Tema 8: Espectrofotometría de

absorción ultravioleta-visible

Tabla de contenido
1.- Fundamento de la técnica ........................................................................................................2
1.2.- Tipos de transiciones electrónicas .....................................................................................2
2.- Instrumentación ......................................................................................................................6
2.1.- Fuentes de radiación .........................................................................................................6
2.2.- Monocromadores .............................................................................................................7
2.2.1.- Filtros .........................................................................................................................7
2.2.2.- Monocromadores.......................................................................................................8
2.3.- Recipientes para muestras ................................................................................................9
2.4.- Detectores ...................................................................................................................... 10
2.4.1.-Células fotovoltaicas. ................................................................................................ 10
2.4.2.- Fototubo .................................................................................................................. 11
2.4.3.- Tubos fotomultiplicadores. ....................................................................................... 11
2.5.- Instrumentos de haz sencillo y de haz doble.................................................................... 12
3.- Aplicaciones analíticas ........................................................................................................... 12
3.1.- Análisis cualitativo .......................................................................................................... 12
4.2.- Análisis cuantitativo ........................................................................................................ 13
Análisis de mezclas de sustancias absorbentes ........................................................................ 14
Análisis Instrumental Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

1.- Fundamento de la técnica

La absorción de radiación ultravioleta y visible origina transiciones entre distintos niveles de
energía electrónicos, así como simultáneamente transiciones vibracionales y rotacionales, de forma
que el cambio en la energía molecular de una determinada especie como consecuencia de la
absorción de energía radiante puede representarse así:
E = Eelectrónica + Evibracional + Erotacional + Etraslacional
De todos los términos que figuran en la expresión anterior, el más importante es Eelectrónica, pués
la diferencia de energía entre dos estados vibracionales es unas 10 veces menos, y Erotacional es, a su
vez, entre 10 y 100 veces menor que Evibracional. Por otro lado, el último término es tan pequeño que
prácticamente puede prescindirse de su influencia.
Debido a lo anteriormente expuesto puede ser de utilidad clasificar las especies absorbentes en
base al tipo de transiciones electrónicas que pueden tener lugar. Asimismo, esto permite
correlacionar el comportamiento espectral de una determinada especie con sus características
químicas, lo cual es importante en orden a determinar estructuras moleculares y para la
identificación de ciertos grupos funcionales.

1.2.- Tipos de transiciones electrónicas

Las moléculas orgánicas, y una gran cantidad de aniones inorgánicos, contienen electrones en
orbitales moleculares  y π, así como en orbitales no enlazantes, n, por lo que cuando estas especies
absorben fotones de contenido energético adecuado se pueden producir transiciones a los
correspondientes orbitales moleculares antienlazantes, * y π*, tal como se indica en la figura 1,
donde se muestra la estructura de Lewis para una molécula orgánica sencilla y las transiciones
electrónicas correspondientes.

Figura 1: Transiciones electrónicas entre niveles de energía moleculares

Como se representa en la figura 1., pueden tener lugar cuatro tipos de transiciones: —>*. 𝜋—>π*.
n—>* y n— >π*. Asimismo, también pueden producirse transiciones denominadas de transferencia
de carga y de campo ligando. Seguidamente se comentarán algunas peculiaridades de cada una de
las transiciones mencionadas.
 Transiciones   *. Estas transiciones entre orbitales moleculares sigma enlazantes y
antienlazantes implican energías relativamente grandes, de forma que las bandas de absorción se
observan en el ultravioleta lejano, a longitudes de onda inferiores a 200 nm (Figura 2). Esta región del
espectro se denomina ultravioleta de vacío, debido a que los constituyentes normales del aire,m
nitrógeno y oxígeno, absorben fuertemente a 160 y 200 nm respectivamente, por lo que los
espectros en esta zona deben obtenerse operando en el “vacío”.

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Figura 2: Bandas de absorción originadas por diferentes transiciones electrónicas

