Tema 1: Laboratorio de Anatomía Patológica y Citología.

 DENTRO DEL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA:

 El laboratorio de anatomía patológica es otro de los apartados de un hospital. Además hoy

en día todo lo que se quita se analiza y pasa por el laboratorio de anatomía patológica. En este
laboratorio lo que más se analizan son muestras citológicas, aproximadamente en un 80% de las
muestras analizadas pertenecen a este tipo.

 La anatomía patológica se usa sobre todo en medicina preventiva.

 Las muestras que se toman, se procuran que cada vez sean menos cruentas (menos
dolorosas).

 Existen distintos tipos de laboratorio de anatomía patológica dependiendo del volumen de

las muestras y del tipo de procesado, pero todos los laboratorios deberían ser amplios, luminosos,
ventilados y seguros, aunque ahora mismo en los laboratorios se están realizando importantes
cambios ya que antes se encontraban bajo el suelo y en sótanos (ya que [explicación de la profesora]
antiguamente los cadáveres, etc. Se encontraban en el subsuelo y eran más fácil llevar mediante
conductos y pasillos a los laboratorios que estar cambiándolos de plantas mediante ascensores…).

 Las habitaciones que un laboratorio de anatomía patológica debería tener son:

o Sala de recepción y registro de volantes de petición

o Secretaria

o Sala de procesado general de muestras y tinciones

o Zona de preparación de bloques de parafina

o Sala móvil

La sala de procesado general de muestras y tinciones consta de una zona especial

llamada zona de tallado, la cual está compuesta por una campana extractora de vapores,
una mesa e metal o de mármol, una pila diseñada para que caigan líquidos en el
fregadero, un grifo de formol, tomas de agua caliente y fría, un dictáfono con pedal incluido
además de otros materiales, como una cinta métrica, tijeras, pinzas, bisturís, balanza…
donde se realizan el procesado de las muestras que llegan al laboratorio, donde se lava,
mide, pesa corta y prepara para hacer un bloque de parafina para poder cortar con un
micrótomo y poder preparar una muestra para observar al microscopio.

Zona de preparación de bloques de parafina: en ella se encuentra el procesador de tejidos

y dispensador de parafina donde se rellenan unas cubetas metálicas de parafina que se
enganchan a las casetes de donde posteriormente saldrán los bloques de parafina.

En la zona móvil se realizan las tinciones de los tejidos (histológicas) que pueden ser de
distintos tipos, histoquímicas, inmunohistoquímicas o generales. También se realizan
procesos de biopsias estudiando los anticuerpos monoclonales y policlonales. Además de
observar al microscopio electrónico los resultados obtenidos. Se procesan también las
muestras, procedentes de citología de líquidos orgánicos o de punción y aspiración fina o
gruesa (PAAF o PAAG) también se realizan funciones ginecológicas, como por ejemplo
Papanicolau, May Grimwald-Giemsa, Diff Quick o Shorr. También se realizan otras
funciones como son los cultivos celulares donde se almacenan y cultivan órganos y la
zona de biología molecular.

 FUERA DEL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA:

 Encontramos la sala de espera, almacenes y el despacho de diagnóstico médico, en el cuál es
frecuente que se reúnan los médicos para hacer preguntas.

 También encontramos al personal que es muy variado y formado por: técnicos en el

laboratorio de anatomía, a médicos que son anatomopatólogos, a jefes de servicio, a secretarios,
técnicos de limpieza y celadores que por lo general se encargan de las salas de necropsias.
o Labores del técnico de anatomía patológica:

 Sus responsabilidades comienzan con la llegada de las muestras al

laboratorio

 Tiene que realizar el registro y volante e inscripción

 Colaborar con el patólogo responsable de la sala de estudio macroscópico

 Realizar limpieza apertura de piezas huecas, indicar fijador a emplear y

realización de técnicas especiales.

 Comprobar en las piezas fijadas que el volumen del líquido fijador es 20

veces el del tejido, es decir el adecuado.

 Organizar la campana de tallado

 Distribuida material quirúrgico, piezas, peticiones y casetes con su

numeración correcta y sus tapaderas, utensilios necesarios como pueden ser reglas, balanzas,
dictáfono, lupa…

 Ayudará al médico en la retirada del casete seleccionado, emplazar

fijadores, retirada de piezas procesadas y en la limpieza de la sala.

 Informará sobre las piezas que requieran orientación especial

 Completará el formulario

 Y será responsable de los aparatos del laboratorio, realizarán los cortes, la

“pesca”, recogida de las mismas tinciones y montaje.

 Además del personal encontramos también las muestras, que requieren dos tipos de estudio,
uno histológico y uno citológico.
o Histológico:

 Puede proceder de una autopsia

 Procedente de una biopsia o pieza quirúrgica.

Estos dos tipos de muestras se procesan de forma parecida. En segundo lugar aparecerán
de estudiar las muestras para estudio citológico, que son aquellas que proceden de
muestras que contienen células que vienen o bien fijadas en estallidos o sobrenadando en
líquidos.

Las muestras histológicas llegan en un bote con formol. A veces también llegan en gasas
mojadas en suero fisiológico y generalmente se hace para intraoperatorios, es la única
urgencia en el laboratorio de anatomía patológica y suele estar pactada. Para realizar
estos intraoperatorios se necesita de un aparataje especial como es un micrótomo de
congelación o criostato. En este caso es más rápido y acabara con la tinción y el
diagnóstico en aproximadamente 15 minutos. Además parte de este tejido suele
procesarse como una muestra más. La biopsia intraoperatoria es para casos muy
específicos.
 En la intra se identifica en el tejido, la naturaleza y la presencia de la lesión y permite
adecuar los márgenes quirúrgicos o la extensión de la enfermedad. La aproximación de un
diagnóstico rápido de la intra y el diagnóstico del procesamiento en parafina varía entre un
94 y un 98%. En las muestras citológicas no hay casos urgentes y suelen llegar o bien en
extendidos o bien en alcohol.

 Gestión de la información:

El laboratorio de Anatomía patológica debe tener unas normas en las que se indique con
claridad las instrucciones con el envío de las muestras. Siempre llevara un volante donde
figuraran los datos legibles mínimos (nombre, apellidos, edad fecha de nacimiento,
diagnóstico previo, médico que lo trata, tratamientos que este siguiendo) siempre se
comprobara que los datos del volante se corresponden con la muestra. Esto es lo primero
y fundamental.

El personal técnico comprobará los datos y ante la duda lo comunicará lo antes posible.

La primera operación del día es en el laboratorio de Anatomía Patológica se reciben y

numeran los volantes de petición así como los envases, se asigna manualmente mediante
etiqueta adhesiva, código de barras o rotulador o tampón, el mismo código identificador al
volante y al envase simultáneamente.

En algunos hospitales existen sistemas informáticos basados en la presencia de etiquetas

con códigos de barras que serán detectados por lectores ópticos, en cualquier caso se
pondrá la fecha de recepción. Las muestras se dividen en algunos hospitales en:

-A (Autopsias)

-B (Biopsias)

-C (Citologías) que pueden ser:

-G (Ginecológicas)

-NG (No Ginecológicas)

Lo importante es que el contenido sea legible y esté lo más desglosado posible. A

continuación de esta letra se pondrán el año con sus dos últimos dígitos y el número de
orden que hace esa muestra.

Si con un volante llegaran varios botes se pondrá tantas etiquetas en el volante como en
los botes por lo tanto u mismo paciente puede tener varias etiquetas.

En los libros que manejamos en el laboratorio se suele poner una serie de columnas que
variaran de un laboratorio a otro pero que todos deben llevar el número de identificación,
nombre, apellidos, doctor y servicio de procedencia, la pieza que es y el número de
bloques que se hace.

En algunos casos se especifica con números romanos de que parte de la pieza pertenece
el bloque. En otro libro ponemos el número de identificación, las técnicas que se le hacen
(tinciones), patólogo que lo diagnostica y la fecha de salida.

 Citologías:

Previamente fijadas habrá que comprobar que el porta llegue grabado la identificación en
la misma superficie donde está la muestra extendida. A veces los volantes se agrupan por
pacientes, antes de ser etiquetados, también es importante agruparlos por centro y por
médico. Y es importante disponer de información sobre los estudios previos.
 Una vez hecho el diagnostico, los volantes pasan a secretaria dónde se guarda la
información y salen informatizados los resultados.

Existen programas que nos indican las patologías, se den solo en hombros y cuales solo
en mujeres, por lo que si hubiera un error diagnóstico, el propio programa nos lo indicaría.

 Archivos de informes de bloques de piezas y de portaobjetos:

Los archivos son el mayor tesoro de un laboratorio de anatomía patológica, deben

mantenerse actualizados y en orden para que sean operativos, un informe mal archivado,
un bloque un cristal es material irremediablemente perdido preferiblemente solo una
persona debería tener acceso a cada tipo de archivo, pero en la práctica esto es imposible
en la formación del histotécnico hay que incluir en gran responsabilidad de que los
archivos estén en condiciones.

Los archivos nunca deberían extraerse de los archivadores donde están archivados, sería
útil tener una fotocopiadora.

Con la finalidad de proteger los bloques de parafina del oxidado y de la acción de vapores
de sustancias volátiles conviene archivarlos todos los días. Existen archivadores
diseñados para ello. Sería útil que el material utilizado para necropsias se utilice aparte, en
cuanto a los cortes histológicos ya distendidos en portas hay que archivarlos teniendo un
orden distinto, utilizando para ello distintos sistemas modulares. Es importante tener en
cuenta el peso de los cristales a la hora de ubicar este archivo ya que el peso del cristal en
pocos metros cuadrados puede acarrear hundimientos.

En cuanto al archivo de piezas tiene doble sentido preferiblemente se guardaran durante 3

meses. Después del enviado el resultado del estudio el medico peticional y posibles
discordancias y comprobación con el material ya tallado. Algunos laboratorios guardan
posiblemente el material de autopsias concentrar muestras de todas las localizaciones de
un individuo, en estos casos debe comprobarse la integridad del material guardado en
formol.

 MATERIAL DE LABORATORIO:

Tubos: forma cilíndrica, alargada, hay de distintos tipos: ensayo, hemólisis, centrifugado
(más duros), de fondo cónico o redondo.

Probetas: tubos altos cilíndricos base ensanchada, distintos tamaños y capacidades,

sirven para medir.

Matraces: se utilizan para hacer disoluciones. Cada matraz tiene 1 cantidad determinada
no usar lugar almacén.

-Aforado: tiene aforo en el cuello, se utiliza para volúmenes exactos, fondo redondo o
plano.

-Erlenmeyer: son más exactos que los aforados.

Vasos de Precipitado: vaso con vertedor y escala orientativa de volúmenes, hay de

distintos tamaños.

Portaobjetos: o portas pieza rectangular sirve para colocar muestras para observar al
microscopio puede tener en uno de sus extremos una banda mate para escribir con lápiz y
puede tener los bordes esmerilados.

Cubreobjetos: Cuadrado o rectángulo mucho más fino que se coloca encima de la

muestra situada sobre el porta hay distintos tamaños.
 Embudos: son recipientes cónicos que sirven para trasvasar líquidos de un recipiente a
otro y colocamos dentro un papel de filtro sirve como filtrador.

Vidrio de Reloj: Recipientes algo cóncavos que se utilizan para tener sustancias sólidas y
pesarlas en la balanza ya que nunca se puede pesar directamente.

Cristalizador o cubeta de tinción: sirve para poner a escurrir los portas ya teñidos

Cubetas de tinción: son de forma rectangular y se utiliza para contener soluciones en

estas cubetas puede tener cestillos de tinción que contienen los portas y también pinzas
para sujetar los cestillos.

-Cubeta de Koplin: tiene hendiduras para introducir los portas (5 portas)

-Cubeta de Hellenbach: es lo mismo solo que para 8 portas.

Pipetas: pueden ser aforadas o graduadas, sirven para tomar mediciones. Puede haber de
plástico también.

Placas de Petri: están formadas por dos partes que se acoplan y sirven para contener
soluciones.

Varillas agitadoras: son cilindros gruesos de cristal sirven para agitar disoluciones.

Frascos lavadores

Espátula

Escobillones

Gradillas

Escurretubos

Microtomo: Siempre se encuentra a su lado un baño de flotación. Sirven para cortar

parafina hay otro tipo de microtomo son los criostatos que sirven para cortar muestras de
parafina congeladas.

Microscopio.

Procesador Tisular: Se puede usar como teñidor programado.

Ordenador e impresora

Archivadores de bloques y portas

Estación Fría de montaje de Bloques.

Estación Caliente: (menos importante) En la mayoría de los hospitales hay montadores

automáticos. Se necesitan campanas extractoras, las estufas (para eliminar principalmente
la parafina) frigoríficos, congelador, centrifugas, citocentrífugas (controlar las células),
balanzas, agitador y placa calefactora y también un pHmetro.

Centrifugas:

Balanza

Phmetro:

 Para las técnicas histológicas suelen ser suficientes con congeladores de hasta 30ºC. Para
bancos de muestras biológicas son necesarios congeladores de -70ºC y -80ºC o dispositivos de
nitrógeno líquido. Siempre estarán conectados a un grupo electrógeno para cuando se valla la luz.
 Cuchillas de microtomo

Bisturí: mango y hoja

Pinzas de disección con dientes de ratón: pueden ser rectas o curvas y sus puntas son
anchas, tiene una serie de estrías interiores pare retener y no apretar el tejido.

Tijeras: de punta roma o mixta.

Agujas histológicas

Bandejas metálicas: sirven para hacer bloques con casetes.

Baño de flotación

Estación de Tallado.

Estufa

 Material de vidrio limpia con agua y jabón si el agua tiene mucha cal se limpia con agua
jabón, agua destilada y luego lejía. Para limpiar las pipetas hay un pipetero. La parafina se limpia
con Xilol y Toluol. Si el material tiene restos orgánicos se sumerge durante 24 horas en una mezcla
sulfocrómica formada por dicromato potásico (50 gr.), ácido sulfúrico (100 ml.) y agua destilada
(cantidad suficiente para un litro csp 1 l.)

 Portas y cubres se limpian con agua y jabón y luego se escurren: se hace en una mezcla de
alcohol éter en proporción 50-50 % o 30-70 %. También simplemente se sumerge en alcohol etílico
puro se mete en lejía pura después lavar y secar

Tema 2: Normas de Seguridad en el Laboratorio. Aplicación al Laboratorio de

Anatomía Patológica y Citología.

 INTRODUCCIÓN:

En cualquier laboratorio de Anatomía Patológica es un área de importante riesgo potencial

que no siempre se controla de manera adecuada.

Dentro de los riesgos que nos encontramos el primero de ellos es la manipulación de

sustancias químicas y variadas y muchas veces están almacenadas en el propio
laboratorio. Estas sustancias pueden hacer efectos adversos sobre la persona que las
maneja, atmósfera de trabajo e incluso puede extenderse fuera del laboratorio.

Otro peligro es el derivado de la manipulación de tejidos no fijados y muestras del personal

que las manejan. Son también factores de riesgo potencial los medios eléctricos y de
combustión existentes en el laboratorio como mecheros, bombonas de gas o alcohol. Que
vienen a acentuar la capacidad de ignición.

Otros riesgos: congelación, uso del microtomo, con objetos cortantes o eléctricos frente a
todos estos peligros potenciales se imponen el cumplimientos de unas normas básicas de
seguridad.

Lo principal es adquirir conciencia de que la seguridad depende de todos los miembros del
servicio de Anatomía Patológica y de la aplicación del sentido común en nuestro trabajo.

 NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO:

 No comer ni beber en el laboratorio

  Todos los reactivos y soluciones del laboratorio estarán perfectamente etiquetados y guardados
en la sala de materiales. Los reactivos peligrosos llevarán además una etiqueta adicional que
especifique el peligro por su naturaleza. Las muestras infectadas también estarán etiquetadas.

 En cuanto a la limpieza y mantenimiento del laboratorio, éste debe estar en condiciones de

estricta higiene. Cualquier mancha o salpicadura se limpiará inmediatamente. Las superficies de
trabajo serán desinfectadas con agua de lejía. Todo el material se limpia y se pone a secar tras su
uso. Los vidrios rotos se depositan en recipientes rígidos desechables. Antes de comenzar el trabajo
hay que asegurarse de que todo el material a usar está en perfectas condiciones de higiene. En el
laboratorio el uso de la bata blanca, guantes y mascarilla son indispensables. En general, cuanto
mayor sea la higiene mayor seguridad se tendrá en el laboratorio.

 Nunca tocar, robar o inhalar ningún producto que no conozcamos.

 Lavarse las manos antes y después de cada operación. Se procuraran de estar libres de cortes y
en su caso, se usará un apósito y guantes para evitar la contaminación o la penetración de cualquier
sustancia. Mientras se trabaja hay que evitar frotarse os ojos con las manos, morderse las uñas y
llevarse objetos a la boca.

 Antes de abrir una estufa mirar la temperatura a la que se encuentra.

 No confundir un reactivo con otro que tenga un nombre parecido.
 Hay que tener un perfecto conocimiento del instrumental de laboratorio.
 Cuando desconectamos el destilador de agua, lo desenchufaremos primero de la red y luego
cerramos la entrada del agua.

 No pipetear nunca con la boca.

 Precaución con las lentes oculares, ya que, a veces, son capaces de absorber algunos disolventes.
 Al centrifugar hay que tener en cuenta que la citocentrífuga o centrifuga estén en perfectas
condiciones y deben estar alejadas de cualquier objeto que pueda entorpecer su rotación.

 Las manipulaciones que impliquen producción de vapores irritantes y tóxicos se efectuará

mediante la protección de una campana de extracción de aire.

 Los procesadores de tejidos interesan que estén cerrados en armarios y con ventilación al
exterior ya que producen vapores de tolueno acumulables.

 En cuanto al uso de mecheros de alcohol o de gas los situaremos lejos de corriente de aire o
cerca de alguna fuente de calor.

 Al manipular las muestras de tejidos debemos usar guantes.

 Todo el material punzante que se utiliza en el laboratorio de anatomía patológica hay que
depositarlo en un bote adecuado.

 Nunca se deben dejar reactivos donde no corresponda ya que pueden derramarse, romperse o
explotar produciendo graves accidentes. Hoy existe una ley para la rotulación de los envases que
contienen estas sustancias.

 Para manipular los materiales sólidos hay que hacerlo con espátulas.
 RIESGOS DEL USO DE SUSTANCIAS QUIMICAS:

 Para manipular cualquier agente químico es fundamental poseer la información

imprescindible sobre dicha sustancia por lo tanto es necesario leer el etiquetado donde además del
nombre químico se informa sobre su pureza, propiedades físicas y químicas, peligrosidad y
precauciones para su utilización.
 Según su peligrosidad las sustancias químicas se clasifican en tóxicas, nocivas, corrosivas,
irritantes, explosivas, comburentes e inflamables.

 Cada grupo de sustancias representase mediante un dibujo o pictograma de validez universal

y con una o varias letras, se dibujaran bajo fondo amarillo o naranja en negro.

- Sustancias Tóxicas: provocan siempre lesiones graves incluso muerte por inhalación,
ingestión o contacto por la piel. Ej.: Óxido arsénico en su manipulación sebe evitarse todo
contacto con el cuerpo y consultar inmediatamente con el medico en caso de accidente.
Se representa por medio de una calavera sobrepuesta a dos tibias que se cruzan en aspa
(además de llevar la letra T)

- Sustancias nocivas: su símbolo es una cruz en aspa de grueso trazado. Produce

lesiones menos graves que el grupo anterior. Al emplearlas hay que evitar el contacto con
el cuerpo, inhalación de vapores y en caso de malestar consultar al médico. Ej.: Piridina
(Xn)

- Sustancias corrosivas: se representa mediante dos probetas inclinadas de las que caen
gotas que dañan la piel y un material inerte. Su contacto provoca la destrucción de los
tejidos vivos y de ciertos materiales. Ej.: Ác. Sulfúrico. Las precauciones que hay que
adoptar son NO respirar sus vapores y evitar el contacto con mucosas piel y vertidos (C)

- Sustancias irritantes: símbolo cruz en aspa. Estos productos pueden irritar la piel, los
ojos y las vías respiratorias por lo que debe evitarse la respiración de sus vapores y el
contacto en la piel y las mucosas por ejemplo el amoniaco: NH3 (Xi)

- Sustancias explosivas: vienen representados por un núcleo fraccionado que irradia

destellos. Las sustancias explosivas se caracterizan por presentar un peligro específico de
explosión en determinadas circunstancias. Ej.: Dicromato potásico es necesario evitar
choques, fricciones y el empleo de chispas y fuego (E).

- Sustancias comburentes: Se representan por un círculo de fondo blanco que irradia

llamas. Tiene la propiedad de facilitar la inflamación de materiales combustibles y
mantener los incendios impidiendo su extinción. Ej.: Permanganato potásico. Durante su
utilización es necesario evitar su contacto con materiales comburentes. (O).

- Sustancias inflamables: Su símbolo es una gran llama y dentro de este grupo se

clasifican sustancias autoinflamables (P). Líquidos inflamables (etanol) y gases fácilmente
inflamables (F)

 El reglamento de sustancias las clasifica como: peligrosas para el medio ambiente,

carcinógenas, teratogénicas y butagénicas:

- Sustancias peligrosas para el medio ambiente: son las que pueden presentar un
riesgo inmediato o diferido para el medio ambiente (M).

- Sustancias carcinógenas: son aquellas que por inhalación, ingestión o penetración

cutánea pueden producir cáncer o incrementar su frecuencia.

- Sustancias teratogénicas: (razones anteriores) pueden inducir lesiones en el feto

durante su desarrollo intrauterino.

- Sustancias butagénicas: pueden producir alteraciones en el material genético de las

células.

 Como complemento de los símbolos de peligrosidad se han tabulado los posibles riesgos
particulares de cada una de estas sustancias, empleando posibles riesgos particulares de cada una de
estas sustancias, empleando unas frases con la letra R a la que se añade un número que indica el tipo
 de riesgo particular. A las R se le añaden otras indicaciones de seguridad que se indican con la letra
S.

 En la valoración de una situación concreta de riesgo, a las características de peligrosidad y

de riesgo y a las indicaciones de seguridad para su manipulación hay que añadir la concentración de
sustancias peligrosas en el medio de trabajo.

 Se han establecido los calores TLV que significa, Valores Limite Umbral y nos indican la
concentración máxima de una sustancia y se considera que casi todos los trabajadores pueden estar
expuestos a valores inferiores a ellos día tras día, sin padecer efectos adversos.

 El TLV indica la concentración media ponderada en el tiempo para una jornada normal de
trabajo (8h) y 40h a la semana a la que pueden estar expuestos diariamente los trabajadores. Se
expresa en unidades de partes de gas o vapor por millón de aire contaminado o en miligramos de
metros cúbicos de polvo (mg de m3).

 EFECTOS TÓXICOS DE ALGUNAS SUSTANCIAS:

o BENCENO: Producto muy tóxico que se está retirando del empleo rutinario aunque
todavía se utiliza en histopatología como disolvente y liquido intermediario para la inclusión en
parafina.

Las vías de entrada son por ingestión, inhalación y por contacto con la piel y su efecto
patológico va desde más leve (irritación piel y mucosas) pasando por intoxicación aguda
con afectación del sistema nervioso central, incluso puede llegar al coma y fallo
respiratorio y puede existir también un cuadro de intoxicación crónica que sería resultado
de repetidos exposiciones a sus vapores en baja concentración. El daño producido es
multisistémico. Se ha descrito: degeneración de hígado, riñón y corazón y la manifestación
más importante es la depresión de la médula ósea que puede conducir a una anemia
aplásica.
o TOLUOL Y XILOL: Son agentes aclarantes, son más utilizados que el benceno,
menos volátiles, pero también muy inflamable. Sus efectos son similares al del benceno pero con
menos intensidad.
o PIRIDINA: Se utiliza como disolvente de grasas y en algunas técnicas
histoquímicas y de impregnación argéntica. Ésta sustancia causa: Conjuntivitis, defalca, dermatitis,
nauseas y vómitos y es extremadamente inflamable.
o AGENTES CORROSIVOS: necrotizante local con formación de úlceras con
cicatrices deformantes. Ácidos fuertes: sulfúrico. Clorhídrico y nítrico. La intoxicación más grave de
estas sustancias es la afectación del tubo digestivo y de las vías respiratorias por ingestión. Las zonas
más dañadas frecuentemente son la piel y ojos. El efecto inmediato de su contacto es un intenso
dolor al que acompaña una tumefacción roja y al día siguiente se advierten escarificaciones y
depósitos membranosos, si el tiempo de contacto es mayor, se produce necrosis profunda con
cicatrices deformantes como secuelas.

La ingesta: afectan a labios, lengua, paladar, pared posterior faringe, esófago y estómago
y aparecen extensas zonas de necrosis que pueden producir vómitos, hemorragias,
perforaciones y complicaciones, xerosis, cicatrices deformantes.

Tratamiento inmediatamente es lavarlo con agua. Si se ha producido ingestión no debe

inducirse el vómito por el peligro de perforación, lo que hay que hacer es administrar
hidróxido de magnesio, leche o clara de huevo disuelta.

Al manipular estas sustancias se tendrá en cuenta a la hora de disolver en agua que se

añade siempre el acido sobre el agua. En el caso de las bases los efectos son
 comparables a la de los ácidos, en este caso la medida inmediata si es por ingestión, hay
que neutralizar con un ácido débil como el jugo del limón, diluido en agua o vinagre diluido
al 10% y remitir al médico.
o SUSTANCIAS CARCINÓGENAS: Pueden producir cáncer, dentro de ellos están:
diaminobencidina y derivados, otras son sustancias explosivas como el ácido pícrico y nitrato de
plata, estos no deben ser manipulados cerca del fuego y deben evitarse golpes y fricciones sobre el
envase.

 RIESGO BIOLOGICO EN EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA:

 En los laboratorios de anatomía patológica es frecuente recibir muestras de tejidos y

citologías en fresco (no fijadas) habitualmente se remiten en fresco las biopsias intraoperatorios, los
de ganglios linfáticos, renales y de piel y en general todos aquellos a los que se apliquen técnicas
especiales, este material pueden estar infectada por gérmenes con el resto para el personal que lo
maneja por eso es imprescindible que los responsables de la toma de la muestra lo identifiquen.

 La identificación se puede realizar de manera simple añadiendo una pequeña etiqueta

cuadrada autoadhesiva de color rojo o anaranjado a la hoja de petición también se puede utilizar la
clasificación de Howie que divide los microorganismos en 3 grupos basándose en su nivel de
peligrosidad:

 Comprende gérmenes peligrosos para el personal del laboratorio y susceptibles que producir
epidemias, requieren extrema precaución en su envasado y manipulación.

 IIi) agrupa organismos considerados especialmente peligrosos y que requieren medidas

especiales de acomodación y envasado Ej.: Clostridium Botilium.

IIii) Virus de hepatitis.

 Comprende organismos no listados en los grupos de alto riesgo

 En definitiva sea conocido o no la infección de la muestra remitida siempre es preciso
manipular ésta bajo estrictas condiciones de seguridad como primera medida: el manejo de la
muestra debe realizarse en cabina de seguridad utilizando guantes de protección y evitando cortes en
los dedos, evitar también o tenga alto contenido en sangre.
 Los instrumentos empleados deben ser desinfectados después de usarse y conviene fijar el
tejido rápidamente.

 RIESGOS DERIVADOS DEL EQUIPO DEL LABORATORIO DE ANATOMÍA

PATOLÓGICA:

 El equipo cada vez es más complejo y debe cumplir unos requisitos legales de seguridad
pero no hay que descargar la posibilidad de accidentes debido a su manejo.

 Riesgo debido a la electricidad con la posibilidad de que se produzcan quemaduras e incluso

electrocución. Además una conexión eléctrica deficiente o un instrumento en mal estado pueden ser
detonante de la explosión o ignición de algunas sustancias químicas peligrosas.

 Riesgo mecánico derivado del uso de instrumentos como Microtomo, bisturís y manejo de

cristalería.

 Riesgo térmico derivado del uso de fuentes de calor y frío.

 RESPONSABILIDAD LEGAL DEL TÉCNICO:

 Las denuncias presentadas por enfermos o familiares contra el personal o por negligencia o
imprudencia están aumentando mucho en España no ha habido aún sentencias judiciales contra un
 técnico, pero si en otros países. Los motivos suelen ser negligencia y violación de derechos de
confidencialidad.

 La confidencialidad del diagnóstico anatomopatológico no es solo moralmente obligatorio

sino que tiene responsabilidad penal, es necesario considerar la responsabilidad de una incorrecta
manipulación de sustancias químicas que puede producir daños a compañeros e instalación y medio
ambiente.

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Tema 3: Operaciones Físico-Químicas Básicas

 Filtración:
Es un proceso mediante el cual se separa dos o más sustancias que se encuentran
mezcladas y para realizar la operación de filtrado, se usan embudos sobre los que
colocaremos papeles de filtro donde nos quedara retenida la parte sólida.

Los filtros tienen un tamaño de foro determinado, pudiéndose en algunos casos calcular el
tamaño de la partícula retenida. Nuestro papel de filtro es de celulosa con un 20% de H2O
absorbido, y el tamaño del poro será más o menos grande según el tamaño del sólido a
separar.

Los papeles del filtro van numeradas y las numeraciones según aumente el tamaño del
poro es menor. El filtro puede ser de pliegues que se utiliza para filtraciones más rápidas y
filtros lisos que se utilizan para filtrajes más lentos.

 Centrifugación:
En este proceso se logra separar de un líquido una parte sólida por medio de la fuerza
centrífuga para ello se utilizan aparatos que son las centrífugas y en anatomía se utilizan
las citocentrífugas. En las centrifugas normales lo que se introducen son tubos y en las
citocentrífugas lo que introducimos son portaobjetos con un dispositivo especial, con el fin
de obtener restos celulares que están contenidos en un líquido. Se someten en las
muestras a un movimiento de rotación y es importante que las muestras estén equilibradas
en el aparato, una frente a otra.

 Decantación:
Es la separación de dos gases por acción de la gravedad, generalmente un sólido
mezclado con un líquido o dos líquidos de distinta densidad, se dejan reposar y se hace un
vertido directo del líquido superior o bien se elimina con una pipeta.

 Medidas de Volumen y Capacidad.

Para medir un volumen utilizaremos el menos recipiente capaz de medir.

Cuando hablamos de volumen nos referimos a sólidos y cuando hablamos de capacidad

nos referimos a líquidos. Sin embargo los confundimos y hablamos de volúmenes
refiriéndonos a líquidos.

Para medir capacidades los recipientes que usaremos serán recipientes de boca ancha
como vasos de precipitados, erlenmeyer para medir de forma aproximada, aunque en
realidad todo habría que medirlo con matraces aforados, para llenarlos, cualquier
recipiente, ser hará de forma rápida al principio y según aumenta el volumen por el cuello
del recipiente pararemos acabaremos enrasando gota a gota con una pipeta.

Enrasar: Es hacer que el extremo del menisco que forma un líquido cuando está contenido
en un tubo estrecho sea tangente a la línea de enrase siempre medido a la altura de los
ojos, para evitar lo que se denomina error de PARALELAJE. Esto es el desplazamiento
aparente de un objeto cuando se mira desde diferentes puntos, al leer un volumen nuestro
ojo debe estar al mismo nivel que el “menisco” si se observa por arriba el volumen que
mediremos será menor y si se hace por abajo el volumen que medimos será mayor.

El menisco: es la curva que se forma en el borde del líquido con las paredes del recipiente
en el que se encuentra debido a la diferencia en la tensión superficial. El menisco sea más
curvo cuanto más estrecho sea el diámetro del recipiente.

También podremos medir con otros recipientes más estrechos como la probeta y la pipeta.

¿Cómo se pipetea? Tipos de pipeta.

Las pipetas graduadas se denominan así porque tienen una graduación para medir
cantidades exactas del líquido. Generalmente en las pipetas graduadas en la parte de
arriba llevan dos números. El de arriba es la capacidad total en mililitros y el de abajo es el
mínimo volumen que es capaz de apreciar y puede ser en forma de decimal o en forma de
quebrado. Existen pipetas de distinto tamaño, 10, 5, 2, 1, 0.2, 0.1 ml y también existe lo
que se denominan micropipetas.

Hay dos formas:

-1º) se introduce la pipeta en el líquido se aspira y se enrasa a 0 lo llevamos al tubo donde

queremos echar esa cantidad y lo dejamos caer resbalando por las paredes la cantidad
deseada. El resto o se tira o se devuelve al recipiente inicial.

-2º) Se introduce la pipeta en el líquido, se aspira y se enrasa en un punto determinado de

la pipeta calculando previamente restando al volumen total de la pipeta el volumen
requerido, por ejemplo si necesitamos 3ml y utilizamos una pipeta de 5ml enrasaremos en
dos y sacaremos esa cantidad y no nos quedará nada.

5. Métodos de pesada - Medidas de Peso:

Aunque ambos conceptos están íntimamente relacionados y a veces se utilizan

indistintamente, existen diferencias entre ellos.

La masa nos mide la cantidad de materia de un objeto y es invariable.

Peso es el valor de la fuerza por la que es atraído un objeto hacia el centro de la tierra
debido a que la fuerza de atracción difiere con la altitud y con la latitud. El peso de un
objeto es variable. (P = Masa · Gravedad (9.8)). En el laboratorio nos vamos a basar en la
masa para evitar que los resultados varíen según la situación geográfica.

La masa se va a determinar con las balanzas (la cual el peso de un objeto se comprara
con el conjuntos de masas patrón (pesas)).

Debido a que la gravedad afecta igual al peso problema que a la masa patrón una igualdad
de pesos indica una igualdad de masas.

En la práctica terminológica no hay diferencias entre masa y peso ya que llamamos

pesada a la comparación de masas y peso a los objetos de masa conocido.

 Propiedades de la balanza:
Exactitud: es la aproximación de una serie de pesadas al valor verdadero.

Precisión: también llamado en el caso de algunas balanzas fidelidad. Es la propiedad más

importante de una balanza y se corresponde con la reproducibilidad de la pesada, es decir,
si se repite varias veces una misma pesada debe obtenerse siempre el mismo valor.

Sensibilidad: Se define como la capacidad de la balanza de detectar una sobre carga, es

decir, variación de masa más pequeña que una balanza puede medir o detectar.

Capacidad de Carga: Máxima carga que una balanza puede medir.

 Tipos de balanza: Se pueden clasificar según

1. Su sensibilidad:

- Balanzas de precisión: con sensibilidad desde 0.1 a 0.001 gr.

- Balanzas analíticas: cuya sensibilidad es igual o mayor de 0.0001 gr.

2. Según su construcción:

-Balanzas mecánicas:
- Granatarios: tenían dos platillos

- De 3 vigas: con platillo único.

- Mohrs Wespal: obtener densidad de líquidos.

- Mecánica analítico: más capacidad de carga, precisión y sensibilidad puede tener 1 o 2

platillos.

- Balanzas electrónicas: Son las que actualmente se utilizan en los laboratorios de

investigación y actualmente se utiliza la monoplano de carga superior. Se pesa
depositando los objetos sobre el plato y se lee en la pantalla el resultado. Si para pesar
una sustancia u objeto, tenemos que hacer uso de un recipiente que lo contenga. P. ej.
Vaso de precipitado o un vidrio de reloj, debemos conocer el peso del mismo. Podemos
tararlo poniendo en el platillo y pulsando la tecla tara.

Los objetos o sustancias podremos pesarlos después.

 Reglas para utilizar una balanza:

Debe evitarse o estar exento de vibraciones radiaciones de calor, exceso de humedad,
corrientes de aire, deben colocarse en una mesa de pesada especial.
Las balanzas mecánicas, mientras no se utilizan deben estar bloqueadas.

Se debe centrar la carga en el platillo o en el plato y nunca se colocará las sustancias

sobre el plato, se depositará sobre un objeto de vidrio, material inerte o plástico, la balanza
debe estar escrupulosamente limpia y si la balanza tuviera pesos, estos se cogerían con
pinzas, nunca con la mano.

 Agua:
El agua se utiliza como medio de limpieza de material, preparación de reactivos lleva gran
número de impurezas orgánicas e inorgánicas. Puede suponer errores en el laboratorio. Es
necesario utilizar agua pura actualmente la calidad del agua se indica por grado-reactivos
sucesivos.

El CNP reconoce 3 niveles de pureza del agua en el laboratorio en función de la

conductividad específica de la resistencia específica de los silicatos o de los metales
pesados.

El agua de tipo 1: debe utilizarse en procedimientos cuantitativos así, como en la

preparación de controles patrones, etc.

El agua de tipo 2: se utilizará en técnicas cuantitativas así como en microbiología,

inmunología y hematología.

El agua de tipo 3: se puede utilizar como materia prima para obtener agua de tipo 1 o 2
según el uso posterior que se le dé al mismo.

Métodos de purificación del agua: pueden clasificarse en: Destilación, Desionización,

Ósmosis Inversa, Filtración y adsorción. Ninguno de ellos se puede considerar como
método de elección.

Destilación: mejor método para obtener agua puta, es un proceso en el cual el agua se
calienta hasta evaporar condensándose a continuación con lo que obtenemos agua exenta
de aguas extrañas que contengan material orgánico, no volátil, impurezas inorgánicas,
bacterias y muy baja conductividad. Para obtenerlo se utilizan los destiladores, a partir de
esa agua destilada se puede obtener el agua bidestilada, mediante una 2º destilación en
presencia de un agente oxidante como el permanganato potásico que destruye la materia
orgánica que pudiera existir después del primer proceso. Tiene una serie de
inconvenientes:

-No se eliminan impurezas como el amoniaco, dióxido de carbono, cloro, etc. (NH3, CO2,
CL2)

-Se acumulan en el destilador los materiales no volátiles, lo que implica una limpieza
periódica, con él se obtiene agua de tipo 1 ó 2.

-Se limpia con una solución de HCl al 10% durante 2 horas.

Desionización: es un método de purificación en el cual el agua pasa a través de una

resina de intercambio iónico ácido o básico o mixta. Se encuentra en una columna, estas
resinas son capaces de eliminar impurezas cargadas positiva o negativamente. La vida de
esta columna es limitada y hay que cambiarle periódicamente. Pero también tiene algunos
inconvenientes como son:

-No elimina componentes orgánicos ni microorganismos y es necesario realizar una

purificación preliminar para poder obtener agua de tipo 1 por este procedimiento hay que
realizar un tratamiento posterior con carbono activado o bien filtros para eliminar
microorganismos y compuestos orgánicos.
Ósmosis inversa: Consiste en el paso del agua bajo presión a través de una membrana
semipermeable que detiene el paso de las partículas disueltas tanto orgánicas como
inorgánicas. Con este método se obtiene agua de tipo 3 con lo que no es muy adecuado
para obtener agua del laboratorio. Se suele utilizar como sistema preliminar de purificación
de agua antes de pasar por una unidad desionizadora.

Filtración: consiste en hacer pasar el agua a través de membranas semipermeables, la

calidad de la filtración es inversamente proporcional al tamaño del poro del filtro.

Adsorción: Se utiliza como agentes absorbentes el carbón vegetal, anillos y silicatos se

logra principalmente la eliminación de impurezas orgánicas. Actualmente los sistemas de
purificación suelen estar formada por una unidad de Ósmosis inversa una unidad de
carbón vegetal que elimina materia orgánica unidades de desionización mixtas para
eliminar material inorgánico y filtros para eliminar partículas disueltas y bacterias.

 Disoluciones:
Se llama disolución a la mezcla homogénea de moléculas, átomos o iones de dos o más
sustancias diferentes. Los componentes se llaman soluto y disolvente. Siempre que la
disolución tenga el mismo estado físico que uno de los componentes se la llama
disolvente.

Si los dos componentes tienen el mismo estado físico que la designación soluto-disolvente
es arbitraria aunque normalmente se le llamó soluto al que está en menos proporción.

Tanto el soluto como el disolvente, pueden tener, un estado físico u otro y así tendremos
diferentes tipos de disoluciones.

De todas estas disoluciones las que más vamos a utilizar son las de sólido en líquido y la
de líquido en líquido.

Las disoluciones cuyo disolvente es el agua se les denominan acuosas y las disoluciones
el disolvente es alcohol se denomina alcohólica.

