TDUEX 2013 Ordiales Rey PDF

ESCUELA DE INGENIERÍAS AGRARIAS
DEPARTAMENTO DE PRODUCCIÓN ANIMAL Y

CIENCIA DE LOS ALIMENTOS
CARACTERIZACIÓN DEL CARDO (Cynara

cardunculus, L) PARA SU USO COMO CUAJO
VEGETAL EN EL PROCESO DE ELABORACIÓN
DE LA TORTA DEL CASAR
Memoria que presenta la Ingeniera

Dña. Elena Ordiales Rey
para obtener el Título de Doctor
Badajoz, Julio de 2012
Escuela de Ingenierías Agrarias
Ciencia y Tecnología de los Alimentos
DEPARTAMENTO DE PRODUCCIÓN
ANIMAL Y CIENCIA DE LOS ALMENTOS
Ctra Cáceres s/n

06071- BADAJOZ
Teléfono: 924286200
Fax: 924286201
María de Guía Córdoba Ramos, Profesora Titular del Área de Nutrición y

Bromatología del Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos
de la Universidad de Extremadura
INFORMA:
Que la Tesis Doctoral titulada “Caracterización del cardo (Cynara cardunculus, L)

para su uso como cuajo vegetal en el proceso de elaboración de la Torta del Casar”
presentado por Doña Elena Ordiales Rey ha sido realizada bajo mi dirección en el
Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos de la Universidad
de Extremadura y cumple las condiciones exigidas para optar al Título de Doctor.
Lo que firma en Badajoz a Lunes, 2 de julio de 2012.
Fdo: María de Guía Córdoba Ramos

Ctra Cáceres s/n

06071- BADAJOZ
Fax: 924286201
Alberto Martín González, Profesor Titular del Área de Nutrición y Bromatología del
de Extremadura
INFORMA:

presentada por Doña Elena Ordiales Rey ha sido realizada bajo mi dirección en el
Fdo: Alberto Martín González

Ctra Cáceres s/n

06071- BADAJOZ
Fax: 924286201
María José Benito Bernáldez, Profesora Titular del Área de Nutrición y

Bromatología del Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos
de la Universidad de Extremadura
INFORMA:

presentada por Doña Elena Ordiales Rey ha sido realizada bajo mi dirección en el
Fdo: María José Benito Bernáldez

Agradecimientos
Tras haber recorrido el camino que tiene su primer parada en la defensa de mi trabajo de tesis,
y con el que he satisfecho las inquietudes y motivaciones que me llevaron a emprenderlo,
pongo el conocimiento generado y recogido en esta tesis a disposición del sector quesero de
Extremadura, en especial a aquellos que se dedican a elaborar la “Torta del Casar”, por si les
resulta útil para mejorar su conocimiento sobre el cuajo y su procedencia, su manejo y la
influencia que ejerce en el producto final. Aprovecho para, desde aquí, despertar la consciencia
en los productores, que deben proteger el patrimonio natural que constituye el cardo en
Extremadura, ya que es un ingrediente fundamental para ellos, y ellos deben ser los más
interesados en conservarlo y controlarlo.
Esta es mi pequeña y humilde contribución a un producto que está llevando el nombre de mi

pueblo por todo el mundo.
A todas las personas que me han ayudado a llevar a cabo este trabajo de Tesis Doctoral:
A mis directores de tesis, Prof. Dr. Alberto Martín, Prof. Dra. Mª José Benito y Prof. Dra. Mª de
Guía Córdoba, por vuestra disponibilidad, por vuestra generosidad, por adaptaros a mi horario,
por vuestro tiempo, por todo lo que he aprendido con vosotros, por el apoyo, por ayudarme en
todo y más de lo que he necesitado en todo este tiempo, por todo lo que me habéis aportado a
nivel profesional y personal.
Al resto de miembros del grupo de investigación CAMIALI, Prof. Dr. Alejandro Hernández, Prof.
Dr. Emilio Aranda, Prof. Dr. Francisco Pérez, por vuestro apoyo y asesoramiento, por vuestra
disponibilidad, simpatía y amabilidad en todo momento.
Al Dr. Santiago Ruíz - Moyano, por todas las horas de laboratorio desde que empezamos con la
beca de colaboración, por venir a trabajar en fin de semana para ayudarme a hacer los quesos,
por traerme cuajo de su tierra, por la búsqueda de artículos en Davis, por su apoyo
incondicional incluso desde California, por sus palabras de ánimo, por entenderme, por ser mi
amigo.
A todos los compañeros con los que he compartido horas y horas en el laboratorio, protocolos,
reactivos, material, etc. desde que empecé este proyecto, muchos de ellos ya Doctores o a
punto de serlo, Dr. Julio, Vita, Guti, Alejandro, Dra. Rocío, Marga, Mª José, Nieves, Malu y el
resto de compañeros, en especial al Dr. Manuel Serradilla, que es el mejor reviewer y a la Dra.
Alicia Rodríguez, por nuestra amistad.
A Mariano Cabrero porque siempre creyó en mí y en mi proyecto, por su interés y su

amabilidad, por sus ánimos y por la energía positiva que me transmite.
A Cándido Cebrián, allí donde esté, por ponerme en marcha la planta piloto y evitarme tener
que leer las instrucciones de los aparatos, y porque nunca me regañó aunque le quedara
muchas cosas para fregar.
A Mª de Guía, por la confianza que depositó en mí desde el principio para poner en marcha
este proyecto y porque gracias a ti se ha convertido en realidad, por el tiempo que me has
dedicado aún cuando no tenías tiempo, por no dejar que me conforme ni me rinda, por las
palabras de ánimo de cada día, por enseñarme a ser mejor profesional y por la confianza a
nivel personal.
A la DOP Torta del Casar, y en especial al Director Técnico, Javier Muñoz, por su colaboración
en la ejecución de este trabajo, por enseñarnos a elaborar el producto y por hacernos llegar los
problemas del sector. Por los datos proporcionados sobre producción, certificación, etc.
A los maestros queseros de Torta del Casar, Jesús Moreno, Diego Lindo y David Franco, por
aguantar mis entrevistas, contarme los trucos, prestarme moldes, y estar siempre dispuestos a
ayudarme.
A la DOP Queso de la Serena por facilitarme los datos de producción e invitarme a sus
queserías.
A Arturo por confiar en que no le iba a quitar el negocio y enseñarme las localizaciones donde
recoge el cardo.
Al Prof. Dr. Abelardo García, por creer en mí, por enseñarme que la tesis sería una carrera de
obstáculos, por las recogidas de cardo en el campo, por los consejos, por estar siempre ahí.
Al Dr. Jerónimo González, de la Finca La Orden-Valdesequera, por prestarme su ayuda y por las
muestras de Cynara cardunculus que recogimos de su plantación.
A Juan Labrador, Raúl Labrador y Arturo Hernández por acompañarme a buscar los cardos en
el campo.
A mis compañeros de CTAEX, Patricia, Abel, Raquel, Isa, Rosa y Carmen, que me han ayudado
con algunos análisis de laboratorio. A mis compañeros del área de Agricultura de CTAEX, y
Aurori y Ángela, por todo lo que me han enseñado estos años, por su cariño, por su apoyo, y
por nuestros desayunos.
A mis amigos, porque siempre estáis cuando os necesito, por vuestras muestras de cariño,
apoyo y comprensión, por alegraros de mis triunfos y acompañarme en mis derrotas. En
especial a Verónica por sus correcciones y consejos.
A toda mi familia, por estar en los buenos y malos momentos, por todos los ratos que
compartimos, por todo lo que he aprendido de cada uno de vosotros, por el camino que nos
queda recorrer juntos, en especial a mi abuela Brígida.
A mis padres, Juan y Maxi, y mis hermanos, Juan Antonio y Prado, por vuestro apoyo y
entusiasmo con este proyecto, por ser mi fuente de inspiración, por recargarme las pilas, por
ayudarme a levantar cada vez que caigo, por escucharme, por dejarme elegir, por corregirme
cuando me equivoco, por enseñarme que nunca me iban a regalar nada en la vida, por ser mi
refugio.
Hay una fuerza motriz más poderosa que el vapor,
la electricidad y la energía atómica, la voluntad.
Albert Einstein
A Juan, Maxi, Juan Antonio y Prado
I.-INTRODUCCIÓN
Introducción
I.1. EL QUESO
I.1.1. Definición de queso

Según el Codex Alimentario, se entiende por queso el producto blando,
semiduro, duro y extra duro, madurado o no madurado, y que puede estar recubierto, en
el que la proporción entre las proteínas del suero y la caseína no sea superior a la de la
leche, obtenido mediante:
a) Coagulación total o parcial de la proteína de la leche, leche

desnatada/descremada, leche parcialmente desnatada/descremada, nata (crema)
de suero o leche de mantequilla/manteca o de cualquier combinación de estos
materiales por acción de cuajo u otros coagulantes idóneos, y por escurrimiento
parcial del suero que se desprende como consecuencia de dicha coagulación,
respetando el principio de que la elaboración del que resulta en una
concentración de proteína del queso que deberá ser evidentemente más alto que
el de la mezcla de los materiales lácteos ya mencionados, en base a la cual se
elaboró el queso y/o
b) Técnicas de elaboración que comportan la coagulación de la
proteína de la leche y/o de productos obtenidos de la leche que dan un producto
final que posee las mismas características físicas, químicas y organolépticas que
el producto definido en el apartado a).
I.1.2. Producción de queso a nivel mundial, nacional y regional

La producción de queso en el mundo ha aumentado un 76,3 % en los últimos 30
años, hasta 19,1 millones de t en 2008. Estados Unidos es el mayor productor de queso
a nivel mundial, produciendo más de 4,8 millones de t en 2008, lo que supone un 39,7
% de la producción mundial. En Europa, Alemania y Francia son los países que más
cantidad de queso produjeron, con 1995 miles de t y 1812 miles de t, respectivamente
en 2008, según datos de la FAO (2008).
En España se produjeron 312900 t de queso, en 2009, según los datos del

MARM. En función del origen de la leche, un 13,7 % del queso producido fue puro de
oveja, frente al 39,5 % de vaca, el 6,7 % de cabra, y un 40,1 % de mezcla de los
distintos tipos de leche. Atendiendo a las categorías de queso, un 20 % de los quesos era
de pasta blanda y semiblanda, un 35 % de pasta semidura y dura y un 41 % de queso
fresco.
3
Introducción
La DOP Torta del Casar certificó más de 500000 unidades de queso tipo torta en
2010. Desde su constitución la producción de quesos amparados bajo esta marca de
calidad ha pasado de 156000 kg de queso en 2002 a 381716 kg de queso en 2010, es
decir, la producción se ha duplicado. En este tiempo el nº de ganaderías inscritas a la
DOP ha disminuido de 39 a 28, sin embargo, la producción no se ha visto
comprometida, dado que estas ganaderías han aumentado su capacidad, con un mayor nº
de cabezas inscritas a la DOP. Unido a ello el nº de industrias inscritas a la DOP
también ha experimentado un aumento desde 2002, como se observa en la Tabla I.1.
Tabla I.1. Evolución del nº de ganaderías, cabezas e industrias inscritas a la DOP Torta del
Casar.
Nº ganaderías inscritas Nº cabezas inscritas Nº industrias inscritas
2002 39 19100 8
2003 45 21650 9
2004 51 23600 9
2005 58 25300 12
2006 52 28800 13
2007 50 27650 13
2008 41 26416 13
2009 30 26632 14
2010 28 24656 14
Analizando la evolución de los datos de producción de leche y queso en los

últimos diez años, se observa una tendencia al alza desde 2002 hasta 2007, cuando se
registraron cifras récord de producción, en términos de litros de leche y kg de queso
certificados, así como de nº de ganaderías y nº de cabezas inscritas. A partir del año
2007 se registran valores más estables de producción, en torno a 285 mil litros de leche
certificada y 375 mil kg de queso certificados (Figuras I.1 y I.2).
4
Introducción
3500000
3000000
2500000
2000000
L
1500000
1000000
500000
0
2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Figura I.1. Cantidad de leche (L) certificada por la DOP Tota del Casar.
450000
400000
350000
300000
250000
kg
200000
150000
100000
50000
0
2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
kg queso certificados formato M kg queso certificados formato L
Figura I.2. Cantidad de queso (kg) certificado por la DOP Torta del Casar.
A lo largo de la vida de la DOP Torta del Casar se ha constatado un cambio en el

formato tradicional de presentación de la Torta, debido a un cambio en el gusto del
consumidor, que demanda productos de menor tamaño, lo cual obligó a los industriales
5
Introducción
a fabricar quesos tipo torta de 0,5 kg, en lugar de las piezas de 1 kg. De modo que se
observa que la cantidad de queso de 0,5 kg ha ido aumentando en los últimos años, en
detrimento de la cantidad de queso de 1 kg de peso (Figura I.2). Desde 2010 la DOP
Torta del Casar también certifica piezas de torta de 0,25 kg de peso, para satisfacer las
demandas del consumidor.
Tabla I.2. Datos de ventas de quesos, en t de queso, en los ámbitos nacional e internacional.
Ventas (t) 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Nacional 154 212,4 264 301,1 389,5 397,9 369,3 339,1 369,3
Internacional 2 23,6 26,1 31,3 31,2 24,6 14,5 12,6 12,4
Las ventas de Torta del Casar en el ámbito nacional han aumentado de forma
progresiva desde 2002 a 2010, alcanzando el máximo en 2007, con 397984 kg de queso
vendidos. La evolución de las ventas a nivel internacional difiere de la tendencia al alza
del terreno nacional, ya que aumentaron hasta 2005, cuando alcanzaron su mayor valor,
pero disminuyen desde entonces de forma progresiva hasta 2010, cuando se destinaron
al mercado internacional poco más de 12000 kg de queso Torta del Casar. El 87 % de
las ventas internacionales se produjeron en los países europeos en 2006, y un 81 % en
2010. El continente americano absorbió un 12 % de estas ventas en 2006 y un 17 % en
2010. Entre el 1 y 2 % de las ventas internacionales se realizaron a países del resto del
mundo. (Datos proporcionados por la DOP Torta del Casar).
La DOP “Queso de La Serena” ampara a quesos elaborados a partir de leche

cruda de oveja, cuajada con el extracto acuoso obtenido de las flores de Cynara
cardunculus, en la zona de La Serena, en la provincia de Badajoz. Esta DOP fue creada
en 1991 y su reglamento se aprobó el 29 de abril de 1992, goza del carácter de
“protegida” desde 1996, y es la DOP más antigua de Extremadura. En la actualidad
agrupa a 18 industrias queseras.
6
Introducción
1400000
1200000
1000000
800000
L
600000
400000
200000
0
2006 2007 2008 2009 2010
Figura I.3. Producción de leche (L) para la elaboración del “Queso de La Serena” desde 2006.
250000
200000
Piezas de queso certificadas
150000
100000
50000
0
2006 2007 2008 2009 2010
Figura I.4. Piezas de queso certificadas por la DOP “Queso de La Serena” desde 2006.
La producción de leche para la elaboración del “Queso de La Serena” ha ido

disminuyendo desde el año 2006, cuando se registró una producción de 1333 miles de
L, hasta el año 2010, con apenas 900 mil litros. Por tanto, la cantidad de piezas de queso
7
Introducción
certificadas en este tiempo ha seguido la misma tendencia, de forma que en 2006 se

certificaron 212 mil piezas, cantidad que se ha ido reduciendo hasta las 192 mil piezas
certificadas en 2010. (Datos proporcionados por la DOP Queso de La Serena).
I.1.3. Tipos de quesos más importantes

Los quesos elaborados a partir de leche de oveja y de cabra presentan un
especial gusto y sabor, muy distintos de los procedentes de leche de vaca. Estas
diferencias sensoriales se deben a la distinta composición de la leche de origen,
especialmente en cuanto a grasa y proteína. Dentro de una misma especie, las
variaciones en la composición de la leche se deben a factores genéticos, fisiológicos y
ambientales.
Existen seis familias de queso de oveja importantes: blanco o fresco, de

salmuera o de vinagre, duro y semi-duro, de veta azul, de cuajada extendida, y quesos
de suero (requesón) (Medina, 2004).
Entre los quesos franceses elaborados con leche de oveja se destacan el queso
Roquefort, Ossau-Iraty y Broccio, que representan el 40 % de todos los quesos
producidos en Francia, con este tipo de leche.
El queso Roquefort es el tipo de queso azul de leche de oveja más importante,

con origen muy antiguo y está protegido bajo una Denominación de Origen Protegida
desde 1925. Se elabora con leche cruda de oveja en el sur de Francia y Córcega. La
leche a una temperatura entre 28-30º C es inoculada con un estárter láctico mesofílico.
Las esporas de Penicillium roqueforti se añaden a la leche, o se espolvorean, como una
suspensión, sobre la cuajada, cuando ésta se pone en los moldes. Después del desuerado
y el salado los quesos se transportan a cuevas naturales, aireadas y húmedas, donde
tiene lugar la maduración. Los quesos con betas son de forma cilíndrica, de 10 cm de
alto y un peso en torno a 2,5 y 2,9 kg.
El queso Ossuau-Iraty se elabora en el suroeste de Francia, a partir de leche de

oveja, bien cruda o bien pasterizada. Tras el cuajado, la cuajada se calienta a 36 – 44º C.
Los quesos maduran durante al menos 3 meses. Es similar al queso Roncal, hecho al sur
de los Pirineos.
8
Introducción
Broccio es un queso de suero producido en Córcega, que recibió la DOP en

1988. El suero fresco se mezcla con leche de oveja y se calienta a 80 – 90º C. La masa
resultante se coloca en moldes y se desuera. Este queso se come fresco, dentro de las 48
h de elaboración y tiene un sabor suave.
En Grecia existe gran tradición en la producción de quesos. Un 39 % de la

producción corresponde a queso de leche de vaca, un 36 % a quesos de leche de oveja y
un 25 % a quesos de leche de cabra. En este país, 23 de las 26 tradicionales DOP de
quesos se refieren a quesos elaborados con leche de oveja mezclada con leche de cabra.
El queso Feta es el queso griego tradicional más famoso. Es de pasta blanda,

madurado y mantenido en salmuera (10-12 % NaCl) durante al menos dos meses. Se
elabora con leche de oveja al 100 % o con una mezcla del 30 % de leche de cabra. Hoy
en día se elabora a partir de leche pasterizada con cultivos estárter mesofílicos y
termofílicos. Presenta un sabor salado y ligeramente ácido, color blanco natural, una
textura firme y lisa, y unas características organolépticas agradables.7
El queso Galotyri es de tipo blando, con textura untuosa y cremosa, producido

con leche de oveja, de cabra, o mezcla de ambas. La leche se calienta hasta la cocción y
se deja en recipientes a temperatura ambiente durante 24 horas. Se añade la sal y se
dejan otros 2 – 3 días a temperatura ambiente. Se puede añadir el cuajo para favorecer la
coagulación.
Kopanisti es otro queso blando griego, producido con leche de vaca, oveja o
cabra, o mezcla de ellas. La leche se coagula a 28 – 30º C en 2 horas. La cuajada
desuerada es salada, distribuida en recipientes, y se mantienen en un lugar fresco con
alta humedad relativa para favorecer el crecimiento de moho en la superficie. Presenta
una textura blanda, untuosa, con sabor salado y picante.
Kasseri es un queso griego semiduro de leche de oveja, que puede llevar hasta
un 20 % de leche de cabra, pudiendo utilizarse leche cruda o pasterizada. La cuajada se
calienta a 38 – 40º C, se desura hasta que el pH baja a 5,2. La cuajada se corta en
lonchas, que se extienden en agua a 70-80º C durante 15 minutos y se introducen dentro
de moldes durante 2 – 3 días. Maduran en sal, a 18º C durante no menos que 3 meses.
El queso Graviera Kritis es un queso duro elaborado en Creta, a partir de leche

de oveja. Es un queso tipo Gruyere, que sufre una limitada fermentación ácida y
9
Introducción
propiónica, que aporta al queso un sabor ligeramente dulce. La leche se calienta a 70º C,
y la cuajada se corta y se escalda a 50 – 52º C. Los quesos tienen un diámetro de 40 cm
y pesan entre 14 y 16 kg. Se maduran durante 90 días a una temperatura entre 15 – 16º
C.
Otro tradicional queso griego, de pasta dura es Kefalograviera, elaborado con

leche de oveja o mezcla de leche de cabra y oveja, principalmente en el oeste de
Macedonia. La cuajada se rompe y se calienta a 48º C, se moldea y prensa. El queso se
mantiene a 14 – 16º C durante 24 horas, y en salmuera durante 2 días. La maduración se
produce a 6º C durante al menos 3 meses. Es un queso de forma circular, con numerosos
agujeros, agradable sabor salado y rico aroma.
Entre los quesos italianos se destacan por su importancia los tipos Pecorino
Romano, Pecorino Siciliano, Pecorino Toscano y Pecorino Sardo.
De ellos, el más famoso es el queso Pecorino Romano, elaborado con queso de

oveja, y textura dura, procedente del área alrededor de Roma y Cerdeña. La leche
calentada a 68º C se inocula con un cultivo estárter, obtenido del suero residual del
queso Ricotta. La cuajada se corta, se cocina a 45-46º C, y tras 30 minutos la cuajada se
moldea y se presa para facilitar el drenaje del suero. Los quesos se salan cada 30-60 días
y se maduran a 10 – 14º C durante 5 – 8 meses (Battistotti y Corradini, 1993).
El queso Pecorino Sardo es un queso semicocinado producido en Cerdeña, a

partir de leche de oveja, inoculada con cultivo estárter natural de suero. Se usa cuajo
animal para coagular la leche. La cuajada se calienta a 41-42º C y se mantiene a esta
temperatura durante 10 minutos. Los quesos se mantienen en salmuera durante 48
horas, y se maduran durante 20-60 días, el tipo semicurado, mientras que la maduración
es de 4 meses para el tipo de queso curado.
Pecorino Siciliano es otro de los quesos de pasta dura de Italia, se elabora con
leche de oveja, empleando cuajo animal. Se consume en diferentes estados de
maduración, fresco, salado durante 1 semana o curado tras 4 meses. Su composición y
propiedades físico – químicas fueron descritas por Gattuso y col. (1995) y sus
características microbiológicas por Giudici y col. (1997).
A diferencia de estos quesos italianos, Pecorino Toscano es un queso de pasta

blanda o semiblanda, de la Toscana. Se emplea leche de oveja, inoculada con cultivos
10
Introducción
estárter y a veces se añaden enzimas lipolíticas. La coagulación con cuajo animal tiene
lugar a 35-38º C en 20 – 25 minutos. Los quesos se salan durante 24 horas, y se
maduran por un periodo mínimo de 20 días para el queso blando y 4 meses para el
queso semiblando. Su sabor es aromático y ligeramente picante. Sus características y
tecnología fueron descritas por Neviani y col. (1998).
La mayoría de los quesos portugueses se fabrican siguiendo métodos

tradicionales, a partir de leche cruda en la mayor parte de los casos, y sin añadir cultivo
estárter. Los quesos portugueses más conocidos son Serra da Estrela, Serpa, Azeitao y
Castelo Branco. Estos quesos, junto con alguno más, como Évora o Nisa, están
amparados bajo DPO. La principal característica que distingue estos quesos de otros
elaborados a partir de leche de oveja es su textura blanda o semi blanda, debido no a la
leche o la tecnología empleada, sino al coagulante vegetal altamente proteolítico
empleado (Medina, 2004).
El queso Azeitao es un queso de textura semi-blanda, con pocos o ningún

agujero, hecho cerca de Lisboa. La coagulación de la leche salada se produce a una
temperatura entre 30 – 35º C, mediante cuajo vegetal. Se madura en dos etapas,
inicialmente los quesos permanecen a temperatura ambiente durante 10 días a 90 – 95 %
de humedad relativa. Durante la segunda fase de maduración, los quesos se mantienen a
10-15º C y 85-90 % de HR durante 2 -3 semanas (Freitas y col., 2000).
Castelo Branco es un tipo de queso de textura semi – blanda, de la parte centro-

oeste de Portugal (Freitas y col., 2000). Presenta un flavor más fuerte y ligeramente
picante, y con una corteza más compacta que el queso Serra da Estrela. Este queso se
obtiene tras un ligero desuerado de la cuajada después de la coagulación de la leche con
cuajo vegetal a una temperatura de 20-30º C. Se maduran durante 40 – 50 días a 8-14º C
y una HR de 80-90 %.
El queso Serpa presenta también una textura semi – blanda, con pocos o ningún
agujero en su pasta, y se elabora en la región de Serpa, con leche de oveja Merino
(Freitas y col., 2000). Se caracterizan por su fuerte sabor, bastante picante. Su
maduración se produce en dos etapas, a 6-10º C y 95 – 100 % de HR y 7-11º C y 75-90
% de HR durante 30 – 40 días.
11
Introducción
El queso portugués más tradicional es Serra da Estrela, producido en las

montañas de Serra da Estrela. Se caracteriza por un fuerte aroma, un flavor ligeramente
ácido y textura blanda con pocos ojos. En su proceso de elaboración la leche se calienta
a 27-30º C y se coagula con cuajo vegetal durante 1 – 2 horas. La cuajada se corta
manualmente y se coloca en los moldes, donde se desuera parcialmente. La maduración
se prolonga durante 30-45 días, a 6-12º C y 85-90 % de HR (Sousa y Malcata, 1998).
España se caracteriza por ofrecer una gran variedad de quesos, entre ellos se
destacan Afuega L’Pitu, Cebreiro, Arzúa-Ulloa, San Simón Da Costa, IGP Valdeón,
Garrotxa, Tronchón, Rondeño, Monte Enebro, Peñamellera, Sierra de Cazorla,
Gamonedo. Muchos de los quesos españoles están amparados bajo la marca de caidad
Denominación de Origen Protegida, como Palmero, Manchego, Idiazábal, Roncal,
Zamorano, La Serena, Torta del Casar, Tetilla, Mahón, Cantabria, Alt Urgell, Quesucos
de Liébana, Ibores, Majorero, Murcia al vino, Cabrales y Picón de Bejes-Tresviso.
En España existen seis DOP de quesos elaborados con leche de oveja,

