La fosfatidiletanolamina es un regulador clave de la

membrana
Fluidez en células eucariotas *
Se requiere una fluidez de membrana adecuada para una variedad de claves procesos celulares y

en particular para el correcto funcionamiento de los miembros proteínas de la brana. En la mayoría

de las células eucariotas, la fluidez de la membrana es conocido por estar regulado por la

desaturación de ácidos grasos y la coles- terol, aunque algunas células, como las de insectos,

están casi desprovistas de la síntesis de esteroles. Mostramos aquí que insectos y mamíferos Las

células presentan una microviscosidad similar en sus respectivas fisio- temperatura lógica. Para

investigar cómo tanto los esteroles como los Los folípidos controlan la homeostasis de la fluidez,

cuantificamos la concentración lipídica Composición de las células SF9 de insectos y HEK 293T de

mamíferos en condiciones normales o modificadas con esteroles. Como era de esperar, insecto las

células muestran esteroles mínimos en comparación con las células de mamíferos. UN También se

observa una diferencia importante en el contenido de fosfolípidos como proporción de

fosfatidiletanolamina (PE) a fosfatidilcolina (PC) está invertido (4 veces más en celdas SF9).

Estudios in vitro en Los liposomas confirman que tanto el colesterol como el PE pueden aumentar

rigidez de la bicapa, lo que sugiere que ambas pueden ser utilizadas por las células para mantener

la fluidez de la membrana. Luego mostramos que exógenamente el aumento de la cantidad de

colesterol en las membranas SF9 conduce a una disminución significativa en la relación PE: PC

mientras que la terol en células HEK 293T mediante el tratamiento con estatinas conduce a una

aumento de la relación PE: PC. En todos los casos, la fluidez de la membrana es mantenido, lo que

indica que ambos tipos de células combinan regula- los esteroles y fosfolípidos para controlar la

adecuada fluidez de la membrana.

El mantenimiento de la fluidez adecuada de la membrana celular es fundamental importancia

fundamental para la difusión adecuada de los componentes de la membrana desde los lípidos

hasta las proteínas e influye en la dinámica y ción de proteínas integrales de membrana. También

es responsable de su notable flexibilidad y, por lo tanto, requerido para una multitud de

transformaciones morfológicas necesarias para las funciones celulares incluyendo división,

diferenciación y adaptación general a el medio ambiente (1, 2). En las bacterias, la fluidez de la

membrana está regulada principalmente por ing la longitud y saturación de las cadenas de acilo
(3). Por ejemplo, al bajar la temperatura de crecimiento, las bacterias típicamente aumentar

considerablemente el contenido de cadenas de acilo insaturadas, acortar longitud de la cadena y

modificar la ramificación o ciclación para reducir la temperatura de transición de fase de gel a

líquido-cristalino estado, un proceso llamado adaptación homeoviscosa (4). En mamma- células

lianas, se sabe que la fluidez de la membrana también está regulada por colesterol, que tiene la

capacidad de producir líquido de membrana interfiriendo con el empaquetamiento de la cadena de

acilo, inhibiendo la transición a estado de gel sólido, pero al mismo tiempo branas al reducir la

flexibilidad de las vecinas insaturadas cadenas de acilo (5, 6). Las membranas de los orgánulos

celulares necesitan adaptar sus propiedades y así su composición según la función que necesiten

cumplir (2, 5). De hecho, se sabe que el porcentaje total de elección lesterol varía ampliamente

entre los orgánulos implicados en tráfico de células; es bajo en retículo endoplásmico (5% de

lípidos), y su cantidad aumenta en el trans-Golgi y la membrana plasmática brana, lo que permite un

empaque más apretado compatible con el plasma función de la membrana como barrera (5, 7). Por

lo tanto, las células animales son sometido a una regulación fina de colesterol y grasas síntesis de

ácido a través de la unión del elemento regulador de esterol vía de la proteína (SREBP) (8). En este

contexto, un desequilibrio en La composición de lípidos de la membrana podría afectar la vínculos y

conducir a consecuencias patológicas como se describe para membranas de eritrocitos en

pacientes con hipercolesterolemia y en diabetes tipo 2 (9, 10). De hecho, un aumento del colesterol:

fósforo La proporción de folípidos (PL) 4 conduce a una disminución de la fluidez de la membrana

y se asocia con una unión reducida de insulina (9). Por el contrario, algunos eucariotas superiores,

como los insectos, no sintetizar esteroles. Aunque los estudios de espectrometría de masas han

demostrado que las membranas de las células de insectos contienen las principales clases de PL

encontrado en células de mamíferos, la presencia de esteroles es estrictamente dependiente de la

dieta (11). Cómo las células perciben y regulan la mezcla compleja y dis- La contribución de los

lípidos para preservar las características de las membranas es, por lo tanto, una pregunta

