Práctica 6 Aislamiento y Purificacion de ARN Total de Mamifero

Práctica 6.
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE ARN TOTAL DE MAMÍFERO
Objetivos
1. Comprender los fundamentos de la extracción y purificación de ARN total de células

de mamífero.
2. Realizar la extracción de ARN total a partir de un cultivo de células de mamífero.
3. Comparar diferentes métodos de extracción de ARN total.
Introducción
Las moléculas de ARN participan y regulan la expresión genética. Actualmente es muy claro que
mucho del genoma de mamíferos se transcribe a ARN, aunque sólo una pequeña fracción codifica
para proteínas. Este conocimiento ha permitido paulatinamente un importante crecimiento en el
campo de la investigación del ARN como un regulador central en procesos biológicos fundamentales
o en su utilidad como una herramienta biotecnológica, terapéutica o diagnóstica. Existen diversos
tipos de ARNs que tienen diferentes funciones biológicas en las células. Los ARNs más abundantes
son los ribosomales (ARNr), los cuales representan entre el 80 al 90% de todos los ARNs, mientras
que los ARN mensajeros (ARNm) y los ARN de transferencia (ARNt) representan entre el 2.5 al 5%.
Se han descrito otros tipos de ARNs reguladores como los microARNs, ARNs largos no codificantes,
ARN pequeños nucleolares y nucleares, entre otros (Rio et al. 2011).
El ARN es una biomolécula inestable, lo que hace difícil su manejo en el laboratorio, por lo tanto, el
principal objetivo de la extracción del ARN es obtener moléculas intactas y mantenerlas así durante
su posterior manipulación, ya que una vez que es extraído de las células, el ARN tiene una vida media
relativamente corta en comparación con el ADN. Se han descrito tres factores principales para la
degradación del ARN: un pH alcalino, la presencia de metales divalentes y la actividad de ARNasas.
Estas últimas son el factor más importante de degradación debido principalmente a su presencia
ubicua en todos los tipos celulares, son termoestables y son capaces de adoptar su plegamiento
nativo nuevamente después del calentamiento, además son difíciles de inactivar debido a que no
necesitan cofactores. Los desnaturalizantes fuertes se han utilizado para inhibir las ARNasas
endógenas durante la obtención del ARN por lo que el éxito en la extracción de ARN se basa en las
buenas técnicas de laboratorio y en técnicas libres de ARNasas. Es importante utilizar sólo
materiales estériles y exclusivos para extracción de ARN, como frascos, puntas y microtubos (Rio et
al., 2011). El área de trabajo, las gradillas y las micropipetas debe ser previamente descontaminadas
con soluciones como RNase AWAY® (Ambion) o RNaseZap® (Sigma), las cuales son soluciones de
descontaminación superficial que destruyen las ARNasas. Todas las soluciones deben estar
preparadas con agua libre de nucleasas o agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).
El primer paso en la purificación del ARN de muestras biológicas de mamíferos es la solubilización

del material biológico del cual se va a realizar la extracción. Durante este proceso lo más importante
es inactivar las nucleasas lo más rápido posible con una sal caotrópica como el isotiocianato de
guanidina o con detergentes desnaturalizantes como el SDS. De acuerdo a esto, las técnicas
utilizadas para obtener ARN total son:
1. El método del TRIzol®.
2. Guanidina/Cloruro de Cesio (CsCl).
3. Guanidina/Cromatografía en columnas de sílica gel.
4. Fenol/SDS.
Una vez extraído y purificado, el ARN debe localizarse en una solución acuosa totalmente clara
(Figura 1) y debe ser precipitado con etanol y mantenerse en frío para promover una mejor
precipitación. El ARN se obtendrá por centrifugación y la pastilla resultante deberá resuspenderse
en agua libre de nucleasas o agua tratada con DEPC (Ausubel et al., 2003).
La calidad y cantidad de ARN se evalúa por diversos métodos como electroforesis y técnicas
espectrofotométricas. Recientemente, el método más utilizado para determinar la integridad del
ARN es el análisis del Número de Integridad del ARN (RIN por sus siglas en inglés) utilizando un
bioanalizador® basado en electroforesis capilar con chips (Rio et al., 2011) (Figura 1).
Material y equipo necesario
• TRIzol®
• Cloroformo
• Isopropanol
• Etanol al 75% (v/v) en agua libre de nucleasas (o agua tratada con DEPC)
• Agua libre de nucleasas (o agua tratada con DEPC)
• RNase AWAY® (Ambion) o RNaseZap® (Sigma)
• PBS
• Cultivo de células de mamífero adherentes (proporcionado por el profesor)
• Espátula de plástico estéril (scrapper)
• Microcentrífuga
• Vórtex
• Microtubos de 1.6 mL, nuevos y estériles
• Rejilla para microtubos
• Guantes de látex o nitrilo
• Hielo/contenedor
• Micropipetas y puntas de 10, 200 y 1000 μL estériles
• PureLink® RNA Mini Kit con las siguientes soluciones:
- Amortiguador de lisis
- Amortiguador de lavado I
- Amortiguador de lavado II
• 2-mercaptoetanol
• Campana de extracción
• Ultracongelador a -80 °C
Protocolo
El profesor sembrará 5 x 106 células de una línea celular de mamífero en cajas de Petri de cultivo
de 60 mm e incubará a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
El día de la práctica:
Antes de iniciar es muy importante limpiar cuidadosamente la superficie de trabajo, las