Manchego, Roncal, Idiazábal y Zamorano, de pasta dura, y Queso de la Serena y Torta
del Casar, de pasta blanda, elaborados con cuajo vegetal.
El queso Manchego se elabora con leche pasterizada o cruda de oveja

Manchega. Su forma es cilíndrica y su corteza dibuja el molde de esparto usado de
forma tradicional. Si se utiliza leche cruda no se añade cultivo estárter, mientras que si
se emplea leche pasterizada, se añade un cultivo estárter láctico y mesofílico. La
ciagulación se lleva a cabo con cuajo animal a 30 – 32º C en 30 – 40 minutos. La
cuajada se corta en cubos de 4 – 6 mm y se escalda a 36-38º C durante 15 minutos
mientras se remueve. Los quesos se presionan durante 6 – 18 horas, se salan en
salmuera, durante 24-48 horas y se mantienen a 10-15º C durante al menos 2 meses.
Idiazábal es un queso de textura semidura o dura, producido en el País Vasco y

Navarra, a partir de leche de ovejas Lachas. Su producción industrial está basada en los
métodos tradicionales. Se añaden cultivos iniciadores homofermentativos previamente a
la coagulación de la leche, la cual se realiza mediante cuajo animal a 30º C. La cuajada
se corta en gránulos de 5-10 mm y se calienta a 37º C. Se coloca en moldes, se prensa
durante 6 horas, se sala durante 24 – 48 horas mediante inmersión en salmuera, o con
sal seca. Los quesos maduran a 10º C y 80 % de HR durante 2 -12 meses. El proceso de
12
Introducción
ahumado que se aplica al tercer mes del proceso de maduración, mediante la

combustión de madera de Alnus glutinosa durante 24 h a 15º C es opcional.
El queso Roncal es de pasta dura, elaborado en Navarra, con leche cruda de

oveja. Su procesado es similar al del queso Manchego, excepto en que la temperatura de
coagulación es más alta (32 -37º C), son de menor tamaño y el tiempo de maduración es
de 4 meses. Las características bioquímicas y microbiológicas de este queso han sido
publicadas (Ordóñez y col., 1980; Millán y col., 1992; Arizcun y col., 1997).
En Zamora se produce el queso Zamorano, de pasta dura, elaborado a partir de

leche cruda de ovejas Churra y Castellana. La leche se coagula, con cuajo animal a 28-
32º C durante 30-45 minutos. La cuajada se corta en piezas de 5 – 10 mm, y se calienta
a 38-40º C antes del moldeado y prensado. Los quesos se salan, bien con sal seca, o por
inmersión en salmuera durante 36 h, y se maduran al menos durante 100 días.
El Queso de la Serena se caracteriza por su pasta semi-blanda y se produce en el

sureste de Extremadura, a partir de leche de oveja Merino. La leche cruda se coagula a
25 – 32º C durante 50 – 70 minutos con cuajo vegetal, obtenido mediante la maceración
de flores secas de C. cardunculus durante 24 h. La cuajada se corta en granos de 10-20
mm y después se elimina el suero. Tras el prensado de la cuajada en los moldes, la
maduración se produce durante al menos 60 días a 8-12º C y 85-95 % HR. Su corteza es
de color marrón, y la pasta toma la textura blanda debido a la proteólisis que ejerce el
cuajo vegetal.
La Torta del Casar es un queso de pasta semiblanda, producido en la zona centro

de Extremadura, alrededor de Cáceres, a partir de leche cruda de oveja Merino, la cual
se coagula mediante cuajo vegetal a 25 – 30º C. El proceso de elaboración es similar al
descrito para el Queso de La Serena (Mas Mayoral y col., 1991).
Recientemente se ha aprobado la Norma de composición y características

específicas para el queso “Ibérico”, mediante el R.D. 262/2011 de 28 de febrero, en el
que se define como un queso de pasta prensada, no cocida, de consistencia semidura a
dura, de forma cilíndrica, con dimensiones variables, de altura comprendida entre 7 y 12
cm y diámetro entre 9 y 24 cm, y pesos variables sin sobrepasar 4 kg. Corteza de
consistencia semidura a dura y aspecto seco, con coloración que puede presentar
tonalidades variables desde blanco amarillento hasta el negro verdoso. Pasta de textura
13
Introducción
firme y compacta y color blanco amarillento. Se elabora a partir de leche de oveja, vaca
y cabra.
I.1.4. La Torta del Casar
I.1.4.1. Descripción de la Torta del Casar

La Torta del Casar es un queso de pasta blanda, obtenido por coagulación
enzimática (Chamorro y Losada, 2002), elaborado con leche de oveja en Casar de
Cáceres y pueblos de los alrededores. Las piezas son de forma cilíndrica, con las caras
marcadas por rayas, con la corteza lisa y cerosa. Con la masa interior cerrada, blanda y
untuosa. Su sabor es agradable, algo amargo y mantecoso al paladar.
La zona de producción abarca 36 términos municipales de la provincia de

Cáceres, aunque tradicionalmente la Torta del Casar se ha elaborado en los términos de
Casar de Cáceres, Arroyo de la Luz, Garrovillas, Malpartida de Cáceres, Hinojal,
Santiago del Campo, Sierra de Fuentes, Torreorgaz y Valdefuentes. Se trata de un queso
puro de oveja de la razas “Merina” y “Entrefina”, elaborado con leche cruda y con una
maduración mínima de 60 días. Su corteza es fina y ligera, de color amarillo céreo a
ocre. En ocasiones dicha corteza se agrieta, permitiendo el vertido de su pasta, que es
untuosa, cremosa, casi líquida, de color amarillento, y sabor y aroma excepcional. La
elaboración se caracteriza por el empleo como coagulante de la leche de la flor del
cardo Cynara cardunculus L. (Mesías y col., 2001).
La DOP Torta del Casar fue aprobada por Orden de 9/10/2001 de la Consejería
de Agricultura y Medio Ambiente de la Junta de Extremadura (DOE del 13/10/2001).
La Torta del Casar es un queso español con DOP a nivel europeo por el Reglamento
(CE) 1491/2003 de la Comisión Europea.
El término Torta del Casar se refiere a su origen. El primero de los nombres se

debe a su forma original, aplastada, por la falta de firmeza de la pasta interior, que no se
endurecía, y recordaba más a las tortas de harina que a los quesos tradicionales. El
segundo nombre hace mención a la población de Casar de Cáceres, cuna del producto,
que se encuentra en la provincia de Cáceres, a 10 km al norte de la capital, en la
comunidad autónoma de Extremadura.
14
Introducción
Esta zona de influencia de la DOP Torta del Casar ha estado históricamente

relacionada con las prácticas de pastoreo y trashumancia. La calzada romana Vía de la
Plata recorre la región extremeña de norte a sur, atravesando Casar de Cáceres, siendo
durante siglos, paso obligatorio de los rebaños, tal como se recoge en el Fuero Juzgo y
en las normas que regían al Honrado Concejo de La Mesta. Existe constancia de la
presencia de rebaños asentados en la zona desde 1291, cuando el Rey Sancho IV otorga
a la aldea del Casar el Privilegio Real, por el que los ganaderos pueden llevar a pastar a
sus ganados a las tierras adehesadas de media legua de extensión alrededor de dicha
aldea. Así mismo se conoce que ya en esta época la Torta del Casar era utilizada como
moneda de pago, aunque no fue hasta 1791 cuando Gregorio Sánchez de Dios deja
constancia escrita de la existencia tanto del queso, como de las cabezas de ganado lanar
que lo producían.
La materia prima con la que se elabora la Torta del Casar es la leche de oveja, de
las razas merina y entrefina, las cuales se caracterizan por su rusticidad, su capacidad de
adaptación a entornos naturales extremos, y su baja producción lechera, en torno a 75
l/oveja y año. Este ganado ha estado vinculado al sistema de explotación tradicional de
la zona, extensivo o semiextensivo, alimentándose de los pastos del ecosistema típico
del área que abarca la DOP, si bien en determinadas épocas del año necesita una
suplementación alimenticia, a base de forrajes o piensos.
I.1.4.2. Proceso de elaboración de la Torta del Casar

La leche empleada en la elaboración de la Torta del Casar debe ser, según el
Reglamento DOP (2001) natural, íntegra, no estandarizada, obtenida del ordeño de
ovejas sanas de las ganaderías inscritas. La leche debe estar limpia, sin impurezas,
exenta de inhibidores, productos medicamentosos, conservantes, etc., que puedan influir
negativamente en la elaboración, maduración y conservación de la “Torta del Casar”,
así como en las condiciones higiénicas y sanitarias de la misma. Debe presentar como
mínimo un 5 % de proteína, un extracto mínimo quesero de un 11 %, 6,5 % de materia
grasa, 18 % de extracto seco total, una acidez máxima de 22º Dornic y un pH mínimo
de 6,6 y máximo de 6,9.
En el proceso de elaboración de la Torta del Casar no se añaden cultivos starter y

se emplea coagulante vegetal, obtenido previamente de la maceración de las flores del
15
Introducción
cardo (C. cardunculus) en agua. El uso de la leche cruda de oveja Merina y del
coagulante vegetal le dan las características del ligero amargor y la textura blanda
(Delgado y col., 2010).
Existen varias formas diferentes de preparar el extracto acuoso de las flores de

cardo, y puede decirse que cada elaborador tiene su propio método de prepararlo. Sin
embargo, todos ellos preparan el extracto cada día previamente al proceso productivo
del queso. Normalmente las flores secas se cortan y se secan durante el verano anterior
y los elaboradores de queso lo compran en mercados locales en cantidad suficiente para
la producción del año. En esencia, las flores secas se maceran en agua a temperatura
ambiente durante un periodo de tiempo variable, algunas veces machacando las flores
en un mortero. Tras este tiempo, las flores se filtran a través de una tela o gasa, el
líquido de color marrón resultante se añade a la leche (Roseiro, 1991). La cantidad de
flores secas y agua empleadas para la preparación del coagulante depende de la cantidad
de leche a cuajar, la calidad visual de las flores secas y la experiencia del fabricante
(Roseiro y col., 2003).
La elaboración del queso comienza con el calentamiento de la leche a 26-33º C,

tras la adición del cuajo, la coagulación de la leche tiene lugar tras 50-90 minutos. Una
vez obtenida la cuajada será sometida a cortes sucesivos hasta conseguir granos de
tamaño fino, tipo grano de arroz. La cuajada es cortada para aumentar la superficie de
contacto, facilitando la separación del suero de la cuajada. Entonces la cuajada se
deposita en moldes cilíndricos adecuados a las dimensiones del queso y es prensada
durante 5 horas como máximo, hasta a una presión máxima de 3 kg/cm2. El proceso de
salado puede ser seco o húmedo, utilizándose exclusivamente cloruro sódico. En caso
de salazón húmeda el tiempo de permanencia en salmuera será de 6 horas como
máximo, en una solución de una concentración máxima de 16 Beaumé. La maduración
mínima será de 60 días, siempre que cumpla la normativa sanitaria vigente, bajo una
temperatura de 4 a 12º C y una humedad relativa de 75-95 % (Reglamento DOP, 2001).
Tradicionalmente, la sal es añadida a la leche durante el proceso de coagulación

de la leche (Macedo y col., 1993), con el fin de facilitar la coagulación de la leche, dado
que la sal contribuye a la estabilización de las micelas (Bautista y col., 1999).
16
Introducción
Durante la etapa de maduración se produce esa intensa actividad proteolítica que

da lugar a la formación de la Torta, generándose las características de textura, sabor y
aroma tan peculiares de este producto.
I.1.4.3. Características de calidad de la Torta del Casar

Según la regulación de la DOP, los quesos “Torta del Casar” presentarán forma
cilíndrica, con caras sensiblemente planas, y superficie perimetral plano convexa. Se
establecen tres formatos en función del peso de la pieza, (A) de 200 a 500 g, (B) de 501
a 800 g, (C) de 801 a 1200 g. Las dimensiones permitidas son un diámetro mínimo de 7
cm y que la relación entre altura y diámetro máxima sea de un 50 %. En cuanto a las
propiedades físico – químicas, este producto debe contener un mínimo de 50 % de grasa
sobre extracto seco, un mínimo de 50 % de extracto seco, un pH comprendido entre 5,2
y 5,9 y un máximo de 3 % de NaCl (DOE, 2001).
Respecto a las características organolépticas, el Reglamento establece que la

corteza debe estar definida y ser diferenciada de la pasta, con color uniforme de
tonalidades ocres sin adición de colorantes, con presentación tradicional untada en
aceite, pudiendo presentar grietas en su superficie. La pasta será blanda a muy blanda,
uniforme, de color amarillento, puede presentar ojos redondeados propios de la
maduración, repartidos en el corte. La textura es la cualidad fundamental y diferencial
de este queso. La Torta del Casar muestra en corte alta cremosidad y untuosidad. En
boca presenta sensación grasa media, capacidad fundente alta y arenosidad baja o nula.
Su olor será a animal agradable de intensidad media, y vegetal de intensidad media o
baja. El sabor se caracterizará por un amargor medio o bajo, salado bajo, acidez baja o
nula, gusto residual persistente, animal agradable medio y vegetal medio o bajo.
Delgado y col. (2010) caracterizaron el perfil de compuestos volátiles del queso

Torta del Casar, durante su maduración, a lo largo de 90 días. Destaca la mayor
importancia de los ácidos carboxílicos con origen en la actividad microbiana (ácido
acético y propiónico) y la degradación de amino ácidos (ácido 2-metil-propiónico, ácido
3-metilbutanoico), sobre aquellos procedentes de la lipolisis (ácidos butanoico,
pentanoico, hexanoico, heptanoico, octanoico, decanoico, y dodecanoico), y lo
considera una característica única de este tipo de queso, que puede relacionarse con el
aroma típico del queso Torta del Casar. Este aroma puede diferenciar al queso Torta del
17
Introducción
Casar de otros quesos en el mercado. Este flavor típico y diferencial del queso Torta del
Casar puede deberse a la alta concentración de etil ester, encontrada por Delgado y col.
(2010), dado su bajo umbral de percepción.
Descriptores del olor asociados con el aroma típico del queso Castelo Branco
son acídico, olor a oveja y notas picanes (Ferreira y col., 2009).
I.1.4.4. Flora característica de la Torta del Casar

La acción de enzimas proteolíticas y lipolíticas y los metabolitos producidos por
la flora secundaria de los quesos juegan un importante papel en la formación de la
textura y el sabor del queso. Este hecho afecta especialmente a los quesos elaborados
con leche cruda, debido a la abundancia de microorganismos no lácticos. Las
Micrococcaceas han sido identificadas en la mayoría de las variedades de quesos como
uno de los principales componentes de la flora secundaria, que permanece a lo largo de
la maduración, probablemente debido a su resistencia a la sal (Cáceres y col, 1997).
El hecho de que la Torta del Casar se elabore a partir de leche cruda de oveja,
permite a la microflora indígena o autóctona, principalmente bacterias ácido lácticas,
LAB, jugar un importante papel durante la elaboración del queso, principalmente
durante la maduración. Sin embargo, esta es también la mayor causa de variabilidad en
las características organolépticas y calidad global del producto final, debido a la falta de
entendimiento (y por tanto difícil control) de los cambios bioquímicos producidos por
los microorganismos en la matriz del queso. Por tanto, urge algún grado de
estabilización en las prácticas de elaboración del queso, lo cual requiere que los
productores del queso elijan cultivos starter bien definidos y específicos, basados en su
comportamiento tecnológico (Pereira y col., 2010).
La microbiología de la Torta del Casar fue investigada por Poullet (1991), y

encontró que los máximos recuentos de Lactococci, Lactobacilli, Leuconostocs y
Enterococci se alcanzan durante los primeros 15 días de maduración. Los recuentos de
Coliformes son de 105-106 ufc/g durante el primer mes y decrecen a 102-104 ufc/g a los
60 días, mientras que el número de Staphylococci coagulasa-positivo son 102-103 ufc/g
durante el primer mes, y disminuye a 10 ufc/g a los 60 días. Las especies predominantes
de LAB durante la maduración fueron Lc. lactis subs. lactis, Leuc. mesenteroides subs.
18
Introducción
dextranicum, Leuc. mesenteroides subs. mesenteroides, Lb. curvatus, Lb. plantarum and
E. faecalis (Poullet y col., 1993).
La caracterización de la microflora del queso de Casar de Cáceres (que más

tarde dio lugar al queso Torta del Casar) ha sido publicada por Cáceres, Castillo y
Pizarro (1997), Poullet, Huertas, Sánchez, Cáceres and Larriba (1991; 1993). La
mayoría de los microorganismos identificados por estos autores eran bacterias ácido
lácticas, aunque también encontraron micrococcaceas, corynebacterias y levaduras. La
presencia de microorganismos del género enterococos fue destacable en su estudio, lo
cual fue observado en otros quesos elaborados con leche cruda de oveja. La razón de la
prevalencia de enterococos frente a lactococos podría deberse a las deficientes
condiciones higiénicas en las que se elaboraban y maduraban estos quesos, a la
presencia de animales cerca del lugar donde se elaboraban los quesos y probablemente a
su capacidad para crecer en soluciones altamente salinas. En la identificación a nivel de
especies, Lactococci fueron aislados durante los primeros 15 días, y todas las cepas
fueron identificadas como Lactococcus lactis subsp. lactis. Entre los enterococos,
aislados a lo largo de todo el periodo de maduración, las especies más abundantes
fueron Ec. faecalis y Ec. avium, mientras que Ec. faecium y Ec. gallinarum fueron
mucho menos abundantes. Respecto al género Leuconostoc, también aislado a lo largo
de la maduración, las especies identificadas fueron Lc. mesenteroides subsp.
dextranicum and Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides. Las especies más abundantes
pertenecientes al género Lactobacillus fueron Lb. curvatus y Lb. plantarum. Lb.
rhamnosus y Lb. brevis fueron también comunes. Es generalmente aceptado que Lb.
plantarum y Lb. casei constituyen la microflora principal de muchas variedades de
quesos, sin embargo Lb. curvatus no había sido descrito en quesos y en cambio, fue uno
de los lactobacilos más abundantes que encontraron Puollet y col. (1991), que
explicaron su presencia en el queso de Casar de Cáceres por el hecho de estar cuajado
con cuajo vegetal, dado que este microorganismo era frecuente en vegetales y en leche.
El uso de leche cruda para elaborar algunas variedades de queso tradicionales

conlleva altos recuentos de microorganismos, como enterobacterias y coliformes, dos
indicadores de la calidad microbiológica. La adición de cultivos starter a la leche cruda
parece reducir las poblaciones de estos microorganismos durante la maduración en los
quesos de La Serena y Los Pedroches (Sánchez y col., 1995).
19
Introducción
Uno de los mayores problemas asociados a los quesos elaborados a partir de

leche cruda es la presencia de microorganismos indeseables a lo largo de los procesos
de elaboración y maduración. El uso de leche cruda, y por tanto la ausencia de procesos
térmicos de estandarización, unido con los diferentes protocolos de manejo y
manipulación, y por ello las diferentes condiciones higiénicas que prevalecen en las
granjas, dan lugar a una gran e imprevisible variabilidad. Los quesos portugueses con
DOP son un ejemplo de este tipo de productos. Son elaborados de forma tradicional a
partir de leche cruda y entera y el desarrollo de sus características depende la flora
microbiana indígena. La contribución de esta microflora, unido con la composición de
la leche, la cual depende de la dieta de los animales y sus condiciones fisiológicas,
finalmente da lugar al favor y textura únicos de este tipo de quesos (Pereira y col.,
2010).
Varios microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y mohos, están

presentes en el queso durante la maduración. Por tanto, contribuyen a la maduración,
directamente vía su actividad metabólica o indirectamente, vía la liberación de enzimas
en la matriz del queso, después de la autolisis. Aunque la mayoría de la microflora de la
leche cruda comprende bacterias ácido lácticas (LAB), como Lactococcus y
Lactobacillus spp., la inclusión pasiva de microorganismos indeseables como
Coliformes, Staphylococcus spp., Pseudomonas e incluso Listeria spp. aumenta el
potencial de amenaza contra la salud pública (Almeida y col., 2007).
Aunque los quesos mencionados se consumen después de un tiempo mínimo de

maduración de 45 días a una temperatura de 10º C (Macedo y col., 1993), que son
condiciones letales para la mayoría de los microorganismos contaminantes, su acción
mientras son viables puede afectar a las características del producto final. La adición de
cultivos starter puede conllevar una contribución favorable para el crecimiento de
microorganismos indeseables. En particular, la acción de LAB vía fermentación inicial
de lactosa y la rotura de proteínas, o vía reacciones catabólicas más complejas al final
de la maduración, es bien conocida como contribuyente a las características
organolépticas percibidas en el queso final (Menéndez y col., 2000). Además, se han
reconocido levaduras que juegan un papel importante en el queso Serra da Estrela
(Macedo y col., 1993; Freitas y Malcata, 2000). Las bacterias ácido lácticas y
coliformes aparecieron como los grupos microbianos predominantes en el queso Serra
da Estrela (Tavaira y col., 1998), en el cual alcanzaron valores de 107 y 105 ufc/g,
20
Introducción
respectivamente, al final de la maduración. Por otra parte, gran parte del conocimiento
existente se deriva de estudios que engloban el crecimiento de cultivos puros testados en
medios sintéticos, pero más atención se pone en las cepas autóctonas de cada ambiente.
Además, debe tenerse en cuenta que las matrices de los quesos actuales albergan células
de microorganismos en diversos estados fisiológicos, crecimiento, latente, muerto y
autolizados (Fleet, 1999).
Vioque y col. (2000) analizaron la microbiología del queso de Los Pedroches,

elaborado con leche cruda de oveja y cuajo vegetal, procedente de la flor de Cynara
cardunculus, a lo largo de la maduración. Encontraron que los recuentos de viables
totales alcanzaban el máximo en las etapas iniciales de la maduración. Otros grupos
microbianos, enterobacterias, coliformes, lactobacilos, mohos y levaduras, alcanzaron
los recuentos máximos entre los días 2 y 8 de maduración, y después disminuyeron a
diferentes niveles hasta el final de la maduración.
Fernández-Salguero y col. (1999) estudiaron la carga microbiana de los extractos

de flores usados como cuajo vegetal en la elaboración del queso Los Pedroches y
encontraron altos recuentos de viables totales, enterobacterias y coliformes. Los
recuentos de la leche cruda utilizada en este queso también fueron altos en todos los
grupos de microorganismos analizados. Después de dos días de maduración de los
quesos, los recuentos de viables totales en quesos fueron casi 5 log unidades más altos
que en la leche y del orden de 4 log unidades para enterobacterias, coliformes y
lactobacilos. Este hecho se explica por el crecimiento microbiano que se produce
durante la fase de coagulación de la leche, a unos 30º C, y porque la adición del cuajo
vegetal aporta contaminación microbiana a la leche inicial.
I.1.4.5. Presencia de aminas biógenas en quesos