importante y desafiante. En este trabajo, comparamos la regulación de la distribución de lípidos de

la membrana y su consecuencia en la fluidez de la membrana de dos ampliamente modelos

utilizados de células eucariotas, SF9 de insecto y células HEK 293T humanas. Usando un sistema

de cromatografía líquida acoplado a una alta resolución espectrómetro de masas de lution,

determinamos la composición de lípidos de ambas membranas. Mostramos que a pesar de las

diferencias en su contenido de colesterol y fosfatidiletanolamina (PE) la fluidez de ambas

membranas fue similar. Mostramos que la gripe La idoneidad en las membranas SF9 y HEK 293T

está regulada de manera similar. De hecho, un cambio en las cantidades de colesterol no afectó a

los miembros fluidez de la brana de ambas células, pero resultó en una modulación inversa del

contenido de PE. Nuestros hallazgos apuntan a una compensación conservada equilibrio entre el

colesterol y el metabolismo de la PE que podría ser necesario para el control de la fluidez de la

membrana.

- Procedimientos experimentales Cultivo celular:

las células SF9 se cultivaron en ESF 921 sin proteínas medio de Expression Systems a 27 ° C con

agitación de 130 rpm ción. Para aumentar la cantidad de colesterol, se cultivaron células durante

cinco pases (7-10 días) en ESF 921 complementado con un 10% suero de ternero fetal (FBS)

(Lonza). Las células HEK 293T se cultivaron en DMEM (Lonza) suplementado con FBS al 10%, 4,5

mg / ml de glu- cose, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM a 37 ° C con 5% CO2. Para el

tratamiento con estatinas, se preparó una solución madre de simvastatina. pelado y activado por el

siguiente método. Primeros 54 mg de La simvastatina se disolvió en 1,04 ml de etanol al 95% y

luego 813 - Se añadió 1 de NaOH 1 N. La solución resultante fue neutralizado con 1 N HCl a un pH

de 7,2 y llevado a 13 ml con agua destilada. A continuación, se dividió en alícuotas el stock de 10

mM y almacenado en - 20 ° C hasta su uso. Antes del tratamiento con simvastatina, las células a

tratar y los controles se cultivaron durante 48 h en suero DMEM libre suplementado con insulina,

transferrina y sele- nium (todos de Gibco), 0,1 mg / ml de BSA, 4,5 mg / ml de glucosa, 1 mM

piruvato de sodio, L-glutamina 2 mM a 37 ° C con 5% de CO2. próximo 75 - Se añadió M

simvastatina sólo para las células tratadas con estatinas; estafa- las células trol permanecieron

libres de estatinas. Luego, las células se recolectaron después 48-50 hy se lavó con solución salina

tamponada con fosfato y pel- se almacenaron en - 80 ° C para la preparación de la membrana.

Estándares de lípidos: se utilizaron los siguientes estándares: para fosfatidilcolina (PC), PE,

fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilserina (PS) y esfingomielina (SM), C12: 0 C12: 0 y C17: 0 C17: 0;

para fosfatidilinositol (PI), C18: 0 C20: 4 y [2,3,4-13C3] colesterol. Las curvas estándar fueron

hechas por MS análisis usando series de dilución de estándares (de 0.02 a 5 10- 5 mg / ml para

fosfolípidos y de 0,2 a 0,002 mg / ml para colesterol). Todos los estándares de fosfolípidos se

adquirieron en Avanti- Polar lipids, Inc. [2,3,4-13C3] Se purificó el colesterol perseguido de Sigma.
Preparación de membranas y extracción de lípidos de membranas. Pellets de células (20106

células para HEK 293T y 60106 células para SF9) se transfirieron a tampón de lisis hipotónico (10

mM Tris, pH 7,4, EDTA 1 mM) y se agitó durante 15 min para romper las células. Las células lisadas

se centrifugaron a 25.000 g durante 10 min, y el Los gránulos que contenían las membranas se

resuspendieron en fósforo. solución salina tamponada con fato. Este procedimiento se llevó a cabo

a 4 ° C. Estándares para cada clase de fosfolípidos y colesterol [13C3] se agregaron a la membrana,

y luego se extrajeron los lípidosde membranas usando una solución de metanol: cloroformo (50:50,

v / v) como lo describen Bligh y Dyer (31) con lo siguiente modificaciones. 10 - Se añadió 1 de HCl 6

N a la mezcla, y La extracción se repitió tres veces en la misma muestra para tener máxima

recuperación de todo tipo de lípidos. Orgánico correspondiente las fases se agruparon, el

disolvente se evaporó bajo una corriente de nitrógeno, y los lípidos se disolvieron en diclo-

romometano: isopropanol (1: 4, v / v) antes del análisis de EM. Análisis de espectrometría de

masas: dos microlitros de cada muestra ple fue inyectado en una cromatografía líquida de rápida

resolución (LC) (serie 1200 de Agilent Technologies) equipado con una columna Zorbax XDB

Eclipse Plus (C18, 4.6 50 mm, 1.8-- metro tamaño de partícula). La corrida duró 30 minutos con las

siguientes características: características: caudal, 0,3 ml / min; temperatura de la columna, 40 ° C.

