Introducción a la

farmacología experimental

Prof. Federico Gago Badenas

Área de Farmacología
Departamento de Ciencias Biomédicas
Curso académico 2019−2020

Animales de laboratorio Mus musculus

tradicionales
Ratón BALB/c atímico
(1/2) Ratón Swiss (“desnudo”) Ratón C57BL/6NHla

Rata Wistar Rata Lewis

Rattus norvegicus
Hamster sirio
Mesocricetus
auratus

Hamster chino Cobaya Hartley (guinea pig)

Cricetulus griseus Cavia porcellus
 Conejo
Animales de laboratorio Oryctologus cuniculus

tradicionales
(2/2)

Cangrejo herradura
Limulus polyphemus

Gato
Perro (Beagle) Felis catus
Canis lupis familiaris

Cerdo “Mono” Rhesus

Minicerdo (macaco)
Sus scrofa Macaca mulatta

Ventajas y desventajas de varios modelos animales

en investigación biomédica.

Porcine Human
CYP2A19 CYP2A13, CYP2A6
CYP2C33v4 CYP2C9
CYP2C49 CYP2C18
CYP2D25 CYP2D6
CYP3A29 CYP3A4
CYP3A39 CYP3A5
CYP1A2 CYP1A2
CYP2E1 CYP2E1
Manejo de animales de
laboratorio: consideraciones éticas
y normativa europea
 Sociedad Española de Ciencias del Animal de
Laboratorio (SECAL): http://www.secal.es

 International Council for Laboratory Animal

Science (ICLAS): http://www.lasa.co.uk/

Russell, W.M.S. and Burch, R.L.

The Principles of Humane Experimental Technique.
Methuen, London, 1959.
1. http://www.understandinganimalresearch.org.uk/
2. http://www.buscaalternativas.com/

Informe sobre las estadísticas relativas a los animales para experimentación animal u
otros fines científicos en los Estados miembros de la Unión Europea:
http://www.derechoanimal.info/bbdd/Documentos/1308.pdf

Recuerda las tres R’s referentes al uso de

animales en experimentación biomédica:
 Reemplazar: buscar alternativas, entre las que se
incluyen los ensayos bioquímicos in vitro, los cultivos
celulares, los órganos perfundidos, las rebanadas de
tejido y las simulaciones por ordenador.

 Reducir: emplear cualquier estrategia que resulte en

la utilización del menor número posible de animales
para obtener la misma cantidad de información o
para maximizar la información que se obtiene por
animal.

 Refinar: evaluar el impacto de cualquier [1959]

procedimiento o condición sobre el bienestar del
Desde 1986, los modelos
animal y desarrollar estrategias para minimizar ese alternativos están apoyados
impacto. por leyes en la Unión Europea
Técnicas básicas en
farmacología experimental
 Los estudios sobre animales intactos siguen siendo esenciales
para los ensayos de toxicidad aguda, subaguda y crónica a los que
debe someterse una nueva sustancia que se desarrolla como
posible fármaco.

 También son necesarios para ensayos de teratogenia y

carcinogenicidad.

 Muchas pruebas farmacológicas se realizan sobre animales

enteros (en ocasiones preparados quirúrgicamente) para ayudar a
la detección y el estudio de las actividades buscadas, por ej. sobre
tensión arterial, inflamación, secreción gástrica, etc.

 Otras pruebas se pueden realizar sobre órganos o tejidos

extraídos (“órgano aislado”).

Técnicas básicas en
farmacología experimental
 Órgano aislado: Puede permanecer
funcional durante varias horas suspendido en
un baño que contenga una solución fisiológica
de sales y a través de la cual se borbotea
carbógeno (90-95% O2 + 5-10% CO2).

 Henrick Magnus (1802–1870) fue el primero

en aplicar este método a una tira de intestino
delgado.
 La contracción o relajación se transmitía
mecánicamente a un estilete que inscribía
sobre un tambor cubierto con papel ahumado
que giraba a una velocidad constante
(quimógrafo).
 El registro permitía visualizar y cuantificar el
efecto del fármaco a lo largo del tiempo.
Aparato típico para experimentos con órganos aislados
transductor

palanca
reservorio

estativo
baño de
órganos

aireador

termostato

aireador

https://www.youtube.com/watch?v=RcGOaUIFo5I
serpentín
 TIRA EN ESPIRAL DE
AORTA DE CONEJO

contracción de la aorta
producida por la noradrenalina

AURÍCULA
AISLADA DE COBAYA

cortar al transductor

cánula
tejido

curvar

cánula

ANILLOS DE TRÁQUEA
(obsérvese la disposición
tejido
de las partes musculares)
atar hilo al soporte