Las aminas biógenas son compuestos nitrogenados de importancia biológica en
las células vegetales, microbianas y animales. Se forman principalmente mediante
descarboxilación de aminoácidos y transaminación de aldehídos y cetonas, en todos los
alimentos que contienen proteínas y aminoácidos libres y están sujetos a condiciones
que favorecen la actividad microbiana o bioquímica (Silla-Santos, 1996). Los quesos se
encuentran entre los alimentos altamente proteicos, en los que la actividad microbiana y
enzimática provocan la formación de de aminoácidos y aminas biógenas (Laleye y col.,
21
Introducción
1987). De hecho, durante la maduración del queso, la degradación de las caseínas da

lugar a la acumulación de aminoácidos que pueden ser convertidos en aminas biógenas
mediante la actividad de las bacterias descarboxylasas (Halasz y col., 1994).
Durante la maduración de los quesos se presentan condiciones (temperatura, pH,

humedad, concentración de sales, disponibilidad de sustrato) que favorecen la actividad
descarboxilante de las bacterias productoras de aminas biógenas, como triptamina,
putrescina, cadaverina, tiramina, histamina, espermina y espermidina. Durante la
maduración de los quesos ocurren transformaciones en las características físicas,
químicas y sensoriales, generando el sabor, olor, color y textura que le son particulares a
cada tipo de queso madurado (Chang y col., 1985; Scott, 1991; Veisseyre, 1972). Los
cultivos iniciadores hidrolizan las cadenas polipeptídicas liberando aminoácidos,
sustrato de las enzimas descarboxilasas microbianas para la producción de aminas
biógenas (Silla-Santos, 1996). Durante este proceso existen condiciones ambientales y
de almacenamiento, que afectan a la textura del queso y pueden favorecer el crecimiento
de enterobacterias. Estos microorganismos pueden estar presentes por inadecuada
manipulación higiénica y tienen capacidad de producir aminas biógenas (Novella y col.,
2002, Scott, 1991).
El interés en la determinación de las aminas se debe a su capacidad para afectar

directa o indirectamente al sistema vascular y nervioso humano. De hecho una gran
cantidad de aminas biógenas pueden causar sarpullidos, dolor de cabeza, nauseas, hipo
o hipertensión, palpitación cardiaca, hemorragia cerebral, shock anafiláctico,
especialmente cuando se ingiere al mismo tiempo alcohol o inhibidores amino oxidasa
(MAO-Is) (Lange y col., 2002; Stratton y col., 1991; Vinci y Antonelli, 2002). Además,
en el caso específico del queso, puede usarse la determinación de aminas biógenas como
un parámetro de la calidad higiénica del proceso de elaboración (Antila y col., 1984;
Mah y col., 2002; Marino y col., 2000) o como indicador del grado de proteólisis y la
tipicidad de algunos quesos particulares (Celano y col., 1992; Innocente y D’Agostin,
2002).
Se han propuesto varios métodos para la determinación de aminas biógenas en

alimentos, desde electroforesis capilar (CE), cromatografía de capa fina (TLC) (Celano,
y col., 1992), cromatografía de gases (GC), cromatografía de intercambio iónico
(Standara y col., 2000) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Mah y col.,
22
Introducción
2002, Marino y col., 2000). Entre los métodos citados, la fase reversa (RP)-HPLC se
considera el más adecuado (Moret y Conte, 1996).
I.1.4.6. Proteólisis
La proteólisis es uno de los mecanismos más importantes que ocurren durante la
maduración de los quesos, en el que las enzimas del cuajo juegan un papel vital,
especialmente en las primeras fases de la maduración, y afectan al rendimiento, la
textura, así como en el flavor del queso (Silva y Malcata, 2005), lo cual ha sido objeto
de estudio en numerosas revisiones. La proteólisis contribuye a los cambios de la
textura de la matriz del queso, debido a la hidrólisis de la red de proteínas, el descenso
de la actividad de agua, mediante el secuestro del agua por grupos carboxyl y amino
liberados, y un incremento del pH (en particular en la superficie de los quesos
madurados con moho), lo cual facilita la liberación de compuestos sápidos (sabrosos)
durante la masticación. Ello contribuye directamente al flavor y al mal sabor (como el
amargor) del queso, mediante la formación de péptidos y aminoácidos libres, así como
la liberación del sustrato (aminoácidos) para los cambios catabólicos secundarios, como
la transaminación, deaminación, decarboxilación, el catabolismo de los aminoácidos
aromáticos y reacciones de aminoácidos con otros compuestos (Sousa y col., 2001).
Durante la proteólisis las proteínas son degradadas a productos primarios

(polipéptidos) y posteriormente a productos secundarios como péptidos de medio y
pequeño tamaño, y finalmente a amino ácidos libres (Desmazeaud y Gripon, 1977). La
proteólisis da lugar a sustancias que son importantes para el flavor en sí, o que actúan
como precursores del aroma (Adda y col, 1982). La primera proteólisis causa la textura
blanda del queso al inicio de la maduración, trastornando la matriz tridimensional de
proteínas. La segunda proteólisis genera péptidos tan pequeños que pueden ser
detectados por los receptores del gusto de los humanos, pero que también pueden servir
como sustratos para las proteinasas y peptidasas microbianas, que dan lugar a péptidos
más pequeños y amino ácidos libres. La alteración de la textura del queso también
influye en la liberación de compuestos del aroma durante la masticación (Fox y col.,
1993).
Durante la maduración, la proteólisis es catalizada por enzimas procedentes de

(i) el cuajo (quimosina, pepsina o proteinasas ácidas de plantas), (ii) la leche (plasmin y
23
Introducción
quizás catepsina D y otras proteinasas de células somáticas), (iii) enzimas de cultivos

starter, (iv) no starter, (v) cultivos secundarios (P. camemberti, P. roqueforti y otros
coryneformes) y (vi) proteinasas o peptidasas exógenas, o ambos, usados para acelerar
la maduración (Sousa y col., 2001).
Proteinasas
de LAB y cultivos
Coagulante residual secundarios
Péptidos
gran Péptidos
Caseínas
tamaño pequeños
Proteinasas
de la leche
Peptidasas de LAB
y de no starter
Amino
ácidos
libres
Figura V.6. Agentes que intervienen en la proteólisis del queso durante la maduración.
En muchas variedades de quesos, la hidrólisis inicial de caseínas es provocada

por el cuajo y en menor medida por plasmin, lo que resulta en la formación de péptidos
grandes (insolubles en agua) y medianos (solubles en agua), que son degradados
posteriormente por el cuajo y por las enzimas procedentes del cultivo starter o de la
microflora (no starter) del queso. Los productos finales de la proteólisis son amino
ácidos libres y su concentración en queso en cualquier fase de la maduración es el
resultado neto de la liberación de amino ácidos de caseínas, su degradación a productos
catabólicos y quizás algunos sintetizados por la microflora del queso (Sousa y col.,
2001).
I.1.4.7. Lipolisis
La lipolisis es un importante mecanismo bioquímico que ocurre durante la
maduración del queso, ya que es una de las vías de generación del flavor del queso. Los
ácidos grasos libres son importantes precursores de reacciones catabólicas, que
producen compuestos volátiles y contribuyen al flavor (McSweeny y Sousa, 2000).
24
Introducción
La grasa en la leche está presente en forma de glóbulos que durante el proceso

de cuajado son casi totalmente incorporados a la red de caseínas. Las interacciones entre
los glóbulos de proteína- proteína y de proteína – grasa influyen en la estructura de la
cuajada y en el rendimiento del queso (Martini y col., 2008).
La grasa de la leche de animales rumiantes contiene un amplio rango de ácidos

grasos. Los principales ácidos grasos libres en la leche son los ácidos butanoico (C4:0),
hexanoico (C6:0), octanoico (C8:0), decanoico (C10:0), dodecanoico (C12:0),
tetradecanoico (C14:0), hexadecanoico (C16:0), octadecanoico (C18:0), cis-9-
octadecanoico (C18:1), cis, cis-9, 12-octadecadienoico (C18:2), y cis-9, 12, 15-
octadecatrienoico (C18:3) (Jensen y col., 1962; 1991). De todos ellos, los ácidos
hexadecanoico y octadecanoico son los más abundantes (Banks, 1991, Gunstone y col.,
1994), que representan aproximadamente el 25 y el 27 % respectivamente del total de
los lípidos (Jensen y col., 1962). Los principales lípidos de la leche son los
triacilglicéridos, que suponen más del 98 % del total de los lípidos (Gunstone y col.,
1994). Los triacilglicéridos son esteres de glicerol compuestos por una columna de
glicerol con tres ácidos grasos unidos (Stryer, 1988). Por otra parte, los fosfolípidos
representan menos del 1 % de los lípidos de la leche, pero tienen gran importancia en la
membrana grasa de la leche, ya que permiten la estabilización de emulsiones de aceite
en agua y de agua en aceite. De media, los fosfolípidos contienen más y más largos
ácidos grasos insaturados que los triacilglicéridos (Banks, 1991; Jensen y col., 1991).
Los principales fosfolípidos encontrados en la grasa de la leche son phosphatidyl
choline, phosphatidyl ethanolamine y sphingomyelin (Gunstone y col., 1994). Otros
lípidos polares se han descrito en la leche en cantidades traza, como ceramidas,
cerobrosidos y gangliosidos. El colesterol es el esterol más abundante en la leche (más
del 95 % de todos los esteroles) y supone menos del 0,3 % del total de los lípidos
(Jensen y col., 1991).
Los lípidos de los alimentos pueden sufrir oxidación o degradación hidrolítica

(McSweeny y Sousa, 2000). La oxidación de los lípidos no ocurre de manera
significativa en los quesos, probablemente debido a su bajo potencial redox (-250 mV)
(Fox y Wallace, 1997; Fox y col., 2000; McSweeny y Sousa, 2000) y a la presencia de
antioxidantes naturales (por ejemplo la vitamina E) (Fox y McSweeny, 1998), por lo
que su contribución al flavor del queso no es importante (Fox y Wallace, 1997; Fox y
col., 2000; McSweeny y Sousa, 2000). Sin embrago, la hidrólisis enzimática de los
25
Introducción
triacilglicéridos a ácidos grasos y glicerol, mono- o diacilglicéridos (lipolisis) es

esencial para el desarrollo del flavor de algunos quesos (McSweeny y Sousa, 2000).
La lipolisis en el queso se debe a la presencia de enzimas lipolíticas, hidrolasas,

que rompen la unión ester entre un ácido graso y el corazón de un glicerol del
triacilglicérido, produciendo ácidos grasos libres, y mono- y diacilglicéridos (Deeth y
Touch, 2000). Las enzimas lipolíticas se clasifican en esterasas y lipasas (Chich y col.,
1997). Las lipasas en el queso pueden tener su origen en diferentes fuentes, como son la
leche, el cuajo, el cultivo starter, el cultivo adjunto al starter, las bacterias no starter y la
adición como lipasas exógenas (Fox y Wallace, 1997; McSweeny y Sousa, 2000).
El uso de cuajo de Cynara cardunculus conlleva una mejora en la lipolisis en los

quesos, lo cual aumenta con la edad, lo que sugiere una ligera actividad lipasa en el
extracto, el cual puede ser debido a la actividad lipolítica inherente de las enzimas
proteolíticas (Agbola y col., 2009).
Para hidrolizar la grasa de la leche en queso las bacterias ácido lácticas (LAB)
poseen enzimas esterolíticas y lipolíticas, capaces de hidrolizar un rango de esteres de
ácidos grasos libres y sustratos tri-, di- y monoacilglicéridos (Chich y col., 1997; Fox y
Wallace, 1997). A pesar de la presencia de estas enzimas, LAB, especialmente
Lactococcus y Lactobacillus spp. son generalmente considerados débilmente lipolíticos
en comparación con especies como Pseudomonas, Acinetobacter y Flavobacterium
(Fox y col., 1993; Chich y col., 1997). Sin embargo, debido a que están presentes en el
queso en números muy altos a lo largo de la maduración, se considera que LAB son
probablemente los responsables de la liberación de significativos niveles de ácidos
grasos libres.
La liberación de ácidos grasos libres, resultado de la lipolisis en el queso, da

lugar a compuestos del flavor y aroma, como metilcetonas, lactonas, esteres, alcanos y
alcoholes secundarios (Gripon y col., 1991; Fox y Wallace, 1997; McSweeny y Sousa,
2000).
La grasa en el queso es el componente más importante que influye, no solo en

sus propiedades físicas, sino principalmente en el desarrollo del flavor. Sanjuán y col.
(2002) encontraron que los quesos elaborados con cuajo vegetal (C. cardunculus)
contenían más grasa que los quesos elaborados con cuajo animal, ya que parece que el
26
Introducción
cuajo vegetal presenta una mayor capacidad para capturar componentes grasos en la
cuajada. Este mayor contenido en grasa puede explicar la textura más fina y mayor
untuosidad descritos para los quesos producidos con cuajo vegetal cuando fueron
evaluados sensorialmente.
I.1.4.8. Compuestos volátiles en el queso

El flavor del queso es uno de los criterios determinantes para la elección y
aceptación del consumidor. El perfil de volátiles refleja la imagen del olor y aroma de
los quesos. Por tanto, el flavor único de una variedad de queso es el resultado de un
balance complejo entre compuestos químicos volátiles y no volátiles, originados durante
el proceso de maduración a partir de la grasa, la proteína y los hidratos de carbono de la
leche (Fox y Wallace, 1997), como consecuencia cada producto tiene una composición
única y característica de compuestos volátiles (Plutowska y Wardencki, 2007). El flavor
del queso es muy complejo y diferencia a unos quesos de otros (Tomasini y col., 1993).
La fracción volátil de los quesos y consecuentemente sus características

sensoriales están influidas por las condiciones climáticas y por la calidad de la leche
cruda, las cuales dependen de la especie animal, la genética, la alimentación y el manejo
de los animales. La microflora adventicia o espontánea de la leche cruda jugará también
un papel relevante (Collomb y col., 1999; Fernández – Garcia y col., 2006; Freitas y
Malcata, 2000; Nàjera y col., 1993; Perea y col., 2000; Tavaria y col., 2002; Tavaira y
col., 2004.)
El flavor del queso maduro es el resultado de una serie de cambios bioquímicos,

que ocurren en la cuajada durante la maduración del queso, provocados por la
interacción de bacterias starter, enzimas de la leche, enzimas del cuajo, lipasas y flora
secundaria (Urbach, 1997). Los numerosos compuestos involucrados en el aroma y
flavor del queso se derivan de tres principales rutas catabolícas, catabolismo de la
lactosa y el lactato, lípidos y porteínas (Molimard y Spinnler, 1996).
En la primera ruta, dependiendo de la variedad, microflora y condiciones de

maduración, el lactato puede ser metabolizado por un número de rutas a varios
compuestos, los cuales contribuyen al flavor del queso (McSweeney y Sousa, 2000).
27
Introducción
La lactosa es el hidrato de carbono más importante en la leche. Su presencia es

transitoria en el queso, ya que desaparece rápidamente de la cuajada debido a la
fermentación glicolítica a cargo de los microorganismos, produciendo ácido láctico, lo
cual determina la acidez del queso y favorece la acción del cuajo, la retracción de la
cuajada y el desuerado, dando a la cuajada ciertas características que influyen en el
flavor final y la textura del queso. También inhibe el crecimiento de algunos
microorganismos que producen gas y flavor y aromas desagradables. Según Webb y
Johnson (1965) la presencia de lactosa sólo es posible en las dos primeras semanas de
maduración en algunos quesos blandos.
La segunda ruta genera compuestos derivados de grasas, formados mediante

lipolisis y reacciones de oxidación lipídica, como por ejemplo ácidos grasos libres,
esteres, lactonas y cetonas, con bajos umbrales de percepción (Kinsella, 1975; Siek y
col., 1971). La lipolisis es llevada a cabo por los microorganismos y las lipasas nativas
de la leche, lo cual es especialmente importante en quesos elaborados con leche cruda,
en los que la lipasa nativa no se desactiva con la pasteurización. El flavor más
importante de estos quesos procede de FFA (ácidos grasos libres) de cadena corta y
media (Nàjera y col., 1993). El fuerte olor de estos compuestos contribuye al aroma
lipolizado del queso (Chàvarri y col., 1999; Fox y Wallace, 1997; House y Acree,
2002; Kalantopoulos, 1993; Macedo y Malcata, 1996; Sousa y Malcata, 1997; Tavaria y
col., 2004).
Finalmente la proteólisis de las caseínas suministra un rango de péptidos de

pequeño y medio tamaño y aminoácidos libres, los cuales probablemente sólo
contribuyen al retrogusto de la mayoría de las variedades de queso. Sin embargo, los
aminoácidos libres son importantes precursores de un rango de reacciones catabólicas
poco entendidas, las cuales producen compuestos volátiles esenciales para el flavor
(McSweeney y Sousa, 2000).
La adición de sal al queso contribuye al flavor del queso final y regula

selectivamente la actividad microbiana también, controlando el desarrollo de
microorganismos indeseables (Loren y Free, 1970).
Los compuestos volátiles se analizan generalmente mediante Cromatografía de

Gases (GC) unida a Espectrofotometría de Masas (MS), con un paso anterior que
implica la extracción y pre-concentración de la fracción volátil. La técnica de
28
Introducción
Microextracción en Fase Sólida (SPME) requiere solo una pequeña cantidad de muestra
y permite el aislamiento de analitos volátiles a partir de matrices tanto en estado sólido,
como líquido, en poco tiempo. Por esta razón, hoy en día esta técnica se usa
comúnmente en la extracción de compuestos de flavor del queso (Coda y col., 2006;
Guillén y col., 2004; Lecanu y col., 2002; Lee y col., 2003).
El perfil de volátiles de algunos quesos españoles hechos a partir de leche cruda

de oveja, que pertenecen a Denominaciones de Origen Protegidas (DOP) han sido
estudiados, como es el caso del queso Manchego (Fernádez-García y col., 2002a,
2002b; Villaseñor y col., 2000), La Serena (Carbonell y col., 2002a, 2002b), Roncal
(Izco y Torre, 2000), Zamorano (Fernández – García y col., 2004b), Idiazábal (Barrón y
col., 2007) y Torta del Casar (Delgado y col., 2010).
Según Delgado y col. (2010), para el queso Torta del Casar, durante la
maduración del queso, los ácidos carboxílicos pueden originarse a partir de las tres
principales rutas bioquímicas, lipolisis, proteólisis y fermentación de la lactosa (Curioni
y Bosset, 2002). Las enzimas con actividad lipolítica (esterasas, lipasas) pueden causar
la liberación de ácidos de cadena lineal (ácidos butanoico, pentanoico, hexanoico,
heptanoico, octanoico, decanoico y dodecanoico), mientras las enzimas proteolíticas son
las responsables de la formación de ácidos de cadena ramificada (ácidos 2-
methylpropanoico y 3 – methylbutanoico) mediante la desaminación de aminoácidos
como valina y leucina (Curioni y Bosset, 2002). Finalmente, el ácido acético y
propiónico pueden tener origen microbiano, resultado de la fermentación de la lactosa,
debido a los cambios en estos ácidos que han sido asociados al crecimiento de bacterias
acéticas y propiónicas (Zino y col., 2005). El origen del ácido 2,4-hexadienoico (E, E)
no está claro. Los microorganismos involucrados en la formación de los esteres son
principalmente levaduras (Molimard y Spinnler, 1996), aunque también pueden ser
responsables algunas bacterias lácticas y Micrococaceas, así como reacciones químicas
(Gripon y col., 2001). La acción de estos dos últimos factores parece ser más probable
en el queso Torta del Casar (Cáceres y col., 1997; Poullet y col., 1991; 1993).
Encontraron alta cantidad de etil ester, lo que contribuye probablemente al flavor
general del queso Torta del Casar, dado su bajo umbral de percepción.
29
Introducción
Parece que los esteres no han sido anteriormente aislados en otros tipos de
quesos, por ello es posible que aporten notas aromáticas características al queso Torta
del Casar (Delgado y col., 2010).
I.2. EL CUAJO
I.2.1. Características del cuajo