En los hidrocarburos saturados, en los que solamente hay enlaces sencillos C-H se producen estas
transiciones; así el metano presenta máximos de absorción a 125 nm y el etano a 135 nm. Desde el
punto de vista analítico, estas bandas tienen poco interés, debido a dificultades de tipo instrumental.
 Transiciones n*. Las especies químicas saturadas que contengan átomos con pares
electrónicos en orbitales no enlazantes pueden dar lugar a que se produzcan transiciones n*.
Esto sucede, por ejemplo, en compuestos saturados conteniendo heteroátomos de oxígeno, azufre y
halógenos.
Estas transiciones requieren bastante energía, si bien en menor grado que las — >*, por lo
que las bandas correspondientes se presentan fundamentalmente en el ultravioleta lejano. Por otra
parte, la intensidad de las absorciones asociadas con estas bandas suelen ser de pequeña magnitud.
Los máximos de absorción correspondientes a esta transiciones n—>* tienden a desplazarse
hacia longitudes de onda menores al aumentar la electronegatividad del heteroátomo. De hecho, la
mayor parte de los compuestos saturados que contienen oxígeno absorben a longitudes de onda
inferiores a 200 nm, lo cual hace posible que compuestos tales como el agua, o los alcoholes, puedan
utilizarse como disolventes en el ultravioleta próximo.
 Transiciones n—>π* y π — >π*. Estas transiciones se consideran juntas debido a que muchos
grupos químicos contienen electrones en orbitales π y no enlazantes. Como se aprecia en la Figura 1.
las transiciones n—>π* requieren la absorción de una cantidad de energía relativamente grande, por
lo que suelen aparecer en el ultravioleta lejano, mientras que las π—>π* necesitan menor cantidad
de energía, como consecuencia de lo cual se originan bandas en las zonas ultravioleta próximo y
visible.
En lo que respecta a la intensidad de la absorción, las absortividades molares de los picos
asociados a las transiciones n—>π* son generalmente bajos, mientras que los correspondientes a los
π—>π * son considerablemente mayores. De cualquier forma, el comportamiento mencionado
puede alterarse, como se verá posteriormente, por la presencia de determinadas agrupaciones
atómicas, o por el tipo de disolvente.
Para que tengan lugar Para que tengan lugar las transiciones consideradas en este apartado, es
evidente que la especie química tendrá que contener algún grupo funcional con enlaces π, esto es, la
estructura molecular deberá presentar centros absorbentes no saturados. A estos grupos de átomos
responsables de la absorción en las regiones ultravioleta y visible se les denomina grupos cromóforos
(por extensión, se considera que los sistemas con electrones s son cromóforos en el ultravioleta
lejano). En la tabla 1. se muestran algunos grupos cromóforos y las transiciones implicadas en
espectrofotometría ultravioleta-visible.
Por otra parte, existen determinadas agrupaciones atómicas que por sí mismas no comunican
color a la molécula que pertenecen, pero son capaces de reforzar la acción de un cromóforo. Estos
qrupos se denominan auxocromos.

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Tabla 1: Grupos cromóforos y transiciones electrónicas

Los grupos auxocromos suelen contener grupos funcionales con electrones en orbitales no
enlazantes y que, en consecuencia, pueden absorber únicamente en el ultravioleta lejano, como
consecuencia de transiciones n*. Sin embargo, si un auxocromo y un cromóforo se encuentran en
la misma molécula, la absorción del cromóforo se desplaza hacia longitudes de onda más largas, a la
vez que se produce un incremento en la intensidad de absorción. Este efecto se agribuye
normalmente a la posibilidad de que se den transiciones nπ*. En relación a las modificaciones de
las intensidades de absorción se definen los siguientes términos: efecto hipercrómico (aumento de la
intensidad de absorción) y efecto hipocrómico (disminución de la intensidad de absorción).
Cuando una molécula contiene dos o más grupos cromóforos pueden darse las siguientes
posibilidades:
a) Si los cromóforos están separados por dos o más enlaces sencillos se dice que están
aislados y, en estos casos, la absorción es la suma de todos los grupos cromóforos
presentes:
λmax (nm) εmax
CH3-CH2-CH2-CH=CH2 184 10000
CH2=CH-CH2-CH2-CH-=CH2 185 20000
b) Cuando los cromóforos están conjugados, esto es, separados por un enlace sencillo, se
produce un desplazamiento batocrómico acompañado de un efecto hipercrómico.
λmax (nm) εmax
-C=C- 170 16000
-C=C-C=C- 220 21000
-C=C-C=C-C=C- 260 35000
La razón de estos desplazamientos se considera que es debido a que la conjugación hace
que se produzca una deslocalización de los electrones π sobre, al menos, cuatro átomos,
como consecuencia de lo cual se rebaja el nivel de energía del orbital π*, con lo que al
ser menor la energía requerida para las transiciones, los máximos de absorción se
desplazan hacia mayores longitudes de onda, aumentado además las probabilidades de
que tengan lugar las mencionadas transiciones, lo que origina un aumento simultáneo
en la intensidad de la absorción. Sin embargo, cuando existe algún enlace triple, se
observa una disminución de la intensidad de absorción (efecto hipocrómico)
λmax (nm) εmax
CH2=CH-CH-CH2 219 21000
CH2=CH-C=CH 219 6500
c) Cuando los cromóforos están unidos directamente, el espectro resultante normalmente
es distinto del que presentan ambos cromóforos cuando están aislados, ya que en
realidad se forma un nuevo cromóforo.

