UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE MEDICINA “JOSÉ MARIA VARGAS”
CÁTEDRA DE HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA NORMAL

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

La histología se define como la rama de las ciencias morfológicas, que se encarga del
estudio de las células, tejidos y órganos.
Para poder realizar tal estudio se cuenta con un instrumento especial: EL
MICROSCOPIO, el cual puede ser óptico, electrónico, de contraste de fases, campo
oscuro, de fluorescencia, de interferencia. Para poder observar un tejido a través de él, la
muestra debe ser procesada bajo una serie de requisitos de preparación, los cuales
dependerán del microscopio a utilizar, luego: EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS
DESTINADOS A OBTENER LAS PREPARACIONES HISTOLÓGICAS SE
DENOMINA: TÉCNICAS HISTOLÓGICAS, Y LA CIENCIA ESTUDIA LOS
FUNDAMENTOS TÉCNICOS Y LA SECUENCIA DE MANIPULACIONES
NECESARIAS PARA LLEVAR A CABO EL ANÁLISIS DE LOS TEJIDOS DE
LOS SERES VIVOS SE LLAMA HISTOTECNOLOGIA.

Según la procedencia de los tejidos y la finalidad de su estudio, podemos distinguir entre

material histológico y material anatomopatológico; el primero es todo tejido obtenido de un
individuo ó animal sano, con la finalidad de estudiar su estructura y composición normal,
mientras que el segundo se trata de muestras provenientes de individuos ó animales
enfermos, con la finalidad de diagnosticar el proceso patológico que presenta.

Para poder llevar a cabo este estudio microscópico, las muestras pueden ser observadas
mediante: Examen Inmediato ó al fresco Examen Mediato ó Postmorten. Se entiende por
examen inmediato, al fresco ó estudio citohistológico vital, aquel estudio citológico y
histológico que se realiza sobre células ó tejidos vivos sin que estos hayan sido separados
del ser que los contiene, ejemplo la observación de la micro circulación sanguínea sobre un
lecho capilar traslúcido, debido a su dificultad se efectúa muy pocas veces. Hay autores que
utilizan el término de Estudios Supravitales; los cuales consisten en el estudio de las células
ó tejidos aún vivos pero separados del organismo del que proceden, ejemplo de esto
tenemos en el estudio de la gota gruesa y la técnica en medios de cultivo. Otro tipo de
estudio inmediato es aquel en el cual se toma la muestra (tejido ó liquido corporal) y se
coloque entre una lámina porta y cubre objetos y se observa al microscopio, las estructuras
allí detalladas dependen de las diferencias entre los índices de fracción de los diferentes
componentes celulares, lo cual nos permite tener una idea somera y rápida de los elementos
constituyentes de la muestra y presencia ó no de los agentes patógenos, sin embargo estos
métodos tienen limitaciones: la limitada capacidad para detallar estructuras y las
preparaciones son poco duraderas.
Podemos concluir aquí con la definición de Vialleton: “Por examen inmediato se entiende
la observación microscópica de elementos anatómicos, hecha directamente sobre elementos
vivos ó al menos en estado lo más próximo posible al que presenten durante la visa”

El examen Mediato ó Postmorten, para algunos autores postvitales, es aquel método en el

cual se somete al tejido a una serie de procedimientos complejos con la finalidad de detallar
las estructuras celulares y tisulares, es el llamado método de cortes.

Se entiende por biopsias a una porción de tejido obtenido de un individuo vivo para su
estudio anatomopatológico mientras que extensión citológica o frotis: Es el conjunto de
células procedentes de un tejido y extendidas sobre un porta – objetos, cuando se obtienen
este conjunto de células de un tejido sobre porta – objetos producto del contacto directo de
este con la superficie de corte de órgano sin que sea preciso el raspado o exfoliación previa
del mismo, hablamos que la preparación así obtenida se llama impronta.

ETAPAS PARA OBTENER PREPARACIONES HISTOLÓGICAS PARA M.O.

