UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRONOMICAS

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL EN LINEA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA (MIC113)

GUIA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO 2

OBSERVACIÓN DE CÁPSULAS Y ENDOSPORAS

Introducción.

Dentro de las posibles estructuras que algunas bacterias pueden producir como resultado de su
metabolismo o reacción ante una situación adversa del medio ambiente, existen dos que son
importantes para la vida de las bacterias que las producen. Estas son la cápsula y la endospora.

La endospora conocida así porque se forma dentro de la célula, es un cuerpo refringente (refracta
la luz), oval, de pared gruesa y que representa una etapa de la vida de las bacterias que la forman.
Es una estructura resistente que se produce cuando las condiciones ambientales comienzan a ser
desfavorables para la bacteria (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas,
radiaciones, compuestos tóxicos, calor, desecación, acidez, etc. y son las estructuras vivas más
resistentes que se conocen. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables
(temperatura adecuada, humedad, nutrientes) la endospora "germina" y se vuelve a generar la
célula genéticamente idéntica que era antes.

No todas las bacterias tienen la capacidad de formar endosporas, dos géneros

microbiológicamente importantes que las producen son: Bacillus y Clostridium.

Bacillus y Clostridium forman endosporas a razón de una por cada célula bacteriana, que se
considera como forma vegetativa, a este proceso se le conoce como esporogénesis o
esporulación. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa (rompimiento) y
libera la endospora ya formada al exterior. La endospora puede perdurar durante años en estado
de latencia o dormancia sin perder la capacidad de germinar.

La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter

taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género. Por ejemplo, Bacillus
sphaericus posee una endospora esférica con localización terminal y deformante de la célula
vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. Bacillus thuringiensis tiene
localizada una endospora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa, lo que provoca un
abombamiento característico denominado en huso.

Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de Clostridium. Ej. C. tetani
(tétanos), C. perfringens (gangrena gaseosa) y C. botulinum (botulismo). Otras son producidas por
especies de Bacillus. Ej. B. anthracis (antrax).

Tinción de endosporas.

La formación de endosporas es un carácter de gran importancia en la biología de un

microorganismo. Para la observación de endosporas bacterianas se hace una técnica de tinción
selectiva propuesta por Sheaffer y Fulton. Técnica denominada así en honor a dos microbiólogos
que la desarrollaron en 1930: Alice B. Schaeffer y MacDonald Fulton. En la técnica se utiliza dos

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colorantes básicos: verde de malaquita (primario) y safranina (de contraste); y un agente

mordiente: calor.

Fundamento de la tinción.

La pared celular de la endospora presenta distinto comportamiento que la membrana bacteriana

frente a la tinción. La endospora es más compleja que la célula vegetativa quien la forma. Sólo se
puede teñir el contenido de la endospora alterando su estructura. La complejidad de las mismas
dificulta que se decoloren una vez teñidas.

El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por lo
tanto, se une débilmente a la bacteria. Este penetra en la célula vegetativa y cuando se calienta la
preparación entonces también penetra a la endospora formada. Durante el lavado con agua, el
verde de malaquita se elimina de las células vegetativas, pero no de la endospora en la cual ya
está fijo.

El colorante de contraste Safranina, interviene para teñir a las células vegetativas que se
decoloraron por el agua. De esta manera se observan al microscopio, endosporas teñidas de verde
y partes o células vegetativas teñidas de rosado. También, en algunas ocasiones se observa la
forma, tamaño relativo y posición de la endospora en la célula vegetativa.

Cápsula bacteriana.

Muchas bacterias se rodean de un material gelatinoso, compuesto de polisacáridos que recibe el

nombre de cápsula o capa mucilaginosa. También a ésta estructura actualmente se le ha dado el
nombre de glucocalix.

La cápsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en
sus ambientes naturales, consistente en una acumulación de material mucoso o viscoso, situado
externamente respecto de la pared celular. Es una capa rígida e impermeable a los colorantes y se
pueden clasificar en función del grado de asociación con la superficie celular, o por su
consistencia:

a) Cápsula rígida: con suficiente consistencia estructural como para evitar la entrada de
partículas como las de tinta china o nigrosina. Suele tener un límite exterior definido.

b) Cápsula flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partículas. Además, es

deformable y carente de límites precisos.

c) Cápsula integral: íntimamente asociada con la superficie celular, con la pared celular

Las cápsulas son estructuras inertes “no vivas”, carentes de actividad metabólica, pero que
confieren a las bacterias importantes propiedades, entre ellas están:

 Sirve de cubierta protectora ante situaciones ambientales adversas.

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 Sirve como depósito de alimentos y como lugar de eliminación de sustancias de desecho.

 Protege de la desecación, ya que contiene una gran cantidad de agua almacenada.
 Permite la adhesión a otras células formando microcolonias.
 Permite la adhesión a sustratos inertes (colonización de sus nichos ecológicos) o vivos
(tejidos de organismos superiores).
 Sirve de protección contra agentes antibacterianos.
 Sirve de protección ante fagocitosis.

Tinción para la observación de cápsula.

Para observar las cápsulas bacterianas, es necesario realizar una tinción de tipo “indirecta”, ya que
éstas no se observan coloreadas en los frotis teñidos corrientemente, porque dichas estructuras
por su naturaleza impermeable no retienen el colorante, por consiguiente, en la tinción la
estructura no se colorea sino que se observa por contraste. Una técnica de tinción utilizada es la
conocida como tinción por el método de Anthony. Esta técnica utiliza el colorante cristal violeta
(colorante primario) y sulfato de cobre (SO4 CU) como reactivo.

Fundamento de la tinción.

