Persistence and Transferability of Noroviruses on and between

Common Surfaces and Foods (Persistencia y transferibilidad de

los norovirus en y entre las superficies y alimentos comunes)
RESUMEN
Los norovirus humanos (HuNoV) son la principal causa de enfermedades transmitidas por
los alimentos, y las malas prácticas de higiene personal de los trabajadores infectados son
el modo más común de contaminación. El propósito de este estudio fue caracterizar la
persistencia y transferibilidad de los norovirus representativos del virus de Norwalk (NV), el
virus de Snow Mountain (SMV) y el norovirus murino 1 (MNV-1) en y entre las superficies
sólidas y los alimentos. Los cambios en la concentración del virus en superficies sólidas
inoculadas artificialmente (acero inoxidable, cerámica y fórmica) o en la lechuga se vigilaron
durante un período de 14 a 42 días. Se evaluó la transferencia del virus desde el donante
(superficie sólida) al receptor (alimentos, por ejemplo, lechuga y carne de pavo en
rebanadas) hasta 2 h después de la inoculación. Los virus se recuperaron mediante elución
y se titularon con una PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) y/o un ensayo
de infecciosidad, según procediera. Sobre la base de la RT- qPCR, la concentración de NV
y SMV en las superficies disminuyó gradualmente con el tiempo, con una reducción media
de 1,5 a 2,0 y 1,8 a 2,3 log, respectivamente, después de 42 días, sin diferencias
estadísticamente significativas por superficie. Cuando se inocularon en lechugas
almacenadas durante 2 semanas a 4uC y a temperatura ambiente, los títulos de NV y SMV
disminuyeron aproximadamente 1,0 y 1,2 a 1,8 log, respectivamente. Comparativamente, la
señal RT-qPCR asociada con el ARN HuNoV purificado colocado en las mismas superficies
se perdió más rápidamente por degradación. La eficiencia de transferencia varió de 0 a 26%
para la lechuga y de 55 a 95% para la carne de charcutería de pavo en rebanadas, con
diferencias estadísticamente significativas (P # 0,05) en la transferibilidad en función de la
presión de contacto (100 y 1.000 g/9 cm2) y el tiempo de secado del inóculo. Cuando se
hicieron experimentos similares con el MNV-1, el virus infeccioso no se detectó en
superficies sólidas después del día 21 de almacenamiento, aunque el virus persistió en la
lechuga. Este estudio proporciona datos cuantitativos muy necesarios para su utilización en
las actividades de evaluación de riesgos destinadas a caracterizar la transmisión del virus
HuNoV durante la preparación y manipulación de los alimentos.

INTRODUCCIÓN
Los norovirus humanos (HuNoV) son la causa más común de gastroenteritis aguda en los
países industrializados (11). Las personas infectadas desarrollan síntomas de náuseas,
vómitos y diarrea acuosa graves que suelen durar de 1 a 2 días. La recuperación suele ser
completa y requiere una intervención médica mínima, pero se han documentado
enfermedades graves y muertes, aunque con poca frecuencia. La exposición al HuNoV se
produce por contacto directo con personas infectadas o superficies contaminadas (fómites),
por el consumo de alimentos o agua contaminados o por la exposición al vómito en aerosol
(11). De hecho, actualmente se reconoce que el VHuNO es la principal causa de
enfermedades transmitidas por los alimentos, responsable de más de 5 millones de casos
de enfermedades relacionadas con los alimentos adquiridas a nivel nacional en los Estados
Unidos cada año (25).
Los alimentos se contaminan con el VHuNO por contacto directo con materia fecal en las
manos de los trabajadores de la alimentación que no han practicado una higiene personal
adecuada y por la transferencia del virus a través del contacto con superficies contaminadas
(28). Intuitivamente, esto tiene sentido, ya que el VHuNO se vierte en gran número en las
heces y el vómito de los individuos infectados, y la efusión puede preceder a la enfermedad,
ocurrir en
individuos asintomáticos, y/o ser prolongado por días o semanas después de la resolución
de los síntomas. Además, sólo se necesitan unas pocas partículas de virus para causar la
enfermedad en un individuo susceptible (11). Otro factor importante que afecta a la
transmisibilidad del HuNoV es la estabilidad ambiental. Esto se apoya en la investigación
epidemiológica de los brotes de HuNoV que se producen en los cruceros y en los hoteles y
hospitales (6, 30). Estudios ambientales transversales recientes también han mostrado
pruebas de contaminación por HuNoV en instalaciones de servicios alimentarios como
restaurantes, comedores y cafeterías, a veces incluso en ausencia de un vínculo claro con
enfermedades transmitidas por los alimentos (4).