Un coagulante vegetal es aquel producto de origen vegetal cuyo componente
activo presenta actividad coagulante. En las condiciones habituales de elaboración del
queso, las preparaciones de estos coagulantes son capaces de provocar la
desestabilización de las micelas de caseína de la leche, con formación de un gel láctico
que madura y da lugar al queso final. Los quesos elaborados con coagulantes de origen
vegetal presentan aromas, sabores y texturas novedosas, totalmente diferentes a los
elaborados en las mismas condiciones con coagulantes de origen animal o microbiano.
Los extractos vegetales han sido usados como coagulantes en la elaboración de

quesos desde tiempos remotos. La primera referencia se atribuye a Lucius Junius
Columella en su tratado De Re Rustica (c. 50 a.C.): “…aunque puede ser cuajado con la
flor del cardo silvestre o las semillas del girasol e igualmente con el líquido que fluye de
la higuera” (Robinson y col., 1998).
Entre un gran número de proteasas con aplicaciones en la industria alimenticia,

las proteínas aspárticas como la quimosina (EC 3.4.23.4) son usadas para cuajar la leche
en la elaboración del queso. La coagulación de la leche se puede conseguir con un
número de enzimas proteolíticas de varias fuentes, como son varios animales (pepsinas
de cerdo, vaca y pollo) y especies microbianas (Rhizomucor miehei, R. pusillus, y
Cryphonectria parasitica). El interés por los coagulantes vegetales está creciendo,
debido a que el uso de los coagulantes animales puede estar limitado por su alto precio,
por razones religiosas (Judaísmo, Islam), la dieta (vegetarianos), o consumidores que
rechazan los alimentos genéticamente modificados (alemanes, holandeses y franceses
prohíben el uso de cuajo animal modificado genéticamente (quimosina)). (Egito y col.,
2007).
30
Introducción
La mayoría de los quesos producidos en el mundo se elaboraban de forma

tradicional, y en muchos casos, es así como se siguen elaborando, usando un coagulante
enzimático, extraído del estómago de terneros amamantados. Este cuajo presenta dos
enzimas proteolíticas, quimosina, en mayor proporción (88-94 % de la actividad
coagulante sobre la leche) y pepsina bovina (EC 3.4.23.1, 9-12 % actividad coagulante
sobre la leche). La principal función de la quimosina en el proceso de elaboración del
queso es coagular la leche, mediante la hidrólisis del enlace Phe105-Met106 de la proteína
establecida como micela, k-caseína, la cual es, en muchas ocasiones, más susceptible a
quimosina que otras uniones de proteínas de la leche, lo que da lugar a la coagulación
de la leche (Fox y col., 2000).
La mayoría de los sustitutos del cuajo animal son más proteolíticos y menos
activos en cuanto a su actividad coagulante. Es bien conocido que estos aspectos no solo
disminuyen el rendimiento del queso y la retención de proteína y grasa por la cuajada,
sino que también afectan a la maduración del producto y a algunas características
sensoriales (Campos y col., 1990).
Se han investigado las proteasas vegetales como coagulantes de la leche, siendo

la característica que comparten estas proteinasas, un segmento extra de alrededor de 100
residuos amino-acídicos, que llevan una secuencia diferente a las proteinasas de
mamíferos o microorganismos (Faro y col., 1995). Las fuentes vegetales de enzimas que
cuajan la leche han sido identificadas en Benincasa cerífera (Gupta y Eskin, 1977),
Calotropis procera (Ibiama y Griffiths, 1987; Mohamed y O’Connor, 1999),
Dieffenbachia maculata (Padmanabhan y col., 1993), partes del fruto de Solanum
dobium (Yousif y col., 1996), Centaurea calcitrapa (Tavaria y col., 1997), Ananas
comosus (Cattaneo y col., 1994), Carica papaya (Cabezas y col., 1981), Withania
coagulans (Singh y col., 1973), Opuntia phylloclades, Cereus triangularis, Euphorbia
cadudifolia, Ficus bengalensis, F. elastica, E. hista, Lactuca sativa, siete especies de
pailonáceas, los cardos C. scolymus, C. humilis y C. cardunculus, y Helianthus annus
(Tavaria y col., 2001).
Las proteasas son las enzimas más importantes por su uso en industrias
alimentarias, farmacéuticas o de detergentes, así como en la preparación de cuero o lana
(Mantell y col., 1985). Las proteasas más ampliamente utilizadas son papaína,
bromelaína y ficina, extraídas de Carica papaya, Ananas comosus y Ficus glabra
31
Introducción
respectivamente. Las flores secas al aire de varias especies vegetales han sido usadas en
las regiones mediterráneas para elaborar quesos desde la época romana. Los altos
niveles de enzimas proteolíticas en las flores son responsables de la efectiva
coagulación de la leche (Heimgartner y col., 1990).
Notable son las proteasas extraídas de las flores del cardo silvestre (Cynara
spp.), las cuales han sido aisladas, purificadas y parcialmente caracterizadas (Faro,
1991). Las diferentes especies de Cynara han sido consideradas efectivos coagulantes:
C. cardunculus (más abundante), C. humilis y C. scolymus (Barbosa, 1983; Sousa,
1993; Sousa y Malcata, 1997a, b, 1998a, b, Sousa, 1998). Aunque se ha visto que la
mayoría de las preparaciones de coagulantes vegetales presentan un ratio de actividad
coagulante/actividad proteolítica excesivamente bajo, lo que resulta en péptidos
amargos en el queso maduro, o una actividad coagulante muy baja, que da lugar a bajos
rendimientos queseros. Las dificultades experimentadas con estas preparaciones
provienen de la composición única de los extractos de plantas, que contienen un
complejo cóctel de enzimas, cuya actividad es difícil de controlar (Sousa y col., 2001).
Las proteinasas vegetales que contienen las flores secas de C. cardunculus, han
sido empleadas con éxito durante muchos siglos para elaborar quesos tradicionales en la
Península Ibérica (Sousa y col., 2001) y otros países del área mediterránea, a partir de
leche de oveja (Barbosa y col., 1976), como por ejemplo los quesos portugueses Serra
da Estrela y Sherpa (Macedo y col., 1993; Vieira de Sá y Barbosa, 1972) o los quesos
españoles Los Pedroches, La Serena y Torta del Casar, así como Los Ibores (a partir de
leche de cabra) y el queso de Flor de Guía (a partir de una mezcla de leche de vaca y
oveja) (Fernández – Salguero y col., 1991). Los quesos obtenidos con los extractos de
las flores son altamente apreciados. Debido a la alta calidad de estos quesos, existe una
demanda creciente de este tipo de proteínas coagulantes (Heimgartner y col., 1990). Las
flores de C. cardunculus son económicamente importantes en Portugal y España, debido
a su tradicional uso en la elaboración de quesos de oveja altamente apreciados (Duarte y
col., 2006).
Como alternativa al cuajo animal y otros tipos de cuajo, se usa el extracto crudo
de los estigmas y estilos de las flores de C. cardunculus, siendo probablemente el cuajo
vegetal de mayor éxito hasta la fecha (Lamas y col., 2001). Vieira de Sá y Barbosa
(1972) fueron los primeros en estudiar las características físico – químicas y los usos
32
Introducción
tecnológicos de C. cardunculus como sustituto del cuajo animal en la elaboración del

queso, su extracto acuoso crudo mostraba menor actividad coagulante pero mayor
actividad proteolítica que los cuajos animales comerciales. Heimgarner y col. (1990)
afirmaron la existencia de tres diferentes proteinasas aspárticas (cynarasas 1, 2 y 3),
cada una de ellas compuesta por una subunidad grande y otra pequeña, siendo estas
proteasas glicoproteínas, que contienen unido –N residuos de manosa, mostrando una
actividad máxima a pH 5,1. Algunos autores afirman que cynarasa 3 presenta similar
actividad coagulante, pero mayor actividad proteolítica que quimosina. Las formas 1 y 2
son similares entre sí, y se denominan cardosina A, mientras que la forma 3 se
denomina cardosina B (Faro y col., 1992).
Además la actividad proteolítica de las cynarasas parece ser menos específica

que la de quimosina: estas enzimas son capaces de hidrolizar αs1-caseína, β-caseína y al
menos una de las γ-caseínas, teniendo mayor afinidad hacia k-caseína (menor Km)
comparadas con otras enzimas que coagulan la leche (Macedo y col., 1993) y presentan
una alta y específica actividad coagulante, que las hace adecuadas para elaborar quesos
de pasta blanda (asociados con ligero sabor amargo y relativamente bajos rendimientos)
(Tavaira y col., 2001).
Agboola y col. (2009) compararon el efecto del cuajo vegetal respecto al cuajo
animal en quesos elaborados a partir de leche de vaca y comprobó, en primer lugar, que
los quesos elaborados con cuajo vegetal de cardo mostraron niveles de Nitrógeno
soluble en agua más altos comparado con quesos elaborados con cuajo animal. Tras 60
días de maduración se observó un gran incremento en TCASN/TN para quesos
elaborados con leche normal y cuajo vegetal, aumentando a más del doble del nivel
registrado a los 7 días. Estos quesos presentaron mayor nivel de N soluble en ácido
fosfotungstico, al cabo de los 60 días de maduración. La coagulación con cuajo vegetal
de cardo dio lugar a una pasta más blanda y cremosa y un color más amarillo
significativamente, aunque también fueron más amargos. Los quesos con cuajo animal
fueron más duros y más adhesivos que los elaborados con cuajo vegetal de cardo. El uso
de extracto de cardo conllevó a una mayor lipolisis, debido a la actividad lipolítica
inherente de las enzimas proteolíticas del extracto. La hidrólisis de proteínas en quesos
coagulados con cardo fue más intensa.
33
Introducción
Veríssimo y col. (1995) establecieron que el cuajo del cardo contiene un

adecuado ratio entre cardosina A y cardosina B, exhibiendo unas propiedades cinéticas
apropiadas, siendo un sustituto adecuado para el cuajo animal (Picón y col., 1995;
Whiteley, 2000). Los quesos fabricados con enzimas coagulantes de origen vegetal
presentan características químicas, reológicas y sensoriales de mejor calidad, lo que
hace que estos quesos sean más apetecibles para los consumidores (Picón y col., 1995).
En la Península Ibérica en particular, los quesos elaborados con coagulante

vegetal, normalmente a partir de leche cruda de oveja, son especialmente apreciados y
algunos de ellos, amparados bajo Denominaciones de Origen Protegidas (DOP). Estos
quesos presentan una textura cremosa característica y exquisito flavor, ligeramente
amargo en algunos casos, pero punzante cuando está maduro (Roseiro, 1996).
La recolección de flores de cardo es laboriosa y cara, por tanto la producción

comercial de la planta sería requerida. Existe una patente española para la producción de
polvo seco de extracto acuoso de las flores de Cynara sp. con el fin de obtener un
producto más estandarizado. Sin embargo, no está registrado el uso de este producto por
los elaboradores tradicionales (Roseiro, 2003).
Parece que el extracto de la flor de cardo no es un buen sustituto del cuajo

animal para los quesos de leche de vaca, debido a los defectos en textura y flavor,
causados por la alta actividad proteolítica de sus enzimas, resultando en pérdida de
rendimiento. Este efecto no se encuentra en los quesos de leche de oveja, lo que quizás
pueda deberse a una afinidad específica de este cuajo por la leche de oveja y de cabra.
Barbosa (1983) sugirió la posibilidad de que las diferentes características de las caseínas
ovinas y bovinas fueran un aspecto clave para la producción de péptidos amargos
durante la proteólisis. Se sabe que el excesivo amargor de los quesos puede deberse a un
exceso de coagulante vegetal durante la elaboración. Dado que la cantidad de
coagulante añadido es normalmente empírico, el excesivo amargor es un defecto que se
puede evitar con un mejor control de la elaboración (Roseiro, 2003).
34
Introducción
I.2.2. Cynara cardunculus, L.
I.2.2.1. Descripción de Cynara cardunculus, L.

El cardo (C. cardunculus L.) es una especie nativa de los países mediterráneos.
Comprende una subespecie, C. cardunculus L. subsp. scolymus (L.) Hegi = C.
cardunculus L. subsp. scolymus (L.) Hayek (alcachofa), y dos variedades botánicas, C.
cardunculus L. var. altilis DC. (cardo cultivado) y C. cardunculus L. var sylvestris Lam.
(cardo silvestre), que se considera el ancestro silvestre de la alcachofa (Foury, 1989;
Rottenberg y Zohary, 1996; Raccuia y col., 2004a), dado que los cruces son
completamente compatibles y sus híbridos F1 son completamente fértiles (Fernández y
col., 2006).
Algunas afinidades entre el género Cynara y otros géneros, como Silybum

(incluye S. marianum) y Cirsium, fueron anteriormente sugeridas (Roseiro, 2003).
Los orígenes ancestrales y geográficos del cardo y de la alcachofa han sido

discutidos por varios autores: un origen del sureste de Europa para C. cardunculus fue
propuesto por antiguos autores, como Atheanaeus y Theophrastus, que afirmaron que el
origen estaba en Sicilia. También se ha propuesto que la alcachofa apareció a partir de
variedades de cardo en los jardines de los monasterios medievales. Esto concuerda con
las antiguas descripciones de la elaboración de quesos en la Península Ibérica (Roseiro,
2003).
Cynara cardunculus, L., comúnmente conocido como cardo, es miembro de la

familia Compositae (Asteraceae), dentro de un relativamente pequeño grupo de
especies, Cynara, el cual comprende alrededor de 8 taxones, entre los que se incluye la
alcachofa cultivada (Tutin y col., 1976; Rottenberg y Zohary, 1996). C. cardunculus
crece de forma silvestre, en el sur y oeste de regiones del Mediterráneo, sur de Portugal,
Madeira e Islas Canarias (Duarte y col., 2006).
Las plantas de cardo silvestre (C. cardunculus, L. var. sylvestris (Lamk) Fiori)
son perennes, no domesticadas y robustas, completamente adaptadas a las condiciones
climáticas Mediterráneas. Presenta altos y erectos tallos y hojas espinosas, agrupadas en
la base de cada planta. Es una planta alógama y presenta un ciclo anual de desarrollo, en
el cual su ciclo reproductivo termina en verano. La parte superior de la planta se seca en
el verano, mientras que la parte enterrada en el suelo permanece viva, al igual que
35
Introducción
ocurre en otras plantas vivaces (Fernández y col., 2006). Cuando las condiciones
climáticas son más favorables las yemas de la parte basal de la planta brotan, dando
comienzo a un nuevo ciclo. Esta sucesión de ciclos anuales de crecimiento puede durar
varios años, más de 15 años, según Fernández y Curt (2006). La floración ocurre en el
segundo año del ciclo de la planta. Las inflorescencias están organizadas como
compactos capítulos, formados por numerosos floretes individuales y hermafroditas
(flores). Los floretes están protegidos por un involucro ovoide – globoso, con brácteas
acabadas en una espina erecta. Los floretes maduros tienen pétalos coloreados,
generalmente lilas, así como un cáliz modificado en un vilano, necesario para la
diseminación de las semillas. La corola se compone de 5 pétalos fusionados por sus
extremos (simpétala), formando un tubo alrededor de estambres sin anteras que
encierran el estigma y estilo (Sampaio, 1947; Tutin y col., 1976).
Los floretes de C. cardunculus poseen estigmas papilados muy largos del tipo
seco. Estos estigmas muestran dos ranuras longitudinales, señal de la fusión de dos
carpelos, que ocurrió a lo largo de la evolución de las Asteraceae (Raven y col., 1999).
Se distinguen cuatro regiones estructurales diferentes en los estigmas del cardo: la
epidermis papilada externa, la región subepidérmica con varias capas parenquimáticas,
un área con tejido de apoyo, rodeando los haces vasculares, y más internamente, el
tejido de transmisión. La epidermis papilada externa, densamente colocada y con forma
de cerilla, es unicelular y compone la epidermis uniseriada de este órgano. En las
últimas etapas de maduración, el estigma se alarga, la epidermis papilada se expande y
los tejidos de apoyo y vasculares se diferencian completamente (Duarte y col., 2006).
Los estilos de las flores de C. cardunculus son del tipo sólido. A diferencia del
estigma, se trata de una estructura cilíndrica fusionada, sin ranuras. El estilo está
formado por una única capa de epidermis con una cutícula espesa, rica en lípidos y
azúcares, rodeando varias capas de células vacuoladas del parénquima cortical. Las
células prismáticas de la epidermis presentan grandes vacuolas, que no acumulan
grandes cantidades de proteínas. El centro de esta estructura está ocupado por haces
vasculares y tejido de transmisión (Duarte y col., 2006).
36
Introducción
I.2.2.2. Otros usos de Cynara cardunculus

Hasta hace relativamente poco tiempo no existían referencias respecto a la
composición de las flores de Cynara sp., que es la única parte de la planta usada como
coagulante (Roseiro, 2003). C. cardunculus (alcachofa) contiene flavonoides (varios
glicosidos a partir de apigenina, luteolina y naringenina) (El-Ansari y col., 1988; El-
Negoumy y col., 1987). En cambio, las flores de C. cardunculus (cardo) contienen
esteroles y triterpenoides pentacíclicos (Grancai y col., 1992), 1,5-ácido
dicafeoylquinico (cynarin) (Grancai y col., 1994), apigenin-7-methylglucoronide
chlorogenic acid (Mucaji y col., 200), saponinas (Mucaji y col., 2001) y 29 compuestos
incluyendo ácidos, esteres, aldehídos, hidrocarburos y alcoholes (Mucaji y col, 2001).
Al igual que la alcachofa, las cabezas inmaduras del cardo, así como los peciolos
y las raíces, adecuadamente preparados, son comestibles. Estudios previos han mostrado
que el cardo silvestre es también una prometedora fuente de aceite de semillas para la
alimentación animal. Tanto el cardo silvestre como el cultivado, son una fuente de
biofármacos. Las raíces contienen inulina, un mejorador de la flora intestinal, mientras
que las hojas son una fuente de compuestos antioxidantes y poseen actividad
antibacteriana (Portis y col., 2005), debido a su composición fenólica, pero también
surge como una buena fuente de polifenoles saludables por su actividad antioxidante
(Falleh y col., 2008). Recientemente se ha incrementado el uso de sus compuestos
polifenólicos en cosmética (Lupo, 2001; Peschel y col., 2006).
Las aplicaciones tradicionales de C. cardunculus comprenden el uso de las hojas

escaldadas, los carnosos peciolos de las hojas, y el receptáculo, en sopas, estofados y
ensaladas (do Amaral Franco, 1976; Fernández y col., 2006; Grieve, 1971). Este cardo
se usa tradicionalmente como agente diurético, colerético, cardiotónico y
antihemorroidal (Koubaa y col., 1999). Las hojas del cardo son usadas para el
tratamiento de dispepsia y como antidiabético (Koubaa y col., 1999; Paris y Moyse,
1971).
Las plantas de Cynara cardunculus ofrecen un amplio espectro de usos para

biomasa diferentes, desde la utilización de la biomasa lignocelulósica para producción
de energía alternativa, mediante combustión, pirolisis y gasificación (González y col.,
2004a; Ochoa y Fandos, 2004), para pulpa de papel (Gominho y col., 2001) o para
combustión de pellet de residuos de biomasa para calefacción doméstica (González y
37
Introducción
col., 2004b). Los frutos de las plantas pueden ser usados de diferentes formas, como por
ejemplo para alimento de rumiantes o para producción de aceite (Raccuia y col., 2007).
Esta última posibilidad se debe al hecho de que este aceite se caracteriza por un ratio
óptimo de ácidos insaturados (5,7), un ratio equilibrado linoleico/oleico (en torno a 1,8)
y la ausencia de ácido erúcico. El aceite contiene altos niveles de α-tocoferol, lo que
aporta estabilidad frente a la oxidación. Estas características hacen que este aceite sea
adecuado para el consumo humano. Tras la extracción del aceite de la semilla, la harina
residual puede ser empleada como alimento animal, debido a la cantidad y calidad de
sus proteínas (Maccarone y col., 1999).
I.2.3. Caracterización del cardo usado como cuajo vegetal

En el suroeste de la península ibérica se han empleado coagulantes vegetales
para la elaboración de quesos artesanales, preparados a partir de los estilos y estigmas
de las flores de C. cardunculus, L. y ocasionalmente con aquellos de C. humilis, L.
(Esteves y col., 2002).
Según los Reglamentos de algunas Denominaciones de Origen de quesos, como

por ejemplo Queso de La Serena, Serra da Estrela (Portugal) o Torta del Casar, el cuajo
vegetal empleado debe proceder de la flor del cardo Cynara cardunculus. Sin embargo,
las flores recogidas en el campo por diferentes recolectores pueden contener mezcla de
flores de C. cardunculus y C. humilis, e incluso podrían estar contaminadas por otras
especies como Centeurea calcitrapa y Silybum marianum (Sanjuán y Fernández-
Salguero, 1994).
Uno de los problemas relacionados con el uso de cuajo vegetal en su forma

natural es que su composición es muy variable debido a la variación planta-planta, que
es consecuencia de diferencias agronómicas por el tipo de suelo y condiciones
climáticas. Barbosa (1983) observó esta variablidad en la composición de las flores
secas de cardo entre lotes y años. Las variaciones a nivel microbiológico, y químico,
entre las muestras de flores de cardo puede contribuir a la variabilidad en las
características entre quesos de la misma variedad. La variación en la humedad de las
flores es otro factor de la variabilidad composicional (Martins y col., 1996). En la
misma línea, Heimgartner y col. (1990) afirmaban que el uso de flores con diferente
38
Introducción
contenido en enzimas proteasas, debido a la variabilidad natural y de las condiciones

climáticas, implica variaciones en las características morfo-organolépticas del queso.
I.2.3.1. Caracterización Morfológica

La caracterización morfológica puede ser una herramienta para la diferenciación
entre especies de cardo que podrían ser confundidas por la flor, parte recolectada para la
obtención del cuajo. Para ello es necesario conocer las características botánicas que
definen a cada una de las especies, especialmente aquéllas que las diferencian entre sí.
La caracterización morfológica de Cynara cardunculus, L. fue llevada a cabo

por Valdés y col. (1987), y publicada en “Flora vascular de Andalucía Occidental”. Esta
caracterización recoge los aspectos botánicos que la definen como tal especie y la
diferencian de otras especies del mismo género. Este método de identificación de
especies vegetales ha sido ampliamente utilizado para la clasificación botánica de las
especies, pero hoy en día se dispone de otras técnicas que apoyan la caracterización
morfológica tradicional, como son las técnicas de biología molecular o las técnicas
basadas en el análisis de proteínas, que además permiten diferenciar entre variedades de
la misma especie.
I.2.3.2. Caracterización Molecular

Los marcadores de ADN son usados, entre otros propósitos, para caracterizar
variedades o cultivares, y la discriminación de fraudes alimentarios (Wolfe y Primrose,
2004). Los primeros marcadores de ADN usados en plantas fueron los análisis de las
variaciones en los fragmentos generados por endonucleasas, generalmente denominados
polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción ó RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphisim) (Beckman y Soller, 1986). Sin embargo, los sistemas
de marcadores basados en la PCR (Polymerasa Chain Reaction) resultan ser la mejor
herramienta para diversos análisis genéticos. Estos sistemas de marcadores incluyen la
“PCR aleatoria”, determinada por la técnica del ADN polimórfico amplificado al azar
(Ramdom Amplified Polymorfic DNA o RAPD) (Williams y col., 1990). Otras técnicas
desarrolladas son el empleo de microsatélites, conocida también como repeticiones de
secuencia simple o SSRs (Broun y Tanksley, 1996), secuencias entre repeticiones
39
Introducción
simples-PCR o ISSR-PCR (Zietkiewicz y col., 1994) y análisis de polimorfismo de los

fragmentos de ADN amplificado o AFLP (Amplified Length Polymorphisms) (Vos y
col., 1995). Las técnicas basadas en los métodos de PCR tienen la ventaja de ser rápidas
y sensibles para identificar entre especies vegetales e incluso entre variedades
(Hernández y col., 2007). Algunos de estos métodos han sido empleados en el mapeo
genético de la alcachofa. Se han realizado diversas evaluaciones basadas en ISSR,
RAPD y AFLP en las variedades de alcachofa “Romanesco” (Pagnotta y col., 2004;
Trionfetti Nisini y col., 2007), “Spinoso sardo” (Lanteri y col., 2001), “Violeto de
Sicilia” (Raccuia y col., 2004; Portis y col., 2005a) y “Spinoso di Palermo” (Portis y
col., 2005a) y también en cardo, tanto cultivado, como silvestre (Sonnante y col., 2004;
Portis y col., 2005b, c). Donde AFLP e ISSR han sido empleados para generar huellas
de ADN a partir de plantas individuales (Lanteri y col., 2004) se ha encontrado un nivel
de variabilidad sustancial dentro de poblaciones morfológicamente uniformes.
Portis y col. (2005) realizaron el primer estudio sobre la variabilidad genética

entre y dentro de poblaciones de cardo silvestre (Cynara cardunculus) de Cerdeña y
Sicilia, mediante SSR. Previamente, Raccuia y col. (2004) analizaron la variación
genética de seis poblaciones de Sicilia mediante marcadores AFLP.
I.2.3.3. Caracterización mediante análisis de proteínas