1.- Obtención del material:

Es importante que toda muestra a estudiar debe ser descrita exhaustivamente donde se
señale: dimensiones, peso, color, forma, presencia o no de lesiones (descripción de la
misma) relación con estructuras vecinas, consistencia, presencia de formaciones quísticas,
hemorragia ó necrosis. Luego debe realizarse un buen muestreo es decir seleccionar las
áreas más representativas de las mismas y dichas muestras deben de tener un espesor no
mayor de 3-5 milímetros, para facilitar la fijación y la impregnación con parafina y un largo
y ancho que permite ser colocado en la lámina porta – objetos.

2.- FIJACIÓN:
La vida es un proceso dinámico por el que el organismo completa su ciclo biológico y
muerte es un nivel metabólico a partir del cual las células no son capaces de recuperar sus
funciones vitales (punto de no retorno). Dentro del conjunto de fenómenos que se llevan a
cabo después del punto de no retorno, deben señalar al proceso de autólisis al proceso auto
digestión enzimática que se lleva a cabo luego del punto de no retorno por la ruptura de la
membrana lísosomial, con la siguiente salida del contenido lisosomial al citoplasma. Se
extiende por putrefacción, el efecto ejercido por agentes tóxicos y enzimas bacterianas
sobre los tejidos, que actúan junto con la autólisis y llevan a la destrucción total de la
célula.

Se denomina Fijación Tisular, al proceso mediante el cual se interrumpe ó se impide la

degradación tisular (autólisis y putrefacción). Luego de la manera más simple, podemos
decir que la fijación significa conferir estabilidad a los tejidos, sin embargo la mejor
definición es la da por Lynch en 1972: “LA FIJACIÓN ES EL PROCESO MEDIANTE
EL CUAL SE LE CONFIERE ESTABILIDAD Y PRESERVA LOS ELEMENTOS
CONSTITUTIVOS DE LA CÉLULA Y POR TANTO DE LOS TEJIDOS, EN
CUANTO A SU ESTRUCTURA FÍSICA Y PARCIALMENTE EN SU ESTADO
QUÍMICO”
 PROPÓSITOS DE LA FIJACIÓN

a.- Prevenir ó detener la autólisis.

b.- Prevenir la composición bacteriana – putrefacción.
c.- Coagular el tejido, para evitar la pérdida de sustancia.
d.- Fortalece y protege los tejidos contra los defectos deletéreos de los diferentes pasos de
la preparación del tejido.
e.- Deja a los tejidos en condiciones que permitan diferenciar estructuras mediante
tinciones y coloraciones especiales.
Se entiende por fijador a toda una sustancia que permita la conservación del tejido tanto a
nivel físico (macro y micro) como químico de la célula.

Conservador es toda sustancia en la que puede permanecer el tejido por tiempo prolongado,
sin que sucedan modificaciones en su estructura.

CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES FIJADORES

Se clasifican de manera general en dos grupos:

a.- Fijadores por métodos físicos: Frío y Calor.
b.- Fijadores por métodos químicos: Coagulantes, No coagulantes, mixtos.

La fijación por métodos físicos son de la elección para la realización de estudios

morfológicos ó funcionales, en los que se requiere contenido enzimático, la clave de este
método (Frío), es que la congelación sea rápida ya que el enfriamiento lento forma
microcristales intratisulares de hielo.

Los fijadores por métodos químicos se clasifican dependiendo del método de acción sobre
las proteínas.

 Coagulantes: son los que se combinan con las proteínas para hacer un compuesto
insoluble. Ej. Ácido Tricloroacético, Ácido Pieríco, Cloruro de Mercurio y las que
desnaturalizan a las proteínas. Ej. Alcohol Absoluto.
 No coagulantes: actúan mediante la polimerización de las proteínas, es decir
mediante la formación de complejos de adicción, creando enlaces entre las
moléculas de proteínas. Ej. Formalina y Ácido acético.
 Mixtos: reúnen ambas características. Ej. Solución Acética de Zenker, solución
fórmica de Zenker, solución de Carnoy y liquido de Bouin.