Sin embargo, sólo unos pocos estudios han tratado de caracterizar el grado de persistencia
y transferibilidad del HuNoV (2, 5, 8, 10, 12, 17, 20). Una de las principales razones de la
falta de esos estudios es que esos virus no pueden cultivarse in vitro y, por lo tanto, la
detección se basa en métodos de amplificación molecular que, si bien son fiables, no
pueden discriminar definitivamente entre los virus infecciosos y los no infecciosos. En
consecuencia, se han utilizado como sustitutos cultivables virus sustitutos que tienen
similitudes genéticas y de comportamiento con el HuNoV, en particular el calicivirus felino
(FCV) y el norovirus murino 1 (MNV-1). Aunque el uso de sustitutos tiene ventajas y
desventajas, hay cada vez más pruebas de que su comportamiento no siempre es
representativo del de los sustitutos cultivados de HuNoV, lo que proporcionaría una imagen
más completa del comportamiento ambiental de estos virus.
El propósito de este trabajo fue caracterizar la persistencia y la transferibilidad del HuNoV y
el MNV-1 en superficies comunes de contacto con alimentos (acero inoxidable, cerámica y
fórmica) y alimentos modelo (lechuga y pavo) mediante el uso de la PCR cuantitativa de
transcripción inversa (RT-qPCR) y/o el ensayo de infectividad, según corresponda.
Mediante el uso de una combinación de cepas humanas y sustitutos, junto con diferentes
enfoques de cuantificación, se pretendía obtener datos comparativos entre las cepas, las
superficies y los alimentos, y las condiciones de almacenamiento, produciendo así
estimaciones de la persistencia y la transferibilidad del norovirus que serían pertinentes para
los futuros esfuerzos de evaluación de riesgos microbianos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Suspensiones de virus, células y análisis de placas. El virus de Norwalk (NV; un prototipo de

genogrupo I [GI] HuNoV) y el virus de Snow Mountain (SMV; un prototipo de genogrupo II
[GII] HuNoV) se obtuvieron como muestras de heces de alta titulación (,107 a 108
RT-qPCR- U amplificable por g) de voluntarios humanos infectados experimentalmente
(cortesía de la Dra. Christine L. Moe, Universidad de Emory, Atlanta, GA). Las heces se
suspendieron un 20% en solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,2), se
alicuotaron y se almacenaron en el J80uC antes de su uso. El MNV-1, obtenido por cortesía
del Dr. Skip Virgin (Washington University, St. Louis, MO) se propagó infectando entre un 80
y un 90% de monocapas confluentes de células RAW 264,7 (ATCC TIB-71, American Type
Culture Collection, Manassas, VA) en un medio completo mínimo esencial que contenía un
10% de suero bovino fetal (HyClone, Logan, UT). Los cultivos de la cepa MNV-1
consistieron en lisados de cultivos celulares cosechados después de tres ciclos de
congelación-descongelación, seguidos de una centrifugación a baja velocidad (1.700 | g)
durante 20 min. La cepa MNV-1 (107 a 108 PFU/ml) se almacenó igualmente en el J80uC
hasta su utilización.
Cuantificación del título del virus. El MNV-1 se cuantificó mediante el ensayo de infectividad
(placa) utilizando células RAW 264.7 como se ha descrito anteriormente (31). Antes de la
amplificación de los ácidos nucleicos con RT-qPCR, se extrajeron eluidos de muestra
(descritos más abajo) de los tres virus para el aislamiento del ARN con el reactivo TRIzol
(GIBCO-BRL, Rockville, MD), con un volumen de reconstitución final de 40 ml. Para la
amplificación del ARN HuNoV se utilizaron cebadores y secuencias de sondas dirigidas a la
región conservada de la unión de los marcos de lectura abiertos 1 y 2 (13, 14).
