los testículos de animales hipoprolactinémicos

mostraron menor producción basal de testosterona que el grupo

control. También se observó una menor respuesta a estímulos

submáximos con hCG en los testículos de animales tratados

con la droga. Luego de un estimulo máximo no se observaron

diferencias significativas en los niveles de testosterona


157

Figura 32.

Curvas dosis-respuesta a la hCG "in vitro" para la producción


de T por testículos enteros decapsulados provenientes de
ratas tratadas con: ( • ) vehículo; (O) 1,5 y ( O ) 0.75 mg
Br/kg peso/dla entre los 30 y 40 días de edad. Cada punto
representa el valor medio - error estandard (n = 3).
158

producidos por los distintos grupos de animales. Cuando se

evaluó la producción de 3 -Diol se obtuvo una respuesta

muy semejante.

Al estudiar la producción de andrógenos por testículos

provenientes de animales que hablan sido inyectados durante

el mismo periodo de tiempo con 3 mg de bromocriptina se obser­

vó el mismo efecto. Asi, en la Figura 33 se muestra como en

el grupo hipoprolactinémico la producción de 3 C>^ -Diol y de

testosterona resultó significativamente disminuida con respec­

to al grupo control (p <. 0.001). En condiciones de estimulo

submáximo también se observó esta tendencia, resultando signi­

ficativos los descensos para 3 -Diol y testosterona luego

del estimulo con 0,4 y 1 mUI respectivamente (p ^0.05).

Una aparente mayor respuesta, fué detectada en los testi

culos provenientes de animales hipoprolactinémicos cuando

estos fueron sometidos a un estimulo máximo con hCG. Dicho

incremento resultó estadísticamente significativo para el

3 o(-Diol producido en respuesta a 4 mUI de hCG (p < 0.05).

Teniendo en cuenta que la administración del agonista

dopaminérgico disminuyó el peso de los testículos sin afectar

el peso corporal, es probable que la expresión de los resulta­

dos en ng/testiculo refleje más ciertamente el verdadero efec­

to causado por la droga. Expresados de esta manera,los resulta

dos se muestran en las Figuras 34 y 35 y puede observarse

una menor producción basal de andrógenos en los animales hipo-


159

Figura 33,

Respuesta a la hCG "in vitro" para la producción de andróge-


nos por testículos enteros decapsulados provenientes de ratas
tratadas con Br (3 mg/kg/peso/dia) entre los 30 y 40 dias
de edad. Las barras abiertas corresponden al grupo control
y las sombreadas al grupo tratado. Cada barra representa
el valor medio í error estándar (n = 3). * Datos significati^
vamente diferentes del control, (p 0.001, en niveles bása­
les para ambos andrógenos, y p < 0.05 para 0.4 y 1.0 mUI
de hCG, test de Student).
160

Figura 34.

Curva dosis-respuesta a la hCG "in vitro" para la producción


de 3 0( -Diol por testículos enteros decapsulados provenientes
de ratas entre los 30 y 40 dias de edad tratadas con: (•)
vehículo; ( O ) 3 mg Br/kg peso/dia. Cada punto representa
el valor medio - error estándar (n = 3). La dosis efectiva
50 % (ED 5 0 ) para C resultó ser 0.7 mUI y para Br 1.4 mUI.
161

Figura 35.

Curva dosis-respuesta a la hCG "in vitro" para la producción


de T por testículos decapsulados provenientes de ratas trata­
das con: ( • ) vehículo; (0)3 mg/Br/kg peso/dia entre los
30 y 40 dias de edad. Cada punto representa el valor medio
- error estándar (n = 3).
162

prolactinóraicos, los que producen también menor cantidad de

andrógenos luego del estimulo con 0,4 y 1 mUI de hCG.

En condiciones de estimulo máximo (4 y 4 0 mUI de hCG)

no se detectaron diferencias estadísticamente significativas

entre el grupo control y el hipoprolactinémico tanto en tér­

minos de producción de 3 O^-Diol como de testosterona.

Al analizar la curva dosis respuesta para el 3 0<-Diol

(Figura 34) se pudo determinar que durante la hipoprolactine-

mia, si bien pudo alcanzarse una respuesta máxima, la dosis

efectiva 50 (ED5 q )se elevó 2,07 veces (157%) con respecto

al control. La Figura 35 muestra la curva dosis respuesta

para la testosterona, en este caso la e d 5q aumentó 2,54 ve­

ces (154,7%). Los cambios observados indican una menor sensi

bilidad a la hCG en el grupo tratado con bromocriptina con

respecto al control.

AMP CICLICO LIBERADO AL MEDIO DE INCUBACION.

En los mismos experimentos que fueron recientemente

descriptos, se estudió también la producción de AMPc "in vitro"

basal y luego del estimulo con dosis crecientes de gonado-

‘trofinas. La Figura 36 presenta la respuesta del AMPc en pre­

sencia de 0; 0.01; 1; 10 y 100 mUI de hCG cuando se incubaron

testículos de animales controles y tratados con 3 mg/kg peso/

dia de bromocriptina durate 10 dias. Como /se puede observar

los niveles de AMPc únicamente se estimularon con concentra-


163

Figura 36.
Respuesta a la hCG nin vitro" para la producción de AMPc
por testículos enteros decapsulados provenientes de ratas
tratadas con Br (3 mg/kg peso/dia) entre los 30 y 40 dias
de edad. Las barras abiertas corresponden al grupo control
y las sombreadas al grupo tratado. Cada barra representa
el valor medio íerror estandard (n = 3). * Datos significati­
vamente diferentes del control (p ^.0.05, test de Student).
164

ciones supramáximas de hCG.