ANILLO DE ARTERIA
Farmacología in vitro: preparaciones corrientes de tejidos aislados
Preparación Receptores estudiados habitualmente Solución para el baño *
Recto abdominal de rana Acetilcolina (nicotínico, tipo muscular) Ringer (rana)
Colon ascendente de cobayo Serotonina 5HT(4) Krebs
Ileon de cobaya Acetilcolina (muscarínico M(3)), histamina H(1) y H(3), serotonina 5HT(3), Krebs o Tyrode
bradikinina B(2), neurokinina NK(1), CCK(A), CCK(B), angiotensina AT(2)

Ileon de cobaya (estimul. campo) Opioides mu y kappa, adrenoceptores alpha(2) Krebs o Tyrode

Conducto deferente de cobayo Prostanoides EP(3) Krebs

Conducto deferente de ratón (estimul.campo) Opioides mu, kappa y delta, dopamina D(2) Krebs (menos Mg2+)

Yeyuno de conejo Adrenoceptores alfa(2) Tyrode

Corazón de conejo Langendorff Adrenoceptores beta(1) Ringer-Locke
Anococcígeo de rata Adrenoceptores alfa(1), GABA(B) Krebs

Aorta de rata o conejo Adrenoceptores alpha(1), serotonina 5HT(2), neurokinina NK(1), Krebs
bradikinina B(1), angiotensina AT(1), péptido rel. gen. con calcitonina
CGRP(1)

Aurícula de rata Adrenoceptores beta(1), acetilcolina (muscarínico) M(2) Krebs

Colon de rata Neurokinin NK(2) Krebs

Nervio frénico/diafragma de rata Acetilcolina (nicotínico) Krebs
Vena porta de rata Neurokinina NK(3) Krebs
Útero de rata Adrenoceptores beta(2), histamina H(2), bradikinina B(2) De Jalón

Conducto deferente de rata (estimul. campo) Adrenoceptores alfa(2), opioide mu, prostanoide EP(3), bradikinina B(2), Krebs (menos Mg2+)
péptido rel. gen. con calcitonina CGRP(2)
* Utilizada de forma habitual aunque no exclusiva

Técnicas básicas en
farmacología experimental

 Órgano aislado:

 Las palancas fueron

eventualmente sustituidas
por transductores y los
kimógrafos fueron
reemplazados por
polígrafos y otros
dispositivos electrónicos.
 BAÑOS DE ÓRGANOS COMERCIALES (INDIVIDUAL, CUATRO, OCHO)

transductor isotónico transductor isométrico

(desplazamiento) (fuerza)

Registradores
1890s 1960s 2010s

Quimógrafo de tambor
PowerLab / LabTutor
para estudiantes

Polígrafo Grass
SIMULACIONES DE BAÑO DE ÓRGANOS
 CUANTIFICACIÓN DEL EFECTO

% efecto máximo
Efecto (escala arbitraria) log M [agonista]

lavado lavado lavado lavado

lavado
lavado lavado

[agonista]

Resultados de un típico experimento farmacológico en el que se mide la dependencia de un efecto biológico (por
ejemplo, contracción, secreción, cambios de conductancia a iones, o producción de un segundo mensajero) con la
concentración de agonista añadida. Entre adiciones sucesivas de agonista existe un período de lavado de varios
minutos. La curva sigmoidea de la gráfica representa cada respuesta individual como porcentaje del efecto
máximo en función del logaritmo de cada concentración de agonista utilizada.
 A: agonista
B: antagonista
competitivo reversible

[A] = [ A'] k1
K A + [A]  [B ] 
K A 1 +  + [A']
A+R AR efecto
 KB  k-1
B+R BR

[A'] −1 = [B ]
[A] KB

pA2

N.B.: explicación detallada en http://www3.uah.es/farmamol/Public/PDF_files/Bases_inter_FR.pdf

Animales de laboratorio
no tradicionales Caenorhabditis elegans

Pez cebra (Danio rerio)

Xenopus laevis (ovocitos, melanóforos, etc)

How suitable are zebrafish for discovering
human drugs?

