Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia.

Laboratorio de
Microbiología General

Presentado por: Maria Paula Salamanca Martinez

PRACTICAS 2 Y 3. TINCIONES DIFERENCIALES Y ESPECIALES
Objetivo Principal: Reconocer las diferentes técnicas de tinción usadas en el laboratorio para identificar
distintas estructuras y tipos de microorganismos bacterianos
Objetivos específicos:

 Identificar microorganismos de acuerdo con su clasificación empleando tinciones diferenciales,

teniendo en cuenta: forma (cocos, bacilos), agrupación (estreptococos, estafilococos, tétradas,
sarcinas) y tinción de Gram (Gram (+) y Gram (-))
 Correlacionar los diferentes conceptos teóricos a cerca de la composición de membranas y
paredes celulares con lo que se puede observar en el laboratorio.
 Identificar las tinciones de Zielh Nieelsen, Sheaffer Foulton y tinciones negativas como técnicas
o herramientas que nos permiten visualizar diversos aspectos de los microorganismos a nivel
microscópico.
Resultados y discusión:
En el laboratorio de microbiología usamos las diferentes técnicas de tinción para poder destacar a los
diversos microorganismos estudiados a nivel microscópico, los colorantes nos ayudan visualizar y
agrupar las principales características de los microorganismos, evidenciar las diferencias estructurales
existentes entre ellos y observar las partes que conforman a la célula. Existen dos grandes tipos de
tinciones usadas: las tinciones simples y las tinciones compuestas; específicamente, las tinciones
compuestas se caracterizan por hacer uso de dos o mas colorantes, lo que nos ayuda a distinguir entre
diferentes tipos de microorganismos o entre dos partes diferentes de la célula evidenciada.
Dentro de las tinciones diferenciales más comunes se encuentran las tinciones de Gram, este es uno de
los procedimientos más útiles por que nos permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos:
bacterias Gram (+) y bacterias Gram (-), el proceso de tinción de Gram consiste a grandes rasgos en
hacer uso de un colorante primario (cristal violeta) que coloree a todas las células de una muestra y
aplicar un mordiente (químico que ayuda a fijar el
colorante en cierto tipo de células), para luego
lavarlo con un agente decolorante y proseguir con la
tinción haciendo uso de un colorante secundario
(safranina) que teñirá a las células decolorizadas del
paso anterior, permitiendo observar una clara
diferenciación entre aquellas que retuvieron el
colorante primario y las que no; de modo que
identificaremos a las bacterias Gram (+) en color
violeta, ya que estas retuvieron el colorante, y a las
bacterias Gram (-) en rosa, ya que se tiñeron con el
colorante secundario o de contraste tal y como se
observa en la Figura 1. El hecho de que las
Figura 1. Micrografía de bacterias teñidas con Gram
bacterias Gram (+) sean capaces de retener el
colorante y las Gram (-) no, se basa en la conformación estructural de su pared celular, ya que las
bacterias Gram (+) se caracterizan por tener su pared celular compuesta por varias capas de
peptidoglicano compuesto por disacáridos y aminoácidos que forman una estructura más gruesa y rígida
a diferencia de las bacterias Gram (-) que contienen una capa delgada del mismo y una membrana
externa formada por lipopolisacáridos. En la tinción el colorante primario ingresa a el citoplasma de
ambas células, pero luego de que se añade el mordiente se forma un complejo entre este y el colorante
que hace que los cristales no puedan abandonar la pared celular de las células Gram (+), de modo que
cuando el agente decolorante se aplica, este deshidrata al peptidoglicano de la pared Gram (+) haciendo
al colorante impermeable y que la célula se mantenga coloreada. Por otro lado, en las bacterias Gram
(-) el agente decolorante disuelve la membrana externa de la pared de la célula haciendo que la capa
delgada de peptidoglicano sea permeable al complejo colorante-mordiente y esta célula pierda el color
por lo que se hace necesario aplicar otro colorante para poder diferenciarla.
Además de clasificar a los microorganismos en Gram (+) y (-), esta tinción tal y como se evidencia en la
Figura 1, nos permite evidenciar distintas morfologías bacterianas, como es el caso de los cocos que
se presentan de forma esférica, los bacilos que tienen forma de bastón y los vibriones que presentan
una forma curveada; además cabe resaltar que la diferenciación entre bacteria Gram (+) y (-) nos
proporciona información útil para determinar tratamientos para ciertas infecciones, ya que por lo general