micropipetas y la centrífuga, con un inhibidor de ARNasas comercial (RNase AWAY® o RNaseZap®)
para prevenir la degradación del ARN durante el procedimiento de extracción y purificación.
a. Extracción de ARN con el método de TRIzol®
1. Eliminar el medio de cultivo de las células en la caja de Petri.

2. Lavar el cultivo celular 2 veces con 2 mL de PBS.
3. Eliminar completamente el PBS con la ayuda de una micropipeta.
4. Adicionar 1 mL de TRIzol® (ThermoFisher Scientific) sobre la monocapa celular y
despegar las células con una espátula de plástico estéril (scrapper).
5. Recuperar la suspensión celular con ayuda de una micropipeta y colocarla en un
microtubo.
6. Homogenizar la suspensión celular durante 2 min con pipeteo constante.
7. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
8. Adicionar 200 μL de cloroformo.
9. Mezclar con un vórtex durante 15 s.
11. Centrifugar a 14,000 rpm durante 15 min a 4 °C.
12. Transferir cuidadosamente la fase acuosa a otro microtubo, evitando tocar la fase
orgánica.
13. Adicionar un volumen de isopropanol a la fase acuosa (v/v).
16. Eliminar el isopropanol con ayuda de una micropipeta, evitando tocar la pastilla.
17. Adicionar 800 μL de etanol al 75%.
18. Agitar en un vórtex durante 1 min.
20. Eliminar completamente el etanol con ayuda de una micropipeta.
21. Secar la pastilla dejando el microtubo abierto durante 10 min a temperatura
ambiente.
22. Resuspender la pastilla de ARN en 30 μL de agua libre de nucleasas (o agua tratada con
DEPC).
23. Almacenar el ARN a -80 °C.
b. Extracción de ARN con un método comercial, PureLink® RNA Mini Kit
1. Eliminar el medio de cultivo de las células en la caja de Petri.

