UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA – INGENIERIA DE ALIMENTOS

Biotecnología Alimentaria
2012

LABORATORIO N°1
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES (MÉTODO ACIDO 3,5-DINITROSALICÍLICO - DNS)

1. OBJETIVOS
Aplicar una técnica sencilla, rápida y eficaz para determinar azúcares reductores en caldos y medios de
fermentación que permitan conocer los rendimientos en sustrato y/o productos.

2. ALCANCE
Esta técnica es aplicable a todos los procedimientos de sistemas de cultivos de medios líquidos y sólidos
cuya molécula de sustrato sean azúcares reductores como glucosa, xilosa, entre otros.

3. CONTENIDO

3.1 GENERALIDADES
 Es un método conveniente y relativamente barato, aunque de baja especificidad
 Altas concentraciones de proteínas interfieren en la determinación de los azúcares
reductores
 La curva de calibración que se hace, es específica para cada volumen de reactivo de DNS
preparado, al agotarse este debe hacerse una nueva curva de calibración
 Los tubos deben sumergirse en el agua en ebullición y baño de hielo en un solo grupo a fin
de garantizar homogeneidad en la reacción

3.2 DESCRIPCIÓN

1.1.1. Principio del método

Este método nos ayuda a determinar la presencia de grupos carbonilos libres (C=O) en los también
llamados azúcares reductores. Esto involucra la oxidación del aldehído presente en el grupo funcional.
Simultáneamente, en presencia de calor el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) se reduce a ácido 3-amino,5-
nitrosalicílico bajo las condiciones alcalinas, desarrollándose un color amarillo café:

oxidación
grupo aldehído grupo carboxilo

reducción
DNS ácido 3-amino,5-nitrosalicílico

Se adiciona sulfito (no necesario para la reacción del cambio de color) en el reactivo para absorber el
oxígeno disuelto, ya que éste puede interferir con la oxidación de la glucosa.

En la reacción se muestra que una mol de azúcar reaccionará con una mol de DNS. Sin embargo, no cabe
duda que se dan muchas otras reacciones, y la estequiometria de la reacción es mucho más complicada
que lo previamente descrito. El tipo de reacción lateral depende de la naturaleza exacta del azúcar
reductor. Diferentes azúcares reductores arrojan distintas intensidades de color; así, se hace necesario
calibrar para cada azúcar. Además de la oxidación de los grupos carbonilos en el azúcar, otras

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reacciones laterales como la descomposición de azúcar también compiten para la disponibilidad del
ácido 3,5-dinitrosalicílico. Como consecuencia, la carboxymetil celulosa puede afectar la curva de
calibración alterando la intensidad del color desarrollado.
Cuando los efectos de compuestos extraños no son conocidos, uno puede incluir efectivamente el
llamado control interno para el desarrollo del color en muestras desconocidas; entonces, una cantidad
conocida de azúcar se adiciona a esta muestra. El aumento en la absorbancia en el segundo desarrollo
de color es equivalente a la cantidad incrementada de azúcar.

1.1.2. Equipos, reactivos y materiales

Equipos
Balanza analítica, espátula, espectrofotómetro, estufa con agitación, vortex, micropipeta

Reactivos
Solución del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) al 1%. (Ver anexo 1). Debe ser almacenado en frasco oscuro
y a 4ºC, agua destilada, solución estándar de glucosa de 1000ppm.

Materiales
Matraz aforado de 1000 ml, 6 tubos de ensayo tapa rosca de 15 ml, papel aluminio, frasco color ámbar,
beaker de 1000 ml, puntas plásticas, pipetas de 5, 1 y 10 ml.

1.1.3. Desarrollo del método

Establecer una escala estándar de 0 a 1000 ppm a partir de la solución de glucosa previamente
preparada. Dentro de una serie de tubos de ensayo, previamente lavados y sumergidos en solución de
ácido sulfúrico al 5% durante una noche, introducir: 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; y 1 ml de solución estándar y
completar a 1 ml con agua destilada. Elabore la siguiente tabla al momento de registrar los datos:

Tubo ml. de s/n ml. de agua Concentración final Absorbancia

estándar glucosa destilada (ppm) (575 nm)
1 0.0 1.0 0
2 0.2 0.8 200
3 0.4 0.6 400
4 0.6 0.4 600
5 0.8 0.2 800
6 1.0 0.0 1000

La determinación de azúcares reductores es efectuada sobre 1 ml de la muestra convenientemente

diluida. La curva estándar y las muestras a analizar siguen el procedimiento descrito, así:

1. Tomar 2 ml de muestra (fermentación)

2. Centrifugar a 8000 rpm durante 10 minutos
3. Tomar 500 µl de CADA TUBO DE LA CURVA (sobrenadante muestra fermentación) y colocarlos en
un tubo de ensayo
4. Adicionar 500 µl del reactivo DNS
5. Agitar fuertemente en un vortex
6. Poner en un vaso de precipitado con agua en ebullición durante 5 minutos
7. Enfriar rápidamente (baño de hielo)

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8. Adicionar 5 ml de agua destilada dentro de cada tubo

9. Agitar fuertemente en un vortex y dejar en reposo por 10 min
10. Leer absorbancia a 575 nm.
11. EL blanco de la reacción son 500 µl de agua destilada sometida a los pasos de 4 en delante de este
protocolo.

4. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
 Grafique la curva de calibración (Concentración vs Absorbancia) para la determinación de azúcares
reductores con el método del DNS. Muestre todos los resultados obtenidos. Calcule el valor de R 2.
 Calcule la concentración en azúcares reductores (Glucosa) de la muestra problema.
 Consulte otros métodos utilizados para la determinación de azúcares reductores y glucosa. ¿Qué
ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnología?.

ADVERTENCIA!

El reactivo DNS es altamente tóxico, cancerígeno y abortivo. Mucho cuidado al manipularlo. Usar
siempre guantes.

5. REFERENCIAS:

 MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analyt Chem.
1959; p. 31, 426-429. En: RAIMBAULT, Maurice. Manual de Laboratorio: Métodos Físicos, Químicos
y Microbiológicos. Cali, Colombia: ORSTOM – UV, 1994; p. 1-3.
 WANG, Nam Sun. Biochemical Engineering Laboratory Manual. University of Maryland. Deparment
of Chemical Engineering. 1999.

4. ANEXOS

Solución de glucosa anhidra (1g/l): disolver 1 g de glucosa y aforar hasta 1000 ml con agua destilada.

Reactivo ácido 3,5-dinitrosalicílico: se elabora a partir de las siguientes soluciones tal como se describe
a continuación: Solución de NaOH 2N (80 g de NaOH y aforar hasta 1L agua destilada), solución de 3,5-
DNS (10 g de ácido dinitrosalicílico, hasta 200 ml de NaOH 2N), solución de tartrato sódico potásico
(402,7 g de Tartrato NaK-4H2O, hasta 500 ml de agua destilada). El reactivo se prepará mezclando 200
ml de la solución de 3,5-DNS, 500 ml de la solución de Tartrato de NaK, y completar con agua destilada
hasta 1000 ml.

LABORATORIO N°2
FERMENTACIÓN ALCOHOLICA EN LEVADURAS

1. OBJETIVO

Aplicar una técnica rápida y sencilla para evidenciar el proceso de fermentación alcohólica, que son
capaces de llevar a cabo las levaduras del género Saccharomyces.

2. DESCRIPCIÓN

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2.1 Principio del método

La fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleta, totalmente anaeróbico, siendo el
producto final un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos
tipos de fermentaciones. Fue descubierta por Louis Pasteur, que la describió como la vie sans l´air  (la
vida sin el aire). La fermentación típica es llevada a cabo por las levaduras.
El proceso de fermentación es anaeróbico ya que se produce en ausencia de oxígeno; ello significa que
el aceptor final de los electrones del NADH producido en la glucólisis no es el oxígeno, sino
un compuesto orgánico que se reducirá para poder reoxidar el NADH a NAD+. El compuesto orgánico
que se reduce (acetaldehído, piruvato, ...) es un derivado del sustrato que se ha oxidado anteriormente.
En los seres vivos, la fermentación es un proceso anaeróbico y en él no interviene la mitocondria ni
la cadena respiratoria. Son propias de los microorganismos, como algunas bacterias y levaduras.
También se produce la fermentación en la mayoría de las células de los animales (incluido el hombre),
excepto en las neuronas que mueren rápidamente si no pueden realizar la respiración celular; algunas
células, como los eritrocitos, carecen de mitocondrias y se ven obligadas a fermentar; el tejido
muscular de los animales realiza la fermentación láctica cuando el aporte de oxígeno a
las células musculares no es suficiente para el metabolismo aerobio y la contracción muscular.
Desde el punto de vista energético, las fermentaciones son muy poco rentables si se comparan con
la respiración aerobia, ya que a partir de una molécula de glucosa sólo se obtienen 2 moléculas de ATP,
mientras que en la respiración se producen 36. Esto se debe a la oxidación del NADH, que en lugar de
penetrar en la cadena respiratoria, cede sus electrones a compuestos orgánicos con poco poder
oxidante.
La fermentación alcohólica ocurre en levaduras, ciertos hongos y algunas bacterias, produciéndose CO 2 y
alcohol etílico (etanol); ambos productos se usan en la producción de pan, cerveza y vino.