Luego de 10 dias de tratamiento, se observó una disminu­

ción en la producción basal de AMPc del 4 8%. Al incubar los

testículos en presencia de 0,01; 0,1 y 1 mUI de hCG se observa

ron resultados muy semejantes a los obtenidos en condiciones

básales. En presencia de 10 y 100 mUI de hCG pudo notarse

un claro incremento en los niveles de AMPc liberado pero en

ese caso no hubo diferencias estadísticamente significativas

en el efecto observado para los dos grupos de animales en

estudio.

Resultados muy similares fueron obtenidos al incubar

testículos provenientes de animales tratados con las dos dosis

menores de bromocriptina.

PRODUCCION DE ANDROGENQS "IN VITRO" POR CELULAS DE LEYDIG

AISLADAS.

Todos los resultados expuestos en esta sección, obteni­

dos mediante la evaluación de diferentes parámetros, coinciden

en sugerir una menor capacidad esteroidogénica durante la

hipoprolactinemia inducida luego del tratamiento con bromocrip

'tina. Con el propósito de investigar si dicha alteración expre

saba un efecto particular en el sector intersticial del testí­

culo, y teniendo en cuenta que Sharpe y col. (1980), describía

ron importantes diferencias funcionales en la respuesta a

la hCG "in vitro" por testículos intactos o suspensiones de


165

células de Leydig aisladas, se decidió estudiar la producción

de andrógenos "in vitro" por células de Leydig aisladas.

A partir de testículos de ratas controles e hipoprolacti

némicas se obtuvo una preparación cruda de células de Leydig,

mediante la digestión con colagenasa según se detalló en la

sección de Materiales y Métodos.

En primer término se comprobó que en células obtenidas

luego de la inducción de hipoprolactinemia no se modificaba

la viabilidad de las células siendo, ia misma siempre supe­

rior al 95% (técnica de exclusión por azul tripan).

En preparados celulares obtenidos a partir de ambos

grupos de animales se investigó además la actividad de la enzi­

ma 3 (i -hidroxiesteroide-deshidrogenasa, que como ya se ha

mencionado se halla predominantemente localizada en las célu-

las de Leydig. El porcentaje de células (3 positivas

obtenidas para varias colagenizaciones de testículos en ambos

grupos de animales resultó entre 20 y 25%, no evidenciándose

efectos especiales de la droga sobre el número de células

teñidas.

Finalmente se estudió la producción de 3 0( -Diol y tes-

tosterona "in vitro", basal y post -hCG en suspensiones de

10^ células de Leydig.

En la Figura 37 se muestran los resultados obtenidosy

cada barra representa el valor promedio de triplicados de


166

Figura 37.

Respuesta a la hCG Min vitro" para la producción de andrógenos


por células intersticiales provenientes de ratas tratadas
-con Br (3 mg/kg peso/dia) entre los 30 y 40 días de edad.
Las barras abiertas corresponden al grupo control y las
sombreadas al grupo tratado. Cada barra representa el valor
medio - error estándar (n = 3). * Datos significativamente
diferentes del control (p < 0 . 0 5 , test de Student).
167

incubaciones de 2 pooles diferentes. La producción basal

de 3 o( -Diol disminuyó significativamente en los anima­

les hipoprolactinémicos con respecto a los controles,

21,9 - 3,1 ng/10^ cel. versus 16,1 - 2,35 ng/lo** células

3 ^HSD/3 hs, (p ^0,05). El mismo efecto fué observado

para la testosterona producida, Grupo control: 7,5


+ c. +
- 0,55 ng/10 ° cel.; grupo hipoprolactinémico: 5,5 - 0,7

ng/10^ cel.3 ^HSD/3 hs de incubación (p < 0.02).

De manera semejante a lo observado para testícu­

los enteros en este caso también se obtuvo una menor

producción en ambos andrógenos en células provenientes

de animales hipoprolactinémicos en presencia de concen­

traciones submáximas de hCG, mientras la capacidad este-

roidogénica máxima no se alteró durante la hipoprolacti-

nemia. Las E D c a l c u l a d a s para 3 o( -Diol y testosterona

resultaron 2,48 (147%) y 1,73 (73,8) veces mas altas

en el grupo hipoprolactinémico, lo que indicarla una

menor sensibilidad a la gonadotrofina.


168

POSIBLES EFECTOS DIRECTOS DE

BROMOCRIPTINA Y PROLACTINA.

El conjunto de resultados descriptos indican que la

inducción de una hipoprolactinemia, a través de la adminis­

tración de bromocriptina durante un periodo de 10 días,

a ratas macho en desarrollo (estadio juvenil a puberal tem-

prano# Ojeda, 1980 ) t es capaz de alterar la capacidad estero_i

dogénica en la gonada.