las bacterias Gram (+) suelen ser destruidas por las penicilinas y las Gram (-) suelen ser resistentes a
los antibióticos, ya a estos se les dificulta atravesar la membrana externa de lipopolisacárido. La técnica
de Gram presenta como desventaja el hecho de que algunas células se tiñen deficientemente o no lo
hacen, por lo que los resultados pueden ser errados, de tal modo que se recomienda utilizar cultivos
bacterianos jóvenes para evitar estos errores.
Otra de las técnicas de tinción diferencial usadas es la Zielh Nieelsen (acido alcohol resistente), esta
técnica es especializada para identificar a las micobacterias, las cuales poseen una compleja estructura
en su pared celular muy rica en lípidos que la hacen hidrófoba y resistente a coloraciones básicas
comunes, por lo que esta técnica se basa en primero usar el colorante rojo carbolfucsina para luego
tratar la muestra con un ácido-alcohol que eliminará el color rojo de aquellas bacterias que no posean la
ácido-alcohol resistencia logrando así la diferenciación de estas con ayuda de un colorante de contraste;
en este caso las bacterias acido-alcohol resistente retienen el color rojo debido a que el colorante usado
(carbolfucsina) es más soluble en los lípidos de este tipo de bacterias que en las otras. Esta identificación
puede resultar de gran ayuda para identificar bacterias con gran importancia patológica, como lo son
mycobacterium tuberculosis, la cual causa la tuberculosis y mycobacterium leprae que causa la lepra.
Cuando se requiere detectar o visualizar partes
específicas de distintos microorganismos, las tinciones
especiales son técnicas que nos permiten visualizar la
presencia de esporas, flagelos y cápsulas bacterianas.
Dentro de este grupo encontramos a las tinciones
negativas para evidenciar a las cápsulas bacterianas,
las cuales son una capa de polisacáridos que rodean a
la célula actuando como una barrera para las defensas
del organismo infectado; esta cápsula particularmente
repele a los tintes, especialmente en la tinción negativa,
lo que se busca es que el colorante usado (tinta china)
o un colorante de carácter ácido se disponga en el
Figura 2. Micrografía de bacterias teñidas usando la
fondo permitiéndonos evidenciar a los organismos
tinción negativa
translúcidos que destacarán del fondo oscuro o que pueden ser teñidos usando un colorante de
contraste como se evidencia claramente en la Figura 2, donde la cápsula se ve de una manera más
clara en forma de halos que rodean a la bacterias teñidas. Las cápsulas son una parte específica de la
bacteria que es importante identificar, pues estas son un medio para determinar la virulencia del
microorganismo.
Las esporas bacterianas son células diferenciadas formadas
por algunos tipos de bacterias que se encuentran
habitualmente en suelos, y que suelen ser resistentes al calor
y difíciles de reproducir, encontramos aquellas que se
encuentran dentro de la bacteria (endoesporas) distribuidas
en distintas partes de la misma y las que se encuentran fuera
de ella (exoesporas), las esporas pueden encargarse de
proteger a la bacteria de condiciones ambientales adversas
y sus paredes son bastante resistentes a la permeabilidad de
los colorantes, por lo que se hace uso de la técnica de
Sheaffer Foulton que consiste en usar el colorante verde de
malaquita fijado al calor de modo que tal y como se evidencia
en la Figura 3 este pueda atravesar la pared de las esporas
tiñéndolas de verde, así al usar un colorante de contraste
para teñir a la célula vegetativa (no forma esporas) podamos Figura 3. Micrografía de bacterias teñidas
identificar en este caso a las endoesporas bacterianas de por la técnica Sheaffer Foulton
forma clara. Las esporas pueden ser identificadas al
microscopio sin necesidad de realizar esta técnica ya que presentan un índice de refracción alto, pero
para poder diferenciarlas claramente de las células vegetativas, estas deben ser teñidas como se explicó
anteriormente.
Como hemos discutido a lo largo del documento existen diversas técnicas de tinción que nos permiten
diferenciar tipos de microorganismos, morfologías y estructuras especializadas, cada una de esas
técnicas se basan en las distintas composiciones de las paredes celulares que caracterizan a estos
microorganismos y que nos permiten reconocer aspectos vitales de estas células, así como
características que pueden afectarnos a nivel infeccioso; cada técnica tiene su utilidad y sus parámetros
para llevarse a cabo, de manera que como investigadores podamos identificar que es lo que
necesitamos utilizar para obtener visualizaciones exitosas.
Conclusiones:

 Existen diferentes técnicas de tinciones diferenciales que nos permiten identificar diferentes tipos
de microorganismos, morfologías y aspectos estructurales y funcionales especificos que nos
permiten entenderlos y estudiarlos más a profundidad.
 Es fundamental entender y conocer la composicion de las distintas estructuras bacterianas tales
como la pared celular y membrana celular de sus distintas estructuras para comprender de
manera clara que visualizamos y sacar conclusiones correctas en los estudios realizados.
 Las tinciones especiales, surgen como tecnicas que nos permiten diferenciar estructuras
bacterianas específicas que cumplen sus distintas funciones dentro del microorganismo y que
como investigadores nos proporcionan datos importantes como la virulencia que presentan.
Referencias:
  Figura 1: Tomada de Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2013). Introducción a la
microbiología (9.a ed.). pág 55
 Figura 2: Black, J. G., & Black, L. J. (2012). Microbiology: Principles and Explorations (8.a ed.).
Arizona, USA: John Wiley & Sons Inc. pág 66
 Figura 3: Black, J. G., & Black, L. J. (2012). Microbiology: Principles and Explorations (8.a ed.).
Arizona, USA: John Wiley & Sons Inc.pág 68

 BIOLOGÍA DE LAS MICOBACTERIAS. (s. f.). Recuperado 12 de septiembre de 2020, de

http://www.fcq.uach.mx/phocadownload/DOCENCIA/MATERIAL-DE-
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%C3%A9risticas%20mas%20importantes%20del,Su%20%C3%A1cido%20alcohol%20resisten
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 Black, J. G., & Black, L. J. (2012). Microbiology: Principles and Explorations (8.a ed.). Arizona,
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 Koneman, E. W., & Allen, S. (2008). Koneman. Diagnostico Microbiologico/ Microbiological
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 López Díaz, Z., & Garcia Tarrau, M. (2013). TEMA 2. Bacterología. | UVS Fajardo. Recuperado
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 Picazo, J. J., Rodríguez, J. Á. G., & de la Garza, J. J. P. (1999). Compendio de Microbiología
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 Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2013). Introducción a la microbiología (9.a ed.).
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 Vela, N. A. C. (2006). Glosario de Biotecnología. Recuperado de
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ciada&source=gbs_navlinks_s
PREGUNTAS:

1. ¿Establezca las diferencias en cuanto a composición bioquímica de las paredes bacterianas de

Gram (+) y Gram (–)?
Rta: La pared celular Gram (+) tiene dos componentes principales, peptidoglicano y ácidos teicoicos,
además de carbohidratos y proteínas adicionales. Su principal componente es el peptidoglicano,
exclusivo de las células procariotas. El peptidoglicano consiste en una cadena lineal de glucano con dos
azúcares alternados, N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM). El segundo
componente en importancia es el ácido teicoico, este es un polímero de fosfato de glicerol con diversos
azúcares, amino azúcares y aminoácidos como sustituyentes. Además, estas bacterias tienen un
componente llamado ácido lipoteicoico que está relacionado con el anclaje de la pared a la membrana
celular.

Las Gram (-) se asemejan con las Gram (+) en la presencia de peptidoglicano que se encuentra en una
cantidad menor formando una vaina de una sola capa alrededor de la célula, mientras que el resto forma
el gel periplásmico, con pocos enlaces cruzados. Fuera del periplasma está la membrana externa, única
de las Gram (-), más sin embargo con una estructura general parecida a la mayoría de las membranas
biológicas con fosfolípidos y proteínas en la cara interna, mientras que en la externa los fosfolípidos se
reemplazan con una molécula especial llamada lipopolisacárido (LPS), que es en extremo tóxica para
los humanos y otros animales y es denominada endotoxina. (Sherris microbiología médica).

2. ¿Según el fundamento de la coloración de Gram, ¿cómo podemos clasificar taxonómicamente a

las bacterias?
Rta: Las bacterias de acuerdo con la tinción de Gram pueden clasificarse en Gram (+) y Gram (-), esto
dependiendo de la capacidad que presentan para retener el colorante primario (cristal violeta) después
de la decoloración.
3. ¿De qué depende que las bacterias Gram (+) tomen el cristal violeta y lo retengan en su
citoplasma comparado con las Gram (–)?
Rta: Una vez se tiñe con cristal violeta, se aplica el mordiente que forma un complejo con el colorante,
haciendo que en la pared de peptidoglicano más gruesa (correspondiente a las Gram (+)) se retenga el
colorante aun después de llevar a cabo la decoloración, mientras que en las bacterias Gram (-) el agente
decolorante disuelve la membrana externa de la pared de la célula haciendo que la capa delgada de
peptidoglicano sea permeable al complejo colorante-mordiente y esta se decolore.
4. ¿Cuál es la importancia de la utilización de cultivos jóvenes (12-24 horas) para la realización de
tinciones?

Rta: Es importante realizar tinciones con cultivos jóvenes ya que en los cultivos viejos las bacterias
Gram (+) en especial, tienden a perder la habilidad para retener el colorante debido a desgastes de la
pared, de modo que podemos cometer errores al notar que algunas se tiñen con el cristal violeta y otras
no, pero que en esencia corresponden a las bacterias de esta clasificación. (Alberto rojas UNAL)

5. ¿Qué implicaciones tiene fijar la muestra con calor antes de realizar la tinción y qué precauciones
se toman el respecto?
Rta: Al fijar los microorganismos, se produce la muerte celular preservándose la morfología celular, la
fijación al calor además de ayudar a la adhesión de estos a la placa funciona como segundo mordiente
o mordiente físico en el proceso de facilitar la fijación del color o el ingreso de este a las células. Se debe
asegurar de ubicar la placa en la llama por el lado adecuado ya que, si se hace por donde está el cultivo,
las células se quemarán, también es fundamental verificar que tan cerca se pone y cuánto puede estar
el microorganismo ahí. (Alberto Rojas UNAL)
6. ¿Qué papel juega el Lugol en la tinción de Gram?
Rta: El Lugol tiene el papel de mordiente, ya se encarga de fijar el color mediante la formación del
complejo cristal violeta-yodo (CV-I), el cual es insoluble. Solo en las células Gram (+) el complejo se
unirá al ácido ribonucleico-magnesio de la pared celular haciendo la decoloración más difícil, no logrando
remover el complejo en Gram (+) que en las Gram (-). (Alberto Rojas UNAL)
7. ¿Qué papel juega la Fucsina en la tinción de Gram?
Rta: La fucsina es usada como un colorante de contraste, ya que después de realizar la decoloración,
en la tinción de gran, aquellas que no retuvieron el complejo cristal violeta-yodo (Gram (-)) quedarán
translucidas, de modo que para poder evidenciarlas estas deben teñirse con ese colorante secundario.
8. ¿Cómo es la preparación óptima de un frotis y cómo influye en la tinción de la preparación?
Rta: El primer paso es limpiar las láminas con agua y jabón, secarlas con papel y desengrasar la lámina
con alcohol dejándolo evaporar, para después marcar la lámina con el nombre o numeración de la
muestra. El segundo paso es extender las bacterias en círculos y longitudinal en la manteniendo los
materiales estériles; luego es mejor permitir que el extendido se seque al aire, para luego fijado al calor.
El uso del portaobjetos engrasado o sucio conllevará una mala fijación del frotis y por ende un mal teñido
de la muestra; el sobrecalentamiento del frotis también provoca daños físicos en la pared afectando la
retención de los colorantes al igual que un frotis grueso también es causal de decoloración inadecuada.
(Alberto Rojas UNAL)
9. ¿Cuál es la composición de la pared de bacterias ácido alcohol resistentes?
Rta: Las bacterias pertenecientes a este grupo (micobacterias) poseen una pared celular compleja que
no solo les confiere la acido-alcohol resistencia, si no también resistencia a detergentes y agentes
antimicrobianos comunes. Esta pared está compuesta por ácidos micólicos, una capa de peptidoglicano
llamada lipoarabinomanano (LAM). Aquí el peptidoglicano está unido a un polisacárido ramificado
llamado arabinogalactano por enlaces fosfodiéster; el complejo formado por peptidoglicano, ácido
micólico y arabinogalactano es el que forma el esqueleto de las paredes celulares de estas bacterias.
(«BIOLOGÍA DE LAS MICOBACTERIAS», s. f.)
10. ¿Cómo se explica el concepto de ácido-alcohol resistente?
Rta: El concepto de ácido-alcohol resistencia hace referencia a aquellas bacterias que en la técnica de
tinción de Zielh Nieelsen resisten la decoloración con colorantes enérgicos, como lo son las soluciones
de etanol y ácido clorhídrico, esta resistencia se debe a que este tipo de bacterias posee en su pared
celular ácidos micólicos formando esterificaciones que dan como resultado una pared lipídica hidrófoba,
de modo que la pared dificulta la difusión de moléculas hidrofílicas como los colorantes haciendo que
estos no sean arrastrados por los decolorantes usados. («Métodos Tinciones», s. f.)
11. ¿Cuál es la composición de la pared de las endosporas?
Rta: Las endoesporas poseen una capa proteica que las rodea y les confiere buena resistencia tanto
química como enzimática, seguida de una capa muy gruesa de peptidoglicano llamado corteza, esta es
necesaria para la deshidratación de la base de la espora, lo que la ayuda a resistir temperaturas altas.
La membrana interna, debajo de la pared de célula diferenciada (endoespora), es una barrera importante
de permeabilidad contra varios productos químicos potencialmente perjudiciales. («Endospora de
Bacterias | Department of Microbiology», s. f.)
12. ¿Qué papel juega el calor en la realización de tinciones de Sheaffer Foulton y Zielh Nieelsen?
Rta: Para realizar este tipo de tinciones, es necesario que la muestra primero se encuentre fijada al
portaobjetos por calor para garantizar que las bacterias queden adheridas al vidrio de modo que no
exista mayor alteración en sus morfologías, sino que además es necesario que al teñir se caliente la
preparación, ya que debido a las composiciones de pared de este tipo de células (acido-alcohol
resistente y esporas) es difícil que el colorante penetre y tiña a las células, de modo que el calor les
ayuda a penetrar la pared celular.
 13. ¿Qué estructuras tiñe la Fucsina en microorganismos esporulados?
Rta: En la técnica de Sheaffer Foulton la fucsina se usa como colorante de contraste y su función es
teñir a la célula vegetativa que produce la espora de modo que esta pueda ser diferenciada de esta que
es teñida con el verde de malaquita.
14. ¿Cuál es el fundamento de las tinciones que se realizan para la identificación de estructuras
flagelares?
Rta: Se basa en el empleo de un mordiente y el carbolfucsina para crear un complejo que aumenta el
diámetro de los flagelos haciendo que estos sean más visibles a la luz del microscopio, ya que estas
estructuras son demasiado pequeñas y difícilmente distinguibles. (Tortora, Funke, & Case, 2013)
15. ¿Cuál es el fundamento del empleo de la Tinta China para observación de microorganismos
encapsulados?
Rta: La tinta china es usada en la técnica de la tinción negativa, aquí tiene la finalidad de teñir el fondo
en el que se encuentran las bacterias con cápsulas, ya que las cápsulas por su composición no poseen
afinidad con los colorantes o la tinta china, de modo que en la visualización de la muestra teñida
negativamente veremos la capsula sin teñir haciendo contraste con el fondo negro, esta se puede
diferenciar también del resto de la célula usando un colorante de contraste.
16. ¿Estructuras como esporas y cápsula son evidenciables en todos los microorganismos? ¿Por
qué?
Rta: Estas estructuras no son evidenciables en todos los microorganismos, puesto que no son vitales
para la supervivencia de la célula, los microorganismos producen estas estructuras con el fin de tener
una ventaja, por ejemplo la cápsula le confiere a la bacteria una capacidad antigénica de forma que las
bacterias la presentan cuando es necesaria para la supervivencia dentro del huésped pero no es
indispensable, de igual modo sucede con las esporas que no son estructuras vitales. (Pirez & Mota, s.
f.)
Referencias:

 Pirez, M., & Mota, M. (s. f.). Morfología y estructura bacteriana. Recuperado 15 de septiembre de
2020, de http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf
 Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2013). Introducción a la microbiología (9.a ed.).
Recuperado de:
https://books.google.com.co/books?id=Nxb3iETuwpIC&dq=tinciones+microbiologia&source=gb
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 Endospora de Bacterias | Department of Microbiology. (s. f.). Recuperado 15 de septiembre de
2020, de https://micro.cornell.edu/research/epulopiscium/espanol/endospora-de-
bacterias/#:%7E:text=La%20capa%20proteica%20externa%20que,peptidoglicano%20especiali
zada%20llamada%20la%20corteza.&text=Esta%20capa%20de%20peptidoglicano%20ser%C3
%A1,de%20que%20la%20endospora%20germine.
 Métodos Tinciones. (s. f.). Recuperado 15 de septiembre de 2020, de
https://www.ugr.es/%7Epomif/pom-bac/pb-iii/pb-iii-3-acido_alcohol.htm
 BIOLOGÍA DE LAS MICOBACTERIAS. (s. f.). Recuperado 12 de septiembre de 2020, de
http://www.fcq.uach.mx/phocadownload/DOCENCIA/MATERIAL-DE-
ESTUDIO/micobacterias/biologia/biologia_de_las_micobacterias.html
 Rojas, A. (2011). Conceptos y práctica de microbiología general. Palmira: UNAL