2. Lavar el cultivo celular 2 veces con 2 mL de PBS.
3. Eliminar completamente el PBS con la ayuda de una micropipeta.
4. Adicionar 300 μL de amortiguador de lisis previamente preparado con 1% de 2-
mercaptoetanol sobre la monocapa celular y despegar las células con una espátula de
plástico estéril (scrapper).
5. Recuperar la suspensión celular con ayuda de una micropipeta y colocarla en un
microtubo.
6. Homogenizar la suspensión celular durante 2 min con pipeteo constante.
7. Centrifugar el homogenizado durante 5 min a 2,600 rpm.
8. Recuperar el sobrenadante en un microtubo.
9. Adicionar 1 volumen de etanol al 75%.
10. Mezclar con vórtex durante 30 s.
11. Transferir 700 μL de la mezcla anterior a la columna previamente colocada sobre un
tubo colector.
12. Centrifugar a 12,000 rpm durante 15 s a temperatura ambiente.
13. Descartar la solución filtrada colectada en el tubo y reinsertar la columna.
14. Repetir los pasos 11, 12 y 13 hasta completar la unión para toda la mezcla de lisis.
15. Adicionar 700 μL de amortiguador de lavado I a la columna.
17. Descartar la solución filtrada colectada en el tubo y reinsertar la columna en un nuevo
tubo colector.
18. Adicionar 500 μL de amortiguador de lavado II a la columna (el amortiguador II debe
estar preparado previamente con etanol, de acuerdo con la cantidad indicada en el
frasco)
20. Descartar la solución centrifugada colectada en el tubo y reinsertar la columna en el
mismo tubo colector.
21. Repetir los pasos 18, 19 y 20.
22. Centrifugar a 12,000 rpm durante 2 min para secar la membrana de la columna.
23. Desechar el tubo colector e insertar la columna en un microtubo para elución.
24. Adicionar de 30 a 100 μL de agua libre de ARNasas o nucleasas en el centro de la
columna evitando tocar la membrana.
26. Centrifugar a 12,000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente.
27. Desechar la columna y almacenar el ARN colectado en el microtubo a -80 °C.
Análisis de resultados
Describa detalladamente los fundamentos de cada paso realizado durante la extracción de ARN
con el método del TRIzol®.
Observe y documente los cambios físicos de la muestra durante todo el proceso de extracción y
purificación con el método del TRIzol®.
Discuta cuál es el fundamento de la extracción de ARN por columna.
Documente y discuta los pros y contras de los dos métodos descritos en la práctica.
Cuestionario
1. ¿Cuál es el efecto del pH y los metales divalentes en la estabilidad del ARN?

2. ¿Qué son las ARNasas?
3. ¿Cuál es la función del DEPC sobre las ARNasas?
4. ¿Cuáles son los componentes del TRIzol®?
5. ¿Qué papel juega cada uno de los reactivos utilizados en el proceso de extracción y
purificación del ARN total por el método del TRIzol®?
6. Mencione al menos 2 kits comerciales que se utilicen para extraer diferentes tipos de
ARN. Indique el fundamento de los kits de acuerdo a las características de los ARNs
que serán obtenidos.
Soluciones
• PBS: NaCl 137 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM, pH 7.5 (1 L) PMNaCL 58.44, PMNa2HPO4
141.96, PMKH2PO4 136.086
Pesar 8 g de NaCl, 1.44 g de Na2HPO4 y 0.24 g de KH2PO4. Disolver en 800 mL de agua destilada y
ajustar el pH a 7.5 con HCl. Aforar a 1 L con agua Milli-QTM. Esterilizar por autoclave en un frasco
de vidrio con tapón de rosca. Almacenar a temperatura ambiente.
• Agua tratada con DEPC (1 L)
Agregar 1 mL de DEPC a 1 L de agua bidestilada, colocar en un frasco de vidrio con tapa de rosca
estéril e incubar a temperatura ambiente durante 24 h. Posteriormente, esterilizar por autoclave y
almacenar a 4 °C.
• Etanol al 75% (v/v) (50 mL)
Mezclar 37.5 mL de etanol absoluto grado biología molecular con 12.5 mL de agua libre de
nucleasas (o agua tratada con DEPC). Almacenar en un frasco de vidrio con tapón de rosca.
Referencias Bibliográficas
1. Rio DC, Ares M, Hannon GJ, Nielsen TW. RNA: A Laboratory Manual. Estados Unidos: Cold
Spring Harbor Laboratory Press; 2011.
2. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current
Protocols in Molecular Biology. Estados Unidos: Wiley; 2003.
3. Life Technologies. PureLink® RNA Mini Kit. Disponible en:
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/purelink_rna_mini_kit_man.pdf.
Consultado agosto 23, 2017.

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1. Comprender los fundamentos de la extracción y purificación de ARN total de células

El primer paso en la purificación del ARN de muestras biológicas de mamíferos es la solubilización

Material y equipo necesario

Antes de iniciar es muy importante limpiar cuidadosamente la superficie de trabajo, las

a. Extracción de ARN con el método de TRIzol®

1. Eliminar el medio de cultivo de las células en la caja de Petri.

b. Extracción de ARN con un método comercial, PureLink® RNA Mini Kit

1. Eliminar el medio de cultivo de las células en la caja de Petri.

Discuta cuál es el fundamento de la extracción de ARN por columna.

1. ¿Cuál es el efecto del pH y los metales divalentes en la estabilidad del ARN?

• Agua tratada con DEPC (1 L)

• Etanol al 75% (v/v) (50 mL)

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