Manual

GUIA DE PRÁCTICAS LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA GENERAL
ADRIANA PABON
ROGER VALLE
JORGE ARBOLEDA
ANTONIO INSIGNARES
Universidad del Atlántico

Facultad de Ciencias Básicas
Programa de Biología
Barranquilla, 2013
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
CURSO: Microbiología General
CÓDIGO: 20404-20407
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GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA
CONTENIDO
Página
INTRODUCCIÓN 4
NORMAS DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO 5
PRECAUCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO 5
EVALUACION 7
PLAN DE TRABAJO 8
LISTA DE MATERIALES (POR GRUPO) 8
LABORATORIO No. 1 9
DISTRIBUCION Y UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS 9
LABORATORIO No. 2 12
TÉCNICAS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS 12
TÉCNICAS DE COLORACIÓN BACTERIANA (TENCIÓN SIMPLE) 21
TÉCNICAS DE COLORACIÓN BACTERIANA (TENCIÓN DIFERENCIAL) 28
LABORATORIO No. 5- 7 32
METABOLISMO BACTERIANO 32
LABORATORIO No.8-9 38
METODO PARA EL RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS VIABLES EN UNA MUESTRA 38
LABORATORIO No.9. 42
ESTIMACIÓN DEL NÚMERO DE BACTERIAS POR MÉTODOS INDIRECTOS (TURDIMETRÍA) 42
LABORATORIO No.10 45
SENBILIDAD BACTERIANA 45
LABORATORIO No.11 47
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HONGOS 47
LABORATORIO No.12. 49
ALGUNOS PARASITOS DE IMPORTANCIA HUMANA 49
LABORATORIO No.13. ¡Error! Marcador no definido.
VIRUS ¡Error! Marcador no definido.
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NORMAS GENERALES DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO
INTRODUCCIÓN
Estas prácticas proponen introducir al estudiante en el conocimiento de las

principales técnicas y procedimientos utilizados en Microbiología experimental, lo
cual complementado con los conocimientos teóricos, le servirá de herramienta
para continuar estudios avanzados, para Ia detección de problemas y el
planteamiento de soluciones a éstos. Las prácticas se harán de forma secuencial
buscando interrelación y coherencia con los conceptos teóricos del curso de
Microbiología, sin que esto, se constituya en una camisa de fuerza para el
desarrollo del mismo.
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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Aunque las normas de conducta varían de un laboratorio a otro, en el laboratorio

de Microbiología es fundamental que se tengan en cuenta y se cumplan ya que se
trabaja con microorganismos y material estéril. El cumplimiento de éstas,
garantizarán Ia seguridad de todos y Ia confiabilidad de los resultados obtenidos.
1. Debe llegar puntualmente a las sesiones de Laboratorio
2. No se debe comer, fumar, ni beber en el laboratorio.
3. Evite llevar objetos no estériles a Ia cara, boca y ojos.
4. Use bata o blusa de laboratorio limpia.
5. Nunca retire los cultivos de microorganismos del Iugar de trabajo.
6. Si quiebra una preparación en fresco con uno de los objetivos del
microscopio, no Ia limpie con Ia mano o pañuelo; sino que debe informar al
profesor.
7. Flamee el asa antes y después de usarla.
8. Cuando tenga el asa bacteriológica cargada con algún cultivo de
microorganismos, no se desplace de cada parte a otra, pues puede crear
aerosoles. Trabaje solo en su puesto.
9. Marque cuidadosamente todos los cultivos y las preparaciones que de ellos
se hacen. lncube en el lugar asignado por el profesor o monitor
10. AI terminar el laboratorio, limpie Ia superficie de Ia mesa de trabajo descarte
cultivos y el material que no necesite. Deje todo el material de trabajo en su
respectivo puesto.
11. Lave sus manos con agua y jabón al terminar su trabajo.
PRECAUCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO
Tenga en cuenta que el microscopio que se le entrega por grupo al iniciar el

semestre será una herramienta valiosa para su trabajo en el laboratorio, por ser un
instrumento delicado, de precisión y costoso, es importante que tenga presente las
recomendaciones para su conservación y buen uso.
1. Evite tocar con los dedos las lentes del microscopio.

1. No olvide retirar el aceite de inmersión del objetivo de alto poder ó 100X al
finalizar Ia práctica. Utilice siempre el material adecuado para ello.
2. No deje placas montadas en el microscopio.
3. Prenda Ia lámpara únicamente al momento de iniciar sus observaciones.
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4. Cuando no lo esté usando, baje Ia intensidad de Ia lámpara (no Ia apague).

5. No retire ni afloje los lentes del microscopio.
6. AI iniciar su trabajo en el laboratorio, revise el equipo y el material a utilizar,
si observa alguna anormalidad, informe al profesor, auxiliar o al monitor.
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EVALUACION
La evaluación del laboratorio se hará con base en Ia realización de pruebas cortas

(quices), presentaciones y notas de seguimiento, las cuales serán definidas al
iniciar cada semestre, teniendo en cuenta las normas académicas vigentes.
CONTENIDO DE LAS NOTAS DE SEGUIMIENTOS O INFORME DE LABORATORIO
Cada informe deberá ser entregado semanalmente y será realizado de forma

grupal o individual, según como lo defina el docente. El informe debe contener las
siguientes partes, según las normas del ICONTEC:
Resumen: Debe contener la información necesaria para darle al lector una idea
precisa de la actividad realizada, la metodología, los resultados obtenidos y las
conclusiones (Máximo 250 caracteres).
Introducción: Debe responder al “porqué y para qué se realizó esta actividad”.
Debe contener el contexto teórico en el cual se ubica el tema, por ello requiere de
una revisión bibliográfica previa sobre la temática a tratar (Máximo 250 palabra).
Objetivos: Debe responder al “que de la práctica” realizada. Se recomienda
formular un solo objetivo general, coherente con el laboratorio llevado a cabo, y los
objetivos específicos necesarios para lograr el objetivo general.
Metodología: Describe en forma organizada y precisa, el “cómo se alcanzó” cada
uno de los objetivos propuestos. Deben detallarse los materiales y equipos
utilizados durante la práctica, así como los procedimientos realizados, técnicas,
actividades y demás estrategias metodológicas que se requirieron (Máximo 250
palabra).
Resultados: Se detallan los logros obtenidos con los procedimientos realizados.
Se puede recurrir a esquemas, tablas, gráficos o dibujos para demostrar el
conocimiento adquirido.
Conclusiones: Permiten evidenciar, de modo concreto, claro y preciso el logro de
los objetivos señalados, y debe estar apoyadas y relacionadas con el
conocimiento teórico.
Bibliografía: Anotar las tres referencias principales en los cuales se apoyó.
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PLAN DE TRABAJO
1. AI iniciar cada practica se hará una discusión sobre el laboratorio anterior.

Usted debe traer los resultados obtenidos durante Ia lectura para ser
discutidos y complementados con los de sus compañeros.
2. Llegue siempre al laboratorio con un conocimiento completo de Ia práctica
que va a realizar. Esto le ahorra tiempo, le permite obtener mejores
resultados y una mayor comprensión.
3. Las técnicas de laboratorio correspondientes a Ia práctica que se va a
realizar, serán explicadas y demostradas por su profesor.
4. Traiga siempre a cada práctica su libreta de anotaciones y el material
solicitado. Anote cuidadosamente todos los resultados obtenidos.
LISTA DE MATERIALES (POR GRUPO)
Cada grupo de trabajo estará conformado por 3-4 estudiantes, los cuales
realizarán durante todo el semestre las prácticas de laboratorio. Cada grupo debe
tener los siguientes materiales:
1. Bata de laboratorio (cada estudiantes)
2. Un Marcador (Sharpie)
3. Un encendedor
4. Una botella de jabón líquido
5. Dos rollos de cinta de enmascarar (1 cm y 2 cm)
6. Un paquete de papel de arroz
7. Un tapa bocas y gorro
Además de los implementos que debe tener cada grupo de trabajo, el curso debe
entregar los siguientes materiales al monitor asignado:
1. Una botella de alcohol antiséptico
2. Una bolsa de detergente en polvo (2, 5 kg)
3. Un par de guantes para lavado
4. Dos rollos de papel absorbente (papel toalla)
5. Una bolsa de algodón (para torundas)
6. Dos rollos de papel aluminio (3 metros)
7. Tres caja de portaobjetos (50 láminas)
8. Una caja de cubreobjetos
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LABORATORIO No. 1
DISTRIBUCION Y UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales. Pueden estar
localizados en suelo, agua, aire, alimentos, tracto intestinal, piel y otros órganos de
animales, el hombre y otros seres vivos. Solo unos pocos lugares en Ia naturaleza como
cráteres de volcanes activos y tejidos sanos de órganos internos del hombre y animales
están libres de ellos.
Su amplia distribución puede ser demostrada exponiendo medios estériles al contacto con
el medio ambiente y diferentes superficies.
En nuestro medio se encuentra una gran variedad de microrganismos suspendidos en el

aire o sobre superficies, por lo cual, en el laboratorio se deben tomar las precauciones
necesarias para evitar Ia contaminación de medios de cultivo, soluciones y equipos a
utilizar.
OBJETIVOS
1. Conocer algunas de las técnicas utilizadas para demostrar Ia existencia de
microorganismos en un ambiente determinado.
2. Distinguir las diferentes formas de crecimiento de estos microorganismos en los
medios de cultivo.
MATERIALES
1. Cajas de Petri con agar nutritivo