Los mecanismos a través de los cuales ocurre esta

modificación podrían ser: 1) una modificación en los niveles

de LH circulante; 2) un descenso en los niveles de PRL y

3) una acción directa de esta última hormona en el testí­

culo. Resultados en relación a los puntos 1 y 2 se han pre­

sentado en las secciones previas. En relación al punto 3

pese a la existencia de sitios receptores específicos para

PRL en la célula de Leydig un efecto directo de la hormona

no ha podido ser determinado. Por otra parte, los resultados

anteriormente presentados no permiten descartar una acción

directa de bromocriptina sobre el testículo. Se decidió

entonces en base a lo anteriormente expuesto, investigar

la posibilidad de efectos directos de PRL y bromocriptina

sobre el testículo, utilizando modelos que descarten una

acción simultánea de manera sistémica.


169

EFECTO LOCAL DE BROMOCRIPTINA.

Como ya se ha mencionado, la administración intrates-


_5
ticular de bromocriptina (8 x 10 M) se realizó regular­

mente en el testículo derecho, mientras que en el contrala­

teral se inyectó el vehículo en igual volumen (20 ). Al

cabo de 18 horas los animales se sacrificaron, los testícu­

los se disecaron, y se determinó la producción " in vitro "

de andrógenos en condiciones básales y luego del estimulo

con hCG.

Tal como se muestra en la Figura 38, pudo • observarse

un significativo descenso en la producción basal de testoste-

rona (p < 0.05) y en la respuesta a dosis submáximas de

hCG (0.4 mUI, p 4. 0.05), mientras que la respuesta esteroi-

dogénica máxima (10 m U I ) no mostró diferencias entre el

testículo inyectado con bromocriptina y su contralateral

con vehículo.

Cuando se estudió el efecto de la incubación simultá­

nea de suspensiones de células de Leydig aisladas y concen-


-9 -5
traciones crecientes de bromocriptina (1 x 10 - 10 M),

‘ durante 3horas a 34QC, sobre la producción de andrógenos

basal y post- estimulo con h C G ^ e obtuvieron los resultados

que representa la Figura 39. Como puede observarse, la bromo

criptina en contacto con células de Leydig en las condicio­

nes expuestas origina una disminución progresiva en la pro-


170

Figura 38.
-5
Efecto de la administración intratesticular de Br (10 M)
sobre la respuesta a la hCG " in vitro" para la producción
de (A): T; (B): 3 o^-Diol por testículos enteros decapsulados
(40 dias de edad). Las barras abiertas corresponden a testicu
los controles inyectados con vehículo y las sombreadas a
los contralaterales inyectados con Br. Cada barra representa
el valor medio - error estandard (n = 3). * Datos significati
vamente diferentes del control (p 40,05, test de Student).
171

Figura 39.
4

Respuesta a distintas dosis de Br Min vitro" para la produc­


ción basal de (A): T y (B): 3 -Diol por células interstjl
ciales provenientes de ratas de 40 dias de edad. Cada punto
representa el valor medio - error estándar (n = 6). Datos
significativamente diferentes del control: *: p < 0.05; **:
p < 0 .02, test de Student).
172

ducción basal tanto de testosterona como de 3oC-Diol. El

efecto resultó estadísticamente significativo en presencia


-5
de 1,3 x 10 M de la droga y los resultados obtenidos de

triplicados de incubación fueron: 3 °( -Diol 5,43 + 1,24

ng/10 6 células versus 2,57 + 0,1 ng/106 3 0 -HSD/3 horas

(p ^ 0.05) testosterona, 3,25 + 0,13 versus 2,71 + 0,36

ng/10** 3(J-HSD/3 horas (p < 0,05).

Cuando se evaluó la capacidad de respuesta de las

células de Leydig, en presencia de dos concentraciones dife­

rentes de bromocriptina (2,5 y 5 x 10“^ M), se observó una

menor tendencia en la respuesta de ambos andrógenos al esti­

mulo con 0,25 y 100 mUI de hCG, resultando significativa

estadísticamente la de 3 -Diol post-estimulo máximo con

hCG (Figura 40).

Los resultados presentados hasta aquí, indican que

tanto en experiencias "in vivo" como Min vitroM, la bromo­

cript ina disminuye la producción de andrógenos testiculares.

Sin embargo, al incubar testículos decapsulados con concen-


-9 -5
traciones crecientes de bromocriptina (1,3 x 10 a 10

M) se observó un efecto algo diferente que se ilustra en

las Figuras 41 y 42. Como se puede observar, la producción

basal de ambos andrógenos resultó incrementada en presencia

del neurofármaco. El análisis de los datos mediante el test

de Student apareado mostró que los cambios eran significati­


173

vos para 3 0<-Diol en presencia de 1,3 x 10 7M de bromocrip-

tina (p 0.05) y para testosterona con 1,3 x 10 de la


droga (p < 0,05).

Cuando los testículos fueron estimulados con dosis

submáximas de hCG y coincubados con bromocriptina el incre­

mento resultó significativo para 3 o< -Diol y testosterona

en presencia de 1,3 x 10 ~5 , 1,3 x 10 ~6 y 1,3 x 10-7 Mde


la droga (p < 0.05).