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λmax (nm) εmax

CH2=CH2 170 10000
CH2=C=CH2 225 500

En cuanto a la influencia del disolvente, puede decirse que al aumentar la polaridad del
disolvente se produce un desplazamiento hipsocrómico (hacia menor longitud de onda) de las
bandas nπ* y un desplazamiento batocrómico (hacia menor longitudes de onda mayores) de las
bandas ππ*. Esto puede explicarse teniendo en cuenta que el estado excitado es más polar que el
estado fundamental, por lo cual, la presencia de un disolvente polar tiende a estabilizar los estados
excitados, rebajando su nivel energético. De todas formas, si únicamente tuviera lugar este efecto,
en ambas transiciones ocurrirían desplazamientos batocrómicos. Sin embargo, en el caso de las
transiciones nπ* se produce un aumento de solvatación del par de electrones no enlazados, lo cual
rebaja la energía del orbital no enlazante en mayor medida que lo que disminuye la energía del
orbital π*. En consecuencia, se produce un aumento de la energía requerida para la transición nπ*
y el consiguiente desplazamiento hipsocrómico.
 Bandas de transferencia de carga. Estas bandas se originan cuando se produce transferencia
de electrones de una parte a otra de un sistema. Para ello es necesario que uno de sus componentes
tenga características de dador de electrones y otro de aceptor. Como consecuencia de esta
transferencia se origina un estado excitado que es el resultado de un proceso de oxidación-reducción
interna. Así, por ejemplo, la absorción de un fotón por el complejo Fe(III)-SCN- da lugar a la
transferencia de un electrón desde el tiocianato hasta uno de los orbitales del hierro, originándose
una especie excitada consistente en Fe(II) y SCN neutro.
Fe(III)-SCN- + hν  Fe(II)-SCN
Lo mismo sucede con otros tipos de excitación electrónica, el electrón que ha experimentado la
transferencia vuelve a su estado original, si bien, ocasionalmente puede tener lugar la disociación del
estado excitado, teniendo lugar, en este caso, una reacción fotoquímica.
Las bandas de absorción originadas por estos procesos de transferencia de carga son
particularmente importantes en análisis químico, ya que muchos compuestos orgánicos e
inorgánicos las presentan en el ultravioleta (a veces también en el visible) y las absortividades
molares suelen ser muy altas (superiores a10000), por lo cual se obtienen límites de detección muy
bajos para estas especies.
 Bandas de campo ligando. El color que presentan muchos iones y compuestos de metales de
transición normalmente se deben a absorciones denominadas de campo ligando (junto a éstas,
suelen presentarse las intensas bandas de transferencia de carga anteriormente mencionadas). Estas
absorciones suelen ser de baja intensidad y aparecen en la región del visible, llegando en ocasiones
hasta el ultravioleta próximo y el infrarrojo próximo.
El origen de las bandas de campo ligando puede explicarse del siguiente modo: los cinco orbitales
d de un átomo o un ión de un elemento de transición en ausencia de un campo magnético o eléctrico
externo están degenerados, no siendo necesaria la absorción de radiación para promover un
electrón de un orbital a otro.
Al formarse un complejo entre el ión metálico y el agua, o algún otro ligando, los átomos dadores
de los ligandos se aproximan al ión metálico central. Como consecuencia de la aproximación los
átomos dadores (cargas puntuales) se origina un campo eléctrico que elimina la degeneración
existente en el grupo de orbitales d y los divide en dos grupos.
La energía de separación entre los dos grupos depende de las características del ión metálico
(carga y número cuántico principal del orbital d) y del,ligando (distribución de su densidad de carga y
polarizabilidad). En este sentido, es posible ordenar los ligando más comunes en orden creciente de E
(serie espectroquímica)
I- < Br- < l- < F- < OH- < C2O42- < H2O < SCN- < NH3 < etilendiamina < NO2- < CN-

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Ejemplo: Las disoluciones acuosas de Cu2+, Cu(H2O)42+ son de color azul pálido, mientras que en
medio amoniacal, Cu(NH3)42+, el color es azul violeta muy intenso. Esto es debido al aumento que
experimenta el campo ligando cuando se sustituye el H2O por NH3.

2.- Instrumentación
El instrumento que normalmente se utiliza para medir la transmitancia o la absorbancia de una
muestra en función de la longitud de onda es el espectrofotómetro.
Los componentes básicos de un espectrofotómetro son: una fuente de radiación, un
monocromador, que seleccione una banda estrecha de longitudes de onda , una cubeta, o recipiente
que contenga la muestra, un detector de radiación y un sistema de tratamiento y lectura de la señal
detectada.

Figura 3: Espectrofotómetro de doble haz

2.1.- Fuentes de radiación

Las fuentes de radiación utilizadas en espectrofotometría ultravioleta y visible deben ser
continuas en una amplia zona del espectro, de intensidad elevada y ser esencialmente constante con
la longitud de onda.
En la zona ultravioleta y visible, las fuentes más utilizadas son de dos tipos: fuentes térmicas,
basadas en la emisión de radiación por efecto de la temperatura, y fuentes cuya radiación se debe a
descargas eléctricas producidas en el seno de gases. Entre las primeras, la más común es la lámpara
de filamento de wolframio. En condiciones ordinarias de operación, esta lámpara resulta útil entre
unos 350 nm y unos 3000 nm.

Figura 4: Curva de distribución espectral de las lámparas de deuterio y wolframio.