Se llama solubilidad de una sustancia en un determinado disolvente a la máxima

concentración que se puede conseguir en una disolución de esa sustancia en un
disolvente determinada y a una determinada temperatura.

La solubilidad depende de la naturaleza del soluto, disolvente y temperatura para

identificar una disolución hay que indicar, no solo los campos que la forman sino también
la concentración en que se encuentra cada componente. La proporción que hay entre
soluto y disolvente se llama concentración. Según la cantidad de soluto una disolución
puede ser saturada cuando no admite más soluto la disolución de manera que si se añade
más se queda en el fondo.

Sobresaturado: cuando la cantidad de soluto es superior a la que corresponde a esa

temperatura se puede lograr disolviendo el soluto cuando la disolución se encuentra a
mayor temperatura. Luego se enfriara lentamente y se dejaría en reposo.

Estas disoluciones son inestables tienden a separarse. También las disoluciones pueden
ser diluidas: cantidad soluto es pequeña paso determinado cantidad de disolvente. U
concentrada cuando se haya cerca de la saturación. Porque la cantidad de soluto es
grande para una determinada cantidad de disolvente.

Concentración: Indica la composición en función de las cantidades que hay de soluto y

disolvente o disolución. Pueden ser:

-Unidades químicas (cómo la molaridad, normalidad, molalidad y la fracción molar)

-Unidades físicas (gr. /l), %, % peso, % volumen, % peso-volumen): se expresa el número
de gramos de soluto contenidos en un litro de disolución se representa por g/l.

-% p: expresa el número de gramos de soluto contenidos en 100 gramos de disolución se

representa por % p/p. Generalmente la riqueza o pureza de los reactivos viene expresados
en % p/p.

-% v: expresa el número de centímetros cúbicos o mililitros de soluto contenidos en 100

centímetros cúbicos o mililitros de disolución.

-% p/v: expresa el número de gramos de soluto en 100 centímetros cúbicos o mililitros de

disolución.

-Se puede expresar parte por millón: indica el número de gramos de soluto por cada millón
de gramos de disolución.

1.- Calcular la cantidad de soluto y disolvente que hay en 400 gramos de una disolución al
6% p/p y en 56 gramos de disolución al 30% p/p.

400gr (400·6)/100 = 2400/100 = 24

De una disolución de 400 gramos, 376 gramos es el disolvente (agua) y el 24 es el soluto.

56gr (56·30)/100 = 1680/100 = 16,8 de 56 gramos, 16,8 son los gramos de soluto mientras
que el resto: 39,2 son los gramos de disolvente (agua)

2.- Calcula las concentraciones de las disoluciones siguientes expresadas en %

-20 gramos de azúcar en 300 gramos de agua

En 300 hay 20 en 100 habrá X. X= (100·20)/300 = 2000/300 = 6,67% p/p

-6 gramos de sal en 80 gramos de agua

En 80 hay 6 en 100 habrá X. X= (100·6)/80 = 600/80 = 7,5% p/p

-20 mililitros de alcohol etílico en 40 gramos de agua.

20 ml son 0.02gr. En 40 hay 0.02 en 100 habrá X. X= (100·0.02)/40 = 2/40 = 0.05% p/p

% p/p = gr. soluto/gr. disolvente · 100

% p/v = gr. soluto/ml. disolvente · 100

% v/v = ml soluto/ml disolución · 100

3.- ¿Cómo prepararías 50 gr. de una disolución de Na(OH). Sabiendo que la riqueza del
reactivo comercial es del 98% cuanto hidróxido de sodio cogerías.

10% = gramos de soluto entre gramos de disolución · 100 10%= gr. soluto/50 gr.= 5gr de
soluto de Na(OH)

Si la pureza de Na(OH) es del 98% para usar 5 gr. de Na(OH) tenemos que coger 5,10 gr.

100·5 =5,1020 gr.

98

4.- Preparar 100 ml de una disolución de NaCl al 5% p/v. Sabiendo que la riqueza del
reactivo comercial es del 99%. Indique cómo lo haría.

5% = (gr. Sol)/100 ml gr. De NaCl = 5

(5·100)/99 = 5,05 gr. Habría que coger para usar puros 5 gr. De NaCl y mezclaríamos con
agua hasta llegar a 100 ml

5.- Tenemos una disolución al 25 % p/v de Na(OH) ¿Cuantos gr. De soluto tenemos en
250 cm3 de esa disolución

25%= (gr. soluto · 100)/250 ml gr. 25·250/100=62,5 gr. De Na(OH) y después se mezcla
con H2O hasta llegara los 250 ml

6.- Vais a preparar 75 ml de una disolución de Na(OH) al 2%. Sabiendo que la riqueza del
reactivo comercial es del 97%.

2%=(gr. Soluto · 100)/75ml gr. 2·75/100 = 1,5 gr.

Molaridad: Se representa por M y se define como numero de moles de soluto entre

litros de disolución

7.- Calcular los grs. De soluto que se necesitan para preparar 250 cm3 de una disolución
0.1M de nitrato de plata. Pesos atómicos: N=14; O=16; Ag=108

N2O5 + H2O = H2N2O6 = HNO3 Ag(NO3) M= (gr./p.a.)/L 0.1= (gr./170)/0.25 0.1· 0.25=
gr./170

V= 250ml =0.25L gr.= 4.25

M=0.1

Gr.=¿? 4,25gr. De soluto de Ag(NO3)

p.a. = 108+(14+16·3) = 108+(14+48) = 108 + 62 = 170

8.- Calcular la molaridad de una disolución que contiene 25 gr. De NaCl en 1300 cm3

M= ¿? M = (25/58.5)/1.3 = 0.328M

V= 1300cm3 = 1300ml = 1.3L

p.a.= 23 + 35.5 = 58.5

gr.= 25 gr.

9.- Calcular gr. soluto para preparar 100 cm3 de una disolución 0.4M de Carbonato de
Hierro III.

Carbonato de Hierro III C2O7 + H2O H2CO4 Fe(CO4)3

P.a. del carbonato de hierro = 55.8 + 3(12+64) = 283.8

Gr.=¿? 0.4= (gr./283.8)/0.1 gr.= 11.352 de Fe(CO4)3

V=100ml=0.1L

M=0.4

10.- Calcular la molaridad de una disolución que contiene 10gr. De HgCl2 en 300 cm3 de
disolución

Cloruro de Mercurio (II) HgCl2 Hg= 200.5 Cl= 35.5

M= ¿? M=(10/271.5)/0.3 M=0.122

Gr=10
V=300ml=0.3L

p.a. = 200.5+2·35.5 = 271.5

11.- se ha preparado una disolución de etanol en agua, para ello se disolvieron 92 gr. De
éste alcohol en 90 de agua, el peso molecular del etanol es 46 y el del agua 18. La
densidad de ésta disolución es 1.018 gr./cm3 Calcular los moles de etanol, la molaridad
(M), los gr./L. Se podrá calcular el % p/p

D=1.018 gr/cm3 = 1.1018 gr/ml

Volumen= 92gr. De C2H6O + 90gr. H2O = 182 gr.

 Mol de etanol mol = gr. / p.a. mol= 92/46 = 2 moles de C2H6O

 Molaridad = Mol de disolución/L de disolución = (gr./p.a)/L (182/64)/182 = 2.84/182= 0.0156
M

 Gr./L ¿? d= 0.1018gr/ml · 1000 ml/L = 1018 gr/L = densidad

 % p/p gr.soluto/gr. Disolvente ·100 % p/p = 92/90 · 100 = 102.2% p/p (90/92 ·100 = 97.82%
p/p)

Tema 4: Estudio Microscópico

1. Introducción:

El microscopio óptico es un instrumento muy utilizado en el laboratorio y nos va a permitir

observar objetos muy diminutos gracias a unas lentes que producen una ampliación de la
imagen. Su nombre viene del griego que es “micros” que significa pequeño y “skopein” que
significa examinar.

Existen diferentes tipos de microscopios para diferentes aumentos, el más sencillo es la

lupa o el microscopio simple hasta el más complejo o microscopio electrónico.

Nosotros vamos a utilizar el microscopio compuesto o común.

El microscopio óptico se basa en la refracción de la luz, es decir, en la desviación de la luz

cuando pasen por unas lentes de vidrio. El más sencillo que es la lupa. Esta gormada por
una lente o sistema de lentes convergentes dispuestas de tal manera que nos va a
producir una imagen virtual derecha y mayor que el objeto.

El aumento habitual de la lupa varía de 4 a 60 aumentos, su uso es muy limitado, y se usa

para diseccionar animales y para la observación de colonias.

2. Microscopio compuesto:

Mecánica:

En este tipo de microscopio se combinan los poderes amplificantes de dos lentes o

sistemas de lentes ambos convergentes que se encuentran colocados al extremo de un
tubo, en un extremo tendremos el objetivo que se encuentra situado cerca del objeto que
se observa, en el otro extremo el ocular situado cerca del ojo.

Con este instrumento se logran aumentos de 50, 100, 1000 o algo más según la
combinación de lentes y longitud de onda empleado en su iluminación. La imagen
resultante es virtual e invertida.
La parte mecánica está formada por la moltura del microscopio y consta de 1 pie o base, 1
columna, 1 platina y un revolver.

-Un pie o base: sirve como base del microscopio y tiene el peso suficiente para dar
estabilidad al aparato. Es una plataforma rectangular, donde va integrado la fuente
luminosa.

-Columna o brazo: es un vástago perpendicular al pie que puede ser arqueado o vertical.
La parte superior es la que se llama brazo y es la que une el brazo con la platina, en caso
de transportar el microscopio de un sitio a otro debemos cogerlo siempre por aquí.

-Platina: plataforma horizontal, tiene orificio circular central, sobre este orificio se coloca la
preparación y permite el paso de los rayos procedentes del foco de iluminación situado por
debajo de ella. La platina es paralela al pie y perpendicular a la columna a la cual va unida.
Puede deslizarse a lo largo de la columna mediante un tornillo situado en ella que se
denomina macrométrico de cremallera o de avance rápido. Existe otro más pequeño que
realiza un movimiento más pequeño, es el tornillo micrométrico de ajuste fino del enfoque.

Sobre la platina existen dos láminas elásticas o pinzas que sirven para retener el
portaobjetos sobre la platina y evitar que se desplace accidentalmente, cambiando el
campo de observación. Tiene también un sistema de cremallera que esta guiado por dos
tornillos de desplazamiento, y permite mover la preparación deslizándolo desde adelante
hacia atrás o de izquierda y derecha y viceversa.

En la parte posterior de uno de los laterales se encuentra un NONIUS (escala) que permite
fijar las coordenadas de cualquier campo óptico y de ésta manera se puede acudir
directamente a él cuando interesa.

-Tubo: es una cámara oscura unido a la columna por medio de una cremallera presenta el
objetivo en su extremo inferior y el ocular en el superior.

-Revolver: es una pieza metálica en forma de casquete situado en el extremo del tuvo y
lleva atornillados los objetivos de distintos aumentos, estos se distinguen por su diferente
longitud, siendo el más corto el de menor aumento.

Cuando hacemos girar el revolver los diferentes objetivos se sitúan sucesivamente en el

eje del objetivo.

Óptica:

Comprende los objetivos, oculares y aparato de iluminación:

-Objetivo: está compuesto por un sistema de lentes convergentes montadas en un tubo

metálico que constituye el soporte del objetivo. Los objetivos actuales llevan lo que se
conoce o denomina moltura telescópica o en resorte que consiste en que la parte central
puede deslizarse en el interior del objetivo, de esta manera al no ser rígido el objetivo se
evita su deteriore en caso de choque con la preparación.

El aumento primario de un objeto es producido por la lente objetiva, ésta imagen se

transmite al ocular donde se realiza el aumento final.

El aumento de una imagen será mayor cuantas más lentes formen parte del objetivo, éste
aumento viene grabado en el tubo soporte y así por ejemplo 10x significa que se aumente
la imagen diez veces con respecto al objeto.

Además del aumento el microscopio tiene una propiedad muy importante que es su poder
de resolución o separación y se define como la capacidad de mostrar diferentes y
separados dos puntos muy próximos.
Cuando mayor sea el poder de resolución mayor será la definición de un objeto. El poder
de resolución de un telescopio radica en el objetivo.

En relación con el poder de resolución existe un concepto que es el de límite de resolución

(R) es la distancia mínima a la que pueden estar situados dos puntos para su perfecta
discriminación el límite de resolución depende de la longitud de onda de la luz utilizada
durante la observación y de una característica de la lente objetivo que es la apertura
numérica del objetivo, este último valor aparece indicado en la montura de los objetivos
modernos.

El poder de resolución de un microscopio será tanto mayor cuanto menor sea el valor del
límite de resolución por lo tanto el aumento de resolución de una lente puede conseguirse
o bien disminuyendo la longitud de onda de la luz incidente, o bien aumentando la apertura
numérica.

Normalmente la longitud de onda viene fijada por lo que para cambiar la resolución lo
haremos en función de la apertura numérica, existen una correspondencia aproximado
entre el aumento de un objetivo y su apertura numérica, de modo que las lentes con
mayores aumentos tendrán mayores aperturas numéricas.

La apertura numérica viene influido primero por la construcción de la lente, y segundo por
el medio a través del cual pasa la luz, si el medio que se interpone es el aire ocurre cuando
trabajamos con objetivos en seco, el índice de refracción de la luz tiene un valor de uno, si
lo que utilizamos es por ejemplo aceite de cedro, cuando usamos objetivos de inmersión,
el índice de refracción es de 1.515.El hecho de que el índice de refracción de la luz cuando
utilicemos aceite, sea mayor nos va a suponer una disminución en el límite de resolución y
como resultante y un aumento de resolución de la lente.

Esto explica porque os objetivos de inmersión tienen mayor apertura numérica que los
objetivos en seco de manera que los objetivos se clasifican en:

-Objetivos secos: son aquellos que no necesitan interponer ninguna sustancia entre el
objetivo y la preparación. Preparación están separadas por aire, los objetivos en seco con
los de 4x, 10x y 40x.

-Objetivos inmersión: son los que se interpone un líquido entre la preparación y la lente,
normalmente se usa liquido transparente, con un índice de refracción mayor que el del
aire, que sea capaz de impedir la desviación de los rayos más oblicuos y así la lente
recogerá más rayos para la formación de la imagen.

Al principio se utilizó aceite de cedro, pero a menudo endurecía por eso actualmente se
usan aceites sintéticos con unos índices de refracción conocidos y uniformes.

-Ocular: Consta de dos lentes o sistemas de ellas que se encuentran montadas en los

extremos de un tubo adaptado a la parte superior del microscopio. Recoge la imagen
suministrada por el objetivo, transformándola en virtual aumentada y derecha, a la lente
superior, se le llama lente ocular y a la inferior colectora o lente de campo. Los oculares
cubren una gama de aumentos de 6x a 25x si bien los más utilizados son los de 10x, para
conocer el aumento total con que se está observando en un momento determinado hay
que multiplicar el aumento debido al objetivo para conocer el aumento total. P. ej. Si
trabajamos con un objetivo de 40x y una lente de 10x trabajaremos con un aumento de
400x.

Los microscopios modernos son normalmente binoculares y permiten una observación

prolongada sin producir cansancio a la vez que proporcionan una mayor calidad de la
imagen.
-Aparato de iluminación: Tiene tres partes que son fuente de iluminación, diafragma y
condensador:

-Fuente de iluminación: situado en el pie, los más antiguos tenían un espejo para recoger
luz natural, actualmente suelen ser bombillas de TUNGSTEN y otras materias, cuya
intensidad de luz es graduable y es reflejado internamente por un espejo lleva un vidrio
difusor de la luz para asimilarlo a la luz natural.

-Diafragma: se encuentra a continuación del espejo es intercalable a voluntad y en algunos

modelos pueden desplazarse de manera que permite enviar la luz a cualquier punto del
campo de visión. Suele estar formado por unas láminas metálicas superpuestas que se
abren y cierran mediante el giro de un rodillo lateral y regula la cantidad de luz que llega a
la muestra.

-Condensador: se encuentra encima del diafragma debajo de la platina formado por varias
lentes, dispuestas de tal manera que al recibir la luz de la fuente salen del condensador
enfocados hacia la preparación Existen también arcosenos que permiten la adicción de
filtros de colores para conseguir mayor contraste en ciertas preparaciones.

3. Manejo del microscopio óptico:

1.- Ajustar primero el asiento al microscopio

2.- Seleccionar el objetivo

3.- Colocar la preparación, para ello bajamos la platina rotando el tronillo macrométrico y
colocamos la preparación sobre ella, sujetándola con las pinzas de la platina, también
centraremos la preparación mediante los tronillos que hay debajo de la platina cuidando de
que este colocado en el sitio adecuado.

4.- Ajuste de la iluminación, enchufamos, encendemos y regulamos la intensidad luminosa

de la lámpara. Cuando se usa el objetivo de inmersión el diafragma está un poco abierto y
el condensador alto y se pondrá una gota de aceite de inmersión y esto se usa para
preparaciones teñidas y sin cubre. Si el objetivo es seco el diafragma se pondrá más
cerrado y en condensador bajo y suele utilizarse para preparaciones en fresco o en
anatomía patológica.

5.- Ajuste de la distancia interpupilar, Se hará moviendo los oculares hasta que se observe
un solo campo visual al mirar por ambos oculares.

6.- Enfoque de la preparación: Cuando usamos el de 100x se coloca una gota de aceite
sobre la preparación después subimos cuidadosamente la platina con el macro hasta tocar
el aceite con el objetivo. Es muy importante mirar esto por fuera del aparato, para no
romper el objetivo por choque. Cuando los objetivos son secos, los demás se coloca con el
macro, la preparación lo más cerca posible del objetivo, sin tocarlo, haciendo también por
fuera del aparato, finalmente en ambos casos se mueve lentamente con el micro y
moviendo los tornillos de observaran diferentes campos. Para cambiar de objetivo no hay
nada más que moer el revolver hasta oír un clic y finalmente ajustamos con el tornillo
micrométrico.

4. Limpieza y cuidados del microscopio:

El microscopio óptico es un instrumento que debe cuidarse con esmero, se debe coger del
brazo para trasladarlo de un lado a otro. Se situará en una mesa recta, ausente de
vibraciones, no se usarán cantidades exageradas de aceite de inmersión porque si no se
quita bien se quedara sobre la lente. Los objetivos secos se limpiarán con agua destilada y
papel para lente. Si el objetivo es de inmersión se limpia con pequeños toques de Xilol y
con papel para lentes con cuidado para que no se desprendan. Se debe hacer una revisión
profesional al año, debe mantenerse tapado y una vez que hallamos terminado, debemos
apartar la fuente de iluminación, quitar el porta, desenchufar y guardarlo limpio y con su
funda.

5. Tipos de microscopios:

1. Microscopio de fluorescencia: la fuente luminosa es luz ultravioleta y una estructura

es solo visible si es fluorescente. Podemos encontrarnos sustancias que son fluorescentes
por sí mismo como por ejemplo el triptófano, también hay sustancias que se pueden hacer
fluorescentes captando determinados colorantes como la auramina que se utiliza para el
diagnóstico de ácidos, alcohol persistentes.

2. Microscopio electrónico: está formado por una fuente de iluminación que son
electrones que inciden sobre el objeto y luego son refractados y se recogen sobre una
pantalla en la que se dibuja la imagen del objeto.

3. Microscopio de fases: permite el estudio de objetos transparentes y no coloreados,

esto es así porque las preparaciones microscópicas tiene variaciones en su índice de
refracción entre las distintas partes de su estructura. Esto hace que se produzcan
variaciones de luminosidad y que se observen las diferentes partes de la preparación. A
los microscopios normales se los puede equipar con dispositivos de contraste de fases. Se
utilizan para preparaciones citológicas y bacteriológicas.

4. Microscopio de campo oscuro: en el la luz no entra directamente en el objeto. Si no

que es refractada por él. El objeto va a aparecer brillante sobre un fondo negro. Este
microscopio lleva un condensador especial.

Teoría Química y Ejercicios:

Normalidad: Se define la normalidad como el número de equivalentes gramo de soluto.

Para hallar el número de equivalentes gramos de soluto se divide la masa en gramos
partido del peso equivalente en gramos.

Molaridad: Se define como el número de moles de soluto entre los litros de disolución.

Molalidad: Se define como el número de moles de soluto entre los kilogramos de

disolvente.

Fracción molar: La relación que existe entre los moles de cada componente de la
disolución y los moles totales, por un lado tenemos la fracción molar del soluto y por otro
lado la del disolvente, En caso de que el soluto sea líquido, lo que ocurre que muchas
ocasiones habrá que reconvertir la unidad de masa en unidad de volumen, para ello
necesito conocer la densidad de la disolución, existe una disolución directa entre
concentración y densidad de manera que a cada concentración le corresponde una
densidad determinada y viceversa.
Preparación de disoluciones: Dependerá de si el soluto es un sólido o es un líquido.

-En sólido Realizaremos los cálculos, pesaremos los gramos necesarios teniendo en

cuenta la pureza del reactivo de partida que suele expresarse en % p/p. En un vaso de
precipitado se disuelve el soluto en aproximadamente 2/3 del disolvente. Se pasa aun
matraz aforado a través de un embudo (en principio sin filtro) y se completa con el
disolvente hasta la línea de enrase. Después se embotella y se etiqueta. Los datos que
recogemos en la etiqueta son:

Nombre de la disolución, Fórmula, Fecha, Concentración, Preparador.

-En líquido: Realizaremos los cálculos, calcularemos si se necesita los ml según la

densidad. Se pipetean los ml necesarios en un matraz aforados se añade el volumen
pipeteado, se añade el disolvente enrasado al aforo y se agita. En el caso en el que sea un
ácido se añadirá primero el disolvente, después el ácido y por último se enrasa con el
disolvente. Se embotella y etiqueta de la misma forma que antes.

Concentraciones: En el laboratorio muchos casos es necesario diluir las muestras o

reactivos para obtener concentraciones adecuadas. La perfecta preparación de estas
disoluciones es imprescindible para obtener buenos resultados.

Para realizar diluciones se parte siempre de una disolución inicial o disolución madre o
disolución concentrada y se llega una disolución final o disolución hija que es la diluida.

Las diluciones que se realizan se expresan como una unidad de la solución inicial por el
número de unidades de la disolución final. Por ejemplo una disolución 1/10 significa que
una unidad de la solución inicial ha sido diluida hasta un volumen final de 10 unidades.

Aquellas concentraciones en las cuales se expresa la concentración como cantidad de

soluto en un volumen fijo de disolución como puede ser la normalidad, molalidad, el tanto
por ciento p/p, v/p, v/v, se denomina escalas volumétricas de concentración. Cuando la
concentración se expresa en una de éstas escalas volumétricas, la cantidad de soluto
contenido en un volumen de disolución es igual al producto del volumen por la
concentración. Esto se puede expresar como:

Si diluimos una concentración el volumen de la misma aumenta, a la vez que disminuya su

concentración, mientras que la cantidad de soluto presente permanecerá constante. Por
ello dos soluciones con distintas concentraciones, pero que tienen las mismas cantidades
de soluto, se relacionan de la siguiente manera.

De esta manera podemos despejar la concentración2:

La dilución se expresa por un cociente que puede ser A/B. Donde A es la parte de la
solución concentrada y B es la parte diluida, es decir, el volumen total. Las diluciones se
presentan siempre como números quebrados y nº enteros donde en el numerador van
siempre las unidades.
El pH de una disolución acuosa se puede determinar experimentalmente de la siguiente
manera:

1º mediante el uso de indicadores de ácido-base

2º mediante métodos potenciométricos con uso de pHmetros

Un indicador acido base es una sustancia que experimenta una variación cromática
perceptible en un cierto intervalo. Ej.: en el rojo de metilo tiene un color amarillo a un pH
mayor de 4.2 y rojo a menor de 3.

Estos indicadores se pueden usar en forma de papeles indicadores o en forma de

solución.

-Papel indicador: se impregna el papel con el líquido durante unos segundos y se compara
con una escala de colores.

-PHmetro: son unos aparatos que se basan en la fuerza electromotriz de una pila.
Depende de los potenciales redox, de los electrodos que la forma y de la composición de
la sustancia en la que están sumergidos. Se trata de buscar un electrodo cuya potencia
depende de la actividad de los iones H de la solución y se mide la fuerza electromotriz de
la pila formada con el electrodo y con otro de referencia de potencial conocido. Para medir
el pH suele utilizarse el electrodo de vidrio.

En las células variaciones de 0.4 en el pH son mortales. El organismo está regulado para
que el pH del medio interno no varíe más de 0.1

Sistemas amortiguadores tampón o buffer: Una disolución tampón tiene la misión de

impedir cambios bruscos de pH para hacerlo se ponen determinadas cantidades de un
ácido débil más la base fuerte o de una base débil más acido fuerte. Llevan siempre el
mismo tipo de iones metálicos. Para que en la disolución haya el mismo tipo de iones, lo
más frecuentes son los iones fosfato y acetato.

En el organismo humano los sistemas tampón se mantiene sobre todo por la presencia de
los bicarbonatos y por el sistema fosfato.

Acido carbónico: H2CO3 / -HCO3 / --CO3

Ácido ortofosfórico: H3PO4 / -H2PO4 / --H

1.- Calcular la Normalidad de una disolución de 20gr. De NaOH en 500ml de disolución

N= (20/40/1)/0.5 = 1 N=1

2.- Calcular la M y N de una disolución de 100 gr. de sulfato cúprico o sulfato de cobre (II)

S2O6 = SO3 + H2O = H2SO4 CuSO4 p.m.=159

M= 100/159 = 0.62 M N=200/159 = 1.258 N

3.- Calcular la cantidad de soluto necesario para preparar 3L de disolución 0.4M de
perbromato de calcio.

Br2O7 + H2O H2Br2O8 = HBrO4 Ca(BrO4)2

V=3

M= 0.4 0.4 = (gr./328)/3 0.4·3 = gr./328 1.2 = gr./328 gr. = 328·1.2 gr. = 393.46

P.m.= 327.88 aprox 328

4.- Calcular la N de una disolución de LiOH sabiendo que tiene 5gr. De soluto en 300 cm3
de disolución

Hidróxido de Litio LiOH Valencia = 1

V = 300ml = 0.3 L

N =¿? N= ((5/24)/1)/0.3 N = 0.69

Gr. = 5

p.m. = 24

5.- Indique como prepararía 100 cm3 de una disolución de 3M de ácido clorhídrico a partir
de un reactivo comercial cuya riqueza es del 35% y una densidad de 1.18 gr. /cm3.

Ácido clorhídrico = HCl

V=100 = 0.1 L M = (gr./36.5) / 0.1 gr. = 10.95 de ác. Puro

M=3 d = m/v 1.18 = 10.95/V V=9.28 ml

R= 35%

D= 1.18 gr./ml 9.28 ml ---------- 35%

p.m. = 36.5 x ml ---------- 100 %

x = 26.51 ml

6.- Calcular la molalidad de una disolución de NaCl que se forma añadiendo 0.9gr. De
NaCl a 100 gr. de H2O

m =(0.9/58.5)/0.15 molal

7.- Halla las fracciones molares del soluto y disolvente del ejercicio anterior.

Xs = 0.015/5.575 = 0.0027 Xd = 5.59/5.575 = 0.997

8.- En 35 gr. De H2O se disuelven 5gr. De HCl, la d de la disolución es 1.060 gr. /ml. Hallar
la concentración en

A: % p/p B: gr. /L C: Molaridad (M) D: Normalidad (N)

a) 5/40 · 100 = 12.5 %

b) 1.060 gr. ----------1 ml x = 37.7 ml = 0.0377 L

40 gr. ---------- x ml

Gr./L= 5/0.0377 = 132.62 g/L

c) M = 0.14/0.0377 = 3.63 M

d) N = ((5/36.5)/1)/0.0377 = 3.63 N

9.- Una disolución está formada por 30gr. De ortofosfito de sodio en 430gr. De H2O.
Calcular % en peso. Molalidad, Fracción molar del soluto y disolvente

P2O3 + 3H2O = H6P2O6 = H3PO3 Na3(PO3)

30 gr. De Na3(PO3) = 0.203 moles

430 gr. De H2O = 23.89 moles

%p/p = ¿? % p/p = 30/460 · 100 = 6.52 p/p

m= ¿? m = 0.203/0.430 = 0.47 molal

Xs = ¿? Xs = 0.203/24 =0.0085

Xd = ¿? Xd = 23.89/24 = 0.9954

10.- Determinar los centímetros cúbicos de una potasa (KOH) comercial, de densidad 1.15
gr. /cm3 y riqueza del 34% que se necesitan para preparar 4L de disolución 0.4 N.

D = 1.15 gr./ml 0.4 = ((gr./56)/1)/4 1.6 = gr./56 gr. = 89.6 de soluto puros

R= 34% 100 gr. ----------- 34 gr. x = 263.52 gr. de soluto necesarios para disolución

V= 4L x gr. ----------- 89.6 gr.

N=0.4 263.52/1.15 = 229.148 cm3 es el volumen del soluto necesario para la disolución al
34 por ciento de riqueza

11.- Calcular los gramos de NaOH con una riqueza del 80% que se necesita para preparar
100 ml. De una disolución 0.4M

R = 80%

V= 100 ml= 0.1L 0.4 = (gr./40)/0.1 gr. = 0.1·0.4· 40 gr. = 1.6

M = 0.4

Gr. = ¿?

12.- Cuantos gramos de ácido nítrico hay en 250 ml de una disolución 3M?

Gr. = ¿? N2O5 + H2O = H2N2O6 = HNO3

V= 250 ml = 0.25 L 3=(gr./36)/0.25 gr.= 3·0.25·63 gr.= 47.25

M=3

13.- Tenemos un ácido sulfuroso del 80% de riqueza en peso y 1.25 gr. /ml de densidad.
¿Cuantos ml de ese ácido se deben utilizar para obtener 50 ml de una disolución 0.2N?

S2O4 + H2O = H2S2O6 = HSO3

R = 80% 0.2 = (gr./82)/0.05 gr. = 0.82

D = 1.25 riqueza: 0.82·100/80 = 1.025 gr.

V= 50 ml = 0.05 L Volumen de HSO3 = 0.101/1.25 = 0.081 ml de ácido sulfuroso

N =0.2
14.- Calcula la fracción molar del soluto y disolvente de una disolución formada por 150 gr.
De nitrato potásico y 1000 gr. De H2O.

150 gr. de KNO3 150/101 = 1.49 moles Xs = 1.49/57.05 = 0.026

1000 gr. de H2O 1000/18 = 55.55 moles Xd = 55.56/57.05 = 0.974

15.- En el laboratorio disponemos de un ácido hipocloroso cuya densidad es 1.2 gr. /ml y
36% riqueza en peso. Calcular el volumen necesario que hay que formar para preparar
500 ml de una disolución 0.1N

Cl2O1 + H2O = H2Cl2O2 = HClO

d = 1.2 0.1 = ((gr/52.5)/1)/0.5 gr. = 2.625 de HClO puros que se necesitan

r =36% riqueza: 2.625·100/36 = 7.29 gr. de HClO que hay que diluir

V = ¿? De HClO d= m/V V=m/d V = 7.29/1.2 = 6.07 de HClO

V = 500 ml = 0.5 L

N =0.1

16.- Calcular la valencia de estos compuestos a la hora de preparar los reactivos:

a) Nitrato de plata N2O5 + H2O = H2N2O6 = HNO3 Ag(NO3) = 1

b) Sulfato de plata S2O6 = SO3 + H2O = H2SO4 Ag2(SO4) = 2

c) Perclorato de calcio Cl2O7 + H2O = H2Cl2O8 = HClO4 Ca(ClO4)2= 2

d) Ortofosfato de Sodio P2O5 + 3H2O = H6P2O6= H3PO3 Na3(PO3)= 3

e) Nitrito férrico N2O3 + H2O = H2N2O4 = HNO2 Fe(NO)3 = 3

f) Ácido fluorhídrico HF = 1

17.- Se disuelven 180 g. de sosa cáustica en 400 gr. De agua. La densidad es 1.340 gr.
/ml Calcular:

a) % p/p b) g/L c) M d) N e) m

a) %p/p = 180/580 ·100 = 31.01 % p/p

b) g/L= 180/0.43284 = 415.85 gr./L

1.340 gr. ---------- 1 ml x = 432.84 ml = 0.43284 L

580 gr. ---------- x ml

c) M = 4.5/0.43284 = 10.39 molar

d) N = (moles/valencia)/L disolución N = (4.5/1)/0.43284 = 10.39 normal

e) m = moles soluto / Kg. disolvente m = 4.5/0.4= 11.25 molal

18.- Preparar 250 ml de solución NaCl al 5% p/v.

% p/v = gr. soluto/ml disolución ·100 5 = gr./250 gr. = 250·5 gr.=1250 gr. de NaCl

19.- Preparar 100 ml de una disolución de CaCl2 al 6% p/v sabiendo que la riqueza del
reactivo comercial es del 98%. Explícalo.

6 = gr. / 100 gr. = 600 de CaCl2 se necesitan puros

Como la riqueza es del 98% 600·100 / 98 = 612.24 gr. se necesitan para que 600 sean
puros

*Para prepararlo necesitamos 600 gramos puros de cloruro de calcio pero como el reactivo
tiene un 98% de riqueza hay que añadir un poco más para que haya 600 entonces
echamos 612.24 gramos de cloruro de calcio y enrasamos con el disolvente hasta los 100
ml.

20.- Calcular el volumen de un alcohol de 96º que se necesita para preparar 250 ml de un
alcohol de 70º.

C1= 96º

V1= ¿? V1= (V2· C2)/C1 V1=250·70/96 V1=182.29 ml

C2= 70º *Tomaremos 182 ml del alcohol de 96º y completaremos con agua hasta 250 ml

V2= 250ml

21.- Queremos preparar una batería de alcoholes seriados y utilizamos alcoholes de 100º,
96º, 80º, 70º, 50º, 30º.

a) Calcular 300 de cada uno partiendo siempre del de 100º

b) Hacerlo con su verdadera graduación 99.5º

c) Hacerlo a partir del anterior.

a) a1 100·300 = 100 · V2 V2= 300 ml c) c1 99.5 · 300 = 100 · V2 V2 = 298.5 ml

a2 96 · 300 = 100 · V2 V2= 288 ml c2 96 · 300 = 99.5 · V2 V2 = 289.44 ml

a3 80 · 300 = 100 · V2 V2= 240 ml c3 80 · 300 = 96 · V2 V2 = 250 ml

a4 70 · 300 = 100 · V2 V2= 210 ml c4 70 · 300 = 80 · V2 V2 = 262.5 ml

a5 50 · 300 = 100 · V2 V2 = 150 ml c5 50 · 300 = 70 · V2 V2 = 214 ml

a6 30 · 300 = 100 · V2 V2 = 90 ml c6 30 · 300 = 50 · V2 V2 = 180 ml

b) b1 100 · 300 = 99.5 · V2 V2 = 301.5 ml b2 96 · 300 = 99.5 · V2 V2 = 289.45 ml

b3 80 · 300 = 99.5 · V2 V2 = 241.2 ml b4 70 · 300 = 99.5 · V2 V2 = 211.05

b5 50 ·300 = 99.5 · V2 V2 = 150.75 ml b6 30 · 300 = 99.5 · V2 V2 = 90.45 ml

22.- A que dilución se encuentra un suero si tenemos 0.25 ml del suero de un enfermo en
39.75 de solución salina fisiológica. A= 0.25 ml B= 0.25+39.75

0.25/40 = 1 /d d = 160 1/160

23.- Hacer una dilución 1/80 a partir de 0.25 ml de suero fisiológico. Hacer otra dilución
1/60 a partir de 0.15 ml de suero fisiológico

a) 1/80 = 0.25/0.25+x 0.25+x = 0.25 · 80 x = 20-0.25 x = 19.75 ml

b) 1/60 = 0.15/0.15+x 0.15+x = 0.15 · 60 x = 9-0.15 x = 8.85 ml

Tema 5: Fijadores (Procesado de Tejidos)

 Introducción:
Una vez que una pieza histológica ha llegado al servicio de Anatomía Patológica comienza
su estudio microscópico de biopsias y piezas quirúrgicas, comprende un conjunto de
métodos estructurados que configuran un sistema de actuación constante para cada
muestra de forma que los resultados puedan ser reproducidos por diferentes patólogos.

Aunque el técnico en anatomía patológica no está obligado a participar en el examen

microscópico, es conveniente conocer algunos aspectos del proceso, previamente a éste
estudio microscópico el técnico ha realizado las siguientes tareas que son: comprobar el
volante, poner el número de entrada y registrar la muestra.

Los objetivos del examen microscópico son:

 Describir exactamente el tipo de material remitido para el estudio, por eso la pieza se pesa,
mide, describe lesiones que contiene, morfología, aspecto, coloración y en casos de piezas
quirúrgicas, sus relaciones con estructuras vecinas.

 seleccionar las áreas donde se hará el estudio microscópico, a esto se le llama tallado o muestreo
del material y lo hace generalmente el patólogo ayudado por el técnico.

Todo esto se graba, nosotros pondremos el número de orden en el casete tantas como
indique el patólogo. El patólogo cortara los trocos necesarios y los meterá en su casete
correspondiente, El resto de la pieza se guarda en el bote de procedencias, si es un
aparato, con el fijador correspondiente. Se guarda hasta que quede emitido el informe o
los protocolos del hospital. Si piden fotos se hacen. Los trozos tallados deben tener como
mucho 0.5 cm. de lado.

Se limpia y se pasa a una pieza.

El tallado se realiza al principio o al final de la mañana.

 Funcionamientos del proceso de fijación tisular.

En anatomía patológica el primero objetivo consiste en observar la estructura tisular. Lo
más parecido posible a como nos lo encontramos en el organismo, pero al no poder
estudiarla dentro de este organismo sino separarla de él. El órgano de estudio ha
comenzado ya su proceso de descomposición por lo que para un mejor estudio de este
órgano ha de ser fijado después de su extirpación con el fin de que se conserve lo más
veraz posible de esta manera se observarán tanto el buen funcionamiento y estructura del
órgano como la patología de esta.

Los fijadores además de conservar intacta la estructura durante un espacio de tiempo más
o menos largo, paralizan todos los procesos orgánicos.

La fijación ideal se realiza entre 0ºC y 4ºC porque aunque el frío retarda la acción del
fijador al contraer la pieza, también paraliza la autolisis del tejido que será más o menos
rápida dependiendo por ejemplo los tejidos ricos en enzimas digestivas como el páncreas
o aquellos que tienen gran cantidad de gérmenes sufran la autolisis con mayor intensidad.

 Principios generales de la fijación.

Los principios generales:

 No existe un método universal de fijación, por lo que un agente fijador para un tejido no tiene
por qué ser adecuado para otro.

 No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido, porque fijación no equivale a

conservación tisular.

 Un defecto en la fijación nunca puede ser corregido.

 Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con grandes defectos de fijación.
 Clases de fijadores según su mecanismo de acción
 Físicos:
 Congelación: Se utiliza como método para la fijación el enfriamiento por congelación del tejido
es el método de elección para realizar estudios morfológicos o funcionales en los que se requiere
conservar intacta la estructura antígena del tejido o su contenido enzimático. La clave para una
correcta fijación por congelación del tejido es que su realización sea instantánea porque un
enfriamiento lento provoca la formación de microcristales titulares de hielo que pueden agregarse
con el paso del tiempo produciendo roturas titulares que dificulten el diagnostico-

El procedimiento idóneo para fijar tejidos por congelación consiste en utilizar

ISOPENTANO a menos de 50ºC como agente de congelación y realizar una
fragmentación suficiente de la muestra que se vaya a congelar.

Normalmente se preparan bloques de no más de 3 cm. cuadrados de superficie y 3 mm de

espesor de modo que el proceso de congelación instantánea no requiera más de 10
segundos. El mantenimiento continuo de isopentano debe realizarse en un congelador
programado a -70ºC para que quede compensado la subida inmediata de la temperatura
que se produce al extraer el líquido del congelador.

Al enfriar tanto no actúan bacterias ni enzimas y el tejido se endurece para cortar estos
tejidos utilizamos el microtomo de congelación o un aparato más evolucionado o criostato
el cual tiene como ventajas que la temperatura se mantiene más baja y se pueden realizar
cortes más finos entre 2 y 15 micras.