Por el contrario, luego de un estimulo máximo con

h C G #se observó como en el caso de las suspensiones celulares,

una inhibición en la producción de ambos andrógenos gonadales,

gue resultaron entre 15 y 20 % más bajas. El descenso re­

sultó estadisticamente significativo para testosterona y

3 -Diol en presencia de 1,3 x 10_7M y 1,3 x 10~6M de bromo


criptina.

EFECTO LOCAL DE LA PRL.

La incubación de testículos decapsulados en presencia


—7 —6
de distintas concentraciones de PRLo (5 x 10 y 5 x 10 M)

durante 3 hs a 34QC, originó un incremento estadísticamente

significativo en la producción basal de ambos andrógenos

estudiados. En presencia de 5 x 10 ^ M de PRL este aumento

también resultó ser significativo para 3 C(-Diol al estimular

se con 0.5 y 100 mUI de hCG (Figura 43 y 44).


174

Figura 4 0 .
-5
Respuesta a Br (5 x 10 M) "in vitro" para la producción
de (A): T; (B ); 3 -Diol, basal y estimulada con hCG por
células intersticiales provenientes de ratas de 40 dias de
edad. Las barras abiertas corresponden a las suspensiones
celulares controles y las sombreadas a los incubados con
Br. Cada barra representa el valor medio - error estándar
(n = 6). *Datos significativamente diferentes del control
(p ^ 0.02, test de Student).
175

.Respuesta a distintas dosis de Br "in vitro" para la produc­


ción de T basal y estimulada con hCG por testículos enteros
decapsulados provenientes de ratas de 40 dias de edad. Las
barras abiertas corresponden a los testículos controles y
las sombreadas a los incubados con Br. Cada barra representa
el valor medio - error estándar (n = 4). * Datos significati­
vamente diferentes del control (p<0.05, test de Student apa­
reado ).
176

Figura 42.

Respuesta a distintas dosis de Br "in vitro" para la produc­


ción de 3 -Diol basal y estimulada con hCG por testículos
enteros decapsulados provenientes de ratas de 40 dias de edad.
Las barras abiertas corresponden a los testículos controles
y las sombreadas a los incubados con Br. Cada barra representa
el valor medio - error estándar ( n = 4 ). *Datos significati
vamente diferentes del control (p 0.05, test de Student
apareado ).
177

Figura 43.

Respuesta a distintas dosis de PRL "in vitro" para la produc­


ción de 3 O^-Diol basal y estimulada con hCG por testículos
enteros decapsulados provenientes de ratas con 40 dias de
edad. Las barras abiertas corresponden a los testículos con­
troles y las sombreadas a los incubados con PRL. Cada barra
representa el valor medio - error estándar ( n = 6 ) . * Datos
significativamente diferentes del control (p < 0.05, test
de Student).
178

Figura 44.

Respuesta a distintas dosis de PRL "in vitro" para la produc­


ción de T basal y estimulada con hCG por testículos enteros
decapsulados provenientes de ratas de 40 dias de edad. Las
barras abiertas corresponden a los testículos controles y
las sombreadas a los incubados con PRL. Cada barra representa
el valor medio - error estándar (n = 6). * Datos significati­
vamente diferentes del control (p 0.05, test de Student).
179

Cuando se estudió el efecto de la incubación simultá­

nea de suspensiones de células de Leydig aisladas y concen-


— 8 — 6
traciones crecientes de PRL (5 x 10 -5 x 10 M ), durante 3

h s . a 34QC sobre la producción de andrógenos basal y post­

estimulo con hCG, se obtuvieron los resultados que represen­

ta la Figura 45. Como puede observarse, la PRL originó un

incremento tipo dosis-respuesta en la producción basal de

3 C< -Diol y testosterona, con una dosis efectiva 50%(ED j_q )


— 8
igual a 3 x 10 M.

Al analizar la capacidad de respuesta de las células

de Leydig a dosis submáximas de hCG (0.25 mUI) luego de

coincubar con la concentración mínima de PRL capaz de incre­

mentar la producción basal de andrógenos, se halló un aumen­

to en la producción de 3 -Diol y testosterona del orden

de 80 y 90 % respectivamente (Figura 46).

La utilización de PRL-r en incubaciones de células

de Leydig aisladas, mostró resultados muy similares.


180

Figura 4 5 .

Respuesta a distintas dosis de PRL "in vitro" para la produc­


ción basal de (A): T y ( B J s S ^ - D i o l , por células intersticia
les provenientes de ratas de 40 dias de edad. Cada punto
representa el valor medio - error estándar (n = 3). Datos
significativamente diferentes del control: *: p < 0.05;
**: p < 0.02, test de Student.
181

Figura 46.
—8
Respuesta a PRL ( 5 x 10 M) "in vitro" para la producción
de (A): T y (B): 3 0 ( -Diol basal y estimulada con hCG por
células intersticiales provenientes de ratas de 40 dias de
edad. Las barras abiertas corresponden a las suspensiones
celulares controles y las sombreadas a las incubadas con
-f
PRL. Cada barra representa el valor medio - error estándar
(n = 3). * Datos significativamente diferentes del control.
DISCUSION II
182

En esta segunda sección se discutirán los efectos

de un descenso en los niveles de PRL sobre el eje hipófiso

gonadal durante la maduración sexual en la rata. Se ha esta­

blecido que el sistema dopaminérgico hipotalámico ejerce

un control inhibitorio sobre la liberación de PRL (Meites

y col., 1972) y que este sistema además se halla presente

desde la vida fetal (Gluckman y col., 1979).