2. Escobillón de algodón estéril
3. lncubadora
PROCEDIMIENTO
 Muestras de Ia población bacteriana ambiental: Coloque una caja de Petri
sobre cualquier Iugar del laboratorio, destápela y déjela expuesta al medio
ambiente durante 15 minutes. Después de este periodo tápela y márquela
adecuadamente. lncube dejando Ia caja invertida a 37 °C de 24 a 48 horas.
 Bacterias en Ia superficie de Ia mesa de trabajo: Tome un escobillón y frótelo

sobre Ia superficie de Ia mesa de trabajo, levante Ia tapa de Ia caja de Petri y
aplique el escobillón sobre un extremo de Ia superficie de agar, hacienda luego
estrías con el asa estéril según figura No. 1 (No rompa el agar). Tape Ia caja,
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inviértala y márquela adecuadamente, incube a 37°C por un tiempo de 24 a 48

horas.
 Microorganismos de mucosas y de piel: Con un escobillón estéril frótelo sobre

cualquier parte de Ia superficie del cuerpo o insérteselo en Ia nariz o carrillo de la
boca y frote suavemente Ia mucosa de Ia misma. Puede ser también un cabello,
aliento, huella digital, etc. inocule una caja de agar nutritivo como lo hizo en el
caso anterior. Tape Ia caja, inviértala adecuadamente, incube a 37 °C por un
tiempo de 24 a 48 horas.
RESULTADOS
Después del período de incubación, observe cada una de las cajas inoculadas. Note las
diferencias entre las colonias de acuerdo a las siguientes características:
1. Color
2. Forma
3. Tamaño
4. Cantidad de crecimiento (escaso, moderado, abundante)
Registre estos datos en el cuaderno de notas o en el formato de preinforme que será

documentado con fotos o dibujos de los resultados obtenidos.
Figura 1. Manera de inocular una caja de Petri con Agar Nutritivo

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CONSULTAR SOBRE
 Distintos tipos de medios de cultivo.
 Preparación y esterilización de medios de cultivo.
 Métodos de esterilización
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LABORATORIO No. 2
TÉCNICAS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
INTRODUCCIÓN
En Ia naturaleza, las bacterias hacen parte de los diferentes ecosistemas. Como los
demás seres vivos, para su crecimiento necesitan nutrientes apropiados y condiciones
ambientales optimas, tales como pH, presión osmótica, oxígeno, temperatura y humedad
entre otros.
Para el cultivo, aislamiento, identificación y determinación de las actividades metabólicas
de las bacterias en el laboratorio se utilizan medios adecuados, los cuales según su
consistencia pueden ser sólidos, semi-sólidos y líquidos; esta consistencia se obtiene por
Ia adición de un polisacárido denominado agar-agar extraído de algas marinas del genero
Gellidium, su concentración en el medio sólido es de 1,5% a 2%, en el semi-solido de
0,5% y los medios líquidos son sin agar.
Los medios simples se preparan con agua, extracto de carne, peptona, extracto de
levadura, sales inorgánicas y carbohidratos. A algunos medios se les adicionan
sustancias como: Líquido ascítico, vitaminas, antibióticos, colorantes, sales biliares,
sangre y suero o glicerina, obteniéndose de esta forma, medios enriquecidos, de
enriquecimiento, diferenciales, selectivos y de transporte
En el aislamiento de bacterias se utilizan varias técnicas, una de las cuales es la siembra

por estrías en superficie que busca agotar Ia muestra sobre Ia superficie del medio para
obtener colonias separadas y poder observar sus características
Es importante tener en cuenta que la inoculación de los microorganismos en los medios

de cultivo, siempre deberá realizarse en condiciones asépticas (cerca del mechero o en
campana de flujo laminar), que limitan la presencia de microorganismos contaminantes.
OBJETIVOS
1. Conocer los métodos más utilizados para el aislamiento y cultivo de bacterias a
partir de diferentes muestras.
2. Conocer Ia composición y el uso de los diferentes medios de cultivo utilizados en
el laboratorio.
3. Diferenciar las características de crecimiento de las bacterias, según el medio de
cultivo utilizado.
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MATERIALES Y REACTIVOS
 1 caja de Petri con agar nutritivo (por grupo de trabajo)

 1 caja de Petri estéril vacía
 20 mL de agar nutritivo fundido y temperado a 45°C
 1 tubo con agua destilada estéril
 1 tubo con caldo nutritivo
 1 tubo con agar nutritivo en plano inclinado
 1 asa de inoculación
 1 aguja de inoculación
 1 Mechero de alcohol
 1 encendedor
 Cinta de rotular
 Marcador (Sharpie)
 Cepa Gram positivas (Staphylococcus aureus) suministrada por el profesor
 Cepa Gram negativa (Escherichia coli) suministrada por el profesor
PROCEDIMIENTO
 Cultivo en cajas de agar: siembra por estrías cruzadas en la superficie para

obtener colonias separadas. Proceda de la siguiente manera:
a. En la parte posterior externa de la caja y con la ayuda del marcador realice
una división en cuatro cuadrantes. Tome una muestra con el asa
previamente flameada y fría, inocule la muestra haciendo 4-5 estrías
simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja y
cierre la caja.
b. Flamee el asa de inoculación y gire la caja en un cuarto. Abra nuevamente
la caja y enfrié el asa tocando la superficie del medio lejos de la zona de
estrías recién hechas.
c. Roce con el asa una vez la superficie del primer cuadrante y haga un
segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante.
d. Repita el procedimiento b y c en el tercer cuadrante y efectué la siembra en
el último cuadrante sin flamear el asa y haciendo estrías más abiertas.
e. Incube las cajas de Petri a 37°C durante 24 a 48 horas, colocándolas en
forma invertida para evitar que el agua de condensación caiga sobre el
cultivo.
 Cultivo en tubos con caldo nutritivo: siembre un cultivo puro de la cepa

asignada por el profesor de la siguiente manera:
a. Tome el tubo que contiene el cultivo puro, retire la tapa del tubo y flamee la
boca del tubo.
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b. Introduzca el asa en el tubo sin tocar las paredes y tome un poco del
cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tápelo y déjelo en una gradilla.
c. Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra,
destápelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa
con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotación con el asa para
emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca
del tubo y tape.
d. Esterilice el asa en el mechero después de usarla.
e. Incube los tubos a 37ºC por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido
 Cultivo en tubos con agar inclinado:

Procede de la misma forma que en la siembra anterior pero con la aguja de
inoculación realice una punción y estríe en el plano inclinado.
RESULTADOS
Después del período de incubación, observe cada una de las cajas y tubos inoculados.
Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa. De acuerdo a sus
observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema.
Morfología colonial de Cultivos Bacterianos

muestra
E. coli S. aureus problema
Aislamiento por estría
cruzada
Forma
Color:
Tamaño (mm):
Borde:
Superficie:
Aspecto:
Elevación:
Consistencia
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Descripción morfológica de cultivos puros en tubos de cultivo

E. coli S. aureus muestra problema
Tubos inclinados de agar
nutritivo
Crecimiento
cultivo en Tubos con caldo
Crecimiento:
color:
Figura 2. Método para inocular las cajas de Agar

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Figura 3. Método para inocular tubos con agar inclinado

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Figura 4. Descripción de las colonias en cajas con Agar

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Figura 5. Diferentes tipos de crecimiento en agar inclinado

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Figura 6. Formas de crecimiento en la superficie de un medio líquido

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CONSULTAR SOBRE
 ¿Qué es el agar y de donde se obtiene?