Zebrafish as tools for drug discovery

https://doi.org/10.1002/cbic.201900741 Calum A. MacRae & Randall T. Peterson
Nature Reviews Drug Discovery 14, 721–731 (2015) DOI:10.1038/nrd4627

Volúmenes y potencial de prestaciones

Densidad y volumen Potencial de
de los pocillos rendimiento
Ensayos en placas de micropocillos

FARMACOLOGÍA EXPERIMENTAL
MODELOS IN VIVO (ANIMAL ENTERO)
MODELOS FISIOLÓGICOS

MODELOS DE DOLOR (para evaluación de analgésicos):

 Coletazo (tail flick) en ratón: agua caliente
 Coletazo (tail flick) en rata: foco de calor
 Placa caliente (hot plate)
 Método de Randall-Selitto: presión en la pata de la rata

MODELO DE INFLAMACIÓN:
 Edema inducido por inyección de carragenina (rata y ratón):
pletismometría
“COLETAZO” (TAIL FLICK) EN RATÓN (1/2)
AGUA CALIENTE A 52º

“COLETAZO” (TAIL FLICK) EN RATA (2/2)

FOCO DE CALOR
 Primary Observation (Irwin) Test in Rodents for
Assessing Acute Toxicity of a Test Agent and its
Effects on Behavior and Physiological Function
The Irwin observation test is commonly used to evaluate the effects of a new
substance on behavior and physiological function. The results of the Irwin test are
used to determine potential toxicity and to select doses for specific therapeutic
activity. The Irwin test can also be used in a safety approach for detecting untoward
effects of a new compound on general behavior and for evaluating its acute
neurotoxicity. In particular, data obtained in the Irwin Test can help to determine
the dose range to be tested in other safety tests. Furthermore, the Irwin Test can
furnish a first but pertinent orientation towards a specific therapeutic indication, a
specific mechanism of action or a specific physiological function.
El ensayo observacional de Irwin se utiliza habitualmente para:
• evaluar los efectos de una nueva sustancia sobre el comportamiento y varias funciones fisiológicas
• determinar posibles toxicidades de tipo agudo
• detectar efectos indeseables de un compuesto nuevo (en una aproximación a la seguridad)
• ayudar a seleccionar las dosis necesarias para una actividad terapéutica determinada
• ayudar a determinar el intervalo de dosis que se debe emplear en otras pruebas de seguridad
• orientar en cuanto a posibles indicaciones terapéuticas y mecanismo(s) de acción.
NOTA IMPORTANTE: Todos los protocolos que utilizan animales vivos deben ser revisados y
aprobados, en primer lugar, por un Comité Institucional de Cuidado y Uso de los Animales y/o
debe cumplir los requisitos gubernamentales de cuidado y uso de los animales de laboratorio.

I
R
W
I
N
Test de Irwin:
Batería de pruebas en roedores para una primera evaluación de un candidato a fármaco

Irwin S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.
Psychopharmacologia. 13(3):222-57 (1968
1968 )
 Esquema de Irwin

“Cola de Straub” tras

administración de morfina

COLA DE STRAUB Y COMPORTAMIENTO ESTEREOTIPADO EN RATA

PROVOCADOS POR APOMORFINA
Estudios tradicionales de comportamiento
en animales de experimentación (ejemplos)

Laberinto en forma de T con posibilidad de elegir luz/oscuridad

Experimentos para probar respuestas

de ansiedad en ratones

Laberinto elevado
Campo abierto en forma de cruz

Caja
luz-oscuridad

Laberinto elevado
en forma de O
COMPARTIMENTO DE LUZ-OSCURIDAD (1/2): modelo para estudio de ansiolíticos

COMPARTIMENTO DE LUZ-OSCURIDAD (2/2): modelo para estudio de ansiolíticos

LABERINTO ELEVADO en forma de +: modelo para estudio de ansiolíticos

LABERINTO ELEVADO en forma de O: modelo para estudio de ansiolíticos

 Estudios tradicionales de comportamiento
en animales de experimentación (ejemplos)

“Rotarod” o rueda de actividad

Caja de actividad

Plataforma perforada
(actividad exploratoria en entorno novedoso)

ROTAROD (1/3): ratón

Evaluación de la coordinación motora y resistencia a la fatiga:

afectación por fármacos, daños cerebrales o patologías.
ROTAROD (2/3): rata

ROTAROD (3/3) ATAXIA ESPINOCEREBELAR

MEMORIA Y APRENDIZAJE (1/3): plataforma sumergida (rata)
Morris Water Maze

MEMORIA Y APRENDIZAJE (2/3): plataforma sumergida (ratón y modelo de Alzheimer)

MEMORIA Y APRENDIZAJE (3/3)

NATACIÓN FORZADA (1/2): modelo para estudio de antidepresivos

NATACIÓN FORZADA (2/2): modelo para estudio de antidepresivos

THE VIRTUAL RAT

“LA RATA VIRTUAL”
 ESTUDIOS TRADICIONALES
DE TOXICIDAD EN ANIMALES

Safety Pharmacology ICH S7A Standard Battery

- CNS (rodent and non-rodent)
- Respiration (rodent and non-rodent)
- Cardiovascular telemetry
- Non-invasive DSI JET system assessments can be
added to toxicology studies
- hERG assay via manual patch clamp