Con el propósito de inducir un descenso marcado en

la PRL circulante se utilizó un neurofármaco con reconocida

actividad dopaminérgica. Asi;se decidió estudiar la importan

cia de la prolactina sobre la función sexual, inhibiendo

de manera selectiva la sintesis y secreción de esta hormona

durante un periodo critico del desarrollo.

Las tres diferentes dosis de bromocriptina utilizadas,

llevaron los niveles de PRL sérica a valores por debajo

del limite de detección del ensayo. Esta hipoprolactinemia

no se acompañó en ningún caso de un cambio paralelo en los

niveles de LH sérica. Previamente, diferentes grupos de

investigadores hablan documentado respuestas similares a

la bromocriptina en relación a modificaciones en las concen-


í

traciones de PRL y LH (Purvis y col., 1979; Waeber y col.,

1983) .

Cabe destacar además que si bien en este estudio no

se midieron los niveles de FSH séricos, de acuerdo a Gil-


183

Ad y col. (1980) y Doherty y col. (1980), ©1 descenso en

la PRL sérica inducida por bromocriptina no modifica los

niveles circulantes de FSH.

Por otra parte, la involución en el peso de los testí­

culos y epididimos originada en los animales por la adminis­

tración de las diferentes dosis de la droga, concuerda con

lo obtenido por Barañao y col. (1981) utilizando sólo la

dosis más elevada. Harper y col. (1976) trabajando con ratas

adultas no hallaron cambio alguno en el peso gonadal y pros-

tát ico luego de la administración de bromocriptina. Debe

sin embargo señalarse, que a esta edad ha sido demostrado

que los animales son menos sensible a variaciones en los

niveles de PRL(Negro Vilar y col., 1977).

Se observó además que el tratamiento de ratas normales

con 3 mg de bromocriptina/kg dia, durante 10 dias reduce

los niveles plasmáticos de 3 0( -Diol y de testosterona +

DHT, y que dicho efecto es también observado al disminuir

la dosis a la mitad o a la cuarta parte. Debe señalarse que

existe controversia con respecto al efecto de la hipoprolac-

tinemia sobre los niveles séricos de andrógenos. Por un


t
lado Bartke y col. (1973) y Barañao y col. (1981), coinciden

en referir una disminución en los niveles de andrógenos

séricos post-tratamiento con bromocriptina, mientras que

Huthaniemi y col. (1981) y Waeber y col. (1983) no encuen-


184

tran cambios en la concentración de testosterona sérica

durante la calda de la PRL circulante. Es oportuno recordar

al respecto, que Kovacevic y col. (1982) en un mismo trabajo

mostraron estimulación, no variación y aún disminución de

la concentración de testosterona + DHT sérica, como respues­

ta a la administración de bromocriptina (3 mg/kg peso/dia)

dependiendo de la edad de la rata en el momento en que se

realiza el estudio.

Se analizaron también las concentraciones tisulares

de andrógenos y de estos estudios surgió primeramente que

en ratas normales de 40 dias de edad, la concentración intra

testicular de 3 0( -Diol supera a la de DHT y testosterona

e incluso a la suma de ambas. Los valores presentados son

semejantes a los publicados previamente por Corpechot y

col. (1980). No obstante, algunas diferencias observadas

en las concentraciones de testosterona podrían adjudicarse

a características propias de la cepa de ratas utilizadas.

El tratamiento con bromocriptina mostró una disminu­

ción en la concentración (ng/g) intratesticular de testoste­

rona, DHT y 3 -Diol, asi como también en su contenido

(ng/testiculo). Estos cambios fueron más importantes al

evaluar las concentraciones en cada uno de los testículos

por separado y expresar los resultados en función del peso

real de cada uno. El descenso observado en los niveles séri-


185

eos de andrógenos luego de la hipoprolactinemia fué probable

mente en parte reflejo de cambios similares aunque mucho

más discretos en las concentraciones intratesticulares de

andrógeno.

En relación al epididimo, únicamente se evaluaron

las concentraciones de testosterona y DHT y los resultados

obtenidos mostraron que en la rata de 4 0 dias predominan

los niveles de DHT sobre los de testosterona, hecho que

coincide con observaciones previas de Pujol y col. (1976),

Purvis y col. (1978) y Larminat y col. (1981). Orgebin Crist,

y col. (1976) describieron la presencia de sitios receptores

para PRL en el epididimo del conejo. En la rata el epididimo

no ha sido considerado como órgano blanco para dicha hormona.