 ¿Por qué el agar nutritivo es un medio general para el cultivo de bacterias?
 ¿Cuáles son las ventajas de un cultivo puro?
 ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen?
 ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia?
 Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo
fuente o del tubo a ser inoculado.
 Cuando tomas un inóculo de una caja de Petri. ¿Por qué es necesario tocar una
parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
 ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos
de siembra?
 ¿Por qué las cajas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación?
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LABORATORIO No. 3
TÉCNICAS DE COLORACIÓN BACTERIANA (TENCIÓN SIMPLE)
INTRODUCCIÓN
La observación microscópica de las bacterias nos permite diferenciar tres de las formas
más típicas que son: cocos, bacilos y espirales entre otras. Los cocos son células
esféricas que se pueden agrupar en parejas (Diplococos), racimos (Estafilococos),
cadenas (Estreptococos), de a cuatro (Tétradas) ó en cubos (Sarcinas). Estas formas de
agrupación están determinadas genéticamente.
Los bacilos son células en forma de bastón o varilla que pueden presentarse
individualmente o agrupadas al asar, formando cadenas, empalizadas o estacas.
Las espirales son células que presentan forma helicoidal y generalmente no se agrupan.
Las anteriores formas bacterianas se pueden observar per medio de los siguientes
métodos:
a. Preparaciones no coloreadas: Con este método se observan las bacterias vivas,

lo cual hace que podamos detectar con facilidad Ia movilidad en las que Ia poseen
y su forma.
b. Preparaciones coloreadas: Como las bacterias son incoloras y tienen el mismo

índice de refracción del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlas
visualizar mejor. Los métodos para observar bacterias, proporcionan las siguientes
ventajas:
 Un contraste entre Ia bacteria y el medio que Ia rodea, permitiendo diferenciar los

tipos morfológicos bacterianos.
 Una visualización de las estructuras internas y externas tales como: endosporo,
equivalente nuclear, gránulos citoplasmáticos, pared celular, capsula y flagelo.
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Los colorantes más utilizados para Ia observación de bacterias son compuestos orgánicos
los cuales presentan unas características moleculares que permiten realizar diferentes
técnicas de coloración. Químicamente, un colorante puede ser definido como un
compuesto orgánico que contiene un anillo bencénico unido a un grupo cromóforo y un
grupo auxócromo (Figura 7).
Figura 7. Composición química de un colorante o tinte.
La capacidad de un colorante de unirse a un componente celular como las proteínas o los

ácidos nucleícos depende de la carga iónica del cromógeno así como, de la carga de la
sustancia a ser teñida.
La carga del ion coloreado, puede ser un Anión o un Catión, según el caso, los colorantes
se denominan:
Colorante Ácido: Son aquellos en los que el cromógeno al ser ionizado toma una carga
negativa presentando una fuerte afinidad por constituyentes celulares con carga positiva.
Ejemplo: Anión coloreado EO- y catión incoloro Na+: Eosinato de Sodio (EO- Na+)
Colorante Básico: Son aquellos en los que el cromógeno al ser ionizado toma una carga
positiva presentando una fuerte afinidad por constituyentes celulares con carga negativa
Ejemplo: Cation coloreado AM+ y anión incoloro Cl-: Clorhidrato de Azul de Metileno (Cl-
AM+)
En la actualidad son muchas las técnicas de tinción que se encuentran disponibles para
visualización, diferenciación y separación de microorganismos en términos de sus
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características morfológicas y estructuras celulares. Un resumen de los procedimientos

más usados para estos propósitos se encuentra en la figura 8.
Figura 8. Tipos de colorantes o tintes.
Para la aplicación de cualquier técnica de tinción se requiere de la preparación previa de

un “frotis”. Esta preparación no es difícil pero requiere de mucho cuidado por lo que se
recomienda seguir meticulosamente las siguientes reglas.
1 Limpieza del portaobjeto: La limpieza de los portaobjetos es esencial para la

preparación del frotis y las grasas o aceites de los dedos que pueden estar sobre
la lámina o portaobjeto deben ser removidos lavándolos con agua y jabón o
detergente y enjuagándolas con alcohol al 95%. Luego de ser lavados, colóquelos
sobre un papel toalla hasta que esté listo apara usarlos.
2 Preparación del Frotis: un frotis denso es absolutamente esencial. Un buen frotis
es aquel en el que al secarse aparece sobre la lámina una fina capa o película.
Los frotis se pueden realizar de un caldo de cultivo o un agar de la siguiente
manera:
a. Caldos: Con la ayuda de una asa de aro estéril, tomar una o dos veces
suspensión de bacterias, las cuales se deben colocar directamente sobre la lámina
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o portaobjetos y esparcir la muestra con movimientos circulares en un área de

aproximadamente un centímetro de diámetro.
b. Agares: Colocar sobre la lámina una gota de solución salina al 0,85% y con la
ayuda de un asa de inoculación estéril (de aguja) tocar suavemente la colonia de
donde desea tomar la muestra teniendo cuidado de no tomar un exceso de células
ni medio de cultivo. Posteriormente homogenizar las células con la gota de
solución salina y con movimientos circulares realizar un esparcido de
aproximadamente un centímetro de diámetro. Dejar secar completamente el frotis
teniendo precaución de No frotarlo ni sacudirlo en el aire.
3 Fijación al calor: Para evitar que los microorganismos sean barridos o pérdida de la
muestra durante los procesos de lavado durante la tinción, la muestra debe fijarse o
adherirse a la lámina mediante calor, que hace que las proteínas se coagulen. La
fijación se obtiene pasando rápidamente dos a tres veces el frotis sobre la llama del
mechero.
OBJETIVOS
1 Conocer algunos de los métodos de observación de las bacterias.
2 Diferenciar las formas de acción de los colorantes, sobre Ia célula, de acuerdo al
carácter químico de éstos (ácidos o básicos).
3 Diferenciar las características morfológicas, de agrupación y de tinción de las
bacterias observadas al microscopio
MATERIALES Y REACTIVOS:
 Colorantes (Azul de metileno, Cristal violeta, Carbol fucsina)

 1 asa de inoculación
 1 aguja de inoculación
 1 Mechero de alcohol
 1 encendedor
 Cinta de rotular
 Marcador (Sharpie
 Microscopio
 Puente de coloracion
 Frasco lavador
 Aceite de inmersion
 Papel de aroz
 Papel toalla
 Láminas o portaobjetos
 Cultivos en agar de 24 horas de E. coli y Bacillus sp. suministrados por el profesor
 Cultivos en caldo de 24 horas de S.aureus suministrados por el profesor
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PROCEDIMIENTO
1 Preparaciones no coloreadas. (Preparación en fresco).

a. Cuando Ia muestra a analizar se encuentra en un medio líquido, proceda así: Con
el asa estéril deposite una gota de cultivo bacteriano en el centro de un
portaobjetos limpio. Coloque un cubreobjetos o laminilla sobre Ia gota evitando Ia
formación de burbujas. Observe con objetivos de 1OX y 43X. Haga esquemas y
describa lo observado.
b. Si Ia muestra a analizar se encuentra en medio solido se debe proceder de Ia
siguiente forma: coloque una gota de solución salina sobre un portaobjetos, toque
con el asa una colonia de cultivo y haga con esta muestra una emulsión en Ia
gota. Cubra Ia preparación con el cubreobjetos. Observe al microscopio. Haga
esquemas y describa lo observado.
2. Preparaciones coloreadas
a. Con colorantes básicos. (Coloración simple o directa).
Los colorantes básicos mas empleados son: azul de metileno, cristal violeta,
safranina, carbofucsina y verde de malaquita.
El procedimiento para preparar y fijar las bacterias para Ia tinción es el siguiente:

a. Prepare en láminas separadas el frotis de cada microorganismos siguiendo el
procedimiento discutido previamente.
b. Siguiendo las instrucciones del docente cubra los frotis con el colorante indicado,
usando el tiempo de exposicion adecuado para cada uno.
Carbol fucsina 15 a 30 segundos; cristal violeta 20 a 60 segundos; azul de
metileno 1 a 2 minutos.
c. Lave el frotis con agua de la llave para remover el exceso de colorante. Coloque la
lámina o portaobjetos paralela al flujo de agua para reducuir la perdida de
microorganismos.
d. Seque los alrededores del frotis con papel toalla y deje secar el frotis al aire.
e. Repita el procedimiento para cada organismo usando un colorante diferente.
f. Examine cada tinción bajo el objetivo de inmersión.
RESULTADOS.
1. Dibuje un campo representativo de cada organismo.