Como puede observarse en la figura 4, la mayor parte de la energía emitida corresponde a la

zona infrarroja. La distribución de la energía depende de la temperatura del filamento, la cual

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depende, a su vez, del voltaje; un incremento en la temperatura de operación aumenta la energía

total emitida y desplaza el máximo de intensidad hacia longitudes de onda más cortas.
Debido a que la radiación emitida depende únicamente del voltaje suministrado, éste tiene que
ser muy estable, por lo cual los instrumentos llevan incorporado un sistema para la estabilización de
la corriente. Por otra parte, el calor producido por la lámpara puede constituir un problema, por lo
que, con frecuencia, en el lugar donde se coloca la lámpara se instala un ventilador con objeto de
evitar el calentamiento de la muestra y de los demás componentes del instrumento.
Por debajo de 350 nm, la potencia de una lámpara de wolframio es inadecuada, debiéndose
emplear una fuente diferente. La más común es la laámpara de descarga de hidrógeno, o de
deuterio. Cuando se produce una descarga eléctrica entre dos electrodos e el seno de un gas, como
hidrógeno, las colisiones entre los electrones de la descarga y las moléculas gaseosas probocasn la
excitación eléctronica, vibracional y rotacional de dichas moléculas, con lo que se obtiene un
espectro de líneas que es característico del gas, siempre que la presión sea baja. Al aumentar la
presión, las líneas se ensanchan, llegando a superponerse, hasta que, a presiones relativamente altas
(0,2-5 mm) se produce un espectro continuo.
Tanto la lámpara de hidrógeno como la de deuterio tienen un intervalo de utilización
comprendido entre 175 y350 mm. También se utilizan con la misma finalidad la lámpara de descarga
de xenón y la de vapor de mercurio.
Finalmente, indicar que, puesto que el vidrio absorbe fuertemente a longitudes de onda
inferiores a unos 350 nm, las lámparas de ultravioleta deben utilizar ventanas de cuarzo.

2.2.- Monocromadores
La misión de los filtros y de los monocromadores es seleccionar un haz de radiación
“monocromática”.

2.2.1.- Filtros
Los filtros de absorción se utilizan en la región visible y se basan en la absorción selectiva de
ciertas longitudes de onda. Normalmente consisten en un vidrio coloreado o una suspensión de un
colorante en gelatina que se coloca entre dos placas de vidrio. Los filtros de banda se caracterizan
por su anchura de banda que puede oscilar entre 30 y 250 nm. Los filtros de corte tienen
transmitancias de casi el 100% en una zona del espectro visible, pero luego disminuye rápidamente
hasta un valor de transmitancia cero. Por combinación de diferentes filtros pueden seleccionarse
bandas espectrales relativamente estrechas.
Los filtros de interferencia consisten en un dieléctrico transparente (frecuentemente, fluoruro
cálcico o magnésico) recubierto en ambos lados con dos finas capas de plata semirreflectante.

Figura 5: Filtro de interferencia

Cuando un haz de radiación incide sobre este dispositivo, una fracción atraviesa la primera capa
metálica, mientras que la restante se refleja. La parte que ha pasado sufre una escisión similar al
llegar a la segunda capa metálica. Si la parte reflejada en la segunda interacción es de longitud de

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onda adecuada, se refleja, en parte, desde la cara interior de la primera capa en fase con la radiación
incidente de la misma longitud de onda, mientras que la mayoría de las otras, fuera de fase, sufren
una interferencia destructiva. Estos filtros proporcionan anchuras de banda menores y
transmitancias de pico mayores que los filtros de absorción.

2.2.2.- Monocromadores
Un monocromador se caracteriza por producir un haz de radiación de gran pureza espectral y
permitir variar, de forma continua y en un amplio intervalo la longitud de onda de la radiación, Los
componentes básicos de un monocromador son una rendija de entrada, que selecciona un haz de
radiación policromática entrante, un elemento dispersante, prisma o red, que dispersa la radiación en
sus longitudes de onda individuales, y una rendija de salida, que aísla la banda espectral deseada
(Figura 6).
La dispersión de radiación por un prisma se basa en el fenómeno de la refracción; esto es, el
cambio de dirección que experimenta un haz de radiación al pasar de un medio a otro con distinto
índice de refracción. El grado de desviación depende de la longitud de onda; así, los azules se desvían
más que los rojos.

Figura 6: Dispersión de la radiación por un prisma

El material de que está contruido el prisma depende del tipo de radiación a dispersar; en la
región visible se usan prismas de vidrio, mientras que en el ultravioleta es necesario usarlos de
cuarzo.
Los prismas presentan las ventajas de su gran pureza espectral (no hay órdenes de dispersión
superiores, como en las redes), mientras que el principal inconveniente reside en que la dispersión
no es lineal; esto es, las longitudes de onda no se dispersan de manera uniforme: es mayor para las
longitudes de onda más cortas.
Las redes de difracción, que son más utilizadas, consisten en una superficie dura, pulida, sobre la
que se ha grabado un gran número de surcos paralelos y muy próximos entre sí (entre 300 y 2000
surcos por milímetro para las regiones ultravioleta y visible).