 Criodesecación o filiación: Consiste en someter al tejido a dos procesos el primero es la

fijación instantánea por congelación en Nitrógeno líquido y el segundo desecación por sublimación
directa del agua confiada a vapor en una bomba de vacío es un proceso complicado y costoso pero
tiene una ventaja muy importante y es que al eliminar totalmente el agua tisular, paraliza la autolisis
y produce una conservación indefinida, además evita que se produzcan enlaces químicos entre el
tejido y el fijador, conservando asila estructura antigénica tisular.

 Criosustitución: es la sustitución lenta y progresiva del agua congelada de un tejido por un

líquido fijador que en ocasiones puede actuar simultáneamente como medio de inclusión. Tras la
congelación instantánea del tejido con nitrógeno líquido o isopentano a -50ºC se coloca el tejido
congelado en el medio de sustitución, este medio está formado por una mezcla de alcohol etílico,
acetona y propilén- glicol. Enfriado a -40ºC, el intercambio del agua tisular por el líquido de
sustitución, se realiza dentro de un congelador y debe procurarse que la temperatura no disminuya
del punto de congelación del líquido de sustitución.

 Químicos:
 Características fundamentales de un líquido fijador: Los fijadores por métodos químicos son
normalmente químicos y deben poseer unas características que son las siguientes:

 Deben tener la capacidad de bloquear de inmediato la autolisis, paralizando la actividad

enzimática del tejido.

 Poseer un efecto microbicida, que impide la acción bacteriana responsable de la putrefacción.

 Son capaz de no provocar sobre el tejido retracciones o distorsiones que generen anomalías en
su estructura.

 Sea capaz de inducir cambios en la textura y composición tisular que favorezcan la inclusión, el
corte y la coloración del material histológico (favorecer la coloración posterior es decir tienen
carácter mordiente)
De todas estas características la más importante es la capacidad de bloquear la autolisis
de inmediato y se va a relacionar con dos cualidades del agente fijador:

 Velocidad de penetración: y se refiere a la rapidez con lo que un fijador se difunde en el interior

de un tejido de manera que el tamaño de una pieza que se pretende fijar ha de ser proporcional a la
velocidad de penetración del agente fijador que se va a utilizar.

 La velocidad de fijación: se refiere al tiempo que cada fijador tarda en estabilizar los
componentes químicos de los tejidos. La velocidad de fijación de un agente químico no siempre es
proporcional a su velocidad de penetración.

 Reglas generales en el empleo del líquido fijador:

 Para evitar la autolisis, las piezas deben tallarse lo antes posible y no deben ser muy gruesas ya
que en este caso el fijador tardaría mucho en penetrar en el centro de la pieza por lo que es preferible
que al tallarlo se hagan cortes con un grosor máximo de 5 mm. ó 0.5cm.

Si se va a fijar un órgano en bloque para preservar la arquitectura del órgano se deben

realizar incisiones, cortes, sobre su superficie y apertura de sus cavidades internas con el
fin de que el líquido fijador alcance lo más rápidamente posible el interior del tejido. Para
conseguir una buena fijación de órganos huecos éstos deben ser rellenados con líquido
fijador y atados en sus extremos.

 El volumen del fijador respecto al de la pieza, es un punto muy importante para la fijación, lo
ideal es 1-20 como mínimo.

 En la fijación con líquido que pierde eficacia al utilizarlos hay que ser mucho más cuidadoso.
Este es el caso del Formol que debe ser renovado cada cierto tiempo en una misma fijación, ya que
pierde eficacia también hay que ser precavidos en el resto de los fijadores porque generalmente
todos los fijadores con volátiles, por lo que nunca será empleado el mismo fijador más de una vez.

 Para lograr una fijación correcta el líquido tendrá que estar en contacto con todas las paredes del
tejido, es por eso que no es conveniente meter en un mismo frasco varias piezas porque podrían
pagarse unas a otras y evitar la penetración del fijador.

Si en una misma biopsia se presentan varios fragmentos nunca deben pegarse al ser
sumergidos ni deben fijarse diferentes órganos en un mismo recipiente
 Los tejidos que flotan como por ejemplo grasa o tejido pulmonar no deben quedarse en la
superficie por lo que deben envolverse en papel de filtro o gasa pesen vallan hacia el fondo y así
estén rodeados del fijador.

 Cada fijador tiene un tiempo de fijación que va a depender de su capacidad de penetración y del
tipo de tejido. Si este tiempo de fijación se prolonga se produce en endurecimientos en distintas
estructuras del tejido. Solo se permitirá la permanencia de un tejido: en un fijador, si además al tener
esta propiedad es un líquido conservante porque si no se corre el peligro de que bacterias aerobias
descompongan el tejido.

 Durante la fijación se producen accidentes que modifican el estado de la pieza, los más
importantes son la Hinchazón y la retracción de los tejidos así como la alteración en el color. Si por
ejemplo: el ácido acético produce hinchazón debido a que deshace los enlaces formando moléculas
de agua que son absorbidas por la pieza. Otros como el ácido crómico, alcohol y acetona, realizan el
efecto contrario porque el fijador absorbe el agua del tejido por eso es importante que la presión
osmótica del líquido fijador sea equivalente a la del tejido y que la de su pH se aproxime al pH
fisiológico salvo que nos interese que su composición sea acida. Este último caso nos interesa para
descalcificar.

 Cada fijador tiene características negativas y positivas por tanto ninguno es el mejor y para cada
tipo de tejido será conveniente usas uno u otro. Los fijadores puros no suelen usarse porque serán
buenos fijadores de algunas estructuras pero estropearan otras. Por ello lo que más se usan serán las
mezclas de varios fijadores que permiten un campo de trabajo más amplio.

 Líquidos fijadores simples: Dependiendo del mecanismo de actuación sobre los tejidos

podemos clasificar los líquidos fijos simples en 4 apartados:

 Fijadores por deshidratación tisular: Alcohol etílico y acetona. Son sustancias altamente
higroscópicas es decir absorben agua actúan eliminando tanto el agua libre como el agua ligada a las
proteínas de forma que estas últimas precipitan y disminuyen su solubilidad. Este cambio proteico es
conocido con el nombre de desnaturalización y provoca importantes alteraciones en la organización
y estructura celular y tisular, por tanto estos agentes fijadores inducen grandes cambios en la
morfología orgánica sobre todo si se emplean como agentes fijadores aislados. Alguno de ellos como
por ejemplo la acetona, altera poco la estructura antigénica tisular y ello se debe a que estos
fenomenitos inducidos son reversibles en parte tras la rehidratación. El fundamente molecular de la
acción deshidratante de los alcoholes y la acetona, está en la competición que establecen con las
proteínas por las moléculas de agua cuando se encuentra en soluciones concentrada, los principales
agentes fijadores por deshidratación son alcoholes metílico y etílico, acetona y cloroformo.

Los únicos que se utilizan como fijadores simples son el alcohol etílico y la acetona.

El alcohol metílico se emplea exclusivamente para la fijación de extensiones

hematológicas.

Alcohol etílico: líquido claro, transparente o incoloro, volátil, inflamable y de olor

agradable. En el comercio se puede encontrar puro en cuyo caso tiene fuertes
gravámenes tributarios para evitar su utilización clandestina para evitar la fabricación de
bebidas alcohólicas, o bien lo tenemos desnaturalizado diluido al 90 o 70 %. Como fijador
único utilizaremos alcohol a unas concentraciones entre el 70 y 90% y se obtiene cogiendo
de 70-90 ml de alcohol puro y se lleva hasta 100 con agua destilada. La fijación más
potente va a corresponder a las soluciones más concentradas pero a altas
concentraciones la capa externa del tejido se endurece en exceso, lo que impide la
penetración del fijador a la parte interna de la pieza.

El tiempo de fijación correspondiente a una pieza de 5mm de espesor es dos a cuatro

horas renovando unas 3 veces el líquido.

Es un fijador que preserva el glucógeno y la actividad de ciertas enzimas titulares, fija los
pigmentos y se emplea en las extensiones citológicas. Como altera escasamente la
estructura antigénica de los tejidos es un buen agente fijador para inmunohistoquímica.
Entre las ventajas del alcohol están:

 Fijan y deshidratan al mismo tiempo

 Posee una gran velocidad de penetración
 Precipita muy rápidamente las proteínas y el glucógeno lo que unido a la anterior propiedad
aporta extraordinariamente el tiempo de fijación es un notable agente bactericida y por tanto un buen
conservante.

Entre sus inconvenientes tenemos los siguientes:

 Fijan y deshidratan al mismo tiempo: es incompatible con muchos fijadores: KCr2 o el OsO3 lo
que limita su participación en muchas mezclas fijadoras.

 No fija adecuadamente la cromatina porque disuelve los ácidos nucleicos y además disuelve
parcialmente los lípidos.

 Endurece y contrae excesivamente los tejidos.

 A medida que realiza la fijación se va diluyendo al incorporar el agua que extrae de los tejidos
por lo cual pierde actividad progresivamente

 Prepara más la tinción porque carece de efecto mordiente

 Puede dar origen a fenómenos de desplazamiento de sustancias.
Acetona: es un líquido transparente, inflamable, muy volátil y de olor dulzor. Des hidrata
rápidamente y considerable el tejido por lo que es poco utilizable. El tiempo de fijación
nunca excederá de dos horas y en piezas delgadas son recomendables 20 minutos. Su
uso como fijador está prácticamente limitado a los métodos histoquímicos e
inmunohistoquímicos porque conserva muy bien la estructura antigénica y la actividad
enzimática, a veces también se utiliza en microscopia electrónica para la fijación del
material que se va a incluir en resinas acrílicas. Se emplea generalmente sin diluir a 4ºC,
entre sus inconvenientes más notables provocan una gran contracción tisular y por tanto
grandes artefactos que suelen hacer inútil su empleo en el microscopio óptico
convencional otro de sus inconvenientes es que debido a su rapidez de acción y a su
capacidad de endurecimiento es imprescindible controlar el tiempo de fijación.

 Fijadores que actúan por cambios en el estado coloidal de las proteínas: Las proteínas son
moléculas anfóteras (pueden comportarse como ácidos o bases, según el pH) cuyo punto isoeléctrico
se encuentra en torno a un pH de 5.8. En este punto la estabilidad de las moléculas es mínima y su
disociación máxima. Ésta escasa estabilidad molecular se debe a que las proteínas en este punto se
desprende del agua líquida o endógena. Por este motivo las proteínas precipitan en presencia de
determinadas ácidos que disminuyen el pH de la disolución hasta alcanzar el punto isoeléctrico.

Todos los fijadores de este grupo son de carácter ácido y se emplean formando parte de
mezclas fijadores. Poseen además una gran velocidad d penetración en los tejidos y algún
poder de descalificación.

Ácido acético: Líquido transparente y fuerte olor avinagrado. Sus vapores son muy
inflamables en estado puro se denomina: ác. Acético glacial. Cuando la temperatura
ambiente disminuye o aumenta, disminuye por debajo de los 10ºC tiende a solidificarse en
forma de agujas cristalizadas muy cáusticas. Se utiliza diluido en concentraciones entre el
1 y 5 % formando parte de mezclas fijadores o de soluciones descalcificantes. Entre las
ventajas que tiene es el fijador ideal para núcleo proteínas y acido nucleicos y otra es
precipitar proteínas sin sustraer el agua de los tejidos porque no es giroscópico y produce
cierto edema intersticial que compensa la excesiva refracción pausado por otros agentes
fijadores. Entre los inconvenientes es mal fijador de citoplasma y membranas celular y
destruye mitocondrias.

Ácido tricloroacético: Son cristales incoloros cáusticos, solubles en agua en solución al 5

% fija los nervios de 8 a 20 horas. Nunca se lavan el tejido después de usar éste ácido
porque el edema que produce es excesivo y de lugar a muchos artefactos. Al 2.5 % se usa
mezclado con otras sustancias.

Ácido sulfosalicílico: Se usa al 5% es buen fijador porque permite casi todas las
coloraciones endurece óptimamente los tejidos pero no los contrae después hay que lavar
el tejido con agua pero la fijación debe hacerse en la oscuridad de 6 a 24 horas.

Ácido crómico: Se emplea en disoluciones al 2% formando parte de mezclas fijadoras, se

utiliza bastante en microscopia electrónica entre las ventajas que tiene:

-Excelente fijador estructural y actúa como mordiente en tinciones que emplean colorantes
básicos, entre los colorantes que tiene es que incompatible con fijadores habituales como
el formol y alcohol.
-Escasa velocidad de penetración en trozos pequeños tarde varios días en penetrar en la
pieza

-Impregna de coloración verdosa los tejidos por lo que hay que lavarlos abundantemente
en agua destilada tras el uso de ese acido, los tejidos quedan excesivamente blandos.

 Fijadores por formación de sales con los tejidos: En estos casos el fijador es un catión metálico
fundamentalmente cromo o mercurio o un derivado orgánico como el ácido pícrico que son
susceptibles de formar con los tejidos sales denominados protenatos metálicos o picratos por lo
general todos los agentes d este grupo poseen gran velocidad de penetración y fijación porque la
formación de la sel, se produce instantáneamente.

Se origina un efecto barrera al actuar los proteinatos formados superficie como dos
mecanismos obstaculizando penetración fijador además se produce sobre el tejido
precipitación metálica lo que provoca un notable endurecimiento que obliga a emplearlo en
mezclas fijadoras que amortigüen este efecto.

Cloruro de mercurio o sublimado: es un polvo cristalino blanco y venenoso y hay que

usarlo bajo campana se usa en soluciones del 5-6%. El efecto fijador se consigue por la
combinación de los iones de Mercurio con los grupos ácidos de las proteínas
especialmente con los de carácter carboxílico, hidroxílico, sulfidrilo y con los residuos
fosfóricos de las nucleoproteínas.

Ventajas: entre sus ventajas tenemos que es un excelente fijador de los caracteres
morfológicos celulares por lo que es el de elección para patologías hematopoyéticas y
renales, donde el diagnostico se apoya normalmente en la observación de finos detalles
nucleares y citoplasmáticos.

Es un excelente mordiente por lo que produce intensa y brillante coloración nuclear y

citoplasmática.

Inconvenientes: No es un buen bactericida por lo que no es un buen líquido conservante

tiene escasa capacidad de penetración por lo que requiere fraccionamiento cuidadoso del
tejido. Otro de los inconvenientes es que si se prolonga demasiado tiempo de actuación
contrae y endurece los tejidos hasta dificultar el corte en el microtomo, por eso nunca
deben sobrepasarse las 4 horas de fijación. Tras haber cumplido esta y común paso previo
a la inclusión, los tejidos pueden conservarse indefinidamente en alcohol etílico al 70%.
Otro de los inconvenientes es que de origen a precipitados metálicos de color pardo sobre
los tejidos lo cual dificulta su observación al microscopio estos precipitados pueden
eliminarse mediante tratamiento del tejido previo a la coloración con soluciones alcohólicas
yodales semejantes al LUGOL yodadas.

Dicromato Potásico: es un polvo amarillento que reacciona con las proteínas para formar
cromatos, se utiliza en disolución acuosa al 1-2%, fija las proteínas por lo que las
mitocondrias quedan perfectamente conversadas y da un aspecto homogéneo al núcleo
después de la fijación del dicromato deben lavarse abundantemente con agua.

Ventajas: es que tiene un fuerte efecto mordiente excelente fijador para lapidar complejos
para mielina, mitocondrias y aparato de Golgi que los contienen en abundancia. Su
utilización es indispensable para técnicas de impregnación argéntica de las células del
sistema nervioso central.

Inconvenientes: el primero de ellos es incompatible con alcohol y formol, posee baja

velocidad de penetración y endurece escasamente los tejidos lo que puede dificultar el
corte en el microtomo. Otro: provoca artefactos titulares como la aparición de vacuolas
citoplasmáticas, retracciones y cambios en la morfología nuclear. Otro: disuelve la
cromatina por lo que es necesario en estos casos asociarlo con ácido acético dentro de
mezclas fijadoras.

Los tejidos han de ser lavados después de fijados en una solución salina o tamponada
para evitar el depósito de pigmento verde que puede producirse en el curso de la inclusión
o coloración posterior.

Ácido Pícrico: En el comercio se encuentra en forma de agujas cristalizadas de color

amarillo muy tóxicas de carácter explosivo.

Actúa coagulando las proteínas a través de la formación de picratos que las confieren gran
apetencia por colorantes ácidos. Se utiliza en solución saturada al 2%, es un excelente
fijador estructural que conserva adecuadamente la composición proteica de los tejidos.
Controlando adecuadamente el tiempo de fijación produce una óptima contracción de los
tejidos que favorece su procesamiento histológico.

Aunque tiene penetración algo lenta posee buena velocidad de fijación no disuelve el
glicógeno ni los lípidos es el fijador de elección para estas sustancias.

Posee una leve acción descalcificante por lo cual puede emplearse como fijador para las
muestras de tejido óseo.

Se maneja fácilmente en soluciones debido a la gran estabilidad que tiene.

Inconvenientes: en estado puro el ácido pícrico es explosivo si se somete a color hay que
mantenerlo alejado de fuentes de color, tampoco deben dejarse evaporar sus disoluciones
para evitar la formación de precipitados. Si se prolonga el efecto de fijación que es de 4-18
horas dependiendo de tamaño pieza aparecen inconvenientes por una excesiva retracción
tisular. Sobre todo si la pieza ha sido inadecuadamente lavado en agua y luego
deshidratada.

Tiñe los tejidos de color amarillo y si no se elimina completamente antes de la inclusión en

parafina provoca un continuo deterioro de la estructura tisular que pueda hacer imposible
su estudio histopatológico algunas semanas después del procesamiento.

La eliminación se realiza mediante lavados sucesivos en alcohol etílico al 70-80% o en una

solución saturada de LiCO4 en alcohol de 70 es incompatible en la inclusión en celoidina.

Acetato de uranilo: Es una sal soluble en agua, cristalizado de color amarillo, se

descompone con la luz, no endurece los tejidos, se usa en soluciones al 2-3%
normalmente mezclado con OsO3 y después de la fijación hay que lavar el tejido
abundantemente con agua.

 Fijadores que actúan por reticularización de las proteínas: El proceso que denominamos
reticularización de las proteínas sobreviene cuando la desnaturalización de éstas moléculas de se
produce no por precipitación, sino porque el agente que provoca el fenómeno induce la rotura
masiva de los puentes de Hidrógeno determinantes de la estructura helicoidal de las moléculas
proteicas, con la formación posterior de una malla reticular polipeptídica por asociación química
entre los grupos activos desenmascarados por el líquido fijador.

Entre los principales fijadores tenemos:

Formaldehído o formol: Es gaseoso en estado puro, se vuelve líquido a 21ºC, es tóxico y

con un olor característico. Se disuelve fácilmente en agua y en éste estado en
concentraciones entre 35-40% y estabilizado con metanol se denomina formalina pura o
formol con la acción del frío la formalina pura tiende a precipitar y esta situación suele ser
reversible añadiendo unas gotas de NaOH y concentrando la mezcla. Como agente fijador
el formaldehído se emplea a una concentración del 4% pero como se parte de una
 solución de formalina ésta concentración se obtiene diluyendo una parte de ésta de la
formalina en 9 de agua en formación salina o tampón.

Ventajas: Es el fijador más barato que existe por lo tanto es de elección para los trabajos
de rutina en Anatomía patológica.

 Es un buen fijador único que determina una moderado conversación de la

estructura tisular.

 Por ser buen desinfectante y no endurecer excesivamente los tejidos, es un

medio óptimo para conversar y almacenar biopsias y piezas quirúrgicas.

 Provoca escasa retracción tisular

 Posee una velocidad de penetración intermedia entre la de los alcoholes y

la del sublimado

 Tiene aproximadamente una velocidad de un milímetro por hora apenas

altera la coloración tisular, por eso es el agente de elección para fijar grandes piezas quirúrgicas.

 Es excelente fijador para el tejido adiposo y para lípidos en general y se

emplea como agente de elección para fijar el tejido nervioso y en general antes de cualquier
impregnación argéntica.

 El proceso de fijación puede ser acelerado o retrasado sin graves

inconvenientes modificando la temperatura, así a temperatura ambiente se consigue un fijador
completa a partir de las 36 horas. A 35º entre 12 y 24 horas y a 55ºC en solo 3 horas. Por este motivo
la formalina es un fijador de elección cuando se emplean hornos de microondas en técnicas de
histotecnología.

 Es compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan

rutinariamente en Anatomía patológica.

Inconvenientes: Produce abundantes vapores de carácter irritante sobre la conjuntiva y

mucosa nasal.

 Por acción de la luz y del oxígeno atmosférico se transforma

progresivamente en ácido fórmico y ésta sustancia tiene la propiedad de disolver rápidamente la
cromatina nuclear por eso con el paso del tiempo los núcleos celulares adoptan un aspecto fantasma
para evitar este inconveniente el formol debe guardarse en frascos opacos o emplearse en forma de
solución neutra o tamponado.

 Se incorpora progresivamente al tejido con lo cual se consumen durante el

proceso de fijación por lo que debe encontrarse en exceso

 Es debido a que se incorpora al tejido y que tiene baja presión osmótica

provoca la incorporación de agua a los espacios intratisulares por lo que el peso y el volumen del
tejido una vez fijado se aumenta de manera notable. Este efecto se puede prevenir utilizando formol
salino o tamponado.

 Posee una relativa capacidad de fijación sobre las proteínas, los pigmentos
que contienen hierro y los derivados de la bilirrubina, a éstos últimos les da una coloración verdosa.

 Tras la utilización prolongada de formalina debido a que se convierte en

ácido fórmico confiere a las piezas un tinte grisáceo y en tejidos que tienen mucha sangre da origen a
un pigmento formólico que es negro o pardo oscuro que precipita en aglomeraciones irregulares
sobre estructuras preexistentes. Este pigmento se puede eliminar sumergiendo los cortes en alcohol
absoluto saturado con ácido pícrico compuesto por 10, 12 gramos de pícrico en alcohol etílico al 95-
 100% durante 5 minutos. O bien podemos sumergirlo en alcohol amoniacal que es el de 1 a 5 partes
de hidróxido amónico en 95 a 99 de alcohol etílico al 70%. En este caso se tratan los cortes durante
15 minutos, seguidos de dos baños de agua destilada y después otro de alcohol al 70% de 5 minutos
de duración cada uno.

 Soluciones fijadoras simples que contienen formol: hay 4 tipos:

Formol salino: Se utiliza para prevenir el efecto osmótico que provoca el empleo de
disoluciones de formaldehído en agua destilada y se prepara disolviendo 9 gramos de
cloruro sódico en 1000 mililitros de formalina al 10%.

Formalina neutra: Se prepara añadiendo a la solución de formalina al 10% una pequeña

cantidad de carbonato cálcico insoluble que queda depositado en el fondo del recipiente
neutraliza esta sal el exceso de ácido fórmico que se produce y aunque puede utilizarse
todavía para la formación de tejidos en la práctica ha sido desplazada por las soluciones
tamponadas.

Formol tamponado: Es la solución más empleada hoy en día para prevenir el choque
osmótico que provoca la disolución de formalina en agua destilada y el depósito de
pigmento formólico que ocurre a un pH inferior a 6. Se preparada la siguiente manera,
como amortiguador se emplea el tampón fosfato calibrado con pH de 7.0 a 7.2 de la
siguiente fórmula:

 FORMALINA PURA…………………………………..100.0 ml.

 FOSFATO SÓDICO MONOBÁSICO…………………….4.0 gr.

 FOSFATO SÓDICO DIBÁSICO (ANHIDRO**)……..….6.5 gr.

 AGUA DESTILADA………………………………...….900.0 gr.


Se emplea fundamentalmente para fijar tejidos nerviosos en la preparación de algunas
técnicas de impregnación argéntica. Y se prepara añadiendo una parte de ácido acético
glacial a 9 partes de formalina al 10% con ello se consigue un pH en torno a 2.

* 4gr: no tiene agua, cogemos 3.5gramos si no pone nada en el bote cogemos 4 gramos.
** Anhidro: hay que hidratarlo después.

Formol cálcico o solución de Baker: Se emplea como fijador de elección en algunas

técnicas de histoenzimología y se prepara añadiendo cloruro cálcico al 1% a una solución
de formalina neutra o tamponada al 10%

 Mezclas fijadoras: 2 tipos:

Glutaraldehido: líquido oleoso en comercios se encuentra en disolución al 25%.
Mecanismo de actuación es el mismo que el formaldehído y como fijador se emplea en
concentraciones entre el 1 y el 3%.

Ventajas: Es el primer fijador de elección para microscopía electrónica porque tienen una
excepcional capacidad para preservar la morfología celular.

 Se emplea para fijación de animales por perfusión en patología

experimental.

Inconvenientes: Tiene velocidad de penetración muy baja por lo que los fragmentos de
tejido no pueden tener volumen superior a unos pocos milímetros cúbicos.
 Posee gran capacidad de retracción y endurecimiento tisular que impide
prolongar el tiempo de fijación por encima de las 3 horas.

 Tiene osmolaridad muy baja por lo que hay que emplearlo disuelta en
soluciones amortiguadoras.

Tetraóxido de Osmio: OsO4: En el comercio se encuentra en forma de cristales

amarillentos solubles en agua, muy volátiles y tóxicas. Actúa igual que el formol y se
prepara como agente fijador al 1% en tampón fosfato.

Ventajas: Es el mejor fijador estructural conocido, por eso se utiliza en microscopía

electrónica específicamente como 2º fijador.

Inconvenientes: Muy caro y descompone en presencia de luz por lo que hay que
conservarlo en recipientes opacos y oscuridad.

 Aunque sea soluble en agua es difícil preparar disoluciones acuosas con las
que se trabaja

 Muy tóxico y en estado cristalino emite vapores que irritan la córnea

mucosa respiratoria. Su manipulación es obligatoria en una campana de extracción de gases para
prevenir la aparición de queratitis.

 Posee muy baja capacidad de penetración tisular por lo que las muestras
deben tener muy poco volumen.

 Es incompatible con formol y dificulta la coloración nuclear, esto obliga a

lavar abundantemente los tejidos tras utilizarlo.

 Es que inactiva por completo las enzimas y altera notablemente la

composición antigénica del tejido.

La combinación de diversos fijadores simples formando soluciones, complejas llamadas

mezclas fijadoras pretende sumar las ventajas de cada una de ellas amortiguando sus
inconvenientes. Desde un punto de vista general se clasifican en dos grupos:

 Aquellas que contienen formol:

 Líquido de Bouin: Solución muy usada como alternativo a la formalina cuando queremos
fijar ciertos Tejidos como piel órganos endocrinos, testículos y tejido embrionario en general. Sin
embargo no está fijado para la fijación de biopsias renales sobre los cuales provoca una severa
distorsión.

Se prepara de la siguiente manera:

- SOLUCIÓN ACUOSA DE ÁC. PÍCRICO

(ÁC. PÍCRICO AL 1-2% EN AGUA DESTILADA)……..750.0 ml.

 FORMALINA CONCENTRADA………………………250.0 ml.

 ÁC. ACÉTICO GLACIAL……………………………….50.0 ml.

 PH. FINAL…………………………………………………2.2

 TIEMPO DE FIJACIÓN……………………………..2 a 24 horas


 Fijador de Bouin-Hollander: es una variante del líquido de
Bouin especialmente indicado para la fijación de los cilindros de biopsia de médula ósea cuando no
 es posible controlar el tiempo de fijación de la muestra en éste líquido, la conservación, puede
incluso conservar las 48 horas sin que se produzca excesivo endurecimiento.

Se prepara de la siguiente manera:

 ACETATO NEUTRO DE
COBRE………….……………2.5 gr.

 ÁC.
PÍCRICO……………………………………………..4.0 gr.

 FORMALINA
CONCENTRADA……………………....10.0 ml.

 ÁC. ACÉTICO
GLACIAL……………………….……….1.5 ml.

 AGUA
DESTILADA…………………………………..100.0 ml.

Para preparar la solución se disuelve primero la sal de cobre en el agua destilada luego se añade el
ácido pícrico y tras filtrarlos el formol y el ácido acético glacial.

Esta solución se conserva indefinidamente a temperatura ambiente el tiempo de fijación oscila entre
48-72 horas y sigue las mismas precauciones que el líquido de Bouin

 Bouin alcohólico (fijador de Dubosq-Brasil): Es una alternativa

de líquido de Bouin cuando la pieza que se debe fijar es relativamente voluminosa porque posee una
velocidad de penetración mucho más elevada. Se utiliza también cuando se precisa una fijación
específica de sustancias hidrosolubles como el glucógeno ya que evita su disolución.

Se prepara de la siguiente manera:

 ALCOHOL ETILICO
80%...............................................75.0 ml.

 ÁC.
PÍCRICO………………………………………………0.5 gr.

 FORMALINA
CONCENTRADA………………...……..30.0 ml.

 ÁC. ACÉTICO
GLACIAL……………………………..….7.5 ml.

Mezclar antes de usar el tiempo medio de fijación para fragmentos con un espesor en torno a 5
milímetros es de 2 a 3 horas.

 Líquido de Gendre: Es una variación que está especialmente

diseñada para la fijación del glucógeno y pigmentos derivados de la hemoglobina. Se prepara por:

 SOLUCIÓN SATRUADA DE ÁC.

PÍCRICO

EN ALCOHOL ETÍLICO AL 70%.....................................80.0 ml.

 FORMALINA
CONCENTRADA………………………...15.0 ml.
 ÁC. ACÉTICO
GLACIAL………………………………….7.5 ml.

El tiempo de fijación oscila entre 1 y 4 horas. Tras acabar el proceso debe realizarse sucesivamente 2
lavados cortos en etanol al 80, 95 y 100º

 Fijador de Müller: Es la disolución acuosa de un fijador simple

de dicromato potásico con la adición de sulfato sódico su importancia actual radica en que se emplea
para fabricar los fijadores de Orth y de Zenker. Lo que llamamos solución madre. Está compuesta
de:

 DICROMATO
POTASICO…………………………………2.5gr.

 SULFATO
SÓDICO………………………………………..1.0 gr.

 AGUA DESTILADA
……………………………………100.0 ml.

Tiempo de fijación 4 y 8 horas. Tras la fijación es necesario lavar abundantemente en agua corriente
durante unas horas.

 Fijador de Orth: Hoy día se emplea exclusivamente en ciertas

técnicas de fijación de tejido nervios. Se prepara de la siguiente manera:

 Solución stock de Orth: idéntica a la

composición del fijador de Müller.

 Solución de trabajo: en el momento de

su uso se mezclan:

 SOLUCIÓN
STOCK………………………………..90.0 ml.

 FORMULINA
CONCENTRADA………………….10.0 ml.

El tiempo de fijación de tejido nervioso es de 48 horas y tras el proceso de fijación los tejidos han de
ser lavados abundantemente en agua y almacenados en alcohol etílico al 70%

 Solución de B-5 y Zenker-Formol (Liquido de Nelly): Ambas

mezclas son en esencia casi idénticas. La denominación B5 corresponde en realidad a una
modificación de la de Zenker.

La solución de Zenker-formol contiene dicromato potásico y sulfato sódico. La mayor utilidad de

estos fijadores es que mejoran considerablemente la tinción nuclear, de hecho la fijación en una
mezcla que contenga sublimado es hoy día prácticamente imprescindible para el diagnóstico
morfológico en las patologías del sistema linfoide y hematopoyético. Es debido a la gran
importancia que se da a la observación de finos detalles nucleares como es la presencia o no de
hendiduras o repliegues nucleares y del nucléolo para catalogar un tumor maligno de ganglios
linfáticos, o de médula ósea (leucemias) como de alto o bajo grado de malignidad y por tanto
recomendar la terapéutica más oportuna. Además estas soluciones B5 zenker formol son los
fijadores de elección para el riñón, hígado, fibras de tejido conectivo y para fibrina.

Se prefiere la solución de B5 porque al no contener dicromato, esto permite una mejor conservación
de la cromatina nuclear y de la estructura antigénica tisular.
 Solución de 35:

*Solución stock de B5: Esta mezcla es estable durante bastante tiempo pero concentrado en frasco
opaco y oscuridad.

 CLORURO MERCÚRICO...
………………………………… 12.0 gr.

 ACETATO SÓDICO...
………………………………………….2.5 gr.

 AGUA DESTILADA
C.S.P…………………………………….200 ml.

*Solución de trabajo de B5: Esta solución es inestable debido a que el formaldehído reduce el
sublimado a cloruro mercurioso y mercurio metálico que se depositan en forma de un precipitado
blanco grisáceo, por este motivo y por el elevado índice de endurecimiento que posee el sublimado,
el tiempo de fijación no debe superar las 4 horas. Además el espesor máximo de las muestras no
debe superar los 4 mm debido al escaso poder de penetración de la mezcla fijadora. Debido a la
aparición de precipitados mercúricos sobre los tejidos las secciones histológicas antes de ser
coloreados. Han de ser sometidas a un tratamiento específico mediante soluciones que eliminan estos
depósitos. Tras la fijación los tejidos se pueden conservar indefinidamente en alcohol etílico al 70-
80%

- SOLUCIÓN STOCK DE B5…………………………………20.0 ml.

- FORMALINA CONCENTRADA ………………………….…2.0 ml.

 Solución de Zenker-Formol Eliminación del pigmento

mercúrico:

*Solución stock de Zenker:

- CLORURO MERCÚRICO………………………………………5gr.

- DICROMATO POTÁSICO……………………………….…..2.5 gr.

- SULFATO SÓDICO ……………………………………………1 gr.

- AGUA DESTILADA C.S.P. ……………………..………..100.0 ml.

* Solución de trabajo: en el momento de su uso mezclamos:

- SOLUCIÓN STOCK DE ZENKER…………………………..95 ml.

- FORMALINA CONCENTRADA……………………………...5 ml.

Tanto para la solución almacenada como para la de trabajo deben guardarse las mismas precauciones
que para la de B5

 Eliminación del pigmento mercúrico o deszenkerización:

Se realiza tratando las secciones histológicas antes de su coloración con soluciones yodadas y
utilizamos:

*Solución de LUGOL:

- YODURO POTÁSICO…………………………………………..2gr.

- CRISTALES DE YODO ………………………………………..1gr.

- ALCOHOL ETÍLICO 70-80%................................................100 ml.

 *Solución de tiosulfato sódico:

- TIOSULFATO SÓDICO………………………………………..5gr.

- AGUA DESTILADA………………………………………...100ml.

Después de la desparafinación hay que tratar los cortes durante diez minutos con la solución yodada
a continuación lavar bien en agua destilada después decolorar durante dos minutos en la solución en
agua corriente durante 10 minutos antes de realizar la coloración.

 Aquellas que no contienen formol:

 Líquido de Zenker: Trata de combinar los efectos

favorables del sublimado y del dicromato potásico. En la práctica habitual ha sido sustituido por B5.
Su empleo ha quedado prácticamente restringido al proceso de refinación-decalcificación a que son
sometidas las biopsias de médula ósea cuando se realiza una fijación inicial con B5. Se prepara de la
siguiente manera.

 SOLUCIÓN STOCK DE
ZENKER………………………………95.0 ml.

 ÁC. ACÉTICO
GLACIAL……………………………………..… 5.0 ml.

El ácido acético reacciona con el dicromato y hace que la solución se oscurezca progresivamente,
por lo que debe recomponerse antes de su uso.

El tiempo de fijación puede ser más prolongada que con la solución de b5 porque el ácido acético
que contiene, produce un excesivo endurecimiento. Pero no se deben sobreasar las 48 horas. Tras la
fijación el material debe ser tratado con sulfato sódico al 5% durante 1-2 horas.

 Liquido de Carnoy: Es el mejor fijador conocido para el

glucógeno y en general, para los hidratos de carbono simples y para proteínas fibrilares y sobre todo
miofibrillas, su acción fijadora es extremadamente rápida deshidratando el tejido al mismo tiempo,
sin embargo produce una excesiva retracción mística y una hemólisis masiva de eritrocitos así como
una pobre conservación estructural del ADN. Está compuesta por:

 ETANOL
ABOSLUTO…………………………………………..60.0 ml.

 CLOROFORMO………………
………………………………….30.0 ml.

 ÁC. ACÉTICO
GLACIAL………………………………………..10.0 ml.

El tiempo de fijación puede ser acortado hasta 3 horas. Las muestras deben cambiarse directamente a
alcohol etílico absoluto. El mayor endurecimiento se produce al prolongar demasiado la
deshidratación en alcohol, para prevenirlo se puede sustituir el etanol por metanol en la composición
de líquido fijador, que además provoca menor retracción tisular, y para conservar la pieza se
deposita en alcohol etílico absoluto.

 Lavado postfijación.

Es el aclarado que se realiza después del proceso de fijación para eliminar los residuos del agente
fijador, con el fin de limitar el tiempo de contacto entre el fijador y el tejido o impedir el contacto del
fijador con los medios de inclusión utilizados, para proseguir el tratamiento de la muestra, a veces
 algunos colorantes alteran su efecto si la pieza contiene restos de determinados fijadores, como es el
caso por ejemplo del ácido pícrico. No todos los fijadores deben lavarse igual:

 Las piezas fijadoras en

formalina se lavan con agua prolongadamente.

 Fijadas por ácido pícrico hay

que introducir las piezas hasta quitar color amarillo.

 Fijadas por tricloroacético hay

que introducirlas en alcohol de 90%.

 Conservación de tejidos.

Cuando se practica un estudio histológico, solo se incluyen una pequeña porción del material
remitido para el análisis. El resto se guarda de reserva para estudios complementarios. Casi nunca es
posible conservar el tejido en el mismo líquido utilizado para la fijación.

La solución conservante más indicada en la mayor parte de los casos es el alcohol etílico al 70% en
él además de iniciarse la deshidratación, el tejido una vez fijado puede conservarse durante meses sin
apenas sufrir cambios, como alternativa más simple y siempre que no se desee preservar el tejido
para posteriores estudios inmunohistoquímicos, pueden usarse como conservante una solución de
formalina neutra o tamponada al 10%.

Cuando lo que se produce exclusivamente es derramar la intrusión del tejido en parafina sobre todo
para pequeñas muestras delicadas se puede realizar la deshidratación completa en alcoholes
crecientes y conservarlos en butanol que permite una conservación indefinida y mejora la textura
tisular.

Cuando se deseen conservar órganos completos procedentes de necropsias podemos utilizar las
soluciones de JORES.

JORES I:

 SULFATO
SÓDICO……………………………………………………….22 gr.

 SULFATO
POTÁSICO……………………………………………………..1 gr.

 CLORURO
SÓDICO………………………………………………………..9 gr.

 BICARBONATO
SÓDICO…………………………………………….….18 gr.

 FORMOL
10%.............................................................................................50 ml.

 SOLUCION ACUOSA
SATURADA DE HIDRATO DE CLORAL…….50 ml.

 AGUA DESTILADA C.S.P.

……………………………………………1000 ml.

JORES II:

 ACETATO
POTÁSICO…………………………………………………300 gr.
 GLICERINA…………………
………………………………………….600 ml.

 AGUA DESTILADA C.S.P.

…………………………………………..1000 ml.

En recipiente bien cerrado se conserva hasta años.

 Resultados de la fijación y su interpretación.

Durante la fijación se producen procesos que modifican la estructura tisular; se producen desgarros
en tejidos que siendo de distinta estructura están en contacto, por ejemplo la muscular y la
submucosa y al exponerlos a cambios bruscos, como tienen distintos contenidos, en agua se contraen
más que otros. También se producen grietas por la misma causa que los desgarros, pero son
pequeñas aberturas que pueden dar lugar a error porque parecen naturales, son muy difíciles de
evitar y son más frecuentes cuando la fijación se hace en tejidos que ya han comenzado su
descomposición.

Estas deformaciones de los tejidos que no corresponden con la realidad y son producidas por la
agresividad de los fijadores se denominan artefactos y varían de un fijador a otro debido a las
características propias de cada uno.

Ejercicios:

 La hematoxilina de Harnix se prepara con dos partes: A: 1

gr. De hematoxilina en polvo más 10 cc. De etanol. B. 20 gr. De alumbre de aluminio potásico más
200 gr. De H2O. Disolver en caliente. Técnica: A+B ebullición y añadir 0.5 gr. De óxido mercúrico.

 Vamos a preparar eosina alcohólica, está formado por una

solución stock y una de trabajo.