La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1% (análisis de MS positivo) o 5 acetato de amonio mM, pH 5

(análisis de MS negativo) y La fase móvil B fue un gradiente de isopropanol, que comenzó con 90%

de disolvente A, aumentado directamente al 20% en 10 min, permaneció en 20% de disolvente A

durante 15 min, y se volvió a equilibrar para comenzar condiciones en 5 min. Una fuente de iones

por electropulverización (ESI) serie 6520 - Espectrometría de masas de alta resolución de tiempo

de vuelo cuadrupolo (QTOF) Se utilizó un trómetro de Agilent Technologies. Para la EM / EM

análisis, se utilizó el modo auto-MS / MS, y los parámetros fueron los sigue: modo positivo o

negativo; adquisición de alta resolución modo (4 GHz); temperatura del gas, 330 ° C; gas de secado,

7 litros / min; presión del nebulizador, 50 p.s.i.g .; voltaje capilar, - 4500 V; frag- mentor, 210 V;

energía de colisión fija, 25 V; Rango de escaneo MS y frecuencia, 100-1700 a cuatro espectros por

segundo; Rango de escaneo MS / MS y frecuencia, 50-1700 a tres espectros por segundo; auto-

MS / MS, tres precursores máximos; umbral absoluto de precursor, 200 cuenta; exclusión activa en

dos repeticiones y liberada después de 0.5 min; rango de exclusión fijo, 100– 499 y 1500–1700;

privilegiado estado de carga, 1 y 2. Los datos fueron adquiridos por Mass Hunter Adquisición- para
TOF y QTOF versión B.04 SP3 (Agilent Tecnologías). Para la cuantificación, se realizaron análisis de

EM formado con los siguientes parámetros: positivo o negativo modo; modo de rango dinámico

extendido (2 GHz); temperatura del gas temperatura, 330 ° C; gas de secado, 7 litros / min; presión

del nebulizador, 50 p.s.i.g .; voltaje capilar, 4500 V; fragmentador, 210 V; Escaneo de MS rango y

frecuencia, 100-1700 a dos espectros por segundo. Los datos fueron adquirida por Mass Hunter

Acquisition para las versiones TOF y QTOF sión B.04 SP3. Se analizaron las fosfatidilcolinas y el

colesterol. lizado en modo positivo, mientras que los otros PL se analizaron en modo negativo.

Análisis y cuantificación de datos: los datos se analizaron primero lizado por Mass Hunter

Qualitative Analysis versión B.06 SP1 basado en un modo de búsqueda basado en fragmentos.

Brevemente, el MS / MS Los espectros obtenidos durante el tiempo de ejecución se seleccionaron

de acuerdo con la fragmentación específica de cada PL. En modo negativo, el el modo de búsqueda

se centró en los fragmentos de ácidos grasos (C16: 0; C16: 1; C14: 0; C14: 1, C18: 0. . . ). En modo

positivo, la búsqueda El modo se centró en los fragmentos de la cabeza polar del PL. El error

máximo aceptado en m / z detectado fue de 5 ppm. Respecto a cuantificación, las muestras se

procesaron en modo MS simple. Cromado de iones Los matogramas se extrajeron en base a las

masas exactas del lípidos observados durante los análisis de auto-MS / MS. Fosfolípidos fueron

cuantificados por las curvas estándar (con concentración de masa ciones) se ejecutan durante el

conjunto de experimentos. Formación de liposomas y determinación de tamaño por dinámica

Dispersión de luz: lípidos utilizados para la formación de liposomas (POPE, POPC y colesterol) se

compraron a Avanti Polar Lipids, Inc. Se prepararon mezclas de lípidos con los siguientes

procedimiento. POPC se mezcló con 0, 10, 20 o 30% (p / p) de cho- lesterol; con 40, 50 o 60% (p / p)

de POPE; o con 10% de colesterol terol además de 30 o 60% (p / p) de POPE a una concentración

final de lípidos concentración de 3 mg / ml en HEPES 100 mM, pH 7,4. Liposomas

Luego se sonica en un baño de hielo / agua durante 5 min e inmediatamente utilizado para la

determinación del tamaño o 1,6-difenil-1,3,5- mediciones de fluorescencia de hexatrieno (DPH).