2. Describa la forma y arreglo del organismo.
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Figura 7. Tinción directa de colorante básico

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CONSULTAR SOBRE
 ¿Por qué los colorantes básicos son más efectivos para las tinciones bacterianas
que los tintes ácidos?
 ¿Una tinción simple puede ser usada para identificar algo mas que las
caracteristicas morfologicas de un microorganismo? Explique.
 Si se te olvidara fijar la muestra durante la aplicación del procedimiento de tinción
simple, ¿Qué diferencias crees que encontrarias al mirar tu muestra en
comparación con unca correctamente fijada?
 Si durante una charla de amigos uno de ellos derrama café sobre tu camiseta y
luego de varias labadas no puedes recuperar su color original; ¿podemos decir
que el café es un verdadero tinte biologíco o es solo una sustancia capaz de
impartir color? Explica tu razonamiento.
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LABORATORIO No. 4
TÉCNICAS DE COLORACIÓN BACTERIANA (TENCIÓN DIFERENCIAL)
INTRODUCCIÓN
Las tinciones diferenciales son aquellas que se usan para diferenciar de manera más
explícita los microorganismos. Las tinciones diferenciales más importantes que se
empleanen bacteriología son las de Gram y la tinción ácido-resistente. Ambas tinciones se
utilizan para obtener información acerca de la composición de las capas de la pared
celular de las células bacterianas.
Tinción de Gram: El bacteriólogo Danés Christian Gram, descubrió en 1884 un método

de coloración el cual ha dividido a las bacterias en dos grupos, el de las gram positivas y
el de las gram negativas. La técnica esta basada en Ia capa gruesa de peptidoglicano que
poseen las bacterias gran positivas que es capaz de retener el complejo colorante-
mordiente (cristal violeta- durante Ia decoloración con el alcohol acetona, que provoca
una deshidratación de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces el
complejo en el interior de la célula.
Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano pero rica en
lípidos como el lipopolisacarido o LPS que son disueltos y se permite la salida del
complejo colorante-mordiente (cristal violeta-yodo), perdiendo el color purpura propio del
cristal violeta y deben ser coloreadas nuevamente con el colorante secundario o de
contraste como .la safranina, que es un colorante de contraste de color rojo, dicho
colorante da un color rojo claro a las células decoloradas.
Este método de coloración diferencial constituye una de las técnicas más importantes en
el trabajo bacteriológico, pues Ia información que da, ayuda a Ia identificación bacteriana.
Tinción de Ziehl-Neels: Esta coloración fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich
para demostrar la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras
clínicas de pacientes. La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de bacterias:
bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) positivas y BAAR negativas.
Las paredes celulares de ciertos microorganismos contienen ácidos grasos (ácidos

micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.
Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis
y M. marinum y los parásitos coccídeas como Cryptosporidium parvun se caracterizan por
sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen
requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene
lípidos como el colesterol y ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua,
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provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no

puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética
de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las
bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul.
OBJETIVOS
1 Adquirir destreza en Ia técnica de coloración de Gram.

2 Diferenciar con base en Ia aplicación de esta técnica las bacterias gram positivas
de las gram negativas.
3 Conocer los diferentes campos de aplicación de esta técnica.
MATERIALES
 Portaobjetos
 Papel absorbente
 Puente de coloración
 Mechero de alcohol
 Aceite de inmersión
 Reactivos requeridos para Ia coloracion de Gram: Cristal violeta, Safranina, Lugol y
alcohol acetona.
 Asas bacteriológicas
 Microscopio
 Cultivos de estreptococos, estafilococos, bacilos Gram (+) y Gram (-)
PROCEDIMIENTO
1. Prepare, seque y fije Ia muestra con se realizó en la laboratorio anterior (# 3).

2. Cubra el extendido con cristal violeta. Déjelo actuar durante un minuto. Lave el
exceso de colorante con agua.
3. Cubra el extendido con solución yodada de Gram (Lugol) durante un minuto. Este
actúa como un mordiente. Lave con agua.
4. Decolore con alcohol acetona durante 20 a 30 segundos aproximadamente y lave
con agua.
5. Cubra el extendido con safranina. Déjela actuar durante un minuto.
1 Lave con agua, seque y observe al microscopio con el objetivo de inmersion.
RESULTADOS.
1. Dibuje un campo representativo de cada organismo.

2. Describa la forma y arreglo del organismo.
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CONSULTAR SOBRE
 ¿Cuál es la ventaja de la técnica de tinción diferencial frenta a la de tinción simple?

 Diga cual es la función de Cada uno de los siguientes reactivos en una tinción
diferencial: tinte primario, contratinte, agente decolorante, mordiente
 ¿Por qué es escencial que el colorante primario y el contra tengan colores
contrastantes?.
 ¿Cúal cree usted que es el paso más crucial en la coloración de Gram? explique.
 Suponga que el laboratorio de hoy fue aplasado y se realiza la proxima semana
con el cultivo de B. cereus que tiene 9 días de antigüedad. Al realizar la tinción de
Gram usted observa celular teñidas de violeta intenso y otras de color rosa.
Proponga una explicación a este reultado
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Figura 8. Procedimiento para Ia tinción de Gram

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LABORATORIO No. 5- 7
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCIÓN
El metabolismo bacteriano se define como el conjunto de reacciones químicas que

desarrolla Ia célula. Estas reacciones incluyen procesos de obtención de energía como
son: la descomposición de moléculas orgánicas en las bacterias quimiótrofas
(catabolismo) o la captación de luz para el caso de las fotótrofas, así como de síntesis de
material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo). Todas las reacciones
metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría funcionan dentro de la célula
por lo que se conocen como endoenzimas, hay también exoenzimas principalmente
lashidrolíticas que son liberadas por la célula para catalizar reacciones fuera de ésta.
El número y Ia clase de enzimas bacterianas son diferentes, debido a que cada enzima
está fabricada bajo un control genético, per lo cual se dan variaciones en Ia utilización de
los sustratos. Estas variaciones se utilizan a su vez para ayudar a determinar los
diferentes géneros y especies bacterianas.
En el laboratorio, es posible conocer las características metabólicas de los

microorganismos, inoculándolos en diferentes medios de cultivo, con sustratos que
pueden utilizar como fuente de energía, fuente de carbono y de otros nutrientes
esenciales para su crecimiento.
La mayoría de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de carbono y de energía.

Al entrar a la célula, la glucosa es oxidada en forma incompleta (fermentación) o completa
(respiración) dependiendo de la presencia de oxígeno y de las capacidades enzimáticas
de los microorganismos.
En la fermentación, los microorganismos obtienen 1-2ATP/mol de glucosa y liberan ácidos

orgánicos u otras pequeñas moléculas orgánicas como productos metabólicos; mientras
que las bacterias y levaduras de catabolismo respiratorio obtienen mayor cantidad (36-3
8ATP /mol de glucosa), CO2 y agua. Algunas especies microbianas pueden ser de tipo
respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condiciones de oxigenación.
Se han propuesto numerosas pruebas bioquímicas en medios de cultivo con indicadores

de pH para detectar la producción de ácido o álcali; con inhibidores selectivos como bilis,
cianuro, colorantes, sulfuros, etc., que facilitan la determinación de diferentes actividades
metabólicas como son: la capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa,
sacarosa), catabolizar aminoácidos y urea, la producción de enzimas específicas de tipo
endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas ,etc.
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Como se ha observado en las prácticas anteriores, algunas bacterias y levaduras tienen

características coloniales y microscópicas muy similares, lo que no permite decidir si dos
cultivos bacterianos o de levaduras morfológicamente similares pertenecen a una misma
especie.
Con algunas pruebas bioquímicas es posible su diferenciación e incluso su identificación,

cuando el número de pruebas es suficientemente amplio.
Pruebas Bioquímicas de algunas Bacterias Entéricas Gram Negativas
Prueba de carbohidratos: Se utiliza el agar Kliger inclinado, en cual contiene dos

hidratos de carbono: Lactosa a una concentración del 1% y glucosa en concentración de
0,1 %, sales de hierro y rojo de fenol como indicador de pH. Es utilizado para diferenciar
los bacilos Gram negativos de este grupo par su capacidad para desdoblar los azucares y
liberar sulfuros. La fermentación de los azucares está indicado por un cambio de color del
rojo inicial al amarillo. En algunos casos hay producción de gas o de H2S; este último se
manifiesta por un ennegrecimiento del medio.
Prueba del citrato: Determina si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como fuente
de carbono. Se utiliza el agar citrato de Simmons inclinado, el cual contiene como
principal componente citrato de sodio como única fuente de carbono y azul de bromotimol
como indicador de pH. Las bacterias que lo utilizan alcalinizan el medio, lo cual se
manifiesta con un cambio del color verde a azul.
Prueba de motilidad: Establece Ia diferencia entre bacterias móviles y no móviles. Se

utiliza el agar blando, el cual es un medio semisólido que permite fácilmente el
desplazamiento de las bacterias. La movilidad de los microorganismos se manifiesta por
un crecimiento difuso alrededor de Ia línea de inoculación.
Prueba de hidrólisis de Ia Urea: Señala Ia capacidad de un microorganismo para

desdoblar Ia Urea por acción de Ia enzima ureasa y obtiene como resultado Ia formación
de amoníaco. El indicador de pH es rojo de Fenol. Los microorganismos que Ia utilizan
cambian el color amarillo inicial del medio rojo rosado.
Urea Ureasa Amoniaco + C02
Prueba de SIM: Con esta prueba se pueden observar tres reacciones:

1 Producción de ácido sulfidrico (H2S): Ayuda a diferenciar entre las especies de
bacterias capaces de producir ácido sulfídrico. El medio contiene aminoácidos
azufrados, que por acción enzimática de las bacterias producen un gas incoloro
(H2S), que al reaccionar con una sal pesada de citrato férrico de amonio produce
un precipitado negro insoluble (sulfato ferroso).
Cistina Desulfurasa cisteina Cisteina
Ácido pirúvico + H2S + NH3
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H2S + citrato férrico de amonio Sulfuro ferroso (precipitado negro).
2 Prueba del lndol: Señala Ia capacidad de las bacterias para oxidar el triptófano. La
acción enzimática de Ia triptofanasa produce varios metabolitos entre los cuales
esta el lndol.
Triptofano Triptofanasa lndol + Ácido pirúvico + Amoníaco
Desaminación
.
El indol producido se detecta adicionándole al cultivo dos o tres gotas del reactivo
de Kovacs (P-Dimetilaminobenzaldehido)
.
lndol +(Kovacs) anillo (color rojo violaceo) l
3 Prueba de motilidad En este medio se puede detectar Ia movilidad de las bacterias

que Ia poseen, siempre y cuando no haya producción de H2S que dificulta Ia
lectura. Cuando esto ocurre Ia motilidad se observa en el medio Agar blando
descrito anteriormente.
OBJETIVOS
1 Diferenciar Ia actividad bioquímica de las bacterias mediante Ia utilización

de medios de cultivo con sustratos específicos.
2 Analizar las pruebas bioquímicas utilizadas y con base en los resultados,
realizar Ia determinación de las bacterias
3 Comprender la importancia de las pruebas bioquímicas para la
caracterización e identificación de estos microorganismos.
MATERIALES
 Papel absorbente
 Mechero de alcohol
 Asas bacteriológicas
 2 cajas con agar almidón
 2 tubos con campana de Durham y 5mL de cada uno de los siguientes medios:
glucosa rojo de fenol, lactosa rojo de fenol, sacarosa rojo de fenol y manitol-rojo de
fenol.
 2 tubos con 7mLde medio SIM (Sulfuro, Indól, Motilidad)
 2 tubos con 7mL de medio TSI (triple azúcar hierro) o Klinger (dos azucares,
hierro) solidificados en forma inclinada
 2 tubos con 7mL medio de citrato de Simmons solidificados en forma inclinada
 2 tubos con 7mL de caldo urea
 Portaobjetos
 H202 (Peróxido de hidrógeno)
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 Suero humano o de conejo

 Cultivos en agar de 24 horas de Klebslella sp. Stafilococcus sp. Streptococos
sp., E. coli y Bacillus sp. gram (+) y gram (-) suministrados por el profesor
PROCEDIMIENTO
El profesor proporcionará los cultivos puros de Bacillus sp, E. coli, Klebslella sp. o
Stafilococcus sp. a cada uno de los equipos. Además de un cultivo problema.
Todos los tubos y cajas deben etiquetarse e inocularse de acuerdo a las
siguientes instrucciones:
1. Esterilice Ia aguja de inoculación.

2. Toque una colonia de Ia muestra a analizar
4 lnocule el TSI o Kliger, introduciendo Ia aguja hasta el fondo, luego sáquela y haga
una estría en zig-zag en Ia superficie del bisel.
5 Sin tomar una muestra y sin flamear Ia aguja, inocule el agar citrato de Simmons
hacienda estrías en Ia superficie del bisel.
6 Luego, sin flamear introduzca Ia aguja hasta Ia mitad del contenido del agar SIM.
7 lnocule el agar blando procediendo como en el literal anterior.
8 Finalmente y sin flamear Ia aguja, inocule el caldo urea agitándola.
9 lncube todos los tubos de estas pruebas a 37°C por 24 horas.
Nota: Además de estas pruebas, existen actualmente otras sofisticadas y rápidas que
permiten una determinación bastante confiable de las diferentes especies de bacterias,
ejemplo, el sistema API y Micro-ID.
RESULTADOS.
Hacer observaciones alas 24 y 48 horas de incubación y determine si hay crecimiento,

cambios en el color del indicador y producción de gas en la campana de Durham
comparando cada tubo problema con tubos control que contienen los mismos medios de
cultivo pero sin inoculación de microorganismos. Para Ia identificaci6n de las
Enterobacteriaceas utilice Ia Tabla No. 1.
Otras Pruebas Complementarias para Bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Fermentación de carbohidratos: Una amplia variedad de carbohidratos son

fermentados por bacterias y el patrón de fermentación es característico de ciertos géneros
y especies.
Así el conocimiento de Ia fermentación de carbohidratos por un organismo particular

ayuda a su determinación. Esta característica se puede determinar inoculando el
organismo dentro de un caldo de carbohidratos. Este medio esta compuesto
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esencialmente de caldo nutritivo adicionado con 0,5% del carbohidrato particular más un
indicador de pH y además contiene un tuba de Durham (pequeño tubito invertido dentro
del tubo con caldo). Puesto que los productos finales de Ia fermentación de los
carbohidratos son ácidos y gas, el indicador revelará Ia producción de ácido y el tubito
invertido atrapará el gas si este se produce.
Para esta prueba proceda de Ia siguiente manera:

1. Esterilice el asa.
2. lnocule el caldo de carbohidratos con una asada del cultivo a analizar.
3. Rotule bien los tubos e incúbelos a 37°C por 48 horas. Incube también un
tubo del caldo con carbohidratos sin inocula como como control.
Hidrólisis de almidón: Algunas bacterias producen enzimas (amilasa) capaces de

desdoblar las moléculas complejas de polisacáridos. Estas enzimas son extracelulares y
realizan Ia ruptura de los sustratos por medio de Ia hidrólisis. Así, Ia amilasa hidroliza el
almidón cuando los organismos que Ia producen se cultivan en un medio que contiene
este polisacárido (Agar almidón). Para esta prueba, proceda de Ia siguiente manera:
1. Divida una caja de Petri en cuatro cuadrantes.
2. Marque un cuadrante con Ia palabra control y las demás con su respectiva cepa.
4. lnocule el agar en el centro de cada cuadrante con Ia respectiva bacteria.
5. lncube a 37°C por 24 a 40 horas.
6. Después de Ia incubación cubra Ia superficie del agar con una solución de lugol,
este en presencia de almidón origina un color azul oscuro. Un halo transparente
alrededor de Ia colonia nos indica que Ia bacteria hidroliza el almidón. La ausencia
de halo significa un resultado negativo.
Prueba para Ia catalasa: Diferencia entre especies de bacterias que utilizan el oxigeno.
La catalasa es una enzima que esta relacionada con Ia capacidad de un organismo para
utilizar el oxigeno. Esta enzima cataliza Ia degradación del agua oxigenada en agua y
oxigeno, no se encuentra en los organismos anaerobios, lo cual produce en éstos Ia
muerte cuando se encuentran en presencia de oxigeno. Para esta prueba, proceda de Ia
siguiente manera:
1. Tome varias colonias de un cultivo de Staphylococcus spp. y colóquelas sobre un
portaobjetos limpio.
2. Agregue sobre las colonias una gota de H202 al 30%.
3. Observe Ia producción de pequeñas burbujas, lo que indica Ia presencia de Ia
catalasa en las bacterias. Repita el proceso con una cepa problema.
Prueba para Ia coagulasa: Señala Ia capacidad de ciertas bacterias para coagular el