Non-GLP Cardiovascular Safety Screening Assays

- Rat telemetry (SHR, normotensive)
- Anesthetized guinea pig QT assay
- ECG and indirect BP in large animal
- hERG via automated patch clamp

Métodos alternativos para

los estudios ADME-Tox
 Un solo ensayo no puede sustituir la complejidad del sistema
experimental “in vivo”
 se sigue la estrategia de intentar validar métodos que puedan sustituir
algunos aspectos o etapas de los estudios principales en el animal.
 toda la aproximación “in vitro” a la predicción de la toxicidad debe de
considerar una batería de ensayos diferentes tendentes a cubrir el mayor
número de respuestas posibles y permitir la confirmación de los resultados.

 La incorporación de otros modelos animales alternativos a los mencionados,

tales como invertebrados o pequeños vertebrados (pez zebra) a la investigación
preclínica temprana, refuerza la tendencia a posponer los ensayos “in vivo” de
validez regulatoria con mamíferos a la fase clínica.
 si bien estos últimos ensayos, hoy por hoy, no tienen validez regulatoria, se
consideran una herramienta de cribado (screening) muy útil para
discriminar productos con distintos niveles de seguridad, permitiendo
descartar aquellos no seguros.
Cribados fenotípicos en el pez zebra:
recapitulación de la biología humana fundamental

Kithcart A, MacRae CA.

Using Zebrafish for High-Throughput Screening of Novel Cardiovascular Drugs.
JACC Basic Transl Sci. 2(1):1-12 (2017
2017)
2017

Cultivos celulares primarios

a) Cordón umbilical b) Células nerviosas

c) Hepatocitos d) Queratinocitos
Cultivos celulares de líneas establecidas

CHO-K1 (ovario de hámster chino) RTG-2 (trucha arco iris)

HeLa (cancerosas humanas) Vero (riñón de mono)

Ensayos de absorción: células Caco-2

lado apical

monocapa
de células Filtro
microporoso
(21 días)

lado basolateral
 Células humanas procedentes de cáncer de colon que, a diferencia de las
células normales del epitelio gastrointestinal humano, dan lugar a monocapas
celulares y presentan características morfológicas y bioquímicas similares a las
de los enterocitos diferenciados, y algunas diferencias puntuales.
 Constituyen un buen modelo, especialmente para fármacos y sustancias
xenobióticas susceptibles de absorberse únicamente por difusión pasiva.
 Existe una excelente correlación entre los coeficientes de permeabilidad en
células Caco-2 y la biodisponibilidad oral en humanos de este tipo de fármacos.
 Los resultados obtenidos con Caco-2 se utilizan para la clasificación
biofarmacéutica de principios activos.
 matriz extracelular
monocapa en 2D

esferoides

Langhans SA.
Three-dimensional in vitro cell culture models in
drug discovery and drug repositioning.
Front Pharmacol. 9:6 (2018)

Gradiente de oxígeno
Células y su Gradientes de nutrientes
Gradientes factores solubles
microentorno Gradiente de proliferación
Composición de la matriz extracelular (MEC)

Interacciones heterotípicas célula-célula

Interacciones homotípicas célula-célula
Adherencia de las células a la MEC

Señalización paracrina
Rigidez de la MEC

Langhans SA.
Three-Dimensional in vitro Cell Culture Models in FENOTIPO CELULAR
Drug Discovery and Drug Repositioning.
Front Pharmacol. 9:6 (2018) RESPUESTA A FÁRMACOS
 Esferoides como modelos in vitro de tumores

TRANSICIÓN EPITELIO-MESÉNQUIMA

E. Forte et al.
EMT/MET at the Crossroad of Stemness, Regeneration and Oncogenesis:
The Ying-Yang Equilibrium Recapitulated in Cell Spheroids.
Cancers (Basel) 9:8 (2017)

Órganos en un chip: Un nuevo paradigma para la evaluación

toxicológica y el desarrollo de fármacos preclínicos
Lo siguiente: Human-on-a-chip

Evolución de los modelos in vitro desde los cultivos monocapa simples a los OoCs.

 El desarrollo de nuevos materiales y matrices ha permitido el crecimiento de modelos

organotípicos tridimensionales con mejores características fisiológicas que los cultivos en
monocapa.
 Los dispositivos de microingeniería, que incorporan tecnologías de fluidos y sensores, han
permitido después la transferencia de estos tejidos tridimensionales a un entorno dinámico,
creando órganos en un chip que se asemejan más a los órganos humanos in vivo.
Human-on-a-chip
https://www.tissuse.com/en/products/human-on-a-chip/
https://youtu.be/nkkBu8GrExk