UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

FACULTAD DE QUÍMICA

PROGRAMA DE POSGRADO EN ALIMENTOS DEL

CENTRO DE LA REPÚBLICA (PROPAC)

DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE SISTEMAS

NANOPARTÍCULADOS CON INGREDIENTES ALIMENTICIOS
COMO VECTORES PARA INCREMENTAR LA VIDA ÚTIL DE
ALIMENTOS.

TESIS

Que como parte de los requisitos para obtener el grado de

DOCTOR EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS

Presenta:

María de la Luz Zambrano Zaragoza

Dirigido por:

Dr. Edmundo Mercado Silva

Dr. David Quintanar Guerrero

Santiago de Querétaro, Qro., Enero 2013

i
 RESUMEN
El objetivo principal de esta tesis doctoral fue investigar como incrementar la vida
útil de fruta entera y cortada mediante el desarrollo de dispersiones a nivel nanométrico
(nanocápsulas y nanopartículas lipídicas sólidas) con ingredientes aceptados para su uso
en alimentos como modificadores de sistemas barrera convencionales y activos. Los
sistemas de talla submicrónica se evaluaron en dos etapas, aplicados en manzana fresca
cortada y guayaba entera, tomados como modelos con la finalidad de evaluar las
posibilidades de las nanopartículas aplicadas como recubrimiento en la conservación de
frutas. En la etapa 1, se prepararon nanocápsulas por el método de emulsificación-
difusión, obteniéndose las condiciones óptimas para la preparación: 200 mg de polímero
(poly-ε-caprolactona), 5 % de estabilizante (alcohol polivínilico), y veolocidad de agitación
de 4,000 rpms. Los sistemas estudiados fueron goma xantana, solución, nanocápsulas,
nanoemulsión y emulsión con -tocoferol. Los recubrimientos fueron preparados con 0.3
% de goma xantana y 2 g/L de dl--tocoferol. Se evaluó la efectividad de los sistemas en
la conservación de manzana fresca cortada en relación a las variables que inducen el
oscurecimiento del fruto y cambios fisicoquímicos. Los sistemas fueron estables por ocho
semanas. Los tamaños de partícula promedio fueron de 300 nm y potencial zeta de -45
mV lo que indica que los sistemas fueron estables. Los sistemas de talla submicrónica
fueron los más efectivos en el control del oscurecimiento, las nanocápsulas tuvieron un
mejor control del índice de oscurecimiento de 34 con respecto a un inicial de 26, seguido
por nanoemulsión 41 y nanoesferas de 43. Fue posible además corroborar que las
nanocápsulas presentaron la menor actividad polifenoloxidasa (1038 U/mL), mínimas
variaciones en el contenido de fenoles totales (430 mg EAg/g de muestra) y poca
variación en la actividad fenilalaninamonio liasa (2.88 µmol/g h). Las micrografías pusieron
en evidencia la presencia de entidades capsulares distribuidas homogéneamente en el
producto. En la etapa 2 se prepararon nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) a partir de
lípidos sólidos (cera de candeuba), se aplicaron a guayaba entera que fue almacenada en
refrigeración a 8ºC. Las NLS se incorporaron en un recubrimiento con base en goma
xantana (0.4 %), para estudiar su efecto sobre la vida útil. Los recubrimientos contenían
de 6 a 8 % de una dispersión de 10 % de cera de candeuba en las NLS. Mediante
microscopía electrónica, se logró evidenciar que a concentraciones por encima de 75 %
de NLS se provoca a la falta de oxígeno, lo que desarrollo daño fisiológico.
Demostrándose que las concentraciones que favorecen la conservación del fruto hasta
por cinco semanas fueron con 60 y 65 % de nanopartículas lipídicas sólidas. Además se
logró establecer que la utilización de nanocápsulas y nanopartículas lipídicas sólidas
contribuyen a incrementar la vida útil de los frutos estudiados y que además tienen una
mejor funcionalidad que los sistemas convencionales empleados comercialmente.

Palabras clave: Manzana, Guayaba, Nanocápsulas, Nanopartículas lipídicas sólidas,

Recubrimientos.

ii
 SUMMARY
The main goal of this doctoral thesis was to develop nano-scale dispersions (solid
lipid nanoparticles and nanocapsules) from acceptable food ingredients as modifiers of
conventional barrier systems and active additives to increase the shelf-life on whole and
fresh-cut fruit. Submicron size systems were evaluated on the surface of fresh-cut apple
and whole guava; these fruits were used as fruit models to evaluate the potential effect of
nanoparticles in conventional coatings on the preservation of fruit. In a first step,
nanocapsules were prepared by emulsification-diffusion method, obtaining the optimal
conditions of preparation: 200 mg of polymer (e. g. poly-ε-caprolactone), 5% of stabilizer
(e. g. polyvinyl alcohol) and agitation rate of 4.000 rpm. The systems studied were:
xanthan gum, “solution”, nanocapsules, nanoemulsion and emulsion all with 2 g/L of dl--
tocopherol (antioxidant agent). Coatings were prepared with 0.3 % of xanthan gum and 0.5
% propylenglycol. The systems effectiveness was evaluated in fresh-cut apples
conservation. The stability of the systems was above eight weeks. The particle size was of
300 nm and zeta potential -45 mV suggesting high dispersion stability. Submicron size
systems were the most effective to control the browning. Nanocapsules had the best
browning index control with a value of 34 with respect to an initial condition of 26, followed
by nanospheres with browning index of 41 and nanoemulsion with browning index of 43. It
was also possible to confirm that the nanocapsules had the lowest polyphenol oxidase
activity (1038 U/mL), negligible variation in total phenol content during storage time (430
mg EAG/g sample), and unchanged in phenilalaninamonie lyase activity (2.88 µmol/g h).
The micrographs showed the presence of capsular entities homogeneously distributed in
the product. In a second step, solid lipid nanoparticles were prepared from acceptable
solid lipids (e. g. candeuba wax), they were incorporated in a coating based on xanthan
gum (0.4 %) in order to study its effect on the fruit shelf-life. Coatings containing between
60 to 80 % of a dispersion of 10 % candeuba wax of nanoparticles were applied on guava
whole stored at refrigeration (8ºC). Scanning electron microscopy confirmed that
concentrations higher of 75 % of nanoparticles produced physiological damage due
apparently to the lack of oxygen. Concentrations that improve guava preservation for five
weeks were 60 and 65 % of lipid solid nanoparticles. It was possible to further provide that
the use of solid lipid nanoparticles and nanocapsules help to increase the shelf-life of the
fruits studied and also have better functionality than conventional commercial systems.

Keywords: Apple, Guava, Nanocapsules, Solid lipid nanoparticles, Coatings.

iii
 DEDICATORIAS

Este trabajo esta dedicado a esa mezcla genética que hizó posible mi existir,
pensamiento y sentimiento, a esa pequeña semilla que fue sembrada en mi primera
infancia y que ha sido la luz que ha alumbrado mi camino, al entorno que hizó la
diferencia y a la vida que nos hace trascender en el espacio de tiempo, por ser un
continuo en la humanidad que intenta ser superior a cualquier error de transcripción
genética…

A mis hijos David Ybraim y Sebastian, quienes han sido pacientes observadores en
este trayecto de vida, me han apoyado, tranquilizado y sonreído cuando más lo he
necesitado, por su abrazo calido, por sus besos tiernos y su gran fortaleza… gracias
por su tiempo, por ayudarme a enfrentar el mejor y más difícil reto de la vida, el de
ser madre, por quererme y aceptar que no tuvieron una madre normal!

A David, mi compañero de vida, que escucha mis filosofías y que día día intenta
entenderme sin lograrlo y como hacerlo….IMPOSIBLE, si las cosas se fueron
sucediendo de forma inesperada, sin planearlo y sin mayor futuro que el ahora…. te
amo y te estoy amando, gracias por estar, por hacerme tan feliz, aunque la queja
continua sea mi forma de expresarlo… Soy y estoy feliz de estar a tu lado.

iv
 AGRADECIMENTOS
Agradezco al Dr. David Quintanar, por dirigirme con el mayor interés, por hacer posible este
trabajo por mezclar sus conocimientos con los poco que hubiese yo adquirido para aplicar lo ya
aprendido a la conservación de alimentos, por su paciencia en el aprendizaje de la tecnología, por
sus consejos, revisiones y desconfianzas para que este trabajo llegará a su conclusión.

Al Dr. Edmundo Mercado Silva, le agradezco el haber aceptado ser mi director de tesis cuando el
futuro se veía desolador, por su paciencia y también por esa gran capacidad para formar, por creer
en sus alumnos, apoyarlos y tener esa gran vocación por la investigación, me ha enseñado que
todo es un proceso que hay que digerir y enfrentar… muchas gracias.

Al Dr. Eduardo Castaño Tostado, por sus grandes consejos para que el trabajo fuese aplicable no
importando el origen del fruto, por estar dispuesto a enseñarme un poco de lo tanto que sabe de
estadística, por corregir algunos de mis grandes errores de concepto para la interpretación de
resultados, por hacerme reflexionar y estar dispuesto a revisar el trabajo con un ángulo que
siempre retroalimento la investigación.

A la Dra. Sandra Olimpia Mendoza, agradezco su paciencia y cooperación con las mejoras para este
trabajo, por su disposición y aportación en el análisis de resultados y sus efectos de los detalles
que siempre se pasan por alto cuando se hace un tr abajo experimental.

Al Dr. Victor Castaño, por sus aportaciones y apoyo desde el inicio de la investigación.

A Alfredo Álvarez Cárdenas y Jaime Flores, por compartir conmigo su experiencia, por su apoyo
incondicional, por compartir los proyectos, porque juntos hemos aprendido el uno del otro y
hemos hecho posible la formación de recursos humanos.

A mis amigas de locuras, discusiones, proyectos, sueños y pensamientos, Elsa, Angie y Alicia
quienes escuchan con paciencia mis exposiciones y pusieron un poco de sus conocimientos,
tiempo y trabajo para que este momento llegará y me encuentre aquí pensando en lo que viene.

A mis amigas de toda la vida Charo y Yadira, con la que me he llenado de filosofías, de sueños, con
las que he visto la luna una y mil veces escuchando una canción o riendo a carcajadas, con las que
pase las etapas trascedentales en la vida la adolescencia y primera Juventud, gracias por
acompañarme desde entonces y hasta ahora.

A mis compañeros de aula, fiesta, clase, casa y ciudad, quienes un día decidieron emprender una
vida lejos del terruño y que en su primera etapa compartieron conmigo, porque juntos
aprendimos a practicar la tolerancia que ha hecho posible que aún después de transcurridos
tantos años continuamos viéndonos con el tiempo suspendido en el último día. Gracias Cirilo,
Martín, Juan Pasos, Trini, Leo y Bruno.

A mis alumnos, quienes han contribuido de alguna manera a mi formación quienes me han
enseñado mucho más de lo que pudiesen creer, porque cada que les explico algo reaprendo y

v
modifico mis errores, a todos esos que llegaron cuando desarrollaba este trabajo y que formaron
equipo conmigo a Alicia, Claudia Idalid, Valentín, Erika, Moises, Verónica, Arnaldo, Vicky,
Marytony, Irene y Carmen, quienes están en mi pensamiento como una de mis más satisfactorias
experiencias. Gracias por estar en el momento preciso.

Agradezco a Ricardo Reza, el más terco y afin alumno-profesor con quien he compartido esta
última etapa, porque aprendas lo mejor de las personas y seas siempre superior a tu guía, porque
solo así sabremos que trascendimos y evolucionamos.

A mi hermano Paco, gracias por creer en mí por darme fortaleza y por hacerme sentir en la
distancia que somos una amalgama difícil de separar, que compartirmos la misma raíz, que
modificamos nuestra historia a pesar de la estadística.

A mi hermana Gely y mis sobrinos Alejandra (por muchos años mi sobrina preferida), Carlos y
Eduardo, de quienes tengo mucho que aprender como ser alivianda porque disto mucho de ver la
vida como la ven, por enseñarme a ser feliz y por ese 2 de noviembre de 2007 en que todo
cambio.

A mi hermano Omar con quien me siento compaginada y de quien puedo algunas veces predecir
que pensará, porque si me veo en un espejo veo a ese niño que nunca fue y que siempre deseo
ser, a ese adolescente que vi crecer en la distancia en la soledad y la incertidumbre, al
profesionista que admiro al Médico filosófico que solo la vida y su observación pudo enseñar que
mucho de lo que como pacientes sentimos esta en el pensamiento. Gracias Omar por ser mi
hermano, por ser mí igual con el que me entiendo.

A mi Madre Socorro Zaragoza, quien dio de acuerdo a sus enseñanzas y a lo que creyó mejor, se
que fue y se preocupo porque estuviéramos bien, quien observó mi crecimiento impávida sin decir
palabra, a esa madre que imagina mi pensamiento y que se estrella con la realidad. Gracias por
estar ahí siempre, cuando te necesito y cuando me siento débil.

A mi Papá José Zambrano quien inculco sin querer y sin saber el resultado, ese gran deseo por
saber, aprender e investigar, quien me enseño el camino con el ejemplo, quien me hizó tanta falta
en mi vida con quien desee compartir tantos sueños y pensamientos que quedaron en el tintero,
que me apoyo para salir adelante y quien dejo su obra inconclusa para que solo la vida logrará
darle forma a su manera. Gracias papá solo tu sabes y sabras tu historia.

A mis Sobrinos que conozco, quiero y siento Andrea Sofía y Leonardo a quienes por ser tan
pequeñitos me dan tanta ternura y quienes desconozco porque aún están en formación.

A mi cuñada Iris, por ser la esposa, compañera y madre que acompaña los pensamientos de mi
hermano, por hacerlo feliz.

vi
 ÍNDICE
SUMMARY .............................................................................................................. i
RESUMEN ............................................................................................................... ii
DEDICATORIAS ..................................................................................................... iii
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. iv
ÍNDICE .................................................................................................................... vi
ÍNDICE DE CUADROS ........................................................................................... xi
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................ xii
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1
II. REVISIÓN DE LA LITERATURA ......................................................................... 4
2.1 Nanotecnología ................................................................................................. 4
2.1.1. Nanopartículas.................................................................................. 5
2.1.2. Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) ........................................... 6
2.1.3. Métodos de preparación de Nanopartículas ..................................... 7
2.1.3.1. Emulsificación/evaporación ........................................................... 7
2.1.3.2. Homogeneización a alta presión .................................................... 8
2.1.3.3. Técnica de microemulsión ............................................................. 8
2.1.3.4. Desplazamiento del disolvente en medio acuoso .......................... 9
2.1.3.5. Emulsificación-difusión .................................................................. 9
2.1.4. Estabilidad de sistemas coloidales. ................................................ 11
2.1.4.1. Distribución de tamaños de partícula ........................................... 12
2.1.4.2. Potencial zeta (ζ) ......................................................................... 13
2.2 Nanotecnología en Alimentos ...................................................................... 14
2.3. Recubrimientos comestibles ....................................................................... 16
2.4 Características fisicoquímicas de los frutos ................................................. 17
2.5. Frutos frescos cortados ............................................................................... 19
2.6. Cambios fisiológicos y bioquímicos en frutas frescas cortadas .................. 20
2.6.1. Pérdida de agua ............................................................................. 20
2.6.2. Cambios de textura. ........................................................................ 20
2.6.3. Acumulación de metabolitos secundarios y cambio de color .......... 21
2.6.4. Actividad de la fenilalanin amonio-liasa .......................................... 25
2.6.5. Riesgos y Regulación en Nanotecnología ...................................... 26
III. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................. 30
IV. HIPÓTESIS ...................................................................................................... 31
V. OBJETIVOS ...................................................................................................... 32

vii
 5.1. Objetívo General ......................................................................................... 32
5.2. Objetívos Particulares ................................................................................. 32
VI. METODOLOGÍA .............................................................................................. 33
6.1. Desarrollo Experimental .............................................................................. 33
Etapa 1 Aplicación de Nanocápsulas .................................................................... 35
6.1. Optimización para preparación de nanocápsulas ....................................... 35
6.1.1. Preparación de nanocápsulas ........................................................ 35
6.1.2. Diseño Experimental para nanocápsulas ....................................... 36
6.1.3. Análisis Estadístico nanocápsulas .................................................. 37
6.1.4. Optimización del modelo para nanocápsulas ................................. 38
6.1.5. Comprobación de repetibilidad lote a lote ....................................... 38
6.2 Caracterización de nanocápsulas ................................................................ 38
6.2.1. Mediciones de tamaño de partícula e índice de polidispersión (PDI)
.................................................................................................................. 38
6.2.2. Potencial Zeta (ζ) ............................................................................ 39
6.2.3. Densidad de los sistemas de talla submicrónica (np) .................... 39
6.2.4. Microscopía electrónica de barrido ................................................. 40
6.3 Desarrollo de dispersiones coloidales (recubrimientos) ............................... 41
6.3.1 Preparación de nanocápsulas con dl--tocoferol ............................ 41
6.3.2. Preparación de nanoesferas ........................................................... 42
6.3.3. Preparación de la emulsión ............................................................ 42
6.3.4. Preparación de la nanoemulsión .................................................... 42
6.3.5 Preparación de la solución de -tocoferol ....................................... 43
6.4. Estabilidad de los sistemas coloidales ........................................................ 43
6.5. Aplicación de recubrimientos en manzana fresca cortada .......................... 43
6.5.1. Material Biológico ........................................................................... 43
6.5.2. Tratamiento de manzanas frescas cortadas ................................... 43
6.6. Caracterización morfológica de los recubrimientos en manzana ................ 45
6.7. Cambios físicos y químicos en manzana .................................................... 45
6.7.1. Pérdida liquido drenado .................................................................. 45
6.7.2. Color ............................................................................................... 46
6.7.3. Textura ........................................................................................... 46
6.7.4. pH ................................................................................................... 47

viii
 6.7.5. Sólidos Solubles Totales (SST) ...................................................... 47
6.7.6. Acidez ............................................................................................. 47
6.8. Cambios enzimáticos y contenido de fenoles ............................................. 47
6.8.1. Determinación de la actividad polifenoloxidasa (PFO) ................... 47
6.8.2. Medición de fenoles totales ............................................................ 48
6.8.3. Determinación de la actividad Fenil-alanina-amonioliasa ............... 49
6.9. Tratamiento estadístico para comparación de recubrimientos .................... 49
Etapa 2. Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) en Guayaba ............................. 49
6.10. Preparación de NLS .................................................................................. 50
6.10.1. Caracterización de Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) .......... 50
6.10.2. Microscopía electrónica de barrido (MEB) para NLS y guayaba .. 50
6.10.3. Estabilidad de las NLS .................................................................. 51
6.11 Desarrollo de recubrimientos de NLS ........................................................ 51
6.11.1. Evaluación del efecto de la concentración de NLS ....................... 51
6.12. Aplicación de recubrimientos con NLS en guayaba .................................. 52
6.12.1. Material Biológico ......................................................................... 52
6.12.2. Aplicación del Recubrimiento con NLS ......................................... 52
6.13. Cambios fisicoquímicos en guayaba con NLS .......................................... 54
6.13.1. Pérdida de peso ............................................................................ 54
6.13.2. Cambios químicos ........................................................................ 54
6.13.3. Cambios de color .......................................................................... 54
6.13.4. Cambios de Firmeza ..................................................................... 55
6.14. Análisis estadístico para recubrimientos en guayaba ............................... 55
VII RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 56
Etapa 1. Resultados Nanocápsulas ...................................................................... 56
7.1. Preparación y optimización de nanocápsulas ............................................. 56
7.1.1. Ajuste del modelo ........................................................................... 57
7.1.2. Tamaño de Partícula ...................................................................... 58
7.1.3. Índice de polidispersión (PDI) ......................................................... 61
7.1.4. Potencial zeta () ............................................................................ 63
7.1.5. Densidad (nc) ................................................................................. 65
7.1.6. Establecimiento de condiciones de preparación de nanocápsulas . 65
7.1.7. Morfología de Nanocápsulas .......................................................... 66

ix
 7.1.8. Verificación del modelo y versatilidad del método .......................... 67
7.2. Sistemas con -tocoferol ............................................................................ 68
7.2.1. Nanocápsulas ................................................................................. 68
7.2.2. Nanoemulsión ................................................................................. 69
7.2.3. Estabilidad de las dispersiones sin goma ....................................... 72
7.2.4. Estabilidad de las dispersiones con goma xantana ........................ 74
7.2.5. Morfología de las dispersiones ....................................................... 76
7.3. Evaluación del efecto de recubrimientos en manzana fresca cortada ........ 77
7.3.1 Calidad visual de manzana tratada con diferentes recubrimientos con
dl--tocoferol ............................................................................................ 77
7.3.2 Cambios de color ............................................................................. 81
7.3.2.1 Luminosidad (L*) ........................................................................... 81
7.3.2.2 Cambios en a* .............................................................................. 83
7.3.2.3 Cambios en Índice de oscurecimiento .......................................... 85
7.3.3. Caracterización fisicoquímica después de la inmersión ................. 87
7.3.3. Cambios en la ultraestructura de rebanadas de manzana tratadas
con los recubrimientos de talla submicrónica. .......................................... 88
7.3.4. Cambios fisicoquímicos durante el almacenamiento refrigerado .... 92
7.3.4.1. Pérdida de líquido drenado .......................................................... 92
7.3.3.2. Sólidos solubles Totales (SST) .................................................... 93
7.3.3.3. Acidez titulable ............................................................................. 94
7.3.3.4 Cambios en pH durante el almacenamiento ................................. 95
7.3.4 Cambios de textura .......................................................................... 97
7.3.5. Cambios en actividad de polifenoloxidasas (PFO) ....................... 100
7.3.7 Cambio en el contenido de fenoles totales .................................... 105
7.3.8 Actividad fenilalanin amonioliasa (PAL) en manzana .................... 107
7.4. Establecimiento de condiciones de preparación de las NLS ..................... 110
7.4.1. Tamaño de partícula ..................................................................... 110
7.4.2 Índice de polidispersión (PDI) ........................................................ 111
7.4.3 Potencial zeta (ζ) ........................................................................... 112
7.5. Desarrollo del recubrimiento con NLS ....................................................... 113
7.5.1. Estabilidad de los recubrimientos de NLS/goma xantana ............. 114
7.5.1.1. Tamaño de partícula e PDI durante el almacenamiento ............ 116
7.5.1.2. Cambios de ζ durante almacenamiento ..................................... 117

x
 7.6. Caracterización Superficial de NLS........................................................... 119
7.7. Calidad visual del Fruto durante el desarrollo experimental ...................... 119
7.7.1 Aspecto visual de guayaba previó a la aplicación de los
recubrimientos ........................................................................................ 121
7.7.2 Cambios en calidad visual de guayaba durante el almacenamiento
................................................................................................................ 122
7.8 Observaciones de microscopía electrónica de guayabas recubiertas........ 125
7.9 Cambios de color en Guayaba recubierta con NLS ................................... 131
7.10.1. Pérdida de peso .......................................................................... 135
7.10.2. Cambios en Sólidos Solubles Totales (SST) .............................. 139
7.10.3. Cambios en acidez titulable ........................................................ 142
7.10.4. Cambios en firmeza de los frutos ............................................... 144
IX REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS ................................................................ 149

xi
 íNDICE DE CUADROS.
Cuadro Página
2.1 Características de estabilidad con diferentes valores de ζ 14
2.2 Resumen de las aplicaciones de la nanotecnología en la 15
cadena
de producción de alimentos.)
2.3 Composición fisicoquímica de guayaba a diferentes estados de 18
madurez.
6.1 Materiales utilizados para la elaboración de nanocápsulas 35
6.2 Variables independientes codificadas en el modelo de 37
superficie de respuesta
6.3 Recubrimientos desarrollados para el tratamiento de manzana 41
fresca cortada.
7.1 Resultados respecto a la media de las nanocápsulas 57
preparadas por lote experimental.
7.2 ANOVA y coeficientes de regresión sobre las variables de 58
respuesta respecto a los factores estudiados.
7.3 Caracterización de nanocápsulas formadas con otros 68
materiales y empleados en la validación del método de
emulsificación-difusión.
7.4 Caracterización inicial de manzana después de aplicación de 88
los recubrimientos.
7.5 Actividad enzimática PFO de manzanas sin tratamiento. 101
7.6 Caracterización inicial de muestras NLS-goma xantana. 116

xii
 íNDICE DE FIGURAS

Figura Página
2.1. Nanopartículas biodegradables 6
2.2. Descripción del mecanismo para la formación de 11
nanopartículas por el método emulsificación-difusión con base
en el mecanismo de “diffussion-stranding” a) antes de la etapa
de difusión, b) durante la etapa de difusión
2.3 Distribución de tamaño de partícula en sistemas coloidales 13
2.4 Cinética de oxidación de o-difenol (catecol [A]) y monofenoles 24
(fenol [B]) por la polifenoloxidasa
2.5 Biosíntesis de compuestos fenólicos 25
6.1 Desarrollo metodológico para la aplicación de sistemas 34
nanopartículados en frutas
6.2 Procedimiento de preparación de nanopartículas por el método 36
emulsificación-difusión
6.3 Marcadores de densidad utilizados en la determinación de 40
densidad de sistemas coloidales
6.4 Diagrama de Bloques, Elaboración de manzanas frescas 44
cortadas
6.5 Procedimiento utilizado para los estudios de recubrimientos de 53
guayaba
7.1 Comparación de densidad para nanoemulsión, nanoesferas y 56
nanocápsulas (con diferentes concentraciones poli-ε-
caprolactona).
7.2 Superficie de Respuesta para el tamaño de partícula de 60
nanocápsulas en función de: a) velocidad de agitación vs
alcohol polivinílico a una concentración de 200 mg de poli-ε-
caprolactona, b) velocidad de agitación vs poli-ε-caprolactona
(mg) a 5 % de alcohol polivinílico y c) alcohol polivinílico vas
poli-ε-caprolactona a 4000 rpm
7.3 Superficie de Respuesta PDI de nanocápsulas en función de: 62
a) velocidad de agitación vs alcohol polivinílico a una
concentración de 200 mg de poli-ε-caprolactona, b) velocidad
de agitación vs poli-ε-caprolactona (mg) a 5 % de alcohol
polivinílico y c) alcohol polivinílico vas poli-ε-caprolactona a
4000 rpm
7.4 Superficie de Respuesta PDI de nanocápsulas en función de: 64
a) velocidad de agitación vs alcohol polivinílico a una
concentración de 200 mg de poli-ε-caprolactona, b) velocidad
de agitación vs poli-ε-caprolactona (mg) a 5 % de alcohol

xiii
 polivinílico y c) alcohol polivinílico vas poli-ε-caprolactona a
4000 rpm.

7.5 Micrografías de nanocápsulas a condiciones de preparación 66

óptimas
7.6 Distribución de tamaño de partícula nanocápsulas preparadas 69
a 4000 rpm, 5 % pluronic F-127 y 186 mg de poli-ε-
caprolactona.
7.7 Tamaño de partícula de nanoemulsiones en función a los 70
ciclos de homogenización.
7.8 Distribución de tamaño de partícula para la emulsión (E), 71
nanoemulsión (NE), nanocápsulas (NCS) y nanoesferas
(NESF).
7.9 Cambios de tamaño de partícula e Índice de polidispersión de 72
los sistemas: nanocápsulas (NCs), nanoemulsión (NE),
emulsión (E).
7.10 Variación en el ζ, durante el almacenamiento 74

7.11 Fluctuación de tamaño de partícula por efecto de la 75

incorporación de goma xantana a los sistemas:
nanocápsulas/goma xantana (NCS + GX), emulsión/goma
xantana (E + GX), nanoemulsión/goma xantana (NE + GX).
7.12 Variación en el potencial zeta en muestras con 0.3 % de goma 76
xantana
7.13 Morfología de los sistemas desarrollados (a) NCS = 76
nanocápuslas, (b) NE = nanoemulsión y (c) E = emulsión.
7.14 Aspecto visual de las muestras de manzana tratada con 77
sistemas submicrónicos
7.15 Aspecto visual de las muestras de manzana antes del 79
almacenamiento.
7.16 Cambios en aspecto visual en manzana fresca cortada control 80
respecto a recubrimientos con emulsión, solución y goma
xantana
7.17 Cambios en aspecto visual en manzana fresca cortada para 81
recubrimientos de talla submicrónica respecto al control
7.18 Cambios en Luminosidad en manzana almacenada a 4 °C 82
para los diferentes recubrimientos. NE = nanoemulsión, NCS =
nanocápsulas, NESF = nanoesferas, E = emulsión, TPGS = -
tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma xantana.
7.19 Cambios en “a*” durante almacenamiento a 4 ºC por efecto de 84
los diferentes recubrimientos. NE = nanoemulsión, NCS =
nanocápsulas, NESF = nanoesferas, E = emulsión, TPGS = -
tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma xantana
7.20 Cambios en índice de oscurecimiento en manzana a 4°C para 85
los diferentes recubrimientos. NE = nanoemulsión, NCS =

xiv
 nanocápsulas, NESF = nanoesferas, E = emulsión, TPGS = -
tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma xantana.
7.21 Superficie de un corte de la manzana Red Delicius, sin 89
tratamiento
7.22 Micrografías del tejido de manzana tratado con los diferentes 91
recubrimientos: a) GX = goma xantana, b) NCS =
nanocápsulas, c) NESF = nanoesferas, d) NE = nanoemulsión,
e) TPGS = dl--tocoferol propilenglicol succionato, f) E =
emulsión.
7.23 Pérdida de peso por liquido drenado para los diferentes 92
recubrimientos: NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas,
NESF = nanoesferas, TPGS = dl--tocoferol propilenglicol
succinato, E = emulsión, GX = goma xantana.
7.24 Cambio en sólidos solubles durante el almacenamiento 93
refrigerado (4°C) de manzana con diferentes tratamientos: NE
= nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF = nanoesferas,
TPGS = dl--tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma
xantana.
7.25 Cambios en acidez durante el almacenamiento de manzana 94
con diferentes recubrimientos:NE = nanoemulsión, NCS =
nanocápsulas, NESF = nanoesferas, E = emulsión, TPGS = dl-
-tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma xantana.
7.26 Cambios en pH durante el almacenamiento a 4°C para los 96
diferentes tratamientos: NE = nanoemulsión, NCS =
nanocápsulas, NESF = nanoesferas, E = emulsión, TPGS = dl-
-tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma xantana.
7.27 Cambios de firmeza durante el almacenamiento a 4ºC para los 97
diferentes recubrimientos utilizados: E/GX = emulsión, GX =
goma xantana, NcS/GX = nanocápsulas, NE/Gx =
nanoemulsión, Nesf/Gx = Nanoesferas, Sol = dl--tocoferol
propilenglicol succinato
7.28 Comportamiento del módulo de compresión para manzana 99
almacenada con diferentes recubrimientos: NE =
nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF = nanoesferas, E
= emulsión, TPGS = dl--tocoferol propilenglicol succinato, GX
= goma xantana.
7.29 Actividad de PFO en manzana fresca cortada durante 102
almacenamiento con diferentes tratamientos: NE =
nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF = nanoesferas, E
= emulsión, TPGS = -tocoferol propilenglicol succinato, GX =
goma xantana.
7.30 Estructura, hidrólisis y función antioxidante de TPGS 104
7.31 Variación en el contenido de fenoles totales: E = emulsión, GX 106
= goma xantana, NCs = nanocápsulas, NE = nanoemulsión,
NESF = nanoesferas, Sol = dl--tocoferol propilenglicol
succinato

xv
7.32 Actividad fenilalanin amonioliasa en manzanacon durante 107
almacenamiento. NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas,
NESF = nanoesferas, GX = goma xantana
7.33 Distribución del tamaño de partículas de NLS en relación a los 111
ciclos de homogenización
7.34 Variación del potencial zeta por efecto del número de ciclos de 112
homogenización (10,000 rpm/min) para dispersiones de cera
de candeuba.
7.35 Efecto de la temperatura de aplicación, concentración de goma 114
xantana y uso de plastificante (propilenglicol) sobre la cantidad
de recubrimiento depositado en el fruto
7.36 Distribución del tamaño de partícula de los recubrimientos con 115
diferentes concentraciones de NLS y concentración constante
de 0.4 % de goma xantana y 0.5 % de propilenglicol
comparadas con NLS solas.
7.37 Variación del tamaño de partícula en función al tiempo de 117
almacenamiento y % deNLS a una concentración constante de
0.4 % de goma xantana.
7.38 Variaciones el potencial zeta durante el almacenamiento de 118
NLS con concentración constante de goma xantana (0.4%) y
propilenglicol (0.5%)
7.39 Micrografías de Nanopartículas Lipídicas Sólidas de cera 119
candeuba (suspensión al 10 %).
7.40 Fotos de los recubrimientos con goma 120
xantana/plastificante. a) 0.3 % goma xantana, b) 0.4 % goma
xantana y c) 0.5 % goma xantana aplicados a 20ºC. d)
solubilización del recubrimiento en agua

7.41 Distribución de recubrimientos con diferentes 121

concentraciones de goma xantana, 60 % NLS y 0.5 % de
propilenglicol a) 0.3 % de goma xantana, b) 0.4 % de goma
xantana, c) 0.5 % de goma xantana.
7.42 Guayaba variedad Media china al inicio de la experimentación 122
con diámetro promedio de 4.44 cm
7.43 Cambios en el aspecto visual de frutos de guayaba durante el 123
almacenamiento refrigerado a 8ºC.
7.44 Cambios en el aspecto visual de guayabas transferidas 125
5 días a temperatura ambiente después del periodo de
almacenamiento refrigerado poner temperatura 8°C.