El cristal violeta tiñe todo el frotis color oscuro. El reactivo sulfato de cobre tiene función
decolorante y se usa para enjuagar el colorante cristal violeta. No se usa agua, porque la capsula
es soluble a ésta. También contribuye al contraste de la cápsula con el fondo de la preparación.

Objetivos.

1. Adquirir conocimientos teóricos y prácticos relacionados a las tinciones selectivas para

observar endosporas y cápsulas bacterianas.
2. Realizar tinciones para observar cápsulas y endosporas bacterianas.
3. Comprender el fundamento de cada tipo de tinción.

Materiales y equipo.
 Cultivos en medios sólidos de Bacillus  Colorante Safranina.
subtilis, Escherichia coli  Colorante Verde de malaquita.
 Solución salina o agua destilada.  Colorante Cristal Violeta.
 Láminas portaobjetos.  Solución de Sulfato de Cobre.
 Asa bacteriológica.  Mechero de Bunsen
 Fósforos  Aceite de inmersión.
 Bandeja de tinción.  Microscopio.
 Otros.

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Desarrollo.

Técnica de la coloración de endosporas (Método de Sheaffer – Fulton).

Cada estudiante realizará la técnica de tinción de endosporas con la bacteria B. subtilis (cultivo de
6 días).

1. Tomar el asa bacteriológica y esterilizarla a la llama. Enfriarla en la proximidad del

mechero.
2. Tomar el cultivo de la bacteria B. subtilis en tubo y abrirlo cerca del mechero. Tomar
con el asa una porción del cultivo que ha crecido sobre la superficie y cerrar el tubo
(flamear la apertura del tubo antes de cerrarlo).
3. Realizar un frotis y fijar a la llama.
4. Aplicar colorante Verde de Malaquita sobre el frotis y dejar por 10 minutos.
5. Calentar el frotis hasta emitir vapores durante 3 minutos. No dejar que el colorante
llegue a secarse. Si se comienza a secar, agréguele más colorante.
6. Lavar con agua durante unos 20 segundos.
7. Aplicar colorante Safranina sobre el frotis y dejar durante 30 segundos.
8. Lavar con agua, secar con cuidado y observar con el lente de 100x.
9. Observar y hacer esquemas.

Resultados: en la coloración se observa estructuras de color verde que corresponde a las

endosporas; ese color es debido al colorante primario que es el verde de malaquita. Las formas
vegetativas se observan de color rosado debido al colorante de contraste safranina.

Técnica de la coloración de Cápsulas (Método de Anthony).

Cada estudiante realizará la técnica de tinción de cápsulas con la bacteria Escherichia coli.

1. Tomar el asa bacteriológica y esterilizarla a la llama. Enfriarla en la proximidad del

mechero.
2. Tomar el cultivo de la bacteria Lactobacillus ó Escherichia coli en tubo y abrirlo cerca del
mechero. Tomar con el asa una porción del cultivo que ha crecido sobre la superficie y
cerrar el tubo (flamear la apertura del tubo antes de cerrarlo).
3. Realizar un frotis, secar al aire y NO FIJAR a la llama.
4. Aplicar colorante Cristal Violeta (solución acuosa) sobre el frotis y dejar por 2 minutos.
5. Lavar la preparación con una solución de Sulfato de Cobre (SO4Cu).
6. Secar al aire en posición vertical y examinar con lente de inmersión.
7. Observar y hacer esquemas.

Resultados: al observar al microscopio la coloración, las capsulas aparecen como halos

ligeramente traslucidos y las bacterias aparecen teñidas de color azul.

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Técnica de la coloración de Cápsulas (Método de tinta china).

1. Coloque una gota de tinta china en una lámina portaobjetos.

2. Coloque dos asadas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae o Lactobacilus acidophillus
en la lámina y mézclela adecuadamente con la gota de tinta china.
3. Con ayuda de otra lámina extienda la gota (Fig. ).
4. Descarte la lámina que utilizó para extender el frotis adecuadamente.
5. Dejar secar cerca del área del mechero y fijar cuidadosamente en el mechero.
6. Coloree durante un minuto con una solución acuosa de safranina al 1%.
7. Lavar con agua corriente y dejar secar.
8. Examine la lámina bajo el objetivo de inmersión ye esquematice sus resultados.

Fuentes de consulta

Ávila, BD. 2007. Manual de Prácticas de Laboratorio. Universidad de El Salvador. Facultad de

Ciencias Agronómicas. Departamento de Protección Vegetal. San Salvador. 73 p.

Brock, TD; Madigan MT. 1993. Microbiología. Prentice Hall. 6° ed. México. 956 p.

Manacorda, AM. et. al. 2005. Manual Práctico de Microbiología. Departamento de Ciencias del
Ambiente.

Microbiología General. Guion de prácticas. Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales.

UPNA/CSIC. 45 p.

Pelczar; Reid; Chain. 1982. Microbiología. 2° ed. McGraw-Hill. México, D. F. México. 773 p.

Prácticas de Microbiología. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca.

34 p.

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ANEXOS

Figura 1. Pasos en la tinción selectiva de endosporas.

Figura 2. Izquierda: observación al microscopio de endosporas (verde). Derecha: observación al

microscopio de cápsulas bacterianas (halo traslúcido alrededor de bacterias).

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Figura 3. Proceso de coloración de endosporas (verde) y células vegetativas (rosado).

Figura 4. Composición estructural de una endospora bacteriana

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Figura 5. Etapas en el ciclo de vida de bacterias productoras de endosporas (desarrollo vegetativo

y esporogénesis)

Figura 6. Elaboración de frotis con lámina portaobjetos para observación de cápsula mediante la
técnica de tinta china.

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