En apoyo de esta idea no se detectaron diferencias en la

concentración o el contenido de andrógenos en el tejido

epididimario,como consecuencia de la inducción de hipoprolac

tinemia por bromocriptina. Este hecho sugiere que si existie

ra un efecto de prolactina en el epididimo este no estarla

involucrado en la regulación del contenido de andrógenos.

Al examinar los andrógenos producidos en incubaciones

de testículos decapsulados se observó un neto predominio

del 3 0(-Diol. Estos hallazgos son consistentes con trabajos

previos que muestran que el 3 &(-Diol es el mayor producto

liberado durante la incubación de testículos provenientes


186

de animales inmaduros (Lacroix y col., 1975).

Cuando se compararon los diferentes grupos experimenta

les se observó una disminución en la respuesta "in vitro"

basal de 3 -Diol y testosterona por testículos enteros

provenientes de animales hipoprolactinémicos con respecto

al control. Al estimular los testículos con dosis submáxi­

mas de hCG se puso de manifiesto un efecto muy similar.

No obstante, en presencia de cantidades supramáximas de

la gonadotrofina, las respuestas fueron levemente aumentadas

en el grupo hipoprolactinémico cuando los resultados se

expresaron en ng/g de testículo^ y más aún en el caso de

considerar los resultados en términos de porcentajes de

estimulo.

Debido a la involución observada en el peso de la

gonada como consecuencia del tratamiento, los resultados

se expresaron también en función del peso de cada testículo

y en este caso no se detectaron diferencias entre los grupos

en la capacidad esteroidogénica máxima.

El incremento observado en el grupo hipoprolactinémico

al expresar los resultados como porcentaje de estimulo po­

dría estar influenciado por los niveles básales de los dife­

rentes grupos experimentales. En este caso en particular,

la baja producción basal observada luego del tratamiento

puede en forma aparente exagerar la respuesta del testículo


187

"in vitro". Por consiguiente, consideramos que cuando se

utilizan este tipo de tratamientos que modifica el peso

de la gonada, la expresión de los resultados por órgano

es la más adecuada para evaluar la función testicular.

La sensibilidad de la célula de Leydig y por lo tanto

del órgano a la estimulación con hCG está determinada por

la probabilidad de la interacción LH/hCG-receptor, que a

su vez depende de la concentración de LH y del número de

receptores específicos para la hormona. En la célula de

Leydig hay un exceso de receptores para LH en función del

número requerido para producir una respuesta esteroidogénica

máxima (Catt y col., 1973). Esta última puede ser inducida

con la ocupación de un número de sitios receptores menor

del 1%. Una de las explicaciones posibles referentes a la

existencia de este número de receptores en exceso seria

proveer una mayor sensibilidad de la célula intersticial

a la LH ya que la presencia de este gran exceso de sitios

receptores favorecerla la formación del complejo hormona-

receptor.

Como se mencionó anteriormente la producción basal

de andrógenos "in vitro" en el grupo de animales hipoprolac-

tinómicos estuvo descendida; estos resultados son consisten­

tes con los andrógenos séricos bajos observados en dicho

grupo. Considerando además que los niveles circulantes de

LH permanecieron normales, podría entonces concluirse que


188

la disminución observada en los niveles de andrógenos circu­

lantes y en la producción basal "in vitro" post hipoprolac-

tinemia se deben a un menor grado de estimulo del órgano

por disminución del número de sitios receptores para LH/

/hCG. En concordancia con esta última postulación f se ha

descripto que la hipoprolactinemia por administración de

bromocriptina origina un descenso en el número de receptores

para LH (Me Neilly col., 1979; Calandra y col., 1982; Kolena

y col., 1983) en las células intersticiales.

Paralelamente, en el presente trabajo demostramos una

menor liberación de AMPc al medio de incubación en condicio­

nes básales y bajo estimulo submáximo con hCG luago de la induc­

ción de hipoprolactinemia.

Al analizar las diferentes curvas dosis respuesta

de andrógenos a la hCG en incubaciones de testículo total

y células aisladas provenientes de los diferentes grupos

experimentales^ se pudo comprobar una sensibilidad a la gona-

dotrofina entre 2 y 3 veces menor como respuesta al trata­

miento con bromocriptina.

La producción esteroidogénica máxima en respuesta

a la hCG no se modificó, hecho que es compatible con el

descenso en los receptores de LH/hCG,ya que como se mencionó

en párrafos anteriores, sólo es necesaria una mínima ocupa­

ción de los mismos para producir dicha respuesta.


189

En este estudio se halló además que la inducción de

hipoprolactinemia no afecta la proporción de células de

Leydig viables obtenidas por digestión con colagenasa. Cabe

destacar, que a partir de esta suspensión de células se detec­

tó un tipo de respuesta que coincidió plenamente con la

observada en incubaciones de testículos enteros. Con rela­

ción a estas últimas observaciones existen algunas discrepan

cias entre los datos presentes y los obtenidos por diferen

tes autores utilizando sistemas de estudio semejantes.