Cada fijador tiene un período de tiempo mínimo para llevar a cabo la fijación. Este
período viene condicionado por varios factores, así como: pH, temperatura, modo de
acción densidad del tejido y espesor del espécimen. La influencia del pH y la
temperatura varia con cada fijador. Con respecto al espesor de la muestra, se dice en
general que la mayoría de las veces una fijación inadecuada es producto del excesivo
grosor de la pieza, debiendo colocarse la misma en un volumen de fijador igual a 20
veces el volumen de la muestra.
 FIJADORES MÁS COMUNES

FORMALDEHÍDO-FORMALINA-FORMOL: (Gas ó Sólida) Es el fijador más

frecuente utilizado por su costo y su calidad que es bastante aceptable. Esta solución
produce ácido fórmico durante su almacenamiento por lo que se recomienda
neutralizarla con magnesio ó carbonato de calcio ó más satisfactoriamente con la
adición de sales buffer. No es recomendable utilizarla en solución concentrada y es
necesario diluirla en solución salina (fisiológica) ó en soluciones salinas buffer en una
proporción de 10 partes de formalina y 90 partes del diluyente, es decir el 10%. Es de
acción lenta a temperatura ambiente, penetra a razón de 1 cms por hora. Fija bien el
material a nivel óptico y tiene la desventaja de producir precipitado formólico.

Liquido de Bouin: es un buen fijador en general, es un preparado de formol con ácido

pírico, es costoso, de acción rápida permite un buen detalle nuclear y es recomendable
para la fijación de tejidos que serán sometidos a coloraciones tricrómicas, no se
recomienda dejar el material mucho tiempo en fijación ya que lo reseca y endurece.

Lavado Post-fijación: es el aclarado que se realiza a la muestra después de la fijación

para eliminar el exceso de fijador y evitar el precipitado del mismo así como evitar la
incompatibilidad entre el fijador y el elemento a utilizar en el paso siguiente del
procesamiento de la muestra.

4.- Deshidratación:

Para poder cortar los tejidos en secciones de 5 micras de espesor, hay que conferirle
rigidez, lo cual se logra mediante dos métodos:
a. El más rápido que es mediante la congelación de la muestra para lo cual se necesita
el paso Nº 2 (fijación).
b. El que sustituye todo el agua del tejido por una sustancia rígida como la parafina, la
celoidina ó las resinas. En general los medios de inclusión no son hidrosolubles, por
lo que se necesitara eliminar el agua del tejido mediante la deshidratación del
mismo, para lo cual se pasa la muestra en 7 alcoholes de concentraciones crecientes,
hasta que el agua sea remplazada por el alcohol. Este paso debe producirse poca ó
ninguna retracción del tejido. La buena deshidratación depende de la buena calidad
del alcohol, de la adecuada concentración del mismo, así como del tiempo de
permanencia en cada uno de los alcoholes que por lo general no debe ser menor de
1 hora cada uno.
Las condiciones esenciales de un buen agente deshidratante son:
a. No debe alterar las estructuras tisulares.
b. Debe perder mezclarse con el reactivo intermedio ó aclarante. El alcohol preferido
para deshidratación es el alcohol etílico ó absoluto, otros deshidratantes son:
Alcohol metílico, acetona (aumenta mucho la fragilidad del tejido), alcohol butílico
(es miscible con la parafina por lo que se puede prescindir del agente aclarante),etc.