La de stock está formada por 1 gr. de eosina, 20 cc. de agua y enrasado hasta 100 ml de alcohol de
95%. La solución de trabajo está formada por 25 cc. de solución de stock y 75 cc. de alcohol de 80
%. Calcular para 250 ml de solución de trabajo.

Tema 6: Descalcificación

1. Introducción:

Se denomina decalcificación a la completa eliminación de las sales Calcio presentes en los

tejidos tras haber realizado su fijación. Éste procedimiento se realiza de forma sistemática
sobre tejidos mineralizados (dientes y huesos= y esporádicamente sobre material
anatomopatológico con calcificaciones que puedan dificultar o impedir la observación al
microscopio. Solo está desaconsejado decalcificar el tejido en las enfermedades óseas
metabólicas donde nos interesa valorar el equilibrio entre síntesis y destrucción de matriz
ósea y su grado de calcificación. En éste último caso utilizaríamos un microtomo
motorizado específico para tejidos duros.

2. Decalcificación química:

Los principales agentes descalificadores están formados por ácidos fuertes o débiles
empleados solos o en conjunción a distintos líquidos fijadores. Los principales reactivos
que se utilizan son ácidos inorgánicos fuertes como el ácido nítrico o el clorhídrico y
débiles como el ácido sulfuroso y también ácidos orgánicos como el ácido fórmico el
acético y el tricloroacético. Todas estas sustancias tiene la ventaja de ser estables, baratas
y de fácil disponibilidad.
Un líquido descalcificante ideal debe reunir una serie de cualidades. Estas cualidades son
las siguientes:

1. Debe producir una eliminación completa de los depósitos cálcicos.

2. No debe provocar efectos indeseables o artefactos sobre los tejidos tratados.

3. No interferir con los procedimientos de tinción que se emplean posteriormente.

El agente más rápido y eficaz es el ácido nítrico y se emplea en soluciones del 5 al 7.5%.
El problema que tiene es que utilizado a concentración elevada, por encima del 6% es que
tiende a producir gran destrucción tisular que se atenúa en disolución alcohólica.

Ácido clorhídrico: no es tan rápido como el nítrico pero produce menor agresión tisular y
no precisa lavado post-decalcificación.

Los ácidos orgánicos: producen escasos artefactos titulares y apenas interfieren en los

resultados finales de la tinción pero actúan muy lentamente y requieren la renovación
frecuente del líquido descalcificante. Por eso están indicados exclusivamente cuando la
muestra es tejido óseo esponjoso y contiene solo pequeñas espículas calcificadas.

En el proceso de decalcificación hay que seguir unas normas que son:

1. Para disminuir en lo posible los efectos alterativos descalcificador, la fijación debe

haberse completado antes de iniciar el proceso.

2. La concentración del agente descalcificante debe ser óptima con un volumen de líquido
descalcificador mínimo de 1/20 que debe ser renovado con frecuencia.

3. Para acelerar el proceso los bloques deben ser suspendidos en el centro del recipiente
porque en el fondo se acumula mayor concentración de sales cálcicas.

4. La temperatura ideal para realizar la decalcificación se encuentra en torno a los 25ºC.

Por encima de ésta temperatura el proceso de decalcificación se acelera pero también lo
hace el de descomposición del tejido.

5. La agitación suave ya sea manual o mecánica generalmente acelera el proceso.

6. A veces la adicción de alguna resina de intercambio iónico. Al medio de decalcificación

acelera el proceso porque atrapa los iones de Calcio liberados por el descalcificador
químico.

7. Después de cualquier proceso de decalcificación química donde se haya empleado

ácido, el exceso de éste último ha de ser eliminado mediante lavados en soluciones
neutralizantes, lo mejor el agua corriente. A veces para disminuir el edema en las fibras
colágenas, se da un lavado con una solución de sulfato sódico al 5%.

8. La coloración de tejidos decalcificados puede ser interferida por un exceso residual de

los ácidos empleados para eliminar las sales cálcicas por este motivo a veces se tratan los
cortes con una solución acuosa de carbonato de Litio al 1% para asegurar la neutralización
completa.

3. Soluciones descalcificantes más usadas:

SOLUCIÓN ACUOSA DE ACIDO NITRICO:

Ac. Nítrico concentrado……………………………………………………….5 mL

Agua destilada………………………………………………..………...…….95 mL
El caso de que la solución sea alcohólica la proporción de ácido nítrico debe ser del 7.5%.
El tiempo medio de decalcificación para un bloque óseo de 5mm de espesor es de 12 a 24
horas.

Ventajas:

1. provoca rápida decalcificación

2. Causa baja retracción tisular.

3. Mejor coloración de los núcleos que la solución de formol y nítrico

4. No es necesario neutralizar el agente descalcificante sino que puede pasar directamente

el tejido a etanol de 70º para iniciar la deshidratación.

Inconvenientes:

1. La prolongación excesiva del tiempo de decalcificación suele anular la fijación previa y

alterar progresivamente el tejido.

FORMULINA - ÁCIDO NÍTRICO:

Formalina…………………………………………………….………………10 mL

Ác. Nítrico concentrado………………………………………………………10 mL

Agua destilada………………………………………………………………...80 mL

Tiempo medio de calcificación para un bloque de tejido óseo de 5 mm de espesor es de 1

a 3 días.

Ventajas:

1. Es de acción relativamente rápida.

2. Provoca menos alteraciones titulares que la solución acuosa de ácido nítrico.

3. Por su facilidad de manejo es la solución descalcificante más utilizada para técnicas

histológicas de rutina.

Inconvenientes:

1. Dificulta la tinción nuclear

2. Antes de su procesamiento los tejidos requieren neutralización en sulfato sódico al 5% y

un lavado posterior en agua corriente al menos durante 2 horas.

SOLUCIÓN ACUOSA DE ÁCIDO FÓRMICO:

Acido fórmico al 90%...................................................................................5-10 mL

Agua destilada…………………………………………………………….90-95 mL

Tiempo medio para un bloque óseo de 5 mm de espesor es de 3 a 7 días.

Ventajas:

1. Fija y descalcifica simultáneamente.

2. No dificulta demasiado la coloración nuclear.

3. esta especialmente recomendado para decalcificar bien

Inconvenientes:
1. Acción muy lenta.

2. Requiere neutralización previa a la inclusión en sulfato sódico al 5%

3. Lavado en agua posteriormente durante 18 horas.

Existen también soluciones fijadoras con poder descalcificante. Entre los más utilizados
son los de los líquidos de Bouin, Bouin Hollander, y Zenker. Todo ellos poseen una débil
capacidad descalcificadora por la cual se emplea casi exclusivamente como
descalcificantes de los cilindros biópsicos de medulas óseas, están constituidos sobre todo
por esponjosas y para eliminar pequeñas calcificaciones distróficas.

4. Decalcificación con quelantes químicos

Los quelantes químicos son sustancias capaces de combinarse con iones metálicos en
solución o estabilizados en forma de sales o constituir nuevos compuestos generalmente
solubles en agua.

El quelante que se utiliza normalmente que es el ácido etilén-dianinotetracético.

La sustracción de iones cálcicos que procura el EDTA se realiza de forma muy lenta pero
posee la ventaja de no inducir artefactos. Esta solución se comercializa y se prepara:

Sal disódica de EDTA………………………………………………………….5.5 gr.

Formalina neutra al 10%................................................................................100.0 mL

El tiempo medio de decalcificación para un bloque de 5mm de espesor de esponjosa ósea

de 1 a 3 semanas y para un bloque de hueso cortical entre 6 y 8 semanas.

La decalcificación química, puede acelerarse con el empleo de ultrasonidos. El método se

fundamenta en someter el aumento una vez inmerso en la solución decalcificación a la
acción de ondas ultrasónicas en un baño líquido. De esta forma se induce una vibración
molecular sobre el material calificado favorece la formación de sales entre los iones
desprendidos y los ácidos o quelantes usados durante el proceso.

5. Decalcificación electrolítica

Se basa en el empleo de una corriente eléctrica para provocar la ionización de la solución

salina o descalcificante en que se encuentra sumergido el tejido de esta manera las sales
insolubles de calcio presentes en el tejido son desplazadas hacia el electrodo negativo y
los radicales ácidos hacia el polo electropositivo. Este proceso suele realizarse entre 30 y
45ºC y para especímenes pequeños.

Se completa entre 45 y 60 minutos a pesar de las ventajas del procedimiento no se utiliza

de forma rutinario en la mayoría de los laboratorios de anatomía patológica.

6. Pruebas de control sobre el grado de decalcificación tisular

El control exacto del tiempo óptimo de decalcificación tisular es importante porque una
duración mayor provoca maceración y destrucción celular y un acortamiento provoca el
que no se puedan secciones microfónicas adecuadas. Por eso se precisan mecanismo de
control que permitan establecer el control en el que el proceso sea el completado.

Existen 3 tipos de métodos:

1. Físicos: que se basan en la experiencia del técnico para detectar mediante el tacto el
grado de dureza y calcificación tisular, Histológicamente es muy subjetivo y puede dañar el
tejido durante la manipulación por lo cual no son aconsejables.
2. Radiológicas: bastante sensibles pero requieren instrumento complejo y son costosos.

3. Químicos: son normalmente de elección y se basan en la detección de iones cálcicos

en el líquido descalcificante. Cuando en los sucesivos recambios de líquido dejan de
encontrarse iones cálcicos se considera que el proceso ha finalizado.

La prueba más utilizada es el Oxalato Cálcico.

7. Decalcificación de bloques titulares incluidos en parafina.

Durante el proceso de corte de los bloques incluidos en parafina, aparecen a menudo

calcificaciones no detectadas.

En estos casos graves desperfectos en la cuchilla que pueden llegar a impedir que se
realicen las secciones necesarias. Este problema puede subsanarse sumergiendo el
bloque en líquido de PERENYI o en el ácido fórmico al 50%. Antes de realizar el corte o
bien empleando el método de LENDRUM que consiste en exponer la superficie de corte a
la acción de una solución de ácido clorhídrico al 2% durante varias horas.

Ácido nítrico al 10%..........................................................................................40 mL

Etanol absoluto……………………………………………………………..….30 mL

Ácido crómico al 0.5% en agua destilada……………………………………..30 mL

Centrar inmediatamente antes de su uso, el tiempo medio de decalcificación para un

bloque óseo de 5 mm de espesor es de 2 a 6 días.

Ventajas:

 Prepara adecuadamente la tinción nuclear.

 Apenas provoca maceración tisular.
 No requiere neutralización previa a la intrusión tisular.
Inconvenientes:

1. Actúa lentamente, por lo que no puede emplearse para trabajos de urgencia.

Tema 7: Métodos y técnicas de inclusión

1. Introducción:

La inclusión permite obtener cortes finos y homogéneos para el cual las piezas acortan
deberán tener una determinada consistencia y uniformidad.

El medio de inclusión debe ser un medio líquido que posteriormente se solidifique de forma
homogénea. Este medio de inclusión deber penetrar en todos los espacios libres de los
tejidos. Hay medios de inclusión que son solubles en agua y otros que no. En éste último
caso ha de ser reemplazado por el solvente apropiado al medio de inclusión que se utilice
con excepción de tejidos destinados a congelación, la mayor parte de las muestras para
estudio histopatológico, requiere la inclusión en un medio sólido y ésta puede hacerse de
forma manual o automática.

2. Deshidratación por agentes químicos.

La deshidratación es el proceso que tiene por finalidad la eliminación completa del agua de
la muestra tisular para que se pueda embeber (empapar) adecuadamente el tejido en
aquellos medios de inclusión que no sean hidrosolubles.

El método clásico de deshidratación es la sustitución del agua por el alcohol pero puede
realizarse utilizando cualquier reactivo capaz de absorber el agua de los tejidos. Las
condiciones esenciales de un buen deshidratantes (agente) son dos:

1. No debe alterar la estructura tisular.

2. Es que debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante.

Ventajas:

1. Rapidez en concluir la deshidratación.

2. Reducir a un mínimo aceptable el endurecimiento que provoca en los tejidos

3. Su toxicidad y peligrosidad sea mínimo con escaso desprendimiento de vapores tóxicos.

4. Tuviera menos riesgos de incendio-explosión.

5. Baja toxicidad por inhalación, ingestión y contacto.

El proceso de deshidratación suele realizarse mediante el empleo de alcohol etílico y en el

suelen intervenir los siguientes parámetros:

A. Graduación de los alcoholes: en la práctica la operación de deshidratación se realiza

empleando una serie de alcoholes de gradación ascendente (50, 70, 80, 95, absoluto).

Esto se hace así porque la acción brusca de un alcohol de mayor gradación sobre el tejido
provocaría una marcada retracción de éste, el empleo de series más o menos largas de
alcoholes de distinta gradación así como la decisión de iniciar el proceso en un alcohol de
gradación media o menor van a estar en función primero de la experiencia del personal, de
la fragilidad de los tejidos y del tipo de fijador utilizado, ya que los fijadores con base
alcohólica realizan cierta deshidratación durante el proceso de fijación.

B. Volumen y el número de los baños de deshidratación: No es necesario o preciso

que el volumen de alcohol sea demasiado alto por lo general suele recomendarse un
volumen del baño 10 veces mayor al volumen de la muestra que se va a deshidratar.

Lo que se recomienda es multiplicar el número de baños. Se hacen baños sucesivos y

múltiples que nos aportan las siguientes ventajas:

Ventajas:

1. Al permanecer menos tiempo en cada baño menor el resigo de endurecimiento excesivo

del tejido.

2. El menor índice de saturación de agua en alcohol lo que posibilita la reutilización del

baño de alcohol

3. Se controla mejor el grado de deshidratación de la pieza.

4. Hay menos riesgo de alteración tisular producida por un cambio brusco en la fuerza de
estación del agua.

- DURACIÓN DE LA DESHIDRATACIÓN:

Esta va a estar en función en volumen de los fragmentos titulares y de su contenido en

agua y hay que tener en cuenta dos cosas:
1) Deshidratación ha de ser completa

2) La exposición prolongada al agente deshidratante provoca un endurecimiento de los

tejidos.

A veces en investigación se usan agentes accesorios que eliminan el exceso de agua en

los deshidratantes y supone un cierto ahorro porque permite reutilizar el baño
deshidratantes. Se utiliza el sulfato de cobre anhidro que sirve al mismo tiempo como
indicador del grado de deshidratación del baño de alcohol porque los cristales de sulfato
de cobre adoptan una tonalidad azul brillante cuando el líquido deshidratantes se satura de
agua.

2.1. Principales agentes deshidratantes:

Alcohol etílico: es el agente más comúnmente usado es un excelente deshidratante tiene

el inconveniente de que es muy inflamable y que tiene un precio superior al del alcohol
metílico. Para abaratar costes se puede utilizar alcohol etílico desnaturalizado con metanol
que también se denomina etanol para uso industrial.

Alcohol metílico: A veces se usa como sustituto del anterior pero normalmente no. Y es
muy inflamable y tóxico.

Acetona: Es un agente deshidratante muy volátil y con una acción rápida. Si el tratamiento
de los tejidos es rápido aumenta extraordinariamente su fragilidad.

Alcohol butílico o Butanato: Es un deshidratante lento miscible con la parafina por tanto
permite prescindir de los agentes aclarantes.

Dioxan: Miscible con parafina, muy tóxico en espacios pequeños

Alcohol isopropílico: No puede utilizarse en la inclusión en celoidina

Tetrahidrofurano: No se usa. Agente de acción rápido que no causa excesiva retracción.

Nues
tro
proce
sador
:

Man
ual:

Nues
tro
proce
sador
:

3. Aclaración o desalcoholización
Su finalidad no es hacer transparente el tejido aunque en algunas ocasiones puede ocurrir.
Se trata de un proceso por el cual se consigue la sustitución del agente deshidratante por
una sustancia miscible con el medio de inclusión que va a utilizarse.

Con ello se pretende que toda la pieza histopatológica se halle en bebida empapada en un
agente químico líquido en el que pueda disolverse el medio de inclusión y de este modo
penetrar en el tejido.

3.1. Agentes aclarantes Existen varias y su elección dependerá de su rapidez para eliminar
el deshidratante. Dependerá también de la escasez de acciones nocivas sobre los tejidos y
las células, de la adecuación del agente deshidratante y al medio de infiltración.

De la facilidad de su eliminación de su toxicidad, peligrosidad y de su coste. También se

denominan líquidos intermediarios y se manejan mediante la realización de baños
sucesivos de duración variable en función de las características del agente y del volumen
de la pieza.

En ocasiones se recomienda utilizar antes de los baños del aclarante diversas mezclas de
agente deshidratante con aclarante en diferentes proporciones.

El volumen del agente aclarante ha de ser el mismo que del agente deshidratante y el
proceso si puede acelerar con una suave agitación ya manualmente o eléctrica.

3.2. Principales agentes aclarantes

Xileno o Xilol:

Ventajas:

1. Agente aclarante más rápido

2. No disuelve la celoidina

3. Endurece poco los tejidos.

4. Se elimina fácilmente del medio de inclusión

5. Es fácil de apreciar el punto óptimo de dosificación.

Inconvenientes:

1. Tóxico

2. Solo aclara desde alcohol absoluto.

3. Tiende a volver blanquecino el tejido.

4. Endurece si actúa mucho tiempo.

*Interés práctico: Aclara especímenes con un grosor aproximado de unos 5 mm entre 1h o

media hora. Es el que se utiliza rutinariamente.

Toluol o Tolueno:

Ventajas:

1. Rápido pero menos que el Xilol

2. Endurece menos que el Xilol y no blanquea los tejidos.

3. Puede conservar una muestra más de 12 horas sin una alteración evidente
Inconvenientes:

1. Es tóxico

2. Solo se aclara desde alcohol absoluto.

*Interés práctico: Cuando no hay Xilol se usa Toluol. El tiempo de aclaración varía entre
una y dos horas.

Benceno:

Ventajas:

1. Es relativamente rápido.

2. Endurece muy rápido y no blanquea.

3. Causa retracción mínima.

4. Se elimina fácilmente.

Inconvenientes:

1. Muy Tóxico

2. Altamente inflamable.

*Interés práctico: Puede utilizarse como producto de sustitución. El tiempo de aclaración es

de entre 1 y 3 horas.

Cloroformo:

Ventajas:

1. Es muy tolerante

2. No afecta al tejido

3. Va bien para piezas delicadas

4. Es de acción lenta, por ejemplo piel, muestras descalcificadas.

Inconvenientes

1. El tejido tiende a flotar en el cloroformo y hay que poner peso en la pieza.

2. Difícil eliminación de parafina provoca a la larga, deterioro del bloque.

3. Olor poco agradable.

*Interés en la práctica: tiempo aclaración para muestra de 5 milímetros espesor 12 a 24

horas. Producto de sustitución en circunstancias especiales.

Tetracloruro de Carbono (CCl4):

Ventajas:

1. Acción similar al cloroformo pero más barato. No es inflamable

Inconvenientes:

1. Igual que el cloroformo.

2. Es muy toxico.
*Interés práctico: Tiene tiempo de aclaración de 15 horas puede utilizarse en piezas duras.

Dioxano:

Ventajas:

1. Miscible con parafina. Puede emplearse simultáneamente como deshidratante y

aclarante.

Inconvenientes:

1. Inodoro y muy tóxico, siempre que se utilice es obligatorio extremar medidas de

protección y usar campana de extracción de gases.

*Interés que tiene: Empleo restringido a inclusiones donde esta proscrita (prohibida). La
deshidratación por alcoholes, como estudios histológicos de grasas porque el alcohol
disuelve las grasas.

4. Infiltración o impregnación:

Es el proceso que tiene por objeto rellenar o infiltrar completamente la muestra

histopatológica con el medio de inclusión que se va a utilizar.

El fundamento de este proceso radica en la ocupación completa con este medio de los
espacio intratisulares y extratisulares inicialmente rellenos por agua.

Para conseguir este efecto, casi siempre es imprescindible eliminar previamente todos los
restos de aclarantes residuales en el tejido.

La finalidad última de éste proceso es proporcionar a la pieza anatómica la homogeneidad

y dureza suficiente para que se pueden obtener secciones finas de calidad. Se puede
realizar la inclusión distintos medios. Pero hoy en día el método de elección sigue siendo
la inclusión en parafina.

Las parafinas son sustancias de tipo céreo, compuestas por mezclas de hidrocarburos de
cadena blanca y pueden obtenerse con una amplia variación en su punto de fusión que va
a condicionar en gran medida en histotecnología. Son sólidos a temperatura ambiente las
parafinas que se usan habitualmente, tiene una temperatura de fusión de entre 54 a 58
grados centígrados.

La dureza de la parafina está en función de su plasticidad. El punto de plasticidad está

unos pocos grados por debajo del punto de fusión y se define como la temperatura más
baja a la que puede ocurrir una deformación permanente sin fractura:

En la práctica diaria no se unan las parafinas cloritas sin purificar porque se oxidan con el
paso del tiempo y adoptar una tonalidad amarillenta y una consistencia blanda.

Se suelen utilizar mezclas con polímeros plásticos con un peso molecular controlado y con
aditivos que mejoran sus características de inclusión.

4.1. Infiltración en parafina: Se realiza mediante baños sucesivos en parafina fundido.

Estos baños deben ser renovados frecuentemente porque se cargan del medio de
aclaración y producen disminución del punto de fusión de la parafina y la vuelven más
blanda y menos apropiada para el corte.

-4.1.a) Procedimientos de infiltración: este procedimiento puede hacerse o bien de forma

manual o de forma automática en procesadores de inclusión:
-Procesamiento manual: No suele hacerse habitualmente y se hará en muestras que
tiene gran volumen como por ejemplo cuando se quiera incluir piezas quirúrgicas
completas o bien aquellas muestras que sean muy delicadas y no puedan meterse en un
procesador automático.

También es bueno para el aprendizaje porque se puede seguir los cambios en la

estructura tisular durante el proceso.

En la técnica manual es posible emplear agentes deshidrátenles y sobre todo liquido

intermediarios que por su elevado costo (sobre todo el cloroformo) no puedan usarse en
procesadores automáticos. Además si queremos acelerar el proceso podemos utilizar color
también en los pasos de fijación y deshidratación.

-Procesamiento automático: Se hace en procesadores automáticos que contienen

múltiples vasos para realizar los baños y el sistema mecánico de trasporte, regulado por
un programador horario.

Ventajas:

1. Permiten procesar simultáneamente gran cantidad de muestras diferentes.

2. Economizan notablemente la cantidad de líquidos empleados en el proceso.

3. Realizan rápido procesamiento a lo largo de la tarde-noche del día de recepción y así

las piezas estarán dispuestas para ser encastradas diseccionadas en la siguiente jornada
de trabajo. Para obtener buenos resultados con éstos sistemas es fundamental renovar a
menudo los líquidos contenidos en los baños. Su enturbiamiento a la percepción de olor
aclarante en el último baño de parafina indica la necesidad de cambiarlo.

-Encastramiento del tejido y confección de los bloques: Este procedimiento consiste en la

obtención de un bloque sólido de tejidos más medio de inclusión mediante el enfriamiento
lento a 10-15ºC. Temperaturas más bajas producirían un efecto brusco de enfriamiento
con contracción e los bloques que puede llegar a fracturarle. La finalidad del proceso es
obtener un bloque fácil de manejar de dureza homogénea y de plasticidad y elasticidad
adecuada que permita realizar cortes de calidad sin distorsión ni fragmentación de las
estructuras que formaron el tejido.

Para la realización de los bloques se utilizan las estaciones de inclusión que constan de un
dispensador de parafina líquido una placa caliente para la orientación de las piezas y una
placa fría para la solidificación del bloque y habitualmente estará a temperaturas inferiores
a la ideal de 10ºC.

-Orientación de la pieza: El espécimen infiltrado se coloca en la posición adecuada al tipo

de corte que se desea realizar, teniendo en cuenta que la cara inferior del bloque será la
superficie de corte. Además debemos orientar la pieza de manera que la parte más blanda
se corte primero y la parte más dura o firme al final del proceso.

Los moldes que se emplean en la confección de los bloques de parafina suelen ser de
parafina así facilitan el enfriamiento homogéneo en dirección ascendente y la transmisión
del frío al medio de encastramiento. El fondo de los moldes suele ser de tamaño variable
que se ajusta a los de las piezas.

En ellos se encajan perfectamente las casetes que llevan la muestra histológica y su

identificación facilitando la confección de un bloque único que no precisa ningún tipo
especial de montaje sobre el portabloques del micrótomo.
FOTOCOPIAS:

Bloques: Material necesario para hacer bloques en parafinas:

1. Dispensador: Es un aparato eléctrico donde se funde la parafina y se mantiene a una temperatura

constante de unos 60ºC. Este aparato deberá estar conectad o a la red eléctrica noche y día para
evitar la solidificación del medio de inclusión.

2. Paramoles: Son de naturaleza metálica, de distinto tamaño y grosor, y sirven para dar forma a
los bloques. En el comercio existen de varios modelos.

3. Pinzas: Deberán ser sin dientes para facilitar la recogida del tejido.

4. Mechero de alcohol: Sirve para calentar las piezas y evitar que se pegue el medio de inclusión a
ella. Este mechero puede ser sustituido por una placa caliente, que normalmente viene acoplada al
dispensador.

5. Sistema frío: Sirve para disminuir la temperatura de los bloques y favorecer su solidificación.
Puede ser:

- Placa fría metálica que puede venir o no acoplada al dispensador.

- Placa de hielo que sirve para facilitar la separación del bloque de los paramoles.

6. Material de inclusión: Se presenta en estado sólido, de distintas formas como son láminas,
bloques o granos. Pueden ser de diferente naturaleza como parafina, paraplast o celoidina, etc.

FOTOCOPIAS:

Forma de hacer Bloques:

1. Las piezas anatomopatológicas se encuentran en la última impregnación del procesador.

2. Llevar la última jarra o recipiente al procesador de la mesa de trabajo y conectarla a la red

eléctrica para evitar la solidificación del medio de inclusión

3. Sacar los casetes de la jarra del procesador (de una en una) para evitar el endurecimiento de la
pieza.

4. El molde se rellena ligeramente con el medio de inclusión. Para sacar las piezas de los casetes
nos ayudamos con unas pinzas calentadas previamente con un mechero; la pieza se introducirá en
el molde dándole la orientación adecuada y a continuación se terminará de rellenar el molde.

5. es muy importante no olvidar poner la numeración en el molde.

6. Introducir los moldes en el congelador para su entera solidificación.

7. Sacar de la nevera y separar los paramoles de los bloques.

FOTOCOPIAS: Orientación del espécimen

4.2. Otros métodos de inclusión: Existen otros medios de inclusión que aunque se aplican
raramente en la práctica diaria si son de interés para procedimientos específicos de
investigación o determinación tecnológica especiales sobre todo para microscopia
electrónica. En general se plantea el empleo de medios alternativos de inclusión en los
siguientes casos:

1. cuando el tejido es demasiado duro: hueso sin descalcificar. O tejido con estructura que
se desnaturaliza con el calor.

2. Tejido que contiene abundantes interfases de consistencia heterogenia como el globo

ocular.

3. Para estudio de sección de tejidos de espesor superior a 20 micras.

-Gelatina: La Gelatina se utiliza como material de inclusión cuando se quieren realizar

cortes macro-micrométricos de órganos completos en unos micrótomos de gran tamaño
denominados de tipo TËTRANDER y también como una alternativa cuando se quieren
hacer cortes en congelación. La gelatina es soluble en agua por lo que no es necesario
deshidratar y aclarar el tejido pero el fijador desnaturaliza las proteínas que componen la
gelatina por eso, esta sustancia ha de ser completamente eliminada del tejido mediante
lavado en agua corriente en circulación continua durante 12-24 horas.

La inclusión en gelatina se realiza mediante infiltraciones sucesivas a 37ºC en

concentraciones crecientes.

-Celoidina: Es una sustancia amorga, blanca amarillenta y insoluble en agua y soluble en

alcohol éter al 50%. También se denomina con el nombre de Colodión elástico y
químicamente es una forma purificadora de nitrocelulosa.

Esta inclusión se hace pocas veces, ciertos trabajos neurohistológicos muestras duras,
frágiles o de gran heterogeneidad, con esta procedencia se obtiene bloques de gran
dureza que no precisan temperaturas elevadas. La mayor limitación para su empleo deriva
del mucho tiempo necesario para completar el procesamiento. Este tiempo se mide en
días incluso en semanas, además los cortes obtenidos a partir de celoidina, no pueden ser
inferiores a 10 micrómetros de grosor, la media son 15 micras.

-Medios hidrosolubles diferentes a la gelatina. Se emplea para demostrar enzimas, lípidos,

y aquellos elementos intratisulares que pueden ser desnaturalizados por el color o por el
tratamiento con agentes deshidratantes y aclarantes.

4.3. Inclusión en plásticos (Resinas): La utilización de resinas acrílicas como el metil

metracrilato o de tipo epoxi como medio de incluir tejidos ha experimentado un notable
desarrollo en los últimos tiempos, este método es el procedimiento básico, de infiltración
en microscopia óptica de transmisión y también puede utilizarse para el estudio del tejido
óseo sin descalificar y para materiales de mayor dureza como los dientes.

La deshidratación del material ha de ser exhaustiva y suele llevarse a cabo en acetona. A

continuación se procede a infiltrar con el monómero plástico y el tiempo de infiltración varía
según el plástico que se utilice. Muchos de las resinas empleadas tienen el inconveniente
de que su polimerización se realiza en forma de reacción exotérmica, que puede inducir
daño en los componentes celulares debido a la elevada temperatura que se alcanza.
4.4. Inclusión en microscopio electrónico. Los procesos de inclusión en microscopia
electrónica son a grandes rasgos como los de la inclusión general por las características
del proceso, el corte debe poseer dos cualidades fundamentales una de ellas es que
deben poseer una extraordinaria finura para permitir el paso de los electrones. La otra
cualidad debe tener una presentación idónea de la estructura celular. Para cumplir estas
condiciones, la microscopía electrónica impone el empleo de un medio de inclusión de
elevada dureza que permita obtener secciones ultra finas. Los medios de inclusión que se
utilizan son de tipo plástico. En un principio se usaba la inclusión en metil metacrilato pero
actualmente se incluyen en epoxi resinas. Estas sustancias son polímeros plásticos entre
los cuales se encuentren la araldita, la resina epón y la resina Spurr. Todas ellas suelen
proporcionar una buena conservación de la estructura celular y conserva mejor el corte
que el metacrilato. El fundamento general de la inclusión del epoxi resinas radica en la
utilización de una resina monomérica líquida que se trasforma en un polímero sólido de
gran dureza en presencia de calor, de un endurecedor, de un acelerador de la reacción y
opcionalmente de un agente plastificante que disminuye su fragilidad.

Ejercicios:

1.-Preparar 100 cc de ác. Clorhídrico de 0.5 N a partir de una al 37 % de riqueza y

densidad 1.19 gr/cc.

Datos: [N = 0.5] [p.a. HCl = 36.5] [r = 37%] [N = (gr. · valencia)/ (p.m. · L (dón))]

0.5 = gr · 1 / (36.5 · 0.1) gr. = 1.825 son puros que se necesitan

37% riqueza 1.825 · 100/ 37 = 4.93 hay que pesar para que puros hayan 1.825

1 gr. --------------- 1.19 cc

4.93 gr. ----------- x cc x = 5.87 mL de HCl

Hay que medir 5.87 mL de HCl y echar sobre una pequeña cantidad de agua previamente
y después de añadir el ácido enrasar hasta 100 mL

*L (dón) = Litros de Disolución

Tema 8: Micrótomo

 Concepto
Es un instrumento mecánico con el que se realizan secciones titulares de espesor
micrométrico y por lo tanto lo suficientemente delgados para su posterior observación
microscópico. A menor grosor mejor estudio.

 Tipos:
Existen 6 tipos básicos de micrótomos pro todas tienen un principio básico de
funcionamiento. Tiene un portabloques en el que se va a apoyar el material que se va a
cortar que avanza sobre una cuchilla gracias a un sistema de cremallera de forma
periódica se hace incidir el bloque con la cuchilla o viceversa que va sobre el portacuchillas
con lo que obtendremos secciones titulares de espesor equivalente al seleccionado por el
tornillo que controla el mecanismo de avance. El mecanismo de avance puede ser manual
o digitalizado. Nuestro bloque está formado por parafina. Antiguamente la fijación del
bloque era con parafinas fundida. Actualmente se realiza por medio de una pinza y es
encima de éste portabloques donde existen unos tornillos que los permiten orientar el
bloque de manera que queda paralela a la cuchilla.
Portacuchillas consta de dos palancas que nos permiten fijar la cuchilla al micrótomo.
Estos impiden que la cuchilla quede suelta y hay una palanca que controla la inclinación de
la cuchilla para cortar de forma homogénea el bloque. El sistema de avance mecánico del
portabloques sobre la cuchilla proporcionará cortes sucesivos de tejido a partir del bloque.

 Micrótomo de Oscilación:
Posee un sistema de avance de tornillo y las secciones se obtienen por un sistema
oscilatorio de planaza que realiza el portabloques sobre la cuchilla al vascular sobre ella.

Ventajas: simplicidad y bajo coste

Desventajas: no permite obtener secciones seriadas.

 Micrótomo de Rotación:
Ha sido el más empleado en anatomía patológica. El portabloques colocado en posición
vertical se mueve de arriba abajo. Delante del filo de la cuchilla El portabloques avanza de
manera automática y constante, en cada vuelta del mango.

Ventajas:

 Al tener más peso, tiene más precisión, permite obtener secciones seriadas muy finas.
 El mecanismo de avance es más exacto.
Desventajas:

1. El elevado precio debido a la complejidad del mecanismo de avance, que además

dificulta y encarece las reparaciones.

2. La imposibilidad de cortar con él tejidos incluidos en celoidina, en gelatina y en propilén

glicol.

El micrótomo del aula es Minot

 Micrótomo de Deslizamiento:
Existen principalmente dos tipos según se movilice el portabloques, sobre la cuchilla
permaneciendo esta fija, o viceversa, en ambos casos.

El movimiento que produce el corte es el avance y retroceso de la porción móvil sobre

unas guías metálicas.

1º modelo: deslizantes o de tipo Leizls es más estable y proporciona mejor calidad de

corte ya que la vibración de la cuchilla se elimina al permanecer fija.

2º modelo: es el que tiene una cuchilla móvil también llamado Rehicher-Jung, este modelo
está en desuso

3º modelo: este existía es el tipo tetrander que se utiliza para realizar secciones macro-
microscópicas de órganos completos. La cuchilla está fija y lo que se desliza es el objeto.
Se monta sobre una mesa especial.

Ventajas:

 Por su diseño ocasiona pocas averías.

 Permite regular de forma exacta la presión de la cuchilla sobre el tejido.
 Debido al tamaño de la cuchilla permite seccionar bloques titulares de gran tamaño.
 Por la disposición de esta cuchilla permite cortar bloques incluidos en celoidina.
Inconvenientes:

 No permite realizar cortes seriados, con lo cual se enlentece el proceso.

 La exposición de la cuchilla puede provocar accidentes
 Es casi imposible obtener secciones de un espesor inferior a 8 micras.
 Micrótomo de Congelación:
Se utiliza para efectuar secciones de tejido congelado y por tanto no deshidratado. La
congelación se consigue haciendo circular CO2 por el interior del portabloques procedente
de una bombona y de esta forma el gas cuando se expande provoca el enfriamiento del
tejido. Una vez congelada las secciones de trabajan con una cuchilla que se encuentra
sobre un eje fijo de manera que el avance lo realiza el portabloques por un mecanismo
directo del tornillo.

Inconvenientes:

 Necesita CO2 y los cortes generalmente son mayores de 10 micras y se dificulta el estiramiento.
El microtomo de congelación ha sido desplazado por el criostato, solo se utiliza para el
sistema nervioso, para estudios arquitecturales e histoquímicas.

 Criostato o criotomo:
Colocado en un mueble frigorífico con una tapadera en la parte superior y tiene una
manivela que se mueve desde fuera consta de un micrótomo de tipo Minot. Semejante al
convencional de parafina que está incluido en una cámara de congelación permite obtener
cortes de material sin fijar a -20ºC o incluso a -60.

La manivela que controla la realización del corte está fuera mientras que la cuchilla y el
mecanismo de avance está dentro de la cámara fría. La obtención de secciones seriadas
es posible gracias a la existencia de un sistema antienrrollamiento que obliga al corte a
deslizarse sobre la superficie de la cuchilla, en los más modernos es posible optar por el
corte manual o motorizado, así como enfriar rápidamente la muestra, a menos 60ºC por
medio de isopentano o nitrógeno líquido.

Ventajas:

1. Con él se obtienen cortes más delgados que con el micrótomo de congelación de 4

micras o incluso 2 que se utiliza no solo para intras en estudios histoenzimáticos o
inmunohistoquímicos o en grasas. Se realiza primero 1 devastado de 10-20 micras se
corta generalmente a 5. En éste caso la pieza saldrá al revés que con el microtomo de
rotación, o de tipo Minot.

 Ultramicrótomo:
Prácticamente es un derivado del de tipo Minot pero con mejorar técnicas que permiten
efectuar secciones de manómetros de espesor incluso en plásticos. Se obtiene en
microscopia electrónica.

Tiene un sistema de iluminación múltiple con una luz incidente sobre el bloque posterior

Tiene un alcance técnico por dilatación de una varilla, metálica que se controla por n
microordenador que permite el ajuste digital en pasos de un manómetro.
 Tiene una platina, portacuchillas regulable apta para cuchillas de vidrio o diamante, El
sistema óptico tiene un microscopio o una lupa binocular incorporado mediante un motor
se regula el brazo de avance tiene una unidad de control independiente con selectores
para avance macro y micrométrico regulable en amplitud y velocidad. El portabloques es
una pinza redondeada como la de los taladros (como la de las brocas).

 Cuchillas: Tipos:
Eran piezas de acero grandes que había que mantener en buen estado lo hacia el técnico
y eran personales. Actualmente las cuchillas son desechables, se tiran cuando tienen
mellas y existen cuchillas de distintos materiales como acero inox., vidrio, carburo,
diamante dependiendo de lo que se va a seccionar y del medio de inclusión. Se suele
utilizar de acero inox. y para incluir en parafina y de carburo de tolueno.

El largo de las cuchillas variará según el portacuchillas. Existen 4 tipos:

1. Bicóncava por ambas caras: se utiliza para cortar bloques de parafina blanda en el
microtomo de balanceo o de rotación.

Inconvenientes:

1. Vibra en exceso, pero si el tejido es suficientemente blando produce excelentes

secciones, se utiliza también para celoidina blanda.

2. Plano-cóncavas: También se llaman de tipo A y B según sea mayor o menor el frado

de concavidad de la cara no aplanada. Lo de tipo A se usa para bloques de parafina en el
microtomo de deslizamiento y la de tipo B se utiliza para bloques en celoidina.

3. Cuchilla biplana en cuña: o de tipo C que se utiliza indistintamente para cortes

criostáticos en congelación de parafina de tipo Minot. Este tipo se ha impuesto por su fácil
mantenimiento y su mayor rapidez cuando la dureza de los tejidos oscila notablemente.

4. Biplana: O de tipo D. Se utiliza para cortar material congelado con el microtomo de gas
carbónico o cuando el tejido es muy duro.

 Técnica de corte:
En anatomía patológica es una de las funciones más importantes, la exactitud en el
diagnóstico de la calidad y el espesor de los cortes, para ello necesitamos un microtomo
moderno con adecuad mantenimiento cuchillas adecuadas y formación y experiencia
suficiente. La confección de los cortes consta de 6 pasos.

 Si no trabajamos el freno ha de estar puesto

 No se coge la cuchilla con las manos, cuando no se utiliza la cuchilla se pone una pieza que
se llama guardas.

 Antes de empezar a cortar hay que tener preparado el material. Hay que preparar placas de
parafina frías con hielo para mantener fríos los bloques, prepararemos portas, lápices de grafito,
agujas histológicas…

 Se enchufara el baño de flotación programando la temperatura entre 45-50 grados. Se debe

comprobar periódicamente esta temperatura, con el termómetro.

 Se añadirá al baño una pequeña cantidad de gelatina en polvo, o bien que los cortes se
adhieran al portaobjetos.