Varios trabajos han descrito métodos basados en patrones de proteínas para el
control de calidad de los alimentos (Bietz, 1994; Cancalon, 1995; Hernández y col.,
2007; Serradilla y col., 2008). Los análisis de proteínas en estas matrices complejas se
realizan hoy en día, principalmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE) sodio dodecil sulfato, y por cromatografía líquida de alta resolución y fase
reversa (RP-HPLC).
La técnica SDS-PAGE es actualmente empleada como un proceso adecuado y

eficiente para evaluar y monitorizar la degradación de proteínas, además permite
determinar el peso molecular de las proteínas y sus hidrolizados (Barros y Malcata,
2006). Se utiliza para proteínas y péptidos de peso molecular alto. En dicha
electroforesis las proteínas se separan en base exclusivamente al tamaño de sus
subunidades (Weber y Osborn, 1969). Esto es debido a que se utiliza un detergente
aniónico, dodecil sulfato sódico (SDS) y un agente reductor, como el 2-β-
40
Introducción
mercaptoetanol, que disocian las moléculas proteicas, rompen los puentes disulfuro y
cargan las subunidades negativamente. Esta técnica se basa, en la aplicación de un
voltaje alto sobre el capilar relleno de un gel de poliacrilamida. Las matrices sólidas
más utilizadas son las discontinuas, en las que hay dos geles, uno concentrador con gran
tamaño de poro (normalmente con un 4% de acrilamida) y otro separador con menor
tamaño de poro (Laemmli, 1970). Esta técnica se caracteriza por la pequeña cantidad de
muestra necesaria para su realización, así como la posibilidad de un análisis cuantitativo
directo de los componentes de la muestra. En contraposición, esta técnica requiere
muchos pasos manuales, preparación del gel, colocación del gel en el aparato de la
electroforesis, inyección de la muestra, retirar los geles de los moldes, teñir y desteñir
los geles, etc. (Bietz, 1994). Además para cuantificar las proteínas teñidas se necesitan
otros pasos manuales para la densitometría o análisis de imagen del gel teñido.
La electroforesis capilar (CE) puede ser un método alternativo, dado que ofrece
una serie de ventajas sobre la técnica SDS-PAGE, como que es un método de análisis
más rápido, detección, cuantificación en columna, y una mayor eficiencia y resolución
(Cancalon, 1995; Manabe, 1999). Además, el método CE conlleva un método de
extracción de proteínas sencillo y necesita pequeñas cantidades de solventes orgánicos
en comparación con la técnica RP-HPLC. Una categoría de la electroforesis capilar
(CE) es la electroforesis capilar en zona (FZCE), que ha sido aplicada en el análisis de
sistemas complejos de proteínas. Hernández y col. (2006; 2007) utilizaron y
optimizaron la técnica FZCE para la detección de pimentón fraudulento (adulterado)
elaborado a partir de las variedades de pimiento Papri Queen, Sonora y Papri King. Así
mismo, esta técnica fue eficaz para determinar el proceso de secado en la elaboración
del pimentón, a partir de las variedades de pimiento autóctonas. Como consecuencia de
estos estudios, esta técnica se propuso como herramienta para el control de calidad
rutinario del “Pimentón de la Vera”. Por su parte, Serradilla y col. (2008) utilizaron la
técnica FZCE como método de autentificación de variedades de cereza tipo “Picota” del
Valle del Jerte, que además proporcionaba información acerca de los parámetros físico-
químicos más relevantes relacionados con la calidad sensorial del fruto. De modo que
este método se propuso como técnica a emplear en los controles de calidad rutinarios
que lleva a cabo la DOP “Cereza del Jerte”.
En la última década, CE ha demostrado ser una eficiente técnica de separación

para el análisis de proteínas en los alimentos en general (Recio y col., 2001) y de
41
Introducción
proteínas de la leche en particular (Recio y col., 1997). Esta técnica, CE, ha sido
empleada para monitorizar la proteólisis en quesos (Otte y col., 1999), principalmente
en quesos de vaca, pero también en quesos de oveja y cabra (Cattaneo y col., 1996).
También ha sido utilizada para estudiar la proteólisis en quesos elaborados con cardo
vegetal (Cynara L.) (Roseiro y col., 2003).
I.2.4. Obtención del cuajo para la elaboración de la “Torta del Casar”

Los extractos acuosos se preparan a partir de los estigmas y estilos de las flores
de Cynara cardunculus, que se recolectan y secan a la sombra, al aire libre. Los
extractos de C. humilis se utilizaban también en la fabricación de quesos de oveja
(Fernández – Salguero y Sanjuán, 1999; Vioque y col., 2000). Las proteinasas presentes
en estas flores se llamaron inicialmente cyanrasas, y actualmente se denominan
cardosinas (Heimgartner y col., 1990; Faro y col., 1992).
El coagulante de C. cardunculus contiene dos enzimas, cardosina A y cardosina

B (Esteves y col., 1995), siendo ésta más proteolítica que cardosina A. Ambas enzimas
hidrolizan el enlace Phe105-Met106 de k-caseína. Los parámetros cinéticos de cardosina
A son similares a aquellos observados para quimosina y los valores de cardosina B
fueron similares a los de pepsina, cuando un péptido fue usado como sustrato
(Veríssimo y col., 1995).
Las proteasas encontradas en Cynara humilis son diferentes a las de Cynara

cardunculus, no solo porque C. humilis solo contiene cardosina A, sino también en
términos de actividad coagulante (Fernández-Salguero y col., 1997).
Las cardosinas exhiben una preferencia por enlaces entre aminoácidos

hidrofóbicos de αs1-caseína bovina (Ala163-Val167) y β-caseína (Ala189-Tyr193), el cual es
menos susceptible al ataque de quimosina (Queiroz-Macedo y col., 1996).
I.2.5. Enzimas presentes en las flores de “Cynara cardunculus”

Las proteinasas vegetales son interesantes por ser productos naturales que
pueden ser extraídas fácilmente mediante una infusión acuosa. Las proteinasas que
aparecen en las flores secas de C. cardunculus son proteinasas aspárticas (EC 3.4.23),
42
Introducción
también conocidas como porteasas ácidas o aspartil proteinasas, constituyen una de las
4 subfamilias de enzimas proteolíticas, pertenecen a la familia de las endopeptidasas,
muestran un pH óptimo ácido para la actividad enzimática (5,1), son inhibidas por la
pepstatina A, y están ampliamente distribuidas en variedad de organismos como
algunos vertebrados, plantas, virus y retrovirus, algunas bacterias, hongos y levaduras
(Barros y col., 2004). Están involucradas en un número de procesos fisiológicos y
patológicos, como digestión (pepsina y quimosina) (Chow y Kassell, 1968; Foltmann,
1992), infección retroviral (proteinasa del virus de la inmunodeficiencia humana) (Huff,
1991), proteólisis intracelular y degradación de la matriz extracelular (Dingle y
Leaback, 1975) y la liberación del péptido β-amiloide del precursor amiloide en la
enfermedad de Alzheimer (Vassar, 2004), entre otras.
Las cardosinas A y B han sido ampliamente caracterizadas a nivel molecular y

bioquímico en los últimos años (Ramalho – Santos y col., 1997; 1998; Vieira, y col.,
2001). Estas cardosinas son enzimas glicosiladas de doble cadena. A pesar de presentar
alta homología, a nivel de nucleótidos y de aminoácidos, las cardosinas A y B están
dirigidas hacia distintos compartimentos celulares en la flor (Oliveira y col., 2010).
Las proteinasas cardosinas A y B aparecen en la parte femenina de la flor de C.

cardunculus, en la parte superior (donde el ratio de concentración de cardosina A sobre
la B es más alto) y en la parte inferior, donde sólo está presente la cardosina B
(Castanheira, 1998). Cardosina A está formada por dos subunidades con pesos
moleculares de 31 y 15 kD, mientras la cardosina B está formada por dos subunidades
de pesos moleculares 34 y 14 kD, siendo estás enzimas parecidas, en términos de
especificidad y actividad, a la quimosina y la pepsina, respectivamente (Pires y col.,
1994), que son los principales componentes del cuajo animal (Esteves y col., 1995).
En el tejido del callo se detectó cardosina A (31 kDa), junto con una banda de 45
kDa y otra de 55 kDa. La banda de 45 kDa parece ser una cadena no disociada de la
enzima. Por su parte, cardosina B fue detectada mediante una banda de 64 kDa,
correspondiendo al precursor, y otra banda de 55 kDa. La banda de 55 kDa de cardosina
A no ha sido descrita en la literatura aún y no se ha detectado en flores de cardo
(Ramalho – Santos y col., 1997; Vieira y col., 2001), semillas o hojas (Pereira y col.,
2008). La banda de 55 kDa puede ser una forma intermedia de cardosinas sin el
prosegmento, hipótesis que se apoya por el documentado lugar de hidrólisis de
43
Introducción
cardosina A-Arg68-Asp69, Asn309-Gly310 and Ser414-Thr415 (Ramalho – Santos y

col., 1998), si bien estos estudios se han realizado con tejido de células indiferenciadas,
que son distintos a los tejidos completamente diferenciados (Oliveira y col., 2010).
Cardosina A y B se localizan, a nivel intracelular, en el citoplasma, más

probablemente en el retículo endoplasmático. Las cardosinas pueden estar implicadas en
el metabolismo basal, como activos o inactivos precursores de moléculas, con otras
funciones aparte de la proteólisis, ocurriendo el desencadenamiento de su expresión
cuando aumenta el metabolismo del tejido debido a eventos de diferenciación y
desarrollo (Oliveira y col., 2010).
Egas y col. (2000) proponen la idea de que los precursores de proteinasas

aspárticas (PA) son moléculas bifuncionales, y pueden estar involucradas en
mecanismos de defensa de las plantas y/o actuando en el proceso de muerte celular. La
procardosina A, precursor de cardosina A, sufre un proceso proteolítico cuando la flor
madura (Egas y col., 2000; Simôes y Faro, 2004). El precursor de cardosina A (64 kDa)
fue detectado en el embrión. Una banda de 45 kDa fue también detectada y corresponde
a una forma intermedia de la proteína, descrita por Ramalho-Santos y col. (1998). La
forma intermedia de cardosina B (37 kDa) fue detectada en el embrión durante las
primeras etapas tras la imbibición y disminuye tras 72 – 84 h hasta hacerse casi
indetectable. Cardosina B es indetectable en la semilla en cualquier estado de desarrollo
(Pereira y col., 2008).
Las proteinasas aspárticas pueden estar implicadas en la reorganización de la

membrana y la transformación lipídica necesaria para la toma de agua, reorganización
de los tejidos, el crecimiento de la radícula y el cotiledón y la senescencia durante la
germinación de las semillas, además de en su actividad proteolítica y/o proceso de
reserva de proteínas de las semillas. La síntesis de novo de la cardosina A ocurre en el
momento de la emergencia de la radícula, quizás en respuesta a una señal de desarrollo.
De forma diferente a otros zymogens, las procardosinas son activas y pueden tener
función en la proteólisis (Simôes y Faro, 2004). Ambas formas, el precursor y la forma
madura, pueden presentar diferentes funciones en la germinación de las semillas, lo cual
se apoya en su diferente localización (Pereira y col., 2008).
La forma madura de cardosina B (34 kDa) fue detectada desde las primeras
etapas, tras la imbibición hasta la emergencia de la radícula, lo que sugiere que se
44
Introducción
originó de los tejidos ováricos, por lo que parece que esta enzima es resistente a la
proteólisis a lo largo de la maduración y desecación de las semillas. La cardosina B está
también presente en semillas desarrolladas, y tras la rehidratación, es activada y actúa
relajando las estructuras antes de la emergencia de la radícula (Pereira y col., 2008). En
los sacos embrionarios completamente maduros, la localización de cardosina B está
relacionada con el programa de muerte celular en la nucela de C. cardunculus, lo que
sugiere su implicación en el desarrollo del óvulo y el saco embrionario (Figuereido y
col., 2006).
Juntas, cardosinas A y B, actúan durante el desarrollo postembrionario de la

semilla en diferentes momentos, realizando diferentes funciones: mientras cardosina B
es importante para la movilización de proteínas de almacenamiento antes de la
emergencia radicular, cardosina A es sintetizada de novo en ese momento e incrementa
después (Pereira y col., 2008; Oliveira y col., 2009). De este modo se pone de
manifiesto la idea de que la expresión de de las cardosinas y sus roles fisiológicos están
asociados con órganos y tejidos de alta actividad metabólica (Oliveira y col., 2010).
La mayoría de las proteínas solubles en estigmas maduros son cardosinas, y la

abundancia de proteasas en las flores de una planta es inusual. Las proteasas aspárticas
de las plantas identificadas son vacuolares o secretadas, y las cardosinas A y B son un
ejemplo de esta variedad. Cardosina A es una proteína vacuolar presente en el papillae
estigmático maduro, mientras que la cardosina B es secretada y principalmente
localizada en la pared celular y la matriz extracelular del tejido de transmisión del estilo,
aunque también se encuentra en la parte inferior del estigma. Cardosina A está presente
de forma abundante en el estigma a lo largo del desarrollo de la flor, principalmente en
el papilae estigmático, pero también en las capas parenquimales subepidérmicas, siendo
detectadas en estigmas recogidos en inflorescencias tanto abiertas, como cerradas. En el
papillae epidérmico de los estigmas cardosina A es evidente y está específicamente
localizada en las vacuolas de almacenamiento de proteínas del tipo electron-dense.
Cardosina A también está presente en la epidermis del estilo, pero en mucha menor
cantidad (Duarte y col., 2006).
Debido a la localización de cardosina A en la flor, parece razonable pensar que

participa en los eventos de reconocimiento del polen, ya que este proceso, en este tipo
de plantas, se da a nivel del estigma. Faro y col. (1999) demostraron que cardosina A
45
Introducción
contiene un tema Afg-Gly-Asp (RGD), una secuencia bien conocida, a través de la cual
ocurre la interacción de los receptores del polen. Por otra parte, la acumulación de
cardosina A en las flores maduras de C. cardunculus puede indicar la participación de
esta proteinasa aspártica en la senescencia de este órgano (Ramalho – Santos y col.,
1997; Simôes y Faro, 2004). En cuanto a cardosina B, debido a su localización
específica a lo largo del tejido de transmisión del estilo durante la maduración de la flor,
podría ser responsable del proceso de ensanchamiento o relajación del tejido de
transmisión de ECM para facilitar el crecimiento del tubo polínico. Es posible, por
tanto, que las cardosinas estén implicadas en la reproducción sexual de C. cardunculus.
El hecho de que las cardosinas estén localizadas en diferentes partes de la flor de C.
cardunculus apoya la idea de que estas proteinasas tienen funciones biológicas
diferentes (Duarte y col., 2006).
Oliveira y col. (2010) especularon que en el tejido calloso podría existir otro tipo
de cardosina B, una proteinasa como la cardosina B (cardosin B-like), aunque no está
bien descrita. De igual forma, Pimentel y col. (2007) aislaron dos nuevos genes de las
flores de C. cardunculus que codifican para las cardosinas C y D, las cuales comparten
gran similitud con cardosina A, siendo por ello denominadas cardosin A-like. No es
sorprendente la existencia de muchos tipos de cardosinas, dado que están codificados
por una familia multigénica, y es probable que en diferentes órganos o tipos de células
existan diferentes tipos de cardosinas, en función de las necesidades celulares.
Las cardosinas A y B representan las proteasas aspárticas de flores mejor

caracterizadas, junto con las cyprosinas (Cordeiro y col., 1994), otras dos proteinasas
aspárticas presentes en los pistilos de C. cardunculus L. Cardosinas y cyprosinas no han
sido copurificadas hasta ahora y su coexistencia en la planta aún parece difícil de
conseguir (Oliveira y col., 2010). Las secuencias de amino ácidos deducidos de las
cardosinas C y D revelan que ambas enzimas posen la típica estructura de organización
dominante en las proteinasas aspárticas vegetales (Simoes y Faro, 2004). La tipología
del grupo de proteinasas aspárticas procedentes de la familia Asteraceae sugiere que, en
algún momento de la evolución de C. cardunculus, un gen ancestor de las proteinasas
aspárticas se duplicó y dio lugar a las ramas que comprenden cyprosinas y cardosinas
(Pimentel y col., 2007).
46
Introducción
Pimentel y col. (2007) demostraron que los genes de las cardosinas A y D

comparten un patrón de expresión similar, siendo ubicuamente expresados, el gen de
expresión de cardosina B es específico del pistilo, y el de cardosina C es específico de la
flor y se restringe al polen y a los pistilos de los capítulos parcialmente abiertos.
Cardosinas y cyprosinas comparten una estructura de organización dominante similar y
muestran un alto grado de identidad en términos de estructura primaria. Contrariamente
a las cyprosinas, las cardosinas no contienen los residuos Lys11/Tyr13 en el dominio N-
terminal. Estos residuos están bien conservados entre las proteinasas aspárticas
vegetales, y están involucrados en la inactivación del mecanismo de la forma precursora
de las enzimas.
Las cardosinas y las proteinasas aspárticas presentes en Cynara humilis son las
únicas proteinasas aspárticas vegetales conocidas hasta la fecha, que no contienen estos
residuos en la estructura primaria, una característica que puede explicar la actividad
enzimática que exhiben las procardosinas recombinantes (Oliveira y col., 2010).
La presencia de una familia de multigenes que codifica las proteinasas aspárticas

en Cynara cardunculus, L. (Pimentel y col., 2007) sugiere que existan otras proteasas.
De hecho, Sarmento y col. (2009) identificaron y caracterizaron cinco proteasas más a
partir de los pistilos de C. cardunculus, de modo que ya serían nueve las proteasas
aspárticas presentes en esta planta. Esto supone uno de los más altos números de
proteinasas aspárticas purificadas de un solo organismo, lo que concuerda con una
específica e importante función biológica de estas proteínas dentro de C. cardunuclus.
Las cardosinas E, F, G y H son diméricas, con dos subunidades glicosiladas, con peso
molecular de 29 y 15 kDa, sensibles a pepstatin, activas a pH ácido, con un máximo de
actividad a pH 4,3. Las cardosinas E, F, G y H se parecen más a cardosina A que a
cardosina B o cyprosinas. Las cardosinas E y G son más activas que la cardosina A. En
cuanto a su especificidad, parece que cardosina E muestra diferente especificidad que
cardosina A (Sarmento y col., 2009).
I.2.6. Actividad proteolítica del cuajo obtenido de Cynara cardunculus

En la degradación de la matriz proteica de la cuajada participan principalmente
las enzimas proteolíticas de C. cardunculus, aunque también participan las enzimas
47
Introducción
propias de la leche y de la población microbiana presente en el queso (Baer y Collin,

1993; Macedo y Macalta, 1997; Sousa y col., 2001).
Estudios realizados sobre la especificidad y cinética en la cadena de oxidación

de la insulina mostraron que la cardosina A tiene una especificidad de hidrólisis similar
a la quimosina, mientras que la cardosina B se asemeja a la pepsina (Faro y col., 1992;
Veríssimo y col., 1995; Ramalho-Santos y col., 1996). Las enzimas de los extractos de
las flores secas de C. cardunculus hidrolizan el enlace Phe105-Met106 de k-caseína (Faro
y col., 1992; Macedo y col., 1993b; Sousa y Malcata, 1998b), primera fase de la
coagulación enzimática (Silva y Malcata, 2005), generando dos fragmentos
polipeptídicos; la para-κ-caseína insoluble y el glicomacropéptido soluble que se separa
de la estructura micelar y pasa al suero. Estos péptidos de elevado tamaño procedentes
de las κ-caseínas, junto con las demás proteínas de la leche, son degradados
posteriormente durante la etapa de maduración del queso. Bajo ciertas condiciones (pH
6.5, 5.5 en ausencia de NaCl, y a pH 5.2 con 5 % NaCl) el principal lugar de rotura de
las proteinasas de C. cardunculus fue Phe23-Val24 para αs1-caseína ovina, si bien estas
proteinasas son capaces de producir la escisión de 9 enlaces, Phe23-Phe24, Tyr153-Tyr154,
Trp164-Tyr165, Tyr165-Tyr166, Tyr166-Val167, Phe145-Tyr146, Leu149-Phe150, Leu156-Asp157 y
Ala163-Trp164, actividad mayor que la descrita para la quimiosina sobre la αs1-caseina
bovina (Macedo y col., 1996), mientras que αs2-caseína ovina y caprina se escinde por
los enlaces Phe88 – Tyr89 y Ser9-Ser10 (Sousa y Macalta, 1998). Respecto a β-caseína
ovina, las proteinasas de C. cardunculus las hidrolizan principalmente por Leu127-Thr128
y Leu190-Tyr191, a pH 6.5 o 5.5 en ausencia de NaCl, y a pH 5.2 con 5 % NaCl (Sousa y
Malcata, 1998b).
Merece la pena resaltar que las proteinasas de C. cardunculus escinden todos los
enlaces de ciertas regiones extremadamente hidrofóbicas de αs1-caseína (Ala163-Trp-
Tyr-Tyr-Val167) y de β-caseína (Ala189-Phe-Leu-Leu-Tyr193), mientras que quimosina
solo hidroliza el enlace Trp164-Tyr165 en esta región de αs1-caseína y en los vínculos
Ala189-Phe190 y Leu192-Tyr193, en estas regiones de β-caseína. Esto sugiere que las
proteinasas de C. cardunculus manifiestan una mayor preferencia por enlaces entre
voluminosos residuos hidrofóbicos que la quimosina (Macedo y col., 1996). La
hidrólisis de β-caseína bovina por quimosina (Fox y Walley, 1971) y por las proteinasas
de C. cardunculus (Sousa, 1993) es fuertemente inhibida al 5 % NaCl y completamente
inhibida al 10 % de NaCl, pero el efecto es debido a un cambio de sustrato más que a la
48
Introducción
enzima, lo cual demostraron algunos autores (Kelly y col., 1996; Kristiansen y col.,
1999) en queso, de modo que los quesos no salados presentaban menos cantidad de β-
caseína intacta que los quesos salados, y que el fragmento C-terminal de β-caseína, β-
CN (f193-209), el cual es amargo y producido por quimosina, se formó solo en los
quesos no salados.
Roa y col., (1999) encontraron que las degradaciones primarias que afectan a las
caseínas en quesos elaborados con los extractos de C. cardunculus, como el queso de La
Serena, son principalmente debidas a la acción residual de este cuajo, produciendo
péptidos de medio tamaño a partir de las primeras caseínas, estos después se degradan
en péptidos más pequeños y finalmente en amino ácidos, en un proceso conocido como
segunda proteólisis. La primera proteólisis juega un papel esencial en el desarrollo de la
textura del queso, mientras que la segunda proteólisis está implicada con el flavor del
queso, de ahí la gran importancia de asegurar un equilibrio en la rotura de las caseínas,
con el fin de prevenir el desarrollo de indeseables atributos en el queso, como baja
viscosidad y alto amargor (Visser, 1993).
La actividad proteolítica y coagulante de los extractos de cardo fue estudiada por

primera vez por Christen y Virasoro (1935). Ellos determinaron que la actividad
enzimática se encontraba sólo en la flor (estilos y estigmas de la inflorescencia) y que
esta actividad se mantiene hasta 70º C. Investigaciones posteriores confirmaron estos
resultados (Vieira de Sá y Barbosa, 1972; Tsouli, 1974).
Roa y col. (1999) observaron como las enzimas de C. cardunculus generaban

mayor proteólisis sobre las αs-caseina que sobre las β-caseínas en el queso de La
Serena. Por otra parte, las proteinasas de la flor del cardo también han manifestado
actividad sobre las proteínas del lactosuero como la α-lactoalbumina y la β-
lactoglobulina, formando péptidos de mayor digestibilidad y funcionalidad, que
influyen además sobre la textura y el sabor de los quesos (Lamas y col., 2001).
La actividad proteolítica del extracto de las flores del cardo es extremadamente

variable, dependiendo de la variedad, el estado de maduración, la parte de la flor
(máxima actividad proteolítica se asocia con las proteasas del estilo), el tiempo de
secado y el contenido final de humedad (Macedo y col., 1993). Según Esteves y col.
(1995) el proceso de secado de las flores del cardo para la preparación del cuajo
provoca una disminución de la actividad proteolítica del cuajo, en particular la actividad
49
Introducción
asignada a cardosina B, dado que es la enzima con la actividad proteolítica más fuerte
en la flor del cardo. Dicho proceso por tanto, afecta a la actividad proteolítica global del
cuajo.
La presencia de iones de sal puede ser determinante en el aumento de la

actividad proteolítica del extracto y el proceso de coagulación de la leche (Sales-Gomes
y Lima-Costa, 2008). Heimgartner y col. (1991) y Campos y col. (1990) observaron el
efecto de la temperatura sobre la actividad proteolítica, confirmando que la actividad
proteolítica aumenta con la temperatura hasta un máximo de 37º C. El tiempo de
coagulación, por tanto, disminuye al aumentar la temperatura.
Según Veríssimo y col. (1995) se establece una relación inversa entre actividad
proteolítica y actividad coagulante. Alta actividad proteolítica del extracto corresponde
generalmente a tiempos bajos de actividad coagulante (Sales-Gomes y Lima-Costa,
2008).
Se ha descrito que la mayoría de las plantas poseen un ratio excesivamente bajo

de actividad coagulante frente a actividad proteolítica, lo cual, probablemente conlleva a
péptidos amargos en queso maduro, o a una fuerza de cuajado excesivamente baja que
produce quesos con muy poco rendimiento (Sousa y col. 2001).
La actividad proteolítica de las cardosinas ha sido determinada por muchos

autores, utilizando diferentes sustratos para ser degradados por dichas proteinasas. Así
Barros y Malcata (2004) estudiaron la digestión de azocaseína por parte de cardosina A
y su cuantificación se basó en la cantidad de péptidos liberados, mediante absorbancia a
440 nm, del mismo modo emplearon la técnica SDS-PAGE para estudiar la hidrólisis de
las proteínas del lactosuero. Campos y col. (1990), Esteves y col. (2005) y Egito y col.
(2007) también utilizaron estas técnicas para estudiar la hidrólisis de las caseínas. Otras
técnicas empleadas con el mismo fin son CE (electroforesis capilar) (Hwei Low y col.
2006), HPLC (Egito y col., 2007), RP-HPLC (Pina y col., 2003). Tavaira y col. (2001)
determinaron la actividad proteolítica global utilizando como sustrato Na-caseinato
ovino y caprino, frente a una solución de enzimas procedente del extracto de C.
cardunculus, midiendo la absorbancia a 280 nm (Campos, 1990). La actividad
proteolítica específica de este extracto fue determinada mediante la técnica UREA-
PAGE, expresando en % la degradación de las caseínas. Trujillo y col. (2000) también
emplearon UREA-PAGE con el mismo fin.
50
Introducción
Según Marcos y Serrano (1980) la proteasa de la flor de C. humilis, a pesar de

tener una actividad coagulante ligeramente inferior a la de la renina, en mucho más
proteolítica que la renina. Vierira de Sá y Barbosa (1972) también comprobaron que el
extracto de la flor de C. cardunculus era más proteolítico que el cuajo animal a igual
actividad coagulante. La excesiva actividad proteolítica del cuajo vegetal puede resultar
inconveniente desde el punto de vista práctico, por su efecto sobre la calidad del
producto, permite, no obstante, el acortamiento del periodo de maduración, y puede
paliarse o controlarse tecnológicamente, favoreciendo la actividad coagulante mediante
la acidificación de la leche o adición de cloruro cálcico (Nielsen, 1975), y reduciendo su
actividad proteolítica mediante el empleo en las salas de curado de temperatura de
refrigeración (Martens y Maudts, 1973).
I.2.7. Actividad coagulante del cuajo procedente de Cynara cardunculus