Específicamente, para NV (GI), se utilizaron los primers COG1F-COG1R (59CGYTG-
GATGCGNTTYCATGA39; 59CTTAGACGCCATCATTYAC39) y las sondas etiquetadas
FAM-BHQ RING1(a)-TP (59AGATYGCGAT- CYCCTGTCCA39) y RING1(b)-TP
(59AGATCGCGGTC- TCCTGTCCA39). Para el SMV (GII) se utilizaron los cebadores
JJV2F-COG- 2R (59CAAGAGTCAATGTTAGTGATGAG39, 59TCGACG-
CCATCTTCATCACA39) y la sonda RING2P etiquetada por FAM-BHQ
(59TGGGGCGATCGCAATCT39). Los cebadores para la amplificación del MNV-1
correspondían a una región del gen de la ARN polimerasa dependiente del ARN, y se
designaron G54763F- G54863R (59TGATCGTGCCAGCATCGA39, 59GTTGGGAGG-
GTCTCTGAGCAT39), con la sonda etiquetada por FAM-BHQ G54808
(59CTACCCACCAGAACCCCTTTGAGACTC39) (29). El kit One Step (QIAGEN, Valencia,
CA) se utilizó para todas las reacciones de RT-qPCR. El volumen total de la reacción de 25
ml consistió en 2,5 ml de plantilla de ARN, 1,0 ml de enzima, 5,0 ml de tampón 5| , 10 U de
inhibidor de la RNasa (Promega, Madison, WI), 400 nM de desoxinucleósido
mezcla de trifosfato, 200 nM cada juego de cebadores, y 150 nM sondas RING (a) y RING
(b) (para NV) y 150 nM sonda RING2P (para SMV), y 200 nM sonda G54808 (para MNV-1).
Las amplificaciones se hicieron en un SmartCycle (Cepheid, Sunnyvale, CA) con una
combinación de temperatura-tiempo de 55uC durante 30 min, 95uC durante 15 min, seguido
de 45 ciclos de 94uC durante 10 s, 55uC durante 20 s, y 72uC durante 15 s.
El número de copias genómicas de todas las muestras, incluidas las reservas de virus, se
determinó por comparación con una curva estándar de ARN que se generó utilizando
amplicones de los tres fragmentos del genoma del norovirus. En resumen, los amplicones
correspondientes a los fragmentos del genoma 5291 a 5671 (NV), 5003 a 5424 (SMV), y
4721 a 5073 (MNV-1) se produjeron con cebadores de avance que contenían una
secuencia promotora de la polimerasa de ARN 59 T7, es decir, T7-COGIF- G1SKR (NV),
T7-JJV2F-G2SKR (SMV), y T7-MNV STF- MNV STR (MNV-1). Las secuencias
correspondientes fueron las siguientes: 59CCAACCCARCCATTRTACA39 (G1SKR);
59CCRC- CNGCATRHCCRTTRTACAT39 (G2SKR) (16); 59CCGTGC-
GATAGTTGTGAC39 (MNVSTF); y 59GCCATCACTCATC- CTCATTCACAA39 (MNVSTR)
(este trabajo). Los amplicones resultantes (tamaños 380, 421 y 353 pb para NV, SMV y
MNV- 1, respectivamente) se sometieron a transcripción in vitro con el equipo de
transcripción de alto rendimiento MEGAshortscript (Ambion, Austin, TX). Las transcripciones
se limpiaron además por digestión con TURBO DNasa (Ambion) y se purificaron por
precipitación de cloroformo-isopropanol. La concentración se determinó con un ND-
1000A-UV-VIS (Nanodrop, Wilmington, DE). Las concen- traciones de transcripción
oscilaron entre 3,1 y 4,3 | 1012 copias de ARN por ml, y éstas se almacenaron en J80uC
hasta su posterior uso. Cada transcripción se diluyó en serie en agua tratada con
dietilpicrocarbonato antes de su uso en la producción de las curvas estándar RT-qPCR.