 Tallado y enfriamiento del bloque:

Retallar un bloque es eliminar el exceso de medio de inclusión que existe en su periferia
para disminuir la superficie total en contacto con la cuchilla. Esto se realiza con la parte de
atrás de la hoja de bisturí se consigue que el bloque oponga solo la resistencia al corte
propia del tejido. Después el bloque debe enfriarse para conseguir una consistencia óptima
de la parafina. S e debe colocar a 4ºC si se colocara a menos de 0 la parafina tiende a
cristalizar y se resquebrajaría los bloques apareciendo artefactos en los tejidos. Esto no
siempre se hace.

 Fijación al portabloques:
Existen sistemas comerciales que se adoptan a la pinza del micrótomo sino fuera así se
podría hacer con parafina líquida.

 Orientación y cuchilla:
Hay que saber que existen 4 ángulos de control de la incidencia del bloque sobre la
cuchilla:

1º es el ángulo de inclinación, se representa por I, debe ser de 10-15 grados

2º es el ángulo de arrastre, se representa por A, debe ser entre 5 y 8 grados

3º es el ángulo de corte, se representa por C, debe ser de 60 grados

4º es el de ángulo libre, es el complementario al ángulo de corte.

 Orientación del bloque:

Colocar el boque retallado sobre el portabloques y orientarlo de manera que quede
paralelo al filo de la cuchilla, para orientarlo había 2 tornillos. Se quita el freno y se hace
descender el brazo hasta que la superficie del bloque entre en contacto con la cara interna
de la cuchilla de devastado. Se comprueba que queden paralelos y si no se restablece
mediante la manipulación de los tornillos.

 Devastado y selección del espesor de los cortes:

Para tejidos incluidos en parafina, lo 1º que hay que hacer es devastar para eso se ponen
20 micras y se elimina la 1º capa de parafina. Cuando vemos que empieza a salir tejidos
se cambia el selector de micras y se pone a la que nos convenga.

El espesor final será de 2 a 5 micras, se utiliza el corte de 10 para tejido nervioso que tiene
baja celularidad, los cortes más delgados son difíciles de obtener, son útiles en patología
renal, hematopoyéticas y linfoide.

 Realización de las secciones:

Realizaremos con una cuchilla que tengamos para devastar siempre con una parte de la
cuchilla y una vez que sale el tejido, se cambia o se mueve la cuchilla y con un movimiento
rítmico del volante, se generará una cinta continua de cortes que es conveniente retirarla
por medio de un pincel o aguja histológica y colocarla en el baño de flotación que
tendremos al lado. Si el tejido se resquebraja es útil añadir vaho sobre el bloque, en todo
momento tendremos un cubito de hielo par frotar sobre el bloque. Los cortes tienen 2
caras. La superior mate y la detrás mate¿?

 Estirado de los cortes y confección de los cortes y confección de las preparaciones:

Se coloca el corte en el baño de flotación de manera que la cara brillante o inferior quede
en contacto con el H2O al estar en H2O entre 45-50 grados el corte se estira debido a la
tensión superficial y flota, si existen pliegues se suelen estirar al ponerlas en el baño, a
 veces en la tira de cortes, según sale, se puede coger con un porta objetos humedecido en
alcohol de 50 o 70 y con este porta se deja reflotar en el baño.

Después procederemos a la captura de los cortes con nuestro porta enumerado, si nos
sale mal podremos volver a reflotar y coger. Después de montar las preparaciones y los
portas hay que eliminar del H2O cualquier resto para evitar contaminaciones accidentales.
Esto consigue pasando sobre la superficie del H2O un papel de filtro.

 Secado de los cortes:

Antes de iniciar el proceso de coloración hay que secarlos para evitar los
desprendimientos. La desecación e puede realizar de distintas formas. La desecación
puede hacerse de esta forma rápida introduciéndose los portas en un cestillo y este en una
estufa que se encuentra previamente a 60 grados durante 30-35 minutos.

También se puede dejar hasta 37 grados hasta el día siguiente.

 Problemas en el corte:
(FOTOCOPIAS)

 Sistemas de Adhesión al porta:

El porta debe estar bien desengrasado, para ello después de lavarlo con agua y jabón y
enjuagarlo con agua destilada se pueden dejar en una solución de alcohol clorhídrico
formado por 1 mL de HCl en 1000 mL de alcohol etílico de 96 o bien dejarlo en alcohol éter
a partes iguales durante un día. Se deja secar y se coge por los bordes (Se deja secar
inclinados). Para los procedimientos más rutinarios o procedimientos más habituales, la
adhesión del tejidos al porta queda garantizada con un desengrasado meticuloso. Para
técnicas histoquímicas inmunológicas o de biología molecular se necesita impregnar los
portas con sustancias adhesivas que eviten que se desprendan los cortes, para ello se
utilizan sustancias naturales como la albúmina de huevo o gelatina o bien sistemas
comerciales formados por resinas y compuestos del tipo poli - L - lisina que son más caros
pero proporcionan mayor adhesividad.

Albúmina glicerinada de Mayer: Los reactivos son:

 Clara de huevo recién extraído ------------------------------------------50 mL

 Glicerol o glicerina ------------------------------------------------------- 50 mL

 Salicilato sódico o fenol o timol una gota o --------------------------- 1gr.

Se mide la clara y se bate a punto de nieve se le añade la misma cantidad de glicerina, se

mezcla se agita y se filtra y se le pone un antibacteriano que puede ser salicilato sódico,
fenol o timol.

Del filtrado se impregna cada parte con una película y se deja secar el aire.
Posteriormente, durante el desparafinado se van a coagular la albúmina y se aumenta la
adhesión al porta.

Gelatina: se hace a una concentración al 5%, se disuelve en agua destilada y se puede

disolver primero en agua caliente sin que llegue a hervir porque perdería sus propiedades
de cohesión, cuando esté a temperatura ambiente se añade el fenol (antibacteriano) del
preparado anterior se añade 3 o 4 cucharaditas por litro de agua al baño de flotación. En
otros sitios añaden directamente una cucharada de gelatina en polvo al baño para técnicas
de enzimología o de inmunohistoquímica (ihq) no podemos usar proteínas animales ya que
pueden producirse reacciones cruzadas.
Resinas: son sustancias de alto peso molecular derivadas del fenol y son el sistema que
proporciona mayor adhesión, habitualmente se utiliza una solución de resina en acetona
en proporción 1:10 antes de su uso.

 Técnica de corte en material congelado:

-Técnica de corte en el criostato: por las especiales características de este instrumento,
es un microtomo minot o de rotación, situado en el interior de una cámara congeladora, es
posible conseguir secciones de hasta 2 micras.

-Congelación del material: para la realización de técnicas histoenzimáticas o

inmunoquímicas es imprescindible que el tejido no haya sido fijado y que la congelación,
no se haya realizado lentamente en la cámara fría del criostato, debido a la formación de
cristales intratisulares de hielo que esto provoca. Si el criostato dispone de un sistema de
congelación ultrarrápido a -50ºC con isopentano se empleara también isopentano enfriado
en nitrógeno líquido, con ello se consigue que el tejido esté suficientemente congelado
cuando se coloque en la cámara de corte del criotomo incluso puede ser necesario esperar
algún tiempo hasta que se alcance la temperatura idónea para el corte. La realización de
los cortes se facilita antes de ser congelado, el tejido se coloca dentro de una gota de
medio sintético de OCT de esta forma se provoca la inhibición del tejido en el medio,
además se favorece la fijación al portabloques del criostato.

 Hidratación:
Con ella conseguimos hidratar nuestros cortes para ellos e pasara por una batería de
alcoholes con concentración decreciente se puede hacer de diversas maneras.

-1º forma: Con 2 cubetas de alcohol absoluto. Una cubeta de 96 y otra de agua. Se hacen
pases rápidos en cada una de ellas.

-2º forma: Cubetas de 100, 2 de 96 y 1 de 80. Después de esta hidratación hay que
colorear.

Siempre acaba en agua. Y según la técnica, después de colorear habrá que deshidratar
aclarar y montar.

Tema 9: Coloración

 Fundamentos Generales de Coloración

La percepción de los colores por la retina está ligada a la capacidad que posee el ojo
humano para captar la radiación lumínica comprendida entre 400 y 800 nanómetros de
longitud de onda () y cuya mezcla homogénea se llama normalmente luz blanca o espectro
visible de la radiación solar cuando un cuerpo iluminado por la luz refleja por la superficie
toda la radiación que recibe, la retina lo percibe de color blanco. Si absorbe toda la
radiación se percibe de color negro. El color que vemos es el complementario al absorbido.
Las estructuras contenidas en las preparaciones histológicas poseen poco color o carecen
de él. Por lo que no pueden ser distinguidas a excepción de la melanina de la piel o de la
hemoglobina de la sangre. Este inconveniente se subsana por la propiedad de los
diferentes componentes celulares de manera que pueden incorporar y fijar determinados
materias colorantes. Un colorante se puede definir como la sustancia que puesta en
contacto con un soporte adecuado. Se une a él y le transmite color.

Las preparaciones en colores, se deben a que no todas las estructuras celulares se tiñen
con un colorante con la misma intensidad. Si se sabe exactamente la reacción química o
física en la que se basa una coloración es posible deducir ciertos datos sobre las
características o la constitución química de las estructuras que se ponen en manifiesto.

Tipos de colorantes según su origen podemos clasificarlos en:

Naturales: son relativamente escasas y se obtiene en forma de extractos a partir de

ciertas plantas, insectos o moluscos. Son ampliamente utilizados en anatomía patológica y
un ejemplo son el carmín que se utiliza como colorantes nuclear y se utiliza con
hematoxilina.

Artificiales: en su mayor parte derivan de la anilina. Comenzaron a utilizarse a mitad del s.

XIX y sirve a numerosas coloraciones, inicialmente se obtenía del alquitrán y actualmente
se sintetiza en el laboratorio.

 Naturaleza Química de los Colorantes

El soporte químico de la mayor parte de los colorantes naturales y de todos los artificiales
son anillos aromáticos derivado del benceno. Debido a que los dobles átomos de carbono
anillos no son fijos. Es decir, pueden ser reordenados Esto hace posible que están muchos
derivados del benceno y por tanto de los colorantes de anilina.

El Benceno al igual que todos los hidrocarburos aromáticos, originalmente tienen una
sustancia incolora que puede absorber radiaciones dentro del espectro de la luz
ultravioleta, es decir a menos de 400 manómetros. Si se produce una reacción química e
introducimos radicales químicos, el derivado del benceno que se obtiene puede absorber
radiación luminosa, dentro del espectro visible y no nos mostrará color. El anillo bencénico
será incoloro, a nuestros ojos. A los radicales químicos responsables de la modificación
molecular a la que se debe la aparición del color se le llama grupo cromóforo y se
denomina cromógeno al conjunto formado por el grupo cromóforo y el anillo bencénico.
Cromógeno no es sinónimo de colorante ya que el cromógeno no siempre tiene apetencia
por el tejido o no se une fuertemente al tejido. Otras veces el colorante puede perder
temporalmente, su capacidad para absorber radiación lumínica dentro del espectro visible.
Esto ocurre generalmente por la reducción del grupo cromóforo que lo transforma en un
leucoderivado. En estos casos el color suele aparecer tras realizar una oxidación que
restaura el grupo cromóforo, esto ocurre cuando no se almacena correctamente. El anillo
bencénico puede llevar uno o dos grupos cromóforos. Los principales grupos cromóforos
conocidos son los siguientes radicales:

--------------------------------------
Etileno - (>C=C<)

--------------------------------------
Carbonilo - (>C=O)

--------------------------------------
Tiazólico - (>C=S)

--------------------------------------
Imino - (>C=N)

--------------------------------------
Azoico - (-N=N-)
 --------------------------------------
Nitroso - (-N=O)

--------------------------------------
Nitro - (-NO)

La conversión del cromógeno en colorante está vinculada a la adicción sobre la molécula

cromática de otros grupos atómicos que la confieren o le dan la oportunidad de disociarse
electrolíticamente o de formar sales con los diferentes tejidos. Estos radicales se los
denomina grupos auxocrómos o potenciadotes del color. Generalmente tienen carga
eléctrica es decir posee carácter ácido o básico y son los responsables de que el colorante
tenga mayor o menor afinidad por la estructura que va a teñir.

Los grupos auxocrómos de importancia son: el grupo hidroxilo, carboxilo, amino, sulfidrilo y
determinados iones derivados del Fe, Cr, Al y del Mb.
 Clasificación de los colorantes según los Grupos Cromóforos.
En función del grupo cromógeno que contienen. Existen 8 grupos de colorantes:

Coloran
Nitrocolo te
rante azoico

Antraqui Acridin
nona a

Oxacina Tiacina
 Trienal
Acina metano

Ftalocia
nina de
Xianteno Cobre

Colorantes Nitratos o Nitrocolorantes:

Son nitro o nitrosos derivados del benceno o del naftaleno con algunos grupos hidroxilos
aminos, etc. El más sencillo es el 2, 4, 6 trinitrofenol. La presencia de los 3 grupos nitro
incrementa el carácter ácido del grupo fenólico.

Colorantes Azoicos:

Contienen el grupo Azo unido o uniendo anillos adyacentes derivados del benceno o del
antraceno. En general son colorantes ácidos, también los hay neutros o básicos pueden
tener un solo grupo azo (monoazoicos) como por ejemplo el orange G o Anaranjado 2, el
cromotropo 2R o también diazoicos como el Sudán rojo y negro, el Rojo Congo o el
Escarlata de Biebrich

Colorantes Derivados de la Antroquinona:

Se obtiene a partir de la oxidación del antraceno para formar anillos quinónicos como el
Rojo de Alizarina S.

Colorantes de Derivan de la Acridina:

Naranja de Acridina,

Iminas Quinónicas

Poseen 2 grupos cromóforos y en función de ellos se clasifican en derivados oxacínicos

como por ejemplo la Galocianina el Azul Nilo o el Violeta de Cresilo. Derivados tiacínicos
como por ejemplo: tionina, Azur A, B y C. Azul de Toluidina, derivados acínicos como por
ejemplo el Rojo Neutro, Safranina E y Azocarmin.

Derivadas de Difenil metano:

Como por ejemplo la auramina y del trifenilmetano como las fucsinas o el Verde Ligero.
Los colorantes de este grupo pueden ser ácidos o básicos según el grupo auxocrómo que
se le añada a la molécula.

Colorantes Derivados del Xanteno:

Los grupos cromóforos son variables y entre ellos están:

-Piridina

-Rodanina

-Sulfoftaleina.

Colorantes Derivados de las Ftalocianinas:

Por ejemplo el Azul Alcian cuyo anillo recuerda a la molécula de la hemoglobina, en

general junto al nombre de los colorantes figuran algunos códigos y siglas -numéricos.

Siglas: corresponden a abreviaturas comunes a diferentes colorantes. Ejemplos: Si

encontramos una:

B azulado

G verdoso

L insensible a la luz

M mezcla

R rojizo
 S soluble

W soluble en agua

Y amarillento

El código -numérico nos remite a lo que se denomina C.I. que es el Índice Calorimétrico
del colorante que nos sirve para identificarlo y lleva 5 dígitos.
 Clasificación de los colorantes según los Grupos Auxocrómos y Apetencia Tisular.
Cinco grupos fundamentales:

1º) Colorantes Básicos: asociación de un cromógeno de baja intensidad y de carácter

débilmente ácido al que se le añade grupos auxocromos catiónicos fuertemente básicos
que son los responsables de la carga global del colorante por eso se utilizan para teñir
estructuras ácidas.

Ejemplo: laca de hematoxilina - colorante nuclear.

Fucsina básica

Galocianina

2º) Colorantes Ácidos: productos de la unión de un cromógeno de baja intensidad

débilmente básico al que se le añaden grupos auxocromos fuertemente acido lo que le dan
dicho carácter al colorante tiñe estructuras básicas celulares en el citoplasma celular:
Eosina-C. Citoplasmática / Fucsina-Ácida.

3º) Colorantes Neutros: unión colorante ácido y básico para formar un precipitado

comúnmente insoluble en agua y muy estable en disolución alcohólica de esta forma
siendo su carga floral neutra conservan en parte la propiedad de colorear conjunta o
separadamente diferentes estructuras dependiendo de que sean o no capaces de atrapar
algunos iones generando cuando la sal se disocia tras ser inestabilizada al colocarla en
disolución acuosa. Ejemplo Giemsa.

Las estructuras así coloreadas adquieren una tonalidad policroma = multicolor.

4º) Colorantes Indiferentes: En condiciones normales colorean los tejidos por un

mecanismo de impregnación física no poseen carácter ácido, básico o salino definido por
ejemplo la tinción argéntica.

5º) Colorantes Metacromáticos: en condiciones normales la mayor parte de los

colorantes tiñen los tejidos con un color parecido a él, esta propiedad es la
ORTOCROMASIA, sin embargo cuando se utilizan ciertos colorantes básicos derivado de
la anilina algunas estructuras titulares se tiñen con tonos diferentes al que cabria esperar
por el colorante usado. Por ejemplo los gránulos de los mastocitos presentan color rojo con
el azul de metileno o el azul de toluidina, este efecto es la METACROMASIA y estructuras
teñidas LA CROMOTROPAS, los colorantes metacromáticos son sustancias químicamente
puras y no de carácter salino. La explicación se cree que se debe a que se produce una
polimerización entre las moléculas de colorante adyacente a las estructuras a teñir. Existen
estructuras como son por ejemplo glúcidos complejos o cartílago que se observan mejor
con estos colorantes metacromáticos.
 Teoría del Proceso de Coloración o Mecanismos de Coloración
Los métodos de tinción se fundamentan en una serie de procesos fisicoquímicos
complicados que venían según los colorantes algunos son todavía desconocidos no se
sabe si la coloración se efectúa por procesos físicos o químicos. Aunque ambas teorías
intervienen y además se produce una serie de procesos complicados que entran en el
campo de la físico-química (aunque el proceso de coloración la

- M. Físicos: ligados a las propiedades de disolución e impregnación del colorante sobre el

tejido, el colorante es más soluble en el tejido que en el disolvente que actúa como medio
de transporte, suele ser agua, un ejemplo: la tinción para grasas, en esta el colorante se
disuelve mas fácil en los lípidos titulares que en la solución alcohólica siguiendo reglas de
la difusión para el colorante de la solución colorante a las estructuras de su predilección
también el proceso de impregnación se basa en m. Físicos en este caso el colorante tiene
un gran volumen molecular o bien se hace una precipitación selectiva en forma de
agregados insolubles de manera que el colorante queda atrapado entre la mellad e células
y fibras que constituyen los tejidos.

- M. Químicos: La reacción entre colorante y tejido ocurre por procesos químicos bien
definidos de manera que al interaccionar se produce un nuevo cromógeno responsable del
color obtenido, los procedimientos que se fundamentan en este mecanismo. Se agrupan
en el campo de la histotecnología que estudia la estructura química y la composición de
los tejidos mediante reacciones químicas especificas para la localización microscópica de
determinadas sustancias.

- M. Físico-Químicos: Se basa en la formación de uniones intermoleculares por atracción

electrostática (cargas diferentes) de manera que el colorante ácido tiene estructuras
básicas y viceversa.

VOCABULARIO EN LAS TENICAS DE COLORACIÓN:

Coloración progresiva: en ella se deja actuar el colorante hasta que la coloración alcanza
la intensidad deseada, se lleva el control exacto de los tiempos y el punto exacto se
controla con el microscopio.
Coloración regresiva: en ella una se sobrecolorea y luego se elimina el exceso de
colorante, a éste último proceso se le llama diferenciación que se puede hacer con agua,
con ácidos, alcohol, bases o con soluciones metálicas.

Coloración Terminal: Colorea estructuras cuya intensidad es independiente del tiempo

que actúa el colorante.

Impregnación: en ella se utilizan sales metálicas como cloruro de oro, nitrato de plata y se
origina precipitados metálicos en las estructuras.

Coloración en Bloque: en ella las piezas se tiñen, se incluyen, se cortan tal cual.

Coloración directa: el colorante tiñe por el mismo, necesita mordiente.

Coloración indirecta: el colorante no tiñe por si mismo sino que hay que tratar con un
mordiente

Coloración Topográfica: es aquella que proporciona una visión de conjunto, de manera

que se pueden separar todos los componentes arquitecturales.

Coloración estructural: nos sirve para resaltar ciertas estructuras titulares. Ejemplo:
núcleos, fibras elásticas…
FORMAS DE COLOREAR:

El procedimiento más usado es dejar la sustancia colorante sobre el corte y luego llevar o
añadir al porta un líquido para extraer el colorante, ese líquido suele ser agua o alcohol par
ello necesitaremos 100-150 mL por grupo Tinción por vertido.

También se puede hacer por inmersión introduciendo la preparación en colorante y en este

caso si es un koplin de 90 mL, los colorantes se conservan en frasco cerrado, color
topáceo, se etiquetará y se filón antes de usar. Algunos colorantes se alteran con el tiempo
por lo que se hará la disolución justo antes de utilizarlos, en algunos de estos casos se
puede dejar hecha la solución madre. Otras veces el colorante necesita madurar, entonces
hay que prepararla con antelación (Hx).

 Deshidratar
Después de colorear nuestra preparación hay que deshidratar, algunos cortes de parafina
necesitan deshidratarse después de haber sido teñidos, la elección del agente
deshidratante depende de la solubilidad que en él tengan las sustancias colorantes
utilizadas en la tinción si se utiliza un colorante soluble en alcohol se utilizará la acetona o
dioxano como agente deshidratante, si el colorante es hidrosoluble deberá evitarse los
alcoholes de menor concentración, los cortes pueden deshidratarse siempre con alcohol
absoluto y cuando el exceso de colorante haya sido eliminado con papel secante se hace
sobretodo en la deshidratación con acetona, si secamos un corte con papel de filtro no se
hará nunca expuesto al aire ya que puede dar lugar a artefactos. Existen varios
procedimientos para deshidratar:

Xilol: Aclarar y conservar la muestra hasta el montaje. Se quedan dentro de las cubetas de
Xilol hasta el montaje porque sino se estropean. Al sacar el corte del Xilol no se deben
observar gotas, esto indicaría una mala deshidratación o bien que el corte se ha
impregnado de un Xilol contaminado.

Desparafinar Estufa 60º 30 min.

Aclarar MC o X 2 cubetas de Xilol durante 5 min. cada una.

!

Hidratar 2 cubetas de 100º 2' cada una, 2 de 96º 2' cada una, 1 de 80º 2', 1 de agua 2'

Colorear

Deshidratar 1 cubeta 80º 5', 2 de 96º 5' cada1, 1 de absoluto 5' y otra de absoluto nuevo 5'.

Aclarar 2 cubetas de Xilol 5' cada una

Montar

 Técnicas de Montaje
 El paso final de la preparación del porta con el tejido y después de teñir, deshidratar y
aclarar es el montaje como paso previo a la observación microscópica, es decir cubriremos
la porción que recubre el tejido con un vidrio muy delgado que es el cubre, finalidad de los
medios de montaje es evitar que la muestra situada entre porta y cubre se ponga en
contacto con el aire, características de los medios de montaje:

No deben tener ninguna acción sobre los colorantes o los tejidos y deben conservar la
muestra durante mucho tiempo y permitir el examen microscópico. Hay gran cantidad de
preparaciones según sea deshidratado o hidratada. Ciertos colores son mas estables y
ácidos y otros mas neutros o alcalinos.

 Azul de Metileno Alcalino

 Van Gieson Ácido.

La composición química de los medios de montaje pueden ser: Resinas naturales, resinas
sintéticas o determinados alcoholes polivinilicos.

 Medios de montaje para preparaciones hidratadas:

Para preparaciones hidratadas se utiliza la gelatina glicerinada también llamada jalea

glicerinada. Su fórmula es:

 Gelatina 5 gramos

 Glicerina 35 cc

 Agua destilada fría 25 cc

 Agua normal 40cm3

 Gotitas de fenol o Timol para desinfectar.

Ablandar la gelatina en agua fría y cuando esté en blando disolver el agua sin que llegue a
hervir, cuando esté bien disuelto y a temperatura ambiente añadir la glicerina y el fenol y
señales el cubre en el borde con un poco de pintauñas.

En coloraciones de grasas: Se utiliza jarabe de goma arábiga.

- Preparaciones deshidratadas:

Se montan con resinas naturales de origen vegetal lo que se llamaba bálsamo, de estas
resinas naturales son parecidas a los terpenos y otros compuestos se parecen a las
esterinas vegetales. Antiguamente se usaba el bálsamo de Canadá pero se ha desechado
porque produce una reacción ácida, destiñe, seca lentamente, puede cristalizar y
oscurecer las resinas artificiales se obtienen por condensación químico de aldehídos con
fenoles. Así existen compuestos comerciales como el EUKITT, ACRITOL o el Ápex.

El Ápex es una solución de Polietilén glicol en xilol, con él se obtienen buenos resultados,
como hematoxilina y toxina o en el Masson- Goleen.

En microscopía de fluorescencia se usa aceite de cedro, jarabe de goma arábiga o laca de

Oxilina.

Los cortes deshidratados cubiertos por el medio de montaje se cubren con el cubre. Si la
preparación es hidratado se bordea con un medio para que no se evapore el líquido y para
sellar los extremos para ellos se utiliza la laca de uñas.

- Formas para colocar el cubre:

- Se deja caer el medio de montaje sobre el tejido y encima se coloca el cubre pudiéndose
presionar ligeramente con una aguja de disección o una pinza.

- O colocar una gota en el extremo de la preparación y tomando el cubre entre los dedos
índice y pulgar se deja caer suavemente, sujetando con una aguja histológica.

- Colocar la gota sobre el cubre y el porta se invierte sobre el cubre, en todos los casos el
exceso de elimina de los alrededores del cubre presionando ligeramente con un paño
humedecido con Xilol o Toluol.

- Errores que se pueden cometer:

- Permitir que el tejido se rehidrate, si pasa mucho tiempo desde que se saca del agente
aclarante, se observa como pierde transparencia y a esto se le llama secado. Es decir, el
agente aclarante se ha evaporado y los huecos los ocupa la humedad. Si se monta el
resultado es desastroso. Para evitar este efecto se sacará el porta del aclarante, justo en
el momento de montar.

- Exceso de medios de montaje.

 Procedimientos para Desteñir una Preparación

1º) Quitar el cubre, para ello dejaremos la preparación en Xilol durante horas o durante
días. A mayor antigüedad más tiempo necesitará. Si se introduce en la estufa a 60º se
necesita menos tiempo, pero el Xilol es muy tóxico. Otra manera es introducir en el
congelador con el cubre hacia abajo sobre el hielo de 10 a 15 min., incluso puede tardar
horas y en ambos casos provistos de gafas, y con una aguja histológica se introduce para
retirar el cubre, para eliminar el medio de montaje se retira el Xilol y para retirar la tinción
nuclear se utiliza el HCl diluido en alcohol o agua 5-20 minutos o más después en agua
corriente durante 10-15 minutos.

2º) Otra forma:

 Xilol
 OH Absoluto (x3) - 10 pases
 OH Absoluto (x3) - 10 pases
 Agua
 Solución acuosa alcohólica (alcohol) (3'-5'): 10cc HCl (5N) + 1000cc alcohol 70º
 Agua
 Reteñir
3º) Otra forma:

 Alcohol Absoluto + Xilol - 10 pasos

 Alcohol Absoluto x2
 Alcohol Absoluto 95º (x4) - 80 - 70 - 50
 Agua
 HCl 1º / 1 - 2.
 Agua 10'
  Reteñir

CITOLOGÍA DE LÍQUIDOS Y SECRECIONES:

Tema 0:

Generalidades:

Características generales de los frotis inflamatorios

Cuando tenemos inflamación debemos evidenciar una serie de signos que denominamos
signos propios de la inflamación. Estos signos los podemos empezar a visualizar con el
objetivo de menos aumento.

Con el objetivo de 40 podemos identificar el tipo de infiltrado inflamatorio: PMN, histiocitos

o linfocitos.

Pero esto no es suficiente, ya que hay que evidenciar unos signos característicos en las
células que encontramos en la citología, que son por otra parte los signos propios de la
degeneración celular, ya que en las células afectadas por la inflamación se producen una
serie de lesiones que inevitablemente nos llevarán a muerte celular. Las células van
perdiendo progresivamente sus características morfológicas y también su función.

Esta degeneración celular viene representada por una serie de cambios que afectan al
núcleo, al citoplasma y a ambos en conjunto.

 Alteraciones inflamatorias que afectan al núcleo.

 Tamaño: hinchado - reducido

 Forma: variable - fragmentado (cariorexis)
 Textura: cromatínica normal
 Coloración: hipercromático - hipocromático
 Aparición de inclusiones aliadófilas y basófilas.
 Multinucleaciones
 Alteraciones inflamatorias que afectan al citoplasma.

 Tamaño: tendencia a la tumefacción (hinchado) aunque también puede aparecer reducido

 Forma: variable
 Tendencia a la eosinofília tinción de rosa (a veces el citoplasma es anfófilo rosa/azul.
 Presencia de: inclusiones leucocitarias y vacuolas citoplasmáticas.
 Queratinización
 Depósito de pigmentos
 Rotura de la membrana y destrucción
 Alteraciones inflamatorias que afectan a la célula

 Halos perinucleados
 Núcleos sueltos
  La relación N/C se mantiene (diagnóstico diferencial con cel. malignas)
 El núcleo normalmente se mantiene en su posición habitual
 La fase final

La fase final de este proceso es la muerte celular que viene determinada por 3 procesos:
cario núcleo

 Cariopicnosis: condensación del núcleo por deshidratación y concentración de la cromatina.

 Cariorexis: rotura del núcleo

 Cariolisis: disolución completa del núcleo (no lo vemos)

Las alteraciones degenerativas de las células debidas a la inflamación pueden parecer en

muchas ocasiones cambios tumorales o cambios malignos.

Tema 1:

Citopatología del aparato respiratorio:

 Introducción:
La citología del aparato respiratorio estudia las células e la superficie de dicho aparato que
podemos considerar que va desde la cavidad nasal a los pulmones. Éstas células se
obtienen mediante distintos procedimientos:

 Exfoliación espontánea

 Lavado

 Cepillado

 Aspirado

 Punción

Después del material ginecológico, el respiratorio y por encima el esputo constituyen el 2º

el volumen de muestras, de forma que entre la citología ginecológica y la respiratoria
constituyen del 80% de las muestras.

 Utilidad de la patología respiratoria

 Se utiliza para diagnosticar tumores en pacientes de riesgo y recidivas.
 Para diagnosticar infecciones en pacientes inmunodeprimidos y conocer con rapidez el tipo de
germen

 Para otras patologías pulmonares.

 Ventajas de éstas citologías
 Fácil de obtener

 Bajo coste

 Resultados fiables

 Procesado fiable

 Diagnóstico rápido

 Tipos de muestras
 Esputos

 BAS (bronco aspirado)

 Cepillado

 BAL: lavado bronco alveolar

 PAAF

 Esputo
Es la más utilizada para el diagnóstico citológico. Está compuesta por:

 Moco

 Material celular

 Material acelular diverso

Dentro del esputo podemos encontrar:

 Esputo fresco
Es el que suele llegar al laboratorio. Se obtiene realizando el paciente una expectoración,
se recomienda que sea el 1º de la mañana a que este es el más celular.

La expectoración se realiza en un recipiente adecuado y estéril, y conviene que el paciente

realice esto durante 3 días consecutivos.

Antes de hacer la expectoración se recomienda hacer gárgaras con agua salina para
minimizar la contaminación que pueda provenir de alimentos e incluso de bacterias.

Para obtener un esputo en condiciones el paciente debe aspirar intensamente y realizar la

expectoración en el frasco.

Se debe llevar inmediatamente al laboratorio, pero en el caso de que no se pueda se debe

conservar como máximo 24h en la nevera.

 Esputo inducido:
Aquel esputo que se obtiene, cuando el paciente no puede expectorar, induciéndole a ello
mediante aerosoles específicos.

 Laboratorio:
o El técnico tiene que comprobarla filiación y registrarla.

o El técnico debe analizar el esputo y anotar sus características macroscópicas, ya que

pueden ser de suma importancia en el diagnostico.

Para ello tomara una pequeña cantidad de esputo con unas pinzas y lo depositara en una
placa de Pietri (tomara con las pinzas las partes mas representativas del esputo y las más
compactas ya que pueden contener mas células, restos tisulares,… son más interesantes.
También tomará las zonas rojas, amarillas, verdes,… desechando las zonas más liquidas.)
o Con ayuda de otro porta realizará una extensión de forma que quede una película
fina, a continuación se fija con alcohol de 96 mínimo 30 minutos. Si el esputo de demasiado
hemático se puede fijar con alguna solución lisadora de glóbulos rojos (CARNOV).
o Tras la fijación procedemos a la tinción, normalmente realizamos 5 extensiones d
las cuales 2 o 3 se tiñen con Papanicolau y el resto con Grocott y PAS.
  Esputo prefijado
Se usa cuando el paciente no puede llevar la muestra al hospital en fresco, la calidad es
menor y en lo que consiste es en realizar una expectoración en el frasco con una cierta
cantidad de alcohol.

 Técnica de Sacommano
Fue propuesta en el 64 para hacer Screening (prevenir) en poblaciones de alto riesgo de
carcinoma de pulmón.

La técnica consiste en que el paciente deposita el esputo en un bote convencional

esterilizado varios días consecutivos con alcohol (no hace falta que sea en el mismo bote
aunque al final se van a mezclar.

El esputo de bate, se centrifuga y se obtiene el sobrenadante.

La parte más densa se pone en el potra y se extiende, después se fija y se extiende, y

después se fija y tiñe con Papanicolau. Se obtienen extendidos muy celulares por lo que
es muy representativo para el screning.

Inconveniente: en el caso de que haya hongos, las hifas se destruyen y nos las veo.

 BAS
Recogida de secreciones del aparato respiratorio por aspiración.

Para ello se usa un tubo flexible con un sistema óptico específico que se llama
broncofibroscopio que se introduce vía nasal u oral. Normalmente se precisa anestesia
local y es bien considerado por el paciente

Es una muestra muy útil para el estudio de tumores y otras patologías. La muestra de BAS
es muy liquida, llega en tubos específicos al laboratorio y según el protocolo del laboratorio
o se utiliza el THIN- PREP o se usa la citocentrífuga (luego se extiende, se fija y se tiñe); si
la muestra es muy líquida se procesa directamente.

 BAS selectivo: que es cuando recogemos las secreciones de un segmento pulmonar

específico. Se utiliza para neoplasias ocultas.

 Cepillado bronquial:
Consiste en un cepillado de la mucosa bronquial con un fibroncoscopio específico. Es una
muestra en la que las células están muy bien conservadas. Es muy indicada en aquellos
casos en los que es difícil realizar una biopsia.

 BAL
Es el lavado bronquioalveolar, es una muestra muy específica ya que se usa para recuento
celular. Consiste en la instilación y posterior aspiración de una solución salina en las vías
distales (alveolos) del aparato respiratorio. Se utiliza para diagnosticar sobretodo
infecciones

 PAAF
Tema 2

Histología del aparato respiratorio.

 El aparato respiratorio es el que realiza la función mecánica de la respiración, es decir, el
proceso mediante el cual el oxigeno se absorbe de la atmósfera que pasa al sistema
vascular sanguíneo mientras que el Dioxido de carbono sigue el camino inverso.

Para realizar esta función, el Ap. Respiratorio consta de lo que se podría llamar un sistema
de conducción que transporta los gases tanto desde el interior al exterior como al revés.
Consta de un sistema capaz de producir el intercambio de dichos gases (una interfaz).

El sistema de conducción comienza con un tubo único que va progresivamente

ramificándose y finalmente termina en unos sacos ciegos que son os alveolos y que es el
lugar donde se produce el intercambio gaseoso.

Desde el punto de vista anatómico el sistema respiratorio se puede dividir en lo que

llamamos:

Tracto respiratorio superior

Separados por la faringe.

Tracto respiratorio inferior

 Fosas nasales y senos de la cara:

El aire entra a través de las fosas nasales, en concreto a través de las aberturas nasales.

La parte externa de estas aberturas está constituida por: epitelio escamoso estratificado
queratinizado que se convierte rápidamente en epitelio escamoso estratificado no
queratinizado.

Ya en la parte interna de las fosas nasales encontramos el epitelio respiratorio (epitelio

columnar pseudoestratificado que contiene entre otras células caliciformes (moco) y
células ciliadas).

Debajo del epitelio (por debajo de la mb. Basal) encontramos la lamina propia o corion de
tejido conjuntivo que contiene glándulas de tipo seroso y mucoso.

El aire inspirado es humedecido por las secreciones que producen las glándulas a la vez
que una lámina de moco se deposita sobre su superficie (del epitelio) y atrapa las
partículas indeseables.

Éste moco será deglutido o expectorado. La lamina propia contiene también gran cantidad
de células inmunitarias como son macrófagos, cel. Plasmáticas y linfocitos.

Los senos paranasales que se llaman: maxilar, esfenoidal, etmoidal y frontal. Son unos
espacios cavernosos en los huesos del cráneo del mismo nombre. Cada seno se
comunica con cada cavidad a través de una serie de pequeños orificios y están revestidos
por un ep. de tipo respiratorio.

La función de estos senos paranasales es la de aumentar la superficie de la cavidad nasal.

Una parte del techo de la cavidad nasal está tapizada por una mucosa específica llamada
mucosa olfatoria.

 Nasofaringe

Porción de la faringe que se continúa con la parte posterior de las fosas nasales, es un
conducto musculo-membranoso que constituye una encrucijada aerodigestiva.
 La laringe se encuentra tapizada en todos sus tramos por epitelio respiratorio excepto en la
zona en la que está en contacto con los alimentos (orofaringe) formado por epitelio
escamoso estratificado no queratinizado.

 Laringe

Es una estructura muy compleja ya que debe evitar que el aire entre en el esófago cuando
inspiramos, la entrada de alimentos en el ap. Respiratorio y debe ser capaz de producir los
sonidos.

Está constituida por una armadura de piezas cartilaginosas articuladas entre si y unidas
por ligamentos y músculos estriados.

Ésta arquitectura es evidentemente mantenida por las piezas de cartílago, pero se pueden
mover debido a las pequeñas bandas de músculo estriado que reciben el nombre de
músculos intrínsecos de la laringe. Los cartílagos mantienen así la abertura y la forma de
la vía aérea.

En la laringe encontramos además una lamina central de cartílago elástico que se llama
epiglotis, que evita que los alimentos entren en la vía respiratoria.

Histológicamente está tapizada por un epitelio respiratorio, y hay una porción del epitelio
escamoso estratificado en la parte de la epiglotis que está más próxima a la lengua.

En la laringe encontramos también las cuerdas vocales que están tapizadas por epitelio
escamoso estratificado.

 Tráquea

La laringe se continúa con la tráquea, que es una estructura semirrígida que mide
aproximadamente unos 10 cm de longitud. Está constituida por unos anillos (20) de
cartílago incompletos. En la parte posterior encontramos una pequeña banda que carece
de cartílago formada por un ligamento fibrocolagenoso denso que además contiene haces
de musculo liso que permiten a la tráquea cierta articulación.

Histológicamente está organizada así:

o Epitelio cilíndrico pseudoestratificado (ep. respiratorio) con células ciliadas y
caliciformes.
o Membrana basal

o Lámina propia o corion de tejido conjuntivo muy rico en tejido linfoide fibras
elásticas.
o Submucosa que presenta glándulas seromucosas que van disminuyendo el nº en las
porciones inferiores
o Anillo de cartílago

 Bronquios

La tráquea se bifurca en dos bronquios principales uno para cada pulmón y son los vasos
de mayor calibre del árbol bronquial. Son extrapulmonares y penetran en cada uno de los
pulmones junto con las arterias pulmonares a través del hilio pulmonar.

Una vez en los pulmones se dividen en los bronquios lobulares, 3 en el pulmón derecho y
2 en el pulmón izquierdo.
 A lo largo de su trayecto los bronquios se van dividiendo hasta llegar a un punto
denominado bronquiolos.