Asi, en ratas adultas tratadas con bromocriptina duran

te 2 u 8 días, Huthaniemi y col. (1981), no observaron cam­

bios relacionados al descenso en la PRL sérica con la produc

ción basal y luego de un estimulo máximo con hCG en células

de Leydig en suspensión. Por otra parte, Waeber y col. (1983)

usando células intersticiales purificadas (población II),

mostraron que testículos de ratas adultas tratadas con el

agonista dopaminérgico durante 4 días o 4 semanas, presenta­

ban una secreción basal de testosterona y post-estimulo

con hCG similar a la de ratas controles. Es posible que

las discrepancias entre nuestros resultados y aquellos cita­

dos en la literatura puedan ser debidas a las diferentes

edades de los animales utilizados, dado que la PRL, al menos

en ratas, parece, ejercer un cierto papel durante el desa­

rrollo sexual. En apoyo de esta hipótesis, se ha descripto


190

que el tratamiento con bromocriptina induce en ratas de

30 dias de edad una reducción significativa en la respuesta

a la hCG de los andrógenos 17 (Purvis y

col., 1979) y en la actividad de la enzima ¿i4-5 C* -reducta­

sa en túbulos seminíferos (Barañao y col., 1981).

En conclusión todos estos resultados tomados en conjun

to indican que la administración de bromocriptina "in vivo"

origina alteraciones significativas en la esteroidogénesis

testicular en ratas prepuberales.

Además de los efectos observados como consecuencia

de la hipoprolactinemia, la bromocriptina fué capaz de afec­

tar la esteroidogénesis testicular directamente, evidencián­

dose un efecto inhibitorio de la droga cuando se inyectó

por via intratesticular.

Asimismo, este agonista dopaminérgico (1,5 x 10 M)

fué capaz de modificar la producción "in vitro" de testoste-

rona por células de Leydig dispersas, reduciendo la libera­

ción de andrógenos al medio de incubación tanto en ausencia

como en presencia de hCG. Estos hallazgos están en acuerdo

con observaciones previos de Vermes y col. (1978) y Grizard

y col. (1983), quienes obtuvieron resultados similares a

partir de preparaciones de células intersticiales de rata.

Sin embargo, difieren de las observaciones de Bartke y col.


191

(1981), que utilizando testículos totales de ratón y con

concentraciones tan bajas como 1 ng/mlf la bromocriptina

estimuló la producción de testosterona en ausencia o en

presencia de dosis bajas de hCG.

Hasta el presente estudio, las discrepancias hablan

sido atribuidas a posibles diferencias en los procedimientos

de los Laboratorios y especialmente a la utilización de

distintas especies de animales. Como resultado de las actua­

les experiencias realizadas f se observó que la incubación

de testículos enteros provenientes de ratas de 40 dias en

presencia de bromocriptina en diferentes concentraciones,

resulta en un incremento en la producción de andrógenos.

El efecto es más pronunciado en ausencia de hCG, pero tam­

bién se evidencia con cantidades submáximas de la hormona.

Resulta sumamente difícil tratar de interpretar las

diferencias observadas al intentar comparar los datos obtenjL

dos a partir de células en suspensión o testículos descapsu­

lados .

La acción vasoactiva de los alcaloides de la ergotami-

na ( Fluckinger y col., 1976) no parece ser relevante en estas

incubaciones, por cuanto la mayoría de los vasos sanguíneos

se descartan al decapsular los testículos. Sin embargo,

algún posible efecto en otros sectores testiculares no pue­

de ser descartado.
19 2 -

Poca atención se ha prestado hasta el presente a

las acciones de la dopamina sobre la célula de Leydig. No

obstante es necesario considerar los efectos dopaminérgicos

de la bromocriptina, dado que la acción periférica de la

dopamina es mediada a través de receptores específicos

(Bogaert y col., 1981).

Ante la evidencia experimental discutida en párrafos

anteriores de la participación de la PRL en el normal funció

namiento de la función gonadal en la rata durante la madura­

ción sexual, surgió entonces la hipótesis relacionada a

una posible acción directa de la hormona en la gonada. La

presencia de receptores específicos para PRL en el testículo

(Charreau y col., 1978) constituye un aval en tal sentido.

Con el objeto de corroborar dicha hipótesis, se anali­

zó el efecto del agregado "in vitro" de PRL,tanto a testícu­

los enteros decapsulados como a suspensiones de células

de Leydig. Ambos tipos de diseños experimentales exibieron

características casi idénticas, mostrando que la PRL es

capaz de estimular la producción de andrógenos "in vitro"


—8
a partir de concentraciones de 5 x 10 M.

Shiu y col. (1978), describieron un número de recepto­

res para PRL por célula de Leydig considerablemente menor

que los correspondientes para LH. Esta observación podría

ofrecer una posible explicación para las elevadas concentra-


193

dones de PRL necesarias para estimular la esteroidogénesis

"in vitro" con respecto a las de LH (Odell y col., 1976).

Los presentes resultados podrían también ser atribui­

dos a una contaminación de la PRLo con LH. Al respecto,

Menon y col. (1985) empleando células luteales, no lograron

detectar una inhibición en el ensayo de actividad del radio-

receptor de LH/hCG.