Estudios de persistencia de virus. Los experimentos de persistencia de virus se hicieron con
tres superficies y dos alimentos. Se prepararon cupones de cerámica, fórmica y acero
inoxidable (5 por 5 cm) para su inoculación lavándolos a fondo con jabón líquido,
enjuagándolos en agua del grifo, sumergiéndolos en lejía al 1% (10.000 ppm; Clorox,
Oakland, CA) y etanol al 70% cada uno durante 30 min, y luego enjuagándolos en agua
desionizada y secándolos al aire en condiciones ambientales. Cada cupón se envolvió en
una bolsa y se esterilizó en autoclave durante 20 minutos antes de ser utilizado en los
experimentos. Las hojas de lechuga Iceberg obtenidas de fuentes comerciales locales se
prepararon cortando en trozos cuadrados (3 por 3 cm), enjuagando a fondo en agua
destilada estéril durante 1 min, seguido de un secado en una campana de flujo laminar
durante 20 min y una desinfección por exposición a la luz UV durante 1 min.
Inoculation was done by placing a 25-ml volume of undiluted fecal specimens of NV or SMV
(corresponding to approximately 1 | 104 RT-qPCR amplifiable U per ml) on the center of
multiple coupons or lettuce squares. For MNV-1, 50 ml of undiluted cell culture lysate
suspended in 1 to 5 ml of 20% artificial feces (Feclone, SiliClone Laboratories, Valley Forge,
PA) was used as inoculum. Inoculated coupons were stored over time (up to 42 days) under
ambient conditions of temperature, relative humidity, and light, while inoculated lettuce
samples were stored for up to 14 days at room temperature and refrigeration (4uC). At
various times (immediately after inoculation [time 0, control]), after virus inoculum drying
[approximately 30 min], and at additional times thereafter), the virus inoculum from one
coupon or lettuce square was recovered by elution with 100 ml of glycine (0.05 M)–saline
(0.14 M) buffer (pH 8.5) by repeated pipetting (25 times). The eluant was collected and the
process repeated with 100 ml of fresh buffer, giving a final eluant volume of 200 ml. The
efficiency of this elution procedure ranged from 85 to 90% for HuNoV on both surfaces and
lettuce, from 45 to 70% for MNV-1 on surfaces, and from 85 to 95% for MNV-1 on lettuce
(data not shown). The entire elution volume was held to J80uC prior to quantification of virus
titer by RT-qPCR and cell culture infectivity assay.
In an effort to characterize the behavior of naked viral RNA on these same environmental
surfaces and foods, the 20% NV and SMV stool suspensions or undiluted MNV-1 stock were
extracted for RNA isolation with the QIAamp Viral RNA kit (QIAGEN), with quantification of
viral RNA yield and purity done with the Nanodrop ND-1000A-UV-VIS. A 10-ml aliquot of a
1:1 dilution (made in nuclease-free water) of the RNA was then deposited onto the center of
the coupons or food, followed by elution with PBS (pH 7.0) at times ranging from
immediately after inoculation until viral RNA was no longer detected. These eluates were
also stored at J80uC until assayed by RT-qPCR.
Estudios de transferencia de virus. En estos estudios se evaluaron dos alimentos modelo
(lechuga y carne de pavo en rodajas), tres superficies representativas (acero inoxidable,
cerámica y fórmica) y dos virus (SMV y MNV-1). Las superficies sólidas y la lechuga fueron
descontaminadas e inoculadas con el virus como se ha descrito anteriormente. Todos los
experimentos de transferencia, para el MNV se realizaron con el lisado de cultivo celular
como inóculo. Se compró carne de pavo en lonchas en un mercado local y se cortó en
trozos de 3 por 3 cm que, antes de la inoculación del virus, fueron descontaminados por
exposición a la luz UV durante 1 min. En cada momento después de la inoculación (0, 15,
30, 60 y 120 min.), se colocaba un trozo de lechuga o de pavo en el cupón inoculado con
pinzas estériles, y se aplicaba una cantidad fija de presión (100, o 1.000 g/9 cm2; controlada
con una balanza electrónica), sin fricción ni frotamiento, en la parte superior de la lechuga
durante 15 s. La cantidad más baja de presión aplicada se aproximaba a un ligero toque de
la superficie, mientras que la presión más alta se ajustaba más a lo que cabría esperar
durante el corte o la mezcla del producto (8). A continuación se eludía el virus de las
superficies de la lechuga o el pavo como se ha descrito anteriormente y se procesaba para
la cuantificación del virus por ensayo de placa y/o RT-qPCR, según procediera. Como se
informó anteriormente (8), la transferencia porcentual se calculó de acuerdo con la siguiente
fórmula: Transferencia porcentual ~ (copias RNAfood)/(copias RNAtime 0 control) | 100.