Histológicamente está organizado así:

o Epitelio cilíndrico pseudoestratificado (ep. respiratorio) que se va haciendo más
cúbico y con menos cel. caliciformes.
o Membrana basal

o Lámina propia o corion de tejido conjuntivo más densa y con más fibras elásticas.

o Cantidad variable de musculo liso que progresivamente va aumentando de tamaño

conforme avanzamos en el árbol bronquial.
o Submucosa que presenta menos glándulas seromucosas.

o Cartílago: va disminuyendo a medida que descendemos en el árbol bronquial de

forma que los bronquios extrapulmonares tienen un cartílago como el de la tráquea mientras que las
intrapulmonares van presentando placas de cartílago hasta que desaparece.

Las células que vamos encontrando en el ep. respiratorio y a lo largo del mismo son:

 Células cilíndricas ciliadas: células mayoritarias y que progresivamente se van haciendo

más cubicas.

 Células basales o de reserva: son las que descansan sobre la mb. Basal, son pequeñas y son
las llamadas “células madre” porque son las que dan lugar a las demás.

 Caliciformes o de Globet: diseminadas entre las ciliadas y que son más numerosas en los
bronquiolos principales.

 Células neuroendocrinas o cel. De Hultchisky: son células minoritarias que se sitúan sobre
la membrana basal y que se sitúan también a lo largo del aparato respiratorio a partir de la tráquea.
En los bronquiolos terminales son mucho más numerosas.

 Células de clara: aparecen en los bronquiolos terminales y respiratorios son células

cilíndricas pero no ciliadas que contienen unos gránulos de secreción que segregan surfactante (que
impide que las paredes finísimas de los alveolos se peguen (obstruyan)).

 A lo largo del ap. Respiratorio hay multitud de células inmunológicas constituidas por
acúmulos de linfocitos y células plasmáticas.

 Bronquiolos

Son las vías aéreas distales.

Histológicamente están organizados así:

o Epitelio respiratorio ya es prismático simple y encontramos menos células
caliciformes.
o Membrana basal

o Lámina propia: densa y con elastina

o La capa de musculo liso se va haciendo más gruesa.

o Submucosa prácticamente no hay glándulas

o Cartílago: va desapareciendo progresivamente

o Aparecen nuevas células denominadas células clara.

 Bronquiolos terminales

Son los conductos finales del ap. respiratorio y estructura es igual a la de los bronquiolos.
Cada bronquiolo terminal se divide para formar los bronquiolos respiratorios y estos se
consideran los elementos base del sistema respiratorio.

Están revestidos por un ep. Cubico y las paredes de estos conductos están formadas por
unas aberturas localizadas lateralmente que son los alveolos. Normalmente cada conducto
alveolar acaba en los sacos alveolares.

Los alveolos son unos sacos de aire y es el órgano sonde se realiza el intercambio
gaseoso. Constituyen el parénquima pulmonar. Son pequeñas bolsas de paredes muy
finas abiertas por un lado y recubiertas de un epitelio simple que descansa sobre una mb.
Basal. Además asociadas a su pared encontramos gran cantidad de capilares.

La mayoría de los alveolos se abren en un saco alveolar o en un conducto alveolar;

aunque algunos lo hacen en un bronquiolo respiratorio.

El revestimiento alveolar está constituido por dos tipos de células de revestimiento.

 Neumocitos tipo I: representan el 40% del total, son células aplanadas con núcleos muy
planos.

 Neumocitos tipo II: células más grandes que se encuentran 6 o 7 por alveolo.

La separación entre 2 alveolos continuos recibe el nombre de tabique interalveolar, y la

comunicación entre alveolos contiguos se realiza a través de unos poros llamados poros
de Khon.

En la zona alveolar finalmente encontramos en el parénquima unas células que son los
macrófagos alveolares. Los macrófagos se encuentran en los espacios aéreos
moviéndose con libertad y fagocitando todos los detritos inhalados y las bacterias,
constituyendo así una línea defensiva de suma importancia.

Tema 3

Citopatología del esputo

El esputo es una mezcla de secreciones que proceden del ap. Respiratorio. Está
constituido por:

 Agua

 Moco

 Electrolitos

 Exfoliaciones celulares

 Secreciones nasales y salivares

 Flora microbiana saprófita

 Contaminantes

Es la muestra más frecuente que se analiza en el laboratorio, y se utiliza normalmente

como primera muestra para realizar análisis anatomopatológicos.

Tras la citología de esputo y si se cree conveniente se hacen otros estudios.

 Contraindicación:

 Extrema debilidad del paciente

Condiciones para un diagnóstico fiable:

 Buena conservación de la muestra

 Procesado correcto

 Debe contener células de todo el ap. Respiratorio

 El estudio debe ser de 3 días consecutivos.

Ventajas

 Sencilla

 Barata

 Material representativo de todo el ap. Respiratorio

 Sensibilidad del 60%

Inconvenientes:

 Cuando obtenemos una muestra + para malignidad no sabemos de que parte del ap.
Respiratorio es.

 Puede dar falsos - por ejemplo: si hay una obstrucción en un conducto y las células malignas
no han salido al expectorar.

Los tumores que mejor se diagnostican son los de gran tamaño y los que descaman
abundantemente.

Procesado de la muestra:

 Hacer la identificación y registro

 Examen macroscópico: cantidad, aspecto: consistencia, color, olor,…
Adjetivos para descripción: con burbujas/ amarillos con mal olor/ mucosos/ purulentos/
hemoptoicos/ blanquecinos/ gelatinoso/ mucopurulentos/…

 Extensión
 Fijación
 Tinción
Citología normal de esputos:
o Células epiteliales

o Células sanguíneas (no epiteliales)

o Material no celular

o Contaminantes

 Células epiteliales
Células escamosas
En el esputo suelen ser muy abundantes y van a proceder de todas aquellas partes del ap.
Respiratorio que tengan epitelio escamoso estratificado. Son células de tipo superficial e
intermedio, de citoplasmas amplios con núcleos picnóticos o vesiculares. Su nº disminuye
en pacientes que hayan hecho gárgaras.

A veces presentan cambios reactivos o degenerativos por diversos motivos. Cualquier

esputo que solo tenga estas células no es valorable.

Células cilíndricas ciliadas

Son las que aparecen en el epitelio respiratorio y se encuentran a lo alrgo de todo el tracto
respiratorio. Son unas células muy características pero su presencia en el esputo no
implica que la muestra venga del tracto respiratorio bajo.

Morfológicamente son células con citoplasma alargado, homogéneo, que se descama de

forma individual o en grupos pequeños y que se aprecian unos 200 cilios que van anclados
a una estructura denominada placa terminal o de anclaje. La presencia de cilios o de esta
barra es uno de los criterios más claros de benignidad. El núcleo es redondeado con una
cromatina finamente granular y 1 o 2 nucleolos.

Las células ciliadas pueden irritarse debido a multitud de factores cuando; cuando se
produce este hacho se suele producir un agrandamiento nuclear y además los nucléolos
se hacen más visibles y la cromatina más rugosa. Los cilios suelen desaparecer pero se
conserva la barra de anclaje

Estos cambios no solo afectan a la morfología de las células, sino que también afectan a
su disposición dando lugar a una hiperplasia de células cilíndricas (aumento del nº de
células). Esta hiperplasia recibe el nombre de cuerpos de creola.

Cuerpo de creola: las células se disponen con una morfología en 3D o papilar y la

dificultad estriba en que se pueden confundir con adenocarcinomas. El diagnostico de
benignidad es encontrar barras de anclaje.

Hay otro fenómeno que se produce por degeneración celular debido a cambios irritativos:

Ciliocitoftoria: la célula ciliada se rompe y por un lado se pierde el tercio distal con los cilios
anclados y por otro lado el núcleo se fragmenta o se pierde. Esto se atribuye a
degeneración de origen viral.

Células caliciformes o de Globet

Tienen forma de cáliz, núcleo basal y citoplasma lleno de moco que le suelen conferir una
coloración basófila (azul) con Papanicolau. El núcleo suele estar como aplastado por el
moco.

Estas células con menos frecuentes que las ciliadas porque son mas lábiles, son de mayor
tamaño que las ciliadas.

En algunas enfermedades pueden estar aumentadas (EPOC). En respuesta a procesos de

tipo irritativo se puede producir un aumento tanto en tamaño como en producción. En la
mayoría de las muestras respiratorias (esputo) es frecuente encontrar una fina película de
moco producido por estas células aumentando en ciertas patologías de obstrucción
crónica.

Células de reserva o basales

Son células que se encuentran próximas a la mb. Basal y que originan el resto de las
células epiteliales; son pequeñas, no ciliadas y que difícilmente se ven en una citología,
 salvo que haya habido una exfoliación traumática o cualquier proceso que haya producido
una gran exfoliación del epitelio.

Si estas células aparecen las encontramos en grupos cohesivos de células pequeñas,

redondas y con núcleo basófilo.

Células cuboidales o alveolares

Son menos frecuentes que todas las anteriores y las encontramos en muestras de BAL.
Descaman sueltas o en grupos laxos. Son redondas u ovales con citoplasma basófilo y
tamaño variable bastante más grandes que los linfocitos (20 - 40 µ)

Se confunden con histiocitos por tamaño o linfocitos por aspecto.

Células metaplásicas

Metaplasia: cambio celular que consiste en el cambio del epitelio ciliado

pseudoestratificado por epitelio escamoso por causa de cualquier agente de tipo irritativo
que puede ser desde el tabaco hasta cualquier enfermedad que pueda producir irritación.

En la 1ª instancia esta irritación produce una reacción en las células basales, que en lugar
de diferenciarse o transformarse en ciliadas se convierten en escamosas.

Por tanto sus características citológicas son:

 Aparecen en grupos poco cohesivos y pequeños

 Adoptan una posición característica que recuerdan a mosaico.

 Recuerdan a células ciliadas con forma redondeada.

 Citoplasma basófilo aunque se puede ver cianófilo (rosa) con vacuolas, más denso y oscuro.

 Núcleo central con nucléolos

 Se pueden confundir con células escamosas contaminantes.

La metaplasia en ciertas ocasiones puede ser atípica, que es cuando en las células
metaplásicas aparecen ciertos rasgos que nos hacen sospechar malignidad: anisocariosis,
hipercromasia, Disqueratosis, cromatina más irregular, nucléolos más prominentes,
descaman más sueltas y son más redondeadas.

Es muy importante en este caso revisar la citología ya que pueden ser displásicas. Aunque
también pueden aparecer en otras patologías no tumorales como en neumonías.

Los carcinomas descaman en células metaplásicas sueltas.

 Células no epiteliales
Macrófagos alveolares

Proceden de los monocitos. Su presencia en el esputo no se asocia a ninguna lesión

específica, pero proporcionan la seguridad de que el material es correcto.

Su misión es la de fagocitar las partículas indeseables que pueden penetrar en el ap.

Respiratorio.

Citológicamente tienen estas características:

 10 - 100 µ

 Forma variable ( redondas o alargadas)

 Citoplasma de color cianófilo o basófilo pálido y espumoso.

 Núcleo excéntrico en forma arriñonada aunque frecuentemente lo veremos ovalados.

 Células multinucleadas y con nucléolos.

 A veces presentan diferentes aspectos o coloraciones como consecuencia de los elementos

que hayan fagocitado, así por ejemplo encontramos:
o SIDERÓFAGOS: en su interior tienen hemosiderina (puntitos rojos)

o HIPÓFAGOS: fagocitan grasa ( Sudán III)

o MACRÓFAGOS ANTRACÓTICOS: citoplasmas con zonas oscuras a causa del

polvo al fagocitarlo.

Células gigantes multinucleadas

Son células de naturaleza histiocitaria y son macrófagos enormes, redondeados y pueden

tener hasta 50 núcleos

Son frecuentes en algunas enfermedades como la tuberculosis

Células epitelioides

Son también una variedad de histiocitos gigantes con núcleos alargados, con citoplasma
pálido y bordes mal definidos.

Aparecen en enfermedades específicas como la tuberculosis.

Células inflamatorias

 PMN: aparecen de forma normal en la mayoría de las citologías y aumentadas en las

inflamaciones agudas.

 Linfocitos: no se encuentran de forma natural y su presencia cuando están aumentados

indica inflamación crónica.

 Eosinófilos: son típicos de algunas enfermedades como: alergias, asma, infecciones fúngicas
y parasitarias.

 Basófilos: apenas se observan

 Material no celular o material celular inanimado

Espirales de Curshmann

Material mucoso precipitado en la luz de los bronquios. En la citología se observan de una

manera muy específica:

 Aparecen como estructuras alargadas

 Se tiñen intensamente con H-E

 Está constituida por un eje central que hace zig-zag que está rodeado de una plumosa

Se producen en obstrucciones de tipo crónico que pueden ir desde bronquitis a carcinoma.

Cristales de Charcot - Leyden

Es una forma especial de cristalización del material de granulación de los eosinófilos.

Tienen una estructura romboidal, alargada de tamaño diverso y reacción tintorial
eosinófilas.
 Se producen en pacientes con alergia o asma.

Cuerpos amiláceos - corpora amilácea

Son condensaciones de glicoproteínas y que aparecen como unas estructuras

redondeadas con un tamaño de 5 -25 µ y que tienen una color rosa anaranjado.

Se producen en patologías como: infartos pulmonares, bronquitis,…

Cuerpos de Psamoma

Estructuras formadas por minerales, sobre todo calcio de color pardo-rojizo que van
haciendo circunferencias y que están relacionados con diversos procesos obstructivos
pero también con ciertos tipos de carcinoma.

Cristales de hematoidina

Es una sustancia resultante de la degradación de la hemoglobina y que se encuentra en

focos hemorrágicos. Aparece en la citología como en grades haces que termina con punta
en forma de aguja.

Bandas fibrilares

Estructura que aparece en esputos muy purulentos, ya que provienen de los PMN -
Neutrófilos y aparecen como bandas teñidas fuertes con hematoxilina

 Cuerpos extraños y contaminantes.

La contaminación en este tipo de citologías es de muy diversa índole ya que puede
proceder en primera instancia de la cavidad oral, de medio ambiente (polen, talco), del
medio industrial o restos diversos debidos al procesado.

Su origen puede ser animal, vegetal o mineral y son muy diversos en cuanto a forma,
color, tamaño,…

En líneas generales podemos resumirlos en:

Material alimentario
Es muy frecuente en pacientes que tengan escasa higiene oral, se presentan como
estructuras.

Cuerpos ferruginosos o de asbesto.

Son sustancias formadas por hierro que aparecen en la citología con aspecto como de
pesa de color amarillo - negruzco que están relacionadas con la exposición prolongada a
tóxicos industriales que contengan asbesto u oros minerales.

ARTEFACTOS Y CONTAMINANTES

Artefacto:

Cualquier alteración del frotis a causa del procesado y según el momento del procesado
las podemos clasificar en artefactos de:

 Extensión:

Puede ser demorada, en este caso las células aparecen desecadas y la tinción
defectuosa.

Y puede ser defectuosa, aparecen grumos,…

 Fijación

Excesiva: pueden aparecer manchas oscuras encima de las células

Insuficiente: aparecen pálidas, mal teñidas, no se tiñen o cogen poco colorante.

 Tinción

Débil: poco teñidas o mal teñidas.

Sobretinción: mal teñidas, demasiado teñidas

 Montaje

Polvo de oro incorrecta aplicación del bálsamo

Burbujas

Montar con dos cubreobjetos

Mirar la preparación al revés

Montar al revés

Contaminante

Partículas y organismos ajenos a la población celular dl frotis. Para identificarlos aparecen

fuera del foco y a distinto nivel.

Se clasifican en dos tipos:

 Intratintorial:

Precipitados de colorantes: se pueden evitar filtrando el colorante tantas veces como haga
falta.

 Extratintorial.

Son de naturaleza diversa y que en muchos casos son inevitables:

o Espermatozoides
o Fibras de algodón

o Pelos

o Algas

o Polen

o Cremas terapéuticas

o Lubricantes

o Polvos de talco

o Microorganismos que pueden contaminar la muestra

En el esputo las fibras alimentarias.

TEMA 14 HISTOQUÍMICA

1. HISTOQUIMICA DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

  INTRODUCCIÓN
La histoquímica es la aplicación de reacciones químicas y bioquímicas en la técnica
histológica, con el fin de localizar y determinar de manera científica ciertas sustancias o su
actividad.

En todas estas reacciones o bien se tiñe la sustancia que buscamos o los colorantes
reaccionan químicamente con ella, como es el caso del PAS.

Los hidratos de carbono o glúcidos son polialcoholes oxidados (polihidroxicetonas o

polialdehidos). Los polisacáridos son glúcidos formados por la unión de muchas moléculas
de monosacáridos (mas de 10). Entre los polisacáridos además de los polisacáridos
simples como el glucógeno destacan los polisacáridos complejos.

Los polisacáridos complejos se dividen en 3 grandes grupos:

 Mucopolisacaridos que pueden dividirse en :

 Mucopolisacaridos neutros

 Mucopolisacaridos ácidos

 Mucoproteínas

 Mucolípidos.

 REACCIONES HISTOQUÍMICAS BASADAS EN LA DEMOSTRACIÓN DE

GRUPOS CARBONILO FORMADOS SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO POR
OXIDACIÓN PREVIA.

TÉCNICA DEL PAS (Ácido Periódico Schiff)

Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico (HIO4) para incrementar el número de
grupos carbonilo (aldehído o cetona) presentes en ellos, de forma que puedan ser demostrados
posteriormente mediante reactivo de Schiff.

Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados, en una proporción
aproximada de uno por molécula de monosacárido. Precisamente por ello es necesario oxidarlos con
el fin de incrementar dichos grupos, que solo pueden ser detectados por el reactivo de Schiff si se
encuentran situados en carbonos contiguos y delimitados por grupos alcohólicos o amino.

Para los grupos aldehidos que aparecen en posición 1,2 glicol estas condiciones se cumplen
exclusivamente tras la oxidación de los correspondientes radicales hidroxilo.

 Procedimiento Técnico:

Fijación:
o Formol al 4 % o Líquido de Carnoy o Bouin.

o Ácido Periódico……………0.5 % p/v.

o Reactivo de Schiff:

 Fucsina básica (CI: 42510)………… 1g.

 Agua destilada……………………... 200 ml.

Disolver la fucsina en 200 ml de agua (d) hirviendo.

Dejar enfriar hasta aproximadamente 50º C. y filtrar

 Posteriormente agregar 20 ml de HCl 1N. Después enfriar hasta 25º C y añadir 1g de Bisulfito
sódico o Metabisulfito potásico (sódico).

Mantener en la oscuridad. El liquido tarda unos 2 días o a veces 24h en tornarse de color amarillo
que indica que está listo para su uso.

Añadir 2g de carbón activado, mezclar y filtrar hasta que desaparezca el color.

La solución debe conservarse en el refrigerado protegido de la luz.

o Baño de Ácido Sulfuroso o Agua sulfurosa:

o Ácido Clorhídrico (HCl) 1N…………… 5 ml.

o Metabisulfito sódico 10 %……………... 6 ml.

o Agua (d)………………………………... 100 ml.

o Colorante de contraste: Hematoxilina, Orange G o Van Gieson.

Técnica de Tinción:

 Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes)

 Ácido periódico 0.5 %…………………………………… 5 min.

 Lavar en agua (d).

 Reactivo de Schiff……………………………………….. 15- 30 min.

 Aclarar en 3 baños de agua sulfurosa…………………… 2 min. Cada uno.

 Lavar en agua corriente

 Colorante de contraste

 Lavar con agua corriente.

 Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados:

Material PAS +: rojo oscuro a magenta.

B. Compuestos PAS +

 polisacáridos simples: como el glucógeno y la celulosa.

 Mucopolisacaridos neutros: se encuentran en el epitelio gástrico, en glándulas del duodeno y

en cápsulas bacterianas, también en intestino y estómago.

 mucoproteínas como son algunas mucinas del tubo digestivo y del árbol respiratorio o
bronquial, también la tiroglobulina que está en el tiroides y la hormona estimulante.

 Glucoproteínas del suero

 Glucolípidos: como los gangliósidos y cerebros idos.

C. Compuestos PAS -

Los mucopolisacaridos ácidos no pueden ser oxidados por el ácido periódico y por eso son PAS - (ya
que no aparecen los grupos carbonilos)

D. Controles de la técnica del PAS.

 Es imprescindible realizar preparaciones testigo o de control que confirmen los resultados obtenidos,
para ello suelen ser muy útiles las técnicas de bloqueo tales como las de bloqueo de grupos aldehídos
en general y las de acetilación de grupos aldehídos situados en posición 1,2 glicol.

Técnica de bloqueo para aldehídos en general

Se realiza tratando los grupos aldehido presentes en el tejido, tras la oxidación con ácido periódico
con una solución de ácido acético saturado con Dimedona, entre 1-16 h. a 60 º C.

Posteriormente se lava con agua destilada y se continúa con PAS normal.

Únicamente se teñirá el material PAS + formado a expensas de grupos aldehídos situados en

posición 1,2 glicol (los que proceden de glúcidos).

Técnica de bloqueo mediante acetilación para grupos 1,2 glicol.

Se basa en la negatividad de la reacción del PAS después de la acetilación de los grupos 1,2 glicol
presentes en los hidratos de carbono.

Este proceso es total o parcialmente reversible por saponificación posterior mediante tratamiento con
hidróxido potásico. Si no se ha realizado el bloqueo de los aldehídos preexistentes debe realizarse un
control sin oxidar el tejido; todo lo coloreado en esta preparación no serán grupos 1,2 glicol
oxidados, sino grupos aldehídos que ya estaban presentes antes de la oxidación.

Después se realiza el PAS oxidando y se compara los resultados de ambas preparaciones.

El 2º problema en la técnica del PAS se plantea cuando se trata de diferenciar si los grupos aldehídos
aparecidos tras la oxidación lo han hecho sobre grupos alcohólicos situados en posición 1,2 glicol o
si los oxidados han sido grupos hidroxiaminos primarios o hidroxiaminos secundarios, compuestos
no presentes habitualmente en los hidratos de carbono que son PAS +.

Esta distinción pude realizarse mediante acetilación reversible y saponificación.

Acetilar consiste en introducir un grupo acetilo en un compuesto orgánico. El anhídrido acético es

un reactivo que tiene gran aplicación para acetilar, de forma que con este reactivo se bloquean todos
los grupos alcohólicos en general existentes en el tejido.

CH3 - C - O - C - CH3 + ROH CH3 - C - O - R

OOO

Este tipo de unión se llama éster.

Saponificar es romper un enlace tipo ester de forma que en condiciones idóneas reaparece el grupo
químico que existía antes de la acetilación.

La acetilación es totalmente reversible tras saponificación para los grupos alcohólicos en posición
1,2 glicol; totalmente irreversible para los grupos hidroxiaminos secundarios y moderadamente
reversible para los hidroxiamino primarios.

CH3 - C - O - R + KOH ------------ CH3 - COOK + R - OH

Procedimiento técnico de acetilación - saponificación

o Soluciones:

 Mezcla para la acetilación:

o Anhídrido acético………. 13 ml.
o Piridina anhidra………… 20 ml.

o mezcla para la saponificación

 Hidróxido potásico 1N en solución acuosa o en alcohol 80º C.

Modo de operar:

 Acetilación:

 Desparafinar e introducir los cortes en alcohol absoluto.

Secarlos y pasarlos a la piridina.

 Tratar con la mezcla de acetilación de 37º - 58º C durante

un tiempo que depende del material biológico y suele estar de 30 min. a 24 h.

 Pasamos los cortes a la piridina.

 Alcohol absoluto.

 Hidratar.

 Acetilación + saponificación:

 Se repite el proceso anterior.

 Tratar con la disolución de KOH durante

45 min.

 Enjuagar con agua.

 Lotes de preparaciones y resultados en los

controles de la técnica del PAS.

 Una preparación a la que se le hace el PAS normal.

 Otra preparación del mismo corte. Se le hace un PAS sin

oxidar para detectar grupos aldehídos ya existentes o bien se hace un método de bloqueo específico
para dichos grupos.

 Un lote de cortes que llevan acetilación.

 Un lote de cortes que llevan acetilación + saponificación.

Resultados:

 Al acetilar desaparecen todos los grupos

PAS+ menos los aldehídos ya existentes.

 Al acetilar y saponificar los grupos

alcohólicos en posición 1,2 glicol quedan como estaban, recuperan la PAS positividada.

 Los hidroxiamino primarios reaparecen

mucho más débilmente y los secundarios permanecen bloqueados al ser la acetilación irreversible.

1.3 TÉCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS.

Los mucopolisacaridos ácidos son unos polisacáridos que no tienen grupos alcohólicos en posición
1,2 glicol sino grupos ácidos carboxilos o sulfatados.

Las técnicas para determinar mucopolisacáridos ácidos son principalmente:

a) Azul Alcián
 b) Reacción Metacromática

 Técnica del Azul Alcián: se ha comprobado que usando

el azul alcián en condiciones de pH en torno a 2,4 -2,6 se colorean los mucopolisacáridos ácidos
sulfatados y los carboxílicos.

Si por el contrario se emplea a un pH muy bajo, en torno a 1, sólo se colorea los mucopolisacáridos
sulfatados, los carboxílicos no se tiñen.

Si se sigue disminuyendo el pH hasta 0,5 se incrementa la selectividad de la tinción y en este caso

sólo se tiñen los mucopolisacáridos fuertemente sulfatados.

Procedimiento Técnico:

 Fijación: formol al 4%.

 Soluciones:

 Azul alcián a pH 2,5:

 Azul alcián (C.I. 74240)

…………… 1 g.

 Ácido Acético 3%
………………….. 100 ml.

 Azul alcián a pH 1:

 Azul
alcián…………………………. 1 g.

 HCl 0,1 N
…………………………… 100 ml.

 Azul alcián a pH 0,5 :

 Azul alcián
…………………………. 1 g.

 HCl 0,5 N
………………………….. 100 ml.

Filtrar todas las soluciones antes de usar.

Las soluciones son estables durante 2 semanas aproximadamente, como colorante de contraste se
puede usar una solución de Rojo nuclear al 1 %.

Modo de operar:

 Desparafinar e hidratar.

 Tratar con la solución deseada de azul

alcián durante 30 min.

 Si se usó la solución a pH 2,5, lavar con

agua (d) ; si se usó cualquiera de los otros dos, secar sólo con papel de filtro.

 Contrastar si se desea con rojo nuclear.

 Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados:
  Azul alcián a pH 2,5 los
mucopolisacaridos ácidos
(carboxilos y sulfatos) se tiñen
de azul.

 Azul alcián a pH 1 sólo se tiñen

de azul los mucopolisacaridos
ácidos sulfatados.

 Azul alcián a pH 0,5 sólo se

tiñen de azul los
mucopolisacaridos ácidos
fuertemente sulfatados.

b) Reacción Metacromática:

La metacromasia indica un cambio de color cuando un colorante químicamente puro tiñe

selectivamente una estructura tisular de color “diferente”al de la solución diluida de colorante; se
dice que ha ocurrido una reacción metacromática.

La estructura responsable de este cambio se llama cromotropa.

Para distinguirla de las restantes que se tiñen normalmente (ortocromáticas)

Sustancias cromotropas son los mucopolisacaridos ácidos, ácidos nucleicos, lípidos de carácter ácido
y partículas de sílice.

La reacción metacromática presenta grandes variaciones ante las más pequeñas modificaciones del
medio donde reproduce, por lo tanto la reacción metacromática es de difícil interpretación e incluso
puede proporcionar resultados contradictorios.

AZUL DE TOLUIDINA (técnica de metacromasia que mas se hace)

 Fijación:

En el caso de los mucopolisacaridos ácidos pueden emplearse tejidos fijados con alcohol, Bouin
alcohólico e incluso formol pero deben evitarse los fijados con agentes oxidantes.

 Soluciones:

 Solución Tampón de ácido acético - acetato a pH

4,2:

 Acetato sódico……………. 2,7 g.

H2O (d)……………………. 100 ml.

 Ácido acético 0,5 M……….. 1,1 ml

H2O (d)……………………. 100 ml.

Solución A…………. 30 ml.

Solución B…………. 90 ml.

 Solución a 0,2 % de azul de toluidina en la

solución tamponada anterior.

 Solución acuosa al 4 % de molibdato amónico.

Procedimiento Técnico:
 Desparafinar e hidratar.

 Teñir con azul de

Toluidina…………………………. 2 - 5 min.

 Lavar en la solución tamponada.

 Tratar los cortes en la solución de

molibdato……….. 10 min.

 Lavar con agua (d).

 Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados:

Elementos de carácter metacromático se van a ver de rojo a púrpura y el resto se va a ver azul.

Los baños en alcohol etílico inhiben la metacromasia por lo que deben realizarse preparaciones
testigo.

Una 1ª preparación se observa tras su paso por el agua cética antes de fijar con molibdato. Esto tiene
por objeto evaluar el efecto metacromático inmediato en fase inestable. A continuación se sigue el
procesamiento normal.

Otra preparación no se deshidrata y se monta en un medio acuoso para evitar el paso por alcohol
etílico.

La última preparación se confecciona normalmente, es decir, deshidratando y montando por el

método habitual.

Comparando las 3 preparaciones se puede seguir la evolución del efecto metacromático y la

influencia del procesamiento histológico realizado sobre ellas.

También se deben realizar controles de especificidad en la reacción metacromática. Se usan para

distinguir entre mucopolisacaridos ácidos carboxílicos y sulfatados.

Son principalmente de 2 tipos:

 Variación de pH: consiste en realizar la tinción

entorno a un pH de3, 5. en este caso la mayoría de los mucopolisacaridos ácidos carboxílicos pierden
su metacromasia mientras que los sulfatados la conservan.

Haremos 2 lotes: el 1º se tiñen a pH 4,5 y el 2º a 3,5.

Los mucopolisacaridos ácidos que siguen siendo metacromáticos en el 2º lote corresponden a

mucopolisacaridos ácidos sulfatados ya que los carboxílicos pierden su metacromasia.

 Metilación reversible: consiste en tratar un

grupo de cortes con una mezcla de alcohol metílico y ácido clorhídrico, con lo que se bloquean por
metilación los grupos ácidos de los mucopolisacaridos ácidos.

Después se realiza mutilación seguida de saponificación, reapareciendo la metacromasia solamente

en los mucopolisacaridos ácidos carboxílicos.

1.4 TÉCNICA PARA DIFERENCIAR MUCOPOLISACÁRIDOS ÁCIDOS, NEUTROS Y

GLICOPROTEÍNAS. TÉCNICA DEL AZUL ALCIAN - PAS.

Procedimiento Técnico:

 Fijación: formol al 4 %.
 Soluciones:

 Solución azul alcián a pH 2,5.

 Solución ácido periódico el 0,5 %.

 Reactivo de Schiff.

 Solución de ácido sulfuroso.

 Colorante de contraste.

Técnica:

 Desparafinar e hidratar.

 Solución azul alcián a pH

2,5……………………… 30 min.

 Lavar con agua (d)

 Ácido
periódico……………………………………. 10 min.

 Lavar con agua (d).

 Reactivo de Schiff
………………………………… 15 - 30 min.

 Aclarar con 3 baños de agua

sulfurosa…………….. 2 min. Cada uno.

 Lavar con agua corriente

…………………………... 5 min.

 Colorante de contraste (Hematoxilina

Harris normalmente).

 Lavar, clorar y montar.

Resultados:

Mucopolisacaridos ácidos: azul

Mucopolisacaridos neutros y glicoproteínas: rojo o rosa.

Resto: violeta (si se usa hematoxilina).

2. HISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS Y ACIDOS NUCLEICOS.

 METODOS HISTOQUÍMICOS PARA LA

COLORACION DE PROTEÍNAS.

Desde la introducción de los métodos inmunohistoquímicos que permiten caracterizar

antigénicamente a la mayor parte de las proteínas, todos los métodos de coloración puramente
histoquímicas para proteínas han perdido vigencia.

De forma genérica las técnicas histoquímicas para colorear proteínas pueden clasificarse en 3
grupos:

 Reacciones generales: pretenden colorear

globalmente a las proteínas presentes en un tejido.
 Reacciones de grupo: pretenden caracterizar, no
la molécula proteica globalmente sino un corto numero de grupos reactivos específicos de dichas
sustancias.

 Reacciones específicas: para grupos químicos

particulares propios de de determinados aminoácidos, como por ejemplo el grupo fenol.

 Reacciones de grupo. Reacción de Ninhidrina

- Schiff.

Se trata de establecer la naturaleza proteica de una determinada sustancia a partir de la demostración

en ellas de ciertos grupos químicos que se encuentran de forma exclusiva en los polipéptidos.

La reacción de la Ninhidrina - Schiff se basa en un proceso de desaminación oxidativa de las

cadenas polipeptídicas, provocado por la ninhidrina por el cual los grupos amino son sustituidos por
grupos carbonilo.

Tras el proceso se realiza la determinación de los carbonilos neoformados mediante reactivo de

Schiff (igual que la técnica del PAS).

TÉCNICA DE LA NINHIDRINA - SCHIFF

 Fijación: alcohol o acetona.

Formol tamponado y líquido de Zenker, también se puede utilizar pero en estos casos el tiempo de
incubación con la ninhidrina debe ser superior a 20 horas. Se pueden utilizar secciones en
congelación o en parafina.

 Soluciones:

 Solución de ninhidrina:

 Ninhidrina…………………..
0.5 g.

 Etanol absoluto……...............
100 ml.

 Solución de reactivo de Schiff.

 Procedimiento:

 Desparafinar e hidratar.

 Tratar los cortes con alcohol etílico al 70

%.

 Incubar a 37 º C con la solución de

ninhidrina entre 6 - 24 horas,
(habitualmente toda la noche).

 Lavar bien las secciones en agua

corriente.

 Teñir con reactivo de

Schiff…………….. 30 - 45 min.

 Contrastar con hematoxilina de Harris.

 Posteriormente lavar con agua

corriente………… 10 min.
  Deshidratar, aclarar y montar.

 Resultados:

 Grupos amino (NH2): rojo - rosa

púrpura.

 Controles:

La ninhidrina solo oxida los grupos amino cuando están próximos a un radical metilo o a un radical
ácido.

Además es posible la aparición de falsos positivos en casos de preexistencia de grupos aldehídos en

el tejido (R - C = O), por ello debe incluirse siempre un lote de preparaciones sin tratamiento con la
ninhidrina, es decir, que se traten sólo con el reactivo de Schiff.

 METODOS HISTOQUÍMICOS
PARA LA DETERMINACION DE
ACIDOS NUCLEICOS.

Los ácidos nucleicos están compuestos por largas cadenas de unidades llamadas nucleótidos,
enlazadas por uniones covalentes.

En general los nucleótidos están formadas por:

 Ácido fosfórico, implicado en el

mecanismo fisico-quimico de coloración por el cual se tiñen intensamente con colorante básicos
como le hematoxilina.

 Una pentosa (5 carbonos), que puede

ser ribosa (ARN) o desoxiribosa (ADN).

 Bases nitrogenadas ( ADN : A,C,T,G),

( ARN: A,C,G,U)

En condiciones normales los ácidos nucleicos se conjugan con proteínas básicas para formar
nucleoproteínas, por ello la realización de una hidrólisis ácida permite separar el componente
proteico y así poder demostrar la presencia de ácidos nucleicos (los ácidos nucleicos se enrollan
sobre las proteínas y la hidrólisis es para eliminar las proteínas).

 Técnicas que permiten separar el ADN de

otras estructuras. Reacción de Feulgen.

Estas técnicas se utilizan para visualizar el núcleo, el proceso de tinción se realiza en 2 fases:

1ª Fase. Una hidrólisis ácida del ADN: con esto se pretende mediante la actuación del ácido
clorhídrico romper la estructura del ADN por el lugar en que la pentosa se une a la base nitrogenada,
de forma que sobre cada molécula de azúcar (pentosa) reaparece un grupo carbonilo. Estos grupos se
encuentran situados a una distancia entre 1 - 1.1 nm.

2ª Fase. Demostración de los grupos carbonilos: mediante reactivo de Schiff (color rosa ADN
sólo). El ARN no puede ser detectado por el reactivo de Schiff tras la realización de la hidrólisis
ácida, puesto que la distancia entre grupos carbonilo es menor de 1 nm, y por tanto no se produce la
reacción con el reactivo de Schiff.

 Problemas generales de esta técnica:

 Hidrólisis excesiva: el ácido clorhídrico es un

ácido fuerte, si se prolonga excesivamente el tiempo de hidrólisis se puede disgregar la molécula de
 ADN en su totalidad, impidiendo así su posterior detección. Por ello el aspecto más importante de la
técnica es el tiempo de hidrólisis, que varia mucho según el fijador utilizado.

 Envejecimiento del reactivo de Schiff: en

condiciones normales es incoloro, la aparición de una tonalidad rosada indica envejecimiento y por
tanto debe desecharse, puesto que el envejecimiento lo hace inservible para detectar los grupos
carbonilos.

 METODOS PARA LA IDENTIFICACION Y

TINCION DE PIGMENTOS E IONES METÁLICOS.

 MÉTODOS PARA DETECTAR IONES

TÉCNICOS. TÉCNICAS DEL AZUL DE PERLS.

En el interior de los tejidos el hierro se puede depositar de 2 formas:

 En forma iónica, o formando sales ferrosas y

ferricas, por lo general en forma de cloruros o hidróxidos.

 Como hierro ligado a proteínas.

La técnica del azul de Perls es la de mayor importancia para detectar hierro, ya que el hierro ferrico
es el más frecuente en los tejidos. El fundamento de esta técnica se basa en la propiedad que tiene el
ferrocianuro potasico, para transformarse en presencia de hierro férrico en ferrocianuro ferrico, o
azul de Prusia por acción del ácido clorhídrico que actúa como desencadenante de la reacción.

CL3Fe

Ferrocianuro potásico + HCL Ferrocianuro férrico.

TÉCNICA.

 Fijación: cualquier fijador es válido. Se

pueden utilizar secciones en parafina o improntas.

 Soluciones:

 Ferrocianuro K al 10 % (conservar en nevera).

 Ácido clorhídrico :

- Ácido clorhídrico concentrado……………. 2 ml.

- Agua destilada…………………………...... 98 ml.

 Solución de ferrocianuro K, ácido clorhídrico:

mezclando a partes iguales la solución 1 y 2. esto se debe preparar inmediatamente antes de su uso.

 Procedimiento Técnico:

 Desparafinar e hidratar.

 Tratar con la mezcla de ferrocianuro K, ácido

clorhídrico………… 10 min.

 Lavar con agua destilada (el Fe se ve azul).

 Se puede contrastar con una solución rojo nuclear

al 1 %……….. 2 - 3 min.

 Deshidratar, aclarar y montar.

 Resultados:

- Hierro férrico: azul.

- Núcleos: rojo.

 Observaciones:

El tiempo de tinción depende de la cantidad de hierro existente en los tejidos.

Siempre deben utilizarse preparaciones positivas de control. Si al echar la disolución 3 en la porta

toma color verde debemos desecharla, enjuagar y poner reactivo nuevo.

 METODOS PARA LA DETERMINACIÓN

DE CALCIO. TECNICA DE VON KOSSA.

Las sales de calcio están presentes normalmente en los huesos, dientes y sangre aunque en ocasiones
también aparecen áreas de calcificación en tejidos desprovistos de ellas.

En general las sales que con mayor frecuencia se depositan son carbonatos, oxalatos y fosfatos.

TÉCNICA

 Fijación: formol al 4 %
preferiblemente y utilizar secciones en parafina.

 Soluciones:

 Solución acuosa de nitrato de

plata al 1 %.

 Solución de tiosulfato sódico al

2,5 %.

 Rojo neutro al 1 %.

 Procedimiento técnico:

 Desparafinar e hidratar.

 Tratar con la solución de nitrato de plata a plena luz………….. 30 - 60 min.

 Lavar con agua destilada.

 Lavar en la solución de tiosulfato…………….. 5 min.

 Volvemos a lavar con agua destilada.

 Contrastar con el rojo neutro…………………. 2 - 3 min.

 Deshidratar, aclarar y montar.

 Resultados:

- Iones calcio o calcificación: negro.

- Núcleos: rojo.

 METODOS PARA LA DETERMINACION DE COBRE. TÉCNICA ÁCIDO

RUBEÁNICO.

Este metal se encuentra presente de forma casi exclusiva en el hígado y otros órganos de pacientes
con enfermedad de Wilson.
 En ocasiones se encuentra presente en algunas cirrosis hepáticas aunque en muy pequeña
proporción.