En la fermentación alcohólica dada bajo condiciones anaeróbicas, se produce bióxido de carbono y

alcohol etílico (etanol). El bióxido de carbono crea la efervescencia en la cerveza y hace que el pan
“suba” dentro del horno. El etanol que se produce es el alcohol presente en la cerveza y los vinos.

En este laboratorio se usarán varias soluciones de carbohidratos para determinar cuáles pueden
metabolizarse mediante la fermentación.

Ácido pirúvico acetaldehído +

CO2
 
acetaldehído + NADH + H+ etanol
+ NAD+
2.2 Equipos, Reactivos y materiales
Equipos
Vortex, micropipetas, Balanza

Reactivos
Azúcar o melaza

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Soluciones de sacarosa, maltosa, galactosa y lactosa (7%)- 70g/L

Suspensión de Levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae)
Solución de Fluoruro de sodio 5%

Materiales
Erlenmeyers de 200 ml, Balones aforados de 100 ml, Pipetas de 1, 5 y 10 ml, Beaker 200 ml, Varillas de
agitación, tubos de ensayo medianos boca ancha, gradilla, papel de parafina (parafilm), pipetas pasteur.
2.3 Desarrollo del método

2.3.1 Preparación de Reactivos

SUSPENSIÓN DE LEVADURA:
Preparar en el laboratorio una suspensión de levadura tomando 2 g de azúcar o melaza en 100 ml de
agua tibia, luego de tener completamente disuelto el azúcar, se adicionan 5 g de levadura de pan
Saccharomyces cerevisiae.

ADVERTENCIA!: No tener el agua demasiado caliente porque se afectan las células del cultivo.

SOLUCIÓN DE GLUCOSA:
Pesar 7 gr. de glucosa y disolverla en el H2O destilada hasta completar un volumen de 100ml.

SOLUCIÓN DE MALTOSA:
Pesar 7 gr. de maltosa y disolverla en el H 2O destilada hasta completar un volumen de 100ml.

SOLUCIÓN DE GALACTOSA:
Pesar 7 gr. de maltosa y disolverla en el H 2O destilada hasta completar un volumen de 100ml.

SOLUCIÓN DE LACTOSA:
Pesar 7 gr. de lactosa y disolverla en el H2O destilada hasta completar un volumen de 100ml

2.3.2 Procedimiento
Rotule seis tubos de ensayo del 1 al 6, posteriormente añada y mezcle bien lo siguiente:

Tubo 1: 3 ml de la solución de glucosa y 3 ml de la suspensión de levadura.

Tubo 2: 3 ml de la solución de maltosa y 3 ml de la suspensión de levadura.

Tubo 3: 3 ml de la solución de galactosa y 3 ml de la suspensión de levadura.

Tubo 4: 3 ml de la solución de lactosa y 3 ml de la suspensión de levadura.

Tubo 5: 3 ml de agua destilada y 3 ml de la suspensión de levadura

Tubo 6: 3 ml de la solución de glucosa, 3 ml de la suspensión de levadura y 3 ml de Fluoruro de sodio.

A continuación realice el siguiente protocolo para cada tubo:

I. Llene una pipeta graduada de 1 ml con la solución del tubo.
II. Tape el extremo con el dedo mientras sella el lado opuesto con papel de parafina.

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III. Con la ayuda de la pipeta Pasteur, continúe llenando la pipeta graduada hasta que se
desborde el contenido.
IV. Invierta la pipeta colocándola en el tubo de ensayo.

Durante la fermentación el CO2 subirá y se acumulará en el extremo superior de la pipeta.

Anote la producción de CO2 a intervalos de 5 minutos durante 30 minutos y anótelo en la siguiente
tabla:

Tabla 1. Medición de la producción de CO2 durante la fermentación

Tiempo (min) TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6
5
10
15
20
25
30

3. CÁLCULOS Y CONSULTAS

 ¿Cuál fue la producción final de CO2 (ml/30 min) para cada tubo?
 ¿Qué tipo de fermentación ocurrió?
 ¿Puede la levadura usar diferentes carbohidratos para la fermentación? Explique.
 ¿Qué sucedería si no sella con parafina el extremo superior de la pipeta?
 ¿Por qué hay diferencia en la fermentación de los carbohidratos usados?
 ¿Qué influencia tiene el NaF en el proceso de fermentación y por medio de qué mecanismo lo hace?
 Grafique la curva de producción de CO 2 vs tiempo para cada una de las soluciones evaluadas.
Explique la curva.

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