La coagulación de la leche por medio de un cuajo es un paso esencial durante la
elaboración del queso, y es el resultado de tres fases diferentes pero que se solapan: a) la
hidrólisis de κ-caseína da lugar a la desestabilización de las micelas de caseínas, b) la
agregación de las micelas de caseínas desestabilizadas, c) la gelificación (Dalgleish,
1992). Durante la coagulación de las caseínas se forma un gel a modo de matriz, que
atrapa o retiene grasa, agua y algunos componentes solubles de la leche.
La actividad coagulante ha sido atribuida a la relativamente alta concentración

de proteinasas aspárticas, especialmente en los tejidos florales de Cynara cardunculus
(Barros y Malcata, 2004). La mayor parte de la actividad coagulante que se añade a la
leche se pierde en el suero, solo un máximo del 15 % de la actividad coagulante añadida
a la leche permanece en la cuajada tras la elaboración, dependiendo de factores como el
tipo de coagulante, el ratio de diferentes enzimas en mezclas, la temperatura durante la
elaboración, la variedad de queso y el nivel de humedad en el queso final (Guinee y
Wilkinson, 1992).
Según Irigoyen y col. (2000) la actividad coagulante del cuajo empleado es uno
de los factores que tiene mayor importancia en la degradación de las caseínas,
similarmente el origen de la enzima coagulante usada (animal, microbiana o vegetal)
puede condicionar el nivel de proteólisis, de modo que las enzimas vegetal y
microbianas rompen β- caseína más rápido que las enzimas animales.
51
Introducción
La actividad coagulante está relacionada con la habilidad de la enzima para

romper o hidrolizar κ-caseína en la región del péptido Phe105-Met106, que es específico
en el proceso de elaboración del queso. Según los resultados de Campos y col. (1990),
el extracto de cardo muestra una especificidad más amplia y ataca varios péptidos
unidos, lo que significa que presenta un menor ratio de actividad coagulante
relativa/actividad proteolítica. Por tanto, deberían introducirse modificaciones en el pH
y la temperatura para mejorar las condiciones de coagulación durante la elaboración de
queso.
El primer paso de la elaboración del queso es la coagulación de la leche, lo cual

implica la unión mediada enzimáticamente de κ-caseína al péptido Phe105-Met106.
Además de esta actividad coagulante, las enzimas del cuajo se quedan atrapadas en la
cuajada, donde provocarán la ruptura de proteínas durante la maduración del queso
(Dalgleish, 1987, Fox, 1989) y por tanto, son las responsables de la liberación de varios
péptidos con funciones bioquímicas, reológicas y sensoriales en el queso (Dalgleish,
1987).
La actividad coagulante disminuye cuando aumenta la temperatura de le leche

disminuye cuando aumenta el pH de la leche, aumenta al aumentar la concentración
enzimática, aumenta con mayores concentraciones de calcio.
La actividad coagulante de las cynarasas presentes en las flores de C.

cardunculus sobre la leche, las convierte en enzimas adecuadas para elaborar quesos de
pasta blanda, y se asocian con sabores amargos y bajos rendimientos relativamente
(Tavaria y col., 2001). Desde el siglo XIX varias metodologías han sido empleadas para
caracterizar la actividad coagulante sobre la leche, estando la mayoría de ellas basadas
en la observación de la formación de la cuajada sobre un sustrato de leche (Soxhlet,
1877; Berridge, 1952). Sin embargo, estos métodos carecen de la definición de la
actividad coagulante total (Andrén, 1998), lo cual ha sido adecuadamente solucionado
por el IDF Standard 157ª: 1997.
Sousa y Malcata (1998) definieron la actividad coagulante en base a Unidades

de Coagulación (RU), de modo que una unidad coagulante (RU) se define como la
cantidad de extracto necesaria para coagular 10 ml de leche a 30º C durante 100
segundos. Por su parte, Chazarra y col. (2007) definieron una unidad de fuerza del cuajo
52
Introducción
o actividad coagulante (RS) como el número de volúmenes de leche coagulada por cada
volumen de cuajo en 40 minutos a 35º C.
I.2.8. Actividad antimicrobiana de Cynara cardunculus

Algunas investigaciones han mostrado la presencia de saponinas, lactonas
sesquiterpénicas, flavonoles, esteroles, cumarinas, etc., en las hojas y semillas de C.
cardunculus (Koubaa, y Damak, 2003; Pinelli y col., 2007; Sevcikova y col., 2002;
Valenteao y col., 2002). En las brácteas involucrales se han identificado esteroles, de
saponinas triterpenoides, cumarinas, flavonoides y derivados del ácido cafeico (Mucaji
y col., 2000). Los extractos acuosos liofilizados de las hojas del cardo presentan
actividad antioxidante y contra los radicales superóxido (Valentao y col., 2002). Los
ácidos mono- y dicafeoil-quínico, que están presentes en los extractos de cardo
muestran actividad anti-HIV integrasa (Slanina y col., 2001). Las saponinas
triterpenoides aisladas de las brácteas involucrales de C. cardunculus reducen la
mutagénesis inducida químicamente in vitro (Krizkova y col., 2004). Además los
extractos de las hojas de C. cardunculus previenen la pérdida de la función vasomotor,
asociada a la edad (Rossoni y col., 2005). La actividad antioxidante y antimicrobiana
que presentan los extractos de las brácteas involucrales de C. cardunculus apoyan el uso
medicinal tradicional de esta planta y sienta las bases para el empleo de la misma como
alimento funcional (Kukic y col., 2008). Las hojas de C. cardunculus presentan
actividad antioxidante, debido a su composición fenólica, en base a ácidos cafeoil-
quínico y glicósidos de luteolina y apigenina (Pinelli y col., 2007; Valentao y col.,
2002), o β-sitosterol, sitosteryl-3β-glucosido, sitosteryl-3β-acetato, taraxasterol y
taraxasteryl-3β-acetato (Grancai y col., 1992), apigenina, apigenina 7-glucosido,
luteolina y luteolina 7-glucosido (Grancai y col., 1993), apigenina 7-rutinosido,
luteolina 7-rutinosido (Grancai y col., 1996), y apigenina 7-metilglucoronide (Mucaji y
col., 2000), cynarina (Grancai y col., 1994b) y ácido clorogénico (Mucaji y col., 2000),
cynarasaponinas A y H y sus metil derivados (Mucaji y col., 1999) y cynarasaponinas B
y K (Mucaji y col., 2001), identificados en las brácteas involucrales de esta planta. Los
extractos obtenidos de esta parte de la planta también presentan actividad
antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and B. subtilis,
Salmonella typhimurium, E. coli, y actividad antifúngica sobre Aspergillus niger,
Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Penicillium ochrochloron, Penicillium
53
Introducción
funiculosum, Trichoderma viride, Fusarium tricinctum y Alternaria alternata (Kukic y

col., 2008). Las hojas de Cynara cardunculus muestran una interesante actividad frente
a varias bacterias patógenas para los humanos, posiblemente debido a su específica
composición fenólica. Desde el punto de vista de la alimentación, C. cardunculus
resulta interesante no sólo por su actividad antimicrobiana, sino también como fuente de
polifenoles saludables (Falleh y col., 2008).
I.2.9. Problemas asociados a la utilización del cuajo procedente de Cynara

cardunculus en la actualidad
Hasta hace tan solo tres años no se conocían plantaciones de la especie vegetal
Cynara cardunculus, de la que se obtiene el cuajo para elaborar la Torta del Casar. Sin
embargo, este ingrediente resulta ser fundamental para imprimir al queso sus
características diferenciales respecto al resto de quesos, tanto a nivel nacional, como
internacional. A pesar de esta importancia, no se ha detectado en el sector quesero la
inquietud o necesidad de identificar, caracterizar, conservar o proteger este recurso. De
modo que de forma tradicional y actual, las plantas de Cynara cardunculus se
encuentran repartidas por cunetas, tierras agrícolas marginales o abandonadas, bordes de
caminos, de fincas, etc., de forma silvestre.
Este hecho implica por un lado que se desconozca el material genético empleado
(a conservar), que ese material se pueda perder por construcciones sobre las tierras
abandonadas, carreteras, etc. Por otro lado, este material se perpetúa o reproduce
libremente, originando gran variabilidad genética en la población de cardos, Cynara
cardunculus, de Extremadura, así las flores procedentes de estas plantas presentan
características diferentes en su aptitud como cuajo vegetal. Con esta situación, los
queseros se conforman con el material que la naturaleza les ofrece, en lugar de poder
controlar este recurso y utilizarlo para mejorar sus producciones. Unido a ello, las
personas que se dedican a la recolección de las flores de cardo no tienen en cuenta la
existencia de dicha variabilidad genética de la población de Cynara cardunculus, ni las
repercusiones que ello tiene en la elaboración del queso, ya que esto hasta ahora se
desconocía. Por lo tanto la trazabilidad de este producto queda en entredicho, por más
que el cuajo que se suministra a las queserías hoy en día debe tener Registro Sanitario.
54
Introducción
Todo ello se traduce en un cuajo muy heterogéneo, procedente de diferentes

plantas, recogidas en distintas localizaciones, lo cual constituye una de las causas de la
falta de homogeneidad que se presenta en el queso, tanto desde el punto de vista de
rendimiento quesero, hasta diferencias a nivel sensorial (características organolépticas).
En las queserías se recibe como cuajo vegetal un producto a base de pistilos

disgregados y secos, siendo imposible reconocer o distinguir si las flores pertenecen a
plantas de Cynara cardunculus o de otra especie de cardo, con diferentes características
coagulantes. De modo que hasta ahora no se podía garantizar la autenticidad del cuajo.
En 2009 la DOP Torta del Casar impulsó el establecimiento de una pequeña

plantación de Cynara cardunculus, a partir del material genético de la finca La Orden,
de la Junta de Extremadura, la cual seleccionó dicho material para producción de
biomasa. El paso de plantas silvestres a plantas cultivadas debe hacerse mediante
estudios agronómicos, para evaluar la influencia de las técnicas de cultivo en el
rendimiento en flores y características tecnológicas de las mismas. Estos estudios
deberán abarcar aspectos como la densidad de plantación, el aporte de fertilización, de
agua de riego, control de malas hierbas y control de plagas y enfermedades. Se deberá
contemplar también el momento ideal de cosecha y estado de maduración de la flor.
El cuajo se prepara de forma tradicional, mediante la maceración en agua de los

pistilos de las flores recolectadas en campo. Una vez filtrada esta solución, se añade a la
leche para provocar su coagulación. Esta solución presenta una gran carga microbiana
procedente de las flores (y de las manos y herramientas de los recolectores), que acaba
formando parte de la microflora presente en el queso. (No se somete el cuajo a
tecnologías para disminuir la carga microbiana sin causar detrimento en su actividad
coagulante y proteolítica). Muchos de estos microorganismos causan alteraciones en el
queso, y pueden dar lugar a la aparición de aminas biógenas.
55
Introducción
56
II. OBJETIVOS
Objetivos
1. Caracterizar botánica, genética y fenotípicamente los cardos silvestres

recolectados en la región extremeña para la elaboración de la Torta del Casar, así
como analizar la aptitud tecnológica que los extractos de los mismos presentan.
2. Evaluar la influencia que los diferentes años y estadios de maduración en la

recolección del cardo ejercen sobre las características sensoriales de las tortas.
3. Estudiar las modificaciones en las características físico – químicas,

microbiológicas y sensoriales que la utilización de los diferentes cardos recolectados
generan en las tortas elaboradas.
4. Ceder a la DOP “Torta del Casar” el cardo más adecuado para la obtención de
las mejores tortas.
59
III. MATERIAL Y MÉTODOS
Material y Métodos
III.1. Material
III.1.1. Reactivos químicos y medios de cultivo

Todos los reactivos químicos utilizados para el desarrollo de este trabajo fueron de calidad
reactiva y pertenecientes a las casas comerciales PANREAC, SIGMA, MERCK, ALDRICH y
SCHARLAU.
Los gases empleados en la cromatografía gaseosa procedían de la firma comercial

LINDE S.L.
Los medios de cultivo y productos utilizados en las pruebas microbiológicas fueron

adquiridos y preparados como recomendaban los distintos fabricantes pertenecientes a las
casas comerciales OXOID, MERCK, CULTIMED, PRONADISA, VIOCULT, BIOMEDIX,
BIOKAR y SCHARLAU.
La leche descremada para la determinación de la actividad coagulante era de la marca

LA ASTURIANA. La leche cruda de oveja empleada para la elaboración de los quesos fue
suministrada por Quesería Hermanos Pajuelo, inscrita en la DOP Torta del Casar.
Los reactivos utilizados para las extracciones de ADN fueron de las marcas TIB-
MOLBIOL, Roche, Pharmacia Biotech, Finnzyme y Sigma.
Los reactivos utilizados para la PCR fueron de las marcas TIB-MOLBIOL, Biotools,
Roche, Pharmacia Biotech, Finnzyme y Sigma.
El nitrógeno líquido empleado en la homogenización de las muestras fue cedido por el

Centro Nacional de Selección y Reproducción Animal (CENSIRA), y se almacenó en un
bidón Air Liquide TR 21.
III.1.2. Aparatos
Las incubaciones se realizaron en una estufa de hibridación HYBAID mod. Shake “n”
Stock, mientras que el secado de los precipitados de ADN se realizó en un bloque térmico
SELECTA modelo Tembloc.
Para la esterilización mediante filtrado se utilizaron filtros GELMAN SCIENCES de

0,22 m de diámetro de poro previamente estériles.
63
Material y Métodos
Los geles de agarosa (Pronadisa) se prepararon en agitadores magnéticos

SELECTA con calefacción modelo AGIMATIC-E.
Para preparar los geles de agarosa y como tampón de carrera se utilizó el tampón
TAE 1X. Este TAE 1X se elaboró disolviendo 20 ml de TAE 50X (Tris Base 2 M;
5,71% de ácido acético glacial (v/v); EDTA 0,05 M (pH 8)) en 980 ml de agua
desionizada.
El tampón de carga se elaboró con 40% (p/v) de sacarosa y 0,25% (p/v) de azul
de bromofenol.
Para adicionar el bromuro de etidio se preparó una solución con una

concentración de 10 mg/ml, y a partir de esta disolución se añadió una concentración
final de 0,5 g/ml (p/v) (Maniatis y col., 1982).
La electroforesis en gel de agarosa se realizó con cubetas MIDICELL Primo

System modelo EC330, MAXICELL Primo System modelo EC340 y BIO_RAD
MINISUB modelo CELL GT; y alimentados con una fuente SCIE-PLAS modelo PSU
400/200. Posteriormente, la visualización de ADN extraído se llevó a cabo mediante un
transiluminador SYNGENE modelo CHEMI Genius y el programa informático Gene
Snap versión 3.06 (SynGene; a Division of Synoptics Ltd., Beacon House, Nuffield
Road, Cambridge CB 4 1 TF, England).
El marcador de peso molecular utilizado fue el DNA Molecular Weight Marker

IV (0,07-19,3 kpb) de la casa comercial Roche (Roche Diagnostics GMBH, Roche
Molecular Biochemicals, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim, Germany). La
concentración del marcador fue de 0,25 g/l. El marcador contenía 14 fragmentos de
ADN con las siguientes pares de bases y concentraciones (Figura 6): 19.329 pb (93,5
ng/l), 7.743 pb (37,5 ng/l), 5.526 pb (26,75 ng/l), 4.254 pb (20,5 ng/l), 3.140 pb
(15,25 ng/l), 2.690 pb (13 ng/l), 2.322 pb (11,25 ng/l), 1.882 pb (9 ng/l), 1.489 pb
(7,25 ng/l), 1.150 pb (5,5 ng/l), 925 pb (4,5 ng/l), 697 pb (3,5 ng/l), 421 pb (2
ng/l) y 74 pb. Estos fragmentos eran provenientes de la rotura con las endonucleasas
de restricción Sty I y Sau I de cantidades equimolares de ADN y pSPTBM20 ADN.
Después de la electroforesis en gel de 1 g de la mezcla de fragmentos en un gel al 1%
de agarosa, son visibles 13 bandas. La banda más pequeña sólo es visible en geles
sobrecargados.
64
Material y Métodos
Para la cuantificación del ADN se empleó el programa informático Gene Tools versión
3.06 (SynGene; a Division of Synoptics Ltd., Beacon House, Nuffield Road, Cambridge CB 4
1 TF, England).
Para la realización de la PCR se utilizó un termociclador Mastercycler gradient, de la

marca EPPENDORF.
Se utilizaron las técnicas SDS y UREA-PAGE para determinar perfiles de proteínas de

los cuajos y de los quesos, así como para determinar la actividad proteolítica de los extractos
sobre caseínas.
Las incubaciones de las muestras se realizaron en un termobloque SELECTA mod.

Termobloc.
Las electroforesis de proteínas se llevaron a cabo en lámina vertical utilizando cubeta

BIORAD mod. MINI PROTEN 3 CELL, alimentada por una fuente CG A174.
Las fotografías de los geles de poliacrilamida se realizaron con un analizador de

imágenes de la marca SYNGENE mod. GeneGenius.
Para purificar las cardosinas de los extractos se empleó un equipo de ultrafiltración

Pellicon XL PXB010A50, Millipore. La solución concentrada se cargó en una columna de
flujo rápido Q-Sepharose, acoplada a un sistema FPLC, equipado con un detector UV a 214
nm y un colector de fracciones FRAC-950 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia).
Las fracciones de cardosinas fueron concentradas y filtradas a través de un equipo de
ultrafiltración Pellicon-2 PLCGC10, Millipore Corp.
Para la determinación de la actividad coagulante se utilizó un baño termostático.
Para el estudio de la actividad antimicrobiana de los extractos se utilizó un turbidómetro

automático BIOSCREEN C.
Para llevar a cabo la elaboración de quesos se utilizó el equipamiento de la planta piloto

de la Escuela de Ingenierías Agrarias de Badajoz, (de la Universidad de Extremadura),
formado por una cuba de 50 L de capacidad, con camisa de agua, liras y palas, cámaras de
refrigeración, prensa neumática, moldes, baños para la salmuera.
65
Material y Métodos
Las muestras de cardos y de quesos fueron trituradas utilizando una picadora

MOULINEX y homogeneizadas mediante un homogeneizador de cuchillas SORVAL
OMNIMIXER, mod. 17106.
Para la medición del pH se utilizó un pHmetro de electrodo combinado, de la marca

CRISON, modelo Basic20.
Las mediciones de la actividad del agua se realizaron con un medidor

LABMASTER.aw NOVASINA.
Los medios de cultivo se prepararon en agitadores magnéticos con calefacción de

SELECTA, mod. AGIMATIC-E para posteriormente ser esterilizados, al igual que las
soluciones y material de laboratorio, en una autoclave de SELECTA mod. PRESOCLAVE
75.
Los microorganismos y reactivos se conservaron en frigoríficos ZANUSSI mod.