Diámetro medio de liposomas se evaluó mediante dispersión de luz dinámica utilizando un

Zetasizer (Malvern Instruments Ltd.). Monitoreo de la fluidez de la membrana por fluorescencia

DPH Polar- Mediciones de ización: lípidos extraídos de las membranas se secaron en viales

previamente pesados, luego se pesaron y se resuspendieron en el volumen correcto de HEPES 100

mM, pH 7,4 para tener 0,3 mg / ml. Para los liposomas, tomamos el volumen de lípidos de cloro

roform stock correspondiente a 0,3 mg en total de acuerdo con la concentración proporcionada por

el fabricante y luego secada antes de la resuspensión en 1 ml de HEPES 100 mM, pH 7,4. Las

membranas y los liposomas se sonicaron antes de aplicar fluo- Mediciones de polarización

rescence. Siguiente 1,5 ml de bicapa en 0,3 mg / ml de concentración final en HEPES 100 mM, pH

7,4 fue mezclado con 0,2 - g / ml concentración final DPH (de una reserva de 0,1 mg / ml en N, N-

dimetilformamida). Esta mezcla fue entonces agitado y calentado durante 15 min a 45 ° C para

permitir homogeneidad integración de DPH en la bicapa. Polarización de fluorescencia de El DPH

se midió en un fluido de Photon Technology International. orómetro con el siguiente protocolo:

polarización basada en el tiempo, modo digital, longitud de onda de excitación de 358 nm, onda de

emisión longitud de 429 nm y filtro de paso de banda de 4 nm. La polarización fue evaluado

utilizando un gradiente de temperatura de 16 a 50 ° C con un Aumento de 2 ° C con estabilización

de temperatura durante 1 min y tres medidas tomadas por temperatura (una medida cada 6 s).

Polarización de fluorescencia de condensadores no marcados con DPH. Se utilizaron bicapas de

control para la corrección.

Resultados Las membranas de células de mamíferos y de insectos muestran fluidos similares

ididad a temperaturas fisiológicamente relevantes: inicialmente analizó la viscosidad de las

membranas utilizando medidas de polarización seguras del tinte DPH. La sonda está incorporada

en membranas en paralelo a las cadenas de acilo de los lípidos de membrana, y su polarización de

fluorescencia depende de la viscosidad bicapa ity. Medimos la polarización DPH de las membranas

extraídas de celdas SF9 y HEK 293T en un rango de temperaturas entre 15 y 50 ° C (Fig. 1).

Sorprendentemente, observamos casi valores idénticos (0.219 0.002 para celdas SF9 y 0.211 0.008

para HEK 293T) al comparar la fluidez de ambas membranas a las temperaturas relevantes (es

decir, la temperatura utilizada para el cultivo celular), a saber, 27 ° C para SF9 y 37 ° C para HEK
293T (Fig.1, gris y flechas negras, respectivamente). Curiosamente, la temperatura La dependencia

de la fluidez es mucho menos pronunciada en las células de insectos. membranas en comparación

con las membranas de células de mamíferos (ver abajo). Composición lipídica de membranas de

insectos y mamíferos Análisis cuantitativo de la composición lipídica de las membranas. preparado

a partir de células de insecto SF9 y células HEK 293T de mamífero realizado por MS. A efectos de

cuantificación, las normas internas Los dados para cada una de las especies de PL se agregaron

antes del lípido extracción. Se consideraron todos los lípidos eucariotas principales: PC (y

plasmalogen PCO-), PE (y plasmalogen PEO-), PG, PI y PS, así como SM y colesterol (ver

“Procedimiento experimental dures ”). El método permite la evaluación y corrección de la pérdida

experimental para cada clase de lípidos de una manera específica. Los lípidos extraídos se

sometieron luego a LC de resolución rápida siguiendo reducido por espectrometría de masas de

alta resolución (ESI-QTOF 6520 serie). Primero analizamos las muestras por auto-MS / MS para

identificar tificar los componentes (grupos de cabeza y cadenas de acilo) y luego por MS única para

cuantificar cada uno de los lípidos identificados por auto- MS / MS utilizando las curvas estándar y

los estándares internos. Ambas membranas celulares contienen cantidades comparables de todos

clases de fosfolípidos (Fig. 2A). Contenido de lípidos de la membrana total Las carpas de las

celdas SF9 y HEK 293T estaban compuestas de 18,4 a 23,4% de PS, 7 a 13% de PI, 3% de PG y

alrededor del 11% de SM (fig. 2A). Como era de esperar, se encontró una mayor cantidad de

colesterol en mamíferos. membranas malienses, expresada como la relación colesterol: PL (9

veces mayor en las membranas HEK 293T en comparación con SF9) (figura 2B). La pequeña

cantidad de colesterol identificada en lo más probable es que las células de insectos provengan del

medio de cultivo celular, que de hecho se encontró que contiene bajas cantidades de colesterol

(alrededor del 0,2% de la masa media total; Tabla1). Sin embargo, un significativo Se observó una

gran diferencia al comparar PC y PE cantidades. La EP representó el 38% y la CP el 16% del total

lípidos de membrana en células SF9 (no se encontraron plasmalógenos), mientras que las

membranas HEK 293T contenían 16% PE, 14% PEO-, 36% PC y 5% PCO-. Así, el PE: PC ((PE PEO -) :

( PC PCO-)) es 4 veces mayor en las celdas HEK 293T que en las SF9 (Figura 2C). El análisis de las

cadenas de ácidos grasos muestra para ambos tipos de células una gran dominancia de cadenas

de acilo compuestas por 16 y 18 carbonos (Fig.