Análisis estadístico. Todos los ensayos se hicieron por duplicado, y todos los experimentos
se replicaron tres veces. Los datos de RT-qPCR fueron expresados como el logaritmo del
número de copias de ARN según se extrapoló con la curva estándar, mientras que los datos
de infectividad fueron expresados como el logaritmo del PFU. Se compilaron los datos y se
calcularon las medias más las desviaciones estándar para cada vez y cada tratamiento.
Para los datos de persistencia, se ajustó una curva de regresión lineal (tiempo frente a
concentración de virus detectable) a los datos de cada tratamiento con Office 2007 Excel
(Microsoft, Redmond, WA). En los casos en que la recuperación del virus a lo largo del
tiempo se aproximaba a una relación logarítmica lineal, el valor D, o el tiempo para lograr
una reducción de 1 log en el título del virus, se definió como el recíproco negativo de la
pendiente de la línea de regresión. El análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba
de comparación múltiple de Tukey-Kramer (InStat, versión 3, GraphPad Software, San
Diego, CA) se utilizó para comparar la persistencia y la transferencia de datos por tipo de
virus y tipo de superficie. El mismo programa se utilizó para hacer comparaciones entre la
eficiencia de transferencia de los virus a lo largo del tiempo a cualquier presión dada o entre
los virus. La significación estadística se estableció en el nivel de P , 0,05.

RESULTADOS

Persistencia de NV, SMV y MNV-1 en las superficies de preparación de alimentos y en la

lechuga. Los resultados de los estudios de persistencia se muestran en las figuras 1 y 2.
Aunque hubo una reducción constante del número de copias del genoma
(aproximadamente 1
a 2 log) con el tiempo, ambas cepas de HuNoV permanecieron detectables por RT-qPCR en
las tres superficies de preparación de alimentos durante todo el período experimental de 42
días (Fig. 1A y 1B). Los valores D- oscilaron entre un mínimo de 28 días y un máximo de 43
días. Sobre la base del ANOVA, hubo una diferencia estadísticamente significativa por tipo
de superficie para el SMV pero no para el NV. Por otra parte, el ARN HuNoV purificado
(proporción A260/A280 de 1,8:1,9) colocado en las mismas superficies pudo ser detectado
por RT-qPCR durante no más de 7 días. En general, se observaron diferencias
estadísticamente significativas al comparar la persistencia de los dos HuNoV para cualquier
superficie.
Se observaron resultados de persistencia similares cuando se inocularon NV y SMV en la
superficie de la lechuga (Fig. 1C y 1D). En este caso, se observó una reducción de 1 a 1,5
log en el número de copias genómicas durante el período experimental de 14 días. Ambos
virus mostraron una mayor persistencia cuando la lechuga se almacenó a 4uC (valores D de
17 y 25 días para NV y SMV, respectivamente) en comparación con 22uC (valores D de 9 y
17 días, respectivamente); aunque esta relación fue estadísticamente significativa sólo para
NV. El ARN viral purificado inoculado en la lechuga (relación A260/A280 de 1,8:1,9) se
mantuvo estable hasta 14 días.