Figura 7:Difracción de radiación por una red de refracción

Cuando un haz de radiación incide sobre una red de refracción con un ángulo i (Figura 7) se
refleja según un angulo , diferente del incidente. En la figura 7 se muestran los haces paralelos 1 y 2.
La máxima interferencia constructiva entre ambos se produce cuando la diferencia de caminos
recorridos por ellos sea un múltiplo entero de la longitud de onda, y esta diferencia es AB – CD. Los
segmentos AB y CD pueden expresarse en función de d y de los ángulos i y .

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AB = d sen i CD = d sen 
por lo cual,
nλ = d (sen I + sen )
donde n, número entero, se denomina orden de difracción.
Según la ecuación anterior, existen distintos valores de λ para unos determinados ángulos i y ,
por lo que junto con la línea de primer orden (n=1) aparecen líneas de órdenes superiores.
Ordinariamente, la línea de primer orden es la más intensa. Las líneas de órdenes superiores pueden
eliminarse mediante filtros.
El fenómeno de la difracción de una radiación policromática por una red se representa
esquemáticamente en la figura 8. Para seleccionar la readiación de una determinada longitud de
onda, se hace girar la red hasta hacer que la radiación que interesa coincida con la rendija de salida,
eliminando los órdenes superiores mediante filtros.

Figura 8: Difracción de la radiación policromática por una red

En resumen, y comparando con los prismas, las redes de difracción presentan las ventajas de su
elevada resolución, dispersión lineal y pocas pérdidas de radiación por absorción. Posiblemente, el
mayor inconveniente esté relacionado con la presencia de órdenes de difracción superiores.

2.3.- Recipientes para muestras

En espectrofotometría analítica, casi siempre se trabaja con disoluciones, por lo cual la mayoría
de los recipientes para la muestras son celdas o cubetas para colocar líquidos en el haz del
espectrofotómetro. Estos recipientes deben estar fabricados con un material que permita el paso de
radiación de la región espectral de interés. Así, el vidrio puede emplearse entre 350 y 2000 nm,
mientras que en la región ultravioleta se necesita cuarzo o sílice fundida (ambas sustancias también
son transparentes en la región visible).
En algunos instrumentos baratos se utilizan a veces tubos de ensayo cilíndricos como recipientes
para las muestras. Es importante que estos tubos siempre se coloquen igual, para lo que se marcan
en un lado, y la marca siempre se pone en la misma dirección cuando se coloca el tubo en el
compartimento de cuberas del instrumento.
Las celdas se deben llenar de tal forma que el haz de radiación pase a través de la disolución, con
el menisco por encima del haz. Las celdas típicas para las regiones ultravioleta y visible tienen 1 cm
de paso óptico, si bien existe una gran variedad en cuanto a tamaño, forma y otras peculiaridades,
como se muestra en la figura 9.

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Figura 9: Celdas para espectrofotometría

2.4.- Detectores
Los detectores usados en espectrofotometría ultravioleta y visible son transductores que
convierten la energía radiante en una señal eléctrica. Un detector ideal deberá presentar las
características siguientes:
 Sensibilidad elevada en la región espectral de interés.
 Respuesta lineal para la energía radiante.
 Tiempo de respuesta pequeño.
 Utilizable en un amplio intervalo de longitudes de onda.
 Elevada relación señal/ruido.
 Mínima señal de salida en ausencia de radiación.
 Buena disponibilidad para la amplificación.
Sin embargo, no existe el detector ideal, por lo que en la práctica, se evalúan todos los factores
anteriores y se selecciona algún detector que resulte adecuado al caso. Los más utilizados son:
células fotovoltaicas, fototubos, y tubos fotomultiplicadores.
2.4.1.-Células fotovoltaicas.
Consisten en una placa de hierro, que actúa de electrodo positivo, sobre la que se deposita una
fina capa de un material semiconductor, como selenio, y éste se recubre de una capa muy fina de oro
o plata, que actúa como segundo electrodo o electrodo colector (Figura 10)

Figura 10: Célula fotovoltaica

Cuando la radiación electromagnética incide sobre el selenio, se promocionan electrones a las

bandas de conducción, haciendo que pasen electrones desde la superficie del selenio hasta el
electodo colector de plata, produciéndose un aumento de la conductividad proporcional al número
de fotones que inciden sobre la superficie del semiconductor.
Las células fotovoltaicas presentan las siguientes características: son sencillas de construir,
relativamente baratas y no requieren una fuente de energía externa, por lo que pueden conectarse
directamente a un galvanómetro o un amperímetro. En cuanto a los inconvenientes, su uso limitado
a la región visible (su máxima sensibilidad se presenta hacia los 550 nm, mientras que la respuesta a
350 ya 750 disminuye hasta un 10% de la máxima), presentan dificultados para la amplificación, y
fenómenos de fatiga de forma que la corriente de salida disminuye gradualmente con el tiempo.