plasma por Ia acción de esta enzima. El plasma humano o de conejo, coagula igual que si
fuera sangre entera. Esto se previene si se añade un poco de citrato de sodio
(anticoagulante general), el cual mantiene líquido el plasma. La coagulasa que es·una
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exoenzima elaborada par Ia mayoría de los Staphylococcus aureus invierte Ia acción del
anticoagulante (en este caso el citrato de sodio). Cuando a este plasma se le inocula Ia
cepa patógena del S. aureus, Ia coagulación se realiza tal como si no se hubiera añadido
citrato. Para esta prueba, proceda así:
2. Agregue 0,5 ml de plasma citratado a cada tubo de ensayo (2 tubos)
3. Tome una asada de colonias de S. aureus (coagulasa positiva) e introduzca en
uno de los tubos con plasma.
4. Proceda de igual forma con el tubo problema.
5. Observe por una o dos horas, revisando cada media hora. ·cuando el plasma ya
no fluya como al principio, Ia prueba es positiva, en caso contrario es negativa.
KLIGLER IMVIC
Carbox
Ureasa
Motilid
Lisina
Fondo Inclinación Indol Rojo Voges Citro
ad
de
Familia Enterobacteriaceae H2S
de Simmo
Metilo ns
1 Escherichia coli A A + + - - - V+ - V+
2 Shigella spp A K V + - - - - - -
3 Klebsiella spp A A V- V+/- + + - - V1 +
4 Enterobacter A A - - + + - + - +
aerógenes
5 Serratia marcescens A K - V + + - + Vd +
6 Salmonella spp A K - + - V + + - +
7 Citrobacter freundii A V2 V- + - + V+ + Vd -
8 Proteus vulgaris A K V + - + + + + -
9 Pseudomonadaceae
10 Pseudomona aerugin K K - - - + - + V -
A-Ácido
A- Ácido-gas
A- Ácido con producción lenta de gas
K- Alcalino
V- Variable
V- Variable
1
-Lento
2-Puede ser retardado
9: No es Enterobacteria
Tabla 1: Identificación de enterobacterias

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LABORATORIO No.8-9
METODO PARA EL RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS VIABLES
EN UNA MUESTRA
INTRODUCCIÓN
Los estudios que involucran el análisis de materiales como alimentos, agua, leche y en
algunos casos aire, requiere la cuantificación de los microorganismos presentes en dicha
sustancia y se han diseñados muchos métodos para conseguir esto, incluyendo conteo
directo al microscopio, uso de contadores electrónicos de células, métodos químicos para
la estimación de la masa celular o de constituyentes celulares, medida turbidimétrica y el
método de diluciones seriadas-conteo en caja. A continuación describiremos de modo
general cada uno de ellos:
 Conteo directo al microscopio: este método requiere el uso de una cámara de

conteo especializada llamada cámara de Petroff-Hauser o cámara de Neubauer,
en la que se cuenta un alícuota de suspensión de células y el número total de
células se determina matemáticamente. Este método tiene como ventaja el hecho
de ser muy rápido pero la desventaja es que tanto células vivas como muertas se
incluyen en el conteo.
 Contador electrónico de células: es un instrumento capaz de contactar

rápidamente el número de células suspendidas en un fluido conductor, que pasa a
través de un diminuto orificio por donde fluye una corriente eléctrica. Cuando una
célula pasa por el detector, aumenta la resistencia del líquido conductor
registrándose como una célula. Este método tampoco distingue entre celular vivas
o muertas y además es incapaz de diferenciar entre partículas inertes y células.
 Métodos químicos: el incremento de la turbidez en un cultivo es indicador de

crecimiento. En un turbidímetro la cantidad de luz transmitida disminuye
proporcionalmente al aumento del tamaño poblacional del cultivo. Este método es
rápido pero su mayor limitación radica en que sólo es sensible a suspensiones
celulares de más de 10 millones de células.
 Diluciones seriadas-conteo en caja: la mayor desventaja de los métodos

anteriores radica en su incapacidad de distinguir entre células vivas y muertas y la
mayoría de las veces se requiere el número de células viables. Para conseguir
esto comúnmente se usa el método de diluciones seriadas-conteo en caja. Este
método incluye una dilución seriada de una suspensión bacteriana en agua estéril
(blanco). Una vez diluidas las células un volumen conocido de éstas se colocan en
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el medio cultivo adecuado. Generalmente se vierte una cantidad conocida de la

suspensión celular en una caja de Petri vacío y estéril y posteriormente se vierte
en el mismo el agar fundido y se mezcla por rotación suave de la caja para
garantizar la distribución homogénea de las células. Las diluciones deben ser
hechas por duplicado para garantizar la exactitud. Posteriormente se incuban
durante toda la noche y con ayuda de un contador de colonia se cuenta el número
de colonias y las cajas seleccionadas para el conteo no deben tener menos de 30
ni más de 300 colonias. El número total de células por volumen de muestra se
obtiene multiplicando el número de células contadas en la caja por el factor de
dilución.
OBJETIVOS
1 Conocer algunos de los métodos de recuento de microorganismos.

2 Adquirir destreza en Ia aplicación de algunos de éstos métodos y determinar
cuantitativamente el número de células viables en un cultivo bacteriano.
MATERIALES
 Tubos con 20mL de agar nutritivo

 Tubos con 9 mL solución salina peptonada (SSP) estéril para diluciones.
 Cajas de Petri estériles
 Baño María con termostato
 Termómetro
 Gradillas
 Mecheros
 Pipetas estériles de 1mL
 Propipeteador
 Solución desinfectante
 Marcador
 Cultivo de 24-48 horas de E. coli en caldo nutritivo.
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PROCEDIMIENTO
1. Funda los tubos con agar y manténgalos a 45°C en el baño María con
termostato
2. Rotule el cultivo de E. coli como tubo número 1 y los tubos con 9mL de
agua destilada con los números del 2 al 8. Rotule las cajas de Petri como
1A, 1B, 2A, 2B, 3A y 3B.
3. Agite el tubo 1 para asegurarse que las células bacterianas estén bien
homogéneas y dispersas en el cultivo.
4. Con una pipeta estéril y asépticamente, transfiera 1mL del tubo 1 al tubo 2.
Descarte la pipeta en solución desinfectante.
5. Mezcle bien el tubo 2 y con una nueva pipeta trasfiera 1mL del tubo 2 al
tubo 3. Descarte la pipeta en la solución desinfectante.
6. Continúe haciendo las diluciones de cada tubo transfiriendo con una nueva
pipeta 1mL del tubo hasta llegar al tubo 8. Descarte la pipeta en la solución
desinfectante.
7. Adicione a cada uno de las cajas de Petri, los volúmenes de muestra como
se indica a continuación.
Caja Tubo Volumen

1ª Tubo 5 0,1mL
1B Tubo 6 1,0mL
2ª Tubo 6 0,1mL
2B Tubo 7 1,0mL
3ª Tubo 7 0,1mL
3B Tubo 8 1,0mL
8. Asegúrese que el agar este fundido y a 45°C. Seque la parte externa de los
tubos con un papel toalla. Usando técnicas asépticas, vierta un tubo de
agar dentro del tubo 1A y mezcle por rotación suave para asegurar una
distribución uniforme de las células en el medio.
9. Repita el paso el paso anterior con las demás cajas.
10. Una vez el agar se halla solidificado incube las cajas en posición invertida a
37°C durante 24 horas.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
1. Observe todas las colonias sobre las cajas. Las cajas que contengas más de 300
colonias no deben ser contados y serán reportados como “muy numerosos para
contar” (MNPC). Cajas con menos de 30 colonias serán reportados como “muy
pocas para contar” (MPPC). Cuente y reporte sólo las cajas que contengas entre
30 y 300 colonias.
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2. El número de organismos por mililitro del cultivo original de E. coli se calcula al

multiplicar el número de colonias contadas por el factor de dilución por el volumen
añadido en la caja así: Células/mL = Colonias contadas x Factor de dilución x vol.
añadido
Ejemplo:
Colonias contadas = 50
Dilución = 10-6
Volumen añadido = 1mL
Células/mL = 50 x 1.000.000 x 1
Células/mL = 50.000.000 o 5,0X107cel/mL
3. Consigne sus observaciones y cálculos en la siguiente tabla.
Caja Dilución Mililitros de la Dilución Número Número Número

en el tubo dilución final en de de promedio
añadidos a la la caja colonias bacterias de cel/mL
caja por mL de
muestra
1A
1B
2A
2B
3A
3B
CONSULTAR SOBRE
 ¿Cuál es la mayor desventaja de los métodos de conteo de microorganismos a