El VN-1 también se evaluó en estudios de persistencia, en este caso tanto por RT-qPCR
como por ensayo de infectividad. Sobre la base de la RT-qPCR, el MNV-1 fue relativamente
estable en las superficies comunes de contacto con alimentos, sin que se produjera
prácticamente ninguna disminución del número de copias del genoma durante todo el
período experimental de 42 días (Fig. 2A), y no se observaron diferencias estadísticamente
significativas al comparar los tipos de superficie. La estabilidad del virus, evaluada por
RT-qPCR, fue similar cuando se colocó la suspensión del virus en la superficie de la
lechuga (Fig. 2C). Curiosamente, el ARN viral purificado obtenido del MNV-1(proporción
A260/A280 de 1,7:1,85) fue más estable en ambas superficies (unos 24 días para el ARN
MNV-1 frente a 7 días para el ARN HuNoV) y en la lechuga (14 días para el ARN MNV-1
frente a ,4 días para el HuNoV). Hubo diferencias estadísticamente significativas en la
persistencia del MNV-1 cuando se suspendió en el lisado de cultivo celular frente a las
heces artificiales, según la evaluación de la RT- qPCR. Los resultados de persistencia
obtenidos para el MNV-1 inoculado en las tres superficies y la lechuga difirieron
significativamente en función del tipo de ensayo. Mientras que por RT-qPCR hubo una
pérdida mínima en el número de copias genómicas durante todo el período experimental de
42 días para las superficies, la pérdida completa de la infecciosidad del virus se logró en 14
días para el inóculo de lisado de cultivo celular y después de 21 días cuando se suspendió
el MNV-1 en las heces artificiales (Fig. 2B). Estas diferencias fueron estadísticamente
significativas. Cuando se inoculó el MNV-1 en lechuga y se controló la supervivencia
mediante el ensayo de infectividad, se produjo un descenso de aproximadamente 1,5 log en
la infectividad del virus para la lechuga almacenada durante 14 días a 4uC, y de
aproximadamente 3,0 log para la almacenada a temperatura ambiente (Fig.2D), aunque
estas diferencias no fueron muy significativas desde el punto de vista estadístico (P ~ 0,06).
Una vez más, el MNV-1 fue mucho menos persistente cuando se evaluó con el ensayo de
infectividad versus RT-qPCR.
Transferencia de SMV y MNV-1. Se llevaron a cabo experimentos para caracterizar la
facilidad con la que el SMV y el MNV-1 podían transferirse desde las superficies
contaminadas a alimentos representativos (lechuga y carne en rodajas) en función de la
presión táctil y el tiempo de postinoculación. Debido al alto grado de variabilidad de estos
datos, y en consonancia con otros investigadores (8, 22), los datos de transferencia
porcentual se transformaron logarítmicamente antes del análisis estadístico. La
transferencia de SMV de la cerámica a la lechuga, evaluada por RT-qPCR, osciló entre el 0
y el 9% (100 g/cm2) y el 0 y el 24% (1.000 g/cm2); se obtuvieron datos similares para el
acero inoxidable y la fórmica (Fig. 3). Se observaron diferencias estadísticamente
significativas en la eficiencia de la transferencia a lo largo del tiempo (disminuciones en la
transferibilidad con un aumento del tiempo de postinoculación), independientemente de la
superficie dura probada. El efecto de presión previsto (es decir, el aumento de la
transferibilidad con el aumento de la presión) fue estadísticamente significativo sólo para la
superficie cerámica.
Cuando se repitieron estos mismos experimentos de transferencia de lechuga utilizando el
MNV-1, la eficiencia de transferencia varió entre el 2 y el 13% para ambas presiones para
todas las superficies evaluadas con la RT-qPCR (Fig. 4). Por el ensayo de infectividad, la
eficiencia de transferencia varió de 0 a 4% (100 g/cm2) y de 8 a 20% (1.000 g/cm2) para las
tres superficies (Fig. 4). Se observó un efecto de tiempo menor para el MNV-1 en
comparación con el SMV,
pero cuando se observó, la significación estadística se alcanzó sólo al comparar el tiempo
de 120 minutos con todos los demás. El porcentaje de transferencia evaluado por RT-qPCR
fue mayor que el estimado utilizando el ensayo de infectividad a bajas presiones (100 g/9
cm2), mientras que se observó la tendencia opuesta a una presión táctil más alta (1.000 g/9
cm2). En la mayoría de los casos, hubo un aumento estadísticamente significativo de la
transferibilidad (excepto en el caso de las baldosas de cerámica evaluadas por RT-qPCR)
con una mayor presión, independientemente del tipo de ensayo.