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2.4.2.- Fototubo
Consisten en un cátodo semicilíndrico recubierto interiormente de un material fotosensible, y un
ánodo, en el interior de un recipiente en el que se ha hecho el vacío. (Figura 11)

Figura 11: Fototubo

Cuando la radiación incide sobre el cátodo, se produce una emisión de fotoelectrones que se
dirigen al ánodo, originándose una corriente que posteriormente se amplifica. La emisión de
electrones depende de la naturaleza de la superficie del cátodo y de la frecuencia de la radiación. En
el comercio existen fototubos que difieren en el material con el que está construida la superficie del
cátodo, siendo, por tanto, diferente su respuesta a la radiación de diversas frecuencias.
Muchos espectrofotómetros están provistos de detectores intercambiables que permiten
mantener una buena respuesta en un amplio margen de longitudes de onda. En general, puede
concluirse que los fototubos son más sensibles que las células fotovoltaicas, por la posibilidad de
poder amplificar la corriente inicialmente generada.

2.4.3.- Tubos fotomultiplicadores.

Este tipo de detector consiste en un cátodo fotosensible y una serie de electrodos (dínodos),
cada uno a un potencial menos negativo que el que le precede (figura 12).

Figura 12: Tubo fotomultiplicador

La radiación que llega al fotocátodo provoca la emisión de electrones primarios, que son
acelerados hasta el primer dínodo. Al incidir en él, cada fotoelectrón origina la emisión de varios
electrones adicionales; éstos, a su vez, son acelerados hasta el dínodo 2, y así sucesivamente, hasta
que al final, la corriente así producida se recoge en el ánodo, se amplifica electrónicamente y se
mide. Normalmente, los tubos fotomultiplicadores contienen 9 ó 10 dínodos, los cuales originan de
106 a 107 electrones por cada fotón.
Este sistema de detección se caracteriza por su respuesta rápida y elevada sensibilidad. El límite
de detección viene condicionado por el ruido de fondo que se origina como consecuencia de la
emisión termoiónica, la cual puede reducirse enfriando. De hecho, estas corrientes pueden
eliminarse virtualmente enfriando el detector a -30 °C, si bien esto no se lleva a cabo en el trabajo
espectrofotométrico ordinario,

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2.5.- Instrumentos de haz sencillo y de haz doble

Las medidas de absorción de radiación ultravioleta y visible son, por su propia naturaleza, de
carácter relativo; debe de compararse, continuamente, la absorción de la muestra, conteniendo el
analito, con la de una referencia o blanco conteniendo las mismas especies que la muestra, excepto
el analito. En los instrumentos de haz sencillo hay solamente un haz de radiación que, después de
pasar a través de la muestra llega al detector. De esta forma, para comparar la absorción del blanco,
debe sustituir éste a la muestra en cada lectura, lo cual implica varios segundos entre cada medida.
Alternativamente, la muestra y la referencia pueden compararse varias veces por segundo
usando un instrumento de doble haz. En él, (figura 3) la radiación pasa alternativamente a través de
la muestra y de la referencia, lo cual se lleva a cabo mediante un motor que hace girar un espejo
("chopper") dentro y fuera de la trayectoria de la radiación. Cuando el espejo obturador intermitente
no desvía el haz, éste pasa a través de la muestra y el detector mide la potencia radiante P. Cuando
dicho espejo desvía el haz a través de la celda de referencia, el detector mide P 0. De esta forma la
radiación es desviada varias veces por segundo, y el circuito compara automáticamente P y P0 para
obtener la absorbancia.
La operación con el sistema de doble haz presenta, fundamentalmente, las dos ventajas
siguientes: la comparación muy rápida de muestra y referencia ayuda a eliminar errores debidos a
fluctuaciones en la intensidad de la fuente y del detector, inestabilidad electrónica y cambios en el
sistema óptico. Por otra parte, se facilita la posible automatización.

3.- Aplicaciones analíticas

En principio, cualquier especie química que absorba radiación electro magnética en las regiones
ultravioleta o visible es susceptible de poder ser determinada por técnicas espectrofotométricas. El
mayor campo de aplicación se encuentra en el análisis cuantitativo, siendo la espectrofotometría una
de las herramientas más usadas.

3.1.- Análisis cualitativo

Los espectros de absorción ultravioleta y visible son, en general, menos útiles con fines
cualitativos que los espectros en la región infrarroja, debido a que en aquellos las bandas son más
anchas y, por consiguiente, menos características.
La identificación de un compuesto puro requiere la comparación empírica de los detalles del
espectro (máximos, mínimos y puntos de inflexión) de la sustancia problema con los del compuesto
puro. Además, la intensidad de la absorción, expresada en términos de la absortividad molar, ε, se
usa con frecuencia como criterio adicional para la identificación, sobre todo si ε tiene un valor
elevado a determinadas longitudes de onda.
Cuando se trata de identificar sustancias orgánicas, es conveniente operar en fase de vapor y a
presión baja, ya que en estas condiciones, el espectro observado es debido a moléculas aisladas y,
generalmente es posible resolver la estructura fina vibracional y rotacional, lo que proporciona
detalles característicos para la identificación. En disolución y, sobre todo, en presencia de disolventes
polares como el agua, alcoholes, esteres y cetonas, las moléculas no se encuentran aisladas, sino
solvatadas, como consecuencia de lo cual se limita la rotación. Además, los campos del disolvente
pueden modificar de forma irregular los niveles de energía vibracionales y, cuando el número de
moléculas es grande, los niveles de energía son poco definidos, obteniéndose como resultado la
aparición de una banda.

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Análisis Instrumental Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

Una de las pocas sustancias orgánicas con espectro de absorción característico en disolución es el
benceno. Su espectro se usa frecuentemente en test de especificaciones de pureza, donde el
contenido en benceno debe ser cuidadosamente controlado, por ejemplo, en alcohol absoluto o en
ciclohexano.
Aun cuando la identificación de un compuesto orgánico de forma inequívoca con esta técnica, no
es posible normalmente, el espectro de absorción en las regiones ultravioleta y visible puede ser de
utilidad para la detección de ciertos grupos funcionales. Así, por ejemplo, la presencia de una banda
débil entre 280 y 290 nm, que se desplaza hacia menores longitudes de onda al aumentar la
polaridad del disolvente, indica la presencia de un grupo carbonilo. De cualquier forma, y para mayor
seguridad, estos datos deben usarse siempre en combinación con los obtenidos a partir de espectros
infrarrojos, de resonancia magnética nuclear o cualquier otra información analítica de que se
disponga. En resumen, el espectro de absorción ultravioleta y visible no es una prueba infalible de la
identidad de una especie química, pero sí representa otra herramienta disponible para aplicarla de
forma inteligente.
En cuanto a sustancias inorgánicas, casi las únicas que tienen espectro de absorción ultravioleta y
visible característico son los iones trivalentes de las tierras raras. De hecho, el Ho2O3 se utiliza en
ocasiones para comprobar el calibrado de la longitud de onda de algunos instrumentos.

4.2.- Análisis cuantitativo

Ya se ha comentado que la espectrofotometría de absorción ultravioleta y visible es una de las
técnicas más usadas en análisis cuantitativo. Se ha estimado que solo en el campo biosanitario un
95% de las determinaciones analíticas se llevan a cabo por espectrofotometría.
En relación con los métodos clásicos de análisis (gravimétricos y volumétricos), los métodos
espectrofotométricos son menos exactos, si bien su mayor sensibilidad (10-4-10-6 M) y rapidez los
hace competir ventajosamente con aquellos en muchas ocasiones. La precisión puede considerarse
aceptable, ya que, normalmente se obtienen incertidumbres relativas entre 1 y 2 % aunque con
determinadas precauciones pueden reducirse considerablemente.
La base de la aplicación de los métodos espectrofotométricos al análisis cuantitativo es la ley de
Beer. El procedimiento a seguir para llevar a cabo una determinación analítica consta de una serie de
etapas encaminadas a establecer las condiciones de trabajo y la preparación de la curva de calibrado.
a) Selección de la longitud de onda. Las medidas de absorbancia se llevan a cabo normalmente a
la longitud de onda correspondiente al máximo de absorción, ya que de esta forma se obtienen
máximas sensibilidades. Por otra parte, en esa zona, la curva espectral suele ser bastante plana, por
lo que el cumplimiento de la ley de Beer es normalmente satisfactorio.
A veces no es posible operar a la longitud de onda del máximo de absorbancia cuando a esa
longitud de onda absorbe apreciablemente alguna especie (distinta del analito) presente. Incluso, en
ocasiones, el propio reactivo.
b) Preparación de las muestras para el análisis. Muchos compuestos orgánicos absorben en la
región ultravioleta y el tratamiento de la muestra solo implica la separación de las posibles
interferencias. Por otra parte, algunos elementos inorgánicos absorben intensamente en la región
visible, pero solo en ciertos estados de oxidación. En estos casos, una etapa previa (además de la
disolución si se trata de muestras sólidas) debe incluir un proceso redox para llevar el elemento al
estado de oxidación adecuado. Así, por ejemplo, el manganeso se determina frecuentemente en
forma de permanganato. previa oxidación con persulfato:
2 Mn2+ + 5 S2082- + 8 H2O -> 2 Mn04- + 10 S042- + 16 H+
La disolución violeta de permanganato presenta un máximo de absorbancia a 525 nm.

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Análisis Instrumental Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

En otras ocasiones es posible desarrollar un color por medio de reactivos orgánicos o

inorgánicos. Así, por ejemplo, el Fe3+ puede determinarse mediante el color rojo de los complejos
formados con SCN-; el Ni2+ por el color rosa de su quelato con dimetilglioxima, etc.
c) Determinación de la relación absorbancia-concentración. Una vez conocida la absorbancia de
una determinada especie, en principio, se podría obtener lo concentración a partir de la ley de Beer:
A = ε b c. Sin embargo, no es prudente asumir el cumplimiento de dicha ley y utilizar un solo patrón
para determinar la absortividad molar, ε. Asimismo, tampoco es conveniente basar los resultados de
un análisis en un valor de la bibliografía para obtener ε. Por ello, el método normal de trabajo
consiste en la preparación de un calibrado a partir de una serie de disoluciones patrón, preparadas
en las mismas condiciones que la muestra y obtener los resultados por interpolación.
Cuando se trata de analizar materiales complejos, es muy difícil, si no imposible, reproducir en
los patrones las condiciones de las muestras. En estas ocasiones suele ser de utilidad el método de
adición estándar, con objeto de contrarrestar los efectos de la matriz. Este método, en análisis
espectrofotométrico, se suele aplicar de la siguiente manera: a varias alícuotas idénticas de la
muestra se adicionan volúmenes variables de una disolución estándar del analito de concentración
conocida. Se añaden entonces los reactivos correspondientes al método empleado y cada disolución
se enrasa a un volumen fijo, antes de medir la absorbancia. Si se cumple lo ley de Beer, los datos se
representan como en la figura 13 a partir de la cual se obtiene el punto de corte de la recta
(obtenida, si es necesario, por ajuste por mínimos cuadrados) con el eje horizontal y, a partir de ahí,
la concentración de la muestra original.

Figura 13: Método de adición estándar para análisis espectrofotométrico

Análisis de mezclas de sustancias absorbentes

Cuando en una disolución hay varias sustancias que absorben radiación, es posible, en muchos
casos. Ilevar a cabo su determinación sin necesidad de separar previamente los distintos
componentes. Se va a considerar el caso de que la muestra esté constituida por los componentes M y
N. La forma de proceder depende de los espectros de absorción de ambas especies, y pueden
presentarse los siguientes casos:
Espectros no superpuestos. En estas ocasiones, como se muestra en la figura 14 es posible
encontrar algunas longitudes de onda a las que absorba solo una de las especies; λ1 para determinar
M y λ2 para determinar N.

Figura 14: Análisis de mezclas. Espectros no superpuestos.

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Análisis Instrumental Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

Espectros superpuestos parcialmente. Cuando la situación es como se muestra en la figura 15, la

especie N no interfiere en la medida de M a la longitud de onda λ1, por lo que la determinación de
esta especie puede hacerse directamente a λ1. A continuación se determina la absorbancia de M a la
longitud de onda λ2 a partir de la absortividad molar (en una experiencia previa) y finalmente, se
resta esta contribución de la absorbancia medida a λ2. Con ello se obtiene la absorbancia del
componente N. cuya concentración se calcula posteriormente de

Figura 15: Análisis de mezclas. Superposición parcial de espectros

Espectros completamente superpuestos. Como se indica en la figura 16 no es posible encontrar

una longitud de onda en la que M y N absorban de forma exclusiva.

Figura 16: Análisis de mezclas. Espectros superpuestos.

En este caso, el problema se resuelve midiendo las absorbancias A1 y A2 a las longitudes de onda
λ1 y λ2 respectivamente, y planteando las ecuaciones siguientes:
A1 = εM1 b CM + εN1 b CN (a λ1)
A2 = εM2 b CM + εN2 b CN (a λ2)
Esto es posible porque la ley de Beer establece que la absorbancia es una propiedad aditiva, de
forma que la absorbancia total de una disolución a una longitud de onda dada es igual a la suma de
las absorbancias de los componentes individuales presentes.
En las ecuaciones anteriores, b representa el camino óptico y εM1, εM2, εN1 Y εN2 los absortividades
molares de M y N a las longitudes de onda λ1 y λ2 que deben ser determinadas previamente a partir
de disoluciones patrón, o mejor, a partir de las pendientes de sus representaciones de la ley de Beer.
Esta forma de proceder es válida solo si se cumple la ley de Beer y si los dos componentes se
comportan independientemente uno del otro. La mayor precisión se alcanza cuando se eligen
longitudes de onda en las que las diferencias entre las absortividades molares sean grandes: a λ1 ε1
grande y ε2 pequeña, y a λ2 ε1 pequeña y ε2 grande. Sin embargo, no todos los sistemas se comportan
de este modo. Puede ocurrir que exista solapamiento a todas las longitudes de onda y que, para cada
λ, εM > εN. Un procedimiento alternativo para analizar estas muestras consiste en un método gráfico,
cuyo fundamento es el siguiente; la primera de las ecuaciones anteriores puede escribirse asi:

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Análisis Instrumental Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

𝐴1 𝜀𝑁1
= 𝐶𝑀 + 𝐶
𝜀𝑀1 𝑏 𝜀𝑀1 𝑁
En lugar de medir A, εM y εN solamente a dos longitudes de onda, se miden estas magnitudes a
varias, para lo cual es necesario disponer de los espectros correspondientes a los componentes puros
y a la mezcla desconocida. Para un cierto número de medidas, se representan gráficamente los
valores de A/εM b frente a εN/εM, obteniéndose una línea recta. La pendiente de la recta permite
obtener CN y la ordenada en el origen. CM. El método puede extenderse con facilidad a sistemas de
tres componentes. La principal ventaja del método es que el uso de múltiples puntos a lo largo de
todo el espectro, en lugar de utilizar solamente dos permite alcanzar un grado superior de precisión y
exactitud.

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