TROPIC SYSTEM y WHIRPOOL y congelador vertical ZANUSSI, FORMA SCIENTIFIC
mod. –80 ºC.
En el análisis microbiológico, para el homogeneizado de las muestras se utilizó un

Stomacher, Mod. LAB BLENDER 400.
Para la realización de las diluciones y medida de volúmenes se usaron las pipetas

automáticas de 1-5 ml, 100-1000 µl, 50-200 µl, 10-100 µl y de 1-10 µl de la marca BIOHIT, y
agitadores de tubos HEIDOLPH, Mod. Reax-top.
Las siembras se llevaron a cabo en campanas de flujo laminar TELSTAR mod. AV -

100.
Para las incubaciones se utilizaron estufas SELECTA mod. CONTERM 80L y

CONTERM 150L e incubador de CO2 mod. NUAIRE airjacketed GH Autoflow Automatic
mod.2004, Hotcold-M refrigerada y un incubador orbital BRAUN BIOTECH mod. IS.
Los recuentos de colonias se llevaron a cabo en un contador de automático

COMECTA mod. DIGITAL S.
66
Material y Métodos
Para la determinación del nitrógeno total (Kjeldahl) se utilizó un digestor “BLOC

DIGEST 20” P Selecta y un destilador “KJELTEC SYSTEM 1002 DISTILLING UNIT”
Tecator.
El perfil de proteínas de los extractos de flores, la producción de aminas biógenas y de

iones de los quesos se determinaron mediante electroforesis capilar, utilizando un equipo
BECKMAN Pace System serie 5500, dotado con detector diode array que permite la
obtención de espectros desde 190 a 600 nm.
Para el análisis por electroforesis capilar se utilizaron columnas suministradas por

Beckman, silanizadas, de 75 µm de diámetro interno.
Para la determinación de la grasa se empleó un rotavapor
La extracción de los compuestos volátiles se realizó mediante una fibra de

microextracción en fase sólida de Carboxen/Polidimetilsiloxano (PDMS) de SUPELCO con
75 m de diámetro.
Para la separación de los compuestos volátiles se utilizó el cromatógrafo de gases

HEWLLET-PACKARD mod. HP 6890 dotado con una columna capilar de sílice fundido del
tipo DB-5 (5% fenil metil silicona) de 30 m x 0,32 mm x 1,05 m.
La detección de los volátiles se realizó con un detector selectivo de masas HEWLLET-

PACKARD HP 5973 y su análisis mediante el programa informático MS-ChemStation. Para la
identificación se utilizaron las bases de datos de espectros de masas WILEY y NIST/EPA/NIH
del National Institute of Standard and Technology.
Para las mediciones de la textura se utilizó un Texturómetro modelo TA.XTA2i (Stable

Micro Systems, Godalming, UK).
El análisis sensorial de los quesos se realizó en un laboratorio equipado con luz

fluorescente blanca en puestos individualizados.
Para las pesadas rutinarias se utilizó una balanza METTLER TOLEDO mod. B2002-S
con precisión de 0,01g y para las pesadas de mayor precisión se utilizó una balanza
METTLER TOLEDO mod. AB54-S de precisión 0,0001g.
67
Material y Métodos
Para las centrifugaciones se utilizaron las siguientes centrífugas: centrífuga de

sobremesa MICROSPIN SORVALL modelo 24S y una centrífuga de sobremesa refrigerada
EPPENDORF 5810 R.
Para las determinaciones de absorbancia se utilizó un espectrofotómetro UNICAM,

Mod. Helios α.
La eliminación de los disolventes orgánicos se realizó en un rotavapor (HEIDOLPH

Mod. Laborota 4000).
Además se utilizó diverso material de uso general en el laboratorio como destilador de

agua (USF ELGA), desionizador de agua mod. ELGASTAT UHQ II, etc.
La homogeneización de las muestras, tanto de cuajos, como de queso, se empleó un

Homogeneizador Politron.
Para el filtrado de las muestras se utilizaron filtros GELMAN SCIENCES de 0,2 m

de diámetro de poro y WHATMAN Nº 54.
Para las esterilizaciones por filtración se utilizaron filtros MILLIPORE de 0,22 µm de

tamaño de poro.
En el tratamiento estadístico de los datos se empleó el programas informático SPSS

para Windows, 15.0.
III.1.3. Material biológico

Para el desarrollo de este trabajo se parte de muestras de cardo de las especies Silybum
marianum, (L.) Goertner, Onopodom nervosum, Boiss, Cynara humilis, L., Cynara scolymus,
L., y Cynara cardunculus, L. La recogida de las muestras de cardo de las diferentes especies
se llevó a cabo en la campaña de 2006, cuando las flores estaban en el estado fenológico de
plena floración. Las muestras se recolectaron en localizaciones representativas de la región de
Extremadura. A lo largo de las campañas 2007, 2008 y 2009 se recogieron muestras de
Cynara cardunculus, L. de diferentes zonas de Extremadura, en las que se recolectan los
cardos para el suministro a las queserías de la región. Las muestras se recolectaron entre junio
y julio, en los estados fenológicos de inicio de floración, plena floración y flor senescente.
68
Material y Métodos
Las flores recolectadas se separan del involucro en un laboratorio de la Escuela de

Ingenierías Agrarias de la Universidad de Extremadura, dejando los estigmas y estilos que se
sequen. Una vez secos, se guardaron las flores de cada muestra por separado en bolsas de
plástico y se mantuvieron en un lugar seco, a temperatura ambiente, hasta su utilización.
Figura III.5. Localizaciones de recogida de las muestras de cardos de las diferentes

especies estudiadas, en Extremadura.
69
Material y Métodos
Tabla III. 3. Muestras de cardo de las diferentes especies muestreadas para la realización de este estudio.
Especie Estado de Maduración1 Año Localización2 Nº de

muestras
Silybum marianum b 2006 L7 Talayuela 1
Silybum marianum b 2006 L1 Balboa-Talavera 1
Silybum marianum b 2006 L2 Ctra. Mérida-Madrid 1
Cynara humilis b 2006 L4 Canal Lobón 2
Cynara humilis b 2006 L8 Ctra. Cáceres 6
Cynara humilis b 2006 L9 Villar del Rey 2
Onopordum nervosum b 2006 L10 Badajoz 4
Onopordum nervosum b 2006 L1 Balboa-Talavera 3
Onopordum nervosum b 2006 L11 Berlanga 1
Cynara scolymus b 2006 L12 Cáceres 1
Cynara cardunculus b 2006 L5 Puebla de la Calzada 1
Cynara cardunculus b 2006 L13 Villafranco del Guadiana 3
Cynara cardunculus b 2006 L11 Berlanga 3
Cynara cardunculus b 2006 L6 Sancha Brava 2
70
Material y Métodos
Cynara cardunculus b 2006 L14 Montijo – La Nava S. 5
Cynara cardunculus b 2006 L3 La Albuera 3
Cynara cardunculus b 2006 L15 Santa Marta-Solana 2
Cynara cardunculus b 2006 L16 Cruce Montijo 1
Cynara cardunculus b 2006 L2 Ctra. Mérida - Madrid 12
Cynara humilis b 2006 L10 Badajoz 2
Cynara humilis b 2006 L17 Casar de Cáceres 4
Onopordum nervosum b 2006 L1 Balboa-Talavera 2
Cynara scolymus b 2006 L13 Villafranco del Guadiana 3
Cynara cardunculus b (2)2, c (3) 2007 L5 Puebla de la Calzada 5
Cynara cardunculus a (4), b (2), c (3) 2007 L3 La Albuera 9
Cynara cardunculus a (5), b (4), c (6) 2007 L6 Sancha Brava 15
Cynara cardunculus a (4), b (8), c (3) 2007 L14 Montijo – La Nava S. 15
Cynara cardunculus a (4), b (3), c (7) 2007 L16 Cruce Montijo 14
Cynara cardunculus b (12), c (5) 2007 L2 Ctra. Mérida - Madrid 17
Cynara cardunculus b 2008 L12 Cáceres 2
Cynara cardunculus b (2), c (4) 2008 L18 La Orden-Guadajira 6
71
Material y Métodos
Cynara cardunculus b (3), c (8) 2008 L1 Balboa-Talavera 11
Cynara cardunculus b (6), c (3) 2008 L14 Montijo – La Nava S. 9
Cynara cardunculus b (8), c (7) 2008 L2 Ctra. Mérida-Madrid 15
Cynara cardunculus b (3), c (3) 2008 L3 La Albuera 6
Cynara cardunculus b (4), c (4) 2008 L6 Sancha Brava 8
Cynara cardunculus b (4), c (4) 2009 L19 Alcántara 8

1
a: la flor se está abriendo, solo algunos estigmas y estilos son visibles; b: flor completamente abierta, incluso con polen; c: flor comienza a secarse, algunos
estilos y estigmas son de color marrón.
2
Coordenadas geográficas: L1: 38º 54' 8,82" N 6º 43' 59,9" W, L2: 38º 50' 34,8" N 6º 57' 39,73" W, L3: 38º 45' 6,73" N 6º 48' 10,42" W, L4: 38º 52’ 29,07” N
6º 45’ 11,50” W, L5: 38º 53' 59,94" N 6º 51' 12,43" W, L6: 38º 56' 32,78" N 6º 20' 23,16" W, L7: 39º 59’ 7,44” N 5º 35’ 21,59” W, L8: 39º 19’ 30,53” N 6º 29’
54,41” W, L9: 39º 8’ 5,03” N 6º 51’ 13,63” W, L10: 38º 54’ 23,07” N 6º 58’ 15,10” W, L11: 38º 17’ 23,93” N 5º 49’ 48,00” W, L12: 39º 26’ 19,40” N 6º 22’ 52,95”
W, L13: 38º 53’ 55,65” N 6º 53’ 15,99” W, L14: 38º 55’ 20,77” N 6º 35’ 57,79” W, L15: 38º 37’ 55,93” N 6º 37’ 0,20” W, L16: 38º 55’ 16,44” N 6º 57’ 23,19” W,
L17: 39º 35’ 31,47” N 6º 23’ 30,03” W, L18: 38º 51’ 17,61” N 6º 41’ 20,37” W, L19: 39º 42’ 25,67” N 6º 53’ 5,49” W.
72
Material y Métodos
A. B.
Figura III.6. Plantas de las especies A. Silybum marianum (L) Goertner, y B. Onopordum
nervosum, L.
C. D.
Figura III.7. Plantas de las especies C. Cynara humilis, L. y D. Cynara scolymus, L.
73
Material y Métodos
E.
Figura III.8. Planta de la especie E. Cynara cardunculus, L.
III.2. Métodos
III.2.1. Toma de muestras de cardos de diferentes especies (2006). Toma de

muestras de Cynara cardunculus (2007-09).
Se recolectaron muestras de hojas y flores de varias especies de cardo en varias
localizaciones de Extremadura, y una vez secas, se almacenaron en lugar seco y a
temperatura ambiente. Las hojas y las flores se recolectaron individualmente planta por
planta con el fin de analizar la variación intra – especie. El muestreo de las flores se
realizó teniendo en cuenta el estado fenológico de la flor. En la campaña de 2006 se
recogieron un total de 65 muestras en el estado de plena floración, de las especies
Silybum marianum, Onopordom nervosum, Cynara humilis, Cynara scolymus y Cynara
cardunculus.
A lo largo de las campañas de 2007, 2008 y 2009, se recogieron un total de 140

muestras de la especie Cynara cardunculus, de las zonas más representativas de la
región de Extremadura. Estas muestras se recogieron en 3 estados de maduración de la
flor, inicio de floración, plena floración y senescencia de la flor. Se llevaron a un
laboratorio de la Escuela de Ingenierías Agrarias para ser analizadas. Se separaron los
estigmas y estilos del involucro de la flor y se dejaron secar a temperatura ambiente.
Una vez secas las flores se guardaron en bolsas de plástico, en un lugar seco y a
temperatura ambiente hasta que fueron utilizadas.
74
Material y Métodos
III.2.2. Caracterización morfológica

La caracterización morfológica se llevó a cabo in situ, en el campo, donde las
plantas de cardo de las diferentes especies eran muestreadas, teniendo en cuenta la guía
de Clasificación de Valdés y col. (1987), para la descripción de las características
morfológicas principales de estas especies.
Las especies de cardo muestreadas pertenecen a la familia de las Asteraceae.

Crecen como hierbas o arbustos. Sus inflorescencias aparecen en capítulos, rodeados
por un involucro de brácteas coriáceas. El fruto es un aquenio con un vilano para la
dispersión de las semillas.
III.2.3. Extracción de ADN

El método de extracción empleado está basado en los trabajos realizados por
Lodhi y col. (1994) y Porebski y col. (1997), el cuál fue mejorado por Hernández
(2007). La principal característica de este método es la utilización de un tampón de
extracción cuya composición es Tris base 100 mM; NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM (pH 8);
2% de cetiltrimetilamonio de bromo (CTBA) y 0,3% de 2-mercaptoetanol. El 2-
mercaptoetanol se añadió a la muestra por separado del tampón de extracción, justo
después de la adicción de este.
El proceso se inició con la homogenización de la muestra, hojas de cardo, para

lo cual se tomó una cantidad variable de hoja de cardo, que se fraccionó con un bisturí y
seguidamente se pulverizó en un almirez metálico (previamente esterilizado) con la
ayuda de nitrógeno líquido. Una vez homogenizadas las muestras se pesaron
aproximadamente 0,5 g de hoja de cardo en un tubo cónico estéril de 50 ml de volumen
máximo y se conservaron en hielo picado. Todo el proceso se realizó en condiciones de
esterilidad con mechero, y utilizando los bisturí, pinzas y espátulas esterilizados con
etanol (70% v/v).
A la muestra pesada se le añadió 10 ml del tampón de extracción. Seguidamente

se añadió 30 μl de 2-mercaptoetanol, 400 l de proteinasa K (Sigma) esterilizada
mediante filtración, con una concentración de 10 mg/ml; y 200 l de ARNasa (Sigma)
esterilizada mediante filtración, con una concentración de 10 mg/ml; incubando la
disolución a 60 ºC durante 1 hora y 30 minutos en movimiento continuo. Transcurrido
el tiempo de incubación, se continuó la extracción del ADN con la adición de 3 ml de 5
75
Material y Métodos
M acetato potásico y tras dejar reposar la dilución 2 minutos, se recogió el sobrenadante

mediante alícuotas de 600 l en microtubos de 1,5 ml de volumen. La purificación de
este extracto se llevó a cabo mediante un lavado con 600 l de fenol-cloroformo
alcohol isoamílico (25:24:1) (Sigma) y centrifugado a 10.000 x g durante 10 minutos.
La fase superior se recogió en alícuotas de 400 l en microtubos de 1,5 ml de volumen,
y se precipitó el ADN con 150 l de isopropanol y etanol (100% v/v) a –20 ºC. Para
favorecer la precipitación los microtubos se mantuvieron a –20 ºC durante 12 horas.
Seguidamente se centrífugo a 7000 x g durante 3 minutos, eliminando el sobrenadante y
lavando el precipitado con 500 l de etanol (70% v/v) a –20 ºC. La nueva
centrifugación a 7000 x g/2 min., el eliminado del sobrenadante y el secado del
precipitado a 37 ºC en el bloque térmico aseguraron la eliminación del etanol. Una vez
seco, el ADN se resuspendió a 4 ºC en 100 l de agua desionizada estéril hasta la
solubilización completa.
III.2.4. Análisis de AND mediante técnicas RAPD-PCR

Electoforesis en geles de agarosa
Después de realizar las extracciones de ADN se procedió a una evaluación y

cuantificación del mismo mediante electroforesis horizontal submarina en gel de
agarosa con bromuro de etidio.
Las muestras fueron preparadas añadiendo aproximadamente 1 l de tampón de

carga (Sambrook y col., 1989) por cada 5 l de disolución de ADN. Los geles se
prepararon hirviendo un 1% de agarosa en tampón TAE 1X. Las electroforesis se
realizaron con voltaje constante inferior a 100 voltios. Para la determinación del peso
molecular se cargó en un pocillo 2 l de marcador DNA Molecular Weight Marker IV
disuelto en 1 l de tampón de carga.
Las muestras se consideraron adecuadas cuando no hubo presencia de ARN, y el

ADN se mostró como una banda de tamaño definido y homogéneo para todas ellas.
La cuantificación de la concentración del ADN extraído se realizó mediante

comparación con el DNA Molecular Weight Marker IV y el programa Gene Tools.
76
Material y Métodos
Digestión mediante enzimas de restricción
Para la determinación de la pureza del ADN mediante corte con enzimas de

restricción se utilizó el método descrito por Michiels y col. (2003) y Puchooa (2004). Se
tomaron 20 l de ADN y se le añadieron 3 l de tampón de reacción 10X, se añadieron
2 l de la enzima Eco RI y se completó la reacción a 25 l de volumen final con agua
desionizada estéril. La reacción se incubó a 37 ºC durante 12 horas.
Finalizada la incubación se procedió a la visualización del corte con

endonucleasas mediante electroforesis horizontal submarina en gel de agarosa con
bromuro de etidio como se detalla en el método anterior. El marcador de peso molecular
utilizado fue el DNA Molecular Weight Marker IV.
Las muestras se consideraron adecuadas cuando se observa una banda degradada

de ADN debido a la digestión enzimática.
Purificación del ADN extraído
Debido a la extracción, junto al ADN de los cardos, de moléculas que impedían

el correcto funcionamiento de la DNA polimerasa durante la PCR, se procedió a
purificar el ADN extraído de cada muestra. Esta purificación se llevó a cabo utilizando
el kit de purificación de ADN “High Pure PCR Product Purification Kit” de Roche
Molecular Biochemicals (Mannheim, Germany) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Éste retiene el ADN al ser centrifugado a través de unas columnas.
Finalmente el producto purificado se eluyó en 100 l de tampón de elución.
Técnicas basadas en la PCR
Todas las técnicas basadas en la PCR que se utilizaron en este trabajo se

optimizaron en cuanto a las concentraciones de reactivos y condiciones de
amplificación de los productos de la PCR. Las modificaciones realizadas y los valores
que se consideraron más óptimos se muestran en los respectivos apartados. Se
realizaron cambiando en cada grupo de experimentos una sola variable. De esta forma,
se utilizó el valor óptimo obtenido de cada variable para experimentos posteriores. La
concentración de DNA polimerasa, de cebador y de dNTPs no fue modificada. Las
77
Material y Métodos
concentraciones testadas estaban basadas en estudios previos donde se optimizaron

técnicas de PCR (Parejo, 1996; Díaz-Amigo, 1999; Arroyo, 2001; de la Rosa, 2002;
Hernández, 2007).
Después de realizar las PCR con las condiciones optimizadas para cada cebador,
se procedió a una evaluación y cuantificación de los productos obtenidos mediante
electroforesis horizontal submarina en gel de agarosa con bromuro de etidio. De manera
similar a como se realizó tras la extracción de ADN, las muestras fueron preparadas
añadiendo 4 l de tampón de carga y 20 l de disolución de ADN. Los geles se
prepararon hirviendo un 2% de agarosa en tampón TAE 1X. En este caso, las
electroforesis se realizaron con voltaje constante inferior a 75 voltios. Para la
determinación del peso molecular se cargó en un pocillo 2 l de marcador DNA
Molecular Weight Marker VI (2,1 kpb-0,15 kpb) disuelto en 2 l de tampón de carga.
Este marcador este compuesto de 15 fragmentos con los siguientes pesos

moleculares y concentraciones: 2.176 pb (55,5 ng/l), 1.766 pb (44,75 ng/l), 1.230 pb
(31,25 ng/l), 1.033 pb (26,25 ng/l), 653 pb (16,75 ng/l), 517 pb (13,25 ng/l), 453
pb (11,5 ng/l), 394 pb (10 ng/l), 298 pb (7,625 ng/l), 298 pb (7,265 ng/l), 234 pb
(6 ng/l), 234 pb (6 ng/l), 220 pb (5,5 ng/l), 154 pb (3,875 ng/l) y 154 pb (3,875
ng/l); provenientes de la mezcla del corte con Bgl I de pBR328 ADN con el corte de
Hinf I de pBR328 ADN.
RAPD-PCR (Cebadores aleatorios)
La reacción se desarrolló en 30 l de volumen a partir de las concentraciones de los

siguientes reactivos:
- 3 l de tampón de reacción de la Taq DNA polimerasa 10X (Tris-HCl 75 mM

(pH 9); KCl 50 mM; (NH4)2SO4 20 mM).
- 0,7 l de mezcla de nucleótidos, con una concentración de 10 mM cada
nucleótido.
- 2,5 l de MgCl2 a una concentración de 50 mM.
- 1 l de la solución acuosa del cebador, a una concentración de 50 M.
- 3 l de solución de ADN (50 ng/l).
78
Material y Métodos
- 18,8 l de agua desionizada y esterilizada.
Una vez realizada la disolución con los anteriores componentes, se realizó una
primera desnaturalización a 94 ºC durante 3 minutos, posteriormente se añadió 1 l de
una solución de DNA polimerasa (1U/l) (Biotools) y se adicionó 20 l de aceite
mineral estéril para evitar la evaporación.
Las condiciones de amplificación empleadas fueron las descritas en la Tabla III.2:
Tabla III.4. Condiciones de amplificación empleadas en los RAPD-PCR.
Etapas Temperatura (º C) Tiempo (min) Nº ciclos
Desnaturalización 94 0,5
Hibridación 45 1
35
Extensión 72 1
Extensión final 72 5
Para determinar el perfil genético de las variedades de cardo se utilizaron 7

cebadores aleatorios para el desarrollo de la técnica RAPD (Tabla III.3). Estos
cebadores fueron seleccionados fundamentalmente de otros estudios basados en la
caracterización genética de vegetales.
79
Material y Métodos
Tabla III.5. Cebadores utilizados para el desarrollo de la técnica RAPD.
CEBADORES SECUENCIA (5-3) REFERENCIA
OPAE10 CTGAAGCGCA Hernández (2007)
OPB06 TGCTCTGCCC Hernández (2007)
OPB07 ACGCGCCCT Hernández (2007)
OPE19 ACGGCGTATG Hernández (2007)
OPF05 CCGAATTCCC Hernández (2007)
OPF08 GGGATATCGG Hernández (2007)
OPG12 CTCCCAGGGT Hernández (2007)
Para optimizar la amplificación, se llevaron a cabo variaciones en la

composición de la mezcla de reacción empleando el cebador OPE19. Las variaciones
realizadas se llevaron a cabo modificando en cada experimento uno sólo de los
componentes de la reacción (Tabla III.4) hasta obtener los mejores resultados de
amplificación.
Tabla III.6. Concentraciones evaluadas de reactivos para la optimización de la técnica RAPD.
Variable Unidades Valores Testados
Tampón 10X µl 2,5 3
Cl2Mg µl 1,5 2 2,5 3
ADN µl 1 2 2,5 3 5 10
Cebador µl 1
dNTPs µl 0,7
Polimerasa µl 1
80
Material y Métodos
También se evaluó la incidencia de las condiciones de amplificación sobre la

obtención de los productos resultantes. Las condiciones de amplificación empleadas
inicialmente fueron las utilizadas por Hernández (2007) para la caracterización de
distintos pimentones. A partir de estas condiciones se hicieron las modificaciones que se
muestran en la Tabla III.5:
Tabla III.7. Condiciones de amplificación testadas para la optimización de la técnica RAPD.
FASES Tª (º C) Tiempo (min)
Desnaturalización inicial 94 3
Desnaturalización 94 30
40 1
Hibridación
45 1
Extensión 72 1
CICLOS (Nº ciclos) 35
III.2.5. Análisis de ADN mediante microsatélites (SSRs)

Para el desarrollo de la PCR con los cebadores no aleatorios, la reacción se llevó a
cabo en en 30 l de volumen, donde se utilizaron las siguientes concentraciones de
reactivos:
- 3 l de tampón de reacción de la Taq DNA polimerasa 10X (Tris-HCl 75 mM

(pH 9); KCl 50 mM; (NH4)2SO4 20 mM).
- 0,7 l de mezcla de nucleótidos, con una concentración de 10 mM cada
nucleótido.
- 2,5 l de MgCl2 a una concentración de 50 mM.
- 2 l de la solución acuosa del cebador, a una concentración de 50 M,
perteneciendo 1 l a la parte directa del cebador y el otro l al reverso.
81
Material y Métodos
- 1 l de solución de ADN (50 ng/l).

- 19,8 l de agua desionizada y esterilizada.
Una vez realizada la disolución con los anteriores componentes, al igual que con el
RAPD-PCR, se realizó una primera desnaturalización a 94 ºC durante 3 minutos y
posteriormente se añadió 1 l de una solución de DNA polimerasa y se adicionó 20 l
de aceite mineral estéril para evitar la evaporación.
Las condiciones de amplificación empleadas fueron las mismas que las descritas en
la tabla 2 para el desarrollo del RAPD-PCR.
En este caso se utilizaron 10 cebadores para determinar el perfil genético de las

variedades de cardo estudiadas (Tabla III.6):
82
Material y Métodos
Tabla III.8. Cebadores utilizados para la amplificación de los SSRs
CEBADORES SECUENCIA (5’-3’) REFERENCIA
TCATGGCATTTATGAATGTT DIRECTO
CMAFLP-01
ATAAATATTTTGATTGTTTTCT REVERSO
CGATAGCTCTTTCCCTTT DIRECTO
CMAFLP-04
ATGGGTGAGATTGGTTTAC REVERSO
GGCTCCACCGTACTCCTA DIRECTO
CMAFLP-07
TCTCTCGTCAGTAAACCC REVERSO
AGGTGTGAAGGCTTCATC DIRECTO
CMAFLP-08
TCCCGAGATCCTTGACTCAG REVERSO
GAAGGAGAAGCTTGATATCTG DIRECTO Acquadro y col.

CMAFLP-11
CATCCTCACGAGGACATC REVERSO (2005)
TTTGATCTTGTCCCTATATATATA DIRECTO
CMAFLP-13
TCGGCTTTTCTGAATATC REVERSO
TTGAGAGGGTTTTCCGAGAG DIRECTO
CMAFLP-15
TAGGATGAGTCCTGAGTAAT REVERSO
AAGTGTTGCATAATAACTTACC DIRECTO
CMAFLP-18
CCGAACAAATTGCTTACAA REVERSO
TAAATAGTTAGTGTTCTCGTTTG DIRECTO Acquadro y col.