La eficiencia de la transferencia también varió según el alimento. Específicamente, la
transferencia del MNV-1 del acero inoxidable a la carne de charcutería de pavo rebanada
varió entre el 55 y el 95%, lo cual fue estadísticamente significativo que la transferencia
entre el acero inoxidable y la lechuga en las mismas condiciones (Fig. 5). Los datos del
ensayo de infectividad de cultivos celulares en estos experimentos confirmaron un grado
similarmente alto de eficiencia de transferencia (90 a 95%). Una vez más, hubo diferencias
estadísticamente significativas al comparar los datos de la RT-qPCR con el ensayo de
placa, y al comparar entre las dos presiones táctiles. Curiosamente, la eficiencia de la
transferencia no se vio afectada significativamente por el tiempo en que se utilizó carne de
pavo en rodajas como superficie receptora.

DISCUSIÓN

En virtud de su facilidad de transmisión y su tendencia a causar brotes propagados entre

individuos que viven en estrecha proximidad, se ha sospechado desde hace tiempo un alto
grado de persistencia ambiental para el HuNoV (6, 30). Las consecuencias de esa
persistencia en las enfermedades transmitidas por los alimentos se confirman además en
estudios recientes que muestran pruebas de contaminación por el HuNoV en las
instituciones de venta de alimentos al por menor, incluso en ausencia de un vínculo claro
con los brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos (4). Lamentablemente,
pocos estudios se han centrado en la caracterización real de la supervivencia, la
persistencia, la eliminación y la transferencia del virus HuNoV, sobre todo porque el diseño
de esos estudios se complica por cuestiones de método y lógica, ya que esos virus no
pueden cultivarse in vitro. No obstante, se necesitan urgentemente datos cuantitativos para
evaluar el riesgo para la salud pública causado por las infecciones de HuNoV transmitidas
por los alimentos.
Los primeros trabajos para examinar la persistencia ambiental de los virus entéricos se
basaron en las cepas cultivables del virus de la poliomielitis, el rotavirus y el virus de la
hepatitis A. Estos estudios demostraron que la persistencia de los virus entéricos está
influenciada por innumerables factores
incluyendo el tipo de superficie, la temperatura, la humedad relativa y el tipo de virus
(revisado en (24)). En nuestro estudio, no intentamos manipular las condiciones
ambientales como la humedad relativa, ya que queríamos observar el comportamiento de
los virus bajo condiciones ambientales de luz y temperatura, incluyendo la refrigeración de
la lechuga. De esta manera, estábamos imitando lo que podría esperarse en el servicio de
alimentos o en los ambientes de preparación de alimentos en el hogar.
Nuestros resultados confirman que el HuNoV puede persistir en las superficies de contacto
con alimentos comúnmente utilizadas y en un modelo de alimentos durante largos períodos,
según se evalúa por el único método fiable para detectar estos virus, RT-qPCR. Esto es
consistente con los pocos estudios que se han publicado sobre el HuNoV. Concretamente,
D'Souza y otros (8), utilizando la RT-PCR convencional, informaron de que el NV inoculado
en las mismas tres superficies podía detectarse a los 7 días de la postinoculación, lo que
constituía la duración de su estudio. Más recientemente, Liu y otros (18) demostraron
tendencias similares en cuanto a la persistencia del NV y el SMV inoculados en cupones de
superficie, encontrando una reducción media que oscilaba entre 0,4 y 2,9 copias
equivalentes al genoma logarítmico después de 28 a 42 días de almacenamiento en
condiciones ambientales. En las almohadillas de los dedos, la cantidad de ARN HuNoV
disminuyó ligeramente (,0,25 log) 15 min después de la inoculación, y luego permaneció
relativamente inalterada a partir de entonces (hasta 120 min). Seitz y otros (26) también
descubrieron que el NV seguía siendo infeccioso (según la evaluación del estudio de
desafío humano) durante 61 días en aguas subterráneas almacenadas a temperatura
ambiente, mientras que Hewitt y Greening (12) demostraron la supervivencia a largo plazo
(4 semanas) del HuNoV en mejillones marinados. Por último, Lamhoujeb y otros (17)
descubrieron que una cepa de HuNoV GII sobrevivió al menos 10 días cuando se depositó
en la superficie de alimentos refrigerados listos para comer. Los primeros estudios con otros
virus entéricos cultivables han demostrado que la refrigeración favorece la persistencia del
virus en los alimentos (24), y nuestros resultados sugieren que en algunos casos, lo mismo
puede decirse del HuNoV.