TÉCNICA

 Fijación: cualquier fijador es válido. Se deben utilizar secciones en

parafina o en congelación.

 Soluciones:

 Solución madre de ácido rubeánico al 0,1 %.

 Solución de acetato sódico al 10 %.

 Solución de trabajo:

- De la solución 1: por cada 2.5 ml se echan de la solución 2, 50 ml

 Procedimiento Técnico:

 Desparafinar e hidratar.

 Tratar con solución de trabajo a 37º durante toda la noche

en un recipiente tapado herméticamente.

 tratar los cortes con alcohol etílico al 70 %……………

15 min.

 Alcohol etílico absoluto……………….. 6 horas.

 Aclarar con xileno y montar.

 Resultados:

- Depósitos de Cobre: con granulaciones de verde a negras.

TEMA 15 TÉCNICAS CITOLOGICAS.

1. INTRODUCCION.

La citología, permite examinar grupos celulares de diferentes partes del organismo,

convirtiéndola enana herramienta diagnóstica muy importante para el clínico.

La colección de muestras citológicas es muy sencilla, económica y segura para el

paciente.

En general existen 2 grandes métodos de preparación de muestras dependiendo de la

cantidad de líquido que presenten, de esta manera tenemos:

 Método directo: se emplea cuando la muestra es rica en células, es decir, presenta muy
poca cantidad de líquido por lo que el material colectado se coloca directamente sobre un
portaobjetos para realizar el frotis, como ejemplos tenemos la punción aspiración con aguja fina, los
raspados e improntas.

 Método indirecto: en caso de que las muestras obtenidas sean líquidas y para realizar el
frotis habrá que concentrar la población celular mediante centrifugación, ejemplos son la orina y
líquidos procedentes de lavado.

Los estudios citológicos pueden agruparse en 4 grandes categorías:

 Investigación de las células atípicas en las secreciones líquidas o derrames varios.
 Investigación de células atípicas después de un escobillonado o raspado con instrumentos
diversos de una mucosa o una lesión de piel.

 Citodiagnóstico después de una cito punción, es decir, después de una punción hecha con aguja
fina para recoger líquido tisular recogiendo células en suspensión y no un fragmento del tejido.

 Citodiagnóstico de pieza operatoria no fijada por la técnica de los frotis o del as impresiones.
Los 2 primeros grupos forman parte de la citología de detección precoz o exfoliativa
basada en la investigación de células anormales, a veces poco numerosas y muy
alteradas que requieren del citólogo paciencia, atención y gran experiencia.

Los grupos 3 y 4 permiten en cambio el estudio de verdaderas poblaciones de células, con

frecuencia numerosas y no alteradas, en las que se pueden observar las modificaciones
morfológicas más o menos marcadas, al densidad, la cohesión, la diferenciación y la
reacción celular del estroma avocando en numerosos casos a un verdadero
citodiagnóstico inmediato y al establecimiento de un índice citológico de malignidad que
puede intervenir en el pronóstico y las indicaciones terapéuticas de los tumores.

2. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA EL ESTUDIO CITOLOGICO.

2. a. Tipos de muestras según su procedencia.

 Muestras procedentes de líquidos fisiológicos como por ejemplo sangre, orina líquido
cefalorraquídeo, liquido pleural, liquido prostático, contenido gástrico…

 Muestras procedentes de líquidos y fluidos patológicos, liquido de derrames, pleural, peritoneal,

contenido de un quiste, expectoración bronquial, liquido procedente del lavado de esófago,
estómago, colon…. Y las procedentes de cito punciones como por ejemplo la punción de médula
ósea, la punción hepática

 Muestra procedentes de frotis legrados como por ejemplo el frotis vaginal y el cepillado
bronquial.

 Piezas operatorias.
2. b. Preparación general de la muestra.

La totalidad de las muestras que recibe el laboratorio de citología se puede separar en 3

grandes grupos:

 Frotis fijados: lo constituyen aquellos frotis que han sido extendidos y fijados por el clínico
inmediatamente después de la obtención de la muestra. Deben llegar al laboratorio adecuadamente
identificadas con el nombre del paciente y uniformemente extendidos, normalmente se fijan con cito
spray, estos portas que ya llegan al laboratorio fijados están listos para proceder a la tinción rutinaria
que se suele realizar al de papanicolau, ejemplos son las secreciones de mama, las muestras
procedentes de cepillados y otros tipos de muestras citológicas.

 Frotis secados al aire: son frotis extendidos por el clínico inmediatamente después de la
obtención de la muestra y secados al aire, estos frotis no fijados van destinados a ser teñidos con la
tinción de Romanowsky.

 Muestras no fijadas ni secadas al aire: este tercer grupo incluye las muestras frescas que llegan a
laboratorio generalmente en forma de fluido líquido o semisólido, requiere mayor dedicación y
habilidad.

El procesamiento de estas muestras puede ser por:

o Extensión directa: es la técnica más rudimentaria especialmente útil para muestras
mucosas (esputo, líquido de aspecto mucoso, aspirado bronquial…). Los pasos a seguir son:

 Identificar dos o más portas con el nombre o número de orden del enfermo.
 Observar la muestra y anotar su aspecto microscópico.
 Se seleccionan aquellas partes de la muestra que son representativas de la misma y ó las de
apariencia patológica.

 Se deben colocar las partes seleccionadas sobre un porta y extenderlas con otro hasta conseguir
frotis uniformes, también se pude hacer con el asa de platino previamente esterilizada.

 Los portas preparados pueden introducirse en la solución fijadora (caso de la tensión de

Papanicolau) o se deja secar al aire (si se van a teñir con Romanowsky).
o Otra forma es mediante centrifugación: es una técnica útil para muestras
seromucosas y grandes volúmenes de líquidos serosos (liquido quístico y procedentes de lavados).

El método consiste en:

 Anotar el aspecto mucoso de la muestra.

 Agitar la muestra para después resuspender las células que contiene y verter igual cantidad en
dos tubos de centrifuga.

 Se centrifuga a una velocidad aproximada de 2000rpm, durante 5 minutos, una vez centrifugado
se decanta el sobrenadante, mezclar el sedimento con unas gotas de sobrenadante para resuspender
las células y depositar con una pipeta pasteaur una gota de este sedimento sobre un porta
previamente identificado.

 Realizar una extensión directa con esta parte de la muestra o citocentrifugarla.

 Fijar rápidamente con la solución fijadora.
o Citocentrifugación: esta técnica se hace con una centrifuga llamada citospyn.
Pequeñas alícuotas (cantidades iguales) de muestra líquida se hacen girar lateralmente sobre un porta
para formar una monocapa de células. Es una técnica de gran utilidad y rapidez para la preparación
de muestras líquidas.
o Filtros de membrana: constituyen una técnica de concentración de células en
muestras líquidas de baja densidad celular (orina) ya que rescatan mayor número de células que la
citocentrifugación. Estos filtros son membranas porosas de plástico cuyos poros van de 10 - 8
micras. Los más utilizados son:

 Tipo millipore (de acetato de celulosa).

 Filtros nucleopore (de policarbonato).

Se realiza una filtración con la muestra y posteriormente se examina el filtro.

En citología se usan sobre todo los filtros SM, cuyos poros van de 1 - 2 a 5 micras, cada
cm2 de superficie contiene millones de poros capilares que ocupan más del 80 % del
volumen total. Este filtrado no necesita ningún fraccionamiento del líquido y no hay que
extraer el sedimento y colocarlo sobre el pota objetos; ello permite una estimación
cuantitativa de las células cancerosas en un volumen de líquido dado pero en cambio
pueden haber superposiciones celulares molestas y la membrana filtrante experimentar
una desecación rápida.
El líquido se filtra a la presión atmosférica o a una presión negativa de 25 mm de mercurio,
una presión negativa más fuerte no es aconsejable ya que podría deformar las células.

La fijación debe hacerse únicamente con alcohol etílico de 95º pues el alcohol absoluto, el
éter o la acetona provocarían la disolución del filtro.

El filtro con la muestra sujeto con una pinza se coloca sobre un portaobjetos y se tiñe.

2. c Ejemplos de preparación de algunas muestras.

ORINA

 Recoger aproximadamente 100 ml de orina en un recipiente estéril. Algunos prefieren la 1ª orina

de la mañana pero otros aconsejan hacer practicar ejercicios al enfermo especialmente en caso de
tumor vesical ya que la agitación de la orina contra la pared provoca una descamación importante.

Si se sospecha de un tumor de uréter, pelvis renal o riñón es preferible recoger la orina por
cateterismo uretral.

 Centrifugar unos 10 ml a 1500 rpm durante 5 minutos, seguidamente se realiza un primer

examen del sedimento con el fin de apreciar la cantidad de cristales, si hay muchos se eliminará
ajustando el pH; si hay muchos hematíes hay que hemolizarlos con acético al 5%.

 Rechazar el liquido sobrante y se aspira el sedimento con una pipeta pasteur, si el sedimento es
escaso hay que usar una técnica de concentración como la citocentrifugación.

 Extender el sedimento sobre un porta preferiblemente albuminado.

 Fijar inmediatamente durante 15 segundos.
 Proceder a la técnica de tinción.
SANGRE

Todos los métodos se basan en la eliminación de los hematíes por hemólisis, por
sedimentación acelerada o por centrifugación fraccionada.

Se práctica mucho al técnica de Seal, que se basa en la diferente densidad de las células
cancerígenas y los linfocitos por una parte y los eritrocitos y PMN por otra.
Se usa como medio de separación una mezcla de diferentes siliconas de densidad 1, 075
las células cancerosas y linfocitos se acumulan en la superficie de la silicona y los PMN y
eritrocitos se acumulan por debajo de la silicona.

SECRECIONES PROSTÁTICAS.

Se obtienen por masaje de la próstata en el polo inferior ya que esta región es

frecuentemente el lugar de predilección del desarrollo del cáncer.

Hay que hacer ligera presión con el dedo en el polo inferior y abstenerse de apretar las
vesículas seminales a fin de evitar la descamación de de células de este origen.
Terminado el masaje se hará presión sobre la uretra hasta el orificio del meato uretral para
conducir las secreciones.

Una vez recogidas se depositan sobre los portas previamente impregnados de albúmina
de Mayer para asegurar la adhesión de las células. Cada gota es comprimida entre 2
portas que son separados por deslizamiento y fijados inmediatamente.

DERRAMES PLEIRALES ASCÍTICOS O PERICÁRDICOS.

 Deben recogerse en frascos que contengan anticongelante, se centrifuga la muestra a
2000 rpm durante 10 minutos y se extiende el sedimento sobre dos portas, los cuales
serán teñidos uno con la técnica de Papanicolau y otro con la técnica de May Crundwald
Giemnsa.

LIQUIDO CEFALORRAQUÍDEO.

Es centrifugado y el sedimento es extendido y teñido.

 FIJACIÓN.
Su principal objetivo es conservar el detalle morfológico de la células ene l estado lo más
parecido posible a la célula en el tejido vivo. Esto se consigue con fijadores que
deshidratan las células, inactivan los enzimas autolíticos, coagulan las proteínas y
penetran en la membrana celular.

Es un paso indispensable si no queremos una extensión deteriorada u oxidada que no

tome bien los colorantes y que no permita una correcta lectura cuando se estudia al
microscopio.

La fijación debe realizarse de inmediato a la toma y la extensión del material citológico

cuando la preparación esté todavía húmeda.

No existe el fijador perfecto, todos causan contracción celular y cada uno actúa con una
velocidad diferente.

 Tipos de Fijadores.
 Fijadores alcohólicos: son la mayoría de los fijadores usados en citología, actúan deshidratando
las células y coagulando las proteínas, su mayor ventaja es que son fijadores rápidos y su
desventaja es que son volátiles e inflamables.

Los más usados son:

o Etanol 96 %: es el fijador de elección cuando la tinción posterior es la de
Papanicolau. Produce resultados muy satisfactorios.

La extensión se pone en un baño de etanol al 96 % durante 15 - 20 minutos aunque puede

conservarse indefinidamente siempre que el baño este tapado en el frigorífico.

Se le puede añadir ácido acético al 2´5 % con lo que se lisan los hematíes, por ello en las
preparaciones en que se sospecha existencia e suna buena solución para evitar la
dificultad que representaría una existencia masiva de hematíes recubriendo a los
elementos celulares motivo de estudio. Esta mezcla no debe realizarse en casos en que se
desee realizar una valoración citológica hormonal ya que se produce una falsa eosinofília
que puede llevar a confusión al realizar el recuento para el índice de eosinofília.
o Metanol al 100 %.

o Propanol e isopropanol al 90 %.

o Mezcla de alcohol - éter a partes iguales: da unos excelentes resultados sobre todo
tipo de materiales pero en la actualidad está en desuso por las peligrosas características físico -
químicas del éter que es muy inflamable y volátil.

 Líquido de Carnoy: formado por etílico puro, cloroformo y ácido acético.

 Citospray: es un fijador en forma de aerosol. Es un producto comercial que contiene una mezcla
de alcohol isopropílico y una materia plástica, el polietilglicol, protectora de la desecación.
 Con este spray se pulveriza toda la superficie del porta de forma rápida y sencilla, se debe
aplicar a 25 - 30 cm. de distancia de la muestra. Se aplica al material citológico
inmediatamente después de su extensión en el porta.

Es muy usado por su simplicidad y buenos resultados, se recomienda sobre todo cuando
las extensiones deben ser enviadas a otros laboratorios para su tinción (extensiones
ginecológicas, cepillados orofaringeos, esofágicos, bronquiales...). Por el contrario debe
evitarse su uso en extendidos de materiales líquidos realizados en el propio laboratorio y
en los hemáticos para no provocar agrupamientos de los hematíes.

Antes de teñir debe extraerse el citospray mediante pases sucesivos de 5 - 10 minutos

cada uno por etanol al 96 %.

Alternativamente y dado que el líquido del aerosol es soluble en agua, al extensión puede
ser teñida inmediatamente después de rociarla, con lo que se acorta el tiempo total del
proceso.

El secado al aire sin fijar se emplea cuando se van a realizar ciertas tinciones como por
ejemplo la de May Crundwald Giemnsa, con esta tinción no se ve bien la cromatina nuclear
y se usa en citologías hematológicas.

 ASPECTOS BÁSICOS SOBRE LA INTERPRETACIÓN DE EXTENSIONES EN

CITOLOGÍA.

Para la adecuada interpretación se requiere:

 Puesta a punto del microscopio.

 Detenida lectura de los datos aportados en la hoja de petición.

 Identificar el origen de la muestra cuando esta no esté consignada.

 Examinar el porta detenidamente y en toda su extensión.

 Señalar los hallazgos de interés: aspecto general del extendido, incluyendo la sustancia de
fondo y la disposición de las células (aisladas, agrupadas…), el tamaño y forma celular, al
coloración adquirida por la célula, estructuras, cantidad y relación núcleo - citoplasma y
características del núcleo (número, forma, tamaño, membrana, situación y relación con el nucleolo).

 TÉCNICAS DE COLORACIÓN.
Los principales objetivos de la tinción citológica son:

 Visualización óptima de las células.

 Diferenciación de los constituyentes celulares.

 Destacar lo más posible la estructura nuclear y suavemente el citoplasma, solo para indicar
si es eosinófilo o basófilo.

Para ello se emplean distintos colorantes, si bien, los fundamentales son la Hematoxilina
que tiñe bien los núcleos y Eosina para teñir citoplasmas. Pero hay muchos más
colorantes como el Orange G, verde luz, Fucsina…

Un colorante debe colorear las células, no decolorarse son los disolventes habitualmente
empleados y decolorarse minimamente tras largo tiempo de almacenamiento.

En citología es muy importante la calidad de la tinción del núcleo ya que la distinción entre
células benignas y malignas se basa en la morfología nuclear.
La tinción del citoplasma proporciona información adicional respecto al origen y
maduración de la célula.

Hay muchos métodos de tinción, el más recomendable y usado en citología exfoliativa es

el de Papanicolau.

 Tipos de tinciones.
 Tinción de Papanicolau: está particularmente indicada para el estudio de la queratinización de
las células memalpighianas patológicas. Fue introducida por Papanicolau en 1925, es una tinción
diferencial o policroma.

Usa tres colorantes básicos (o mezclas), el colorante nuclear en la hematoxilina de Harris

que produce una impregnación excelente de la estructura cromatinica y también usa
mezclas de color citoplasmático como el naranja G, verde luz, pardo Brismark, eosina…

La hematoxilina de Harris se usa sin acidificar con ácido acético y proporciona un color
azul oscuro a los núcleos.

El naranja G junto con la solución eosina alcohólica (EA) constituye el colorante del
citoplasma. Aunque la solución puede realizarse en el laboratorio se encuentra
comercializada bajo el nombre de OG - G, tiñe de naranja los citoplasmas celulares que
contienen queratina como por ejemplo las células del carcinoma epidermoide.

Las soluciones EA además de este colorante contiene verde luz y pardo Bismark.

Comercialmente se encuentran ya diluidos constituyendo las mezclas EA - 36, EA - SO y

EA - &%, que si bien proporciona buenos resultados para cualquier muestra, en
determinadas situaciones es recomendable el uso de alguna fórmula en particular. Este es
el caso de algunas muestras ginecológicas con frecuencia gruesas donde es preferible
emplear EA - 65 ya que al tener verde luz no colorea tan intensamente el fondo de la
preparación, además el empleo de esta mezcla facilita la distinción entre adenocarcinoma
de cerviz (citoplasma rosáceo) y adenocarcinoma endometrial (citoplasma azulado).

Procedimiento técnico en una fotocopia.

Un método alternativo mas adecuado para teñir extensiones urinarias y de lavados

gástricos consiste en el empleo de agua destilada durante 10 inmersiones sucesivas
rápidas y como colorante nuclear durante 45 segundos de Hematoxilina de Harris
acidificada con acético y la omisión del lavado en solución clorhídrica.

Este procedimiento tiene la ventaja de que requiere menos tiempo y la desventaja de que
la hematoxilina impregna algo mas estructuras basófilas no nucleares haciendo los
citoplasmas menos transparentes.

 Tinción de Shorr:
Es una técnica de coloración de excelentes resultados en la evaluación hormonal de la
citología vaginal. Permite distinguir con gran facilidad las células queratinizadas (color
naranja brillante) de las no queratinizadas (intermedias y parabasales que se tiñen de color
azul verdoso).

Los núcleos se tiñen de azul nunca tan claramente como la técnica de Papanicolau.

Otros componentes de la muestra como leucocitos hematíes, bacterias,

espermatozoides… se distinguen satisfactoriamente.

También puede utilizarse para detectar cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos que se

tiñen de color rojo vivo.
  Tinción de May - Grundwald Giemsa
Esta coloración también denominada Pappenheim se realiza sobre material secado al aire
en preparaciones de citología por punción aspiración.

Consiste en una combinación de dos coloraciones sucesivas, la de May - Grundwald y la

de Giemsa que emplea diversas variantes de eosinato de azur o de metileno para producir
una coloración policroma más brillante que la obtenida con cada uno.

Además presenta algunas ventajas sobre los métodos clásicos de Papanicolau y

hematoxilina - eosina para la percepción de los finos detalles citológicos sobre el
diagnóstico de malignidad.

Esta tinción resalta detalles del citoplasma como la presencia de vacuolas, gránulos o
mucina y los distintos componentes del fondo como la matriz mixoide, el colágeno, la
mucina o el coloide.

 Coloraciones extemporáneas:
Son coloraciones rápidas, el empleo de la citología para el diagnóstico peri operatorio
necesita coloraciones rápidas, ejemplos:
o Coloración de Azul de Unna: en 15 segundos proporciona una coloración legible.
Es monocroma pero muestra suficientemente la morfología celular: la anisonucleosis, las
alteraciones nucleares para permitir un diagnóstico exacto.
o Coloración de Giemsa: utiliza la secuencia siguiente: alcohol metílico puro de 1 - 2
minutos y seguidamente colorante Giemsa 2 minutos.
o Coloraciones vitales con rojo neutro al 1 / 1000 - 1/ 500.

o coloración vital con Azul de metileno al 1 %.

 Coloraciones especiales: Tinción con anaranjado de acridina.

Las técnicas histoquímicas pueden ser aplicadas a la citología para investigación del
glucógeno por el carmín de Best o el yodo, la coloración de mucopolisacáridos, las
fosfatasas, las grasas, los ácidos desoxiribonucleicos y los ribonucleicos; aquí veremos la
coloración que utiliza el anaranjado de acridina y la microscopia de fluorescencia.

Técnica de coloración con el anaranjado de acridina en fluorescencia:

Se basa en la fluorescencia roja que da el citoplasma de las células cancerosas a causa

de su riqueza en ADN.

Puede practicarse sobre material fresco y fijado.

Procedimiento Técnico:

Se separa una solución madre de anaranjado de acridina al 0´1 % en agua destilada. Esta
solución se conserva indefinidamente; para la coloración se diluye una parte de dicha
solución en un tampón de fosfato 1/15 molar (M).

Es necesario producir una diferenciación de la fluorescencia del ARN, esto se realiza con
una disolución acuosa de cloruro de Ca.

La fijación se debe realizar inmediatamente después de la extensión durante 5 - 10

minutos en alcohol o mezcla de alcohol - éter, debe evitarse la fijación con formol.

La secuencia de la tinción consiste en:

 Hidratación del frotis con pases de alcohol.
 Aplicación del colorante de anaranjado de acridina.
 Lavado con solución de tampón fosfato.
 diferenciación de los núcleos con la solución de cloruro cálcico hasta que los núcleos de los
diversos tipos aparezcan de una coloración verde clara transparente.

 Las preparaciones son lavadas nuevamente con tampón fosfato y montadas en húmedo bajo un
cubre.

 Observar al microscopio de fluorescencia.

RESULTADOS:

Las células aparecen destacadas con formas claras y brillantes sobre un fondo oscuro.

Las tonalidades son distintas según la estructura celular, pasando desde verde por el
amarillo, naranja y hasta el rojo dependiendo del contenido en ADN y ARN.

En general se puede decir que la coloración roja es indicadora de células atípicas

malignas, en extensiones de células superficiales que sonverdosas o intermedias que son
amarillas o verdes.

Después del examen las preparaciones pueden ser decoloradas pasándolas durante unos
minutos por alcohol de 50º y recoloreadas pasándolas por cualquier otro método como
Papanicolau.

Después de la coloración pueden también conservarse indefinidamente en el fijador para

recolorearlas más tarde.

TEMA 16

MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS

1.- INTRODUCCIÓN

2.- LAS BACTERIAS

3.- MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE BACTERIAS

4.- TINCIÓN DE OTROS MICROORGANISMOS

1.- INTRODUCCIÓN

 CONCEPTO DE MICROORGANISMO Y DE MICROBIOLOGIA.

Los microorganismos, comúnmente llamados microbios, no forman parte de un único
grupo taxonómico. Este término comprende a todos los seres microscópicos que
pertenecen a los Reinos Monera, Protoctista y Hongos. Son extremadamente abundantes
no sólo por el número de especies sino también y, sobre todo, por la enorme cantidad de
individuos existentes en sus respectivos hábitat. Tanto es así que se considera que la
mitad de la biomasa de la biosfera está constituida por los microorganismos.

El estudio de estos organismos, llevado a cabo por la Microbiología, es de gran

importancia ya que muchos de ellos son patógenos y producen enfermedades en el
hombre, en los animales y en las plantas.
 La microbiología es la ciencia o parte de la Biología que se ocupa del estudio de
organismos tan pequeños que no pueden ser observados sin la ayuda de una lupa o un
microscopio. El desarrollo de la microbiología empieza después del descubrimiento del
microscopio óptico por Anthony Van Leeuwenhoek (1632 - 1723). Hay organismos que
escapan a esta definición como es el caso de algunos tipos de algas.

 DIFERENCIACIÓN ENTRE CÉLULA EUCARIOTA Y CÉLULA

PROCARIOTA

El grupo más representativo de la microbiología son las bacterias con una estructura
celular mas primitiva que la de los organismos superiores (células eucariotas) . Son células
procariotas , es decir sin una diferenciación entre el núcleo y el citoplasma.

Célula procariota

 El núcleo no esta separado o delimitado del citoplasma, es decir, carecen de membrana

nuclear.

 El ADN se encuentra condensado en una zona centralizada que recibe el nombre de

nucleoplasma.

 Es el tipo de células que tienen las bacterias y algas cianofíceas también llamadas algas
azules.

Existen otras diferencias en cuanto a:

 Transmisión y expresión de la información genética.

 Metabolismo que utiliza cada tipo de células para proporcionar y obtener energía.

 Entrada y salida de materiales.

 PRINCIPALES TIPOS DE MICROORGANISMOS

Aunque las bacterias son el grupo más representativo de microorganismos hay otros:

 Protistas que incluyen:

 Protozoos

 Algas

 Hongos

 Virus (que no son células), su estructura se limita a una capsula de naturaleza proteica
(cápside) en cuyo interior se encuentra ácido nucleico que puede ser ADN o ARN.

 BACTERIAS
 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y ESTRUCTURALES DE LAS BACTERIAS
 Tamaño
Las bacterias son invisibles al ojo humano, su tamaño se mide en micras y varia de unas
especies a otras, y el intervalo de tamaño varia entre 1 - 250µ siendo el tamaño mas
habitual entre 1 - 10µ, en cualquier casi su tamaño es más reducido que el de una célula
eucariota normal.

 Forma
 Forma esférica llamadas cocos (Sthaphylococcus).
 Forma de palillos llamadas bacilos (Lactobacillus).

 Forma de coma llamadas vibrios (Vibrio cholerae).

 Forma de espiral llamadas espirilos (Espiroquetas).

 Disposición o agrupación que presentan

 Aisladas

 Formando agrupaciones características:

 Cadenas (Streptococcus)

 Parejas (Nisserias)

 Racimos (Sthaphylococcus)

 Tetradas

 Formas cúbicas (Sarcinas)

 Esporas
Algunos géneros de bacterias tienen la capacidad de formar esporas. Esta característica
ayuda a su identificación.

Las esporas son formas de resistencia a la temperatura, agentes químicos, agentes físicos
como la desecación, en general, resistencia a agentes adversos. Esta característica la
presentan el género Bacillus gram+ (B. anthracis), el género Clostridium (C. botulinum, C.
tetani).

La producción de una endospora por una bacteria en un proceso lento que se inicia como
respuesta a condiciones ambientales adversas.

 Presencia de cápsula
La cápsula es una capa gelatino - mucosa de tamaño y composición variable y que juega
un papel importante en las bacterias patógenas como el caso de la Klebsiella pneumoniae.

 Presencia de cilios y flagelos

No existen en todas las especies, solo en algunas. Los cilios (cortos) y flagelos (largos)
son filamentos de longitud variable, constituyen órganos de locomoción y según las
especies pueden estar implantados en uno o en los dos polos de la bacteria o en todo su
contorno, este es un rasgo identificativo de cada bacteria.

Constituyen el soporte de un tipo de antígeno que es el llamado antígeno H o flagelar.

 Pared celular
Además de tener membrana citoplasmática poseen una pared celular, suele ser rígida y de
naturaleza glúcido - lípido - proteica. En la pared celular existen constituyentes propios de
las distintas especies.

La diferente composición bioquímica y el distinto grosor que presenta esta estructura

bacteriana es responsable del distinto comportamiento frente a las tinciones (tición de
Gram).

 Periplasma
Es el espacio entre la pared celular y la membrana citoplasmática.
  Membrana citoplasmática
Está situada debajo de la pared y tiene permeabilidad selectiva frente a las sustancias que
entran y salen de la bacteria, es soporte de numerosas enzimas y tiene un papel
fundamental en la división del material nuclear bacteriano.

 Mesosomas
Son repliegues de la membrana que tienen gran importancia en la vida de la bacteria.

 Estructuras internas
Citamos:

 Núcleo

Que lleva el material genético de la bacteria y está formado por un único filamento de
ADN.

 Ribosomas

Son elementos granulosos que se hallan contenidos en el citoplasma bacteriano. Está

formado por ARN y su principal papel es su intervención en la síntesis proteica.

 Citoplasma

Solución coloidal que contiene elementos nucleares, inclusiones citoplasmáticas como

vacuolas, vesículas y los ribosomas.

 CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS

Según su pared bacteriana se clasifican en:

 MICOPLASMA

Bacterias que no sintetizan pared celular, sirviendo la membrana como capa externa
limitante.

 BACTERIAS GRAM (+)

Sintetizan una pared celular de una sola capa.

 BACTERIAS GRAM(-)

Sintetizan una pared celular compuesta de al menos dos capas estructurales distintas.
(Fuera de la pared celular encontramos una membrana a su alrededor).

3.- MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS

 Preparaciones en fresco
En Microbiología se pueden aplicar técnicas de detección de microorganismos en
materiales frescos sin aplicar ningún tipo de colorante. Estos métodos son muy útiles para
ver bacterias vivas y la mayoría están basados en el estudio de la movilidad.

Estos métodos comprenderán la extensión de la muestra a estudiar pero no seguida de

fijación. Se suele hacer la preparación en húmedo añadiendo una pequeña gota de
solución salina isotónica en la zona de la siembra. No se utiliza colorante.

Se tiene que observar con un cubreobjetos encima y directamente se mira al microscopio.

En el microscopio se intentara fijar la atención en las partículas en movimientos para
diferenciar si existen bacterias flageladas.
 Los flagelos son los que permiten el movimiento que es característico de ellos, ya que el
movimiento de otras partículas es al azar, el de las gotas de agua es browniano, mientras
que el de las bacterias es unidireccional.

Con estas preparaciones no puede distinguirse el tipo de bacteria, ya que la preparación

en fresco se utiliza solo para detectar microorganismos móviles. Para estas técnicas se
utilizan portaobjetos especiales llamados escavados.

 Preparaciones teñidas.
En Anatomía patológica lo que se realizan son técnicas microbiológicas de preparaciones
teñidas , con la observación de preparaciones teñidas obtenemos información sobre la
morfología bacteriana (cocos, bacilos...), además obtenemos información sobre la
disposición celular que adoptan las bacterias (cadenas cortas, largas, racimos, tétradas..),
si son Gram + o -, ácido alcohol resistentes.

Las técnicas histológicas no permiten identificar específicamente las bacterias, pero si

poner de manifiesto su presencia en el tejido y demostrar algunas de sus características
morfológicas básicas.

Mediante estas técnicas es posible precisar si son cocos, bacilos, espirilos e incluso una
vez teñidos si son Gram+, Gram-, o ácido alcohol resistentes.

Las espiroquetas se demuestran generalmente mediante impregnaciones argénticas y

algunas se colorean con la tinción de Giemsa.

Con las tinciones bacterianas se hacen más visibles los microorganismos y sus estructuras
ya que el colorante que se deposita en las células bacterianas aumentan el contraste con
respecto al medio.

Según el microorganismo que se vaya a teñir se distinguirá entre:

 Tinciones bacterianas.

 Tinciones para hongos.

 Tinciones para virus.

 Tinciones para parásitos.

 TINCIONES BACTERIANAS
Los mecanismos de las tinciones bacterianas pueden ser:

 Fisicos

Obedecen a un mecanismo de absorción del colorante a través de los poros de la célula

bacteriana quedando éste retenido en su interior.

Puede existir un mecanismo físico de adsorción del colorante, es decir, el colorante se

queda adherido a la superficie de la célula bacteriana sin pasar a su interior. Esto es lo que
ocurre en las técnicas de impregnación argéntica para la detección de espiroquetas.

 Químicos

En este se forma un verdadero enlace químico entre el colorante y algún componente de la

estructura bacteriana.

Tipos de tinciones bacterianas

 Tinción simple
 Son aquellas que utilizan un solo colorante, permite la visualización de la morfología
bacteriana, su agrupación y la cantidad de microorganismos.

 Tinción compuesta o diferencial

Utiliza mas de un colorante, esta nos permite la diferenciación de bacterias como:

- Tinción de Gram.

- Ácido alcohol resistente.

 Tinciones especiales
 Tinción de espiroquetas

- Tinción de esporas.

 Tinción de cápsula (verde de malaquita).

 Tinción de flajelos.

 Procedimiento técnico de las tinciones :

Para la realización de cualquier tinción se siguen los siguientes pasos:

- Extensión de la muestra. Esta extensión será diferente según el producto que llegue sea
líquido, sólido o exudado.

- Desecación.

- Fijación. Se suele realizar por calor utilizando un mechero Bunsen, también se puede fijar
exponiendo el porta a los vapores de un compuesto fijador.

- Tinción.

- Lavado.

- Secado.

- Observación al microscopio.
En el caso de que la muestra a estudiar sea una muestra de tejido, ya sea necrópsica o
biópsica que va incluida en parafina, el primer pasó será desparafinar e hidratar y
seguidamente se realizará la tinción.

 TINCIÓN SIMPLE
Se aplica un único colorante.

Los colorantes más empleados serán el violeta de genciana (1% durante un minuto),
Fucsina básica diluida, azul de metileno (1% de 3 - 5 minutos).

 TINCIÓN DE GRAM
 Fundamento :

Las bacterias Gram+ poseen grupos sulfhidrilos susceptibles de formar enlaces estables
con el violeta de genciana y el violeta de metilo previo tratamiento con lugol . El compuesto
resultante se resiste a salir a través de la pared celular de las bacterias gram + , no pasa lo
mismo con las bacterias gram - , de pared celular mas fina y diferente estructura.
 La tinción de Gram utiliza como colorantes el violeta de genciana al 1% o cristal violeta,
tintura de yodo o lugol, una solución decolorante formada por alcohol - acetona 7:3 y un
segundo colorante que es la fucsina básica diluida o safranina.

Técnica

Comprende los siguientes pasos en el caso de muestras histológicas:

- Desparafinar e hidratar.

- Violeta de genciana un minuto.

- Lugol, arrastrar el colorante y dejarlo un minuto.

- Lavar con agua.

- Echar decolorante (alcohol - acetona) hasta que salga limpio.

- Lavar con agua.

- Safranina de 30 - 60 segundos.

- Lavar, secar y observar al microscopio.

Resultados

 Gram+: violetas - azul oscuro.

 Gram- : rojo - fucsia.

Objetivo

Sirve para la diferenciación de dos tipos de bacterias, esta diferenciación se produce por el
diferente comportamiento que presentan la paredes celulares frente a los colorantes
empleados.

 TINCIÓN ÁCIDO - ALCOHOL RESISTENTE O DE

ZHIEL - NEELSEN
 Fundamento :

Todo el género de las micobacterias presentan gran dificultad mediante la técnica de Gram
porque poseen una gruesa cápsula protectora , de composición lipídica
fundamentalmente , que impide la penetración del colorante. Sin embargo, cuando se
fuerza la entrada en su interior (aplicación de calor), las micobacterias demuestran una
apetencia mayor de lo común por el colorante resistiendo posteriormente la diferenciación
con ácido mientras que el resto de microorganismos se decoloran por completo. Debido a
este comportamiento a las micobacterias se las llama ácido - alcohol resistentes.

La tinción de Zhiel Neelsen en ocasiones es negativa por la escasez de bacilos presentes

en la mayor parte de las muestras, en estos casos puede optarse entre demostrar su
presencia mediante fluorescencia específica con aureamina - rodamina o con reacciones
inmunohistoquímicas más específicas.

Los más importantes en clínica son el Mycobacterium tuberculosis y el Mycobacterium

leprae.

Utiliza como colorante:

- Fucsina fenicada de Zhiel Neelsen.

 - Alcohol 70%.

- Ácido clorhídrico puro (1ml).

- Azul de metileno al 1%.

Técnica

- Desparafinar

- Hidratar.

- Teñir con fucsina fenicada de Zhiel Neelsen a 60º durante 5 minutos o una hora a
temperatura ambiente.

- Lavar con agua destilada.

- Diferenciar con alcohol - ácido hasta la decoloración casi completa del citoplasma (rosa
pálido) durante 5 minutos.

- Lavar con agua corriente durante 5 minutos.

- Teñir con azul de metileno al 1% durante 20 segundos.

- Aclarar en agua destilada.

- Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados

 Microorganismos ácido - alcohol resistentes color rojo y los otros azul.

Siempre deben emplearse preparaciones control+.

 TINCIÓN DE ESPIROQUETAS
Dentro de las espiroquetas los microorganismos más importante son:

 Treponema pallidum (sífilis)

 Leptospira icterohemorrágica causante de la leptospirosis o enfermedad de Weir.

Hay una gran dificultad para demostrar estos microorganismos en los cortes histológicos
(debido a su pequeño tamaño ). Se emplean los métodos de impregnación argéntica:

 Tinción de Warthin - Starry que utiliza como solución reductora el pirogalol.

 Tinción de Levaditi

Ambos métodos utilizan como colorante el nitrato de plata al 11'5% en muestras de

autopsias y al 3% en muestras de biopsias.

Resultados

 Espiroquetas negras y fondo amarillo parduzco.

 TINCIÓN DE OTROS MICROORGANISMOS

 TINCIÓN DE HONGOS
Los hongos se clasifican según su morfología en:

 Hongos filamentosos que producen hifas.

 Hongos productores de esporas.

 Hongos filamentosos productores de esporas.

Cuando en la técnica histológica es necesario demostrar la presencia de hongos no suele

ser posible su identificación específica, en general los hongos son Gram+ en el caso de los
formadores de hifas y pueden ser Gram+ o Gram- en el caso de los formadores de
esporas.

Otra tinción que da información sobre la presencia de hongos es la de PAS. Serán PAS+
debido a la presencia de hidratos de carbono en su pared celular.

Una técnica muy empleada, es la técnica de la plata metenamina junto con el PAS. En la
tinción de la plata metenamina los hongos se ven de color negro.

 TINCIÓN DE VIRUS
Los virus son parásitos intracelulares. Las técnicas de detección de virus han sido
desplazadas por las técnicas de microscopía electrónica y por técnicas inmunológicas, es
decir de la determinación de antígenos específicos por serología.

 TINCIÓN DE SHIKATA
Sirve para teñir el virus de la Hepatitis B. Este método tiñe las células infectadas con el
virus de la Hepatitis B.

Otro método que se utilizó fue el método de la floxina - tartracina.

 TINCIÓN DE PARÁSITOS
Los parásitos más frecuentes en secciones tisulares son:

 Paludismo.

 Huevos de helmintos.

 Amebas.

 Triquina espiralis.

El parásito del paludismo, los huevos de helminto y las amebas se colorean con al tinción
de Giemsa. Los huevos de helmintos y amebas se demuestran con la técnica del PAS, con
la hematoxilina férrica y la hematoxilina fosfotúngstica.

TEMA 17 INMUNOHISTOQUÍMICA

 METODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS.
Sirven para detectar antígenos celulares o titulares mediante la reacción antígeno -
anticuerpo. Para visualizar el lugar donde se produce la reacción antígeno - anticuerpo es
preciso emplear un trazador o marcador.

El marcaje puede realizarse con fluorocromos (técnicas de inmunofluorescencia), técnicas

inmunoencimática o también pueden ser iones metálicos en forma coloidal (técnica de
inmuno - oro), y el último marcador son isótopos radioactivos.

2. TECNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS

2.1. Fundamentos:
 La fluorescencia es una forma de luminiscencia entendiéndose ésta última como la
emisión de la luz que se produce a partir de una fuente de energía no térmica y bajo el
efecto de una excitación.

La fluorescencia primaria o autofluorescencia es aquella que presenta determinadas

sustancias de forma espontánea sin necesidad de ser modificadas; por ejemplo la lámina
elástica de las arterias muestra autofluorescencia en determinadas condiciones).

En los tejidos que no poseen esta propiedad se puede inducir la fluorescencia,

llamándola fluorescencia secundaria, esto se puede hacer mediante tinción histoquímica
con sustancias fluorescentes llamadas fluorocromos o uniendo fluorocromos a antígenos
dirigidos a anticuerpos tisulares. De este último procedimiento se sirven las técnicas de
inmunofluorescencia.

2.2. Fluorocromos.

Son sustancias químicas que tienen la propiedad de absorber fotones de alta energía
procedente de la radiación ultravioleta o del espectro visible. Ello provoca una
redistribución de los electrones de las moléculas fluorescentes, puesta de manifiesto por la
emisión de una radiación luminosa de longitud de onda distinta auque dentro del espectro
visible.