5.- CLARIFICACIÓN O DESALCOHOLINIZACIÓN:

Su finalidad no es como su nombre lo indica, el hacer transparente al tejido no en este
caso en particular, se necesita de una sustancia que sea soluble con la parafina y el
alcohol. La parafina es una sustancia insoluble en agua y poco soluble en alcohol, de
aquí que se utilice una sustancia intermedia miscible con el alcohol y la parafina. Se
utilizan 3 Xiloles, una hora en cada uno previo pasaje por una solución de Alcohol –
Xilol. Sustancias clarificantes:

 Xilol: buen clarificante, de acción rápida, endurece poco los tejidos (sino
permanece largos periodos).
 Tolueno: buen clarificante produce menos retracción y endurecimiento que el xilol.
 Cloroformo: es ideal para SNC y los ganglios. No produce retracción ni
endurecimiento, pero es muy caro.
 Nota: Los buenos agentes aclarantes deben eliminar pronto el alcohol y aclarar
rápidamente el tejido sin endurecimiento del mismo.

6.- IMPREGNACIÓN:

Este paso tiene `por objeto rellenar por completo los espacios intra y extracelulares
inicialmente llenos de agua, con parafina para así proporcionar a la muestra
homogeneidad y dureza que favorezcan la obtención de secciones finas de calidad, sin
provocar distorsión y sin alterar las relaciones especiales del tejido y de los elementos
celulares. Se dan dos baños de parafina de 45 minutos cada uno.

7.- INCLUSIÓN:

Consiste en la obtención de un bloque sólido que permita obtener cortes finos y

conserve la muestra por tiempo prolongado.

Medios de Inclusión:

a. Parafina: es el más frecuente utilizado.

b. Celoidina.
c. Doble inclusión Parafina- Celoidina.
d. Resinas: se utilizan cuando se desean realizar cortes muy finos menores a 2 micras.

8.- CORTE Y MONTAJE:

Se lleva a cabo los micrótomos. Se practican secciones de 4-6 micras de espesor, luego
se colocan los cortes en el baño de maría ó de flotación el cual nos va a permitir estirar
los cortes (agua a 60º con gelatina o albúmina de huevo); los cortes se montan en los
portaobjetos y se colocan en la estufa a 60 y 70º durante a 20 a 30 minutos. En la estufa
se elimina el exceso de parafina y simultáneamente el corte se adhiere a la lámina.
 9.- COLORACIÓN:

Coloración de rutina con H-E: Batería:

 Dos xiloles.
 Tres alcoholes.
 Hematoxilina de Meyer o Harris.
 Agua ácida o amoniacal: Para la hematoxilina de Harris y agua sola para llevar la
Hematoxilina de Meyer. (Diferenciación)
 Eosina.
 Tres alcoholes.
 Tres xiloles.

a. Xiloles: Sirven para desparafinar o eliminar el resto de parafina que está dentro del
material.
b. Alcoholes: Se utilizan de manera decreciente para hidratar la muestra, ya que los
colorantes son elementos hidrosolubles.
c. Agua: Se debe lavar la muestra para eliminar el exceso de alcohol y terminar de
hidratarla. Por otra parte actúa como mordiente para las hematoxilinas de alumbre y
simultáneamente prepara el material para la hematoxilina coloree mejor.
d. Hematoxilina: Colorante nuclear básico, colorea el núcleo porque tiene afinidad
por las estructuras ácidas.
e. Diferenciación: Proceso mediante el cual la Hematoxilina reafirma su coloración y
se elimina la misma del resto del tejido. Primero se pasa por agua para eliminar el
exceso de colorante. Nota: Cuando la Hematoxilina utilizada es la Meyer solamente
utilizamos agua, pero cuando se usa la de Harris (que son las dos más utilizadas),
primero se usa y luego agua ácida, en este caso ambos pasos (agua sola y agua
ácida) eliminan el exceso de colorante: seguidamente se lava con agua amoniacal,
para evitar que siga actuando la Hematoxilina y por último nuevamente se lava con
agua solamente. Se usa cheques la coloración nuclear al microscopio, los cuales
deben estar teñidos de azul violeta.
f. Eosina: Colorante citoplasmático, ácido. Colorea el citoplasma de rosado.
g. Alcoholes: Tres alcoholes de manera creciente, que nos permite eliminar el exceso
de eosina y simultáneamente deshidratar la muestra.
h. Xiloles: Tres xiloles, los cuales cumplen la función de aclaración, fijación del
colorante y lo prepara para montar el corte con el bálsamo preservador.
i. Colocación de cubreobjetos: Se coloca el bálsamo y el cubreobjetos.