excepción del método empleado en este laboratorio
 Diferencie entre dilución y factor de dilución
 ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del método empleado en este laboratorio?
 si 0,1mL de una dilución 1X10-6 produce en una caja de Petri 56 colonias, calcule
el número de células por mL en el cultivo original.
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LABORATORIO No.9.
ESTIMACIÓN DEL CRECIMIENTO Y EL NÚMERO DE BACTERIAS POR
MÉTODOS INDIRECTOS (TURBIDIMETRÍA)
INTRODUCCIÓN
La determinación de la turbidez (turbidimetría) es un método práctico para controlar y

estimar el crecimiento bacteriano para algunos tipos de trabajo experimental. Cuando las
bacterias se multiplican en un medio líquido, éste se torna turbio o nebuloso por las
células y el instrumento que se utiliza para medir este efecto es un espectrofotómetro o
colorímetro. En este equipo un haz de luz se transmite a través de la muestra a una celda
fotoeléctrica y cuando la cantidad de bacterias aumenta, la luz se dispersa y menos luz
alcanza la celda fotoeléctrica. Este cambio de luz se registra en el instrumento como
porcentaje de transmisión. También se puede determinar como una medición logarítmica
del instrumento denominada absorbancia o densidad óptica (D.O), el cual se utiliza para
graficar el crecimiento bacteriano. Cuando las bacterias se encuentran en la fase
logarítmica de crecimiento o de muerte, la representación de la absorbancia frente al
tiempo forma una línea casi recta.
Es importante tener en cuenta para visualizar los primeros puntos o trazas de turbidez de
haber más de un millón de células bacterianas por mililitro de muestra y se precisan de 10
a 100 millones de bacterias por mililitro para que la suspensión se vuelvo lo bastante
turbia como para ser leída en un espectrofotómetro. Por lo tanto, la turbidemetría no es un
método útil para medir contaminación de líquidos con un número relativamente pequeño
de bacterias.
OBJETIVOS
 Conocer y estimar el crecimiento bacteriano mediante una curva de cinética de la
biomasa celular.
MATERIALES
 45 mL de caldo nutritivo
 Espectrofotómetro
 Gradillas
 Mecheros
 Pipetas estériles de 5mL
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 Propipeteador
 Solución desinfectante
 Marcador
 Cultivo de 24-48 horas de E. coli en caldo nutritivo (50 mL).
PROCEDIMIENTO
1. Tome 5 mL del cultivo de E. coli y deposítelos en un Erlenmeyer que

contenga 45mL de caldo nutritivo, homogenice el cultivo mediante agitación
suave.
2. Tome 3 mL de este cultivo homogéneo y deposítelos en una celda del
espectrofotómetro para leer el valor de densidad óptica (D.O) a 600 nm.
Esta lectura corresponderá al tiempo 0 (t =0).
3. Incube el cultivo a 37 ˚C. Lea y anote las D.O a las 0,5- 1,0-1,5-2,0-3,0, 4,0
y 6,0 horas pos incubación, de la misma manera que leyó el tiempo cero.
1. Elabore una gráfica de D.O vs tiempo e identifique las fases de crecimiento y

duración (fase Lag o período de adaptación, fase exponencial, fase estacionaria y
Fase de muerte).
2. Determine las generaciones (n) o número de divisiones celulares en el cultivo. n=
(logN-logNo)/log 2 ó n= (logD.O-logD.Oo)/log 2. Tener en cuenta que Log 2= 0,301
3. Calcule la velocidad de crecimiento (Vc): Vc= n/t, es decir el número de
generaciones (n) que ocurren por unidad de tiempo.
4. Tiempo de generación (tg): es el tiempo requerido para que se duplique el número
de células de la población bacteriana.tg=1/vc.
CONSULTAR SOBRE
 ¿Qué factores bióticos y abióticos controlan el crecimiento microbiano?.

 ¿Que otros tipos de métodos directos e indirectos hay para valorar el crecimiento
bacteriano?
 Responda las siguientes preguntas de acuerdo a la siguiente gráfica.
 ¿En qué fase de crecimiento se encuentra el

cultivo en el punto (a)?
 ¿Qué eventos metabólicos están ocurriendo en
las células en el punto (a)?
 Proponga una hipótesis del porque el número de
microorganismos no aumenta en el punto (c).
 ¿
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 ¿A qué se debe la disminución del número de microorganismo en el punto (d)?.

Justifique su respuesta.
 ¿Qué tipo de cultivo permite que el microorganismo pase por las cuatro fases de
crecimiento?. Justifique su respuesta.
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LABORATORIO No.10
SENBILIDAD BACTERIANA (CONTROL MICROBIOLÓGICO)
INTRODUCCIÓN
Sabemos que el control de los microorganismos se basa en el conocimiento previo de las

condiciones físicas favorables y de una fuente de nutrientes necesarios para su
crecimiento óptimo que permite la modificación de éstas, las cuales pueden ser
potencialmente letales. Entre los agentes más utilizados por el hombre en el control de
microorganismos tenemos los Biológicos, Físicos y Químicos como Ia temperatura, Ia
radiación con Ia luz ultravioleta, variaciones en el pH, Ia presión osmótica, lo mismo que
Ia acción de algunos compuestos químicos de uso corriente como los antibióticos. Estos
agentes actúan distintamente, dependiendo de varios factores tales como el tiempo de
exposición, la temperatura, la concentración, su intensidad, la presencia de materia
orgánica o el pH; sí como el número, clase y naturaleza de los microorganismos y también
del material de soporte para su aplicación.
Es importante destacar que según sus características, los agentes que se utilizan para el
controlar los microorganismos, ocasionan diferentes efectos sobre su estructuras, entre
las que podemos mencionar: daños en Ia pared, Ia membrana celular, los ácidos
nucleícos, el citoplasma o en los ribosomas, así como Ia inhibición de Ia actividad
metabólica.
En Ia presente práctica estudiaremos, como actúan sobre los microorganismos algunos

antibióticos.
OBJETIVOS
 Conocer y. evaluar Ia acción de los antibióticos sobre los microorganismos
utilizando el método del antibiograma, el cual consiste en discos de papel filtro
impregnados con distintos antibióticos.
MATERIALES
 Cajas de Petri con agar Muelller- Hinton o nutritivo

 Escobillón de algodón estéril
 lncubadora
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 Cultivo de 24-48 horas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella spp en

caldo nutritivo.
 Mechero
 Sensidiscos para antibiograma
 Marcador
PROCEDIMIENTO
1. Humedezca el escobillón en la suspensión de cultivo y quite el exceso de

caldo presionando y girando el escobillón sobre la pared interna del
recipiente, por arriba del nivel del caldo.
2. Estrié el medio en tres o cuatro direcciones sobre la totalidad de la
superficie del agar para obtener un inóculo uniforme y espere 3 a cuatro
minutos que se seque el inóculo
3. Tome una pinza estéril y coloque los sensidiscos en un tiempo menor a 15
minutos después de haber inoculado la caja, presione ligeramente los
discos para asegurar un contacto con la superficie. Evite una sobreposición
de las zonas de inhibición con una distribución adecuada de los discos y
con un límite no menos de 15 cm de los bordes de la placa
4. Invierte la cajas e incube el cultivo a 37 ˚C por 16 a 18 horas
Con la ayuda de una regleta mida el diámetro del halo de inhibición por el fondo de
la caja, la cual se ilumina con la luz reflejada y clasifique las cepas en términos de
resistente (R), intermedio (I) o sensible (S), dependiendo del diámetro del halo de
inhibición.
CONSULTAR SOBRE
 ¿Cuál es el mecanismo de acción del medicamento presente en los sensidiscos