2D y Tabla 2) con una distribución igual del 44% entre C16 y C18 en membranas SF9 y una mayoría

de 58% de acilo C18 cadenas versus 30% C16 en HEK 293T. Curiosamente, acilo C16 Las cadenas

contenían más insaturación en SF9 que en HEK 293T células (77 frente a 43%) (Fig. 2E). Nuestros

datos concuerdan en gran medida con los estudios publicados que analizan composición lipídica

de las membranas celulares de insectos (11), en particular Células SF9 (12), especialmente con

respecto a cantidades limitadas de colesterol terol así como por su alto contenido en PE. En

contraste, encontramos que SF9 de manera similar a las células HEK 293T contienen todos los

principales espe- cies, en particular PG, PS y SM, que se describió para Drosoph
pero no se encuentra en estudios publicados anteriormente sobre células SF9. Células cultivadas

de mamíferos epiteliales (Madin-Darby canine kid- células ney) ya se han estudiado por su

composición de lípidos por MS. Los resultados obtenidos están de acuerdo con nuestros datos

relativo a la distribución global de PL (13). Sin embargo, el satu- El estado de ración de las cadenas

de acilo difirió entre ambos estudios. Rea- Se encontraron cantidades notables de ácidos grasos

poliinsaturados en Células renales caninas de Madin-Darby, mientras que nuestros datos solo

muestran trazas de ácidos grasos poliinsaturados en células HEK 293T. Esta diferencia en los

ácidos grasos poliinsaturados podría deberse a diferencias odológicas (preparación y

cuantificación de muestras método) oa diferencias intrínsecas en las líneas celulares utilizadas. El

aumento de la insaturación de PE reduce la dependencia de la temperatura presencia de la fluidez

de la membrana: como se muestra en la figura 1, la fluidez de Las células SF9 muestran poca o

ninguna dependencia de la temperatura en a diferencia de las células de los mamíferos. Los

insectos son generalmente ectotermos y organismos poiquilotermos que están potencialmente

expuestos a rápidos cambios de temperatura en su entorno. De una evolución punto de vista ario,

sería por tanto sensato que la membrana prop- erties de células de insectos, fluidez en particular,

no fluctúan mucho con cambios de temperatura. Por el contrario, los estudios sobre una amplia

gama del organismo han demostrado que, con los cambios de temperatura, control abólico de la

homeostasis de la membrana (por ejemplo, fluidez) típicamente implica la modulación del estado

de insaturación (4, 14-17). Por lo tanto, investigamos si las diferencias en los ácidos grasos

insaturación entre lípidos de células de mamíferos e insectos observado aquí (Fig. 2E) podría

correlacionarse con la diferencia en Sensibilidad a la temperatura. Como se muestra en la Fig.3, la

temperatura La dependencia es menor en presencia de DOPE en comparación con POPE como lo

ilustran las diferencias estadísticamente significativas en pendientes de la polarización de

fluorescencia DPH en función de temperatura. De hecho, en una aproximación lineal, vemos que

para la relación PC: PE en las mezclas (40:60) la pendiente para DOPC: DOPE es la mitad de la de

DOPC: POPE (p 0.001) y la pendiente de el POPC: DOPE es respectivamente 1,5 más pequeño que

el de POPC: PAPA (p 0.005). Esto demuestra temperatura reducida dependencia en presencia de

PE diinsaturada cuando se comparado con PE monoinsaturado. La modulación de la temperatura

La dependencia natural de las insaturaciones era específica de la EP porque noLa diferencia en la

pendiente de las curvas de aproximación lineal fue notado entre DOPC y POPC. Tanto la PE como el
colesterol afectan la microviscosidad in vitro, como Hemos observado que la microviscosidad de la

membrana es casi idéntico en células SF9 y HEK 293T a temperatura de crecimiento turas,

nuestros datos argumentan que el colesterol y la cadena de acilo insaturados ción no son los

únicos reguladores de la fluidez de la membrana de mayor eucariotas y que la relación PE: PC

puede estar involucrada. Así nosotros realizó mediciones de microviscosidad en liposomas de con-

composición controlada, variando las cantidades relativas de PE y PC de cadenas de acilo idénticas

y las cantidades de colesterol (Fig. 4). Como era de esperar, las mediciones de DPH en liposomas

de POPC mantener 0, 10, 20 o 30% de colesterol mostró un claro aumento en Curvas de

polarización DPH, que reflejan un aumento en la bicapa rigidez (Fig. 4A). Se obtuvieron resultados

similares cuando reemplazado el colesterol por PE: es decir, adición de cantidades crecientes de