Aunque es imposible confirmar que el ARN detectado en los estudios de persistencia de
HuNoV estuviera realmente asociado a un virus infeccioso, el hecho de que el ARN viral
purificado fuera comparativamente inestable en esas mismas superficies sugiere que al
menos parte del ARN detectado a lo largo del tiempo estaba asociado a un virus infeccioso.
Una tendencia reciente ha sido la incorporación de pretratamientos enzimáticos como medio
para distinguir entre los virus infecciosos y los no infecciosos (23). Por ejemplo, Lamhoujeb
y otros (17) emplearon una digestión enzimática en dos etapas (proteinasa K y RNasa),
seguida de una amplificación del ácido nucleico para demostrar la persistencia del
"supuesto VHNO infeccioso" durante 10 días en los alimentos refrigerados. Sin embargo,
cabe señalar que en estos y otros estudios de persistencia (17, 19), no se observaron
diferencias estadísticamente significativas en el número de copias de ARN estimado por la
amplificación del ácido nucleico al comparar los resultados con y sin el tratamiento previo de
digestión enzimática. Esto sugiere que en el caso de estos tipos particulares de estudios,
incluso este método comúnmente utilizado para distinguir entre el HuNoV infeccioso y el no
infeccioso podría carecer de fiabilidad. A falta de datos que demuestren lo contrario, y dada
la convincente evidencia epidemiológica que apoya la persistencia ambiental del HuNoV a
largo plazo, creemos que nuestros datos sugieren que el virus infeccioso persiste en estas
superficies hasta 6 semanas, tal vez incluso más. Por ejemplo, algunos estudios con el FCV
tienen una persistencia de virus infeccioso de tipo demoníaco hasta 7 días después de la
inoculación (8, 20), mientras que otros informaron justo lo contrario, con la eliminación de 4
a 5 log de infectividad del FCV en sólo 8 a 72 h (7). Nuestros datos de infecciosidad para el
MNV-1 sugieren que este virus es relativamente estable en las superficies.
Específicamente, encontramos que la infectividad del virus disminuyó de 3.0 a 4.0 log en 21
días cuando se inoculó en superficies sólidas, y de 1.5 a 3.0 log en 14 días en la lechuga.
Esto está en yuxtaposición con Cannon y otros (5), que pudieron detectar el MNV-1
infeccioso inoculado en superficies de acero inoxidable sólo 5 días después de la
inoculación, y Fallahi y Mattison (9), que recientemente informaron de la detección del
MNV-1 infeccioso en el acero inoxidable más de 42 días después de la inoculación. Las
variaciones en los resultados de estudios similares podrían deberse a varios factores, entre
ellos los medios de suspensión del inóculo (cultivo de tejidos frente a matriz fecal), el
método de elución y otras diferencias metodológicas, y abogan por la futura normalización
del diseño experimental. Al igual que Fallahi y Mattison (9), también encontramos que el
ARN del MNV-1 podía detectarse a lo largo del período experimental de 42 días
(superficies) o 14 días (lechuga), lo que confirma que la evaluación de la supervivencia del
virus mediante RT-qPCR no se correlaciona con estudios similares que utilicen el ensayo de
infectividad.
En nuestros primeros estudios de persistencia con el MNV-1, se utilizó lisado de cultivo
celular como inóculo del virus. Sin embargo, otros han informado de que el medio de
suspensión influye en la supervivencia del VFC en el acero inoxidable, y que la suspensión
en la materia fecal ejerce un efecto protector sobre la infectividad del virus a lo largo del
tiempo (8, 20).
Observamos un efecto similar, siendo el tiempo total para obtener la pérdida completa de la
infecciosidad del virus más largo cuando el inóculo se suspendió en heces artificiales. Este
fenómeno también ha sido observado por Takahashi y otros.