Si al iluminar una sustancia con luz visible ocurre un fenómeno similar al descrito y la
liberación de energía se produce de forma gradual, prolongándose la emisión de luz
después de cesar la iluminación del objeto, este fenómeno se llama fosforescencia.

Los fluorocromos más utilizados en las técnicas de inmunofluorescencia son:

 Fluoresceína: absorbe luz azul y emite fluorescencia verde manzana.

 Rodamina: absorbe luz verde y emite fluorescencia roja anaranjada.

Los fluorocromos pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar la
capacidad de estos últimos para unirse a sus correspondientes antígenos, por ello las
fluorocromos ligados a anticuerpos específicos constituyen un medio útil de visualizar los
lugares donde reproduce la reacción Antígeno - Anticuerpo.

2.3. Preparación del tejido para inmunofluorescencia.

Las técnicas de inmunofluorescencia se realizan casi siempre sobre tejido congelado,

porque el procedimiento de fijación en formol e inclusión en parafina presenta numerosos
inconvenientes para el desarrollo de estos métodos.

Entre los inconvenientes figuran el aumento de los fenómenos de autofluorescencia y el

bloqueo de gran cantidad de determinantes antigénicos provocados por los agentes
fijadores.

2.4. Tipos de técnicas de inmunofluorescencia

 En la técnica de inmunofluorescencia directa se utiliza un anticuerpo específico frente al

antígeno que se desea detectar. Dicho anticuerpo está ligado a un fluorocromo.

 En las técnicas de inmunofluorescencia de tipo indirecto se emplea en un primer paso el

anticuerpo específico no marcado y en una segunda fase un anticuerpo marcado con el
correspondiente fluorocromo que reacciona de forma específica con el anticuerpo primario.

 Otros procedimientos técnicos de inmunofluorescencia bastante menos utilizados que los

anteriores son:
 La técnica de sándwich: que se emplea para detectar la presencia
de inmunoglobulinas específicas frente a un determinado antígeno en las células de tejidos
pertenecientes a un animal previamente inmunizado con ese antígeno. Para ello se toman secciones
de ganglio linfático procedentes del animal inmunizado, se añade el antígeno en un primer paso y
después un anticuerpo marcado con fluorescencia frente a dicho antígeno, si en el tejido existían
anticuerpos frente al antígeno se unirán a este que quedará a su vez fijados sobre el tejido y podrán
ser detectados con el anticuerpo marcado.

 La técnica de incubación con complemento es una modificación

de al técnica indirecta, en ella el anticuerpo que se emplea en el primer paso de la técnica ha de ser
capaz de fijar el complemento. Una vez realizada la primera incubación con dicho anticuerpo que a
su vez es específico frente a un determinado antígeno se añade suero de cobaya fresco como fuente
de complemento y se incuba a 37 º C, y en una tercera fase se incuba con un anticuerpo específico
frente a una determinada fracción del complemento, dicho anticuerpo específico irá marcado con un
fluorocromo.

2.5. Dobles tinciones en inmunofluorescencia.

La determinación de dos antígenos diferentes pude hacerse de forma

simultánea o secuencial.

- En el primer paso se incuba el tejido con una mezcla de dos anticuerpos específicos
frente a los antígenos que se quiere determinar, los anticuerpos irán marcados con
fluorocromos distintos.

- En la técnica secuencial se incuba en primer lugar con uno de los anticuerpos marcado
con un fluorocromo y se fotografían los campos más significativos. A continuación se
elimina la positividad destruyendo los grupos fluorescentes mediante la aplicación de luz
ultravioleta, una vez comprobado que la destrucción es completa se elimina el
cubreobjetos introduciendo la preparación en una solución tamponada y se incuba con un
segundo anticuerpo marcado con fluorocromo.

Este método presenta una serie se inconvenientes: no puede detectarse más de 2

antígenos diferentes, ya que por encima de una determinada dosis de luz ultravioleta se
deteriora el tejido.

2.6. Microscopio de Fluorescencia.

Las técnicas de inmunofluorescencia deben examinarse siempre con un microscopio

especial llamado microscopio de fluorescencia.

Este tipo de microscopio lleva incorporado una fuente de luz ultravioleta y luz visible, varios
filtros que selecciona la longitud de onda de la luz que incide sobre la muestra a estos
filtros s ele llaman filtros de excitación o filtros primarios. También tienen un filtro que
selecciona las longitudes de onda emitidas dentro del espectro de la luz visible dejando
pasar sólo la luz emitida por las sustancias fluorescentes e impidiendo el paso de la luz
excitadora, este filtro se llama filtro secundario o de barrera.

Existen 2 tipos fundamentales de microscopio de fluorescencia:

En uno de ellos la luz de excitación se transmite a través de la muestra y le

llamamos microscopio de transmisión.

En el otro la luz se refleja en el tejido procedente de un foco de iluminación superior, a este

lo llamamos microscopio de luz de incidencia oepiiluminación.
 ASPECTOS PRÁCTICOS DEL DESARROLLO DE LAS TÉCNICAS
INMUNOHISTOQUÍMICAS.

 Fijación.
Durante las inmunotinciones es conveniente aplicar alguna forma de fijación para
preservar el tejido aun cuando se maneje secciones en congelación.

Las condiciones en que se realiza la fijación repercuten en el resultado, por ello debemos
tener en cuenta que:

 Los fijadores que actúan por precipitación de proteínas suelen producir mejores resultados que
los fijadores por reticulación o los que contienen oxidantes.

 Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del tejido.

 El efecto de cada fijador sobre un antígeno puede ser distinto según la localización histológica y
anatómica de dicho antígeno.

 En muestras de gran volumen la fijación por inmersión en la solución fijadora proporciona

resultados variables en cuanto a positividad inmunohistoquimica ya que las zonas mejor fijadas se
teñirán más que las más profundas.

 Existen determinados antígenos de superficie o receptores nucleares cuya determinación en

tejidos fijados no proporciona buenos resultados, por eso debe realizarse en tejido congelado sin fijar
o usando una fijación breve en acetona, en cloroformo o en una mezcla de ambos.

 La fijación debe ser inmediata para evitar la autolisis, sino fuera posible puede frenarse el
proceso de autilisis manteniendo los tejidos a 4 º C o en soluciones conservantes.

Las pautas de fijación en inmunohistoquimica serán distintas según el antígeno que se

desea estudiar.

Cuando se utiliza un anticuerpo por primera vez es aconsejable utilizar secciones de tejido
congelado como control a fin de determinar la fijación más adecuada así como las
diluciones óptimas del anticuerpo primario. Además siempre deben utilizarse
preparaciones de control positivo y negativo que serán fijadas de la misma forma que el
tejido objeto de estudio.

Para acortar el tiempo de fijación puede utilizarse la fijación por microondas.

3.2 Decalcificación.

La inmunoreactividad se conserva bien tras la aplicación de algunos procedimientos

rutinarios de decalcificación (como por ejemplo utilizar EDTA a una concentración 0,5 M,
ácido acético acuoso a una concentración al 10% o ácido fórmico al 5%).

Sin embargo si se utilizan ácidos fuertes como el ácido nítrico la inmunoreactividad

desaparece al cabo de unas pocas horas de tratamiento.

Aunque los procedimientos habituales de deshidratación y aclaración no deterioran

excesivamente los antígenos, la inclusión habitual tanto en parafina como en algunas
resinas sintéticas pueden afectar a los resultados inmunohistoquímicos, así el uso de
acetona en lugar de etanol y el de cloroformo o benzoato de metilo en lugar del xileno
mejoran notablemente la inmunotinción.
 La inclusión en parafina caliente (60º) produce pérdida de antigenicidad, por lo que el
tiempo de infiltración debería reducirse al mínimo y se ha llegado a recomendar el empleo
de parafinas de bajo punto de fusión.

3.4 Obtención de cortes. Utilización de adhesivos tisulares.

Si el procedimiento de inmunotinción se realiza sobre tejido congelado se obtendrán en el

criostato cortes de 4 - 6 micrómetros de espesor que se secan al aire a temperatura
ambiente durante 2 horas.

A continuación se fijan en acetona absoluta a 4º C durante 5 minutos y se vuelven a secar

al aire durante 30 minutos.

Si la técnica se va efectuar más tarde, las secciones pueden guardarse envueltas en papel
de aluminio y con un desecante a - 20º C o a temperaturas inferiores.

En el momento de realizar la inmunotinción se llevan los cortes a temperatura ambiente,

no se desecha el envoltorio de papel de aluminio hasta que los cortes alcanzan la
temperatura ambiente se vuelven a secar al aire a temperatura ambiente durante
aproximadamente 60 minutos, luego se realiza una refinación con cloroformo durante 20 -
30 minutos y posteriormente se pasan a un baño de solución tamponada.

Los cortes de parafina se obtienen de un grosor de 3 - 5 micrómetros y se dejan secar toda

la noche en la estufa a 37º C.

A continuación se desparafinan cuidadosamente en xileno, se llevan hasta alcohol

absoluto y se hidratan.

Cuando se aplican los métodos inmuno enzimáticos es bastante fácil que se desprendan
los cortes debido a los numerosos lavados que es preciso efectuar. Por ello se recomienda
emplear un adhesivo que fije las secciones al portaobjetos, existen varios tipos de
adhesivos como albúmina de huevo, gelatina o poli L - lisina. Un exceso de adhesivo
puede ser causa del aumento de tinción inespecífica de fondo.

En la actualidad existen en el mercado portaobjetos que presentan una o varias superficies

ligeramente deprimidas donde pueden adherirse los tejidos para realizar la incubación sin
que ocurran fenómenos de difusión de los reactivos.

3.5 Restablecimiento de la inmunoreactividad tisular: digestión enzimática y

deslipidización.

La pérdida de antigenicidad ocasionada por los fijadores que contienen aldehídos como el
formol tamponado puede compensarse:

 Utilizando un procedimiento inmunoenzimático de máxima sensibilidad.

 Mediante digestión proteolítica con enzimas o por deslipidización.

 Digestión enzimática:
Con el tratamiento enzimático de duración óptima se reduce en gran medida la tinción no
específica, probablemente porque se suprimen algunas de las moléculas proteicas
responsables de la misma, se utilizan proteasas.

La digestión enzimática tiene inconvenientes como:

o Si es excesiva puede llegar a producir la destrucción del tejido con desprendimiento
de porciones de este.
o Por digestión del antígeno puede debilitarse la tinción o crear falsos positivos.

o La digestión proteolítica excesiva de antígenos tisulares puede desenmascarar

fragmentos proteicos comunes a diversos antígenos y por tanto incrementar la tinción no específica.

Cualquier actividad enzimática proteolítica residual debe eliminarse una vez completado el
tratamiento de los cortes.

 Deslipidización:
La inmunoreactividad de ciertos antígenos de membrana se restablece mejor por medio de
la exposición a disolventes de lípidos como por ejemplo el cloroformo. Al parecer las
glucoproteínas están parcialmente enterradas en la doble capa de lípidos de la membrana
celular por lo que se requiere una exposición prolongada (normalmente 24 horas) al
cloroformo de las secciones de parafina una vez hidratados.

3.6 Bloqueo de la actividad enzimática endógena.

Si en las técnicas inmunoenzimáticas se utiliza como marcador una enzima normalmente

presente en el tejido que se está examinando debe inhibirse su actividad endógena antes
de la inmunotinción, de lo contrario la enzima endógena reaccionará con el sustrato
empleado para localizar la enzima marcadora dando lugar a falsos positivos.

3.7 Bloqueo de la tinción de fondo.

a) Tinción de fondo específica:

Puede ser debida a varias causas:

 La presencia del antígeno objeto de estudio en lugares distintos a aquel en que se quiere
detectar.

 La existencia en el antisuero primario de anticuerpos frente a antígenos distintos al que se quiere

determinar. Este problema se puede resolver usando altas diluciones del antisuero primario.

 Tinción de fondo inespecífica.

Es la unión no inmunológica del antisuero a ciertos componentes de los tejidos. En estos
casos la coloración del fondo puede reducirse bloqueando los lugares con afinidad no
inmune por las inmunoglobulinas (que son anticuerpos).

El procedimiento implica incubar los cortes con una inmunoglobulina que no interfiera con
el antisuero primario.

La tinción de fondo inespecífica también puede reducirse usando el antisuero primario en

diluciones muy altas añadiendo grandes concentraciones de sal (normalmente 2,5 % de
cloruro sódico) al tampón, empleando preferentemente solución tamponada tris o
agregando a la disolución tamponada detergentes tales como el triton X - 100.

La digestión enzimática como ya hemos visto reduce la tinción inespecífica de fondo.

3.8 Penetración de los reactivos. Detergentes.

Para obtener buenos resultados es esencial que los anticuerpos penetren de forma
adecuada y alcancen los antígenos que se quieren detectar. Para contrarrestar la escasa
penetración de algunos conjugados se suele recurrir al uso de detergentes como el triton
X - 100 o lasaponina que actúan permeabilizando las membranas.

3.9 Controles.
Para un buen desarrollo de la técnica es conveniente realizar siempre los siguientes
controles:

 Control negativo: se omite el antisuero primario o se sustituye por suero no inmune o por una
solución tamponada, utilizando el mismo tejido que para el control positivo, si el resultado es
positivo será debido a una positividad inespecífica.

 Control positivo: se utiliza una sección de tejido del que se tenga certeza absoluta de que
contiene el antígeno por determinar, de esta forma si con un control positivo la técnica es negativa
me indica un fallo en el procedimiento técnico o un defecto de fijación.

3.10. Tipos de anticuerpos. Diluciones.

Por lo que se refiere a las incubaciones todos los métodos inmunohistoquímicos consisten
en tratamientos sucesivos con antisueros separados por lavados con soluciones
tamponadas.

Para obtener una tinción óptima es importante que cada antisuero se use en la dilución
mas adecuada, que no se evapore durante la incubación y que el anticuerpo no unido al
antígeno se elimine por completo antes de la incubación siguiente.

Por eso, siempre debe ensayarse una amplia gama de diluciones cuando se usa un
anticuerpo por primera vez o cuando un antisuero conocido se emplea por primera vez
sobre un tejido distinto.

3.11. Incubaciones.

Para prevenir la evaporación de los antisueros, las incubaciones se llevan a cabo en una
atmósfera húmeda preferentemente en cámaras de incubación, de esta forma se ahorra
considerable cantidad de anticuerpos, puesto que la temperatura influye en la velocidad de
la reacción antígeno - anticuerpo si se realizan incubaciones cortas el procedimiento se
hará a temperatura ambiente, si por el contrario se aplica incubaciones largas, por ejemplo
durante toda la noche la cámara de incubación se mantendrá a 4º C.

3.12. Lavados.

En cualquier procedimiento inmunohistoquímico es preciso eliminar todo el antisuero no

unido al antígeno durante una incubación antes de pasar a la siguiente. Esto se realiza
lavando con la solución tamponada elegida.

Para que la solución de lavado se agite continuamente sobre la superficie del corte se
deposita el recipiente con los portaobjetos sobre un agitador magnético o en un baño de
agitación vacío.

TEMA 18 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

1. Introducción

La MEB nació en 1958por Manfred Von Arden cuando basándose en estudios

experimentales construyó un prototipo de microscopia de esta índole. Sin embargo, no
alcanzó un completo desarrollo hasta los años 60.

Las dificultadas planteadas en el procesamiento de los especimenes biológicos hicieron q

las investigaciones realizadas sobre este material no avanzaran tanto como los estudios
sobre materiales inorgánicos.
Hoy día, subsanados casi todos los problemas relacionados con el proceso de las
muestras, la MEB constituye un método sumamente útil para el estudio de la
morfoestructura superficial de las muestras biológicas y, en consecuencia, un medio
complementario de análisis q suministra importante información sobre la estructura de
células y tejidos.

En comparación con la ME convencional, la MEB presenta dos ventajas:

 Permite observar áreas mucho mayores sobre la superficie de los objetos.

 Puede proporcionar más información sobre la estructura y composición del objeto debido a la
gran cantidad de interacciones q realizan los electrones del haz de observación entre sí y con el
propio objeto de estudio.

2. Principios básicos de la MEB

En la MEB un haz de electrones emitidos por un filamento de tungsteno q actúa como

cátodo es dirigido hacia la muestra a través de una columna incluida en el microscopio.
Este haz se desplaza sobre la muestra realizando un barrido de su superficie q es
proyectado sincrónica y simultáneamente sobre la pantalla de observación.

Dependiendo de la señal detectada la información q proporciona el instrumento puede

hacer referencia a:

 Al poder de emisión de electrones secundarios arrancados de la muestra por el haz primario.

 A la capacidad de incluir cambios eléctricos sobre un objeto q actúa como semiconductor
(efecto inducido).

 A la emisión de luminiscencia debido a la liberación de fotones por parte del objeto sometido a
la irradiación electrónica.

 A la detección de los electrones residuales q atraviesan la superficie.

Cuando la información hace referencia sobre todo a electrones absorbidos y al efecto de
fotoluminiscencia se obtiene una imagen 3D del objeto de estudio.

Los componentes básicos del MEB son:

 Cañón de electrones: emiten los electrones q chocan contra el espécimen creando una imagen
aumentada.

 Lentes magnéticas: crean campos q dirigen y enfocan el haz de electrones.

 Sistema de vacío: es muy importante en el ME debido a q los electrones pueden ser desviados
por el aire. Se debe hacer un vacío total (10-5Pa).

 Placa fotográfica o pantalla fluorescente: se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la
imagen aumentada.

 Sistema de registro: muestra la imagen q producen los electrones. Suele ser una computadora.
3. Procesamiento de las muestras

Debido a la gran variedad de los materiales susceptibles de ser observados con MEB los
criterios metodológicos para su preparación son a sí mismo muy numerosos. No obstante,
es posible esbozar una pauta general aplicable a muestras biológicas.

 Lavado minucioso con suero salino de la superficie objeto de estudio.

 Fijación del material: esta fase persigue dar una adecuada estabilidad a la muestra. Se usan
fijadores químicos del tipo de aldehídos. El más usado es el glutaraldehido al 2.5%. La presión
osmótica del fijador debe regularse usando un tampón tipo fosfato. Tb se puede usar el tampón
cacodilato. El tiempo q debe permanecer la muestra en el fijador es variable y depende de la
experiencia de cada laboratorio al igual q el tipo de solución amortiguadora empleada. El tiempo
suele oscilar entre 2-24h según el tamaño considerándose como tiempo medio 6h. Una vez fijadas
las muestras se lavan en solución amortiguadora, generalmente tres cambios de 10-15 min cada uno.

 Tratamiento postfijación: esta fase es importante ya q previene la deformación del secado al

aire cuando no se dispone del procedimiento del punto crítico, aumenta la conductividad eléctrica de
la muestra y evita casi por completa la extracción de los lípidos de las mbs durante la deshidratación.
Como agente postfijador se suele emplear el tetróxido de osmio al 1 o 2% en igual solución
amortiguadora k la usada para glutaraldehido y durante un tiempo entre 30min y 2h.

 Deshidratación: es la liberación de agua de los tejidos q debe realizarse de forma gradual en

baños crecientes del agente deshidratante. Los más usados son etanol, acetona y etilenglicol. Entre
esta fase y la desecación hay q usar líquidos intermedios.

 Desecación: es importante señalar q en MEB no vale con deshidratar es necesario conseguir una
completa desecación. Para ello se aplica casi siempre el método del punto crítico q evita en gran
medida los efectos de la tensión superficial. La muestra se coloca en una interfase de líquido y gas,
el conjunto se lleva a una combinación de presión y Tª a la cual la densidad del gas lleva a una Tª
superior a la crítica sin modificar la presión. Todo el líquido pasará a gas sin atravesar las superficies
celulares y del tejido incluyendo el contenido en la muestra con la q se evitan los defectos de arrastre
y de tensión superficial q toda evaporación supone. El procedimiento técnico es :

La muestra se pone en unas cestas con acetato de amilo, se baja la Tª a una inferior a
10ºC añadiéndole CO2 líquido q va a desplazar al acetato de amilo. Seguidamente se lleva
la muestra al punto crítico del CO2 (31ºC y 74bar). Alcanzadas las condiciones se elimina
el gas de la cámara y la muestra queda desecada.

 Montaje de las muestras: las muestras desecadas se colocan en soportes de aluminio

especialmente diseñados para el MEB usando como adherente sustancias conductoras como la plata
coloidal. Es importante reiterar q en esta fase del proceso la manipulación de la muestra suele ser
extremadamente cuidadosa evitando dañar o manchar la superficie a observar.

 Recubrimiento: esta última fase consiste en proveer a las muestras de una superficie

conductora de la electricidad y del calor q facilite sin carga durante el barrido para lo cual es
necesario usar carbón o metales pesados como oro, platino, aluminio...

De entre las numerosas pautas existentes para el recubrimiento destaca el bombardeo

iónico en cámara de vacío. El procedimiento más común es la metalización con oro o
doble metal con carbón y oro.

Otro método para obtener una superficie conductora es el recubrimiento por

evaporarización tras calentamiento de un metal en cámara de vacío

Otros métodos más antígenos son la inmersión simple en soluciones alcohólicas saturadas
de cloruro de oro y secado al aire. Este es muy poco usado en la actualidad.

4. Variantes metodológicas en MEB

 Criofijación
Sustituye a la fijación primaria y consiste en la inmersión en líquidos criogénicos (N2
líquido) evitando la movilización iónica de las muestras.

Previamente, se deposita el tejido sobre los portamuestras de barrido ya seas de aluminio

o de grafito. El conjunto se sumerge en N2 líquido.
 Para evitar la formación de microcristales por el importante cambio de Tª debe utilizarse un
agente criogénico intermedio como el Freon 22 líquido.

En la actualidad, existen sistemas q en cámaras de vacío y a muy bajas Tª permiten

realizar tras la criofijación una deshidratación progresiva q sustituye por completo al
proceso convencional.

 Criofractura
Corta o fractura las muestras a baja Tª tras producir un enfriamiento en N2 líquido.
Proporciona una superficie q refleja fielmente las características del interior de las
muestras.

 Técnicas conductoras
El fin es aumentar la conductividad de las muestras biológicas y, por tanto, la emisión de
un mayor nº de electrones secundarios en muestras en las q no se desean utilizar la
metalización.

Existen variantes metodológicos de éstos entre los q destaca la propuesta por Murakami q
emplea la combinación de dos ácidos, el ac. tánico y tetróxido de osmio. De esta manera,
las muestras no recubiertas presentan mejor resolución y mayor contraste durante la
observación.

5. Aplicaciones de la MEB

Paleontología, cristalografía, microelectrónica, arte y ciencias de materiales, botánica,

microbiología, parasitología, histología y citología.

En general, tiene aplicaciones en todas aquellas ramas de la ciencia q tienen por objeto de
estudio la morfoestructura de muestras, siempre q estas sean capaces de resistir un alto
vacío.

A continuación, vamos a ver en síntesis diferentes aplicaciones de la MEB en biología

celular:

 En el estudio de las poblaciones celulares del sistema inmunitario y sanguíneo, la MEB está
permitiendo tipificar nuevos patrones morfológicos de superficie. Así ocurre en las recientes
descripciones de los linfocitos “peludos” y vellosos q definen morfológicamente a dos formas
particulares de leucemia.

Una tipificación morfológica similar se esta revelando importante en los estudios de

proliferación y renovación de las poblaciones epiteliales de la morfología cromosómica,
espermetozoides, etc.

Singular interés tiene la aplicación de este tipo de microscopia a los procesos de

biomineralización y, por tanto, a los tejidos duros al no se necesarios su decalcificación. De
este modo, ha sido posible realizar descripciones de esmalte, dentina, cálculos urinarios,
huesos, entre otros, tanto en condiciones normales como patológicas y de
experimentación.

Tb tiene su aplicación tras la preparación de moldes vasculares para conocer mejor la

configuración tridimensional, microvascular de diferentes órganos y sistemas.

La MEB permite incorporar sistemas de detección de energía dispersiva de rayos X y

electrones lo cual es útil para la detección cualitativa y cuantitativa de distintos elementos
químicos.
 Permite visualizar estructuras artificiales teñidas con elementos de elevado nº atómico lo q
posibilita la localización de diversas actividades enzimáticas.

La MEB ha proporcionado información sobre determinados receptores de mb.

Las imágenes en 3D permiten ampliar conocimientos estructurales q quedaban

parcialmente ocultos en el empleo exclusivo de la MO y MET.

TEMA 19 PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACION DE MICROTOMÍA Y

CONTRASTE EN M.E.T.

 PREPARACION DE LOS TEJIDOS.

La preparación de los tejidos comprende 5 tiempos:

 Fijación.
 Deshidratación.
 Inclusión.
 Microtomía.
 Coloración: contraste.
Esta preparación puede efectuarse sin grandes dificultades fuera de un centro de M.E. y
conducir a una inclusión definitiva que puede conservarse casi indefinidamente.

Posteriormente se realiza el transporte a un centro de M.E. sin que ello suponga ningún
riesgo.

 FIJACIÓN.
Interesa que la fijación sea inmediata dentro del minuto que sigue a la extracción del tejido
vivo; es posible un a fijación más tardía pero los resultados serán menos satisfactorios.

La fijación se hace frecuentemente con un fijador ósmico cuyo pH y osmolaridad deben

estar bien determinados, se puede utilizar también el permanganato
potásico, glutaraldehido y el fijador de Dalton.

 FIJACION CON TETRÓXIDO DE OSMIO.

 Ventajas que explican la generalización de su empleo:

 Por una parte su acción sobre los componentes de los tejidos es muy rápida, lo cual limita al
máximo los peligros de autolisis intracelular.

 Por otra parte, la presencia de osmio va a permitir un aumento apreciable del contraste de la
imagen (porque es un material pesado).

 Inconvenientes:

 Penetra con dificultad en los tejidos.

 Otro pequeño inconveniente es que la concentración de osmio disminuye progresivamente

en el curso de la penetración a causa de su absorción por las capas superficiales, esta lentitud de
penetración explica lo poco que se utiliza en histología clásica.
 El tetróxido de osmio actúa por gelificación de las proteínas, es decir, transforma las
soluciones acuosas de estas macromoléculas en un estado que se aproxima al estado
sólido.

El ácido ósmico se presenta en ampollas que contienen cada una 0´5 g. de tetróxido de
osmio cristalizado. En el laboratorio se efectuarán las operaciones necesarias para su
preparación para poder ser utilizado como fijador.

El líquido fijador de tetróxido de osmio tiene que tener un pH 7´38, una vez preparado se
guarda en el frigo, en un recipiente oscuro y herméticamente cerrado, debe permanecer
incoloro o ligeramente amarillo. Su alteración se manifiesta por un viraje al rosa que
aparece generalmente después de algunas semanas. No debe usarse nunca el fijador
color rosa.

Técnica de fijación con tetróxido de osmio:

El fijador debe ser transparente hasta el lugar de la extracción, dentro de pequeños tubos
de cristal, los cuales deberán ser siempre cuidadosamente lavados, pasados por la mezcla
sulfocrómica y secados en la estufa. Estos frascos serán colocados en un recipiente
isotérmico relleno de hielo. En el momento de la extracción se deposita sobre un “cartón”
llamado bristol con unas gotas de fijador y lo antes posible se deposita el fragmento de
tejido obtenido.

El tejido se habrá cortado en forma de pequeños cubos regulares cuyas dimensiones debe
ser del orden de 1mm3.

Esta manipulación se efectúa aproximadamente en 1 minuto, el tiempo de fijación puede

variar entre 1 - 2 horas.

 FIJACIÓN CON PERMANGANATO POTÁSICO.

Este fijador tiene la propiedad de fijarse sobre las membranas celulares y tiene el
inconveniente de impregnar poco las demás estructuras. Debe prepararse en el momento
del uso.

 FIJACIÓN CON GLUTARALDEHIDO.

Se emplea a una concentración de 2´5 % y se puede emplear solo o formando mezclas.

 FIJACIÓN CON EL FIJADOR DE DALTON.

Este fijador también contiene osmio y está particularmente indicado para la fijación de
células sanguíneas. Este fijador se puede realizar a tª ambiente y dura entre 1 - 2 horas.

Después de la fijación los tejidos serán deshidratados.

 DESHIDRATACIÓN.
Se realiza por pasos sucesivos en los alcoholes siguientes:

 Etanol 50º………… 15 min.

 “ “70º…………. “ “

 “ “95º…………. “ “

 “ “100º………… “ “

 “ “100º…………bidestilado y rectificado 30 min. 2 veces.

 En caso de inclusión en araldita o Epon es posible limitarse a un solo pase en etanol
rectificado.

En caso de inclusión en metacrilato es extremadamente importante en los últimos tiempos

utilizar un alcohol recientemente rectificado y perfectamente puro.

La fijación también puede realizarse con acetona.

 INCLUSIÓN.
La técnica de inclusión clásica en parafina no es adecuada en M.E. ya que esta es
demasiado blanda para obtener cortes muy finos. Se utilizan materias plásticas sintéticas,
estas deben reunir varias condiciones: como tener unas determinadas características
físicas de dureza, plasticidad y elasticidad, para responder a las exigencias de la
microtomía ultra fina.

Su penetración en los tejidos debe ser satisfactoria y no deben ocasionar alas células más
que un mínimo de alteración.

La muestra tiene que ser extremadamente fina para que permita el paso de los electrones.
También tiene que presentar una estructura celular y subcelular idóneas para el estudio
con microscopia electrónica por ello las características físico-químicas del medio de
inclusión condicionan toda la cadena de reactivos previos al encastramiento, corte y
tinción.

Como líquidos intermediarios se pueden usar el etanol y la acetona siempre que sean
miscibles con el agente de inclusión. Normalmente es posible el paso directo del tejido al
liquido intermediario pero algunas veces es aconsejable utilizar un agente de transición
que facilite la penetración del medio de infiltración, por ejemplo el 1,2-epoxipropano u
oxido de propileno.

4.1. INCLUSION EN METACRILATO

Tiene 2 grandes ventajas:

 La 1ª se refiere a sus propiedades físicas de elasticidad y dureza que pueden hacer variar a
voluntad y que permiten efectuar cortes ultra finos.
 La 2ª es que da cortes en los que las imágenes aparecen fuertemente contrastadas.

El metacrilato tiene la propiedad de sublimarse bajo el haz electrónico, lo cual tiende a

adelgazar el corte en los sitios en los que las estructuras están ausentes y por tanto a
aumentar el contraste de las mismas.

En cambio tiene el grave inconveniente de provocar alteraciones celulares en el momento

de la polimerización y la conservación de las estructuras finas es generalmente menos
buena que con las otras materias de inclusión como la araldita y Epon. El uso del
metacrilato ha decaído debido a sus inconvenientes.

Se utiliza metacrilato de butilo adicionado de una pequeña cantidad de metacrilato de

metilo, la dureza del polímero está en función de su contenido en metacrilato de metilo que
puede variar a voluntad.

El polímero de metacrilato de metilo está comercializado bajo el nombre de Plexiglas. El

monómero es muy soluble en alcohol y muy fluido y penetra bien en las células tras su
deshidratación total. En cambio es completamente insoluble en el agua, esto explica la
atención que se debe poner a la rectificación del alcohol absoluto. La polimerización del
metacrilato se obtiene añadiendo un iniciador químico y bajo la acción del calor.
 El metacrilato monómero que se expende en el comercio está mezclado con hidroquinona
que impide su polimerización a esto se le llamadesestabilización y se realiza con una
solución de sosa al 40 x 1000.

4.2.INCLUSIÓN EN EPOXIRRESINAS.

Estas sustancias están formadas por un amplio conjunto de polímeros plásticos entre los
que se encuentran el araldite, la resina epon y la spurr. Por retraerse escasamente suelen
proporcionar una buena conservación de la estructura subcelular y mayor preservación del
corte que el metacrilato.

Sus inconvenientes mas graves son:

 Su elevada viscosidad, que enlentece la penetración.

 La toxicidad de sus moléculas, principalmente del componente denominado dióxido de

vinilciclohexano (VCD).

El fundamento general de la inclusión en epoxirresinas radica en la utilización de una

resina monomérica líquida que se transforma en un polímero sólido de gran dureza en
presencia de calor, un endurecedor, un acelerador de la reacción y opcionalmente un
agente plastificante que disminuye su fragilidad.

a) INCLUSION EN ARALDITA.

Su principal ventaja sobre el metacrilato consiste en permitir una mejor conservación de

las estructuras histológicas finas con una notable constancia en los resultados.

La presencia de agua no influye en la polimerización de la araldita, esto es una ventaja

porque no es necesario extremar la deshidratación.

Otra ventaja es la de poseer un punto de fusión más alto que el del metacrilato, además su
conductibilidad térmica es mejor, de ello resulta que los cortes ultra finos de araldita se
calientan mucho menos bajo el haz electrónico que los cortes de metacrilato. Su
resistencia y estabilidad son mejores.

La araldita tiene en cambio 2 inconvenientes importantes:

 La obtención de los cortes ultra finos es más difícil que con el metacrilato.

 El contraste de los cortes es siempre bastante débil, de aquí la necesidad de recurrir a

artificios suplementarios para aumentarlo.

b) INCLUSIÓN EN EPON.

Esta es otra variedad de resina cuyas ventajas e inconvenientes son los mismos que los
de la araldita.

c) INCLUSIÓN EN SPURR

Es una resina de muy baja viscosidad cuyo uso está ampliamente extendido pese a los
inconvenientes descritos para las epoxirresinas.

 ULTRAMICROTOMÍA
Antes de la ultramicrotomía el tejido incluido se tiene q encastrar en un molde. Suele
realizarse en moldes plásticos o de silicona que se desechan tras la polimerización
seccionándolo con una cuchilla longitudinalmente, también se utilizan cápsulas de gelatina
que se eliminan por disolución en agua a 70ºC.
 La observación de cortes histológicos al M.E. exige que estos sean extremadamente
delgados, un grosor del orden de unas centenas de anstrong. Un corte de 0´5 micras de
grosor aparece completamente opaco.

Es prácticamente imposible obtener un poder de resolución superior a la décima parte del

grosor del corte, así pues un corte de 200 A tendrá un poder de resolución de 20 A, este
valor está lejos del límite de resolución de los mejores aparatos actuales (del orden de 5
A), por tanto se procurará hacer los cortes lo más finos posible. La finura de los cortes
depende de 3 factores:

 El micrótomo.
 La cuchilla.
 La materia de inclusión.
5.1. MICROTOMOS.

Actualmente se disponen de varios instrumentos que permiten con facilidad la obtención

de cortes ultra finos.

Todos ellos tienen en común el hecho de que la cuchilla está fija mientras que la
preparación es móvil, el avance de la preparación es regulable a voluntad de uno y permite
la obtención de cortes cuyo espesor puede variar desde algunas micras hasta 0´01 micra.

Se pueden distinguir micrótomos de mano manual y automáticos:

 Los manuales, el desplazamiento de la preparación se efectúa mediante un volante que tiene

una cierta inercia, a cada vuelta del volante corresponde un corte.

 En los automáticos el desplazamiento se efectúa por medio de un motor eléctrico o de un

sistema electromagnético.

5.2. CUCHILLAS.

La perfección de un corte depende tanto de las cualidades de la cuchilla como de las del
micrótomo.

Las cuchillas de acero no sirven en este caso; actualmente la solución está entre las
cuchillas de vidrio y las de diamante, más utilizadas las de vidrio por su bajo precio.

Las cuchillas de diamante presentan la ventaja de su mayor dureza por lo que es preferible
utilizarlas cuando se va a cortar un material duro como el hueso, otra ventaja es que duran
más, como inconveniente que son más caras y no permiten obtener cortes de más calidad
que las de vidrio.

5.3. PRÁCTICA DE LA ULTRAMICROTOMÍA.

Sin ser extremadamente difícil la práctica de la ultramicrotomía necesita gran cuidado, no

cabe duda que el valor de los cortes y la constancia de los resultados dependerán
esencialmente de la habilidad y de la paciencia del operador.

El micrótomo debe estar situado sobre un soporte estable y no sobre un entarimado, el

suelo sobre el cual descansará el micrótomo debe estar exento de vibraciones mecánicas,
también es importante que este en sitio donde la temperatura sea constante y exento de
corrientes de aire. Una simple corriente de aire puede enfriar la muestra y provocar una
contracción de la misma originando una irregularidad en el grosor de los cortes.

Preparación del bloque:

La inclusión definitiva se presenta bajo la forma de un pequeño fragmento de 1mm3 de
tejido envuelto en la materia plástica contenida en una cápsula de gelatina (en el caso de
metacrilato hay que quitar antes esta cápsula), pero cuando las inclusiones están echas
con epon o araldita es inútil intentar quitarla ya que está estrechamente adherida al bloque
polimerizado.

Cortar la extremidad del bloque bajo la forma de una pirámide cuadrangular, esta pirámide
contiene el fragmento de tejido. Se cortará de manera que la superficie de sección sea un
poco inferior a 1 mm2.

Hay que preparar la cuchilla para facilitar la recogida y montaje del tejido cortado. Los
cortes ultra finos no pueden ser recogidos ni sobre una superficie sólida ni manipularlos,
en cambio será posible recogerlos sobre una superficie líquida.

Para esto se adoptará a la cuchilla una pequeña cubeta destinada a ser llenada de agua
cuya superficie horizontal debe estar exactamente en el mismo nivel que la arista de la
cuchilla. Se usan generalmente cubetas de cobre o aluminio y se asegurará su cierre
hermético con un fragmento de cera o parafina, la arista de la cuchilla estará exactamente
en el mismo plano que las extremidades de la cubeta, también se puede formar la
pequeña cubeta por medio de una tira adhesiva impermeable que se fijará de la forma
indicada.

La cuchilla unida a su cubeta será fijada solidamente al micrótomo, habiendo llenado

previamente la cubeta con agua destilada (para el metacrilato) o con agua acetonaza al 10
% (para araldita o epon) se hará al principio algunos cortes semifinos para obtener una
superficie se corte cien regular. Una vez seccionados, estos cortes flotan en la superficie
de la cubeta.

Observados al contraste de fases sin impregnación permitirán observar inmediatamente si

la estructura histológica corresponde a la investigada. Los cortes serán extraídos de la
superficie del agua con un palillo tipo manicura (los cortes semifinos) y depositados sobre
una gota de agua albuminosa situada sobre un portaobjetos. La gota de agua albuminosa
es luego absorbida por el borde de un papel de filtro lo cual permite la extensión regular e
inmediata de los cortes sobre el portaobjetos.

Posteriormente se harán los cortes ultra finos, la sucesión de los cortes debe formar una
tira bien regular siendo preferible no extraer más que las tiras cuyos cortes sean todos del
mismo color, es decir, del mismo grosor; aunque generalmente es necesario antes de la
extracción extender los cortes.

Extensión de los cortes:

En el momento de la sección el corte está generalmente contraído, es decir, que su

superficie es inferior a la del bloque de la cual procede, esto se traduce por un plisado.

Es necesario desarrugar estos cortes, lo cual se consigue con dificultades variables según
la dificultad de la inclusión (por ejemplo añadiendo unas gotas de una sustancia volátil al
agua de la cubeta).

Montaje de los cortes sobre su soporte:

Es imposible manipular con un instrumento estos cortes, ya que son muy frágiles y ultra
finos. La tira formada por la sucesión de varios cortes será extendida sobre su soporte
definitivo que generalmente es una rejilla de cobre muy fina, recubierta o no por una
membrana. La rejilla sostenida con el extremo de una pinza fina se sumerge en la cubeta y
se desplaza horizontalmente debajo de la tira que se quiere extraer y luego se retira de la
cubeta al mismo tiempo que la tira, al cual queda depositada sobre la membrana que
recubre la cara superior de la rejilla.

5.4. IMPREGNACIÓN DE LOS CORTES ULTRAFINOS.

El contraste de la imagen de un corte ultra fino es con frecuencia insuficiente por lo que es
necesario aumentarlo mediante los reforzadores de contraste comúnmente
llamados “colorantes electrónicos”. Se utilizan para este fin sales de metales pesados
susceptibles de fijarse sobre ciertos elementos celulares, generalmente las membranas.

Se utiliza en la mayoría de los casos una técnica de impregnación sencilla que consiste en
hacer flotar durante un cierto tiempo la cuadrícula previamente invertida, es decir, con los
cortes hacia abajo, sobre la superficie de la solución de una sal de metal pesado, por
ejemplo acetato de uranilo y citrato de plomo.