7.45 Micrografía del corte lateral de guayaba sin tratamiento. 126

7.46 Micrografía de guayaba con recubrimiento a base de goma 126
xantana (0.4 %) y propilenglicol (0.5%).
7.47 Micrografía guayaba con recubrimiento 60 % de NLS, 0.4 % de 127
goma xantana y 0.5 % de propilenglicol.
7.48 Distribución de recubrimiento con 60 % de NLS en el 128
pericarpio de guayaba.
xvi
7.49 Micrografía de guayaba con 65 % de NLS, 0.4 % de goma 129
xantana y 0.5 % de propilenglicol.
7.50 Superficie de guayaba recubierta con 70 % de NLS, 0.4 % de 129
goma xantna y 0.5 % de propilenglicol.
7.51 Superficie de guayaba recubierta con 75 % de NLS, 0.4 % de 130
goma xantana y 0.5 % de propilenglicol.
7.52 Micrografía de guayaba recubierta con 80 % de NLS, 0.4 % 131
goma xantana y 0.5 % propilenglicol, con agregados de NLS.
7.53 Cambios en ángulo de matíz (Hue) en guayaba refrigerada a 132
diferentes concentraciones de NLS y una concentración
constante de 0.3 % de goma xantana y 0.5 % de propilenlicol.
7.54 Cambios de color de guayabas refrigeradas + 5 días a 134
temperatura ambiente
7.55 Pérdida de peso de guayaba refrigerada a 8ºC durante 136
almacenamiento
7.56 Pérdida de peso en guayaba transferida a temperatura 138
ambiente después del periodo correspondiente de
refrigeración.
7.57 Cambios en sólidos solubles totales en guayaba refrigerada a 139
8ºC con diferentes proporciones de NLS, goma xantana (0.4
%) y propilenglicol (0.5 %).
7.58 Cambios en SST para guayabas almacenadas a temperatura 141
de refrigeración + 5 días a tempertura ambiente.
7.59 Variación en la acidez titulable durante el almacenamiento 143
refrigerado a 8ºCpara los diferentes recubrimientos
7.60 Cambios de acidez titulable en guayaba refrigerada+5 días 144
ambiente.
7.61 Cambios de textura en guayaba refrigerada a diferentes 145
concentraciones de NLS, 0.3% de goma xantana y 0.5 % de
propilenglicol.
7.62 Cambios de firmeza de guayabas refrigeradas + 5 días a 147
temperatura ambiente.

xvii
 I. INTRODUCCIÓN
Hasta hace algunos años era poco frecuente encontrar palabras que
utilizaran el prefijo nano (milmillonésima parte de una unidad, 10-9), es de llamar la
atención como sin haberlo percibido se han incorporado estas palabras al lenguaje
común. En alimentos, la nanotecnología no comenzó a tomar importancia sino
hasta la década pasada cuando se comenzaron a desarrollar gran parte de las
aplicaciones que ahora impactan el envasado de alimentos, dadas las
potencialidades que ofrece las aplicaciones se han ampliado a otros campos de la
industria de los alimentos en particular a sistemas de liberación nanoparticulados
(micelas, liposomas, nanoemulsiones, nanopartículas, etc.) Es importante resaltar
que en la industria de alimentos, la aplicación de la nanotecnología es aún
limitada, teniendo impacto en la producción de envases activos e inteligentes por
ejemplo la utilización de sistemas antimicrobianos, potenciadores de sabor,
inhibidores de producción de etileno, etc. Recientemente se han identificado
cuatro áreas del proceso productivo de alimentos donde se puede emplear
nanotecnlogía: 1) desarrollo de nuevos materiales funcionales, 2) procesamiento a
micro- y nano-escala, 3) desarrollo de nuevos productos y 4) métodos de
instrumentación (Chen et al., 2006a; Chau et al., 2007).

El desarrollo de recubrimientos comestibles constituye una estrategia

potencial para reducir los efectos perjudiciales que se presentan en los tejidos
vegetales de frutas frescas, en las operaciones previas al pre-enfriamiento y
almacenamiento. Razón por la que se vio en la nanotecnología una vía con alta
potencialidad para resolver el problema e incrementar la vida útil de los frutos,
infiriendo los posibles mecanismos por los que pudiesen ser afines con los frutos
frescos enteros o cortados.

El objetivo de este trabajo fue desarrollar dispersiones nanométricas

(nanocápsulas y nanopartículas lipídicas sólidas) que contribuyan a incrementar la
vida útil de frutas frescas enteras y cortadas, con ingredientes aceptables para su
uso en alimentos que permitan la aplicación de sistemas barrera y, aditivos. El
trabajo se dividió en dos etapas: Etapa 1. Aplicación de recubrimientos

1
comestibles con base en nanocápsulas cargadas con dl--tocoferol aplicadas a
manzana fresca cortada para evaluar su comportamiento e inferir sobre la acción
de los sistemas de talla nanométrica en la conservación del producto. Etapa 2.
Aplicación de recubrimientos con base en nanopartículas lipídicas sólidas en la
conservación de guayaba variedad media china determinando los cambios
fisicoquímicos durante su conservación en refrigeración a 8 ºC y el efecto de la
transferencia a temperatura ambiente.

En la Etapa 1, se empleó el método de emulsificación-difusión propuesto

por Quintanar-Guerrero et al. (1998a), llevando a cabo la optimización de la
preparación (concentración de polímero, estabilizante y velocidad de agitación),
considerando como variables de respuesta el tamaño de partícula, índice de
polidispersión (PDI), potencial zeta (ζ) y densidad. Una vez optimizadas las
condiciones de preparación se evaluó la repetitividad del método utilizando aceites
de soya, girasol y dl--tocoferol. Las nanocápsulas con dl--tocoferol fueron
probadas en manzana cortada en gajos y almacenada a 4 ºC, evaluando los
cambios de calidad y determinando su efectividad en reducir el índice de
oscurecimiento e incremento de la vida útil del producto. Además se determinó el
contenido de fenoles totales, actividad de polifenoloxidasa y fenilalaninamonio
liasa (PAL), con la finalidad de explicar el mecanismo de acción de los sistemas.
Fue posible obtener sistemas de talla submcrónica capaces de distribuirse
homogéneamente en la superficie de manzana e infiltrarse en el tejido del fruto, lo
que fue evidenciado a través de las micrografías obtenidas por microscopia
electrónica de barrido. Es posible atribuir al dl--tocoferol el efecto antioxidante y
modificador del potencial de membrana lo que posibilita la disminución del
oscurecimiento enzimático. Todos los sistemas de talla submicrónica limitaron la
transferencia de oxígeno, por lo que la actividad de polifenoloxidasa y
fenilalaninamonio liasa se ven disminuidas, lo que además se contrasto con el
contenido de fenoles totales.

El hecho de que se formarán sistemas de talla submicrónica como

nanoemulsión y nanocápsulas posibilita un aparente efecto a nivel celular,

2
permitiendo el incremento de vida útil del producto. Esto no fue posible cuando se
emplearon solución de TPGS y emulsión con dl--tocoferol, ya que mostraron una
mayor actividad de polifenoloxidasa y fenilalaninamonio liasa.

La manzana fresca cortada con nanocápsulas, nanoemulsión y

nanoesferas fueron las que tuvieron el menor índice de oscurecimiento y por ende
menor actividad polifenoloxidasa y fenilalaninamonio liasa, además de que
lograron conservar el producto por al menos 21 días en refrigeración con
modificaciones de textura menores del 30 % con respecto a la condición inicial.

En la etapa 2 se prepararon las nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) por

el método de alto corte (rotor-estator) a alta temperatura empleando cera de
candeúba. Con las NLS formadas se llevó a cabo el desarrollo de un recubrimiento
con base en goma xantana. Se obtuvieron por microscopia electrónica de barrido
evidencias de la formación de nanoesferas sólidas con distribución de tamaño
homogéneo. Las variaciones en concentración de cera de candeuba en el
recubrimiento fueron desde 60 al 80 % partiendo de una suspensión de NLS con
10 % de cera de candeuba. En concentraciones superiores al 75 % de NLS se
evidencio la formación de agregados de NLS, lo que explico porque estas
concentraciones no funcionaron ya que provocaron daño fisiológico. Así las
mejores concentraciones fueron 65 y 70 % de NLS con las que se logró prolongar
la vida útil de guayaba hasta por 5 semanas, sin daño aparente por efecto de la
temperatura cuando las muestras son transferidas a temperatura ambiente,
continuando su proceso de maduración que fue comprobado con la obtención de
fotografías, cambios de color y modificaciones fisicoquímicas en el producto.

Finalmente, de acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo fue

posible establecer que los sistemas de talla submicrónica tienen una mejor
funcionalidad para la conservación de fruta fresca entera y cortada que aquellos
sistemas de talla superior o convencionales, demostrándose que pueden ser
empleados dentro de recubrimientos que incrementan, debido a su talla, la
distribución e interacción sobre la superficie del producto, su interacción y su
efecto lo que permite incrementar de manera considerable la vida útil del fruto.

3
 II. REVISIÓN DE LA LITERATURA
2.1 Nanotecnología
Tradicionalmente, los recubrimientos comestibles se han utilizado como una
barrera para reducir al mínimo la pérdida de agua y retrasar el envejecimiento
natural de los frutos recubiertos a través de permeabilidad selectiva a los gases.
Sin embargo, la nueva generación de recubrimientos comestibles está
especialmente diseñada para permitir la incorporación de antioxidantes, vitaminas
productos nutracéuticos por medio de la aplicación de tecnologías prometedoras
como la nanoencapsulación. Debido a las propiedades que presentan los sistemas
de talla submicrónica, la nanotecnología ofrece diversas posibilidades de
aplicación en el área de alimentos (Quintanilla-Carvajal et al., 2010; Weiss et al.,
2006; Zambrano-Zaragoza et al., 2010; Rojas-Graü et al., 2010; Zambrano-
Zaragoza, et al., 2011). Algunos aspectos nanotecnológicos aplicados a alimentos
y ligados a la presente investigación serán discutidos a continuación.

En el área de la conservación de alimentos la nanotecnología es una

nueva y novedosa área que trata acerca de medir, ver, manipular y fabricar
materiales a escalas individuales y muy pequeñas en un rango que va de 1 a 1000
nanómetros. Un nanómetro es la millonésima parte de un milímetro; como
referencia tenemos que un virus mide entre 20 y 300 nanómetros, y un cabello
humano aproximadamente 80,000 nanómetros (Bhushan, 2003; Rao et al., 2004;
Foladori e Ivernizzi, 2005; Azeredo, 2009). Es una tecnología fusionada y
altamente multidisciplinaria que se ha convertido en un área de investigación vital
y activa y que se está desarrollando rápidamente y se extiende a casi todos los
campos de la tecnología (Islam y Miyazaki, 2009).

La materia a escala tan pequeña manifiesta propiedades diferentes a

como se conoce en mayores tamaños (Nagarajan et al., 2009), por ejemplo la
reactividad química y la conductividad eléctrica con las que se pueden hacer
productos que cumplan múltiples funciones, que sean más eficientes y que
interactúen de manera inteligente con el medio (Foladori e Ivernizzi, 2008).

4
 Existen dos técnicas de consolidación que se usan actualmente en la
nanotecnología: top-down, (de arriba hacia abajo), en la que las estructuras
nanométricas se obtienen por la reducción de tamaño de materiales a granel; y el
bottom-up, (de abajo hacia arriba), la cual permite la construcción de
nanoestructuras a partir de átomos individuales o moléculas capaces de
conectarse (Kelsall et al., 2005; Azeredo, 2009).

Dentro de los sistemas coloidales con potencial función como

acarreadores de sustancias de interés alimenticio (antioxidantes, antimicrobianos,
antihumectantes, saborizantes, colorantes, etc.), se encuentran: micelas,
liposomas, cubosomas, nanoemulsiones, nanocápsulas y nanopartículas. A
continuación se comentaran aquellos que fueron de interés para el trabajo de
investigación realizado.

2.1.1. Nanopartículas

Desde el punto de vista químico–biológico, se denomina nanopartícula a

un sólido coloidal, formado de materiales aceptados como seguros (polímeros
biodegradables o no, lípidos, proteínas, etc.) en los que una sustancia de interés
“activo” puede ser incorporada, adsorbida o unida químicamente con un tamaño
que oscila entre los 10 y 1000 nm (Quintanar-Guerrero et al., 1998b).

Los principales factores que influyen en el paso de una micropartícula a

nanopartícula, son la disminución del tamaño de partícula y el incremento de la
relación superficie/volumen. El término es utilizado para definir tanto nanoesferas
como nanocápsulas. En la Figura 2.1 se esquematizan las diferencias entre
nanoesferas y nanocápsulas, estas tienen que ver con su morfología y
arquitectura. Las nanoesferas están formadas por una matriz polimérica densa,
mientras que las nanocápsulas están compuestas de un líquido (por lo general
oleoso) rodeado por una membrana polimérica (Quintanar-Guerrero et. al., 1996).
Las nanopartículas presentan varias ventajas respecto de los sistemas coloidales;
tienen estabilidad física durante el almacenamiento; conservan su integridad al
contacto con fluidos biológicos; son de fácil preparación con diversas técnicas
disponibles y reproducibilidad en la producción lote a lote.
5
 Figura 2.1. Nanopatículas bodegradables: nanocápsulas y nanoesferas.
Kumari et al., 2010

2.1.2. Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS)

Una modalidad muy interesante de nanopartículas fue propuesta a inicio

de los 90’s, las denominadas nanopartículas lipídicas sólidas (Weiss et al, 2008).
Estas se presentan como una nueva alternativa a los sistemas acarreadores de
activos. Las nanopartículas lipídicas sólidas se forman a partir de lípidos sólidos y
no de polímeros. Estos lípidos presentan baja toxicidad, alta biocompatibilidad,
estables y con una capacidad regular para encapsular activos.

Las nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) combinan las ventajas de las

nanopartículas poliméricas y emulsiones aceite/agua. Presentan buena tolerancia
para su consumo, alta biocompatibilidad para la administración oral, acarreador,
fácil escalamiento para su producción a nivel industrial; sin embargo, también
tienen limitaciones como son la baja capacidad de carga y expulsión de activos
6
durante el almacenamiento. Considerando que en los alimentos además de
acarrear nutracéuticos es necesario también protegerlos de las condiciones
ambientales a las que se exponen durante su almacenamiento, distribución y
comercialización, la utilización de nanopartículas poliméricas representa un
potencial desarrollo en sistemas de barrera con permeabilidad selectiva. Además
dado los métodos de obtención también son sistemas termodinámicamente más
estables con lo que es posible tener mayor funcionalidad para su aplicación como
recubrimientos (Mehnert y Mäder, 2001; Weiss et al., 2008).

2.1.3. Métodos de preparación de Nanopartículas

Existen un gran número de métodos para preparar nanopartículas, pero

debido a que el propósito de esta investigación fue generar vectores para uso
alimentario, en esta sección se resumen sólo aquellos métodos que pudieran tener
susceptibilidad de ser aplicados para este fin, en particular los que prefieren
utilizar materiales preformados.

Las nanopartículas obtenidas por reacciones de polimerización no son

revisadas considerando sus potenciales desventajas, como son los residuos
monómericos no biodegradables, productos alternos no compatibles, probables
reacciones entrecruzadas con el activo (aditivos, enriquecedores, fortificantes,
antimicrobianos, etc.) o degradación de los componentes de la nanopartícula,
principalmente cuando alguna radiación es utilizada para inducir la polimerización.
Tampoco serán revisadas las nanopartículas formadas de origen natural debido a
la incertidumbre de la fuente, la pureza de la macromolécula y su potencial
antigenicidad.

2.1.3.1. Emulsificación/evaporación

En este método se producen nanopartículas por medio de la precipitación

de un polímero o un lípido, disuelto en una fase orgánica inmiscible en agua (ej.
Cloroformo, cloruro de metileno) con el que posteriormente se formará una
emulsión en donde la fase acuosa incluye un estabilizante, la emulsión se prepara
utilizando un sistema de agitación mecánica de velocidad variable, seguida de una

7
homogenización a alta presión para lograr la reducción de tamaño del sistema
formado. Posteriormente se evapora el disolvente y se precipita el material
constituyente en la fase acuosa, provocándose de esta manera la formación de las
nanopartículas (Sjöström y Bergenståhl, 1992; Siekmann y Westesen, 1996).

2.1.3.2. Homogeneización a alta presión

Esta técnica se emplea para la preparación de nanopartículas lipídicas

sólidas (NLS), estas se producen por medio de la homogeneización a altas
presiones de los lípidos fundidos dispersados en una solución acuosa conteniendo
el estabilizante. Las gotas de lípido solidifican y se forman las NLS.

Los dos métodos que con mayor frecuencia son utilizados para la
preparación de NLS son la técnica de homogeneización a alta presión (High
Pressure Homogenization) en caliente y en frío. La homogenización a alta presión
empuja el líquido a una presión de entre 100 a 2000 bar a través de un espacio
pequeño, el fluido es acelerado en un tiempo muy corto a una alta velocidad
(mayor a 1000km/h). La cavitación y la turbulencia forzan a las partículas a
reducir su tamaño a una talla submicrónica (Wissing et al 2004). La
homogenización de este método puede realizarse en frio o en caliente y en ambos
casos como paso previo se debe incorporar el ingrediente activo por medio de una
dispersión al lípido fundido (Mehnert et al 2001).

2.1.3.3. Técnica de microemulsión

La preparación de nanopartículas por microemulsión (µE) consiste en

dispersar una µE caliente (aceite/agua) en un medio acuoso frío bajo agitación
mecánica (McClements et al., 2009). La µE está compuesta del material (lípido ó
polímero) surfactante (p.ej. polisorbato 20, polisorbato 60 y fosfatidilcolina de
soya), co-surfactante(s) (p.ej. etanol, butanol, etc.) y agua. Con lo que se forma un
sistema transparente y termodinámicamente estable. El éxito para obtener una µE
depende de que los componentes se encuentren en las proporciones adecuadas.
En general se usan diagramas ternarios para evidenciar las zonas de formación de
la µE. La microemulsión caliente 65-70 ºC se adiciona a un medio acuoso frío (2-3

8
ºC) bajo agitación mecánica, lo que asegura la precipitación del material
produciéndose partículas de talla semejante a la de la µE. Comúnmente las
proporciones entre la µE y el agua son de 1:25 a 1:50 (Cavalli et al., 1999).

2.1.3.4. Desplazamiento del disolvente en medio acuoso

En este método, el material y el activo se disuelven completamente en un

disolvente polar (p. ej. acetona o etanol). La solución resultante se vierte bajo
agitación mecánica sobre un medio acuoso que contiene un estabilizante (p.ej.
poloxámeros o alcohol polivinílico). Las nanopartículas se producen rápidamente
por la difusión del disolvente, el que es eliminado de la suspensión a presión
reducida. El mecanismo de formación de nanopartículas se explica por la
turbulencia interfacial generada durante el desplazamiento del disolvente. Una
fuerza de difusión es observada debido a la mutua miscibilidad entre los
disolventes. Gotas de disolvente, probablemente de talla nanométrica, son
acarreadas de la interfase. Estas gotas son rápidamente estabilizadas por el
agente estabilizante, cuando la difusión del solvente se completa, el polímero se
agrega en forma de nanopartículas (Hu et al.,2002).

2.1.3.5. Emulsificación-difusión

El método de emulsificación-difusión se puede considerar como una

modificación del proceso de “salting-out” pero sin el uso de sales, lo que evita los
subsecuentes pasos de purificación así como los problemas relacionados con la
compatibilidad entre los “activos” y los electrolitos empleados. La originalidad del
método de emulsificación-difusión consiste en el uso de disolventes parcialmente
miscibles en agua, generalmente aceptados para su uso farmacéutico y
alimenticio. Al desarrollar este método para la preparación de nanopartículas
poliméricas se usó alcohol bencílico como disolvente (Leroux et al., 1995a,b). Las
nanopartículas se preparan al formar una emulsión (aceite/agua) entre la solución
del polímero en alcohol bencílico y una solución acuosa que contiene al
hidrocoloide estabilizante, seguido de la dilución de la emulsión con agua.

9
 Posteriormente, se introdujo una modificación en la metodología que fue
la saturación del disolvente parcialmente miscible en agua. Esta saturación de la
fase orgánica con agua y de la fase acuosa con el disolvente orgánico permite
mejorar el equilibrio termodinámico del sistema (Quintanar-Guerrero et al., 1996).
La técnica consiste en la formación de una emulsión (aceite/agua), entre la
solución de un polímero biodegradable (según el método propuesto inicialmente)
en el disolvente saturado con agua (p.ej. propilencarbonato) y una fase acuosa
que contiene el estabilizante (p.ej. alcohol polivinílico), previamente saturada con
el disolvente orgánico. La subsecuente adición de agua al sistema causa que el
disolvente difunda hacia la fase externa, lo que trae como resultado la formación
de nanopartículas del polímero. La adición de un estabilizante adecuado evita la
formación de grumos de polímero, pues éste actúa como un agente protector tanto
para formar la emulsión como para estabilizar las nanopartículas formadas. El
método de emulsificación-difusión presenta las siguientes ventajas: (1) se puede
usar equipo de laboratorio convencional; (2) se emplean disolventes
farmacéuticamente aceptables; (3) es posible reciclar los disolventes; (4) es
adaptable a varios tipos de polímeros; (5) es de fácil escalamiento; además (6)
presenta un alto grado de reproducibilidad y eficiencia y (7) permite la obtención
de nanopartículas (incluyendo lipídicas y nanocápsulas).

Se ha demostrado que cada gota de la emulsión primaria formará varias

nanopartículas y que estas son formadas por fenómenos interfaciales durante la
difusión del solvente. Sin embargo, estos fenómenos no pueden ser totalmente
explicados por efectos de convección causados por la turbulencia interfacial. Los
autores sugieren que las nanopartículas se forman debido a una inestabilidad
química producida por el transporte del solvente, por un mecanismo similar a
aquel usado para explicar los procesos de emulsificación espontánea (diffusion-
stranding). La idea básica es que la difusión del solvente desde los glóbulos
acarrea moléculas hacia la fase acuosa, constituyendo regiones locales de
supersaturación en las que los nuevos agregados de polímero (no totalmente
desolvatados) serán formados (Quintanar-Guerrero, et al 1997a). La estabilización
de estas protonanopartículas por la presencia de estabilizante es muy importante,

10
con el objeto de evitar su coalescencia y la formación de aglomerados. En la
Figura 2.2 se muestra el mecanismo de formación de nanocápsulas, considerando
que si el estabilizante se encuentra en la interfase líquido-líquido durante el
proceso de difusión y considerando que tienen un buen efecto estabilizante, se
provocará la formación de nanopartículas una vez que se lleve a cabo la difusión
del disolvente.

2.1.4. Estabilidad de sistemas coloidales.

Los sistemas coloidales se encuentran en estabilidad termodinámica por

efecto de los surfactantes utilizados, sin embargo; al existir una desestabilización
hay un aumento de tamaño de partícula de las más grandes a expensas de las
pequeñas. Por lo que la probabilidad de floculación, cremado o coalescencia
depende en gran medida del grado de polidispersión de las gotas y las posibles
interacciones entre estas (Aranberri et al, 2006). Una manera de evaluar los
cambios en estabilidad de los sistemas coloidales es monitorear durante el
almacenamiento los cambios en tamaño de partícula, índice de polidispersión y
potencial zeta (ζ).

Figura 2.2. Descripción del mecanismo para la formación de nanopartículas

por el método de emulsificación-difusión con base en el mecanismo de \“diffusión-
stranding\” a) antes de la etapa de difusión, b) durante la etapa de difusión.

11
 Quintanar-Guerrero et al., 1997a.

2.1.4.1. Distribución de tamaños de partícula

El tamaño de las partículas es uno de los parámetros más importantes

para la caracterización de las nanopartículas en dispersiones coloidales. En primer
lugar, la distribución del tamaño de partícula no se define por el valor de la media
del tamaño, sino por la forma en que se define el “medio”. La media, la mediana y
la moda son los descriptores igualmente válidas. Además, la propia población
puede ser definida por el número o volumen de las partículas presentes, y estos
son sólo dos de los diversos sistemas de ponderación que pueden ser empleados.
La propia forma de la partícula es importante también, una forma esférica presenta
una dispersión de la luz diferente de una que es rectangular. Las determinaciones
de tamaño de las partículas son en su mayoría para confirmar que el rango
deseado del tamaño coloidal se ha obtenido durante la preparación y que se
mantiene durante el almacenamiento o la transformación posterior (Nastruzzi,
2005).

La Figura 2.3 muestra los diferentes tipos de distribución que pueden

encontrarse en los sistemas coloidales, en un sistema monodisperso, las
partículas son de un tamaño uniforme, generalmente se produce cuando la
agitación es homogénea, en cambio un mezclado incompleto o mal efectuado
puede dar paso a una distribución polidispersa que genera un amplio rango de
tamaños de partículas. La distribución de tipo bimodal es producido por una
mezcla de dos emulsiones, mostrándose dos poblaciones (Bosquez-Molina et al.,
2003).

12
 Figura 2.3 Distribuciones de tamaño de partícula en sistemas coloidales.
Hernández, 2004.
2.1.4.2. Potencial zeta (ζ)

Los fenómenos electrocinéticos es un término genérico aplicado a los

efectos asociados con el movimiento de las soluciones iónicas cerca de las
interfaces cargadas. La determinación de la estructura detallada de la doble capa
eléctrica de polímeros coloidales son de gran importancia en problemas de
estabilidad y reología de sistemas dispersos (Hidalgo-Álvarez, 1996).

La capa de contra iones que rodean la partícula cargada es llamada doble capa
difusa y la concentración en la doble capa difusa es función de la distancia de la
superficie de la partícula. Cuando la partícula cargada se mueve con respecto a su
envolvente (electroforesis), hay un plano de corte entre las dos fases y el potencial
eléctrico del plano se llama ζ. Se puede medir experimentalmente por el
movimiento electrocinético de las partículas. Debido a que el ζ determina las
fuerzas interpartículas entre sistemas electrostáticamente estabilizados esta es
una medida de estabilidad relativa (Karlsson et al., 2005). En el Cuadro 2.1 se
muestran los valores de ζ y su relación con la estabilidad del sistema.

13
 Cuadro 2.1. Características de estabilidad con diferentes valores
de ζ
Características de estabilidad ζ (mV)
Máxima aglomeración y precipitación +3a0
Excelente aglomeración y precipitación -1 a-4
justa aglomeración y precipitación -5 a -10
umbral de aglomeración -11 a -20
plataforma de estabilidad ligera (pocos aglomerados) -21 a -30
estabilidad moderada (no aglomerados) -31 a -40
buena estabilidad -41 a -50
muy buena estabilidad -51 a -60
excelente estabilidad -61 a -80
máxima estabilidad para sólidos -81 a -100
máxima estabilidad para emulsiones -81 a -125
Schramm, 2005.

2.2 Nanotecnología en Alimentos

La nanotecnología tiene el gran potencial de generar nuevos productos y

procesos en el campo de los alimentos con numerosos beneficios, por ejemplo, el
aseguramiento de la calidad y seguridad alimentaria, análisis de la composición,
detección y neutralización de microorganismos y contaminantes abióticos,
detección de factores anti nutricionales y alérgenos y el control de procesos; en el
Cuadro 2.2 se muestra un resumen propuesto por Bouwmeester et al. (2009)
acerca de los usos de la nanotecnología en alimentos.

Mediante la adición de nanopartículas pueden desarrollarse nuevos

envases y recubrimientos comestibles con mejores propiedades mecánicas y de
barrera a los gases, también es posible incluir nanosensores para alertar a los
consumidores cuando la vida útil de un producto ha terminado. La nanotecnología
puede también emplearse en alimentos funcionales con sistemas de liberación en
sitios de acción específicos para mejorar la salud humana (Chi-Fai et al., 2007;
Siegrist et al., 2008).

14
 Cuadro2.2. Resumen de las aplicaciones de la nanotecnología en la cadena
de producción de alimentos.)
Etapa en Aplicación Nanotecnología Función Contacto
la cadena NP/
consumid
or
Producción Nanosenso- Nanospray en Detecta y colorea +
agrícola res productos alimenticios microorganismos
Dispositivos Detecta contaminantes, --
micotoxinas y
microorganismos
Pesticidas Nanoemulsiones, Aumento en la eficacia y ++
encapsulados solubilidad en agua
Liberación de activos. Activa la liberación local ++
nanoencapsulados de las sustancias
Purificación de Filtros con nanoporos Remoción de patógenos -
agua y y contaminantes.
limpieza de Nanopartículas Remoción, catálisis u -/+
lodos oxidación de
contaminantes
Produc- Producción de Dispositivos de Gran área superficial -/+
ción y alimentos nanocerámicos reactiva
proce- Refrigeradores Incorporación de Recubrimientos -/+
samiento , contenedores nanopartículas (plata y antibacteriales
de para óxido de zinc)
alimentos almacenamien
to, equipo de
preparación de
alimentos
Conserva- Productos Sprays de plata Detección de deterioro -/+
ción alimenticios nanométrica del alimento
Materiales de Incorporación de Monitoreo de las ++
envase sensores, acción condiciones de
antibacterial almacenamiento
Incorporación de NP Aumento de las -/+
propiedades de barrera
y resistencia de los
materiales
Incorporación de NP Eliminación del oxígeno, -/+
activas prevención del
crecimiento de
patógenos
Alimentos Suplementos/a NP de metales Mayor captación del ++
funcionales ditivos coloidales metal deseado
Sistemas de liberación Protección liberación del ++
contenido sólo en
ciertos puntos a ciertas
condiciones
Nutrientes agrupados Mayor absorción de los ++
en formas nanométrica nutrientes
“-”, no hay contacto de la nanotecnología con el alimento; “-/+”, contacto con el alimento durante la
producción pero no hay exposición directa de nanopartículas al consumidor; “+/++”, nanopartículas
directamente agregadas en productos para el consumidor.
Bouwmeester et al., 2009

15
 Algunas aplicaciones en el desarrollo de recubrimientos empleando
nanotecnología para la conservación de frutas y vegetales frescos incluyen
nanopartículas de plata para incrementar la vida útil de zanahorias y ensaladas de
frutas, aprovechando el potencial de las partículas metálicas para inhibir el
crecimiento microbiano (Costa et al., 2011; Costa et al., 2012). En este trabajo se
revisaran algunos aspectos para el desarrollo de recubrimientos comestibles
empleando activos antioxidantes y ceras para el desarrollo de sistemas coloidales
que tienen potencialidades para ser aplicados en la conservación de frutos en
diversas presentaciones.

2.3. Recubrimientos comestibles

Un recubrimiento comestible se define como una capa delgada de

material comestible formado directamente sobre un alimento, éstos son aplicados
en forma de líquido sobre el alimento por inmersión, aspersión o goteo (Olivas y
Barbosa-Canovas, 2005).

En general las películas o recubrimientos comestibles tienen la capacidad

de actuar como barrera a la migración de humedad, O2, CO2, aromas, sabores, y
lípidos; pueden también, mejorar la integridad estructural de productos frágiles o
las propiedades de manejo mecánico del alimento, es por ello que pueden servir
como envase, sí dichas propiedades son adecuadas y las condiciones de sanidad
prevalecen durante su almacenamiento, transportación y comercialización.
Además ayudan a mantener la calidad de los alimentos después de que el envase
es abierto, pues estas sirven para estabilizar los gradientes de actividad de agua,
protegiéndolo contra la pérdida o ganancia de humedad y pérdida de aromas,
además de que hacen posible la incorporación de agentes antimicrobianos,
saborizantes, antioxidantes y pigmentos (Park, 1999; McHugh et al., 2000).

Desde hace muchos años se ha trabajado en mejorar los recubrimientos

desarrollados a base de ceras, ya que si estas no se emplean adecuadamente
impiden la respiración del fruto provocando daños fisiológicos, las ceras más
empleadas han sido la de candeuba, canelilla, cera de abeja, etc. (Bosquéz-Molina
et al., 2003).
16
 Los recubrimientos comestibles pueden influir en la calidad de las frutas
recubiertas de diferentes maneras, como en la transferencia de humedad entre la
fruta y el medio ambiente, la liberación controlada de agentes químicos como
antimicrobianos, saborizantes y antioxidantes, la reducción del oxígeno interno con
una disminución en el metabolismo de la fruta. Por lo tanto, algunos de los efectos
que se pueden observar en los frutos recubiertos son: reducción en la velocidad
de respiración, disminución de la pérdida de peso, retraso del oscurecimiento
enzimático y aumento de la vida útil (Rojas-Graü et al., 2009; Pavlath y Orts,
2009).

La aplicación de recubrimientos comestibles en la superficie de las frutas

imparte una apariencia brillosa y mejor color, reduce las pérdidas de peso,
extiende la vida de anaquel y previene el ataque microbiano, lo cual es muy
importante en frutas perecederas. Los recubrimientos comestibles crean una
atmósfera modificada alrededor de las frutas ya que funcionan como una barrera
semipermeable al vapor de agua y otros gases, y sus usos ofrecen una atractiva
alternativa en empaques debido a sus características amigables con el ambiente
(Debeaufort et al., 1998; Perez-Gago et al., 2006).

La funcionalidad de los recubrimientos comestibles se puede mejorar

mediante la incorporación de nanopartículas (agentes antimicrobianos, aditivos,
antioxidantes e ingredientes funcionales), los cuales pueden tener una mejor
distribución en la superficie del producto y lograr interactuar con la membrana
celular del fruto o impedir el desarrollo de microorganismos (Costa et al., 2012).

2.4 Características fisicoquímicas de los frutos

La calidad es un atributo no definido y puede considerarse como el

conjunto de propiedades o características peculiares de cada producto
hortofrutícola, en esta se consideran propiedades sensoriales que incluyen
apariencia, textura, sabor, aroma y nutricionales (Artés et al., 2002).

El estado de madurez en el momento de la cosecha determina la calidad

final del producto. Cuando lo frutos son recolectados inmaduros, presentan

17
características indeseables identificables como el aumento en la susceptibilidad a
desordenes fisiológicos. Por otro lado, cuando son cosechados muy maduros,
entran rápidamente en la senescencia. No existe un patrón y un consenso del
estado de maduración ideal para la cosecha de guayabas (Barret et al., 2005).
Estas normalmente son recolectadas cuando la pulpa esta firme y la coloración de
la cáscara comienzan a cambiar de verde-oscuro a verde-claro (Azzolini et al.,
2004).

En el Cuadro 2.3 se muestran los resultados encontrados por Soares et al

(2007) en cuanto a color, pH, acidez titulable, sólidos solubles totales, azúcares y
vitamina C en frutos de guayaba blanca a diferentes estados de maduración,
siendo importante resaltar el comportamiento del ángulo Hue que disminuye
conforme transcurre la maduración, lo cual indica el paso del color verde claro al
color amarillo. El valor de pH aumenta durante la maduración de un 4.07 a 4.54
disminuyendo así el sabor ácido y disminuyendo el contenido de acidez; mientras
que, los sólidos solubles totales, la sacarosa y la glucosa tienden a aumentar
durante la maduración.

Cuadro 2.3. Composición fisicoquímica de guayaba a diferentes

estados de madurez.
Parámetros Estados de maduración
inmaduro intermedio maduro
Color
L 53.83 64.05 71.87
a -9.78 -2.99 4.23
b 22.25 28.9 32.83
C 24.3 29.05 33.1
h° 113.73 95.91 82.66
pH 4.07 4.48 4.54
Acidez titulable 0.39 0.46 0.44
(% ac.citrico)
Sólidos Solubles Totales (SST) 7.4 8.6 8.4
Sacarosa 10.57 11.43 11.37
(mg/100g)
Glucosa 22.5 15.16 14.13
(mg/100g)
Fructosa 21.46 17.96 18.39
(mg)100g)
Vitamina C 76.8 145.35 168.36
(mg ac.ascorbico/100g)
Soares et al., 2007

18
 La guayaba es un fruto sensible al daño por frio y a los cambios en
las concentraciones de CO2 y O2 (Benito-Bautista y Mercado-Silva, 1997),
razón por la que se han realizado diversos estudios para el almacenamiento
en atmósferas modificadas y utilización de recubrimientos con base en
carboximetilcelulosa, almidones, pectina, cera de candelilla, candeuba,
sacarosa, glucosa, aceites vegetales, goma de mezquite (Khuyen et al.,
2008; Tomás et al., Espinoza-Zamora et al., 2010).

2.5. Frutos frescos cortados

El hecho de que los productos frescos cortados sean tan apreciados se

debe a sus características primarias de frescura y conveniencia. Los productos
frescos cortados deben de ser inocuos, sanos y preparados bajo Buenas Prácticas
Agrícolas (BPA), Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) por lo que son
necesarios procesos de desinfección y sanitización adecuados. Snyder (2003)
definió los alimentos mínimamente procesados como “aquellos en donde los
riesgos debidos a los procesos biológicos, químicos y físicos se encuentran en
niveles tolerables”.

La Asociación Internacional de Productos Frescos Cortados (IFPA, por

sus siglas en inglés) define a las frutas y vegetales frescos cortados inicialmente
llamados mínimamente procesados o productos ligeramente procesados, como
cualquier fruta fresca o vegetal que ha sido físicamente modificado de su forma
original (por pelado, cortado, lavado, etc.), para obtener un producto 100 %
comestible que es subsecuentemente envasado y almacenado a temperaturas de
refrigeración (Rojas-Graü et al., 2011; Olivas y Barbosa-Canovas, 2005).

Los productos frescos cortados incluyen ensaladas en bolsas, zanahorias

baby, mezclas de vegetales y frutas frescas cortadas como manzana, piñas o
melones (Balla y Farkas, 2006; Rojas-Graü et al., 2011).

Debido al daño mecánico, las frutas y vegetales frescos cortados se

deterioran mucho más rápidamente que los productos intactos lo cual conduce a
cambios físicos y fisiológicos que afectan la calidad y reducen la vida útil. Los

19
síntomas de deterioro de productos frescos cortados incluyen cambios de textura,
oscurecimiento enzimático y contaminación microbiológica (Rojas-Graü, et al.,
2006).

2.6. Cambios fisiológicos y bioquímicos en frutas frescas cortadas

La intensidad de la respuesta a la ruptura celular por el procesado mínimo

depende de diferentes factores, entre los más importantes se encuentran la
especie y variedad del fruto, temperatura de almacenamiento, composición de la
atmósfera interna del empaque, la presión de vapor de agua o humedad relativa y
la presencia de inhibidores de los cambios deteriorativos. Para conseguir
productos frescos de calidad, las alteraciones fisiológicas debidas a las heridas en
el tejido del fruto deben reducirse al mínimo (Gerdemann et al., 2002).

2.6.1. Pérdida de agua

Uno de los factores importantes en la comercialización de frutas frescas

cortadas es la pérdida de peso, que es influenciada por la modificación de la
resistencia de la cutícula, ya que esta es eliminada o cortada durante las
operaciones mínimas realizadas al fruto lo que elimina las barreras a la
transpiración y con ello eleva el intercambio de vapor de agua con el entorno,
además de que con la ruptura del tejido se incrementa la relación entre el área
superficial y el volumen del producto (Toivonen y DeEll, 2002). El desarrollo de
recubrimientos comestibles es una barrera que limita el intercambio gaseoso y
con ello la pérdida de humedad del producto.

2.6.2. Cambios de textura.

Otro cambio muy evidente es la pérdida de firmeza debida principalmente

a la acción de enzimas proteolíticas y pectinolíticas sobre los componentes de la
pared celular. Durante las operaciones de procesado y, especialmente, tras el
cortado, los tejidos vegetales tienen una pérdida de firmeza debido a la hidrólisis
enzimática de las sustancias pécticas que forman parte de la pared celular.
Enzimas como la pectino-metil-esterasa (PME) y poligalacturonasa (PG) juegan un
papel importante en el ablandamiento de los tejidos. La PME produce la hidrólisis
20
de la pectina, formando metanol y ácido péctico, el cual puede ser
despolimerizado por la PG, desestabilizando las estructuras celulares. No
obstante, la actividad enzimática de los tejidos cortados puede depender del
estado fisiológico del fruto entero (Robert et al., 2003).

El daño mecánico del corte o pelado expone los tejidos y aumenta la

permeabilización de las membranas y el intercambio celular de fluidos con la
consecuente inundación de los espacios intercelulares. Induciendo una
descompartimentalización de enzimas y sustratos, causando un aumento de la
actividad enzimática y pérdida de fluidos cuya velocidad solo depende de la
temperatura del sistema (Pérez-Cabrera, 2003).

2.6.3. Acumulación de metabolitos secundarios y cambio de color

La acumulación de fenoles es uno de los fenómenos más estudiados en

respuesta al troceado de frutas y verduras. Las heridas en los tejidos tienen dos
efectos sobre el metabolismo de los fenoles, el primero es la oxidación de los
compuesto fenólicos endógenos como una consecuencia de la ruptura de la
membrana celular lo que permite la mezcla de estos compuestos con sistemas
enzimáticos oxidativos que están separados por membranas (Toivonen y DeEll,
2002), generando quinonas altamente inestables que posteriormente se
polimerizan para formar melaninas, que se ha encontrado poseen propiedades
antibacterianas y antifúngicas, para protección de los daños provocados por
insectos y herbívoros (Vermerris y Nicholson, 2006). El segundo es la estimulación
de células adyacentes por la lesión para producir más compuestos fenólicos en un
esfuerzo para cicatrizar heridas (Mercado Silva y Aquino-Bolaños 2005). Es bien
conocido que la fenilalanina amonialiasa (PAL) es la enzima clave de la ruta de los
fenilpropanoides, catalizando el primer paso en la bisoíntesis de estos compuestos
(González-Aguilar et al., 2010).

Los compuestos fenólicos en fruta fresca cortada es importante debida a

su contribución de propiedades antioxidantes y por su participación como sustrato
en la actividad de las enzimas polifenoloxidasas (PFO), que provocan el

21
oscurecimiento de los frutos. El pelado y cortado provocan la des-
compartimentación de las enzimas por lo que esto favorece la interacción con los
sustratos (Mercado-Silva y Aquino-Bolaños 2005 y Artés et al., 1998). La
degradación de compuestos antioxidantes en fruta fresca cortada se puede ver
favorecida durante el procesado debido a la exposición al oxígeno (O 2) y la luz.

El color es uno de los principales atributos que caracteriza la frescura de

los vegetales. El oscurecimiento en la fruta fresca modifica sus características
organolépticas reduciendo su calidad limitando su vida útil y comercialización.

Las heridas que se producen en las frutas y vegetales por efecto del
manejo, cortado o rebanado producen cicatrices que provocan modificación en la
actividad metabólica y actividad enzimática provocando un aumento en la
producción de compuestos fenólicos y con ello sustrato disponible para las
polifenoloxidasas, responsables del oscurecimiento en frutos. Se han realizado
muchas investigaciones enfocadas al control del oscurecimiento enzimático,
existiendo estudios sobre la actividad de la Fenil alanina amonio liasa (PAL),
enzima limitante de los fenilpropanoides, ruta que se activa principalmente cuando
hay heridas (Hiromi y Homma, 2001; Choi et al., 2005). Sin embargo, otras
enzimas como la peroxidasa también están involucradas en el oscurecimiento
enzimático (Mercado-Silva y Aquino-Bolaños 2005).

El origen de los pigmentos cafés es complejo y no se entiende

completamente, pero se sabe que involucra la oxidación de polifenoles por las
enzimas peroxidasa (POD) y polifenol oxidasa (PFO). Los compuestos fenólicos
de la fruta son oxidados hasta quinonas mediante reacciones catalizadas por las
PFO. Durante el procesado mínimo de fruta se daña la integridad del tejido vegetal
produciendose un incremento en las actividades metabólicas y una ruptura de los
compartimentos celulares dando lugar a que enzimas y sustratos entren en
contacto reaccionanando y formando compuestos activos. Estos últimos, a su vez
experimentan procesos de polimerización que dan lugar a compuestos coloreados
(melaninas), produciendo el oscurecimiento superficial del producto y
disminuyendo así su calidad visual. El grado de oscurecimiento que sufren las

22
frutas depende de la temperatura, concentración y tipo de compuestos fenólicos
presentes en los tejidos, actividad de la PFO, estado de madurez, presencia de
oxígeno (O2) y compartimentación de los enzimas y sustratos (Rojas-Graü, et al.,
2006; Oms-Oliu et al., 2008).

En la Figura 2.4 se muestra un modelo general para explicar la actividad

catecolasa y cresolasa de la PFO de muchas frutas y vegetales. Este modelo
explica la existencia de tres formas enzimáticas (“met”, “oxi” y “desoxi”) y las
particularidades de cada actividad de la enzima (Sellés-Marchat, 2007).

En el ciclo catecolasa, el o-difenol reduce al Cu (II) de la forma met

produciendo la forma desoxiCu (I), en este paso están implicados dos electrones,
además se forman una molécula o-benzoquinona y dos moléculas de agua. A
continuación la forma desoxi reacciona con el oxígeno molecular generando la
forma oxi. Cada uno de los átomos de Cu (II) de la forma oxi se une a un átomo de
oxígeno de los grupos hidroxilo de otro o-difenol dando lugar al complejo ternario
Cu (II)-O2-difenol. En el último paso, el o-difenol es oxidado a o-benzoquinona y la
enzima es reducida a la forma met. Para completar el ciclo, otra molécula de o-
difenol se une a la forma met y se produce la oxidación del o-difenol a o-quinona y
la correspondiente reducción de la forma met a la forma desoxi (Ramírez et al,
2003)

En el ciclo creseolasa (B) sólo participan las formas desoxi y oxi. En este
ciclo la forma oxi reacciona con un sustrato monofenólico para formar un complejo
ternario Cu (II)-O2-monofenol que se reorganiza para dar lugar a un intermediario
de reacción. Este intermediario de reacción es de naturaleza muy reactiva y
conduce a la hidroxilación del sustrato formándose o-difenol unido a la enzima. La
salida del producto implica la transferencia de un electrón a cada Cu2+, pasando
estos a Cu1+ y formándose o-quinona, agua y la forma desoxi (Ramírez et al.,
2003; Sellés-Marchat, 2007).

23
 La forma met, reducida a la forma desoxi por o-difenol también puede ser
reducida a la forma desoxi por otro compuesto reductor (ácido ascórbico,
hidroxilamina, ditionita) y por H2O2 en presencia de O2 (Ramírez et al., 2003).

El grado de oscurecimiento que muestran las frutas y vegetales frescos

cortados puede depender de la concentración y tipos de compuestos fenólicos
presentes en los frutos, así como del contenido de cobre en la enzima que
contribuye a la actividad de la PFO, temperatura, estado de madurez, presencia
de oxígeno, y compartimentación de las enzimas y sus sustratos (Rojas-Graü, et
al., 2006; Jiménez-Vieyra y Zambrano-Zaragoza, 2011).

Figura 2.4. Cinética de oxidación de o-difenol (catecol [A]) y monofenoles (fenol [B])
por la polifenoloxidasa.
Lee y Whitaker, 1995.

La velocidad de reacción del oscurecimiento puede ser diferente entre

frutas y hortalizas. Esto puede ser explicado a la capacidad de respuesta al daño
mecáncio y a la cantidad de compuestos fenólicos en el momento del daño; las
manzanas contienen una suficiente cantidad de polifenoles que causan un rápido
oscurecimiento enzimático, mientras que la lechuga contiene una menor cantidad
de esos compuestos; cuando la manzana es cortada, la sección cortada

24
generalmente se torna café en aproximadamente una hora, en tanto que la
lechuga puede tomar días (Hiromi y Homma, 2001).

2.6.4. Actividad de la fenilalanin amonio-liasa

Una respuesta inicial a las heridas (y muchas otras tensiones bióticas y

abióticas) es la síntesis de “novo” y el aumento de la actividad de la fenilalanin
amonio-liasa (PAL), la primer enzima involucrada en la ruta de fenilpropanoides.

La Figura 2.5 muestra la biosíntesis de los fenilpropanoides; el sitio de

control de la ruta parece ser la transformación de la L-fenilalanina a ácido trans-
cinámico llevada cabo por PAL. Un aumento en la actividad de esta enzima lleva a
formación de una amplia gama de compuestos fenólicos.

Figura 2.5. Biosíntesis de compuestos fenólicos

Pérez-Cabrera et al., 2006

Los compuestos fenólicos solubles producidos por el aumento de la

actividad de la PAL son retenidos en vacuolas y sólo participan en las reacciones
de oscurecimiento cuando se alteran las membranas y se permite a los sustratos y
a las enzimas mezclarse produciendo el oscurecimiento superficial (Choi et
al.,2005).

25
 Las heridas y la exposición al etileno estimulan la ruta de fenilpropanoides
generando nueva actividad enzimática, que conduce a una mayor producción de
los principales compuestos fenólicos y la síntesis de nuevos componentes (Roura
et al., 2008). Así, las heridas generan altos niveles de la actividad de la PAL no
sólo en las células cercanas a la herida, sino también en las células que se
encuentran hasta 2.5 cm de distancia del sitio de la herida. Esto indica que la
cicatrización en el tejido por la producción de PAL debido a las heridas, es
transmitida del tejido herido al que no lo está. La actividad de la PAL no sólo es
producida por lesiones y/o exposición al etileno, también por otras alteraciones
como temperatura e infecciones de hongos.

De aquí que cuando los alimentos son sometidos a un proceso de cortado

con un tratamiento como un recubrimiento, es necesario evaluar la actividad PAL
puesto que con ello será posible predecir la evolución del oscurecimiento
enzimático por la relación existente entre la acción de estas dos enzimas.

2.6.5. Riesgos y Regulación en Nanotecnología

Si bien la nanotecnología tiene amplias posibilidades de aplicación en el

desarrollo de nuevos y mejores sistemas para diferentes sustancias de interés en
alimentos (aditivos, conservadores, agentes modificadores de textura,
saborizantes, colorantes y transportadores de nutraceúticos), es necesario
considerar los riesgos que ésta implica para la salud, ya que durante el
procesamiento, almacenamiento, transporte y comercialización el producto con
nanopartículas pueden tenerse interacciones con otros componentes del alimento
dando lugar a un riesgo toxicológico o bien al desarrollo de sustancias que una
vez ingeridas provoquen en el consumidor efectos adversos, razón por la que es
necesario considerar la evaluación de los riesgos reales atribuidos a los
nanosistemas.

Actualmente, existen diversos organismos a nivel mundial que han iniciado

la evaluación de riesgos y toxicología de productos obtenidos por nanotecnología.
En Estados Unidos por ejemplo existe la dirección general de salud y protección al
consumidor que evalúa los riesgos que pueden producir diversos aditivos.
26
(Bowmester & Marvian, 2010; Cushen et al., 2012). Sin embargo, actualmente
este organismo se ha dedicado a establecer una terminología clara sobre los
nanosistemas. Con el rápido desarrollo de nuevos sistemas de talla submicrónica
se requiere urgentemente la implementación de una metodología para la
evaluación de riesgos reales, en particular para aquellos que son directamente
utilizados en alimentos (Bowmeester y Marvin, 2010).

La evaluación del efecto toxicológico debe considerar las diferentes rutas

por las que los nanomateriales pueden tener impacto, estas rutas pueden ser por
contacto, por inhalación y por ingestión, siendo esta última la más importante para
el consumo de los alimentos (Chen et al., 2006b). En este sentido, es sabido que
existen procesos en los que se incluyen etapas de nanoemulsificación, como
sucede en la industria de helados y aderezos, donde en estas etapas se
obtendrán como resultado formación de partículas de talla nanométrica lo que
implica un riesgo que aún no ha sido evaluado debido a que las partículas lipídicas
formadas pudiesen atravesar el tracto gastrointestinal y producir modificación de
absorción o bien incrementar la respuesta alergénica (Chaydhry et al., 2008;
Chaudhy et al., 2010; Kuzma y Priest, 2010). En relación a la ingestión, el principal
riesgo que debe ser estimado es la interacción de los componentes nanométricos
a nivel intestinal ya que estos pueden modificar la absorción de nutrientes o bien
producir inflamación de la mucosa intestinal que representa un riesgo para la salud
(Chaudhy et al., 2010). Las nanopartículas pueden prolongar considerablemente el
tiempo de residencia en el tracto gastrointestinal incrementado la superficie
disponible para que se lleven a cabo interacciones con la pared intestinal y
provocando que puedan penetrar a través de los tejidos y capilares siendo esto
benéfico ya que puede incrementarse la absorción y liberarse en diferentes partes
del cuerpo. Sin embargo, es necesario evaluar los riesgos que esto pudiese
implicar en las mucosas gastrointestinales y del tracto respiratorio (Nel et al.,
2006). Se han reportado estudios que evalúan el efecto del tamaño de partícula
(50 a 3 µm) y la presencia en sangre de esferas de poliestireno, después de 10
días, encontrándose que cerca del 34 % de la sangre analizada presentó
nanopartículas cuando estas se encontraban entre 50 y 100 nm, y no

27
detectándose cuando los diámetros eran superiores a los 300 nm (Chau et al.,
2007).

En el caso de los alimentos con nanoenvases se desconoce el riesgo que

se tiene con el consumo de alimentos que transfieren nanopartículas desde los
materiales de envase, considerando que el riesgo de toxicidad depende más bien
del nanomaterial utilizado, de la velocidad de migración y el volumen de consumo
de un alimento en particular. La migración de los componentes dependerá en gran
medida del tipo de polímero utilizado, la viscosidad dinámica y la distribución de
tallas de partícula, por lo que el riesgo se verá modificado por estas variables
(Cushen et al., 2012). Sin embargo, en el desarrollo de envases en los que se
emplean principalmente plata, oro, titanio, dióxido, silicón, etc, se ha encontrado
que partículas ultrafinas (d < 100 nm) han implicado serios problemas
inflamatorios en las vías respiratorias (Brayner, 2008).

En general para el estudio de riesgos y toxicidad es necesario considerar

las propiedades fisicoquímicas incluyendo, tamaño de partícula y su distribución,
estado de aglomeración, forma, estructura cristalina, composición química, área
superficial, superficie química, carga de superficie y porosidad. Además cada
sustancia modificada a talla nanométrica presentará problemáticas totalmente
distintas, ya que por ejemplo el selenio que es una sustancia toxica ve reducido su
efecto cuando se disminuye su talla a nivel nanométrico (Zhang et al., 2003;
Oberdörster et al., 2005).

Debido a que los riesgos y aspectos toxicológicos del empleo de

nanopartículas no se encuentran claramente establecidos ha sido necesario llevar
a cabo la evaluación del impacto en la seguridad pública, legislación, sociedad e
industria de alimentos considerando la potencial toxicidad de los nanomateriales
(Cushen et al., 2012). Son muchos los grupos que han presentado iniciativas de
regulación tanto en el sector gubernamental como en el industrial, así por
ejemplo,la comisión del Codex Alimentarius participa en el desarrollo de una
regulación internacional de alimentos incluyendo nanopartículas y otras
tecnologías a nanoescala utilizados en agricultura, procesamiento y conservación

28
de alimentos, sin embargo hasta el momento no existe una regulación clara en
este sentido (Chau et al., 2007).

Para mejorar en los aspectos de regulación en nanotecnología la legislación

se ha separado en dos vertientes una orientada a los atributos de la
nanotecnología y otra más aplicada al uso de la nanotecnología en diversas áreas.
La Legislación Europea en relación a los atributos de la nanotecnología Directiva
2001/95/EC incluye la seguridad del producto, buenas prácticas de manufactura,
etiquetado y la evaluación de la potencialidad del mismo y en relación a los
atributos del producto considera los aspectos químicos, estéticos y funcionales
como aspectos de regulación (Cushen et al., 2012).

La FDA actualmente no ha establecido una posición formal en cuanto a la

regulación de la nanotecnología sino más bien, siendo un organismo que regula el
uso de sustancias en medicina y alimentos, se ha enfocado más bien a los
ingredientes específicos que constituyen un producto. La FDA participa en la
Iniciativa nacional de nanotecnología (NNI por sus siglas en inglés) desde el 2000
y a partir de octubre de 2006 está considerando al momento la evaluación de los
efectos adversos para la salud, sin que exista un avance al respecto en estos
momentos (Bergeson, 2011).

29
 III. JUSTIFICACIÓN
Las frutas y hortalizas en estado fresco presentan como problemática
general una alta perecibilidad debido a su velocidad metabólica que se ve
incrementada si estos productos son sometidos a procesos de corte como los
utilizados en el procesado mínimo. Las técnicas convencionales de conservación a
baja temperatura en conjunto con el uso de atmósferas modificadas (uso de
películas plásticas y películas comestibles) o bien el uso de ceras superficiales
han tenido una aplicación importante que podría ampliarse si se agregara nuevos
conocimientos o herramientas que permitieran un control tecnológico de los
procesos de deterioro.

Los sistemas funcionales empleados en la conservación deben integrarse

homogéneamente a los alimentos con el fin de ejercer la acción de proteger,
enriquecer, reconstituir, fortificar, potenciar y/o inhibir el crecimiento microbiano.
De acuerdo con la revisión realizada es posible considerar qué el desarrollo de
sistemas submicrónicos con ingredientes de uso alimentario tienen amplias
posibilidades tecnológicas, pudiendo ser utilizada en la protección y conservación
de frutas frescas enteras o mínimamente procesadas. Los sistemas de talla
nanométrica, deberán tener la posibilidad de permanecer activos el mayor tiempo
posible y/o ser liberados de manera controlada o sostenida, con el fin de cumplir
con la función de modificar la atmósfera interna de los productos, modificar la
actividad enzimática relacionada con el índice de oscurecimiento, textura y síntesis
de fenoles.

Por otro lado, después de diversas reuniones entre los grupos de

investigación de ingeniería en alimentos y de nanotecnología farmacéutica de la
FES-Cuautitlán, se coincidió en que las implicaciones de la nanotecnología en el
área del procesamiento y conservación de alimentos, tendrían un importante
impacto científico y la generación de una línea de investigación multidisciplinaria
con los correspondientes beneficios técnico-científicos. Razón por la que se cree
tener la certeza de que los sistemas propuestos en el presente proyecto son
innovadores en el área de los alimentos.

30
 IV. HIPÓTESIS
Actualmente la utilización de recubrimientos comestibles con base en
lípidos y antioxidantes ha hecho posible mantener la calidad de fruto frescos
enteros y cortados. Con base en la investigación, análisis y comprobación, el
empleo de sistemas coloidales de talla submicrónica permitirá desarrollar
recubrimientos homogéneos de fácil aplicación, con una mayor área superficial
proporcionada por nanocápsulas y nanopartículas que contribuirán a incrementar
los beneficios de los recubrimientos en la conservación y vida útil de los alimentos,
y con ello aumentar las posibilidades de aplicación de la nanotecnología en áreas
de conservación y procesamiento.

31
 V. OBJETIVOS
5.1. Objetivo General

Desarrollar vectores nanométricos (nanocápsulas y nanopartículas

lipídicas sólidas) con ingredientes de uso en alimentos que permitan su aplicación
en sistemas barrera modificados y con ó sin aditivos que contribuyan a
incrementar la vida útil de frutas frescas enteras y cortadas.

5.2. Objetivos Particulares

I. Establecer la influencia de los componentes y las condiciones del proceso de

emulsificación-difusión sobre el tamaño de partícula y la estabilidad de
nanocápsulas y nanopartículas lipídicas sólidas para definir los parámetros
críticos de la preparación de sistemas de talla submicrónica.

II. Caracterizar los sistemas submicrónicos obtenidos, con el fin de optimizar la

formulación y las condiciones de proceso para obtener productos estables y
funcionales que cumplan con las especificaciones sanitarias y toxicológicas
alimentarias.

III. Evaluar la capacidad de los sistemas submicrónicos obtenidos para ser

utilizados como modificadores de barrera, aditivos, protectores y/o
acarreadores de sustancias funcionales en frutas frescas enteras y cortadas.

IV. Determinar el efecto del uso de nanocápsulas cargadas de antioxidantes

naturales en la actividad polifenoloxidasa fenil alanin-amonio liasa, índice de
oscurecimiento, cambios de color, textura y composición química de manzana
fresca cortada

V. Aplicar nanopartículas lipídicas sólidas en guayaba variedad media china

entera mediante el seguimiento de su velocidad de deterioro y cambios de
madurez, asociándolos a la disminución de su vida útil.

32
 VI. METODOLOGÍA
Esta investigación se realizó en diferentes instituciones que permitieron el
uso de sus laboratorios con equipos necesarios para el desarrollo experimental de
la tesis doctoral, estas se mencionan en orden de importancia:

 Programa de Posgrado del Centro de la Republica, Facultad de Química,

de la Universidad Autónoma de Querétaro.
 Laboratorio de Posgrado en Farmacia, Universidad Nacional Autónoma de
México, Facultad de Estudios Superiores-Cuautitlán, Edo. de México.
 Nave 2000 de Ingeniería en Alimentos, Universidad Nacional Autónoma de
México, Facultad de Estudios Superiores-Cuautitlán, Edo. de México.
 Laboratorio de Microscopía Electrónica, Universidad Nacional Autónoma de
México, Centro de Física Aplicada y Tecnología Avanzada, Campus
Juriquilla, Querétaro, Qro.

6.1. Desarrollo Experimental

Los procedimientos experimentales realizados se dividieron en dos etapas

correspondientes a la aplicación de los sistemas coloidales en la superficie de
frutos de la siguiente manera:

I. Aplicación de nanocápsulas con dl--tocoferol como agente activo, para

disminuir el índice de oscurecimiento en manzana de la variedad ‘Red
Delicius’, tratando de explicar los mecanismos de acción involucrados en la
acción de la polifenoloxidasa.

II. Empleo de nanopartículas lipídicas sólidas como recubrimiento comestible

en guayaba Media China, para incrementar su vida de anaquel evaluando
sus cambios en los parámetros fisicoquímicos durante el almacenamiento
refrigerado.

Con la Finalidad de mostrar el seguimiento de la investigación en la

Figura 6.1 se muestra la secuencia metodológica realizada durante esta
investigación.

33
Figura 6.1 Desarrollo metodológico para la aplicación de sistemas nanopartículados en frutas

34
Etapa 1 Aplicación de Nanocápsulas
6.1. Optimización para preparación de nanocápsulas
De acuerdo con la Figura 6.1, en esta primera etapa se realizó la
optimización de las condiciones de preparación de nanocápsulas, siendo
necesario realizar ensayos preliminares para seleccionar los factores y los niveles
para llevar a cabo la optimización. En el Cuadro 6.1 se muestran los materiales
probados (polímero de 100 a 400 mg), solubilidad de aceites en disolventes
orgánicos (metil etil cetona y acetato de etilo), estabilizantes (2 al 15 %), para de
aquí proponer el diseño experimental.

Cuadro 6.1. Materiales utilizados para la elaboración de nanocápsulas.

Polímero Disolvente Estabilizantes Aceites
Poli-ε- Acetato de etilo Alcohol polivinilico Girasol
caprolactona
Poliláctico- Metil etil cetona Pluronic F-127 Soya
co-glicólico (polóxamero)
Cártamo

6.1.1. Preparación de nanocápsulas

Las nanocápsulas cargadas con diferentes activos (según diseño

experimental, cártamo, girasol, soya, -tocoferol) fueron preparadas por el método
de emulsificación-difusión (Quintanar-Guerrero et al., 1998a). La Figura 6.2
muestra las etapas generales para la preparación de nanocápsulas. Brevemente,
cada uno de los disolventes se saturó por 1 minuto con agua destilada, con la
finalidad de garantizar un equilibrio termodinámico de ambos líquidos (agua-
disolvente orgánico). En la fase orgánica saturada con agua se solubilizó la poly--
caprolactona y 0.5 mL del activo (aceite de cártamo, girasol, soya y dl--tocoferol).
En la fase acuosa saturada con disolvente se solubilizó el estabilizante (alcohol
polivinilico o pluronic F-127). Una vez preparadas las fases orgánica y acuosa se
procedió a preparar una emulsión aceite/agua: 20 mL de la solución orgánica se
emulsificaron con 40 mL de la fase acuosa con un agitador mecánico de velocidad
variable a 1900 rpm (Heidolph® Instruments, tipo R2R1, Schwabach, Alemania) y/o
con dispersión de alta velocidad (Ultra-Turrax® T50, IKA Labotechnik, Staufen,
Alemania), para velocidades de entre 2000 a 6000 rpm que fueron controladas
dependiendo del equipo empleado. El proceso de emulsificación se llevó a cabo

35
por 10 min, para posteriormente pasar a la etapa de difusión, adicionando 200 mL
de agua que indujo la salida del disolvente a la fase continua de la emulsión,
logrando con ello la formación de las nanocápsulas; después de esta etapa se
eliminó el exceso de disolvente mediante evaporación a 30 °C y vacio de 70 mm
de Hg.

Figura 6.2. Procedimiento de preparación de nanopartículas por el método

emulsificación-difusión
Quintanar-Guerrero et al. (1998a)

6.1.2. Diseño Experimental para nanocápsulas

Se evaluó el efecto de tres variables independientes X1 (velocidad de

cizalla), X2 (contenido de alcohol polivinílico) y X3 (contenido de poli--
caprolactona), sobre las variables de respuesta (Y1-Y4), tamaño de partícula, PDI,
(ζ) y densidad). Los efectos fueron evaluados empleando un diseño compuesto

36
central con el fin de estudiar los efectos principales y sus combinaciones en la
preparación de nanocápsulas de aceite de cártamo (0.5 mL), para: determinar el
efecto de los factores sobre las variables de respuesta; crear un modelo que
correlacione las variables entre sí, determinando el efecto de los factores sobre las
respuestas y optimizar el proceso en función a las variables de respuesta
estudiadas y los valores deseables. En el cuadro 6.2, se muestran las variables
independientes codificadas y sin codificar utilizadas en el diseño experimental.
Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en forma aleatoria con la
finalidad de disminuir la variabilidad de los resultados por efectos externos. Los
puntos centrales se repitieron 6 veces con el fin de calcular la repetitividad del
método (Montgomery, 2001; Myers y Montgomery, 2002).

Cuadro 6.2. Variables independientes sin codificadar en el diseño

compuesto central.
Variables Variables sin Niveles
codificadas codificar
-1.633 -1 0 1 1.633
X1 Velocidad (rpm) 734 2000 4000 6000 7266
X2 % PVAL 0.917 2.5 5 7.5 9.08
X3 Poly--caprolactona 36.7 100 200 300 363.3
(mg)

6.1.3. Análisis Estadístico nanocápsulas

Se utilizó el análisis de regresión y de varianza (ANOVA), para estimar los

coeficientes de regresión y evaluar la significancia estadística de los términos que
se emplearon para establecer el modelo matemático que describe el
comportamiento de los datos experimentales y la región óptima para las variables
de respuesta.

El comportamiento de la superficie de respuesta se estableció en función

a las variables de respuesta estudiadas (Yi), empleando un modelo polinomial de
seundo orden descrito por:

(6.1)

donde, Yi representa la respuesta predicha, β0 es la ordenada al origen,

β1, β2 y β3 son los coeficientes de regresión para los términos lineales, β 11, β22 y

37
β33 son los coeficientes para los términos cuadráticos de la ecuación y β 12, β13 y
β23 son los efectos de las interacciones, εi el término de error experimental con
N(0,0.5). Los efectos de los parámetros de la ecuación fueron evaluados con un
nivel de significancia del 5 %. Se consideró una prueba de bondad de ajuste y
estimación de los coeficientes de determinación (R2) para obtener la adecuación
del modelo tomando en cuenta que una R2 de 0.80 es adecuada para un buen
ajuste del modelo (Lee, et al., 2000; Zhang et al., 2009).

6.1.4. Optimización del modelo para nanocápsulas

La estimación de las condiciones optimas para la preparación de

nanocápsulas a partir del modelo estimado se llevó a cabo utilizando el software
MINITAB 14 (Minitab Inc., PA, U.S.A.) con técnicas generales de deseabilidad,
considerando como las respuestas más importantes el tamaño de partícula y PDI,
seguida del (ζ) y por último la densidad de las nanocápsulas.

6.1.5. Comprobación de repetibilidad lote a lote

Una vez obtenidas las condiciones óptimas de preparación de

nanocápsulas y con el fin de corroborar la versatilidad del método se utilizaron
como disolvente orgánico acetato de etilo como estabilizante pluronic F-127, los
activos utilizados fueron dl--tocoferol y β-caroteno, los experimentos se
realizaron por triplicado y se evaluaron las mismas variables de respuesta que
para el diseño, llevando acabo un ANOVA con un nivel de significancia de 0.05.

6.2 Caracterización de nanocápsulas

Entre los parámetros más importantes a considerar en la preparación de

los sistemas coloidales se encuentran el tamaño de partícula, índice de
polidispersión (PDI) y potencial zeta (ζ), a continuación se describe la metodología
seguida en la realización de estas pruebas.

6.2.1. Mediciones de tamaño de partícula e índice de polidispersión (PDI)

La distribución del tamaño de partícula y del PDI de los sistemas

coloidales fue determinada mediante la técnica de dispersión de luz láser con un

38
ángulo fijo de 90° usando un equipo Zetasizer® 4 (Malvern Ltd., Orsay, France).
Con la finalidad de contar con el número de partículas necesarias por segundo
para la medición, las dispersiones fueron diluidas con agua Mili-Q®. Todas las
mediciones se realizaron por triplicado, obteniendo la distribución de tamaños de
partícula con su correspondiente PDI.

6.2.2. Potencial Zeta (ζ)

El potencial Zeta ζ se determinó mediante electroforesis de partícula

empleando un equipo Zetasizer 4 (Malvern, Francia). Para este fin se utilizaron
soluciones diluidas de las dispersiones en agua Milli Q® midiendo el potencial Zeta
ζ en relación a la movilidad electroforética, tomando como referencia soluciones
de poliestireno (ζ = -55 mV). Él  es una medida del grado de repulsión entre las
NC adyacentes, las partículas cargadas en forma similar en una dispersión
provoca repulsión de las mismas, de tal manera que en una dispersión coloidal si
él  es alto (positivo o negativo) entonces las nanopartículas formadas estarán
electrostáticamente estabilizadas (Bala et al.,2005).

6.2.3. Densidad de los sistemas de talla submicrónica (np)

La determinación de la densidad se llevó a cabo por gradiente diferencial

de difusión utilizando sílica coloidal. Previo a la determinación, se eliminó el
exceso de surfactante presente en los sistemas coloidales por ultracentrifugación
a 30,000 rpm a 4 ºC durante 50 min.

Se tomaron 100 L de centrifugado del sistema coloidal y fueron

agregados a una solución de Percoll™ al 45 % p/p en solución de NaCl 0.15 M. La
dispersión así preparada fue centrifugada a 10,000 rpm/ 3 h a 25 °C comparando
la densidad con gradientes de densidad preparados con marcadores de densidad
especifica (Figura 6.3) (Pharmacia LKB, Suecia), estos fueron utilizados como
referencia, siendo sometidos al mismo tratamiento que las muestras. La altura de
las bandas fue medida en función a la distancia desde la parte superior del
menisco al centro de la banda utilizando un vernier (Tesu, Digit-Cal SM, Suiza). La
densidad de las nanocápsulas fue determinada a partir de la interpolación de la

39
altura obtenida con la curva polinomial preparada con los marcadores de
densidad, en función a la siguiente ecuación:

̂ R2 = 0.987 (6.2)

donde x = la distancia del menisco al centro de la banda; y = densidad de

nanopartículas.

Figura 6.3 Marcadores de densidad utilizados en la determinación de

densidad de sistemas coloidales.

6.2.4. Microscopía electrónica de barrido

Las muestras fueron concentradas por centrifugación con el fin de

eliminar el exceso de estabilizante (alcohol polivínilico o pluronic F-127). El
concentrado obtenido fue diluido en agua MilliQ®, una gota de muestra fue
extendida en la superficie de un cubreobjetos, una vez deshidratada se sometió a
baño de oro ( 20 nm) con un equipo iónico (JEOL® JFC1100 Japón). Las
muestras fueron observadas en su morfología con un microscopio electrónico de
barrido a bajo vacío (JSM-6360, JEOL, Japón), con el propósito de evidenciar la

40
estructura capsular en nanocápsulas, la arquitectura y distribución de tamaños de
partícula, así como la posible agregación del polímero.

6.3 Desarrollo de dispersiones coloidales (recubrimientos)

Una vez establecidas las condiciones de preparación de nanocápsulas, se

procedió al desarrollo de recubrimientos utilizando goma xantana como
polisacárido base, dispersión en la que se incorporaron los sistemas coloidales a
comparar con la efectividad de la aplicación de nanocápsulas y que
posteriormente fueron evaluados en la conservación de manzana fresca cortada.
La cantidad de recubrimiento adicionado a las manzanas, se basó en ensayos de
prueba y error a partir de las condiciones propuestas por Rojas-Graü et al., (2007).
En el Cuadro 6.3 se muestran los sistemas que fueron utilizados como
recubrimientos.

Cuadro 6.3. Recubrimientos desarrollados para el tratamiento de

manzana fresca cortada.
Tratamiento Composición
Nanocápsulas 2 g/L de -tocoferol, 200 mg poli-ε-
caprolactona, 5 % alcohol polivínilico, 0.3
% de goma xantana y 0.5 % de
propilenglicol
Nanoesferas Nanoesferas (sin -tocoferol), goma
xantana (0.3 %) propilenglicol (0.5 %)
Nanoemulsión 2 g/L de -tocoferol, 42 g Span® 80, 8 g
Tween, 0.3 % goma xantana y 0.5 % de
propilenglicol
Emulsión 2 g/L de -tocoferol, 42 g Span® 80, 8 g
Tween, 0.3 % goma xantana y 0.5 % de
propilenglicol
Solución TPGS 2 g/L de TPGS, 0.3 % goma xantana y 0.5
% propilenglicol
Goma xantana 0.3 % de goma xantana y 0.5 % de
propilenglicol
TPGS = propilenglicol succinato de  tocoferol

6.3.1 Preparación de nanocápsulas con dl--tocoferol

Las nanocápsulas con dl--tocoferol como activo fueron preparadas

siguiendo la metodología propuesta en el punto 6.1.1., considerando las
condiciones óptimas de preparación que incluyen 2 g/L de dl--tocoferol, 200 mg
de poli-ε-caprolactona y 5 % de alcohol polivínilico, el proceso de emulsificación-

41
difusión se llevó a cabo utilizando un homogenizador rotor/stator Ultraturrax a
4,000 rpm. Una vez obtenidas las nanocápsulas, se incorporó la goma xantana y
propilenglicol.

6.3.2. Preparación de nanoesferas

Las nanoesferas fueron preparadas de la manera descrita en el punto

6.3.1., sin agregar agente activo (dl--tocoferol). Al igual que en el punto anterior,
una vez preparadas las nanoesferas se incorporaron el resto de los componentes
del recubrimiento.

6.3.3. Preparación de la emulsión

La emulsión se preparó por el método de emulsificación convencional

(Solans, 2005). La fase dispersa estuvo compuesta por 2 g de acetato de dl-α-
tocoferol y 42 g de surfactante lipofílico (Span® 80, HLB=4.3). La fase continua se
preparó con 600 mL de agua desionizada y 8 g de surfactante hidrofílico (Tween ®
80, HLB=14.9). Una vez preparadas ambas fases, la fase oleosa se dispersó en la
fase acuosa por medio de un agitador de velocidad variable (Heidolph ®
Instruments, tipo R2R1, Schwabach, Alemania) a 2000 rpm, formando así una
emulsión aceite en agua. Una vez preparada la emulsión se incorporaron el resto
de los componentes del recubrimiento.

6.3.4. Preparación de la nanoemulsión

La nanoemulsión fue preparada a partir de la emulsión formada de

acuerdo con lo descrito en el punto 6.3.3. Para disminuir el tamaño de partícula se
llevaron a cabo hasta 5 ciclos de dispersión a 10,000 rpm por 5 min empleando un
dispersor rotor/estator de alta velocidad (Ultra-Turrax T50, Labotechnik Sataufen
Alemania), los tiempos de reposo entre cada ciclo de dispersión fueron de 5 min,
se midió el tamaño de partícula en cada ciclo para llegar a talla nanométrica con el
menor índice de polidispersión. Una vez preparada la nanoemulsión se
incorporaron el resto de los ingredientes a la formulación del recubrimiento.

42
 6.3.5 Preparación de la solución de -tocoferol

Para evaluar el efecto de la solubilidad del antioxidante en un medio acuoso y su

relación con el índice de oscurecimiento en manzana, se preparó una solución
disolviendo 2 g/L de TPGS utilizando un agitador de propela (Heidolph®
Instruments, tipo R2R1, Schwabach, Alemania) a 500 rpm para incorporar la goma
xantana y propilenglicol.

6.4. Estabilidad de los sistemas coloidales

Con la finalidad de evaluar la estabilidad de las nanocápsulas,

nanoesferas, emulsión y nanoemulsión, se determinó la variabilidad en el tamaño
de partícula, PDI y ζ durante 8 semanas de almacenamiento a 25 ºC, siguiendo la
metodología propuesta para la caracterización de los sistemas en el punto 6.2.1 y
6.2.2. Un incremento en el PDI por encima de 0.3 y cambios en el ζ con valores
tendientes a cero, fueron considerados como agregación e inestabilidad del
sistema.

6.5. Aplicación de recubrimientos en manzana fresca cortada

6.5.1. Material Biológico

Las manzanas ‘Red Delicious’ fueron obtenidas en un centro de

distribución de frutas (Cuautitlán Izcalli, Estado de México). Se seleccionaron
utilizando pruebas subjetivas de acuerdo a su color y tamaño uniformes, un
contenido de sólidos solubles expresado en °Brix de 11 a 14, y una resistencia a la
penetración de 7 N aproximadamente. Las manzanas así seleccionadas, fueron
almacenadas a 4 ± 1°C y 90-95% de H.R previo a su utilización por no más de 3
días en cada periodo experimental.

6.5.2. Tratamiento de manzanas frescas cortadas

En la Figura 6.4 se muestra el diagrama de bloques del proceso seguido

para la preparación de las manzanas; estas fueron cortadas con un cortador
comercial, obteniéndose ocho gajos. Con la finalidad de determinar si hubo
diferencia entre tratamientos con dl--tocoferol en función a la talla de partícula y

43
al empleo del antioxidante, se consideraron durante la experimentación los
siguientes tratamientos: nanoemulsión, nanocápsulas, nanoesferas, emulsión,
solución de TPGS, goma xantana y control, considerando la formulación de los
recubrimientos correspondientes de acuerdo con lo descrito en el punto 6.3.

Figura 6.4. Diagrama de Bloques para los tratamientos a las manzanas frescas
cortadas.

44
6.6. Caracterización morfológica de los recubrimientos en manzana

La caracterización morfológica de la superficie de manzanas recubiertas

con las diferentes dispersiones se llevó realizando un corte longitudinal de tejido,
para inmediatamente después sumergirla en el sistema correspondiente,
colocando la muestra en el porta muestras y, aplicándoles un baño de oro
(~20nm) utilizando un evaporador catódico Sputter Coater JFC-1100 (Jeol, Tokyo
Japan), las manzanas así preparadas se observaron en un microscopio
electrónico de barrido de bajo vacío LV-SEM JSM 5600 con resolución de 5nm y
20 kV y de 12-20 Pa de presión en la cámara el voltaje, obteniéndose así las
micrografías correspondientes a cada tratamiento.

6.7. Cambios físicos y químicos en manzana

Los cambios asociados al recubrimiento aplicado y al tiempo de

almacenamiento fueron evaluados determinando los cambios físicos, químicos y
enzimáticos en el producto almacenado en refrigeración durante 18 días. La
metodología seguida para realizar las determinaciones se describirá brevemente a
continuación.

6.7.1. Pérdida liquido drenado

Uno de los parámetros importantes cuando se aplican recubrimientos en
frutos frescos cortados, es evaluar si el recubrimiento no provocó pérdidas de
peso por drenado en el interior del envase.
Está pérdida se determinó como él % de pérdida de peso respecto al
peso inicial de manzanas frescas cortadas, para ello se pesó la manzana sin
envase durante el periodo de almacenamiento utilizando para ello una balanza
digital (Ohaus Voyager modelo VP613C, USA). La siguiente ecuación describe la
manera en que fue realizado el cálculo.

peso.manzana.inicial  peso.manzna. final

% pérdida.de. peso  *100
peso.manzana.inicial (6.3)

45
 6.7.2. Color
La medición de los cambios de color se realizó utilizando un colorímetro
Minolta CR-300 (Konica Minolta, consola DP-301, Japón). Este fue calibrado
empleando un plato blanco (Y = 94.3; x = 0.3142; y = 0.3211) con iluminante C a
2º del observador. Se tomaron 3 gajos de manzana, realizando dos mediciones
por muestra y registrando los parámetros L*, a* y b* los que fueron empleados
para calcular los diferentes parámetros y que se describen a continuación (Oivas y
Barbosa-Canovas, 2005)

Índice de oscurecimiento

100 X * 0.31
IO  (6.4)
0.172

a  1.75L
X
5.645L  a  3.012b

Ángulo HUE
b
HUE  arctan (6.5)
a

6.7.3. Textura

Se determinó utilizando un equipo universal (Instron Modelo 4411, USA)

equipado con celda de carga de 5 kN y software IX de Instron. En la evaluación de
la firmeza se empleó punzón de 6 mm de diámetro, el ensayo se llevó a cabo a
una velocidad de 150 mm/s, midiendo la fuerza necesaria para penetrar 5 mm del
producto. Para esta evaluación los gajos de manzana fueron cortados en la parte
central para formar un cubo de 1 x 1 x 1 cm, evaluando con el punzón el área
expuesta al recubrimiento. Los ensayos se realizaron por quintuplicado,
obteniéndose la fuerza máxima (N) y módulo de compresión (MPa) (Varela et al.,
2007)

46
 6.7.4. pH

Previó a la determinación se extrajo el jugo de 80 g de manzana utilizando

un extractor de jugos eléctrico. El pH, se determinó en el jugo de acuerdo con el
método AOAC 32.010 (AOAC, 2002), utilizando un potenciómetro (Philips Harris
modelo E3039018G/K, Shenstone England) con electrodo (modelo P43-120).

6.7.5. Sólidos Solubles Totales (SST)

La determinación de los SST se llevó a cabo empleando un refractómetro

de mesa ABBE (Spectronic Instruments, USA), siguiendo la metodología del
AOAC 22.04 (AOAC, 2002).

6.7.6. Acidez

Las determinaciones se realizaron de acuerdo a la técnica del AOAC

22.058 (2002). Este se basa en la neutralización de los iones H+ con solución
valorada de hidróxido de sodio 0.1 N en presencia de una solución indicadora (e.
g. fenolftaleina). La determinación de la acidez se expresó en función al contenido
de ácido málico de acuerdo con la siguiente relación.
(6.6)

Dónde: N = normalidad de la solución de NaOH, V1 = volumen de NaOH utilizado,

Vo = Volumen de jugo y F = meq del ácido orgánico

6.8. Cambios enzimáticos y contenido de fenoles

Los cambios en índice de oscurecimiento son un reflejo de la actividad

enzimática que se ha llevado a cabo en los frutos frescos cortados, razón por la
que un buen parámetro para evaluar la efectividad de los recubrimientos
empleados en este estudio es determinar la magnitud de los a cambios
relacionados con la síntesis y consumo de fenoles.

6.8.1. Determinación de la actividad polifenoloxidasa (PFO)

La extracción de la enzima PFO se realizó siguiendo la metodología

propuesta por Murata et al. (1992) con algunas modificaciones. 30 g de superficie

47
recubierta fueron molidos en una licuadora con cantidad suficiente (20 mL) de
buffer fosfato de sodio frío 0.2 M pH 7.0 conteniendo 1% (v/v) de Triton ® X-100
durante 30 segundos. El homogeneizado fue filtrado con la finalidad de eliminar
las partículas sólidas y centrifugado a 10,000 rpm por 35 minutos. El sobrenadante
consistió del extracto enzimático utilizado para la determinación de la actividad
polifenoloxidasa.

La actividad PFO fue determinada de acuerdo al método propuesto por

Zhou et al. (1993), para la determinación se preparó una mezcla de 0.2 mL de
extracto enzimático y 2.8 mL de catecol (0.050 M en buffer de citrato a pH de 6.5),
determinando los cambios en absorbancia (a 420 nm) durante 15 minutos en
relación a un blanco que no contenía. Definiendo una unidad de actividad de PFO
como el cambio de 0.001 Abs/min.

6.8.2. Medición de fenoles totales

La determinación de fenoles totales se llevó a cabo mediante el método

de Folin-Ciocalteu descrito por Singleton et al. (1999). A 30 µL de jugo de
manzana extraído de la superficie recubierta se les adicionó 2.4 mL de agua
destilada y 150 µL de reactivo comercial Folin-Ciocalteu, después de 30 segundos
y antes de 8 minutos se adicionó a la mezcla 450 µL de una solución saturada de
carbonato de sodio (200 g L-1), se dejó reposar durante una hora a temperatura
ambiente y se midió la absorbancia a 760 nm (UV-Vis Cintra 10e, GBC Scientific
Equipment Ltd. Dandenong Victoria, Australia). Para obtener la relación de la
absorbancia con la concentración, se construyó una curva patrón con
concentraciones de 0 a 700 mg de ácido gálico, midiendo la absorbancia y
obteniendo la siguiente relación.

̂ R2 = 0.99 (6.7)

Donde x representa la concentración de ácido gálico, y la absorbancia

medida. Los resultados fueron expresados como miligramos equivalentes de ácido
gálico (mgEAG) por gramo.

48
 6.8.3. Determinación de la actividad Fenil-alanina-amonioliasa

Para la evaluación de la actividad de la enzima fenilalanin amonio-liasa

(PAL), se adaptó el método propuesto por Ke y Saltveit (1986); 4 g de tejido fueron
homogenizados con 0.4 g de polivinilpirrolidona insoluble. 16 mL de buffer de
boratos (50 mM pH 8.5) y 14 µL de 2-mercaptoetanol. Después de filtrar y
centrifugar la muestra a 10,000 rpm por 40 min a 4 ºC, se determinó la actividad
PAL en el sobrenadante a 40 C usando 300 µL de L-fenilalanina como substrato,
midiendo la absorbancia a 290 nm en un espectrofotómetro (Beckman Coluter®,
Inc.).

La absorbancia obtenida en la muestra, se correlacionó con la curva

patrón de ácido trans cinámico (0 a 2.5 µmolar), donde se obtuvo la siguiente
ecuación de regresión.

̂ R2 = 0.99 (6.8)

Dónde: x representa la concentración de ácido trans cinámico, y la absorbancia

obtenida, expresándose la actividad PAL como la cantidad de PAL producida por
1µmol de ácido cinámico en una hora por gramo de muestra.

6.9. Tratamiento estadístico para comparación de recubrimientos

Los resultados obtenidos se analizarán mediante un ANOVA (α = 0.05) de

dos vías con la finalidad de establecer el efecto del recubrimiento y del tiempo de
almacenamiento sobre los cambios en las variables estudiadas, realizando las
comparaciones de mediante pruebas de Tuke (α = 0.05). Los datos fueron
tratados utilizando el software estadístico MINITAB 14.

Etapa 2. Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) en Guayaba

De acuerdo con el seguimiento metodológico propuesto en la Figura 6.1 y
con la finalidad de probar si los sistemas de talla submicrónica serían útiles para la
conservación de fruta entera, se desarrollaron formulaciones a base de NLS
obtenidas por el método homogenización rotor/estator. Estos recubrimientos
fueron probados sobre la superficie de guayaba de la variedad Media China. A

49
continuación se mencionará la metodología seguida para la realización de estas
pruebas.

6.10. Preparación de NLS

Las NLS fueron elaboradas de acuerdo al método homogenización en

caliente (Schwartz et al., 1992) con un homogenizador tipo rotor-estator
(Ultraturrax®; IKA, Alemania). La cera de Candeuba (10 % p/v) fue fundida a una
temperatura de 90 °C (Multiceras®). Esta fase oleosa se adicionó a una solución
de Pluronic F-127 (5 % p/v) a 90 °C. Se realizaron tres ciclos de dispersión en el
Ultraturax a 10,000 rpm durante 5 min, con 5 min de reposo entre cada ciclo,
durante todo el proceso se mantuvo una temperatura de 90 ºC.

6.10.1. Caracterización de Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS)

La caracterización de las NLS, se llevó a cabo siguiendo la metodología

propuesta para la caracterización de nanocápsulas en los puntos 6.2.1. y 6.2.2.

6.10.2. Microscopía electrónica de barrido (MEB) para NLS y guayaba

Con la finalidad de realizar el análisis morfológico de las NLS se diluyeron

0.5 mL de concentrado de NLS libre de estabilizante en 9 mL de agua Mili Q®
para aplicarla en un cubreobjetos, una vez seca la muestra, se recubrió con una
película fina de oro (≈20 nm) con un equipo iónico (JEOL® JFC1100 Japón). La
superficie se evalúa con un Microscopio Electrónico de Barrido (JEOL® JMS-
25SII Japón) a 12.5 kV.

Para llevar a cabo el análisis microscópico sobre las guayabas con y sin
recubrimiento, fue necesario llevar a cabo la deshidratación de las mismas,
sumergiendo un pequeño corte de las guayabas en etanol absoluto durante 48 h y
eliminado el exceso de alcohol para posteriormente secar las muestras a
temperatura ambiente y recubrirlas con una película fina de oro (≈20 nm) con un
equipo iónico (JEOL® JFC1100 Japón). Evaluando la superficie de las guayabas
por Microscopio Electrónico de Barrido (JEOL® JMS- 25SII Japón) a 12.5 kV.

50
 6.10.3. Estabilidad de las NLS

La estabilidad física de las NLS durante 8 semanas de almacenamiento

se determinó siguiendo la metodología descrita en el punto 6.4. El principal
propósito fue de evaluar la integridad de las NLS y distribución de tamaños de
partícula en las NLS (agregación).

6.11 Desarrollo de recubrimientos de NLS

Los recubrimientos con base en goma xantana fueron aplicados sobre la

superficie de guayabas a temperaturas de 10 y 20 ºC. Las concentraciones de
goma xantana ensayadas fueron a 0.3, 0.4 y 0.5 %; se utilizó una solución al 0.5
% de azul No. 1 con el fin de cuantificar la cantidad y uniformidad del
recubrimiento aplicado. Previo a la aplicación del recubrimiento las guayabas se
midieron en su diámetro axial y radial para obtener la superficie del fruto, fueron
sumergidas en la dispersión durante 2 minutos y secadas a 25 °C durante 2 h.

Una vez recubierta la fruta (con la dispersión colorida) se procedió a

evaluar la cantidad de película adherida, sumergiendo la guayaba recubierta en
100 mL de agua, solubilizando así la goma xantana con el colorante y determinado
por espectrofotometría (UV/Vis, Cary ® UV 500, Varian, Australia) a 630 nm la
absorbancia del recubrimiento desprendido y solubilizado. Se contruyó una curva
patrón de colorante utilizando concentraciones de 0 a 30 mg/mL de colorante
obtendiendose la siguiente ecuación:

̂ R2 = 0.99 (6.9)

Donde: x es la concentración del colorante y la absorbancia de la muestra

con azul No.1. Los resultados fueron expresados en función a los mg de
colorante/cm2 de fruta que representan la cantidad de recubrimiento adherido.

6.11.1. Evaluación del efecto de la concentración de NLS

Después de realizar el análisis estadístico para comparar la cantidad de

recubrimiento adherido respecto a la temperatura, concentración de goma xantana
y plastificante se seleccionó la concentración de goma xantana a utilizar como

51
soporte para las NLS. Con éstas se formularon los recubrimientos con NLS, la
incorporación de la goma xantana al 0.3 % se llevó a cabo utilizando un
homogenizador Ultraturrax ®, IKA a 10,000 rpm durante 3 min.

Con la finalidad de establecer el efecto de la concentración de NLS en la

conservación de guayaba, La suspensión inicial que contenía 10 % de cera de
candeuba en forma de NLS, se diluyó a concentraciones de 60, 65, 70, 75 y 80 %,
utilizando en todos los casos una concentración constante de goma xantana de
0.4 % y de propilenglicol de 0.5 %.

6.12. Aplicación de recubrimientos con NLS en guayaba

6.12.1. Material Biológico

El producto se obtuvo de la central de abastos de Tultitlán, Estado de

México a partir de un lote de 120 kg de guayaba Media china, proveniente de
Calvillo, Aguascalientes. Las guayabas fueron seleccionadas con base a su
estado de madurez (70 % verde, 30 % amarillo). Se consideró además la similitud
de forma, tamaño (45 a 55 cm de diámetro), ausencia de lesiones externas, daños
mecánicos, enfermedades, etc. (Mercado-Silva et al., 1998). Para la
experimentación se formaron 6 lotes con 48 guayabas cada uno.

6.12.2. Aplicación del Recubrimiento con NLS

Una vez que se seleccionó la guayaba y previo a la aplicación del

recubrimiento, se procedió a desinfectarlas por inmersión durante 15 minutos en
solución de hipoclorito de sodio a 75 ppm. Posteriormente, se secaron
cuidadosamente con toallas absorbentes, para después recubrirlas con las
diferentes proporciones de NLS (0, 60, 65, 70, 75 y 80 %), utilizando, goma
xantana como polisacárido de soporte. La aplicación del recubrimiento se llevó a
cabo por inmersión durante 1 minuto, secado posterior a temperatura ambiente y
almacenamiento refrigerado (10 ± 2 °C) durante 31 días.

En la Figura 6.5 se muestra el diagrama de bloques correspondiente a la

aplicación de los recubrimientos con NLS. Los lotes se conformaron con la idea de
llevar a cabo un muestreo cada 3 días, considerando además un lote control al
52
que se les evaluó paralelamente la pérdida de peso y color, para efectuarle las
pruebas destructivas al final del almacenamiento. A continuación se describen las
pruebas fisicoquímicas realizadas a los frutos durante su almacenamiento
refrigerado.

Figura 6.5 Procedimiento utilizado para los estudios de recubrimientos de

guayaba.

53
6.13. Cambios fisicoquímicos en guayaba con NLS

6.13.1. Pérdida de peso

Un parámetro importante a considerar durante el almacenamiento

refrigerado de frutas, es la pérdida de peso. Esta se determinó obteniendo la
diferencia de peso del producto al inicio del almacenamiento con respecto al
tiempo (cada tercer día), utilizando para ello una balanza digital (Ohaus Voyager
modelo VP613C, USA). La siguiente ecuación describe la manera en que fue
realizado el cálculo.

peso.de.la.muestra  peso. final

% pérdida.de. peso  * 100
peso.de.la.muestra (6.10)

6.13.2. Cambios químicos

Para evaluar los cambios fisicoquímicos en guayaba por efecto del

recubrimiento con NLS se siguió la metodología propuesta en los puntos 6.7.5 y
6.7.6 de este capítulo.

6.13.3. Cambios de color

Los cambios de color asociados a la maduración y a los efectos

fisiológicos sobre la guayaba fueron medidos en el pericarpio empleando un
colorímetro (MINOLTA con sensor CR-300, Japón), determinándose los cambios
en L*, a* y b*. Donde “a” va de negativo (verde) a positivo (rojo), y “b” en
ordenadas van desde azul al amarillo y el parámetro “L” representa la luminosidad
desde la reflexión nula (L=0) a reflexión difusa perfecta (L=100). El instrumento fue
estandarizado por medio de una baldosa blanca de cerámica. Las medidas de
color fueron realizadas en la piel en dos lados opuestos de la zona ecuatorial del
fruto, con tres replicas por tratamiento.

Los valores L, a y b se utilizaron para calcular el tono (ángulo de Hue) a

partir de la ecuación:

h  arcan(a / b) (6.7)

54
Donde 0 = rojo-púrpura, 90 = amarillo, 180 = azulado-verde y 270 = azul
(McGuire, 1997).

6.13.4. Cambios de Firmeza

Los cambios en textura están asociados a la madurez de los frutos. En

este estudio se determinaron los cambios en firmeza de las guayabas recubiertas
utilizando un Equipo Universal (INSTRON modelo 4411, USA) con celda de carga
de 5kN. La determinación se llevó a cabo utilizando una placa de compresión de
10 cm2. La evaluación se realizó a una velocidad de cruceta de 150 mm/min y un
20 % de compresión. Todos los ensayos se realizaron por quintuplicado y se
reportó la fuerza máxima necesaria para llevar a cabo la compresión al 20 % del
pericarpio del fruto.

6.14. Análisis estadístico para recubrimientos en guayaba

Los resultados obtenidos de la experimentación fueron analizados utilizando

ANOVA de una o dos vías según fuese el caso, considerando un nivel de
significancia de 0.5 %.

55
 VII RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Etapa 1. Resultados Nanocápsulas
7.1. Preparación y optimización de nanocápsulas

La determación de condicionesde proceso y/o preparación aplicando

diseños compuestos centrales ha sido utilizada ampliamente para evaluar
múltiples parámetros sobre diversas variables de respuesta en muchas
investigaciones y aplicaciones industriales del área de alimentos (Bas y Boyaci,
2007; Mirhossein et al., 2008; Ahn, et al., 2008; Yuan et al., 2008).

La Figura 7.1 representa los datos correspondientes a los gradientes de

densidad obtenidos en función al contenido de poli-ε-caprolactona utilizado,
comparado con nanoemulsión y nanoesferas. Se observa en la Figura 7.1 que las
nanocápsulas tienen una densidad intermedia entre la nanoemulsión y
nanoesferas, con lo que se corrobora que existe una asociación entre el polímero
y el aceite formando una sola entidad, además que en cada lote únicamente se
obtuvo un solo anillo, lo que indica que por el método de emulsificación-difusión es
posible obtener exclusivamente nanocápsulas en la relación polímero/aceite
utilizadas puesto que de acuerdo con Quitanar-Guerrero et al. (1998) y
Abdelwahed et al. (2006), la presencia de una sola banda de densidad es
indicativa de productividad de nanocápsulas efectiva.

Figura 7.1 Comparación de densidad para nanoemulsión, nanoesferas y

nanocápsulas (con diferentes concentraciones poli-ε-caprolactona).

56
 El Cuadro 7.1 resume las propiedades de las nanocápsulas formadas. La
deposición de polímero sobre las nonogotas de aceite es acorde con el
mecanismo de formación explicado por el método de emulsificación difusión
(Quintanar-Guerrero et al., 1997a). En aplicaciones para alimentos las
nanocápsulas presentan ventajas comparadas con otros sistemas
nanopartículados puesto que tienen un centro oleoso que puede tener múltiples
funciones (Lertsutthiwong et al., 2008).

Cuadro 7.1. Resultados respecto a la media de las nanocápsulas preparadas por

lote experimental.
Lote Velocidad PVAL PCL Tp PDI  Densidad
No. de corte (%) (mg) (nm) (mV) (g/cm3)
(rpm)
2 636 5.0 200 1641±346 0.66±0.14 -14.92±0.83 1.021±0.0011
1 2000 2.5 100 655±288 0.46±0.04 -15.52±1.07 1.019±0.0010
9 2000 2.5 300 853±212 0.48±0.05 -19.6±0.25 1.024±0.0001
12 2000 7.5 100 1248±215 0.35±0.19 -17.92±1.07 1.020±0.0002
6 2000 7.5 300 1091±48 0.31±0.08 -18.39±0.20 1.023±0.0003
15 4000 0.8 200 473±18 0.16±0.02 -15.5±1.11 1.021±0.0010
17 4000 5.0 31 223±31 0.04±0.01 -18.51±1.23 1.018±0.0001
14 4000 5.0 200 259±21 0.04±0.02 -20.44±1.06 1.020±0.0005
18 4000 5.0 368 475±153 0.14±0.07 -20.06±2.87 1.024±0.0003
16 4000 9.2 200 782±110 0.05±0.02 -19.35±1.69 1.021±0.0001
10 6000 2.5 100 220±60.1 0.03±0.02 -13.3±1.22 1.019±0.0015
3 6000 2.5 300 219±10.7 0.13±0.02 -11.74±2.72 1.023±0.0008
7 6000 7.5 100 256±130 0.09±0.07 -13.80±2.55 1.020±0.0059
4 6000 7.5 300 136±3.7 0.12±0.04 -11.83±2.39 1.023±0.0035
8 7364 5.0 200 255±122 0.08±0.02 -5.61±1.52 1.021±0.0054
PVAL = alcohol polivinílico
PCL = poli-ε-caprolactona
Tp = tamaño de particular
PDI = indice de polidispersión
 = potencial zeta

7.1.1. Ajuste del modelo

El Cuadro 7.2 presenta el análisis de coeficientes del modelo cuadrático,

los coeficientes de regresión y los p-valores indicativos del nivel de significancia de
los factores. El análisis del modelo y la prueba de bondad de ajuste fueron
utilizados para la selección del modelo adecuado (Lee Ye et al., 2000; Namal-
Senanayake y Shahidi, 2002; Chen, et al., 2008).

57
 Los resultados experimentales fueron modelados para un sistema lineal o
cuadrático por el método de mínimos cuadrados, una vez que las funciones fueron
obtenidas estas fueron probadas para la adecuación del modelo y pruebas de
bondad de ajuste utilizando un análisis de varianza (ANOVA). El ANOVA del
Cuadro 7.2 mostró que el modelo polinomial cuadrático representa
adecuadamente el comportamiento experimental de los datos con coeficientes de
regresión (R2) de 0.95 para el tamaño de partícula, 0.90 para PDI, 0.88 para  y
0.87 para densidad. De acuerdo con Mune et al., 2008, los modelos cuadráticos
tienen buen ajuste y describen adecuadamente el comportamiento de los datos
cuando los valores teóricos obtenidos son similares a los experimentales
indicando un buen arreglo cuando p ≤ 0.05 y R2  0.85.

Cuadro 7.2. ANOVA y coeficientes de regresión sobre las variables de respuesta

respecto a los factores estudiados.
Termino Tamaño de PDI (mV) Densidad
3
partícula (g/cm )
(nm)
Coef p- Coef p- Coef p- Coef p-
value value value value
a a a a
β0 1467.04 0.000 1.33 0.015 3.67 0.000 1.019 
0.001
a -4a a -7ns
β1 -0.52 0.000 -3.98E 0.000 -0.007 0.000 -6.34E 0.177
a a a -4ns
β2 -8.18 0.000 -0.086 0.002 -2.78 0.001 -3.87E 0.070
ns ns ns -6a
β3 1.24 0.239 -0.001 0.056 -0.036 0.789 9.53E 0.000
-5a -8a -7a -11a
β11 5.67E 0.000 3.18E 0.000 9.39E 0.000 7.51E 0.003
a -3a a -5a
β22 18.15 0.000 5.44 E 0.001 0.18 0.000 6.14E 0.000
-3n.s -6a a -8a
β33 1.49E 0.469 2.87E 0.004 5.71 0.025 3.94E 0.000
a -6a -4ns -8ns
β12 -0.021 0.000 8.39E 0.002 1.00E 0.057 2.19E 0404
n.s -7ns -6ns -10ns
β13 -1.017 0.463 1.01E 0.121 3.09E 0.068 -7.22E 0.272
a -5ns -4ns -6a
β23 -0.23 0.036 -6.91E 0.186 4.43E 0.739 -1.20E 0.025
2
R 0.914 0.000 0.907 0.000 0.876 0.865
2
R -adj 0.898 0.890 0.854 0.840
β0= Coeficiente de regresión βi=Coeficiente lineal, βii = Coeficientes cuadráticos y βij= coeficientes de
interacciones.
a
término significativo(p < 0.05)
n.s
término no significativo (p  0.05)

7.1.2. Tamaño de Partícula

El tamaño de partícula es explicado por los términos del modelo

mostrados en la Cuadro 7.2, los p-valores pequeños indican un efecto significativo
de los efectos sobre las variables de respuesta. Las variables que tienen más
influencia sobre el tamaño de partícula de nanocápsulas fueron los términos
lineales de la velocidad de agitación y la concentración de alcohol polivinílico,
58
seguido por el término lineal para la concentración de poli-ε-caprolactona (p 
0.05). Los términos cuadráticos de la velocidad de corte y concentración de
alcohol polivinílico también tienen un efecto significativo sobre el tamaño de
partícula de nanocápsulas (p  0.05) y la interacción que tiene un efecto mayor es
la dada por la velocidad y concentración de alcohol polivinílico, en este sentido
Floury et al., 2000 y Yuan et al., 2008, establecieron que la turbulencia formada
por efecto de la velocidad de corte en emulsiones de nanoemulsiones tiene un
efecto significativo sobre la reducción del tamaño de partícula. El efecto del
alcohol polivinílico y velocidad de corte fue evaluada en la formación de
nanopartículas por el método de emulsificación-difusión estableciéndose que el
tamaño de partícula disminuye considerablemente entre 0.5 y 5 % de
estabilizante, observándose pocos cambios por abajo del 5 % (Quintanar-Guerrero
et al., 1996). El tamaño de partícula más deseable obtenido en función de
deseabilidad en Minitab® 14 fue de 300 nm para este caso y las condiciones
establecidas fueron de 4000 rpm para la agitación, 5 % (p/p) de alcohol polivinílico
y 292 mg de poli-ε-caprolactona.

En las Figura 7.2 (a-c) se muestran los efectos de las variables

independientes sobre las dependientes mostrando los gráficos de superficie para
el modelo polinomial cuadrático, en este se consideró uno de los factores a valor
constante en el punto central.

59
Figura 7.2. Superficie de Respuesta para el tamaño de partícula de nanocápsulas en
función de: a) velocidad de agitación vs alcohol polivinílico a una concentración de
200 mg de poli-ε-caprolactona, b) velocidad de agitación vs poli-ε-caprolactona (mg)
a 5 % de alcohol polivinílico y c) alcohol polivinílico vas poli-ε-caprolactona a 4000
rpm

60
 La Figura 7.2(a) se muestra también que el tamaño de partícula se
incrementa con la disminución de la velocidad de agitación y un incremento en la
concentración de alcohol polivinílico por arriba de 5 % (p/p) con un máximo de
1880 nm a 700 rpm y 9 % de alcohol polivinílico respectivamente, además la
superficie presenta una curvatura significante alrededor del punto central con un
mínimo en el tamaño de partícula de 130-350 nm. Se ha reportado que el
incremento en la concentración de alcohol polivinílico incrementa el tamaño
partícula de nanocápsulas, cuando la concentración de alcohol polivinílico es
superior a 5 % (p/v), este fenómeno es explicado debido al incremento de la
viscosidad del sistema (Moinard-Chécot et al., 2008; Abdelwahed et al., 2006). Por
otro lado la Figura 7.2(b) muestra la curvatura debido a la velocidad de agitación,
la cual es independiente de la concentración de poli-ε-caprolactona con un ligero
efecto cuando se incrementa la concentración del polímero. Un comportamiento
similar es mostrado con respecto a la concentración de alcohol polivinílico y poli-ε-
caprolactosa (Fig 7.2(c)) no mostrándose un efecto de los términos cuadráticos y
variables independientes mostrándose un mínimo alrededor de los puntos
centrales. La ecuación de segundo orden obtenido en función a los términos
significativos en la ecuación son los siguientes:

̂ (7.1)

7.1.3. Índice de polidispersión (PDI)

Las Figuras 7.3 (a-c) presentan la superficie de respuesta del efecto de

las variables independientes sobre el PDI. Las Figuras 7.3 (a-c) muestran la
superficie de respuesta de las variables independientes sobre el PDI. La Figura
7.3(a) muestra la variación del PDI por efecto de la velocidad de agitación y la
concentración de alcohol polivinílico dejando constante la poli-ε-caprolactona (200
mg), en esta se observa que el PDI se incrementa conforme aumenta la velocidad
de agitación a partir de los 4750 rpm con un ligero efecto de la concentración de
estabilizante.

61
 Figura 7.3. Superficie de Respuesta PDI de nanocápsulas en función de: a)
velocidad de agitación vs alcohol polivinílico a una concentración de 200 mg de
poli-ε-caprolactona, b) velocidad de agitación vs poli-ε-caprolactona (mg) a 5 % de
alcohol polivinílico y c) alcohol polivinílico vas poli-ε-caprolactona a 4000 rpm.

62
 En la Figura 7.3 (b) se observa que el PDI es mínimo cuando la velocidad
de agitación se incrementa hasta la concentración de aproximadamente 210 mg
de poli-ε-caprolactona. Un valor mínimo en el PDI es indicativo de que el tamaño
de partícula es más uniforme en el punto central con respecto de la velocidad de
agitación. El efecto de la variabilidad de las concentraciones de alcohol polivinílico
y poli-ε-caprolactona son mostrados en la Fig 7.3(c), mostrando una disminución
del PDI en los puntos centrales, con una mejor distribución de tamaños al ser más
estrecha, atribuido en parte al tipo de aceite y al control de las condiciones de
preparación, pudiéndose establecer que valores de entre 0.06 y 0.25 son
excelentes cuando el criterio de optimización es minimizar la respuesta (Bala et
al., 2005; Zigoneanu 2008; Mirhossein et al., 2008). La ecuación de segundo
orden para el PDI (Y2) en función a los términos significativos es la siguiente:

̂
(7.2)

7.1.4. Potencial zeta ()

Las Figuras 7.4 (a-c) muestran la superficie de respuesta de las variables

independientes estudiadas. La Figura 7.4(a) muestra que el  de -21.70 se obtiene
cuando la velocidad es de aproximadamente 4000 rpm y se mantiene a una
concentración de 5 % para PVAL. De acuerdo con lo mostrado en el Cuadro 7.1
en este trabajo los factores que tuvieron un mayor efecto sobre el  fueron los
términos lineal de la velocidad de corte y la concentración de estabilizante (p ≤
0.0001), el efecto de la concentración de alcohol polivinílico se explica por la
modificación de la carga que a su vez es ayudado por la energía utilizada para
provocar la reducción del tamaño de partícula. Todos los términos cuadráticos
tienen un efecto significativo positivo, sin embargo solo la velocidad de corte con
respecto al alcohol polivinílico y la poli-ε-caprolactona vs alcohol polivinílico tienen
un efecto significativo sobre el .

63
 Figura 7.4. Superficie de Respuesta PDI de nanocápsulas en función de: a)
velocidad de agitación vs alcohol polivinílico a una concentración de 200 mg de
poli-ε-caprolactona, b) velocidad de agitación vs poli-ε-caprolactona (mg) a 5 % de
alcohol polivinílico y c) alcohol polivinílico vas poli-ε-caprolactona a 4000 rpm.

64
 El valor óptimo para el  (Y3 = -20.85) se obtienen para una velocidad de
agitación de 4000 rpm, 5 % de PVAL y 211 mg de PCL, que fueron obtenidos en
función a la superficie de respuesta por prueba de deseabilidad (0.582). La
ecuación de segundo orden (4) para el  en función a los términos signficativos se
muestra a continuación:

̂ (7.3)

7.1.5. Densidad (nc)

En la densidad tanto la velocidad de corte como la concentración de

alcohol polivinílico no tuvieron un efecto significativo de acuerdo con el Cuadro
7.2. La concentración de poli-ε-caprolactona fue altamente significativa (  0.0001)
mostrándose además efectos positivos de los factores involucrados en la
densidad, además de la concentración de p li-ε-caprolactona, la velocidad de
agitación tuvo un efecto significativo (p = 0.002), esto debido probablemente a que
esta variable contribuye al proceso de difusión provocando con ello la formación
de la nanocápsula envuelta en poli-ε-caprolactona. Los efectos cuadráticos no
tuvieron efecto significativo sobre la densidad (p  0.05) (Cuadro 7.2), las
interacciones entre la velocidad y la concentración de alcohol polivinílico tuvieron
un efecto significativo sobre la densidad. En función a los términos significativos el
factor primario que determina el valor de densidad es la concentración de alcohol
polivinílico. La optimización de la densidad por deseabilidad considerado el
promedio es mejor (Y4=1.022 g/cm3) y se puede predecir a 4000 rpm, 5 % de
alcohol polivinílico y 185 mg de poli-ε-caprolactona. La ecuación (5) corresponde a
los coeficientes significativos para la densidad.

(7.4)

7.1.6. Establecimiento de condiciones de preparación de nanocápsulas

Para establecer las condiciones de preparación más deseables se siguió

un procedimiento numérico con la finalidad de predecir en función a los modelos
cuadráticos obtenidos y mejor respuesta esperada, las condiciones predichas de
preparación, se considero para ello un valor de deseabilidad (D = 0.90), tomando
65
en cuenta que en el proceso de preparación debe de: minimizarse el tamaño de
partícula y PDI, maximizandr el valor absoluto del potencial zeta y considerar un
valor medio de la densidad. La optimización dió como resultado las condiciones de
preparación de nanocápsulas por el método de emulsificación-difusión y que
fueron: 3977 rpm, 5.1 % de alcohol polivínilico y 256 mg de poli-ε-caprolactona.
Obteniéndose a estas condiciones, valores predichos para las respuestas: tamaño
de partícula 250 nm, PDI de 0.043,  de -20.02mV y densidad de 1.021 g/cm3.

7.1.7. Morfología de Nanocápsulas

La presencia de entidades vesiculares y por ende evidencia de formación

de nanocápsulas fue observada en micrografías y los efectos de las variables
también pudieron ser caracterizadas.

La Figura 7.5 muestra las micrografías correspondientes a la formación de

nanocápsulas de acuerdo con las condiciones óptimas que correspondieron a los
puntos centrales del diseño experimental. Las micrografías son la mejor evidencia
visual de que se obtuvieron entidades capsulares, que además se correlacionaron
con el tamaño de partícula y densidad de las nanocápsulas preparadas en
condiciones deseables de preparación que llevaran a obtener la menor talla de
partíula posible por el método de emulsificación-difusión.

Figura 7.5 Micrografías de nanocápsulas a condiciones de preparación óptimas.

66
 7.1.8. Verificación del modelo y versatilidad del método

Una vez establecida la repetibilidad de las condiciones se llevó a cabo la

verificación de la versatilidad del método utilizando los disolventes orgánicos
acetato de etilo y metil etil cetona; como estabilizantes alcohol polivinílico y
pluronic-127 aceite de girasol, soya, β-caroteno y dl--tocoferol a una
concentración de 0.5mL.

El cuadro 7.3 muestra que cuando se utiliza acetato de etilo como

disolvente orgánico, no hay diferencia estadísticamente significativa sobre el
tamaño de partículas, PDI y  en relación a los resultados predichos en el modelo
de superficie de respuesta (p>0.05). Además se demostró que cuando se emplea
pluronic-127 como estabilizante hay un incremento en la estabilidad de las
dispersiones mostrada por el aumento en el valor absoluto de , mostrando
tamaños de partícula menores (220 nm). Cuando se emplea metil etil cetona
como disolvente las nanocápsulas formadas tuvieron tamaños de partícula
menores (69 nm con pluronic-127) y un  de -10mV, indicativo de inestabilidad del
sistema, correlacionada con la menor densidad de las nanocápsulas. Los
resultados obtenidos indican que los valores experimentales corresponden con las
condiciones deseables de preparación de nanocápsulas dando como resultado
valores de tamaño de partícula de 298 nm, PDI de 0.047,  de 19.85 mV y 1.01
g/cm3 para densidad.

El Cuadro 7.3 muestra también que los resultados obtenidos son válidos
no sólo para aceites comestibles, sino también para otros ingredientes como el β-
caroteno y dl--tocoferol. Además se estableció que el método es robusto y puede
ser utilizado para otras condiciones de operación. En el caso de los activos
utilizados se encontró diferencia estadísticamente significativa en la estabilidad (p≤
0.05) con respecto a los valores predicho. Las nanocápsulas de dl--tocoferol
tuvieron un tamaño de partícula promedio de 248 nm y  de -32.1 mV, mientras
que las de β-caroteno de 287 nm y  de -17.8 indicativos de una mayor
estabilidad del sistema.

67
Cuadro 7.3 Caracterización de nanocápsulas formadas con otros materiales y
empleados en la validación del método de emulsificación-difusión.
Aceite Estabilizante Disolve Densidad Tp PDI 
3
(5 % w/v) nte (g/cm ) (nm) (mV)

Girasol PVAL AE 1.019±0.001 332±23 0.08±0.01 -15.5±0.45ª

Girasol Pluronic-127 AE 1.021±0.001 228±6 0.10±0.01 -27.5±1.11
a
Soya PVAL AE 1.019±0.001 355±27 0.09±0.03 -27.0±0.75
a a
Soya Pluronic-127 AE 1.019±0.001 223±9 0.10±0.01 -31.4±1.07
a a
Girasol PVAL MEC 1.017±0.001 190±3 0.03±0.20 -9.10±0.38
a a
Girasol Pluronic-127 MEC 1.017±0.001 69±6 0.07±0.01 -11.0±0.52
a a
Soya PVAL MEC 1.017±0.001 203±9 0.08±0.01 -9.42±0.50
a a a
Soya Pluronic-127 MEC 1.016±0.001 83±10 0.15±0.02 -11.5±0.40

DL-- Pluronic-127 AE 1.022±0.004 248± 7 0.15±0.03 -38.1 ± 1.71

tocoferol
β-carotenol Pluronic-127 AE 1.019±0.001 287±13 0.076±0.02 -27.8±1.20
a
diferencia significativa (p  0.05).
PVAL = alcohol polivinílico
AE = acetato de etilo
MEC = metil etil cetona
Tp = tamaño de partícula
PDI = índice de polidispersión
 = Potencial zeta

7.2. Sistemas con -tocoferol

7.2.1. Nanocápsulas

Las nanocápsulas fueron preparadas empleando 2 g/L de dl--tocoferol y

200 mg de poli-ε-caprolactona de acuerdo con las condiciones más deseables
obtenidas del modelo compuesto central analizado, el disolvente utilizado para
preparar la fase orgánica fue acetato de etilo.

La Figura 7.6 muestra la distribución de tamaños de partícula de las

nanocápsulas formadas. El tamaño de partícula en promedio fue de 283 nm, con
un mínimo de 122 nm y máximo de 531 nm, lo que a su vez se ve reflejado en la
amplitud de la curva mostrada e indicativo de las variaciones en el PDI que fue de
0.150.

68
 20
18
16
14

% Intensidad
12
10
8
6
4
2
0
10 100 1000 10000
Tamaño de Partícula (nm)

Ncs Tp1 Ncs Tp2 Ncs Tp 3

Figura 7.6 Distribución de tamaño de partícula nanocápsulas preparadas a 4000

rpm, 5 % pluronic F-127 (5 %) y 186 mg de poli-ε-caprolactona.

Una vez verificada la talla submicrónica y el PDI de la suspensión, se

procedió a desarrollar el recubrimiento en el que se pudieran mezclar las
nanocápsulas de dl- tocoferol con un sistema acuoso formador de película. Se
encontró que empleando goma xantana al 0.3 % se obtiene un sistema estable
con ζ de (-)60.5 mV que forma un recubrimiento, que aparentemente tiene un
distribución uniforme en el fruto.

7.2.2. Nanoemulsión

Para la preparación de esta dispersión se encontró que el número de

ciclos de homogenización es un factor determinante para pasar de tallas micro- a
nanométricas (Figura 7.7). La idea de preparar este sistema es determinar si el
tener un sistema recubierto (nanocápsulas) y uno libre (nanoemulsión) representa
alguna conveniencia sobre la efectividad del antioxidante (dl--tocoferol) para
disminuir el índice de oscurecimiento en manzana o bien si la talla submicrónica
es el factor determinante en el recubrimiento.

69
 1800
1600

Tamaño de partícula (nm)

1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0 2 4 6
No. Ciclos de homogenización

Figura 7.7 Tamaño de partícula de nanoemulsiones en función a los ciclos de

homogenización.

Los resultados de tamaño de partícula en función al número de ciclos

mostró que existieron diferencias estadísticamente significativas entre los
diferentes ciclos (comparación de medias de los tratamientos, Tukey, α = 0.05), las
mayores diferencias fueron encontradas en los tres primeros ciclos (transición
micro-nano) a partir de este ciclo el tamaño de partícula permaneció prácticamente
sin variación. El tamaño de partícula promedio después del proceso fue de
aproximadamente 200 nm. Floury et al. (2000) y Yuan et al. (2008) reportaron que
existe una reducción en el tamaño de partícula por efecto de la velocidad de
agitación y la turbulencia generada en emulsiones y nanoemulsiones con ciclos de
homogenización semejantes a los mostrados en este trabajo. Tan y Nakajima
(2005) llevaron a cabo la preparación de nanodispersiones por el método de
emulsificación-evaporación realizando tres ciclos de homogenización, logrando
disminuir el tamaño de partícula a valores entre 40 a 250 nm, estos datos
coinciden con los alcanzados en este estudio. Para garantizar una talla
submicrónica y una distribución homogénea del tamaño de partícula, la
nanoemulsión se preparó con 5 ciclos de dispersión.

70
 En la Figura 7.8 se observa la distribución de tamaños de partícula con
respecto al porcentaje en volumen para las tres dispersiones preparadas,
emulsión, nanoemulsión y nanocápsulas.

35

30

25
% en volumen

20

15

10

0
50 500
Tamaño de partícula (nm)
Emulsión NE NCS NESF

Figura 7.8 Distribución de tamaño de partícula para la emulsión (E), nanoemulsión

(NE), nanocápsulas (NCS) y nanoesferas (NESF).

La emulsión tuvo un tamaño de partícula promedio de 1620 nm y PDI de

0.197, con un comportamiento bimodal, representado por partículas de menor
tamaño (98 nm en promedio) lo que puede ser importante en la agregación de
partículas durante el almacenamiento. Los sistemas de talla submicrónica
(nanoemulsión, nanocápsulas y nanoesferas) tuvieron un comportamiento
monomodal con tamaños de partícula promedio de 194, 266 y 155 nm y PDI de
0.223, 0.134 y 0.066, respectivamente. Relkin et al., (2008) reportaron
comportamientos monomodales para nanoemulsiones de α-tocoferol preparadas
por el método de homogenización en caliente con tamaños de partícula menores a
200 nm. Yuan et al., (2008) obtuvieron comportamientos monomodales en la
preparación de nanoemulsiones de β-caroteno por procesos de homogenización,
mientras que Yin et al., (2009) mostraron comportamientos bimodales por el
método de desplazamiento de disolvente. Aparentemente, la distribución del
tamaño de partícula de las dispersiones depende en gran medida del proceso

71
utilizado, de la asociación biopolimero-activo y del tipo y concentración del
surfactante utilizado (Bilbao-Sáinz et al. 2010).

7.2.3. Estabilidad de las dispersiones sin goma

Previo a la adición de goma xantana como ingrediente formador de

recubrimiento con permeabilidad selectiva, se llevó a cabo la evaluación de la
estabilidad de las dispersiones durante almacenamiento considerando como
parámetros de estabilidad el tamaño de partícula, PDI y ζ. Al momento de la
preparación, los sistemas evaluados tuvieron un tamaño de partícula de: 258 nm
(nanocápsulas), 298 nm (nanoesferas), 198 nm (nanoemulsión) y 1618 nm
(emulsión) y con densidad de 1.019 g/cm3 para las nanocápsulas, 1.034 g/cm3
para nanoesferas y ≤ 1.018 g/cm3 para emulsión y nanoemulsión.

La Figura 7.9 muestra el comportamiento de los sistemas coloidales

estudiados durante almacenamiento, se observa que los sistemas de talla
submicrónica permanecieron sin importantes cambios de talla de partícula e PDI
durante las 8 semanas de almacenamiento. En contraste, la emulsión tuvo un
aumento significativo en el PDI, lo que podría sugerir fenómenos de agregación de
partículas (e. g.coalescencia, floculación, etc.) lo que modificó la distribución de las
mismas.
2000 0.9
1800 0.8
Tamaño de partícula (nm)

1600 0.7
1400 0.6
1200
0.5
PDI

1000
0.4
800
600 0.3
400 0.2
200 0.1
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8
tiempo (semanas)

NCs NE E NCs PDI NE PDI E PDI

Figura 7.9 Cambios de tamaño de partícula e Índice de polidispersión de los

sistemas: nanocápsulas (NCs), nanoemulsión (NE), emulsión (E).

72
 En la Figura 7.10 se muestran los cambios del ζ de las dispersiones
durante 8 semanas. En general, el ζ promedio para las nanocápsulas y
nanoesferas fue de -43 y 45 mV, no mostrando variaciones significativas con
respecto al tiempo de almacenamiento (p=0.446). Siendo además importante
resaltar queestos presentan una buena estabilidad (considerada a ζ de entre -41-
50 mV) (Schramm, 2005). Además en el gráfico es importante resaltar que las
NCS permanecieron sin variación durante las 3 primeras semanas de
almacenamiento, disminuyendo su ζ ligeramente después de este periodo,
indicativo de que no esisten aglomerados y es estable al almacenamiento. La
nanoemulsión obtenida mostró diferencia estadísticamente significativa respecto a
los otros dos sistemas de talla submicrónica en cuanto al valor de ζ con un valor
promedio de ζ = -54.32 y (p=0.126), estabilizándose transcurridas 3 semanas de
almacenamiento. La emulsión mostró los menores valores de ζ, indicativos de una
muy buena estabilidad del sistema, las principales diferencias se ubicaron en la
primera y última semana de almacenamiento. Bala et al., (2005) han establecido
que el ζ es una medida del grado de repulsión entre partículas similarmente
cargadas en una dispersión, de tal forma que un valor absoluto alto representa un
sistema electrocinéticamente estabilizado. Mirhosseini et al., (2008) mencionan
que potenciales con valores absolutos menores de 25 mV son indicativos de
probable agregación de las dispersiones. Por otro lado, Tewa-Tagne et al., (2007)
mencionaron que cuando se utiliza poli-ε-caprolactona como polímero
encapsúlante se esperan valores negativos para el ζ, debido a la carga del grupo
terminal del polímero.

73
 -30

-35

-40

Potencial zeta (mV) -45

-50

-55

-60

-65

-70
-1 1 3 5 7 9
Tiempo de almacenamiento (semanas)

E NCS NE NESF

Figura 7.10 Variación en el ζ, durante el almacenamiento

7.2.4. Estabilidad de las dispersiones con goma xantana

El comportamiento de las suspensiones en las que se emplea goma

xantana como polisacárido auxiliar en la modificación de permeabilidades
formación de película en conjunto con los sistemas desarrollados y que fueron
empleados como sistemas finales para formar los recubrimientos es mostrado en
la Figura 7.11. Se distinguen variaciones mínimas en el tamaño de partícula para
la nanoemulsión/goma xantana, y nanocápsulas/goma xantana durante las 8
semanas en que se llevó a cabo el monitoreo. La emulsión/goma xantana tuvo
fluctuaciones durante el periodo de almacenamiento con intervalos de confianza
de 0.34 < 0.47 > 0.57.

En la misma Figura 7.11 se observa el comportamiento del PDI respecto al

tiempo de almacenamiento, no habiéndose encontrado diferencia
estadísticamente significativa (α=0.05) para nanocápsulas con intervalos de
confianza de: 0.22 <0.25>0.27. La nanoemulsión presentó el mismo
comportamiento al tiempo cero que la emulsión con un PDI que disminuyó en la
primera semana, estabilizándose y permaneciendo sin variaciones significativas el

74
resto del tiempo de almacenamiento con intervalos de confianza de 0.26 < 0.28 >
0.31.

0 2 4 6 8 10
3000 0.8
Tamaño de partícula (nm)
0.7
2500
0.6
2000
0.5
1500 0.4
0.3
1000
0.2
500
0.1
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo de almacenamiento (semanas)

NCS+GX E+GX NE+GX

PDI NCS+GX PDI NE + GX PDI E+ GX

Figura 7.11. Fluctuación de tamaño de partícula por efecto de la incorporación de

goma xantana a los sistemas: nanocápsulas/goma xantana (NCS + GX),
emulsión/goma xantana (E + GX), nanoemulsión/goma xantana (NE + GX).

La Figura 7.12 muestra las variaciones en el ζ de los sistemas estudiados

con un contenido de goma xantana al 0.3 %. Es posible observar que tanto la
emulsión como la nanoemulsión no se ven afectadas por la incorporación de goma
xantana; sin embargo, las nanocápsulas disminuyen su ζ en un 18.3 % después
de 3 semanas tendiendo a estabilizarse a su condición inicial después de
transcurridas 4 semanas, esto muy probablemente es debido a las interacciones
de la poli-ε-caprolactona con los grupos funcionales de la goma considerando que
esta se comporta como un surfactante aniónico. A pesar de este cambio, las
nanocápsulas fueron estables durante el tiempo de almacenamiento debido a que
los valores de potencial zeta siempre estuvieron por arriba del umbral de
agregación.

75
 -30

-40

Potencial zeta (mV)

-50

-60

-70

-80

-90
0 2 4 6 8 10
Tiempo (semanas)

E NCS NE NESF

Figura 7.12 Variación en el potencial zeta en muestras con 0.3 % de goma xantana

7.2.5. Morfología de las dispersiones

Un aspecto importante a evidenciar es la arquitectura de los sistemas

desarrollados, en particular la presencia de la membrana envolvente de las
nanocápsulas. En la Figura 7.13 se muestra la morfología que presentaron los
diferentes sistemas estudiados, así como una tendencia del tamaño de partícula
de los mismos.

Figura 7.13. Morfología de los sistemas desarrollados (a) NCS = nanocápuslas, (b)
NE = nanoemulsión y (c) E = emulsión.

76
 En la Figura 7.13(a) se presenta la estructura de las nanocápsulas,
confirmandose que son de talla submicrónica. Las figuras 7.13 (b-c) muestran la
morfología de la nanoemulsión y emulsión, se distinguen los glóbulos de talla
nanométrica y micrométrica respectivamente (1-5 μm) formados por el dl-α-
tocoferol. El recuadro de la Fig 7.13(a) confirma la arquitectura de las
nanocápsulas constituida por un centro oleoso (dl-α-tocoferol) submicrónico
envuelto por la membrana del polímero (poli-ε-caprolactona).

7.3. Evaluación del efecto de recubrimientos en manzana fresca cortada

Una vez desarrollados y evaluados los recubrimientos a utilizar para

evaluar la efectividad en la inhibición del oscurecimiento enzimático y demás
parámetros fisicoquímicos, se procedió a realizar una evaluación visual del
aspecto de la manzana fresca cortada previo al almacenamiento y después de
este, por lo que a continuación se presentaran los cambios en calidad visual, para
posteriormente correlacionarlos con los cambios fisicoquímicos, índice de
oscurecimiento y cambios enzimáticos.

7.3.1 Calidad visual de manzana tratada con diferentes recubrimientos con

dl--tocoferol

La Figura 7.14 muestra el aspecto externo que presentaron las rebanadas

de manzanas después de ser sometidas a los diferentes tratamientos con
sistemas de talla submicrónica.

Figura 7.14. Aspecto visual de las muestras de manzana tratada con sistemas
submicrónicos.

77
 Los sistemas donde se aplicaron recubrimientos de talla submicrónica
mostraron una apariencia más clara del tejido con respecto a la manzana sin
tratamiento, esto se atribuyó al cambio en la dispersión de luz por efecto del
tamaño de partícula de estos recubrimientos, lo que imparte al producto una
mayor luminosidad inicial y por ende una apariencia menos oscura aunque
también puede deberse a un probable control de los mecanismos de
oscurecimiento.

La Figura 7.15 muestra el aspecto visual para las muestras al inicio del
almacenamiento y posterior a la aplicación del recubrimiento, en la parte central se
muestra la apariencia visual del control. En estas imágenes es posible resaltar la
diferencias que presentaron los sistemas de talla submicrónica, donde se aprecia
un aspecto más claro y luminoso, respecto al control, emulsión, solución de TPGS
y goma xantana.

78
Figura 7.15 Aspecto visual de las muestras de manzana antes del almacenamiento.

En las Figuras 7.16 y 7.17 se muestran la evolución de cambios en el

aspecto visual que mostraron las manzanas durante el almacenamiento
refrigerado. En la Figura 7.16 se observan las manzanas tratadas con solución
TPGS, goma xantana y emulsión con dl--tocoferol contrastadas con el
comportamiento de las manzanas control, siendo estas las que visualmente
presentaron el mayor oscurecimiento, resaltando además que el recubrimiento
contribuyó a mantener la apariencia visual del fruto hasta los 6 días de
79
almacenamiento, transcurrido este tiempo las muestras tendieron a oscurecerse
paulatinamente. En el caso de la goma xantana el aspecto visual presentado al
final del almacenamiento corresponde a una manzana que en apariencia muestra
menor oscurecimiento, sin embargo también presentó deshidratación superficial lo
que provocó que la intensidad de color disminuyera.

Figura 7.16. Cambios en aspecto visual en manzana fresca cortada control respecto
a recubrimientos con emulsión, solución y goma xantana

La Figura 7.17, muestra los cambios asociados al oscurecimiento para las

manzanas recubiertas con sistemas de talla submicrónica comparados con el
control, observándose que tuvieron una mejor funcionalidad en el mantenimiento
del aspecto visual de las manzanas hasta los 18 días de almacenamiento.
80
 Figura 7.17. Cambios en aspecto visual en manzana fresca cortada para
recubrimientos de talla submicrónica respecto al control.

7.3.2 Cambios de color

7.3.2.1 Luminosidad (L*)

La Figura 7.18 muestra los cambios en L*, asociados a las modificaciones

superficiales del tejido por acción de las enzimas polifenoloxidasas y relacionados
con la barrera que crean los diferentes sistemas de recubrimiento en la superficie
del producto.

81
 78
76
74
72
Luminosidad
70
68
66
64
62
60
0 5 10 15 20
tiempo (dias)

NE NCS Nesf E TPGS GX Control

Figura 7.17 Cambios en Luminosidad en manzana almacenada a 4 °C para los

diferentes recubrimientos. NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF =
nanoesferas, E = emulsión, TPGS = -tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma
xantana.

Los datos iniciales corresponden a las manzanas después de inmersión y

secado en el sistema correspondiente ( 40 min). En la Figura 7.18 es posible
hacer enfásis sobre el comportamiento de las manzanas control en cuanto a la
pérdida de luminosidad la que claramente disminuye drásticamente antes de los 3
días de almacenamiento, con lo que se hace evidente la importancia de realizar
los tratamientos para el producto inmediatamente después del corte. La manzana
control no presentó variaciones en la luminosidad después de los 3 días y hasta
los 9 dias de almacenamiento, después de transcurrido este tiempo mostró
nuevamente una pérdida de luminosidad asociada posiblemente a las pérdias por
deshidratación superficial del producto en un proceso natural de cicatrización del
tejido. Respecto a las muestras recubiertas con goma xantana, se resalta que de
las recubiertas fueron las que disminuyeron más su luminosidad a una velocidad
de 0.66 dia-1 (R2 = 0.94), seguidas por las tratadas con emulsión/goma xantana
que cambiaron de 72 a 67 a una velocidad de 0.34 dia-1 (R2 = 0.89). Se observa
claramente que la utilización de dispersiones submicrónicas contribuyen a
modificar la percepción de la superficie, ya que desde el inicio del tratamiento

82
presentaron un ligero aumento en la luminosidad, lo que puede ser atribuido a la
modificación en la absorción de luz en la superficie del producto, no existiendo
diferencia estadísticamente significativa (α= 0.05) entre las nanocápsulas (L* de
76 a 71 a velocidad de 0.29 dia-1, R2 = 0.87) y la nanoemulsión (L* de 75 a 70 a
una velocidad de 0.28 dia-1, R2 = 0.91). Con respecto a los cambios en L*
diversos autores (Olivas et al., 2007; Rojas-Graü et al., 2006) han mencionado que
la disminución de la luminosidad corresponde al desarrollo de reacciones de
oscurecimiento enzimático o bien por el incremento en la concentración de
pigmentos. Se ha evaluado que la eficiencia de los recubrimientos depende de su
capacidad de funcionar como barrera al oxígeno y por ende limitar la acción
enzimática (Mchugh y Sensi, 2000; Conforti y Totty, 2007; Rojas-Graü et al. 2008).
Además, Soliva-Fortuny et al. (2001) encontraron que para la manzana Golden
Delicius la L* decae drásticamente desde el primer día de almacenamiento en
atmósferas modificadas. Lee et al. (2003) reportaron valores de L* de 79 para
manzanas Fuji que al ser tratadas con carragenina y ácido ascórbico disminuyen
su L* a 73 durante 360 h el almacenamiento.

7.3.2.2 Cambios en a*

Otro factor importante en el desarrollo de oscurecimiento en manzana es

el cambio en a* (-60) verde a (+60) rojo, ya que un incremento de este valor
representa una modificación en el oscurecimiento (Rojas-Graü et al., 2006). En la
Figura 7.19 se muestran las variaciones por los recubrimientos.

83
 4
3
2

valor de "a"
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
0 5 10 15 20
tiempo (días)

NE NCS NESF E TPGS GX Control

Figura 7.19. Cambios en “a*” durante almacenamiento a 4 ºC por efecto de los

diferentes recubrimientos. NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF =
nanoesferas, E = emulsión, TPGS = -tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma
xantana.

En la Figura 7.19, se resalta que al igual que para luminosidad, la

muestras control mostraron un marcado cambio en los valores de a* durante los
primeros 7 días de almacenamiento, lo que implica que es aquí donde la manzana
control presenta el mayor daño, y que además es durante las primeras horas
después del cortado que se presentan los cambios irreversibles asociados al
oscurecimiento, el cambio para las manzanas control fue de -2.7 a 2.9 en las
primeras 24 h. No hubo diferencia estadísticamente significativa entre las
manzanas con goma xantana (-2.32 a -0.37), emulsión (-2.77 a 0.14) y solución de
TPGS (-2.8 a -0.09) hasta los 9 días de almacenamiento; después de este tiempo
la goma xantana tuvo una mayor velocidad (0.19 dias-1) de cambio en los valores
de a*. De acuerdo con Lee et al. (2003), un incremento en los valores de L*
aunado al aumento en a* es una medida directa del desarrollo de oscurecimiento
en frutas frescas cortadas, tal y como sucede en los datos experimentales
analizados en este punto, en los que el cambio en goma xantana, emulsión y
TPGS demuestran valores de a* promedio de -2,7 a 0.09. En relación al
comportamiento de las nanocápsulas y nanoemulsión, la presencia de estos

84
sistemas submicrónicos modifica la percepción del color en la superficie con la
menor velocidad de cambio (de -2.9 a -1.69), contribuyendo a disminuir los
cambios asociados al oscurecimiento y aparentemente limitando la acción
enzimática por disminución de la disponibilidad de oxígeno.

7.3.2.3 Cambios en Índice de oscurecimiento

En la Figura 7.20 se muestran los cambios en el índice de oscurecimiento

por efecto de los diferentes tratamientos utilizados en este trabajo.

85

75
Indice de oscurecimiento

65

55

45

35

25

15
0 5 10 15 20
Tiempo de almacenamiento (días)
NE NCS NESF E TPGS GX Control

Figura 7.19. Cambios en índice de oscurecimiento en manzana a 4°C para los

diferentes recubrimientos. NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF =
nanoesferas, E = emulsión, TPGS = -tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma
xantana.

Con la finalidad de resaltar el efecto de los distintos recubrimientos

empleados, en la Figura 7.20 se muestra la evolución del oscurecimiento en la
superficie del tejido de manzana control, observándose que a las 72 h se había
desarrollado prácticamente todo el oscurecimiento que desarrollarían estas
muestras durante el periodo de almacenamiento.

Las manzanas control mostraron un alto índice de oscurecimiento, siendo

perceptible en las primeras 24 horas con un índice de oscurecimiento de 42,

85
aumentando a razón de 14 % hasta el quinto día y no mostrando diferencia
estadísticamente significativa a partir de ese momento.

El mayor índice de oscurecimiento fue para la emulsión con un intervalo

de confianza de entre 27 < 29 > 30. No se encontró diferencia significativa entre
las muestras tratadas con solución TPGS y goma xantana con valores de entre
22< 24> 28. En ambos casos se tiene un comportamiento ascendente con
velocidades de 1.19 dias-1 (R2 = 0.95) para goma xantana y de 0.90 dias -1 (R2=
0.92) para solución TPGS. Las dispersiones submicrónicas (nanoemulsión,
nonoesferas y nanocápsulas) fueron los sistemas que tuvieron mayor efectividad
para retardar el desarrollo de oscurecimiento. Las velocidades de cambio del
índice de oscurecimiento fueron de 0.80 dias-1 (R2 =0.88) en nanoesferas, de 0.52
-1
dia (R2 =0.84) para nanoemulsión, el recubrimiento con nanocápsulas fue el
sistema más efectivo, con la menor velocidad de cambio de 0.49 dias-1 (R2 = 0.92)
y valor promedio de índice de oscurecimiento de 11 (Figura 7.20). En el caso de la
nanoemulsión el efecto es claramente atribuible a la talla de partícula puesto que
la emulsión con similar contenido presenta un rápido oscurecimiento 0.87 dias -1
(R2 = 0.88). Aparentemente, la actividad del dl-α-tocoferol como nutraceútico-
antioxidante y modificador de las propiedades de barrera se ve favorecida por el
área de contacto con el fruto (Mei y Zhao, 2003).

Es posible, entonces establecer que el desarrollo del oscurecimiento fue

claramente disminuido aplicando nanocápsulas y nanoemulsión (p < 0.05),
teniendo un importante efecto sobre la inhibición del oscurecimiento. La presencia
del dl--tocoferol como activo en estos sistemas juega un rol determinante en el
efecto antioxidante. Lo que es posible contrastar con el comportamiento del
recubrimiento con nanoesferas, ya que a pesar de que este disminuye el índice de
oscurecimiento su efecto no es comparable en magnitud a los que contienen dl--
tocoferol. Aunque la presencia de CaCl2, como agente anti-oscurecimiento (García
y Barret, 2002) puede contribuir a los resultados obtenidos, los efectos son
claramente atribuidos a la habilidad del recubrimiento para funcionar como barrera
al oxígeno; el dl--tocoferol contribuye a la modificación de las propiedades de

86
transporte limitando la acción de la enzima (Park y Zhao, 2005). En cuanto a los
agentes anti-oscurecimiento, Son et al. (2001), evaluaron la efectividad de
diferentes agentes tales como: ácidos carboxílicos, ácido ascórbico, miel de abeja,
ácido oxálico, 4-resorcisol entre otros, determinando que los cambios de color son
una función del índice de oscurecimiento siendo el más efectivo el ácido oxálico.
La efectividad del ácido ascórbico es temporal porque una vez oxidado pierde su
actividad. De manera general, los resultados reportados por estos autores son
significativamente menores a los obtenidos en este estudio para los sistemas
nanopartículados. Perez-Gago et al. (2006), llevaron a cabo un estudio para
evaluar la efectividad de recubrimientos a base de cera de abeja y proteína de
suero de leche con agentes anti-oscurecimiento (ácido ascórbico y cisteína),
concluyen que la utilización de estos recubrimientos disminuye el oscurecimiento
de manzana Golden Delicius en índices de oscurecimiento entre 25 y 35 durante
350 h de almacenamiento. En el estudio realizado en este trabajo, aparentemente
el utilizar nanocápsulas, como sistema reservorio, mejora en gran medida la
conservación de manzana Red Delicius ya que el índice de oscurecimiento inicial
es aproximadamente de 8, atribuido a la dispersión de luz dada por las
nanocápsulas, teniendo el producto un color menos oscuro, reflejado a su vez en
los valores de L* que tienen un cambio de apenas dos unidades durante el periodo
de almacenamiento (Figura.7.18). Estos resultados dan apoyo a las características
visuales observadas en la sección anterior y muestran un uso potencial de estos
componentes.

7.3.3. Caracterización fisicoquímica después de la inmersión

En el Cuadro 7.4 se presentan los resultados obtenidos con la finalidad de

contar con un parámetro de referencia, que asocie el cambio superficial de la
manzana con la aplicación del recubrimiento. Los cambios se monitorearon en
propiedades fisicoquímicas inmediatamente después de la inmersión. Se observa
que en la emulsión y nanoemulsión hubo una ligera disminución en la
concentración de SST, de acuerdo a la dispersión de datos parece que no hay
diferencias estadísticas además de que el análisis es inmediatamente después del
realizar el tratamiento. No se esperaría que hubiera un cambio tan inmediato
87
asociado con la disolución de azucares durante la inmersión, además de una
menor resistencia a la punción (firmeza) en las muestras tratadas con solución de
TPGS, sin embargo en el resto de los componentes analizados no se encontró
diferencia estadísticamente significativa en el comportamiento. Resultados
similares han sido reportados en manzanas frescas cortadas conservadas con
diferentes antioxidantes o utilizando diferentes tratamientos (Soliva-Fortuny et al.,
2005; Rojas-Graü et al., 2006).

Cuadro 7.4. Caracterización inicial de manzana después de

aplicación de los recubrimientos.
Tratamiento Sólidos Acidez pH Firmeza
solubles (N)
(%)
NE 12.8 ± 0.3 0.21 ± 0.02 3.4 ± 0.01 6.2 ± 0.6
NCS 13.6 ± 0.2 0.27 ± 0.01 3.6 ± 0.05 6.7 ± 0.2
NESF 13.4 ± 0.3 0.23 ± 0.03 3.5 ± 0.07 6.9 ± 0.5
E 13.5 ± 0.3 0.21 ± 0.01 3.6 ± 0.06 6.1 ± 0.3
TPGS 12.4 ± 0.4 0.24 ± 0.02 3.7 ± 0.02 5.7 ± 0.2
GX 13.6 ± 0.2 0.21 ± 0.01 3.8 ± 0.06 6.2 ± 0.3
Control 13.4 ± 0.3 0.23 ± 0.07 3.9 ± 0.06 6.2 ± 0.3
NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF= nanoesferas, E= emulsión,
TPGS = dl--tocoferol Propilenglicol succinato, GX = goma xantana.

7.3.3. Cambios en la ultraestructura de rebanadas de manzana tratadas

con los recubrimientos de talla submicrónica.

La Figura 7.21 es una micrografía representativa de manzana fresca

cortada, sin ningún tratamiento y previo al almacenamiento refrigerado. Se
observa el tejido típico con sus diferentes componentes. Estas micrografías fueron
utilizadas como referencias para comparar los efectos en las manzanas tratadas
con los recubrimientos.

88
 Figura 7.21 Superficie de un corte de la manzana Red Delicius, sin tratamiento

La Figura 7.22 muestra las micrografías del tejido de manzana tratado con
los diferentes recubrimientos, estas imágenes fueron tomadas a diferentes
aumentos para evidenciar los distintos componentes del tejido y distinguir la
localización de los componentes de los recubrimientos.

La Figura 7.22(a) pone en evidencia la presencia en la superficie del tejido

de la goma xantana, considerando que los agregados en forma de agujas son
característicos de este tipo de sistemas (Veiga-Santos et al., 2005), además es
posible confirmar que el recubrimiento forma una película homogénea sobre la
superficie del tejido. En la Figura 7.22 (b) se muestra la manzana recubierta con el
recubrimiento a base de nanocápsulas/goma xantana en donde se evidencia la
formación de agregados de la dispersión y gotas producto de la transpiración del
fruto (Soliva-Fortuny et al., 2003). Estos agregados permiten suponer que las
nanocápsulas tienden a aglomerarse después de su aplicación y secado
posiblemente por su naturaleza hidrofóbica que contrasta con la naturaleza del
fruto. Es importante destacar que esta aglomeración no implica que el sistema
haya perdido sus características, en particular sus propiedades superficiales y de
sistema reservorio. Adicionalmente, se observa un recubrimiento continuo con las
nanocápsulas embebidas dentro de la matriz de la goma xantana y distribuidas en

89
toda la superficie del fruto. Esta disposición del recubrimiento sobre el fruto puede
tener efecto sobre la modificación de las propiedades de permeabilidad a los
gases y capacidad antioxidante, como se verá adelante.

En la Figura 7.22(c) se muestra el recubrimiento con nanoesferas, el

comportamiento es muy similar al observado para las nanocápsulas, una
distribución homogénea sobre la superficie del fruto con agregados puntuales y
continuos. Es esperado que la distribución del sistema y su presencia en la
superficie del recubrimiento puedan tener un efecto protector debido a la
interacción con la superficie y modificación del intercambio gaseoso del fruto.

La Figura 7.22(d) corresponde a la micrografía con la nanoemulsión, se

distinguen pequeñas gotas aparentemente correspondientes a los nanoglóbulos
del dl--tocoferol. Igual que en los anteriores recubrimientos se observa
homogeneidad del recubrimiento en la superficie. Se pronostica un menor efecto
protector de este sistema considerando la inmediata disposición del material y su
pronta oxidación al ser un sistema no recubierto. Finalmente las Figuras 7.22( e) y
(f) muestran las micrografías para la solución de TPGS y la emulsión de dl--
tocoferol, en la primera no se evidencian continuas y homogéneas estructuras en
la superficie, lo que hace suponer una mayor infiltración del sistema hacia los
poros del fruto. La emulsión no muestra los glóbulos correspondientes a su talla de
partícula, lo que puede sugerir coalescencia del sistema posterior a su aplicación.
Estas evidencias se utilizarán para analizar el comportamiento del fruto recubierto.

90
 Figura 7.22 Micrografías del tejido de manzana tratado con los diferentes
recubrimientos: a) GX = goma xantana, b) NCS = nanocápsulas, c) NESF =
nanoesferas, d) NE = nanoemulsión, e) TPGS = dl--tocoferol propilenglicol
succionato, f) E = emulsión.

91
 7.3.4. Cambios fisicoquímicos durante el almacenamiento refrigerado

7.3.4.1. Pérdida de líquido drenado

La Figura 7.23 resume los datos de pérdida de líquido drenado,

expresados como él % de pérdida respecto al peso inicial en las rebanadas de
manzana durante el periodo de almacenamiento. Aunque existen diferencias, las
pérdidas durante el periodo fueron en todos los casos menores al 1 % debido
básicamente a que el líquido drenado al interior del envase fue mínimo para todos
los tratamientos analizados.

0.6

0.5

0.4
% pérdida

0.3

0.2

0.1

0
0 5 10 15 20
Tiempo de almacenamiento (días)
NE NCS NESF E TPGS GX Control

Figura 7.23. Pérdida de peso por liquido drenado para los diferentes
recubrimientos: NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF = nanoesferas,
TPGS = dl--tocoferol propilenglicol succinato, E = emulsión, GX = goma xantana.

La Figura 7.23 muestra que los mayores cambios fueron para las manzanas
recubiertas con goma xantana con una pérdida de 0.45 % al final del periodo de
almacenamiento, teniendo esta mínimas variaciones a partir del día 10 de
almacenamiento, debido principalmente a la absorción de la goma xantana en el
tejido lo que en apariencia mostró una ligera deshidratación superficial (Figura
7.17). La menor cantidad de líquido drenado correspondió a las muestras
recubiertas con nanocápsulas/goma xantana siendo en promedio de 0.2 %.
Respecto a este comportamiento, Ball (1999) y Olivas et al., (2007) reportaron que
la pérdida de peso de frutos recubiertos está fuertemente relacionada a la

92
composición del recubrimiento, viéndose en la mayoría de los casos, limitada por
la adición de lípidos. La propiedad hidrofóbica de este componente en el
recubirmiento evita la salida del vapor de agua y por tanto un mejor control de la
pérdida de peso. Los mismos autores concluyen que el uso único de hidrocoloides
no garantiza la formación de una buena barrera para la humedad en alimentos con
alta actividad acuosa, debido a su alta higroscopicidad; que permitirían la posterior
evaporación de las moléculas de agua desde la superficie del hidrocoloide. Es
posible que la pérdida de peso mostrada por la muestras recubiertas con goma
xantana pueda atribuirse a este fenómeno.

7.3.3.2. Sólidos solubles Totales (SST)

En la Figura 7.24 se observa la evolución en el contenido de sólidos

solubles, las curvas muestran diferentes tendencias dependiendo del tratamiento
utilizado.

15

14

13
SST

12

11

10

9
0 5 10 15 20
Tiempo de almacenamiento (días)

NE NCS NESF E TPGS GX Control

Figura 7.24 Cambio en sólidos solubles durante el almacenamiento refrigerado (4°C)

de manzana con diferentes tratamientos: NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas,
NESF = nanoesferas, TPGS = dl--tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma
xantana.

Las muestras control tuvieron una disminución del contenido de SST de

13.8 a 12.0, representando un cambio del 13 % respecto a la condición inicial. No

93
existió diferencia estadísticamente significativa ( = 0.05) en el comportamiento de
los SST en la emulsión y solución de TPGS los que mostraron una disminución del
8.9 y 8 % respectivamente. Las manzanas con goma xantana, nanoemulsión
nanocápsulas mantuvieron una concentración de SST por encima del 11 % no
mostrando diferencia estadísticamente significativa, además es importante resaltar
que en estas muestras y a partir del quinto día de almacenamiento la
concentración de SST permaneció sin cambio aparente. Las variaciones en SST
en algunas ocasiones están en función de la composición del recubrimiento
dependiendo de éste la interacción del producto con el ambiente. Además Li y Yu
(2001) y Olivas et al., (2007) no reportaron variaciones importantes en el contenido
de SST por efecto del tipo de recubrimiento aplicado a diferentes frutos con
recubrimientos de quitosan y alginato.

7.3.3.3. Acidez titulable

La Figura 7.25 muestra los cambios en acidez, factor de gran importancia

para el aroma y sabor de las frutas. El comportamiento de la acidez durante el
almacenamiento refrigerado fue dependiente del tratamiento al que se sometió el
fruto.

290
mg de ácido málico/100 mL de

270
250
230
210
jugo

190
170
150
0 5 10 15 20
Tiempo de almacenamiento (días)

NE NCS NESF E TPGS GX Control

Figura 7.25 Cambios en acidez durante el almacenamiento de manzana con

diferentes recubrimientos:NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF =
nanoesferas, E = emulsión, TPGS = dl--tocoferol propilenglicol succinato, GX =
goma xantana.

94
 En las Figura 7.25 se observa que las muestras control tuvieron un
comportamiento que se diferencia marcadamente de los otros tratamientos,
observándose un comportamiento atribuible a la rápida pérdida de calidad que
muestran los frutos frescos cortados, al igual que en el resto de las propiedades
analizadas, los cambios más importantes se muestran antes de los 3 días de
almacenamiento, con una disminución de 240 a 190 mg de ácido málico /100 mL
de jugo, durante los primeros 3 días de almacenamiento. De acuerdo con Olivas et
al., (2007) la acidez tiende a disminuir durante el almacenamiento de manzanas
“Golden Delicius” debido a los cambios metabólicos y a la maduración de los
frutos; no obstante, cuando se aplican recubrimientos que alteran el intercambio
de gases, la tasa de respiración puede disminuir lo cual puede llevar a prolongar la
vida de anaquel; esta condición puede variar con la composición del recubrimiento
utilizado. Cortez-Vega et al., (2008), reportaron que las manzanas “Fuji” tratadas
con metabisulfito de sodio o ácido ascórbico no mostraron variaciones
significativas durante el almacenamiento en cuanto a los cambios en acidez
titulable. En este trabajo las muestras con goma xantana mostraron una tendencia
similar a las muestras control con una menor velocidad de cambio, asociada a la
naturaleza de la goma xantana. A partir de estos reportes se puede establecer que
el tipo de tratamiento, la variedad del fruto y las condiciones de almacenamiento
son factores determinantes en las variaciones de acidez. Las muestras con
solución de TPGS mostraron una disminución de la acidez a partir de los 10 días;
la menor variación se presentó en las manzanas tratadas con nanoesferas con un
contenido de 234 mg de ácido málico /100 mL de jugo al final del almacenamiento.
Las muestras con nanocápsulas y nanoemulsión no mostraron diferencia
estadísticamente significativa ( = 0.05) durante el almacenamiento con un
contenido de 211 y 219 mg de ácido málico /100 mL de jugo.

7.3.3.4 Cambios en pH durante el almacenamiento

En la Figura 7.26 se muestran las variaciones en pH por efecto del tipo de

tratamiento en función del tiempo de almacenamiento.

95
 4.7

4.5

4.3

4.1
pH

3.9

3.7

3.5

3.3
0 5 10 15 20
Tiempo almacenamiento (días)

NE NCS NESF E TPGS GX Control

Figura 7.26 Cambios en pH durante el almacenamiento a 4°C para los diferentes

tratamientos: NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF = nanoesferas, E =
emulsión, TPGS = dl--tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma xantana.

Para las manzanas control, la acidez tuvo un importante incremento inicial,

seguido de una ligera disminución después de 10 días de almacenamiento
refrigerado. No se registraron diferencias significativas entre los tratamientos con
nanoemulsión, emulsión y goma xantana. Las nanocápsulas mantuvieron el pH
aproximadamente constante hasta los 10 días de almacenamiento con una ligera
disminución del pH de 3.6 a 3.4 a los 15 días. Olivas et al., (2007) trabajando con
manzanas variedad “Royal Gala”, concluyeron que la disminución o mantenimiento
del pH determina el oscurecimiento del fruto, mientras que un aumento del pH
implica menor protección y por ende un mayor oscurecimiento. Este es el caso de
nuestras manzanas control

El hecho de que las muestras con los recubrimientos submicrónicos

muestren menores cambios en estos parámetros parece indicar que, estas
controlaron la actividad metabólica por lo que el consumo de azúcares disminuyó
manteniendo mayores contenidos de sólidos solubles y hubo menor utilización de
ácidos orgánicos para la respiración; esto indicaría que los recubrimientos tuvieron
un efecto retardador del metabolismo y por tanto un incremento en la retención de
calidad.

96
 7.3.4 Cambios de textura

Los cambios de textura o firmeza se muestran en la Figura 7.27,

mostrándose con los gráficos de barras la variabilidad de los resultados durante el
almacenamiento.

6
Firmeza (N)

tiempo (min) 0 3 5 7 9121518 0 3 5 7 9121518 0 3 5 7 9121518 0 3 5 7 9 12 1518 0 3 5 7 9 12 15 18 0 3 5 7 912 15 18 0 3 5 7 9121518

Tratamiento ol X X X X X ol
tr G G G G /G S
on E/ C
s/ E/ esf
C N N N

Figura 7.27 Cambios de firmeza durante el almacenamiento a 4ºC para los diferentes
recubrimientos utilizados: E/GX = emulsión, GX = goma xantana, NcS/GX =
nanocápsulas, NE/Gx = nanoemulsión, Nesf/Gx = Nanoesferas, Sol = dl--tocoferol
propilenglicol succinato.

Se observaron diferencias estadísticamente significativas en función al

tratamiento aplicado y al tiempo de almacenamiento. Las manzanas control
mostraron los mayores cambios, la firmeza disminuyó de 6.2 a 2.8 N durante el
almacenamiento refrigerado, seguidas por las muestras tratadas con la solución y
emulsión, las que además, no mostraron diferencia significativa entre sí, con una
disminución de firmeza del 25 % con respecto a la condición inicial. Resalta el
hecho de que las muestras tratadas con solución de TPGS disminuyeron
considerablemente su textura después de 3 días de almacenamiento,
permaneciendo sin cambio hasta el día 9, para disminuir drásticamente a partir de
los 12 días. La firmeza para los recubrimientos a base de goma xantana disminuye
considerablemente (de 6.3 a 5 N) durante los primeros 3 días de almacenamiento,

97
permaneciendo prácticamente constante y sin diferencia estadísticamente
significativa a partir del día 5 de almacenamiento refrigerado. Para el
recubrimiento con nanoemulsión/goma xantana, los cambios en firmeza fueron
paulatinos, teniendo una velocidad de cambio de 0.13 N/día.

Aunado a la apariencia visual, la textura (expresada como firmeza) que

presentaron los frutos frescos cortados es un factor importante que determina la
decisión de compra de un producto. De acuerdo con Soliva-Fortuny et al. (2005),
el ablandamiento de la fruta es consecuencia de los cambios en las propiedades
físicas y mecánicas del tejido y está directamente asociada a los cambios
químicos en polisacáridos, de tal manera, que la utilización de CaCl2 como
operación previa al recubrimiento contribuye a mantener la textura de los frutos.
Rojas-Graü et al., (2008) reportaron que el CaCl2 incorporado a formulaciones con
proteína de soya contribuye a mejorar la firmeza del fruto, atribuyéndolo a la
composición del recubrimiento y a la acción del calcio en la pared celular.
Entonces, la composición y características del recubrimiento modifican en gran
medida el comportamiento durante el almacenamiento, Es importante destacar
que el tamaño de partícula y las características del recubrimiento tienen un
importante efecto sobre la textura. En el caso del recubrimiento con nanocápsulas
se observó un efecto conservador en la firmeza de los frutos. De manera general,
estos recubrimientos presentaron menor variación durante el almacenamiento,
seguidos de los tratados con nanoemulsión. Este comportamiento permite sugerir
que la amplia área de exposición debida a la talla submicrónica de las
nanocápsulas y de la nanoemulsión (254 nm y 194 nm respectivamente) y su
distribución dentro del recubrimiento permite mejorar la interacción de estos
sistemas con los componentes de la pared celular del fruto (Abbott y Buta, 2002,
Rojas-Graü et al., 2008). Por otro lado, Varela et al., (2007) realizaron un estudio
de textura durante 14 días de almacenamiento en dos variedades de manzana,
Granny Smith y Golden Delicius, utilizando ensayos de punción hasta 10 mm de la
superficie de cubos de manzana. Los resultados mostraron que la firmeza de la
manzana Golden Delicius es menor que la de la manzana Granny Smith. Los

98
valores de firmeza reportados en este estudio son de magnitud semejante a los
obtenidos para nuestras muestras de manzana Red Delicius.

De acuerdo con Varela et al. (2007) el módulo de compresión es un

parámetro recomendado e indicativo para seguir la pérdida de la integridad
estructural de las frutas el cual se manifiesta como una disminución de la rigidez
durante el almacenamiento de productos frescos cortados. Los resultados
obtenidos para los diferentes recubrimientos en almacenamiento son mostrados
en la Figura 7.28, está también evidencia que las muestras de talla submicrónica
mantuvieron más cohecionado el tejido dando mayores valores de compresión y
por tanto mayor firmeza de las muestras

0.06

0.05
Modulo (Mpa)

0.04

0.03

0.02

0.01
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo almacenamiento (dias)

NE NCS NESF E TPGS GX Control

Figura 7.28. Comportamiento del módulo de compresión para manzana almacenada

con diferentes recubrimientos: NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF =
nanoesferas, E = emulsión, TPGS = dl--tocoferol propilenglicol succinato, GX =
goma xantana.

Grotte et al. (2002) realizaron un análisis del módulo de compresión junto

con otras propiedades en manzanas Golden Delicius, observando una disminución
del módulo durante el almacenamiento de manzanas enteras, teniendo un 43 %
de pérdida de rigidez durante 360 h en cierta medida es un comportamiento similar
a las manzanas de control analizadas en el presente trabajo. El módulo de

99
compresión para las manzanas control disminuyó lentamente hasta los 7 días,
después de este tiempo la disminución llegó al 50 %. Las manzanas tratadas con
goma xantana mostraron un comportamiento irregular en el caso de las manzanas
con solución y emulsión no se encontró diferencia significativa en la modificación
del módulo. Para la solución se tuvieron variaciones mínimas durante los 3
primeros días, después de este tiempo la pérdida de rigidez fue incrementándose
paulatinamente a una velocidad de 1.1 Pa/día (R2 = 0.89). Las muestras con
emulsión tuvieron una pérdida de rigidez a razón de 0.9 Pa/día (R2 =0.88). Para
los recubrimientos con nanocápsulas y nanoemulsión no se encontró diferencia
estadísticamente significativa del módulo. El resultado más destacable de esta
evaluación fue que las muestras tratadas con nanocápsulas permanecieron
prácticamente constantes durante el periodo de almacenamiento con una
velocidad de cambio de firmeza de 0.51 Pa/día (R2 = 0.91). El recubrimiento con
nanoemulsión tuvo valores también bajos con 0.64 Pa/día (R2 = 0.93). Nuestros
resultados confirman que las nanocápsulas y la nanoemulsión contribuyen
significativamente al mantenimiento de la rigidez, e incrementar la vida útil de las
manzanas.

7.3.5. Cambios en actividad de polifenoloxidasas (PFO)

En el cuadro 7.5 se resumen los resultados para la actividad de PFO en

manzana fresca cortada previo al tratamiento. El análisis de estas muestras tiene
como finalidad estandarizar el método y comparar los resultados con los
reportados en la bibliografía, ya que estas son el punto de comparación para los
distintos sistemas coloidales estudiados y su correlación con el índice de
oscurecimiento y contenido de fenoles totales.

La actividad promedio fue de 1156 UA/mL. Wakayama (1995) estudió la

actividad polifenoloxidasa en la piel, el mesocarpio y el endocarpio de cinco
variedades de manzana cultivadas en Japón, entre las que se encuentra la Red
Delicious, esta variedad presentó la mayor actividad de esta enzima respecto de
todas las estudiadas con un total de 1570 UA/mL, en donde el mesocarpio y el
endocarpio juntos muestran una actividad de 1230 UA/mL, la que es comparable

100
con la actividad promedio reportada para nuestras muestras. La variación (74
UA/mL) puede ser atribuida a factores no controlables como son el lugar de
procedencia, época de cosecha, condiciones climáticas y de manejo, razón por la
que con estos resultados se procedió a realizar las pruebas correspondientes a
manzanas frescas cortadas y tratadas con los diferentes sistemas coloidales, que
se analizan a continuación.

Cuadro 7.5 Actividad enzimática PFO de manzanas sin tratamiento.

Muestra Pendiente Unidades de Actividad
Actividad relativa
UA) (UA/mL)
Muestra 1 0.201 201 1005
Muestra 2 0.255 255 1275
Muestra 3 0.236 236 1180
Muestra 4 0.245 245 1225
Muestra 5 0.219 219 1095
Promedio 1156
D.E. 84.8
C.V. 7.33

Rojas-Graü et al., (2006) indicaron que uno de los parámetros más

importantes a considerar para determinar la efectividad de tratamientos en frutas
frescas cortadas es monitorear los cambios en actividad polifenoloxidasa durante
el almacenamiento del producto.

La Figura 7.29 muestra el comportamiento de la actividad PFO en función

al tratamiento y tiempo de almacenamiento. En las muestras control la actividad de
PFO aumentó a razón de 53.02 U/mL día (R2 = 0.93) hasta el séptimo día de
almacenamiento, este resultado se correlaciona con el cambio en el índice de
oscurecimiento reportado previamente (7.3.5.3) el cual permanece prácticamente
constante después de 7 días. Este comportamiento es relacionado al agotamiento
del sustrato en la superficie de la manzana ya que los productos de oxidación de
los compuestos fenólicos tienen potencial de interactuar con las proteínas,
generando condensaciones covalentes con los grupos –SH y NH2 de los
aminoácidos susceptibles a la unión o alquilación por quinonas, de aquí la
formación de enlaces entre las quinonas y las proteína que puede resultar en
cambios en las características estructurales y funcionales de las proteínas, dando

101
como resultado la inhibición de la síntesis de “novo” de fenoles y reduciendo por
ende la actividad enzimática (Wojdylo et al., 2008; Stelzig et al., 1972).

1800
1700
1600
Actividad (U/mL)

1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
0 5 10 15 20
Tiempo de almacenamiento (días)

NE NCS NESF E TPGS GX Control

Figura 7.29 Actividad de PFO en manzana fresca cortada durante almacenamiento

con diferentes tratamientos: NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF =
nanoesferas, E = emulsión, TPGS = -tocoferol propilenglicol succinato, GX = goma
xantana.

En la misma Figura 7.29 se observa que el comportamiento de la actividad

enzimática de PFO de las nanocápsulas permaneció prácticamente sin
variaciones durante el almacenamiento, disminuyendo a partir del séptimo día. Es
importante resaltar que en cuanto a la actividad de PFO las nanocápsulas tienen
una actividad similar a la reportada por Ji-Hyun y Kwang-Deog (2011), quienes
utilizaron un tratamiento ulstrasónico y ácido ascórbico para controlar el
oscurecimiento en manzana Fuji. Se puede hipotetizar que el dl--tocoferol tiene
un efecto reductor que pudiese ser asociado a cambios en la actividad de la
membrana y por ende a una disminución de los mecanismos de acción asociados
a la polimerización de o-quinonas. Es ampliamente conocido el papel del dl-α-
tocoferol como un compuesto inhibidor del ataque oxidativo de los ácidos grasos
polinsaturados presentes en las membranas celulares, debido a su capacidad

102
antioxidante, su estructura química permite donar un hidrógeno e inactivar
diferentes especies de radicales libres (Eitenmiller y Lee, 2004).

La acción protectora ejercida por los sistemas con nanoesferas (Figura

7.28) puede ser debida a su distribución en el recubrimiento la cual determina el
intercambio gaseoso durante el almacenamiento del producto. Un efecto adicional
es que la biodegradación del biopolímero matriz (poli-ε-caprolactona) es limitada
por la presencia de agua. (Sinha et al., 2004) por lo que se requiere un tiempo
para llevar a cabo la hidrolisis del polímero lo que contribuye a controlar la
liberación del antioxidante (dl--tocoferol). El efecto protector de las nanoesferas
es significativo y pudiera tener impacto tecnológico aun cuando esta dispersión no
tiene dl--tocoferol, su actividad PFO en promedio es solo 10 % mayor a la
mostrada por las nanocápsulas.

La solución de TPGS tuvo una actividad de PFO constante hasta los 12

días de almacenamiento, a partir de este tiempo se produjo un incremento
aproximadamente constante con una velocidad de 56.2 U/mL día-1 (R2 = 0.96). Un
argumento interesante para el uso de esta molécula como antioxidante es que la
esterificación del anillo del tocoferol con el acetato protege al tocoferol de una
temprana oxidación, puesto que estos grupos ocupan los sitios donde se origina la
actividad antioxidante de este compuesto, entonces es requisito primario que los
esteres sean hidrolizados, para que el α-tocoferol presente actividad biológica.
Además, para que se lleve a cabo la reacción de la PFO es necesaria cierta
cantidad de agua (Robb, 1995), por lo que el acetato de dl-α-tocoferol no puede
inhibir la enzima PFO ya que es un compuesto hidrofóbico, sin embargo, este
puede interactuar con los productos de reacción de la PFO inhibiendo así el
oscurecimiento enzimático (Figura 7.20). Yan et al., (2007), asumieron la hipótesis
de la hidrólisis de TPGS para explicar y correlacionar la absorción de -tocoferol a
nivel intestinal. Suponemos que la actividad protectora de la solución de TPGS es
debida a un retardo en la liberación del dl--tocoferol que explicaría la baja
actividad PFO en los primeros 12 días de almacenamiento, la Figura 7.30 muestra

103
la suposición en que se basa esta discusión respecto a la liberación del
antioxidante para la captura de radicales libres (Jensen et al., 1999).

Figura 7.30. Estructura, hidrólisis y función antioxidante de TPGS

Yan et al., 2007.

En este trabajo se argumenta que el mecanismo potencial por el cual las

nanocápsulas cargadas con dl--tocoferol limitan el desarrollo de oscurecimiento
en manzana fresca cortada debido a que el tamaño de partícula impacta el área
de liberación del tocoferol, permitiendo por ende la acción de este componente a
nivel superficial del fruto. Después de la aplicación de las nanocápsulas a la
superficie del fruto, se inicia la degradación de la membrana polimérica de poli-ε-
caprolactona liberando así el -tocoferol encapsulado desde los nanoglóbulos
cuyo grupo éster será hidrolizado por enzimas carboxilesterasas presentes en la
manzana, generándose ácido acético y -tocoferol los cuales interactuaran con las
o-quinonas formadas modificando el pH superficial e impidiendo la polimerización,
ya que el tocoferol obtendrá su hidrógeno evitando que las quinonas se unan a los
grupos -SH y -NH2 inhibiendo de esta manera la formación de melaninas
causantes del oscurecimiento del fruto.

La nanoemulsión tuvo una mayor actividad de PFO que los otros sistemas
de talla submicrónica evaluados, sin embargo, presentó variaciones durante el

104
almacenamiento. Las muestras con goma xantana mostraron una variabilidad
ondulatoria en el comportamiento de la actividad de PFO. Con un periodo inicial
(primeros 5 días de almacenamiento) de cambio a velocidad constante,
posiblemente debido a que la goma xantana forma un recubrimiento continuo que
reduce la transferencia de oxígeno (Chen y Nussinovitch, 2000). Después de este
tiempo existe un incremento en la actividad de PFO la cual fluctúa de forma
aleatoria y poco predictible, pero con una actividad superior a la presentada en los
sistemas de talla submicrónica.

7.3.7 Cambio en el contenido de fenoles totales

Previó a la determinación del contenido de polifenoles totales en las

muestras tratadas con los diferentes sistemas, se llevó a cabo la obtención de la
ecuación de trabajo para determinar el contenido de polifenoles realizando una
curva patrón con ácido gálico a concentraciones de: 50, 100, 150, 250 y 500 mg/L.
Obteniéndose la ecuación y = 0.017 x (R2= 0.995), con la que se obtuvieron las
concentraciones de las diferentes muestras de manzana.

El contenido de polifenoles en manzanas recién cortadas sin ningún

tratamiento estuvo en un intervalo que va de 415 a 462 mg EAG/g de manzana,
(media = 439 ± 14.62mg EAG/g de manzana). Estos resultados se compararon
con los obtenidos por otros autores (Sapers et al., 1989; Tasao et al., 2003); para
establecer la reproducibilidad del método.

La Figura 7.31 muestra el comportamiento del contenido de polifenoles

totales expresados en función al contenido equivalente de ácido gálico, para los
tratamientos monitoreados durante los 18 días de almacenamiento refrigerado.

La amplitud de la caja representa la variabilidad de resultados en el

contenido de polifenoles totales, en las manzanas control los polifenoles
disminuyeron paulatinamente durante el almacenamiento llegando a una
concentración de 395 mg EAG/g de muestra, esta disminución en la concentración
de fenoles durante el almacenamiento se relaciona con el rápido oscurecimiento
que presentaron las manzanas control (Figura 7.20), reflejado en un incremento en

105
la actividad PFO (Figura 7.29). El comportamiento mostrado se relaciona con lo
reportado en relación a los compuestos fenólicos, actividad PFO grado de
oscurecimiento en diferentes variedades de manzana, encontrando que para
cuatro variedades, incluyendo la Red Delicius, la actividad PFO está directamente
relacionada con el grado de oscurecimiento, tal y como sucedió con las manzanas
control en este estudio (Amiot et al., 1992; Amiot et al., 1995).

470

460

450
mg EAG/g de muestra

440

430

420

410

400

390

380

tiempo (días) 0 3 5 7 9121518 0 3 5 7 9121518 0 3 5 7 9 12 15 18 0 3 5 7 9 12 15 18 0 3 5 7 9121518 0 3 5 7 9121518 0 3 5 7 9 12 15 18

Tratamiento ol E X s E es
f ol
tr G N
C N N S
on
C

Figura 7.31 Variación en el contenido de fenoles totales: E = emulsión, GX = goma

xantana, NCs = nanocápsulas, NE = nanoemulsión, NESF = nanoesferas, Sol = dl--
tocoferol propilenglicol succinato

Las muestras tratadas con nanocápsulas y nanoesferas mostraron pocas

variaciones en el contenido de fenoles totales, debido probablemente a que estos
no entraron en contacto con las enzimas PFO, por lo que se puede suponer que la
utilización de sistemas de talla submicrónica contribuye a modificar el metabolismo
de las células superficiales de manzana Red Delicius, lo que contribuye a
disminuir la velocidad de oscurecimiento y al mantenimiento de la calidad del
producto durante el almacenamiento, prolongando su vida útil a más de 15 días de
almacenamiento. La nanoemulsión presentó variaciones de entre (440 a 410 mg

106
UAG/g de muestra, las cuales pueden ser atribuidas a la presencia de los
surfactantes Tween® y Span® (ingredientes estabilizantes incluidos en esta
formulación) ya que estos estabilizantes tienen un efecto sobre las membranas
celulares adyacentes que provocan la liberación de polifenoles y por ende este se
cuantifica como un incremento (Sapers et al., 1989). Las manzanas tratadas con la
emulsión mostraron un incremento en el contenido de polifenoles totales después
de 5 días de almacenamiento, mostrándose pocas variaciones a partir de este
momento.

7.3.8 Actividad fenilalanin amonioliasa (PAL) en manzana

Una vez analizados los resultados correspondientes a los cambios en índice

de oscurecimiento, actividad PFO y los cambios en polifenoles totales, se decidió
determinar la actividad de PAL; sin embargo, únicamente se consideraron para
esta evaluación los sistemas de talla submicrónica puesto que estos mostraron
una mayor eficiencia en la disminución del índice de oscurecimiento, incremento
de vida útil y cambios en actividad enzimática, contrastándose con el
comportamiento para las muestras con goma xantana y aquellas sin recubrimiento
(control). En la Figura 7.32 se muestran los resultados obtenidos para la actividad
de PAL.

40
35
30
Actividad (µmol/g h)

25
20
15
10
5
0
-5 0 5 10 15 20
Tiempo de almacenamiento (días)

NE NCS NESF GX Control

Figura 7.32 Actividad fenilalanin amonioliasa en manzanacon durante

almacenamiento. NE = nanoemulsión, NCS = nanocápsulas, NESF = nanoesferas,
GX = goma xantana.

107
 La actividad PAL se ve incrementada considerablemente en aquellos frutos
que han tenido heridas como las que presentan los frutos frescos cortados durante
su transformación, siendo un factor importante a controlar con la finalidad de
limitar el oscurecimiento enzimático e incrementar la vida útil del fruto (Hisaminato
et al., 2001; Choi et al., 2005). La actividad PAL tiene un comportamiento
parabólico para el caso del control y de la goma xantana, tal y como ha sido
reportado en otros estudios donde se observa este comportamiento, además de
que una vez obtenido el máximo la actividad disminuye debido a una inactivación
por acumulación de polifenoles (Puschmann et al., 2007). La actividad PAL se
incrementó a razón de 2.33 dias-1 en la manzana control, lo que implica que no
existió protección sobre las heridas generadas durante el corte (cicatrización del
tejido) (Pereyra et al., 2005). Asociada también con el incrementó en el índice de
oscurecimiento (Figura 7.20), ya que la actividad PAL se ve estimulada cuando
hay reacciones de oscurecimiento (Pérez-Cabrera et al., 2003). La actividad PAL
fue menor que para las muestras control cuando se empleó goma xantana como
recubrimiento, este comportamiento es atribuido al efecto protector del
recubrimiento que disminuye la disponibilidad de oxígeno provocando una menor
velocidad enzimática. Por otro lado, la menor actividad PAL la presentaron las
muestras de manzana tratadas con nanocápsulas, lo que se asocia a la inducción
de la cicatrización en la superficie de la manzana. De acuerdo con Choi et al.
(2005), los fenoles resultantes de la actividad PAL son retenidos en las vacuolas y
participan en las reacciones de oscurecimiento solo cuando la alteración de las
membranas permite a los sustratos mezclarse con las enzimas, por lo que es
posible plantear que las nanocápsulas no permitieron modificaciones en la
membrana celular de tal forma que la acción antioxidante del dl--tocoferol fue
efectiva para la estabilidad celular, aunado a la distribución homogénea de los
sistemas de talla submicrónica en la superficie del fruto. La actividad de este
recubrimiento es consistente con los resultados obtenidos para índice de
oscurecimiento, actividad PFO y el contenido de fenoles mostrados en las Figuras
7.20, 7.28 y 7.30. También se resalta que las nanoesferas tuvieron un efecto
protector, atribuible como se había mencionado a los grupos carboxilo terminales

108
que proveen un efecto sobre la disminución de la actividad PFO por modificación
del pH, lo que impide el desarrollo de oscurecimiento, además de que al ser un
polímero que se degrada lentamente aunado a la modificación de la permeabilidad
al oxígeno en la superficie del fruto, limitando su intercambio con el ambiente
(Sinha et al., 2004).

109
Etapa 2. Aplicación de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) en frutos de
guayaba.

En esta etapa se desarrolló un recubrimiento alimenticio a base de

nanopartículas lipídicas sólidas y explorar su aplicación en la conservación de
guayaba Media China. Previo a su aplicación, se determinaron las condiciones de
preparación óptimas para obtener dispersiones de talla submicrónica. Una mezcla
de cera de carnauba y candelilla (cera candeuba) fue utilizada como lípido sólido
modelo por sus propiedades físicas y químicas (Bosquez-Molina et al., 2003). El
alcohol polivinílico (PVAL) se eligió por sus propiedades estabilizantes (Baker et
al., 2012). Las NLS preparadas bajo diferentes condiciones fueron analizadas en
su tamaño de partícula, PDI y ζ a fin de de generar dispersiones de talla
nanométrica y buena estabilidad.

7.4. Establecimiento de condiciones de preparación de las NLS

Las NLS fueron preparadas por el método de homogenización en caliente

(Camacho, 2010) utilizando un sistema rotor-estator de alta fuerza de corte
Ultraturrax ®. La determinación del número de ciclos de homogenización utilizados
fue establecida en función al tamaño de partícula e PDI obtenidos.

7.4.1. Tamaño de partícula

La Figura 7.33 muestra la relación del tamaño de partícula en función de

número de ciclos (10,000 rpm/5 min) empleados. Para los primeros dos ciclos se
obtienen dispersiones con una amplia distribución de tamaño de partícula con
comportamiento multimodal con más de dos poblaciones. Estas dispersiones
tendieron rápidamente a la agregación e inestabilidad física. A partir del tercer
ciclo se obtuvieron dispersiones nanométricas con comportamiento que se ajustó
a una distribución normal. El ANOVA no indicó diferencias significativas (= 0.05)
en el tamaño medio de partícula después del tercer ciclo de homogenización. De
acuerdo con Mora-Huertas et al. (2010) el tamaño de partícula es un parámetro
crítico para este proceso pues determina las capacidades (micro- o nano-) del
método, reproducibilidad y probable escalamiento, además está directamente
vinculado a la estabilidad, la captación celular, la biodistribución y la liberación de

110
sustancias activas y/o funcionales. Por ello se decidió usar tres ciclos de
homogenización (10,000 rpm por 5 min con tiempos de reposo entre ciclo y ciclo
de 5 min) que garantizaron la obtención de partículas de talla nanométrica con
buena estabilidad durante un mes a temperatura ambiente.

14
Ciclo1
Ciclo 2
12 Ciclo 3
Ciclo 4
Ciclo 5
10
% Intensidad

0
10 100 1000 10000
Tamaño de Partícula (nm)

Figura 7.33 Distribución del tamaño de partículas de NLS en relación a los ciclos de
homogenización.

7.4.2 Índice de polidispersión (PDI)

De acuerdo con Awad et al. (2008) un PDI ≤ a 0.2 garantiza la estabilidad

del sistema ya que disminuye la probabilidad de cambio del tamaño de partícula
en corto tiempo. En el desarrollo de las NLS se observó que en el primer ciclo el
PDI fue de  1.0 y en el segundo de 0.67, lo que presupone la formación de un
sistema inestable que muy probablemente no permitirá mantener en dispersión las
partículas de talla submicrónica por tiempos prolongados. Para el tercer ciclo el
PDI mostró valores promedio de 0.18. Este comportamiento sugiere un máximo
efecto turbulento en este ciclo que se refleja en una distribución nanométrica
unimodal estrecha. La talla de partícula se incrementó hasta 0.35 para los últimos
ciclos de homogenización. Lo que indicó que no fue posible disminuir más el
tamaño de partícula, el incremento en el PDI puede atribuirse a que el exceso de
energía es absorbida en la superficie de las partículas a consecuencia del

111
esfuerzo mecánico, lo que provoca modificaciones en la distribución del tamaño de
partícula y en la amplitud de las mismas (Xu y Zang, 2009).

7.4.3 Potencial zeta (ζ)

Como se indicó en la primera etapa, el ζ es un factor predictivo de la

estabilidad física de una dispersión. Expresa la carga superficial de las partículas
en dispersión y considera los efectos de todos los constituyentes del medio.
Cuanto más alejado se encuentre de cero, el sistema tendrá menos probabilidad
de fenómenos de separación de fases (agregación, coalescencia, floculación, etc).
En la Figura 7.34 se presentan las variaciones en el ζ por efecto del número de
ciclos de homogenización.

0
-5 1 2 3 4 5 6

-10
-15
Potencial zeta (mV)

-20
-25
-30
-35
-40
-45
-50
Número de ciclos

Figura 7.34 Variación del potencial zeta por efecto del número de ciclos de
homogenización (10,000 rpm/min) para dispersiones de cera de candeuba.

Un ANOVA ( =0.05) demuestra que hubo diferencia estadísticamente

significativa de la media del ζ entre los diferentes ciclos de homogenización. Se
establece que las mayores diferencias se encuentran en el cuarto y quinto ciclo de
homogenización, aparentemente la energía absorbida provoca una
desestabilización del sistema disminuyendo la energía superficial lo que induce
una disminución del ζ, razón por la que se decidió preparar las NLS con 3 ciclos
de homogenización a alta velocidad de corte.

112
7.5. Desarrollo del recubrimiento con NLS

Después de analizar bibliográficamente (Tapia et al, 2007; Rojas-Graü et

al., 2008; Tapia et al., 2008) diferentes posibilidades de recubrimientos en
particular con polisacáridos y a partir de la experiencia con trabajos previos dentro
de nuestro grupo (Zambrano-Zaragoza et al., 2010), se decidió desarrollar un
recubrimiento que tuviera como base goma xantana y NLS. La goma xantana es
un polisacárido de baja viscosidad, capaz de dar brillantez, transparencia y
mantenimiento de componentes aromáticos (sin limitar la transpiración del fruto)
cuando se utiliza en recubrimientos para frutas, (Chen y Nussinovitch, 2000;
Jouquad et al., 2008). Para evaluar el efecto de la temperatura sobre la formación
del recubrimiento y considerando que las temperaturas a las que se aplican
oscilan para el caso de guayaba entre los 10 y 20 ºC se decidió evaluar la
cantidad de recubrimiento en función a estas temperaturas, considerando además
el empleo de propilenglicol como plastificante (0.5 %), como criterio de decisión
para aplicar los recubrimientos en la superficie del fruto.

La Figura 7.35 presenta la cantidad de recubrimiento retenido (g de

goma/cm2 de piel) para las diferentes concentraciones de goma xantana (0.3, 0.4
y 0.5 %) a dos temperaturas (10 y 20 ºC) y con o sin uso de plastificante. Se
observa que la utilización de plastificante y aumentar la concentración de goma
xantana se incrementa la deposición de recubrimiento en el fruto. Los resultados
confirman que la adición de plastificante ayuda a homogenizar la distribución del
recubrimiento formando una película flexible de menor espesor por lo que la
cantidad de recubrimiento retenida en el fruto es menor. Los plastificantes
hidrofílicos reducen la longitud de la cadena del polímero debido a que modifican
las interacciones para la formación de los puentes de hidrógeno, incrementando el
espacio intermolecular con lo que se logra mayor homogeneidad del recubrimiento
garantizando una mejor distribución sobre la superficie del fruto (Talens y Krochta,
2005).

Los resultados del análisis multifactorial muestran que hubo diferencia

estadísticamente significativa ( = 0.05) en la retención del recubrimiento en el

113
fruto debido a la utilización de plastificante y como una función de la concentración
de goma xantana. Existiendo una interacción entre la concentración de goma, y el
plastificante, lo que disminuye el efecto de la temperatura en la homogeneidad y
cantidad de recubrimiento retenido.

0.2
0.18
0.16
0.14
g de goma/cm2

0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0.3 0.4 0.5
% Goma Xantana

10 ºC sin propilenglicol 20 ºC sin propilenglicol

20°C/0.5 % propilenglicol 10°C/0.5 % propilenglicol

Figura 7.35 Efecto de la temperatura de aplicación, concentración de goma xantana

y uso de plastificante (propilenglicol) sobre la cantidad de recubrimiento
depositado en el fruto

7.5.1. Estabilidad de los recubrimientos de NLS/goma xantana

La estabilidad al almacenamiento de los recubrimientos desarrollados se

llevó a cabo para determinar si la adición de goma xantana y plastificante al
sistema tuvo algún efecto sobre el comportamiento del tamaño de partícula, PDI y
ζ de las NLS. Se estudiaron las diferentes concentraciones de NLS a utilizar como
recubrimiento.

La Figura 7.36 representa la distribución de tamaños de partícula de los

recubrimientos con diferentes proporciones de NLS, las concentraciones de goma
xantana (0.4 %) y propilenglicol (0.5 %) se mantuvieron constantes en todas las
formulaciones.

114
 20
Variable
80 % NLS
75 % NLS
70 % NLS
15 65% NLS
60 % NLS
NLS
% volumen

10

10 100 1000 10000

Diámetro de partícula (nm)

Figura 7.36. Distribución del tamaño de partícula de los recubrimientos con

diferentes concentraciones de NLS y concentración constante de 0.4 % de goma
xantana y 0.5 % de propilenglicol comparadas con NLS solas.

Las NLS sin goma xantana tuvieron un tamaño de partícula promedio de

210 nm no observándose diferencias significativas en la media del tamaño de
partícula por efecto de la adición de goma xantana y plastificante obteniéndose
tamaños promedio de 204 a 240 nm. En la Figura 7.36 se aprecia también que no
existieron variaciones significativas en el PDI ya que la amplitud de la distribución
no se vio modificada significativamente.

Los resultados obtenidos para el PDI son resumidos en el Cuadro 7.6,

siendo importante resaltar que los valores de PDI fueron menores a 0.3, con lo
que fue posible establecer que la distribución de tamaño de partícula es
homogénea (Zigoneau, 2008).

En el mismo Cuadro 7.6 se presentan los resultados de ζ para los

recubrimientos con diferentes concentraciones de NLS, las mediciones se
realizaron 24 h después de la preparación de las dispersiones.

115
 Cuadro 7.6 Caracterización inicial de muestras NLS-
goma xantana.
Muestra PDI ζ(mV)
a
NLS 0.25 ± 0.01 -38.9 ± 1.3a
80 % NLS 0.22 ± 0.06a -43.2 ± 1.6b
75 % NLS 0.26 ± 0.02a -47.2 ± 2.7c
70 % NLS 0.26 ± 0.03a -49.4 ± 2.4c
65 % NLS 0.25 ± 0.16a -43.2 ± 2.0b
60 % NLS 0.22 ± 0.01a -38.4 ± 1.6a
Letras iguales muestran que no existe diferencia estadísticamente
significativa ( = 0.05)

El ζ se ve ligeramente afectado por la adición de goma xantana, sin que

por ello signifique que el sistema tenga mayor probabilidad de formar agregados
ya que el ζ fue menor a -30 mV, por lo que se garantiza que el sistema presenta
estabilidad física en dispersión (Schramm, 2005).
7.5.1.1. Tamaño de partícula e PDI durante el almacenamiento

Puesto que parte de la inestabilidad de los sistemas se ve reflejada por los

cambios en el tamaño de partícula, la Figura 7.37 muestra el comportamiento de
las suspensiones de NLS en función a la concentración y tiempo de
almacenamiento.

Aunque hubo una tendencia de incremento en el tamaño de partícula a

través del tiempo, el intervalo de tamaños fue de 210 hasta 265 nm dependiendo
de la concentración de NLS. Resaltándo que las muestras con goma xantana
tienen un tamaño de partícula ligeramente menor que el de las NLS sin goma
xantana, esto es atribuido a que durante la incorporación de la goma xantana fue
necesario llevar a cabo una homogenización a 10,000 rpm, lo que contribuyó a
darle homogeneidad al sistema.

116
 270

260

Tamaño de partícula (nm)

250

240

230

220

210
Semanas 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
% NLS 60 65 70 75 100

Figura 7.37 Variación del tamaño de partícula en función al tiempo de

almacenamiento y % deNLS a una concentración constante de 0.4 % de goma
xantana.

La estabilidad física de las nanopartículas lipídicas sólidas está en función

de dos factores: la capacidad de la suspensión a permanecer dispersa
homogéneamente (fenómenos electrocinéticos) y no presentar fenómenos de
cristalización (polimorfos) (Weiss et al., 2008). Las muestras con 60, 65 y 70% de
NLS se mantienen estables en cuanto al tamaño de partícula durante las primeras
cinco semanas, presentando un discreto incremento de 9 nm en promedio, lo cual
no ocurrió para las concentraciones de 75%. Es importante destacar que el
tamaño de partícula está íntimamente ligado al PDI debido a que al disminuir el
tamaño de partícula la superficie de contacto de las partículas se reduce y se evita
su aglomeración (Jiménez et al., 2009).

El PDI presentó variaciones de entre 0.22 y hasta 0.35 durante las 8

semanas en las que se evaluó, lo que implica que las muestras no sufrieron
modificaciones considerables en cuanto a la amplitud en la distribución de
tamaños de partícula.

7.5.1.2. Cambios de ζ durante almacenamiento

La Figura 7.38 muestra la variación del ζ durante el almacenamiento. El ζ

no mostró variaciones respecto a la concentración de NLS dentro de una misma

117
concentración de goma en el sistema, Aunque a medida que aumento el % de
NLS se obtuvieron mayores valores del potencial. Por lo que se puede mencionar
que las características de carga de los grupos carboxilo de la goma xantana
contribuyen a darle mayor estabilidad al sistema (Radomska-Soukharev, 2007).

-30

-35
Potencial zeta (mV)

-40

-45

-50

-55
Semanas 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
% NLS 60 65 70 75 100

Figura 7.38 Variaciones el potencial zeta durante el almacenamiento de NLS con

concentración constante de goma xantana (0.4%) y propilenglicol (0.5%).

El ANOVA, mostró diferencias estadísticamente significativas del ζ por

efecto de la adición de goma xantana y plastificante a la formulación, sin que por
ello implique que el sistema sea inestable puesto que este fue de entre -35 a -50
mV dependiendo del % NLS. Probablemente debido a las propiedades
interfaciales que presentan ambos componentes, el propilenglicol y goma xantana.
La disminución del potencial no pone en riesgo la estabilidad física de la
dispersión, y por ello no se observaron fenómenos de agregación visibles durante
las 8 semanas en que se monitoreó el comportamiento de las dispersiones. El
mayor valor de ζ fue para las suspensiones con menor proporción de NLS, este
comportamiento puede ser atribuido a un mayor efecto de los grupos carboxilo de
la goma xantana y al efecto del polietilenglicol que interactúa con los puentes de
hidrógeno, provocando una disminución en el ζ cuando él % de NLS aumenta.

118
Con los valores de potencial obtenidos para todos los recubrimientos es posible
suponer que los sistemas se mantuvieron estables durante el almacenamiento
(Noriega-Peláez et al., 2011; Zambrano-Zaragoza et al., 2011).

7.6. Caracterización Superficial de NLS

La Figura 7.39 muestra las observaciones en microscopía electrónica de

barrido de las suspensiones de NLS con 10 % de cera de candeuba.

Figura 7.39 Micrografías de Nanopartículas Lipídicas Sólidas de cera candeuba

(suspensión al 10 %).

Las partículas se mostraron de forma esférica regular con superficie no

porosa, de talla submicrónica cuya magnitud y distribución se correlaciona con los
datos obtenidos y discutidos en el tamaño de partícula obtenido por el método de
dispersión de luz.

7.7. Calidad visual del Fruto durante el desarrollo experimental

La Figura 7.40 muestra fotos representativas del aspecto del recubrimiento

sobre guayaba en función a la concentración de goma xantana con plastificante.
La elección de la concentración más adecuada de goma xantana a utilizar se
realizó tomando en cuenta el aspecto visual y la cantidad de recubrimiento
retenido en la superficie del fruto.

119
 Figura 7.40. Fotos de los recubrimientos con goma xantana/plastificante. a)
0.3 % goma xantana, b) 0.4 % goma xantana y c) 0.5 % goma xantana aplicados a
20ºC. d) solubilización del recubrimiento en agua

En la Figura 7.41 se presentan las fotografías tomadas a guayabas

tratadas con una formulación que contenía 60 % de una suspensión inicial de NLS
(10 % de cera de candeuba), entre 0.3 y 0.5 % de goma xantana y 0.5 % de
propilenglicol.

Se aprecia que a concentraciones de 0.5 % de goma xantana, la

viscosidad del sistema aumenta debido a la presencia de las NLS, dando como
resultado un recubrimiento de mayor espesor (visualmente perceptible). Este
comportamiento nos sugiere que este recubrimiento podría limitar el intercambio
gaseoso entre el ambiente y el pericarpio del fruto, disminuyendo con ello la
disponibilidad de oxígeno y transpiración del fruto, por lo que esta concentración
de goma xantana fue descartada. Considerando el resto de las concentraciones
experimentadas se eligió una concentración de 0.4 % de goma xantana.

120
Figura 7.41 Distribución de recubrimientos con diferentes concentraciones de goma
xantana, 60 % NLS y 0.5 % de propilenglicol a) 0.3 % de goma xantana, b) 0.4 % de
goma xantana, c) 0.5 % de goma xantana.

7.7.1 Aspecto visual de guayaba previó a la aplicación de los

recubrimientos

Previo a la aplicación de los recubrimientos se llevó a cabo la

caracterización y homogenización inicial del lote de guayaba adquirido. Las
guayabas fueron divididas en 6 lotes para la aplicación de los recubrimientos, se
muestrearon 45 guayabas de cada lote para evaluar la homogeneidad en tamaño.
La Figura 7.42 muestra el aspecto visual que resalta el color y tamaño promedio
de las guayabas utilizadas para llevar acabo la experimentación y que mostraron
un diámetro promedio de 4.44 cm.

121
 Figura 7.42 Guayaba variedad Media china al inicio de la experimentación con
diámetro promedio de 4.44 cm.

7.7.2 Cambios en calidad visual de guayaba durante el almacenamiento

La Figura 7.43 muestra los cambios en el aspecto visual de los frutos de

guayaba tratados con NLS (a base de cera de candeuba) a diferentes
concentraciones durante el almacenamiento a 8 ºC. Las muestras control
mostraron senescencia después de dos semanas de almacenamiento; mientras
que las tratadas con goma xantana sin NLS retrasaron el desarrollo de color
durante tres semanas de almacenamiento; y los otros frutos tratados con 60% de
NLS mostraron un retraso de cambio de color más prolongado indicando que la
incorporación de NLS tuvo efectos en el proceso de cambio de color. Las
muestras con 75 y 80 % de NLS no mostraron la evolución normal del cambio de
color de la piel indicando una posible alteración fisiológica de los frutos tratados
con esos recubrimientos. Las guayabas con 75 % de NLS mostraron daños
visibles a partir de la tercera semana de almacenamiento. Mientras que en las
muestras con 80 % de NLS, los daños fueron perceptibles desde la primera
semana incrementándose significativamente en la segunda semana.

122
 SEMANA
Tratamiento 1 2 3 4 5

CONTROL

GOMA
XANTANA

60 % NLS

65 % NLS

70 % NLS

75 % NLS

80 % NLS

Figura 7.43 Cambios en el aspecto visual de frutos de guayaba durante el

almacenamiento refrigerado a 8ºC.

123
 Las muestras recubiertas con goma xantana, y 60, 65 y 70 % de NLS no
mostraron diferencias visuales entre ellas durante los primeros 19 días de
almacenamiento con un desarrollo de color amarillo (ángulo Hue de 99) No
obstante, la evolución de este cambio fue más lento que el mostrado por los frutos
control.

En la Figura 7.44 se muestra el aspecto visual de los frutos transferidos de

refrigeración a 8°C y luego transferidos a ambiente (20 °C) por cinco días. Los
frutos control mostraron síntomas de senescencia después de dos semanas de
refrigeración y luego durante cinco días a 20°C; mientras que los frutos con goma
de xantana mostraron esos síntomas después de tres semanas de
almacenamiento refrigerado a 8°C y posteriormente cinco días a 20°C. Los frutos
tratados con cera de candeuba y 60% de NLS retuvieron una mejor condición de
color durante el almacenamiento refrigerado y sus transferencias a 20°C; mientras
que los frutos tratados a partir de 70 % mostraron síntomas de alteraciones
fisiológicas que pudieron ser indicadores de estrés para los frutos.

Por lo tanto desde el punto de vista visual pareciera que la condición de

60% de NLS podría ser una condición más aceptable de uso de estos
recubrimientos.

Las muestras con 60, 65 y 70 % de NLS no revelan diferencia significativa

en aspecto del color durante el periodo de almacenamiento. La mayor retención de
color fue para las muestras con 65 y 70 % de NLS. A pesar de que los
recubrimientos con 60 % de NLS desarrollan una mayor velocidad de cambio de
color y SST, presentaron un menor periodo de vida útil. Por otro lado, la goma
xantana no mostró diferencia estadísticamente significativa respecto a las
recubiertas con NLS a 60 % hasta los 24 días de almacenamiento, a partir de este
momento el fruto sufre cambios rápidamente, considerándose entonces que la
concentración que mejora las características visuales del fruto corresponde al 60
% de NLS.

124
7.8 Observaciones de microscopía electrónica de guayabas recubiertas

En la Figura 7.45 se muestra la morfología del pericarpio de los frutos de

guayaba control (sin recubrimiento).

SEMANA
Tratamiento 1 2 3 4 5

CONTROL

Goma
Xantana

60 % NLS

65% NLS

70 % NLS

75 % NLS

80 % NLS

Figura 7.44 Cambios en el aspecto visual de guayabas transferidas 5 días a

temperatura ambiente después del periodo de almacenamiento refrigerado poner
temperatura 8°C.

125
 Figura 7.45 Micrografía del corte lateral de guayaba sin
tratamientoinmediatamente después de aplicado el recubrimiento .
La distribución del recubrimiento formado con goma xantana sobre el
pericarpio de guayaba se muestra en la Figura 7.46.

Figura 7.46 Micrografía de guayaba con recubrimiento a base de goma

xantana (0.4 %) y propilenglicol (0.5%).

Se aprecia una película continua, lisa, homogénea con pequeñas burbujas

de aire. La formación de una película homogénea permite el control del

126
intercambio de gases de la respiración del fruto a través de la permeabilidad de la
película.

La Figura 7.47 muestra la superficie de las guayabas tratadas con 60 % de

NLS.

Figura 7.47. Micrografía de guayaba con recubrimiento 60 % de NLS, 0.4 %

de goma xantana y 0.5 % de propilenglicol.
Se observa la presencia de pequeñas esferas de talla submicrónica,
presumiblemente las NLS. También es posible apreciar agregados de NLS
alrededor de las lenticelas del fruto. Las lenticelas juegan un importante rol en el
proceso de transpiración e intercambio gaseoso con el medio ambiente, razón por
la que el agua que migra desde el interior a la superficie del fruto ocasiona que el
material hidrofóbico se agregue por afinidad química y por ello la agregación. La
presencia de NLS en estas regiones sugiere modificaciones en el proceso
metabólico del fruto, debido a que el material agregado impide que el oxígeno se
encuentre disponible lo que hace que el fruto cambie su fisiología.

Los recubrimientos con 60 % de NLS retardaron el proceso de maduración

de los frutos, sin agregaciones aparentes, lo que es benéfico para la
comercialización del producto, ya que logró mantener la calidad visual del fruto por

127
30 días. La Figura 7.48 muestra que las NLS se encuentran homogéneamente
distribuidas en la superficie como parte del recubrimiento formado.

Figura 7.48 Distribución de recubrimiento con 60 % de NLS en el pericarpio

de guayaba.

Esta distribución de las NLS posiblemente permita modificar la

permeabilidad de los gases del recubrimiento, contribuyendo con ello a limitar el
intercambio gaseoso y por ende la velocidad de respiración del fruto.

La Figura 7.49 muestra las micrografías del recubrimiento con 65 % de

NLS, en las que se observa una distribución homogénea pero más densa de NLS
en el pericarpio de guayaba, teniendo en apariencia que ver la funcionalidad del
recubrimiento en la conservación, y junto con el de 60 % de NLS fueron los que
tuvieron mejor funcionalidad en la conservación del producto.

128
 Figura 7.49 Micrografía de guayaba con 65 % de NLS, 0.4 % de goma xantana y 0.5
% de propilenglicol.

La figura 7.50 muestra la micrografía correspondiente a guayaba

recubierta con 70 % de NLS.

Figura 7.50 Superficie de guayaba recubierta con 70 % de NLS, 0.4 % de

goma xantna y 0.5 % de propilenglicol.
La Figrua 7.50 muestra una importante acumulación y mayor densidad de
nanopartículas sobre la superficie del recubrimiento, esta distribución podría

129
modificar la disposición de oxígeno y por lo tanto la respiración del fruto, y
probablemente relacionarse con los cambios asociados a la calidad visual de los
frutos tratados con este recubrimiento.

La Figura 7.51 representa la superficie de la guayaba recubierta con 75 %

de NLS.

Figura 7.51 Superficie de guayaba recubierta con 75 % de NLS, 0.4 % de

goma xantana y 0.5 % de propilenglicol.
El aspecto más relevante de estas imágenes es la formación de agregados
de NLS y formación de pequeños espacios donde se observa una mayor cantidad
de cera, los cuales seguramente tuvieron un papel en el desarrollo de los síntomas
de estrés y senescencia de los frutos debido a que estos agregados afectaron
negativamente el transporte de gases del ambiente al fruto y viceversa. Razón por
la que es importante considerar la concentración óptima de NLS de tal manera que
la agregación por efecto de afinidad química no ponga en riesgo el proceso
metabólico del fruto provocando cambios indeseables.

La Figura 7.52, presenta la imagen de guayaba recubierta con un sistema

que contenía 80 % de NLS.

130
 Figura 7.52 Micrografía de guayaba recubierta con 80 % de NLS, 0.4 % goma
xantana y 0.5 % propilenglicol, con agregados de NLS.

Nuevamente en la Figura 7.52 se aprecia de manera evidente la fuerte

agregación y formación de una capa de cera que alcanzo espesores de
aproximados de 13m lo cual seguramente alteró fuertemente la respiración del
fruto.

7.9 Cambios de color en Guayaba recubierta con NLS

El color de la cáscara se relaciona con el ángulo de color Hue, que es una

medida objetiva que expresa las diferencias de color del pericarpio del fruto y una
visualización más precisa de los cambios de madurez. Un valor de 180°
representa un color verde y uno de 90° un color amarillo. Los principales procesos
involucrados en la pérdida de coloración verde durante el almacenamiento son la
degradación de la clorofila y la síntesis de caroteno, siendo esta última uno de los
principales criterios para valorar la maduración de frutas y hortalizas (Gross,
1987). En la Figura 7.53 se muestran los cambios en color asociados al
almacenamiento refrigerado.

131
 120
115
110

Ángulo Hue 105

100
95
90
85
80
75
0 10 20 30 40
Tiempo de almacenamiento (días)
60 % NLS 65 % NLS 70 % NLS
75 % NLS 80 % NLS Xantana
Control
Figura 7.53 Cambios en ángulo de matíz (Hue) en guayaba refrigerada a diferentes
concentraciones de NLS y una concentración constante de 0.3 % de goma xantana
y 0.5 % de propilenlicol.

Los frutos de guayaba con los que se realizó el experimento tenían un

color verde claro (valor de hue 116°), el cual cambio hasta un color amarillo (valor
hue de 90°) a los 22 días de almacenamiento a 8°C. La goma xantana empleada
como recubrimiento retrasó el cambio de color y alcanzó valores similares al
control después de 24 días de almacenamiento (valor hue 93°); de forma similar,
aunque de manera más evidente, las frutos recubiertos con 60 y 65 % de NLS
(con 0.4 % de goma de xantana) retrasaron más su desarrollo de color alcanzando
valores hue de 92 y 94° respectivamente después de 34 días de almacenamiento.
Hasta el día 24 de almacenamiento los frutos con 70 % de NLS mostraron un
retraso en el cambio de color verde claro (116º) a amarillo ( 95º), de forma similar
a la guayaba tratada con 60 y 65 %, sin embargo a partir de los 15 días de
almacenamiento, aparentemente ya no existieron cambios evidentes en el
pericarpio del fruto, asociándose este con daño fisiológico debido a que existió
inhibición del proceso de respiración en el fruto, estos efectos se observaron en la
Figura 7.42, mostrada en páginas anteriores, donde se observa el aspecto visual
del fruto ante los diferentes recubrimientos empleados.

132
 Las guayabas con 75 % de NLS muestran daños visibles a partir de la
tercera semana de almacenamiento. En las muestras con 80 % de NLS, los daños
son perceptibles desde el final de la primera semana incrementándose
significativamente en la segunda.

Las muestras recubiertas con goma xantana, y 60, 65 y 70 % de NLS no

mostraron diferencia estadísticamente significativa hasta los 19 días de
almacenamiento con un desarrollo de color tendiente al amarillo (ángulo Hue de
99) que coincide con el aspecto mostrado en las fotografías. Después de este
tiempo la guayaba recubierta con goma xantana incrementó su velocidad de
maduración para alcanzar su máximo en refrigeración a 8 ºC a los 22 días de
almacenamiento. Por otro lado, las muestras con 70 % de NLS mostraron un buen
desarrollo de maduración hasta la segunda semana de almacenamiento, como lo
muestran las fotografías de la Figura 7.42, sin embargo, después de los 19 días
las muestras tuvieron cambios de color asociados con efectos por acumulación de
CO2 atribuible al desarrollo de algunas daños fisiológicos que promovieron el
desarrollo de manchas cafés y que no permitieron la maduración del fruto.

En la Figura 7.54 se muestra el desarrollo de color expresado en función

al ángulo Hue para las muestras refrigeradas posteriormente 5 días de
almacenamiento a temperatura ambiente (25ºC).

Las muestras control mostraron un cambio de color más rápido en

comparación de los frutos tratados; mientras que los frutos tratados con goma de
xantana mostraron cierto retraso en el cambio de color que se igualó al control al
final del periodo de almacenamiento. Los frutos tratados con goma de xantana
adicionada con 60 y 65 % de NLS no mostraron diferencias significativas entre
ambos tratamientos aunque mostraron un retraso respecto de los frutos control.

Las muestras tratadas con goma de xantana y 75 y 80 % de NLS

mostraron los menores cambios de color durante el almacenamiento. Lo que
indicó una alteración importante del proceso de maduración de los frutos que
permanecieron prácticamente sin cambio respecto del color inicial (116º).

133
 125

120

115

110
Ángulo Hue (°)

105

100

95

90

85

80
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Almacenamiento (dias)

Goma Xantana 60 % NLS 65 % NLS 70 % NLS

75 % NLS 80 % NLS Control

Figura 7.54. Cambios de color de guayabas refrigeradas + 5 días a temperatura

ambiente.

Esto sugiere que una vez que el producto es transferido a temperatura

ambiente, éste no desarrolla cambios de color que puedan ser asociados a la
maduración normal del fruto (Mercado-Silva, 1998). Indicando con esto un efecto
muy fuerte del recubrimiento sobre la fisiología del fruto.

De acuerdo con los datos de calidad visual, imágenes al microscopio

electrónico y cambios de color es posible indicar que los tratamientos de goma de
xantana adicionada con 60 % de NLS pudieran ser consideradas con posibilidades
de aplicación en frutos de guayaba.

134
7.10 Cambios Fisicoquímicos

7.10.1. Pérdida de peso

Una vez aplicados los recubrimientos se tomaron muestras cada tercer día
hasta los 31 días, esto se llevó a cabo tanto para las guayabas refrigeradas como
para aquellas que fueron transferidas a temperatura ambiente.

Uno de los principales problemas durante el almacenamiento de los frutos, es la

pérdida de peso por causa de los procesos de respiración y transpiración debido a
que esto conduce a un ablandamiento de los tejidos y torna al producto más
susceptible a deteriorarse (Baldwin et al., 1999; Azzolini et al., 2005).
La Figura 7.55 muestra la pérdida de peso para guayaba refrigerada a
8ºC, durante el período de almacenamiento y previo a la transferencia del
producto a temperatura ambiente.

De manera lógica, la mayor pérdida de peso (15.6%) la presentaron los

frutos control o no recubiertos los cuales mostraron velocidades promedio de
pérdida de peso de 0.71 g/día (R2 = 0.91). Los frutos recubiertos con goma de
xantana sin adición o con adición de 75 y 80% de NLS tuvieron pérdidas de peso
similares entre sí pero ligeramente menores que el grupo control (12.9, 12.6 y 12.4
%). A estos tratamientos le siguieron los tratados con 65 y 70% de NLS los cuales
alcanzaron una pérdida de peso de 9% y los frutos tratados con 60% alcanzaron
pérdidas de peso de 7.7%, no obstante su velocidad de pérdida promedio fue muy
parecida (0.24 g/día) aunque el tratamiento con 60% de NLS mantuvo valores más
bajos durante el almacenamiento.

Para el caso de la goma xantana que mostró una pérdida de peso alta, se
puede atribuir que esa pérdida de peso fue debida a la naturaleza hidrofílica de la
goma lo que conlleva a adsorber más moléculas de agua del fruto, las cuales son
transportadas y liberadas al ambiente exterior ocasionando una alta pérdida de
peso (García et al., 2000). Según Perez-Gago (2003), los recubrimientos de
polisacáridos y de proteínas, debido a su naturaleza hidrofílica, forman una barrera
poco efectiva al agua.

135
 18

16

14
% Pérdida de peso
12

10

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40

Tiempo de almacenamiento (días)

60 % NLS 65 % NLS 70 % NLS
75 % NLS 80 % NLS Goma Xantana
CONTROL

Figura 7.55 Pérdida de peso de guayaba refrigerada a 8ºC durante almacenamiento.

Se esperaba que los tratamientos con adición de NLS controlaran la

pérdida de peso de manera proporcional al contenido de NLS; no obstante y de
manera interesante, esto no ocurrió ya que las de menor contenido de NLS
mostraron las menores pérdidas de peso. Aunque no se tienen datos para explicar
este comportamiento, es probable que al aumentar la densidad de NLS sobre la
superficie de los frutos, además de la formación de agregados de los mismos, se
formó una película que dificultó el paso de oxígeno al interior de fruto lo cual
generó un ambiente anaerobio que indujo posiblemente la respiración anaerobia lo
cual llevó a un consumo acelerado de sustratos en el tejido y por tanto una mayor
pérdida de peso. Es factible que este mismo fenómeno explique los cambios
anómalos de color para estos recubrimientos. Bajo esa misma explicación, la
posibilidad que los recubrimientos de menor proporción de NLS actuaran como
barreras de humedad (disminuyendo la pérdida de agua) limitando en menor
proporción el intercambio de gases lo cual posiblemente evitó las condiciones de
anaerobiosis y por tanto un mayor consumo de sustratos. Banks et al. (1993)
resaltaron la importancia de relacionar la pérdida de masa fresca a las condiciones

136
de maduración de frutos puesto que la barrera al vapor de agua está en relación
con la salida de gases, lo que ocasiona estrés biótico al proceso de maduración y
anaerobiosis.

Se ha documentado que el empleó de ceras contribuye a disminuir la

pérdida de peso. Saucedo-Pompa et al., (2009) propusieron un recubrimiento a
base de cera de candelilla para aguacate, observando que la pérdida de peso fue
de 13.5 % después de 8 días de almacenamiento. Nuestros resultados soportan la
hipótesis que las NLS a concentraciones de entre 60 y 65 % limitan la pérdida de
peso a un mínimo del 7.7 %.

En la Figura 7.56 se muestran los cambios asociados a la pérdida de peso

durante el tiempo que los frutos transferidos permanecieron en almacenamiento.

La tendencia de las muestras con 80 % de NLS es a incrementar la

pérdida de peso a temperatura ambiente, siendo esta superior, en algunas etapas,
a las del control. Se especula que a esta concentración de NLS la guayaba se
afecta fisiológicamente lo que provoca un incremento en la transpiración y por
ende una mayor pérdida de peso. Las muestras transferidas a temperatura
ambiente con 60 y 65 % de NLS mostraron una evolución de maduración
correspondiente a la guayaba sin cambios o modificaciones que hicieran inferir
daño fisiológico.

Es necesario resaltar que las muestras con 60 y 65 % de NLS no

mostraron diferencia estadísticamente significativa (= 0.05) respecto a la pérdida
de peso con 9.5 % durante el total del periodo de almacenamiento, lo que implica
que los sistemas con estas concentraciones de NLS parecieran tener un efecto
positivo en cuanto al intercambio de vapor de agua de las frutas almacenadas en
refrigeración.

De acuerdo con los resultados obtenidos es posible afirmar que los

sistemas de talla submicrónica contribuyen a disminuir la pérdida fisiológica de
peso con un recubrimiento homogéneamente distribuido en la superficie del fruto.
En este sentido, se ha confirmado por numerosos estudios que los recubrimientos

137
contribuyen a disminuir la pérdida de agua en guayaba (Pal et al., 2004; Singh y
Pal, 2008).

20

15
Pérdida de peso (%)

10

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40

-5
Tiempo de almacenamiento (días)

60 % NLS 65 % NLS 70 % NLS 75 % NLS

80 % NLS Xantana CONTROL

Figura 7.56 Pérdida de peso en guayaba transferida a temperatura ambiente

después del periodo correspondiente de refrigeración.

Generalmente la pérdida de peso es debida a la modificación en la

permeabilidad al vapor de agua en el pericarpio del fruto (Singh et al., 2008) y a la
degradación de algunos compuestos químicos debido a la actividad fisiológica
como el almidón a azúcares (Bashir y Abu-Goukh, 2003). De acuerdo a la FDA, la
pérdida de peso del fruto no debe ser mayor al 8% durante el almacenamiento. La
menor disminución en el contenido de humedad de las muestras recubiertas con
respecto al control puede justificarse por la naturaleza hidrofóbica del
recubrimiento, el cual actúa como barrera al agua y presenta mayor eficiencia en
la retención (Garcia-Ochoa et al., 2000; Baldwin et al., 1995). La pérdida de peso
en las muestras a temperatura ambiente es mayor a las que se encuentran en
refrigeración debido a los cambios en la velocidad de evaporación del agua en la
superficie del pericarpio y modificación en la actividad respiratoria del fruto por
efecto de la temperatura, tal y como lo reporta Castellano et al. (2005), donde las

138
muestras control tuvieron una pérdida de peso de 16-18%, las muestras de esta
experimentación perdieron el 20 % aproximadamente al día 30. Es claro que el
uso de altas temperaturas contribuye a acelerar los procesos metabólicos y por
ende la velocidad de respiración aumentando la presión parcial del O 2, como se ha
reportado para aguacate cubierto con una película de polietileno de baja densidad
(Zarazúa-Escobar et al., 2005).

7.10.2. Cambios en Sólidos Solubles Totales (SST)

En la Figura 7.57 se muestran los cambios en SST que tuvieron las

muestras de guayaba tratadas con distintos recubrimientos y almacenadas a 8°C
durante 31 días.

13

12

11

10

8
SST

5
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo de almacenamiento (días)

60 % NLS 65 % NLS 70 % NLS 75 % NLS

80 % NLS Xantana Control

Figura 7.57 Cambios en sólidos solubles totales en guayaba refrigerada a 8ºC con
recubrimientos a diferentes proporciones de NLS, goma xantana (0.4 %) y
propilenglicol (0.5 %).

Las guayabas control alcanzan su máximo contenido de SST (11.9%) a

los 15 días de almacenamiento y disminuyen a partir de este tiempo. Este
decremento posterior puede estar asociado al proceso de senescencia del fruto;
como lo muestran las imágenes de calidad visual descritas en el inicio de la

139
descripción de estos resultados y concuerda con los valores anotados por
Mercado-Silva et al. (1998) en frutos de guayaba de esta misma variedad. Las
muestras con 60 y 65 % de NLS retrasaron el incremento en el contenido de
sólidos solubles alcanzando valores similares al control después de 26 días de
almacenamiento lo cual parece indicar que estos tratamientos modularon el
metabolismo de los frutos. Por lo que el cambio en la concentración de gases en la
superficie del fruto modifica el intercambio gaseoso de tal manera que se logra
retardar la maduración e incrementar el tiempo de vida útil (Singh and Pal: 2008).

Las muestras recubiertas con goma xantana mostraron una evolución

ascendente del contenido de SST hasta el día 26 de almacenamiento alcanzando
una concentración de SST de 12.2, lo que se relaciona con el dulzor desarrollado
por estos frutos. Sin embargo, a partir de este tiempo se inicia la senescencia del
fruto existiendo una disminución en el contenido de SST. Los resultados obtenidos
para los sistemas con concentraciones de 60 y 65 % de NLS fueron los que
mantuvieron mejor las características del fruto con un promedio de SST de 11. Un
incremento en la concentración de NLS, por encima del 75 % puede provocar la
obstrucción de las lenticelas con lo que se propicia la acumulación de metabolitos
y CO2, impidiendo que el fruto lleve a cabo sus procesos fisiológicos y viéndose
reflejado como un daño fisiológico en el fruto.

Los tratamientos de gomas de xantana adicionadas de 70 a 80% de NLS

mostraron una alteración en el proceso de acumulación de SST evidéncialo que
corrobora que efectivamente bajo esas condiciones se propició un estrés
anaerobio que provocó un incremento en el consumo de sustratos (disminución de
SST) y muy probablemente un incremento en la producción de CO 2.

La Figura 7.58 muestra los resultados de los frutos que se almacenaron a

temperatura ambiente durante cinco días después de transcurrido el periodo de
almacenamiento refrigerado correspondiente.

140
 13

12

11

10
SST

6
0 10 20 30 40
Tiempo de almacenamiento (días)
60 % NLS 65 % NLS 70 % NLS 75 % NLS
80 % NLS Xantana Control

Figura 7.58 Cambios en SST para guayabas almacenadas a temperatura de

refrigeración más 5 días a tempertura ambiente.
Las muestras control, mostraron un cambio gradual de los SST hasta los
15 días a medida que transcurrió el almacenamiento. Las muestras con 60 % de
NLS retrasaron el incremento de SST alcanzando un máximo el día 24 con una
velocidad de cambio de 0.17ºBx/día. También se observa que las guayabas con
65 % de NLS y goma xantana muestran un comportamiento similar, aunque
después de 19 días comienza en ambos tratamientos (65 % NLS y goma xantana)
una disminución en sólidos solubles. La muestras con 70% de NLS inicialmente no
tuvieron problemas en el desarrollo de SST (10.3) hasta los 12 y cinco días a
25°C; sin embargo, después de este tiempo disminuyeron drásticamente a un
contenido de SST de 8. Los frutos con 75 y 80 % de NLS mostraron una marcada
alteración del proceso y por tanto en la maduración, este comportamiento puede
ser debido al microambiente generado en interior del fruto no propiciando un
metabolismo normal; por lo que se produjeron cambios fisiológicos indeseables
que se correlacionan con las alteraciones visuales y el cambio de color.

Los SST son una medida directa del contenido de azucares de la

guayaba, pues éstos representan el 85-90% del contenido total de SST en el
producto, por lo que los resultados reflejan los cambios por desdoblamiento de
141
almidones y otros componentes. Los SST varían según la variedad y del tiempo en
que se haya cosechado el producto (Mercado-Silva et al., 1998).

No obstante y a pesar de que existen estudios donde se han aplicado

otros recubrimientos como la goma de mezquite (Tomás et al., 2005) es posible
resaltar que el sistema con 60 % de NLS, logró modificar la atmósfera superficial
limitando el intercambio gaseoso más efectivamente, logrando mantener el
producto por mayor tiempo con un retardo en el máximo climatérico y por ende un
incremento en los SST (Bashir y Abu-Goukh, 2003).

El comportamiento mostrado por los tratamientos a 60 y 65 % de NLS

parece confirmar que este puede ser un tratamiento adecuado para la
conservación de frutos de guayaba.

7.10.3. Cambios en acidez titulable

En la Figura 7.59 se muestra el comportamiento de la acidez titulable

durante el almacenamiento refrigerado para las diferentes muestras tratadas con
NLS y contrastadas con el empleo de goma xantana y aquellas que no fueron
recubiertas (control).

Las muestras control disminuyeron su % de acidez desde 0.9 hasta 0.5

durante los primeros 19 días de almacenamiento. Este comportamiento se debe al
proceso de maduración que induce una degradación de los ácidos orgánicos
siendo estos los más importantes de la actividad respiratoria del fruto (Saucedo-
Pompa et al., 2007).

La guayaba tratada con gomas de xantana y 75 y 80 % de NLS también

disminuyeron su contenido de acidez de manera muy similar que otros
tratamientos; no obstante alrededor de los 22 días de almacenamiento, dicho
contenido se incrementó drásticamente. Este comportamiento se asocia a los
desórdenes provocados por efecto del recubrimiento utilizado y la probable
formación de una película que limitó el intercambio de gases. Las muestras con
goma xantana y 60 y 65 % de NLS mostraron una reducción de la acidez hasta los
29 días de almacenamiento con 0.53 % de acidez en promedio. Las muestras
142
tratadas con 60 y 65 % mostraron un ligero incremento (de 0.55 a 0.70 % de
acidez) a partir de los 22 días y hasta los 30 días. Resultados de disminución de
acidez para guayaba durante el almacenamiento han sido reportados por
Castellano et al. (2005); Mercado-Silva et al. (1998) y Jain et al. (2003) han
reportado que la acidez de guayaba disminuye desde 1.2 a 0.58 dependiendo de
la variedad, época del año y estado de madurez inicial. Los resultados reportados
para los recubrimientos con 60 y 65 % de NLS tienen una buena funcionalidad y
potencial tecnológico para ser utilizados en la conservación de guayaba.

1.1

1
% acidez (ácido cítrico)

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo de almacenamiento (días)

60 % NLS 65 % NLS 70 % NLS 75 % NLS

80 % NLS Xantana Control

Figura 7.59 Variación en la acidez titulable durante el almacenamiento refrigerado a

8ºCpara los diferentes recubrimientos.
Como se ha mencionado es importante asociar la funcionalidad del
recubrimiento en conjunto con la refrigeración y con el comportamiento del
producto a temperatura ambiente.

En la Figura 7.60 se muestran las variaciones en la acidez titulable en

muestras refrigeradas más 5 días de transferencia a temperatura ambiente.

143
 1

% Acidez (ácido cítrico)

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4
0 10 20 30 40
Tiempo de almacenamiento (días)
60 % NLS 65 % NLS 70 % NLS 75 % NLS
80 % NLS Xantana Control

Figura 7.60 Cambios de acidez titulable en guayaba refrigerada más 5 días a

temperatura ambiente.

Las muestras con goma xantana y con 60 % y 65 % de NLS no muestran

diferencia significativa en su comportamiento respecto a los cambios en acidez
hasta los 19 días de almacenamiento, tiempo en que se marcan claras diferencias,
ya que las muestras con goma xantana incrementan considerablemente su acidez
de 0.5 % a 0.75 % a los 26 días de almacenamiento. Este resultado confirma que
estas concentraciones de NLS son las óptimas para la conservación de guayaba.

Como era de esperarse y de acuerdo a los resultados ya analizados para

las muestras refrigeradas, las guayabas con 75 y 80 % de NLS y trasferidas por 5
días a temperatura ambiente desarrollaron cambios en acidez con disminución
hasta los 9 días de almacenamiento y aumento de la misma a partir de este
momento lo que se asocia con procesos de respiración anaeróbicos que
provocaron daños fisiológicos en el fruto.

7.10.4. Cambios en firmeza de los frutos

En la Figura 7.61 se presentan los cambios en fuerza de compresión en

función del tiempo de almacenamiento y al tipo de recubrimiento utilizado. El
propósito es asociarlos con las modificaciones que presentó el pericarpio del fruto.

144
 50
45

Fuerza máxima (N)

40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo de almacenamiento (días)
Goma Xantana 60 % NLS 65 % NLS
70 % NLS 75 % NLS 80 % NLS
Control
Figura 7.61 Cambios de textura en guayaba refrigerada a diferentes
concentraciones de NLS, 0.3% de goma xantana y 0.5 % de propilenglicol.

Las muestras con 60 y 65 % de NLS son las que mantuvieron por mayor
tiempo la textura durante el período de almacenamiento refrigerado con una
resistencia a la compresión de 15.6 N a los 30 días, no perdiendo más del 24 % de
la firmeza durante los primeros 22 días. En este sentido, Pal et al. (2004)
reportaron una disminución de la firmeza durante el almacenamiento refrigerado
de guayabas recubiertas con cera comercial o polietileno, concluyendo que existe
menor pérdida de firmeza en las muestras recubiertas que con el control el cual
mostró una considerable pérdida de textura a los 7 días de almacenamiento.
Nuestros controles tuvieron un comportamiento similar en relación a la resistencia
a la compresión que paso de 40.8 a 16.7 N en 8 días, es decir una pérdida del 59
%, respecto a la firmeza inicial. La pérdida de firmeza en los productos
hortofrutícolas es directamente proporcional al grado de madurez del producto
(Toivonen et al., 2008). Esto es debido a la actividad de enzimas hidrolizantes
como la poligalacturonasa y pectinmetilesterasa que promueven la solubilización
de las pectinas constituyentes de la pared celular (Azzolini y Jacomino, 2004). La
pérdida de firmeza también es atribuible a la pérdida del agua de la pared celular
(Jain et al., 2003).

145
 Es importante resaltar que las muestras con 70, 75 y 80 % mostraron un
comportamiento variable y dependiente de la concentración de NLS, En general la
resistencia a la compresión fue menor que los tratamientos de 60 a 70% de NSL
esto puede ser explicado por la mayor pérdida de peso ya discutida anteriormente
además de una actividad metabólica alterada que llevó a un mayor consumo de
SST y probablemente a un mayor agotamiento de los tejidos.

Las muestras recubiertas con goma xantana, a pesar de presentar un

buen aspecto hasta los 19 días de almacenamiento, el carácter hidrofílico de este
material propició una mayor pérdida de peso lo cual también explica la menor
resistencia a la compresión el cual fue similar al mostrado por los frutos tratados
con 70 y 80% de NLS pero fueron diferentes de las muestras recubiertas con 60 y
65 % de NLS.

Estos datos muestran nuevamente que los recubrimientos de goma de

xantana con 60 o 65 % de NLS tienen un uso potencial para la conservación de
los frutos de guayaba.

En la Figura 7.62 se muestran los cambios de textura de las muestras

transferidas a temperatura ambiente durante 5 días después de concluido el
periodo de almacenamiento refrigerado correspondiente.

Todos los tratamientos mostraron una disminución de la resistencia a la

compresión sin poder indicar diferencias claras entre los diferentes tratamientos,
No obstante, el tratamiento con 65% de NLS mantuvo una mejor resistencia hasta
los 17 días de almacenamiento. Lo anterior indica que son necesarios más
estudios para mejorar la resistencia del fruto a través de estos tratamientos.

146
 25

20

Firmeza (N)
15

10

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo de almacenamiento (días)

60 % NLS 65 % NLS 70 % NLS 75 % NLS

80 % NLS Xantana Control

Figura 7.62. Cambios de firmeza de guayabas refrigeradas + 5 días a temperatura

ambiente.

147
 VIII CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos de la presente investigación, se pueden
anotar las siguientes conclusiones:

Se estableció que el método de emulsificación-difusión es una excelente

opción para preparar nanocápsulas utilizando ingredientes alimenticios con
amplias posibilidades de aplicación en tecnología de alimentos, debido a su
estructura capsular que fue confirmada por tamaño de partícula, densidad y
microscopía electrónica de barrido.

Los sistemas nanopartículados desarrollados (nanocápsulas y nanopartículas

lipídicas sólidas) permitieron elaborar un recubrimiento estable al almacenamiento,
demostrando efectividad en la conservación de manzana fresca cortada y
guayaba.

La aplicación de nanopartículas de 250 nm y ζ  -40 mV a rebanadas de

manzana retrasó los cambios de color, la producción de fenoles, y controló la
actividad enzimática asociada al proceso de oscurecimiento, abriendo una
posibilidad para incrementar la vida útil de frutos.

La aplicación de nanocápsulas y nanoesferas permitió controlar de manera

notable la exudación del tejido de manzana, constituyendo esto una notable
mejora en el proceso de elaboración de manzana fresca cortada, abriendo la
exploración a otro tipo de frutos y mostrando nuevamente las posibilidades de
aplicación de nanopartículas en la conservación de frutas.

El desarrollo de recubrimientos con nanopartículas lipídicas sólidas al 60 %,

0.4 % de goma xantana y 0.5 % de propilen glicol, permitieron controlar la pérdida
de peso, retrasar el proceso de maduración del fruto y mantener por mayor tiempo
la firmeza de los frutos, lo que parece indicar un procedimiento con amplias
posibilidades de alargar la vida útil de frutos de guayaba.

Con estos hallazgos fue posible corroborar la hipótesis planteada, estableciendo

que los sistemas de talla submicrónica tienen amplias posibilidades de aplicación
en el área de conservación de frutas frescas enteras y cortadas, así como su
aplicación a diversas áreas del procesamiento y conservación de alimentos.

148
 IX REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS
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