Conceptos:

Colorante: Toda sustancia que tiñe, producto de su capacidad de fijarse ó cambiarse con
una estructura celular y además tiene la capacidad de absorber una determinada longitud de
onda de la luz.

Coloración: Es la incorporación del colorante al tejido,.

Impregnación: Se utiliza este término para definir el precipitado de una sal por ejemplo
Nitrato de Plata, sobre algún elemento del tejido.

Ortocromacia: Cuando el componente tisular toma el mismo color que el colorante .

Metacromasia: Cuando el componente tisular producto de su constitución ó de su

distribución de cargas polares, toma un color diferente al del colorante.

Alocromasia: Cuando el tejido toma diferentes tonalidades, debido a la presencia de

diferentes agentes tintoriales.

Coloración especifica: Se basa en la identificación de diferentes elementos producto de

reacciones químicas conocidas. Es la base de la Histoquímica.

Coloración directa: Cuando un tejido en presencia de soluciones simples toma color.

Mordiente: Es la sustancia que tiene afinidad por el colorante y por un componente tisular,
actuando como intermediario entre el colorante y el tejido.

Coloración indirecta: Es aquella que necesita de la presencia de un mordiente para

llevarse a cabo.

Coloración ácido: Es aquel colorante capaz de formar una unión salina con un grupo
tisular cargado positivamente, de aquí que el colorante está cargado negativamente Ej.
Eosina, Orange G, Floxina.

Colorante básico: Es aquel colorante capaz de formar una unión salina con un grupo
tisular cargado negativamente, es decir el colorante está cargado positivamente, Ej.
Hematoxilina, Fucsina básica, Azul de Tolouidina, Azul de Metileno.

Acidofilia: Es la capacidad que tiene un componente tisular de combinarse con un

colorante ácido.

Basofilia: Es la capacidad que tiene un componente tisular de cambiarse con un colorante

básico.

Diferenciación: Es la eliminación selectiva del colorante, generalmente sí el colorante es

básico se logra con una solución ácida y viceversa.

COLORANTES HABITUALES ESPECIALES

Dada la necesidad de estudiar una o varias estructuras en un corte histológico, se crean las
coloraciones tri-tetra pentacromáticas, las cuales se hacen sobre la base del uso de 3-4-5
colorantes diferentes, los cuales son capaces de diferenciar el mismo número de elementos.
Otros tipos de coloraciones especiales son las utilizadas para identificar elementos como
grasas, glucógeno ó microorganismos patógenos.
Tricrómico de Gomori: Es especifico para las mucinas sulfatadas, se utiliza para la
identificación de fibras colágenas.

Resultados: Núcleos: Azul negruzco / Negros (Hematoxilina férrica) Fibras musculares,

Fibrina citoplasma: Rojo (Cromotopo 2 R) colágeno, Cartílago, Mucina y Membranas
basales: verde (verde rápido).

Tricrómico de Van Gieson: Es un método útil y sencillo, se utiliza para la identificación

de fibras colágenas.

Resultados: Núcleos: Negros (Hematoxilina Férrica) Citoplasma: Amarillo (Ácido

Picrico) Colágeno: Rojo (Fucsina ácida)

Tricrómico de Mallory: Se utiliza para la identificación de tejido conjuntivo.

Resultados: Núcleos rojo (Azocarmín G) citoplasma, fibras musculares: Naranja rojizo

(Naranja G) Colágeno: Azul (Azul Anilina)

Coloraciones para Hongos: Los hongos son microorganismos vegetales que pueden
causar enfermedades en determinadas condiciones y de acuerdo a su morfología se
clasifican en: Hifas (filamentos), esporas y filamentos con esporas. La coloración más
frecuente utilizada es el método de Grocott.

Resultados:
Hongos: Negro
Tinción de fondo: Verde pálido
Mucina gris: