UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS-ESPE

DEPARTAMENTO DE LAS CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
GENÉTICA
Laboratorio de Genética: Extracción de ADN
INTEGRANTES:
APOLO NICOLÁS
JÁCOME PATRICIA
POAQUIZA ANDREA
QUISHPE DAMIÁN
TERÁN PAUL
NRC: 2808

DOCENTE:
THELVIA ISABEL RAMOS GÓMEZ, PH.D.
PERIODO:
NOVIEMBRE 2020-ABRIL2021
1. Resumen

Se estudiaron y establecieron diferencias entre los métodos de Salting Out y la

extracción de ADN a partir de los Kits QlAamp DNA mini y blood mini kit. Ambos
métodos pueden emplearse para la extracción de ADN a partir de muestras de sangre
humana. Y finalmente se identificó la función correspondiente para cada uno de los
reactivos empleados en su respectivo método.

2. Introducción

La extracción del ADN de cualquier organismo es un proceso que se aborda mediante

marcadores moleculares o segmentos de ADN que nos proporcionan información sobre
la variación alélica y no permite comprender la variación genética entre individuos,
poblaciones y especies; de tal manera que se logre explicar patrones y procesos
evolutivos. Dichos marcadores se obtienen a partir de técnicas como la PCR (Reacción
en Cadena de la Polimerasa) y secuenciación (Cornejo, Serrato, Rendón, & Gracíela,
2014).

Es importante que el procedimiento para la extracción de ADN pueda realizarse sin

mucho esfuerzo en un laboratorio, que se obtenga con una suficiente concentración y
pureza en poco tiempo y que este procedimiento no sea costoso. Todas estas
necesidades deberán de estar bien cubiertas ya que la obtención de ADN libre de
contaminantes como proteínas o ARN es necesaria para el desarrollo de distintas
aplicaciones en biotecnología (Cadavid, Ramírez, López, Mambuscay, 2009).

3. Objetivos

Objetivo General

Comprender el proceso de extracción de ADN a partir de muestras de sangre

mediante la comparación de dos metodologías distintas.

Objetivos específicos

● Aprender las directrices necesarias para el desarrollo de una correcta extracción

de ADN a partir de una muestra de sangre.
● Analizar las dos metodologías disponibles y establecer sus principales
diferencias.
● Reconocer la correspondiente función de cada reactivo empleado en los
procedimientos.

4. Materiales

4.1. Video: DNA extraction from Blood

Equipos:

 Amplificador Kaya
 Vórtex
 Centrífuga
 Cámara de calentamiento
 Nanodrop-espectrofotómetro
 Transiluminador
 Campana de PCR o laminar

Insumos:

 Microtubos
 Micropipetas

Reactivos:

 Solución de lejía al 10%

 Proteinasa K.
 Etanol al 70%
 Buffer AW1 y AW2
 Buffer AE

Muestra:

 Sangre periférica humana.

4.2 Guía de laboratorio (Extracción de ADN a partir de muestra de sangre

periférica)

Insumos:

● Tubo de 50ml.
● Punta azul
● Puntas amarillas
● Eppendorf

Equipos:

● Centrífuga
● Pipeta de 5 mL
● Baño de maría
● Vórtex
● Micropipetas
 Reactivos:

● EDTA PBS Tris-HCL 10mM (ph 8.0)

● Tritón X-100 1%
● Sacarosa
● NaCl
● Agua destilada
● Proteinasa K
● Fenol
● Cloroformo
● Alcohol –isoamílico
● Alcohol

Muestra:

● Sangre periférica de humanos

Preparación de Soluciones:

 EDTA 250μl
 PBS
 TLB (Tris-HCL 10mM (ph 8.0), Tritón X-100 1% y sacarosa 320 mM)
 NLB (Tris HCL 10 mM (ph 8.0), NaCL 400 mM y EDTA 2 mM)
 SDS al 10 %.
 NaCl 5M
 CIA(Fenol Cloroformo alcohol –isoamílico)
 2 propanol.
 Alcohol 70%
 T.E

5. Metodología

5.1. Video: DNA extraction from Blood

Este método de extracción de ADN de la sangre utiliza principalmente los kits QlAamp
DNA mini y blood mini kit. Este procedimiento se hará en duplicación de una sola
muestra de sangre. Dicha muestra se obtendrá mediante la técnica de flebotomía (toma
de sangre de las venas). Se emplean los kits mencionados previamente, utilizando las
soluciones de buffer AW1 y AW2 preparadas con anterioridad con etanol.
Posteriormente, se añade proteinasas K, se realizan centrifugaciones e incubaciones en
los pasos posteriores para purificar las muestras que se analizarán posteriormente con
ayuda de un espectrofotómetro para la determinación de su concentración y pureza.
Finalmente, se aplican geles de agarosa al 1% para el análisis de pesos moleculares del
ADN (Centre for Proteomic & Genomic Research, 2016).
 5.2. Guía de laboratorio

La guía para las prácticas de laboratorio, consiste en el método de extracción salting-

out, también llamado cristalización anti disolvente o cristalización de precipitación,
diseñado para pequeños volúmenes de sangre. Para ello las células o tejidos se lisan
primero y se tratan con proteinasa K, debido a que es capaz de inactivar las RNasas y
las DNasas en ácidos nucleicos de alto peso molecular, además el uso de NaCl saturado
produce precipitaciones de proteínas. Posteriormente, las muestras se centrifugan en
condiciones distintas y el ADN se purifica del sobrenadante mediante lavado con
detergente de etanol. A continuación se coloca EDTA (Ácido etilen diamino tetra
acético), cuya función es actuar como un agente quelante encargado de proteger al ADN
de la acción de enzimas nucleasas, mediante la capturación de los iones magnesio y
calcio, evitando así que actúen como cofactores de las nucleasas (Ramos, 2017). De
forma inmediata se agrega el PBS (Solución salina amortiguada por fosfatos), que
mantiene a las células en condiciones fisiológicas estables durante cada centrifugación
(Rojas, 2017). El uso de la solución TLB (Tris-HCL 10mM (ph 8.0), Tritón X-100 1%
y sacarosa 320 mM), una vez descartado el sobrenadante efectúa la lisis de los
leucocitos, con implementación la solución NLB (Tris HCL 10 mM (ph 8.0), NaCL 400
mM y EDTA 2 mM); junto con el SDS (Dodecil sulfato de sodio) al 10 %, que tiene
efecto de detergente aniónico solubilizante de proteínas y de componentes de
membranas (Ramos, 2017).

Una particularidad de este método es que la adición de altas concentraciones de sal

como el NaCl (5M), que facilitan la separación de proteínas del ADN, debido a que se
vuelven menos solubles precipitándose. Este proceso previene la contaminación del
ADN con proteínas y mantiene la pureza del mismo. Por último, la solución CIA (Fenol
Cloroformo alcohol –isoamílico) funciona como un solvente orgánico que separa las
proteínas y lípidos celulares del ADN, mientras el 2 propanol facilita la precipitación
del ADN que es lavado con alcohol al 70% y después del secado es resuspendido en
solución T.E. que protege el ácido nucleico de la degradación. En general, el método
permite obtener ADN de buena calidad y pureza a partir de volúmenes pequeños de
sangre, el cual será utilizado para su correspondiente amplificación mediante PCR y
una correcta visualización en electroforesis en gel de los fragmentos amplificados.
Además este método de extracción también es útil en el campo de la genética forense,
ya que se puede realizar una PCR con un marcador STR que es utilizado para estudios
de filiación: LPL (Ramos, 2017).

6. Procedimiento

6.1. Video: DNA extraction from Blood

1. Se realiza la desinfección de la zona de trabajo, equipo y materiales de laboratorio.

Eliminar los residuos de desinfectante con agua y aplicar etanol al 70%.
 2. Ajustar el bloque de calentamiento a 56° C.
3. Etiquetar el material a utilizar. En este caso 1a y 1b.
4. Voltear los tubos de ensayo con la muestra aproximadamente 10 veces para que
esta sea homogénea.
5. Se procede a hacer la centrifugación rápida de la proteinasa K.
6. Se prepara una solución de 200 μl de sangre para los tubos 1a y 1b.
7. Colocar 200 μl de tampón en cada solución.
8. Se realiza la agitación de las soluciones durante aproximadamente 15 segundos.
9. Se transfiere las muestras al bloque de calentamiento y se incuba durante 10
minutos. Posteriormente, se debe centrifugar.
10. Se añaden 200 μl de etanol y se centrifuga.
11. Preparar una mini columna de centrifugado para los respectivos tubos.
12. Se transfiere los tubos 1a y 1b a las columnas giratorias. Este paso se repite en los
siguientes pasos.
13. Colocar las muestras en la centrífuga en 6000 G ≈ 8000 rpm por un minuto.
14. Limpiar y desechar los tubos de recolección.
15. Se agregan 500 μl de buffer AW1, para volver a centrifugar e incorporar 500 μl de
buffer AW-2.
16. Centrifugar a 20000 G ≈ 14000 rpm durante tres minutos.
17. Se desecha el filtrado del tubo de recolección y centrifugar por un minuto.
18. Se añaden 200 μl de buffer AE e incubar por un minuto en RT.
19. Se procede a evaluar la concentración y calidad del ADN, mediante el nanodrop al
que se le coloca 1,5 μl de ADN, seguido de la aplicación de electroforesis en gel.
20. Se analiza el estado del ADN con un buffer de carga de gel de agarosa al 1% a 100v
durante 20 a 30 minutos.
21. Se coloca la muestra en una placa, en el transiluminador para visualizar el ADN.
22. Colocar las muestras en la campana laminar y se dividió el ADN en alícuotas del
mismo volumen.

6.2. Guía de laboratorio (Extracción de ADN a partir de muestra de sangre

periférica)

a. Preparación de soluciones

1. Se preparó las siguientes soluciones:

 250 μl de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) empleada para proteger el
material genético de la acción de enzimas nucleasas.
 TLB compuesta por Tris-HCl con un pH de 8, Tritón X-100 al 1% y sacarosa 320
mM.
 NLB mediante Tris-HCl con un pH de 8, NaCl 400 mM y EDTA 2 mM.
 CIA constituida por Fenol, cloroformo y alcohol isoamílico.
 TE con EDTA y Tris-HCl.
b. Protocolo de Extracción

1. En un tubo de 50 ml se trató 10 ml de sangre con 250 μl de ácido etilen diamino

acético (EDTA).
2. A dicho tubo se le añadió PBS o buffer de fosfatos hasta completar los 50 ml del
recipiente. Procediendo a sellar el tubo y homogenizar la solución.
3. A continuación, se centrifugó por 20 minutos a 3500 rpm a 4°C.
4. Una vez pasado este tiempo, se desechó el sobrenadante con una pipeta de 5 ml.
5. Se le adicionó TLB al mismo tubo hasta completar los 50 ml.
6. Se dejó reposar por 30 minutos a 4°C haciendo pausas cada 10 minutos para
homogenizar la solución invirtiendo la muestra 10 veces en ese tiempo.
7. Posteriormente, se añadió nuevamente PBS a la muestra, en esta ocasión 5ml.
8. Esto se centrifugó a 3500 rpm por 20 minutos a 4 °C y concluida la centrifugación
se desechó el PBS de lavado por inversión.
9. A la muestra se agregó 3 ml de NLB y 230 μl de SDS al 10%.
10. Esta solución se colocó en el vortex por 15 segundos y luego se añadió 60 μl de
proteinasa K.
11. Se incubó a baño maría por 1 hora a 55°C y luego se dejó en la incubadora a 37°C
durante toda la noche.
12. Al día siguiente, se añadió 1200 μl de NaCl 5M a la muestra colocando en el vortex
por 15 segundos y centrifugar a 3500 rpm por 20 minutos a 15°C.
13. Concluido este tiempo, se extrajo el sobrenadante a un tubo falcon dejando intacto
el precipitado.
14. Se añadió 5 ml de CIA y se lo colocó en el vortex por 5 segundos.
15. Nuevamente, se centrifugó la muestra a 3500 rpm por 20 minutos, en esta ocasión a
15°C y se extrajo en sobrenadante en un tubo falcon.
16. Se le añadió una cantidad semejante a la sobrante en la muestra de 2-propanol y se
lo invirtió para favorecer la precipitación de ADN.
17. A continuación, se capturó el ADN con una punta azul y se colocó el mismo en un
tubo Eppendorf estéril.
18. Se lo centrifugó un tiempo corto y con ayuda de una punta amarilla se extrajo el
sobrante del 2-propanol cuidando de tocar el ADN.
19. En la muestra se añadió 1 ml de alcohol al 70%
20. Esto se centrifugó a 1300 rpm durante 10 minutos a 1°C.
21. Se eliminó el sobrenadante por inversión y con ayuda de una punta amarilla se
extrajo el líquido restante en la muestra sin tocar el ADN.
22. Se secó al vació por 15 minutos en la secadora con la tapa abierta a 40 de presión.
23. Se resuspendió en 400-500 μl de TE
24. Finalmente, se dejó la muestra 30 minutos en baño maría a 55°C y 1 hora a 37°C.
Pasado este tiempo, está listo para su análisis.
7. Resultados

Reactivos Función

EDTA Se emplean para proteger el ADN de la acción de

enzimas nucleasas; ellos capturan los iones magnesio y
(ácido etilendiaminotetraacético) no permiten que actúen como cofactores de las
nucleasas. (Velasco, 2005)

PBS Se emplea como vehículo neutro para células, ya que

no modifica el perfil de expresión y funcionamiento
(Solución Salina Amortiguada por celular normal. Esta solución es empleada comúnmente
Fosfatos) para lavar células a través de centrifugación. En
combinación con EDTA permite disgregar células
cuando estas forman agregados (Standard Operating
Procedures, 2008).

Tris-HCL 10mM (pH 8.0) Es un tampón biológico, cuya función es mantener el

pH de la solución constante. (Velasco, 2005)

Es un detergente no iónico usado para desnaturalizar

membranas de células sin desnaturalizar la proteína.
Tritón X-100 1% Este detergente rompe los conglomerados de proteínas
para promover la actividad enzimática.

Sacarosa El aporte osmótico ejercido por la sacarosa permitirá la

ruptura de las membranas del glóbulo rojo. (Cercenado
& Cantón, 2005)

Las altas concentraciones (5 M) de NaCl se emplean

para prevenir la contaminación de la muestra con
NaCL polisacáridos que afectan la pureza del ADN, pudiendo
inhibir la actividad de algunas enzimas como
polimerasas, ligasas y endonucleasas de restricción
(Velasco, 2005).
 Agua destilada El agua destilada ayuda en gran medida a la
visualización del ADN, además esta debe estar libre
de DNAsas y RNAsas.

Proteinasa K Inactiva las nucleasas que podrían dañar el ADN,

también sirve para romper y degradar las proteínas que
están unidas al ADN y remueve contaminantes
(Cercenado & Cantón, 2005).

A menudo se efectúa una extracción con disolventes

para eliminar los contaminantes de los ácidos
Fenol - Cloroformo - Alcohol nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una
isoamílico combinación de fenol y cloroformo con objeto de
eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos
nucleicos suele realizarse una precipitación con
isopropanol o etanol.

El cloroformo desnaturaliza nucleasas y el alcohol

isoamílico evita la formación de espuma y facilita las
fases (Alejos, Aragón, Cornejo, 2010).

Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en

alcohol, ya que el ADN es soluble en agua, pero cuando
Alcohol se encuentra en alcohol precipita. Por este motivo, las
hebras de ADN comienzan a hacerse visibles en la
interfase entre la mezcla y el alcohol. (Aula Genyca,
2018)

Buffer AW1 y AW2 Son soluciones de lavado que permiten que el ADN se
mantenga unido a las columnas de sílice y que no
caigan en el colector del tubo después de la
centrifugación.

Buffer AE Sirve para desprender el ADN. (Hidalgo, 2010)

 Buffer AL Es un tampón de lisis (Hidalgo, 2010).

Tampón de carga de gel de agarosa La agarosa electroforesis es la forma más eficaz de

a 1% separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños que
van desde 100 pb a 25 kb. Los geles se comportan como
un tamiz molecular y permiten separar moléculas

cargadas en función de su tamaño y forma (Lee, Hsu y

Kim, 2012).

Comparación de metodologías:

En el protocolo utilizado en el video utilizan sustancias orgánicas no tóxicas como los

kits QiAamp DNA mini y blood mini kit, los cuales aparte de ser económicos no afectan
la calidad del ADN en relación con el protocolo salting-out. Por otro lado, mientras el
protocolo salting out se basa en la lisis inicial de los glóbulos rojos mediante solución
hipotónica y la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el
empleo de detergentes con la posterior eliminación de la proteína mediante
precipitación salina, el método mencionado por el video proporciona purificación de
ADN basada en membranas de sílice. Con relación a los resultados que se pueden
obtener, salting-out permite obtener ADN de buena calidad y pureza a partir de
volúmenes pequeños de sangre.

Por otra parte, el tiempo de proceso es mayor en la extracción de ADN por sangre
periférica. Ambos procesos requieren de centrifugados, sin embargo, el baño maría solo
está presente en el protocolo salting-out.

8. Discusión

Los kits comerciales disponibles para la extracción de ADN hace de esta un

procedimiento rápido y seguro con el inconveniente que son muy costosos y tienen bajo
rendimiento lo cual no lo hace viable para extracción de ADN a gran escala (Ghaheri
et al., 2016). El método presentado en el material audiovisual utiliza un kit comercial
de extracción de ADN y se puede observar que a comparación con el método presentado
en la guía de trabajo la extracción se realiza de manera más rápida y sin tantos
procedimientos.

El método de purificación salina o salting – out es el que se utiliza habitualmente para

la extracción de ADN en muestras de sangre, una de las ventajas de este método es el
rendimiento que tiene pues se obtiene ADN relativamente puro y de alto peso
molecular, sin embargo es un método que consume mucho tiempo y expone la muestra
 a contaminación sin mencionar el uso de productos químicos tóxicos (Ghaheri et al.,
2016). En la guía de trabajo se utiliza el método salting – out para la extracción de ADN,
se puede observar que es un método con procedimientos que requieren un tiempo
considerable mucho mayor al procedimiento observado en el material audiovisual.

Los kits comerciales para la extracción de ADN utilizan sílice o matrices de sílice que
poseen propiedades únicas para su unión con el ADN. Estos compuestos ayudan al
ADN a mantenerse fijo en las columnas giratorias al momento de las centrifugaciones.
Las muestras de sangre se incuban durante unos minutos con un tampón de lisis,
tomando entre 40 minutos a 1 hora para completar todo el proceso (Chacon-Cortes &
Griffiths, 2014). En el material audiovisual utilizando los kits de extracción y sumando
todo el tiempo que se utilizó entre incubaciones y centrifugaciones se puede estimar
una duración de 30 minutos además de no presentar pérdidas ni contaminación de ADN
al evaluar su calidad.

En el proceso de extracción mediante salting – out se utilizan poliaminas y polisacáridos

que pueden contaminar la solución de ADN estos contaminantes se consideran
inhibidores de los ensayos de PCR (Nguyen et al., 2012) El método salting - out es
práctico para obtener ADN a escala de laboratorios de docencia como en nuestro caso
sin embargo si se requiere ADN para ensayos de PCR no sería el método más adecuado
puesto que la prueba puede estar en riesgo ya que se utilizaría un gran volumen de
solución de ADN que conlleva un gran volumen de contaminantes e inhibidores de la
PCR.

9. Conclusiones
● La extracción de ADN a partir de los kits comerciales se basa en duplicar una
sola muestra de sangre, utilizando soluciones buffer AW1 y AW2 y la adición de
proteinanas K. Por otro lado, el método de salting out se basa en la lisis de las
células, sus estructuras subcelulares y la eliminación de las proteínas por
precipitación salina.
● Si bien ambos métodos son útiles para la extracción de ADN, emplear los kits
comerciales es mucho más sencillo y rápido en llevar a cabo y se obtienen muestras
de ADN sin contaminación; a diferencia del método de Salting out que es efectivo
para extraer pequeñas cantidades de ADN, pues en el caso contrario se corre el
riesgo de que la muestra se contamine.
● Es de gran importancia reconocer los reactivos empleados, como están compuestos
y cuál es su respectiva función durante estos procedimientos, ya que poseer estos
conocimientos nos permite recrear o sustituir estos compuestos y realizar una
extracción de ADN exitosa a pesar de no disponer de ellos inicialmente.
10. Bibliografía:

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11. Anexos

Tabla 1: Composición de los reactivos

Reactivos Composición y Obtención

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

Se obtiene a partir de la adición de Cianuro de Sodio y Metanal

(Formaldehído) a una solución básica de Etilendiamina, formando la sal
trisódica.

PBS Solución Salina Amortiguada por Fosfatos

Se prepara a partir de Cloruro de Sodio, Fosfato de Sodio y, en algunas

formulaciones, con Fosfato de Potasio

Tris-HCL Tris(hidroximetil)aminometano (C4H11NO3.HCl)

Se prepara desde nitrometano con (HOCH2)3CNO2 como intermediario.

Se debe reducir este último compuesto

Tritón X-100 Es un derivado de poli (etilenglicol) que es poli (etilenglicol) en el que

uno de los grupos hidroxi terminales se ha convertido en el
correspondiente p- (2,4,4-trimetilpentan-3-il) fenil éter.

Es una enzima que se obtiene a partir de extractos del hongo

Proteinasas K Engyodontium album

Fenol C6H6O Se obtiene a partir de la destilación del alquitrán de hulla.

Cloroformo Triclorometano (CHCl3) Puede obtenerse por cloración como derivado

del metano o del alcohol etílico

Es obtenido por la fermentación de almidón de papa o de determinados

Alcohol cereales, por síntesis y está presente en algunos vinos. Se obtienen
Isoamílico mediante destilación fraccionada