utilizados?
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LABORATORIO No.11
HONGOS
INTRODUCCIÓN
Los hongos son organismos eucarióticos, porque poseen un verdadero núcleo delimitado
y definido. Se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo, en el aire, en el agua y
como parásitos de plantas, animales y el hombre. También como contaminantes de
alimentos y otras sustancias.
Muchas especies de hongos descomponen Ia materia orgánica para que pueda ser
utilizada por las plantas; otras especies se utilizan en procesos industriales como en Ia
producción de ácidos, alcoholes y antibióticos, y unos pocos causan enfermedades en los
seres vivos, especialmente en las plantas.
Los hongos se presentan en dos formas: Como Mohos cuando sus estructuras son de
forma filamentosa y crecen en los cultivos en forma algodonosa o como Levaduras
cuando son unicelulares y su crecimiento en los medios de cultivo es parecido al de las
bacterias.
Los hongos se clasifican en cuatro clases atendiendo a Ia forma como se reproducen, así:
 Zygomicetos, los que poseen esporangiosporas para Ia reproducción asexual y
zigosporas para Ia sexual.
 Ascomicetos, los que poseen ascosporas para Ia reproducción sexual y
conidiosporas para Ia asexual.
 Basidiomicetos, los que poseen basidiosporas para Ia reproducción sexual y
oidiosporas o artrosporas para Ia asexual.
 Deuteromicetos, los que solamente se les conoce reproducción asexual por media
de micro o macroconidias.
Para la clasificación de los hongos se utiliza una serie de herramientas, tales como las
características morfológicas microscópicas y macroscópicas entre otras, para su inclusión
en un grupo taxonómico, igualmente para darle una denominación definitiva
(nomenclatura) se requiere además, identificar sus estructuras de reproducción y evaluar
su fisiología.
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OBJETIVOS
 Identificar a partir de cultivos en medios sólidos y preparaciones en láminas las

principales características que se deben considerar para la clasificación
taxonómica de los hongos y reconocer su gran variabilidad fenotípica.
MATERIALES
 Estiletes o asas de aguja
 Cubre y portaobjetos
 Solución salina al 0,85%
 Lugol
 Azul de lactofenol
 Cultivo de Levadura (Candida spp) en medio Sabouraud o Mycosel.
 Cultivo de Mohos (Rhizopus sp, Penecillium sp, Aspergiflus sp.)-
PROCEDIMIENTO
Observación de las levaduras:

1. Tome una asada de levaduras del cultivo y colóquelas en un portaobjetos,
cúbrala con una laminilla y obsérvelas con objetivo 10X y 40X. Haga
esquemas.
2. En un portaobjetos coloque una gota de lugol y luego tome una asada del
cultivo de levaduras y haga una emulsión con el asa, colóquele un cubreobjeto
y observe al microscopio con 1O y 40X.
3. Trate de identificar las siguientes estructuras: pared celular, cicatriz de yema,
núcleo, vacuolas, blastoconidias, etc. Realice esquemas de lo observado.
Observación de Mohos
1. Examine las colonias de hongos presentes en las cajas con Agar Sabouraud
y/o Mycosel. Describa su color, su contextura, su forma, etc.
2. Prepare una placa tomando con el asa estéril, una muestra del cultivo;
deposítela en un portaobjeto y adiciónele una gota de azul de lactofenol; luego
póngale una laminilla y observe al microscopio con objetivo 1 OX y 43X. Haga
esquemas del tipo de hifa y órganos de reproducción e identifique el género del
moho observado.
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LABORATORIO No.12 - 13.

ALGUNOS PARASITOS DE IMPORTANCIA HUMANA (Intestinales - Tisulares)
INTRODUCCIÓN
Los protozoos y helmintos están entre las causas más comunes de infecciones y
enfermedades que afectan al ser humano y otros animales. Las enfermedades que
ocasionan tienen una gran repercusión socioeconómica y en Salud Pública. Las
enfermedades causadas por parásitos, especialmente los intestinales (helmintos y
protozoos) a menudo son la causa principal de morbilidad. Estimaciones sugieren que al
menos el 50% de la población mundial puede estar infectados con una o más especies de
helmintos, mientras las tasas de prevalencia de infecciones por protozoos pueden oscilar
entre el 15 y el 30% para las regiones tropicales y desde <1% a 10% en las zonas
templadas. La transmisión de muchas de las enfermedades parasitarias, particularmente
las infecciones por helmintos, son con frecuencia, el resultado de suministros de agua
inadecuados, falta de saneamiento o eliminación de aguas residuales mal tratadas. Sin
embargo, recientemente el agua contaminada con materia fecal se está asociando con
brotes de nuevas enfermedades protozoarias transmitidas por el agua, lo cual se está
convirtiendo en una preocupación cada vez mayor.
Para la clasificación de los parásitos se utiliza una serie de herramientas, tales como las
características morfológicas microscópicas y macroscópicas, así como su modo de
infestación.
El diagnóstico de las parasitosis intestinales se realiza mediante un examen denominado

coprológico que consiste en colocar en un portaobjetos limpio, una gota de solución salina
en un extremo y una de lugol en el otro. Posteriormente con un palillo se toma una
pequeña porción de Ia muestra de material fecal a analizar y se hace una emulsión
primero en Ia gota de solución salina y luego en Ia de lugol. Esta muestra se le coloca un
cubreobjetos y se observa al microscopio con 1OX y 40X.
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Para la observación de los parásitos tisulares como los hemoparásitos, la técnica para su
diagnóstico es la gota gruesa y se realiza de la siguiente manera: En el centro de una
placa coloque una gota de sangre y extiéndala en zig-zag en una superficie de un
centímetro aproximadamente. Posteriormente, deje secar la preparación utilizando una
estufa a 37°C por 1 ó 2 horas, o temperatura ambiente y por último coloree con Wright o
Giemsa
Otros parásitos de importancia médica son los ectopásitos como el Pthirus pubis,
Pedículos humanus, o Sarcoptes scabiei que afectan a la piel de los animales de dos
formas: ectodérmica (sobre la piel) o contraindica (dentro de la piel).
OBJETIVOS
 Conocer las principales características morfológicas de algunos parásitos de
importancia en humanos.
 Adquirir destreza en el manejo de las técnicas más utilizadas en el diagnóstico de
estos parasitos.
MATERIALES
 Guantes
 Placas de demostración
 Especímenes conservados en formol
 Solución salina
 Cubre y portaobjetos
 Solución salina al 0,85%
 Lugol
 Palillo de madera para hisopos
 Muestra problema (materia fecal)
PROCEDIMIENTO
Observación de Protozoos lntestinales: Entre los protozoos intestinales que revisten

importancia patológica para el hombre tenemos: Entamoeba histolftica, Giardia Iamblia y
el Balantidium coli. En las muestras, lo mismo que en las demostraciones observe al
microscopio con objetivo de 40X y analice las diferencias entre los trofozoitos y los
quistes.
Observación de Helmintos: Algunos de los helmintos que afectan al hombre son:

Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularis, Taenia solium, Fasciola
hepatica y Ancylostoma duodenale. De algunos de estos organismos se encuentran
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placas demostrativas y muestras para observación en fresco. Observe los parásitos

adultos y los huevos en el microscopio con objetivo de 10x y 40x. Dibuje y anote
características que permiten su clasificación e identificación.
Observación de Protozoos Hemopárasitos: Los parásitos del género Plasmodium cuyas

especies más frecuentes en nuestro país son el P. vivax y P. falciparum constituye un
problema de Salud Pública para los países que se encuentran entre el trópico de cáncer y de
capricornio. De este hemopárasito, al igual que de Trypanosoma cruzi y Toxoplasma gondi, en
el Laboratorio encontrarán placas demostrativas con preparaciones de gota gruesa
teñidas con el colorante de Wright o Giemsa. Observe en el microscopio con objetivo de
100X y haga esquemas de lo observado que le permita clasificarlo e identificarlo.
CÓDIGO: 20404-20407
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Figura 9. Algunos protozoos y helmintos intestinales

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CONTENIDO DE LAS NOTAS DE SEGUIMIENTOS O INFORME DE LABORATORIO

Cada informe deberá ser entregado semanalmente y será realizado de forma

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1. AI iniciar cada practica se hará una discusión sobre el laboratorio anterior.

LISTA DE MATERIALES (POR GRUPO)

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En nuestro medio se encuentra una gran variedad de microrganismos suspendidos en el

1. Cajas de Petri con agar nutritivo

 Bacterias en Ia superficie de Ia mesa de trabajo: Tome un escobillón y frótelo

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inviértala y márquela adecuadamente, incube a 37°C por un tiempo de 24 a 48

 Microorganismos de mucosas y de piel: Con un escobillón estéril frótelo sobre

Registre estos datos en el cuaderno de notas o en el formato de preinforme que será

Figura 1. Manera de inocular una caja de Petri con Agar Nutritivo

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En el aislamiento de bacterias se utilizan varias técnicas, una de las cuales es la siembra

Es importante tener en cuenta que la inoculación de los microorganismos en los medios

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Figura 6. Formas de crecimiento en la superficie de un medio líquido

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 ¿Qué es el agar y de donde se obtiene?

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a. Preparaciones no coloreadas: Con este método se observan las bacterias vivas,

b. Preparaciones coloreadas: Como las bacterias son incoloras y tienen el mismo

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