En este sentido, es de esperar que estudios adiciona­

les en realización en el Laboratorio, con técnicas de culti­

vo de células de Leydig y utilización de un anticuerpo anti-

LH, permitan dilucidar completamente el efecto de la PRL,

y de esa manera poder establecer una mejor correspondencia

entre las observaciones obtenidas de experiencias "in vivo"

e "in vitro".
CONCLUSIONES
194

Los resultados presentados en este trabajo de Tesis

ponen de manifiesto una vez más la importancia de realizar

de manera conjunta, estudios en el hombre y a nivel experi­

mental. Si bien estos últimos permiten ahondar más en el

conocimiento sobre el tema, se debe ser cauteloso en la

extrapolación al ser humano de las observaciones realizadas

en animales de experimentación.

Basándose en los resultados obtenidos a partir del

análisis de muestras testiculares y epididimarias humanas

es posible extraer ciertas conclusiones que se enumeran

a continuación:

- La testosterona testicular es el principal andrógeno

presente en el testículo humano (edad promedio = 65 años),

encontrándose en una concentración casi 40 veces más alta

que su metabolito 5 c>< -reducido la DHT.

- La concentración de testosterona epididimaria es aproxima

damente un 10% de la presente en la gonada, mientras que

la DHT se halla en concentraciones muy semejantes en ambos

órganos.

- En cada uno de los tejidos estudiados el 3 0< -Diol fue

detectado en concentraciones que resultaron 6 veces menores


195

que las correspondientes a DHT.

- La concentración de cinc hallada en testículo y epididimo

humano es 2 veces más elevada que la descripta en la mayo­

ría de los tejidos del organismo.

- Se comprobó una correlación directa entre las concentra­

ciones de cinc testicular y cada andrógeno (testosterona

y DHT); mientras que en epididimo las concentraciones de

testosterona se correlacionaron inversamente con el metal.

- Las concentraciones de los diferentes andrógenos analiza­

dos resultaron uniformemente distribuidas en cada uno de

los segmentos del epididimo (cabeza, cuerpo y cola).

- En los pacientes tratados con estrógenos durante dos

o más meses, las concentraciones intratesticulares de tes­

tosterona y DHT fueron significativamente inferiores a

las del grupo no tratado, observándose el mismo efecto

en los tres segmentos epididimarios.

- La inducción de hipoprolactinemia en pacientes con carci­

noma de próstata por administración del agonista dopaminér-

gico bromocriptina, redujo significativamente los niveles


196

de PRL séricos sin modificar los correspondientes a LH.

- Al cabo de 7 dias de tratamiento con bromocriptina se

observó un descenso en los niveles de la testosterona circu

lante mientras los correspondientes a Adiona y 3 o< -

Diol permanecieron constantes.

- La observación más importante durante la hipoprolactine-

mia fué el marcado aumento en las concentraciones intra-

testiculares de testosterona y DHT, en tanto que el conteoi

do de cinc resultó constante a lo largo del tratamiento.

- Se observó una correlación positiva entre la testoste­

rona testicular y la cantidad relativa de células de Leydig

en cada paciente. Las diferentes alteraciones observadas

en los túbulos seminíferos no se correlacionaron con el

nivel de andrógenos. El estudio histológico testicular

por microscopía óptica no reveló cambios detectables en

ningún sector del órgano como consecuencia de la hipopro­

lact inemia .

Los estudios realizados en la segunda parte de este

trabajo permitieron establecer la importancia de la PRL

durante la maduración sexual de la rata macho evidencián­


197

dose en los siguientes puntos:

La inducción de hipoprolactinemia (niveles séricos de

PRL no detectables por RIE) en ratas de 30 días de edad

por administración de 3 dosis diferentes de bromocriptina

(0.75, 1,5 y 3 mg/kg peso/dia) no modificó los niveles

séricos de LH, ocasionando un descenso significativo en

el peso testicular y epididimario.

- Como consecuencia del tratamiento se produjo una signifi­

cativa disminución en las concentraciones séricas e intra-

testiculares de testosterona, DHT y 3 0(-Diol.

- En los testículos decapsulados provenientes de los anima­

les hipoprolactinémicos, la liberación de AMPc basal al

medio de incubación disminuyó aproximadamente un 50% con

respecto a los controles.

- La producción de andrógenos Min vitro" en testículos

decapsulados y células de Leydig aisladas de ratas hipopro-


r

lactinémicas, resultó sensiblemente menor que los controles

en condiciones básales y luego de un estimulo submáximo

con hCG. La capacidad esteroidogénica máxima no fué diferen

te entre ambos grupos.


198

- No se observaron modificaciones en la proporción de célu­

las de Leydig viables obtenidas por colagenización antes

y durante el tratamiento con el mencionado agonista dopa-

minérgico.

-5
- Bromocnptina en concentraciones de 5 x 10 M ejerce

un efecto inhibitorio directo sobre la producción de andró-

genos "in vitro". Dicho efecto se evidencia luego de una

inyección intratesticular con el neurofármaco o bien agre­

gando el mismo a suspensiones de células de Leydig prove­

nientes de ratas de 40 dias de edad.

— 8
- El agregado de PRLo (5 x 10 M) a testículos decapsula­

dos y suspensiones de células de Leydig provenientes de

ratas de 4 0 dias de edad, en incubaciones durante 3 horas,

originó un aumento en la producción de andrógenos basal

y post-estimulo submáximo con hCG.


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