POPE (40, 50 y 60%) a los liposomas de POPC conduce a una aumento de la polarización de

fluorescencia DPH, reflejando la mejora de la viscosidad bicapa (Fig. 4B), de acuerdo con estudios

previos (18, 19). También comparamos el efecto de la inversión en la relación PE: PC observada

entre SF9 y HEK 293T en presencia de colesterol y notó una clara disminución en la fluidez

cuando la relación PE: PC es mayor (Fig. 4C). Por dispersión dinámica de la luz, determinamos que

el tamaño de todos los liposomas estaba en el mismo rango (180-300 nm), excluyendo un efecto

relacionado con la curvatura en los cambios observados (Tabla 3). En resumen, las mediciones de

polarización DPH indican que el presencia de PE o colesterol mejora la visibilidad de la membrana

cosidad, lo que indica que un equilibrio y regulación entre ellos podría estar involucrado en el

mantenimiento de las propiedades de la membrana celular. Las células de insectos modulan las

cantidades de PE para equilibrar las exógenas Esteroles: para establecer la relevancia biológica de

lo anterior. observaciones, analizamos cómo las células de los insectos adaptan su brana al

aumentar el contenido de esteroles a través de suplementos dietéticos mentación. Cultivamos

células SF9 con o sin FBS al 10%. que contiene colesterol durante 7 días, lo que lleva a un aumento

de 2 veces en el colesterol de membrana (Fig. 5A). Sorprendentemente, a pesar de la aumento de

los niveles de colesterol, fluidez de la membrana del cultivo de FBS células curadas es casi igual en

comparación con el control con Valores de polarización DPH a 27 ° C de 0,210 0,006 y 0,219 0,002,

respectivamente (Fig. 5B).

Luego medimos la distribución PL de ambas muestras por MS y observó que la relación PE: PC se

reduce significativamente en 1.8 (Fig. 5D), lo que refleja una disminución en el contenido de PE de

la membranas de 40 a 32% junto con un enriquecimiento en PC del 18 al 25% en células cultivadas

con FBS en comparación con los controles (Figura 5C). Las cantidades de los otros componentes

lipídicos de las branas permanecieron sin cambios. Las diferencias significativas fueron observado

en la distribución de la longitud de la cadena de acilo de los lípidos totales, es decir, una

disminución de los ácidos grasos C16 junto con un aumento de C20 cadenas (Fig. 5E). Análisis del

estado de saturación de la cadena de acilo (total lípidos y en cada una de las clases PL) muestra un

cambio claro en insatu- distribuciones de raciones (Figs. 5F y 6). De hecho, aunque controla

contenía una mayoría de C16 con una insaturación (85%) ysólo una minoría de C16 saturado (15%),

células SF9 suplementadas con FBS mostró un aumento de cadenas de acilo C16 saturadas (33%)

junto con una disminución de C16 monoinsaturado (67%). No hay diferencia Se observó diferencia
en el estado de saturación de cadenas de acilo de C18. Estos cambios hacia una mayor saturación

también se distribuyeron entre las diferentes especies de fosfolípidos individuales, es decir, PE, PG,

PS y PI (Fig. 6). Estos resultados sugieren que el aumento de El colesterol en las membranas SF9

podría compensarse mediante un disminución en el contenido de PE junto con una disminución en

insaturados Ácidos grasos C16 para mantener una fluidez similar de las membranas celulares. La

disminución del colesterol conduce a la sobreregulación de PE en mamma- Células lianas: para

evaluar si el equilibrio entre el colesterol y PE también está operando en células de mamíferos,

inhibimos cho- síntesis de lesterol en células HEK 293T usando estatinas. Nosotros com-

distribución PL reducida y viscosidad de las membranas de HEK 293T cultivado en medio sin

colesterol con o sin adición de 75 - M simvastatina durante 48 h, un tratamiento que conduce a una

disminución del doble de la relación colesterol: PL (Fig. 7A). A pesar de este cambio, la

microviscosidad de las células tratadas con estatinas no es cambiado en comparación con las

células de control (Fig. 7B). Sorprendentemente, MS El análisis de la distribución PL demostró un

aumento de PE y PEO- de 14 y 4% en controles a 20 y 7%, respectivamente, en membranas tratadas

con estatinas, lo que lleva a un cambio en el PE: PC relación de 0,55 en el control a 0,78 en las

membranas tratadas (Fig.7, C y D). Con la excepción de PC y SM que permanecieron sin cambios

en ambas condiciones, todos los demás PL disminuyeron en estatinas membranas tratadas (Fig.

7C). Sorprendentemente, no observamos un cambio significativo en la longitud o en el estado de

saturación de lípidos totales (Fig. 7, E y F). El estado de saturación de las cadenas de acilo. en las

diferentes especies de fosfolípidos también se mantuvo sin cambios (Figura 8). Tomados en

conjunto, nuestros datos apoyan la hipótesis de que un regulación compensatoria entre el

colesterol y el metabo- lismo en las células eucariotas está involucrado en el control de la

membrana homeostasis.
Discusión El principal hallazgo de este estudio es que tanto mamíferos como Las células de

insectos logran la homeostasis de la fluidez de la membrana no solo modular los niveles de

insaturación y (en células de mamíferos) este- rols sino también cambiando las cantidades de

fosfatidiletanolamina. Específicamente, los cambios en el contenido de esteroles se compensan en

ambos tipos de células por cambios en las cantidades de PE. Esto fue particularmente

sorprendentemente para las células SF9 ya que los insectos no sintetizan esteroles, sugiriendo un

complejo sensible a los esteroles (o sensible a la viscosidad) mecanismo de regulación (ver más

abajo). En el caso de las membranas SF9, un aumento exógeno de esteroides rol condujo a una

reducción en el porcentaje de PE junto con un cambio claro en estado de saturación de la cadena

de acilo. En consecuencia, bloqueando la coles- síntesis de terol en células HEK 293T cultivadas en

medio da como resultado una mejora en las cantidades de PE aunque sin cambios detectables en

el estado de saturación, lo que sugiere que modular las cantidades de PE es un mecanismo

principal para regular fluidez. En este experimento, el alcance de los efectos observados en Las

células HEK 293T tratadas con estatinas fueron algo moderadas, pero Esto probablemente se deba

al hecho de que el tratamiento con estatinas fue intencionado. aliado limitado a 48 h. De hecho,

extender ese tratamiento a 48 a 60 h conduce a un aumento significativo de la muerte celular (20,

21). Nuestro datos implican un control metabólico de HEK 293T y SF9 mem- composición de

lípidos de la brana para mantener las propiedades de la membrana. La medición de la polarización

de fluorescencia DPH se ha utilizado como una herramienta confiable para evaluar la fluidez de la

membrana, pero cuando se aplica a mezclas de lípidos, es razonable aumentar la cuestiones de

porciones y uniones. Como DPH es simétrico Molécula hidrofóbica que se ha demostrado que está

profundamente enterrada. en la región de la cadena de acilo de la bicapa (22), es probable que sea

uniforme distribuidos en ambas capas de las membranas. En este mismo estudio, los autores

muestran que los cambios en la fluorescencia DPH polar- ización en presencia de colesterol

probablemente se deba a un cambio en movimiento y en localización de la sonda. Por el contrario,

los estudios in vitro que investigan el comportamiento de PE: PC ha demostrado que la separación

de fases puede ocurrir a un alto proporción molar de PE (es decir, POPE 30%), lo que sugiere que

los dominios puede formarse en las células SF9 donde detectamos aproximadamente el 38% de PE

total (principalmente DOPE). Aunque vemos un efecto de transición al 60% POPE (40% POPC) por

debajo de 15 ° C, tal comportamiento no fue observado en un rango de temperaturas

fisiológicamente relevante (25–40 ° C). Teniendo en cuenta estos diversos puntos, consideramos

que DPH polarización de fluorescencia razonable para usar como una evaluación confiable Mento
de la fluidez de la membrana para mezclas complejas de lípidos. La medición de la polarización de

fluorescencia DPH se ha utilizado como una herramienta confiable para evaluar la fluidez de la

membrana, pero cuando se aplica a mezclas de lípidos, es razonable aumentar la cuestiones de

porciones y uniones. Como DPH es simétrico Molécula hidrofóbica que se ha demostrado que está

profundamente enterrada. en la región de la cadena de acilo de la bicapa (22), es probable que sea

uniforme distribuidos en ambas capas de las membranas. En este mismo estudio, los autores

muestran que los cambios en la fluorescencia DPH polar- ización en presencia de colesterol

probablemente se deba a un cambio en movimiento y en localización de la sonda. Por el contrario,

los estudios in vitro que investigan el comportamiento de PE: PC ha demostrado que la separación

de fases puede ocurrir a un alto proporción molar de PE (es decir, POPE 30%), lo que sugiere que

los dominios puede formarse en las células SF9 donde detectamos aproximadamente el 38% de PE

total (principalmente DOPE). Aunque vemos un efecto de transición al 60% POPE (40% POPC) por

debajo de 15 ° C, tal comportamiento no fue observado en un rango de temperaturas

fisiológicamente relevante (25–40 ° C). Teniendo en cuenta estos diversos puntos, consideramos

que DPH polarización de fluorescencia razonable para usar como una evaluación confiable Mento

de la fluidez de la membrana para mezclas complejas de lípidos. La fluidez de la membrana y / o la

alteración de la composición lipídica pueden ser responsable del comportamiento patológico de las

células. El efecto de la modulación de la composición lipídica en los glóbulos rojos se ha

extensamente estudiado. De hecho, la reología de los eritrocitos es alterada en pacientes con

hipercolesterolemia debido a una aumento de la relación colesterol: PL y alteración de la fluidez de

la membrana (23, 24). El tratamiento con estatinas reduce la cantidad de colesterol en el

membranas y normaliza la fluidez de la membrana de los eritrocitos (10, 25). De manera similar, la

diabetes tipo 2 resistente a la insulina puede resultar de composición de lípidos modificada de las

membranas de eritrocitos, en particular, la saturación de ácidos grasos y la relación PE: PC (9). Por

lo tanto, la La homeostasis lipídica de las membranas celulares es crucial para la cumplimiento de

sus funciones. Debido a que los eritrocitos carecen de núcleos, pueden carecer de elementos de

regulación que permitan el mantenimiento de sus propiedades de membrana, aunque el

intercambio de colesterol con proteínas de baja densidad (26). Nuestros datos plantean las

preguntas de cómo se considera la fluidez de la membrana. controlados en estas celdas y si hay un

sensor de fluidez directo en la membrana. Considerando que las células de insectos comparten PL
similares composición como células de mamífero, ¿cómo regulan su fluidez de la membrana en

ausencia de esterol endógeno? El r- sensores de fluidez y mal regulados por la composición de

lípidos tienen se ha descrito durante mucho tiempo en las membranas bacterianas. Por ejemplo, el

La vía de dos componentes (DesK / DesR) de Bacillus subtilis es capaz de sentir el cambio en las

propiedades de la membrana con la temperatura ature cambian y desencadenan la expresión de

acil-lípido desaturasa para aumentar las cantidades de ácidos grasos insaturados en la brana y así

mantener la fluidez (3). Fluidez de la membrana También se describieron rutas de control en

células de levadura. El Rho / La vía de señalización PKC1 / MAPK parece estar implicada en

homeostasis de la fluidez de la membrana como lo demuestran los estudios genéticos de

mutantes de levadura y está regulada por cadenas de acilo PL (27).

IRE1 es un sensor de estrés del retículo endoplásmico conservado en eucariotas que detecta, a

través de su dominio transmembrana, perturbaciones bciones como el aumento de la saturación de

lípidos y alerta a los lípidos Maquinaria de biosíntesis para restaurar el retículo endoplásmico.

homeostasis de la membrana mediante la síntesis de lípidos insaturados. Cualquier modificación

incontrolada del saturado / insaturado equilibrio de lípidos (como un aumento en el contenido de

ácidos saturados en retículo endoplásmico) puede conducir a insuficiencia hepática en

enfermedades como la obesidad y la diabetes (5, 28). Estudios previos de los laboratorios Brown y

Goldstein (8, 29, 30) han descrito que la vía SREBP implicada en La homeostasis del colesterol y los

ácidos grasos en las células de los mamíferos es presente en células de insectos donde participa

en el control de ácidos grasos síntesis y puede ser regulado por un fosfolípido con un palmito tate

(muy probablemente el Papa). De hecho, en las celdas HEK 293T, el La regulación a la baja de la

cascada SREBP puede ser activada por acumulación de colesterol y / o ácidos grasos insaturados

en las células para mantener la homeostasis metabólica de ambos. En con- Por el contrario, los

estudios en células de Drosophila muestran que la PE y la PE palmitada en particular controlar la

liberación de SREBP y ejercer retroalimentación sobre síntesis de otros fosfolípidos y ácidos grasos

(29). Este reglamento Podría ser necesaria una acción para mantener una determinada

composición lipídica de membranas celulares y, por lo tanto, para el ajuste de la síntesis de lípidos

comosugirieron los autores. Sin embargo, una relación directa o equilibrio entre las cantidades de

PE palmitado y colesterol en la misma células nunca se ha establecido. Además, el vínculo entre

Regulación SREBP por colesterol / PE palmitado para ajustar lípidos composición y conservación

de las propiedades de la membrana, como fluidez, se sugirió pero nunca se investigó. La similitud

en el comportamiento observado entre insectos y células de mamíferos podrían indicar que

dependen de comparables mecanismos moleculares para mantener las propiedades de la

membrana y homeostasis no solo regulando el estado de saturación de los fosfolípidos recién

sintetizados, sino también por una fina equilibrio sintonizado entre PL (especialmente PE) y

colesterol contenido de las membranas. La implicación de una membrana sensor de fluidez en esta

regulación es la pregunta clave que necesita ser investigado en el futuro. Evidentemente,

estableciendo la base molecular de esta regulación podría traer nuevos per- espectivas en la

comprensión de la fisiopatología procesos relacionados con la hipercolesterolemia.