CMAFLP-21
TGGGGTTGTATTGGTTG REVERSO (2005)
GCCCGTTCACACACAACA DIRECTO Acquadro y col.

CMAFLP-24
CAGGTTCTTTTTATACAGCAG REVERSO (2005)
AGTGGGTAAGTGGGGATG DIRECTO Acquadro y col.

CMAFLP-110
ATCTCCACATTTTCTCCTCC REVERSO (2005)
83
Material y Métodos
Las concentraciones de reactivos ensayadas para la optimización de este

procedimiento se muestran en la Tabla III.7:
Tabla III.9. Concentraciones de reactivos empleadas para la amplificación de los SSRs.
Variable Unidades Valores Testados
Tampón 10X µl 3
Cl2Mg µl 2 2,5 3
ADN µl 0,5 1 2 5
Cebador µl 2
dNTPs µl 0,7
Polimerasa µl 1
Las condiciones de amplificación ensayadas fueron las que se detallan en la

Tabla III.8:
84
Material y Métodos
Tabla III.10. Condiciones de amplificación empleadas para la optimización de los SSRs.
FASES Tª (º C) Tiempo (min)
Desnaturalización inicial 94 3
Desnaturalización 94 30
45 1
Hibridación 50 1
55 1
Extensión 72 1
CICLOS (Nº ciclos) 35
III.2.6. Extracción de proteínas del cuajo vegetal para análisis mediante SDS-
PAGE.
Para el análisis de proteínas mediante la técnica SDS-PAGE se prepararon

extractos acuosos de las diferentes especies de cardo de la familia de las Asteráceas, a
partir de 1 g de flor seca y picada, que se maceraba en 5 ml de agua durante 4 horas a
temperatura ambiente. La solución obtenida se filtró a través de papel de filtro Whatman
Nº 4.
III.2.7. Perfil de proteínas del cuajo mediante SDS-PAGE
Las proteínas extraídas como se ha descrito anteriormente para su análisis

mediante SDS-PAGE se mezclaron con 30 µl de buffer PAGE de carga (62,5 mM Tris-
HCl, pH 6,8, 20 % (p/v) glicerol, 2 % (p/v) SDS, 5 % (p/v) β-mercaptoetanol, 0,025 %
(p/v) bromofenol azul) y fueron incubadas a 99º C durante 5 min para la
desnaturalización de las proteínas. Las condiciones de electroforesis son las descritas
85
Material y Métodos
por Laemmli (1970), y las concentraciones para la acrilamida (29:1

acrilamida/bisacrilamida) en los geles fue de 4 % (p/v) para el gel concentrador, y de 15
% (p/v) para el gel separador. Los geles fueron montados y pinchados en un dispositivo
Miniprotean III (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).
Para determinar el peso molecular de las distintas fracciones se utilizó un patrón

de proteínas constituido por miosina (205 kDa), β-Galactosidasa (116kDa), Fosforilasa
B (97 kDa), albúmina (66 kDa), Glutámico desidrogenasa (55 kDa), ovoalbúmina (45
kDa), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (36 kDa), anhigrasa carbónica (29 kDa),
tripsinógeno (24 kDa), inhibidor de la tripsina (20 kDa), α-lactoalbúnina (14,2 kDa) y
aprotinina (6,5 kDa), suministrado por la casa comercial de SIGMA.
El tampón utilizado para la carrera fue Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS al
0,1%, pH 8,3. Las electroforesis se realizaron a 100 w los primeros 20 min y a 150 w
hasta el final de la carrera. Una vez finalizado el desarrollo electroforético, los geles
fueron tratados con una solución de tinción constituida por 0,25 g de azul de Comassie
R-250 en una solución 1:1 metanol-agua al 90 % y ácido acético al 10 % durante 15
minutos, transcurrido los cuales fueron desteñidos en una solución de metanol al 30 % y
ácido acético al 10 %.
Se utilizó un programa informático de análisis de imágenes (Genetools,

Synoptics Ltd., Cambridge, U.K.) para el análisis densitométrico del gel de
electroforesis.
Figura III.9. Cubetas de electroforesis capilar (SDS-PAGE)
86
Material y Métodos
III.2.8. Extracción de proteínas del cuajo vegetal para análisis mediante FZCE.
Para conseguir un mejor resultado en la extracción de proteínas, se incluyó un
paso previo, que consistía en mezclar 1 g de flor de cardo con metanol (3:10 p/v)
durante 5 min a temperatura ambiente, según el método descrito por Hernández y col.
(2006). Mayor tiempo de extracción no mejoró la efectividad de la extracción. La
suspensión homogeneizada periódicamente, se centrifugó a 5800 g durante 5 min y se
recogió el sobrenadante. A partir de una alícuota de 0,5 ml, las proteínas solubles en
metanol fueron parcialmente precipitadas (excepto la mayor parte de la fracción
proteica apolar) con cloroformo (1:2 v/v) y centrifugadas a 24000 g durante 5 min. Los
pellets se lavaron dos veces con cloroformo y después se disolvieron en 100 µl de
acetonitrilo (30 % v/v) según el protocolo descrito por Hernádez y col. (2007).
III.2.9. Perfil de proteínas del cuajo mediate FZCE

Los extractos de proteínas fueron en primer lugar filtrados a través de un filtro
de 0,2 µm y fueron analizados mediante FZCE. Las separaciones se realizaron en un
aparato PACE 5500 (Beckman Instruments, INC., Palo Alto, CA). Para minimizar la
interacción de las proteínas con la pared de la columna, se eligieron valores de pH
básicos para la carrera. El buffer electrolito fue preparado con agua de calidad HPLC
obtenida mediante el sistema de purificación de agua Mili-Q, y estaba formado por
fosfato monosódico 8,75 mM, tetraborato sódico 20,6 mM a un pH nominal de 9. Se
empleó un capilar (soldado/fundido) de 75 µm de diámetro interno y 57 cm de longitud
total (50 cm de abertura al detector) (Supelco, Tecknocroma, Barcelona, España). Los
capilares fueron inicialmente acondicionados con 100 mM NaOH durante 10 min y
después con agua desionizada durante 5 min. Fueron aclarados entre separaciones
durante 2 min con 100 mM NaOH, con agua desionizada durante 2 min y con buffer de
separación durante 2 min. Al finalizar la carrera los capilares se aclararon con 100 mM
NaOH durante 10 min, seguido de agua durante 10 min, y finalmente se secaron con
nitrógeno durante 10 min. El voltaje de separación fue 263 V/cm (15kV) y la
temperatura de separación, 23º C. La longitud de onda empleada para el seguimiento del
ensayo fue de 254 nm. Las muestras fueron inyectadas bajo una presión (0,5 psi)
durante 5 s y el espectro de proteínas fue monitorizado de 190 a 300 nm con detector
87
Material y Métodos
diode array PACE (Beckman Instrument Inc., Palo Alto, CA, USA). Para la
determinación de los parámetros analíticos, se visualizó un pico negativo de
acetonitrilo, a 254 nm, empleado para normalizar las áreas de los picos y calcular los
correctos tiempos de migración (CMT) de los picos. Los picos de las proteínas se
identificaron mediante el correcto tiempo de migración y el espectro de absorbancia
UV. El programa Beckman P/ACE Station (Versión 1.21) fue empleado para almacenar,
procesar y comparar los electroferogramas.
Con el fin de mejorar la resolución de los perfiles de proteínas obtenidos

mediante esta técnica se llevaron a cabo unos ensayos, que consisten en utilizar buffer
con diferentes concentraciones de acetonitrilo, 0, 10, 20 y 30 %.
El mejor resultado se obtuvo con el buffer que incorpora acetonitrilo al 20 %.

Por esta razón, los perfiles de las muestras recogidas entre los años 2007 y 2009 se
obtuvieron con la misma técnica descrita, pero con buffer con acetonitrilo.
III.2.10. Purificación de cardosinas

Se purificaron patrones de cardosinas a partir de las flores de C. cardunculus
según Sidrach y col. (2005) con algunas modificaciones. Los estigmas y estilos de las
flores de cardo (100 g) fueron molidos en una picadora de alimentos y homogeneizados
en 800 ml de buffer citrato 50 mM (pH 3.0), con NaCl 1 M para prevenir la obturación
de las membranas del filtro por parte de proteinasas no específicas en la siguiente etapa
de ultrafiltración. Esta solución homogeniezada fue filtrada a través de una gasa para
eliminar los residuos sólidos. Se centrifugó a 24000 rpm durante 20 min, el
sobrenadante se filtró a través de un papel de filtro Whatman 4. La solución resultante,
formada por el extracto crudo de cardo, fue concentrada y dializada mediante
ultrafiltración (Pellicon XL PXB010A50, Millipore) contra buffer Tris-HCl 25 mM, pH
7,6, acoplado a un sistema FPLC equipado con un detector UV a 214 nm y un colector
FRAC-950 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Tras la aplicación de la
muestra, las enzimas fueron desplazadas con gradientes de NaCl 0,3, 0,35 y 0,5 M en el
buffer anterior. Se recogieron las fracciones que contenían las cardosinas. Antes del
análisis mediante FZCE, las fracciones de cardosinas fueron concentradas y dializadas
mediante ultrafiltración (Pellicon-2 PLCGC10, Millipore Corp.) contra agua ultrapura.
88
Material y Métodos
III.2.11. Determinación de la actividad proteolítica del cuajo
Los extractos de las flores secas se prepararon macerando 0,25 g de flores secas
en 5 ml de agua (que corresponde a la proporción 50 g/L agua), a temperatura ambiente,
durante 4 horas. El homogenado se filtró a través de papel de filtro Whaman nº 4. El
sustrato empleado para la degradación por parte de los extractos consistió en una mezcla
de caseínas bovinas (Sigma Aldrich, Co., St. Louis, MO, USA (α, β and κ) a una
concentración de 0,5 mg/ml de cada caseína, disueltas en 5 ml de agua destilada. Los
extractos de flores secas se maceraron con la mezcla de caseínas, a 2,5 % de extracto
(v/v) durante 2 horas, a temperatura ambiente, para permitir la degradación de las
caseínas. Después de este tiempo, los extractos junto con las caseínas degradadas fueron
desnaturalizados mediante adición de 30 µl de buffer de carga PAGE (Tris-HCl 6,25
mM, pH 6,8, glicerol 20 % (p/v), SDS 2 % (p/v), β-mercaptoetanol 5 % (p/v), azul
bromofenol 0,025 % (p/v)) e incubación a 99º C durante 5 min. Las condiciones de
electroforesis y el método de análisis empleados se describieron en el apartado III.2.7.
III.2.12. Determinación de la actividad coagulante del cuajo
La actividad coagulante se determinó según el método estándar (NILACTM;

NIZO, Ede, The Netherlands) usando leche descremada en polvo bovina. El sustrato fue
preparado disolviendo 12 g de leche en polvo en 100 ml de CaCl2 0,01 M (pH 6,5) a 30º
C. La leche fue empleada como un sustrato estándar y homogéneo, aunque los extractos
de cardo testados se usan sobre leche cruda entera de oveja en la elaboración de los
quesos. El ensayo enzimático fue realizado empleando 0,2 ml de extracto acuoso de
cardo añadiendo 2 ml de leche reconstituida y el tiempo de actividad coagulante fue
determinado visualmente. Una unidad de cuajado (R.U.) se define como la cantidad de
extracto acuoso de cuajo que se necesita para cuajar 10 ml de leche descremada
reconstituida a 30º C en 100 s (FIL-IDF 157/1992). Las determinaciones se realizaron
por cuadruplicado y la media de cada cuatro datos se consideró como dato.
89
Material y Métodos
III.2.13. Determinación de la actividad antimicrobiana del cuajo
Dado que las hojas de Cynara cardunculus muestran una interesante actividad
contra varias bacterias patógenas para los humanos, probamos si el extracto obtenido de
las flores de cardo, empleado como cuajo, muestra el mismo efecto inhibitorio sobre
siete cepas de bacterias patógenas y sobre seis cepas de bacterias lácticas: Listeria
monocytogenes CECT 934, Listeria monocytogenes CECT 911, Salmonella enteritidis
(1263) (cedida por Centro Tecnológico Nacional Agroalimentario Extremadura,
CTAEX), Escherichia coli CECT 4267, Staphylococcus aureus CECT 976, Bacillus
cereus CECT 131, Yersinia enterocolitica CECT 559, Lactobacillus plantarum CECT
223, Lactobacillus brevis CECT 216, Lactobacillus sakei ssp. carnosus CECT 5766,
Lactobacillus curvatus CECT 904, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides
CECT 394, Pediococcus pentosaceus CECT 923.
Las cepas fueron cultivadas en caldo (BHI para las bacterias no lácticas y MRS
para las bacterias lácticas) durante 48 h a 30º o 37º C según la cepa. Las cepas utilizadas
para este ensayo y las condiciones de cultivo de las mismas se muestran en la Tabla
III.9:
90
Material y Métodos
Tabla III.11. Cepas usadas como indicadores en el estudio de la actividad antimicrobiana y sus
respectivos medios para su crecimiento.
Cepa Caldo de recuperación Agar específico
Listeria monocytogenes CECT 934 Caldo palcam Agar BHI
Listeria monocytogenes CECT 911 Caldo palcam Agar BHI
Salmonella enteritidis 1263(CTAEX) Caldo BHI Agar BHI
Staphylococcus aureus CECT 976 Caldo BHI Agar BHI
Bacillus cereus CECT 131 Caldo BHI Agar BHI
Escherichia coli CECT 4267 Caldo BGBL Agar BHI
Yersinia enterocolítica CECT 559 Caldo BHI Agar BHI
Lactobacillus plantarum CECT 223 Caldo MRS Agar MRS
Lactobacillus brevis CECT 216 Caldo MRS Agar MRS
Lactobacillus sakei ssp. carnosus CECT 5766 Caldo MRS Agar MRS
Lactobacillus curvatus CECT 904 Caldo MRS Agar MRS
Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides CECT 394 Caldo MRS Agar MRS
Pediococcus pentosaceus CECT 923 Caldo MRS Agar MRS
Los extractos de flores de C. cardunculus fueron preparados tal y como se

preparan en las queserías, macerando 50 g de flores secas en 1 L de agua durante 24 h a
temperatura ambiente, ajustando el pH a 6,5, usando NaOH como neutralizador.
Después se filtraron a través de un filtro esterilizador (0,22 µm). Se evaluó la capacidad
de los extractos de flores de C. cardunculus para evitar el crecimiento de las bacterias
patógenas y de bacterias lácticas mediante el seguimiento del crecimiento microbiano a
37º C durante 1 día en un turbidímetro automático Bioscreen C (Labsystems, Findland).
La densidad óptica fue medida con un filtro de banda ancha (OD 420-580 nm). Inóculos
de 5 % en un volumen total de 210 µl. Los medios de cultivo control empleados fueron
caldo MRS y BHI, sin suplementos y con un pH ajustado a 6,5. La actividad
antimicrobiana de los extractos de las flores de cardo se determinó comparando los
ratios de crecimiento de los microorganismos (Tabla III.9) frente al crecimiento en los
medios de cultivo control. Las densidades ópticas por debajo de 200, 400 y 600
91
Material y Métodos
unidades de absorbancia arbitraria (UAA) respecto al control se consideraron como

actividad antimicrobiana baja, media y alta respectivamente.
III.2.14. Elaboración de quesos tipo “Torta del Casar”
Se elaboraron un total de 16 lotes de queso tipo “Torta del Casar”, de 10 quesos

en cada lote. Se utilizó leche cruda de oveja de la raza Merina, y no se emplearon
cultivos starter. Cada uno de los lotes se elaboró con cuajo procedente de las 16
muestras de cardo Cynara cardunculus seleccionadas (Tabla III.10). Los extractos
acuosos de las flores de C. cardunculus, cuajos, se prepararon a partir de 50 g de flores
secas y picadas que se maceraron en 1 L de agua, durante 24 h. Se añadieron 10 ml de
cuajo/L de leche, a la leche previamente calentada hasta 28-30º C, para cada lote de 32
L de leche. Una vez que se forma la cuajada se corta con las liras de la cuba hasta
conseguir el tamaño de grano de arroz, mientras se produce el desuerado. La cuajada
cortada y parcialmente desuerada se coloca en moldes, que se prensan (2 horas, a 2
kg/cm2). Tras el prensado, los quesos se desmoldan y se sumergen en una solución de
salmuera (16 % (p/v)) durante 4 horas. La maduración de los quesos se produjo a una
temperatura de 5-10º C y una humedad relativa de 85-90 % durante 60 días.
92
Material y Métodos
Calentar leche: 28 - 30º C
Añadir cuajo (Cynara cardunculus)
Romper la cuajada
Moldeado, Desuerado
Prensado (2 kg/cm2 máx)
Salado (Salmuera, 16º Bé)
Secadero: 5-10º C, 85-95 % HR
Figura III.10. Proceso de elaboración de los quesos tipo Torta del Casar.
93
Material y Métodos
Tabla III.12. Muestras de cardos utilizadas para la elaboración de los diferentes lotes de quesos.
Muestra Estado de maduración1 Año Localización2

M1 b 2007 L2 Ctra. Mérida-Madrid
M2 a 2007 L3 La Albuera
M3 b 2007 L2 Ctra. Mérida-Madrid
M4 c 2007 L6 Sancha Brava
M5 b 2008 L4 Mérida. Autovía A-V. Cáceres
M7 b 2008 L1 Canal de Balboa
M9 c 2007 L3 La Albuera
M10 c 2008 L1 Canal de Balboa
M13 c 2007 L5 Puebla de la Calzada
1
a: las flores se están abriendo, solo algunos estigmas y estilos son visibles; b: las flores están totalmente
abiertas, incluso con polen; c: las flores empiezan a secarse, los estilos y los estigmas son de color
marrón.
2
Coordenadas geográficas: L138º 54' 8,82" N 6º 43' 59,9" W, L2: 38º 50' 34,8" N 6º 57' 39,73" W, L3:
38º 45' 6,73" N 6º 48' 10,42" W, L4: 38º 57' 0,30" N 6º 16' 53,03" W, L5: 38º 53' 59,94" N 6º 51' 12,43"
W, L6: 38º 56' 32,78" N 6º 20' 23,16" W, L7: 38º 54' 23,54" N 6º 47' 37" W.
El tiempo de cuajado se define en este estudio, como el tiempo que tarda en

formarse la cuajada y por tanto en procederse al corte de la cuajada. Se determinó
visualmente.
Tras la elaboración de los quesos, y antes de comenzar su periodo de

maduración, se determinó el rendimiento quesero, como la cantidad de queso, en kg,
obtenida a partir de 1 L de leche.
94
Material y Métodos
Para la determinación de los diferentes parámetros físico – químicos y

microbiológicos de los quesos, se tomaron muestras en tres momentos a lo largo del
período de maduración, a los 2 días, a los 30 días, y a los 60 días, cuando se considera
finalizada la maduración. En cada uno de estos momentos se tomaron 3 quesos al azar.
Figura III.11. Preparación de los extractos de flores de C. cardunculus, cuajos.
Figura III.12. Calentamiento de la leche y homogeneización en la cuba.
95
Material y Métodos
Figura III.13. Corte de la cuajada con las liras en la cuba de elaboración.
Figura III.14. Moldeado y prensado de los quesos.
Figura III.15. Proceso de salado de los quesos, mediante sumersión en salmuera.
96
Material y Métodos
Figura III.16. Quesos identificados en el secadero durante el periodo de maduración.
Figura III.17. Quesos elaborados tras 30 días de maduración.
97
Material y Métodos
III.2.15. Análisis de los parámetros físico – químicos
Los análisis físico – químicos se realizaron sobre la leche con la que se elaboraron
los quesos, sobre los cuajos empleados, y sobre todas las muestras de queso recogidas
durante el proceso de maduración (a los 2, 30 y 60 días).
 Determinación del pH
El pH se determinó en los extractos de cardo o cuajos, en la leche para la

elaboración de los quesos, y en los quesos.
Las medidas del pH se realizaron según se describe en la Norma ISO 2917: 1999,
introduciendo el electrodo del pHmetro calibrado en un homogenizado de cuajo, leche o
queso.
 Acidez
La acidez de la leche se mide mediante una valoración ácido-base, con NaOH 0,1 N,
utilizando fenolftaleína como indicador. Se expresa en grados Dornic (º D) o en % de
ácido láctico.
 Mermas
98
Material y Métodos
Las mermas se midieron por diferencia de pesada de 3 quesos de cada lote, desde el
principio del período de maduración hasta el final. Para realizar este análisis se
utilizaron siempre los mismos quesos. Se considera merma la diferencia entre el peso
inicial del queso y el peso del queso a los 60 días de maduración, y se expresa en %.
 Humedad
La humedad se determinó según el procedimiento descrito en la técnica de la AOAC

(2005), que consiste en desecar la muestra en estufa a 105º C hasta obtener peso
constante. Se utilizaron cápsulas de porcelana que se desecaron en una estufa a 105º C.
Tras enfriar las cápsulas en un desecador a temperatura ambiente, se pesaron y se
añadió 10 g de muestra. A continuación, se llevaron a una estufa donde permanecieron
hasta peso constante (aproximadamente 24 horas) a 105 ºC, posteriormente se
mantuvieron en un desecador hasta alcanzar la temperatura ambiente. La determinación
de la humedad se realizó por diferencia de pesadas.
 Actividad de agua
La actividad de agua fue determinada mediante la utilización de un equipo Novasina

con control de temperatura. Las determinaciones se hicieron partiendo de 3 ó 4 g de
cada muestra a temperatura de 25 ºC y con un tiempo de equilibrado de 30 min.
Figura III.20. Medición de la actividad de agua de las muestras de queso.
99
Material y Métodos
III.2.16. Determinaciones microbiológicas
Se realizaron análisis microbiológicos a los extractos de flores utilizados como

cuajos, a la leche de partida para la elaboración de los distintos lotes de quesos, y a
todos los quesos a lo largo del periodo de maduración de los mismos (a los 2, 30 y 60
días).
III.2.16.1. Preparación de las muestras para análisis microbiológico
En una bolsa con filtro para StomacherTM modelo 400, previamente tarada, se
pesaron 10 g de muestra (en el caso del queso, y 10 ml en el caso de la leche y del
cuajo). Añadimos un volumen de diluyente, agua de peptona (1%), igual a nueve veces
la muestra para obtener la dilución 10-1 (90 ml). Se colocó la bolsa en el StomacherTM
durante 60 segundos. A continuación, se prepararon diluciones seriadas para la siembra
en los medios de cultivos utilizados.
III.2.16.2. Recuentos
 Bacterias aerobias mesófilas y bacterias psicrótrofas
Para el recuento de bacterias aerobias mesófilas y psicrótrofas se siguió el

procedimiento descrito por Pascual y Calderón (1999). La siembra se realizó en placas
petri estériles con el medio Plate Count Agar (PCA). A partir de las diluciones se añadió
con pipetas 100 µl sobre la superficie bien seca de agar PCA. El inóculo se extendió con
ayuda de varillas de vidrio estériles hasta quedar completamente absorbido por el
medio. Las placas se incubaron en posición invertida a 30 ºC durante 72 horas y a 7 ºC
durante 7 días para las bacterias aerobias y psicrótrofas, respectivamente.
Para los recuentos, se eligieron las placas que presentaron entre 30 y 300 colonias.
Se contó todas las colonias de la placa con el contador de colonias y se multiplicaron
por el factor de dilución. El resultado se expresó en logaritmos de unidades formadoras
de colonias por gramo (log ufc/g).
 Bacterias ácido lácticas
El recuento de las bacterias ácido lácticas se realizó según recomendaciones de la

APHA (1976). La siembra se realizó en placas petri estériles con el medio agar para
100
Material y Métodos
recuento de lactobacilos (MRS), acidificado con una solución de ácido acético al 10%.
A partir de las diluciones decimales se añadió con pipetas 100 µl sobre la superficie
bien seca de agar MRS. El inóculo se extendió con ayuda de varillas de vidrio estériles
hasta quedar completamente absorbido por el medio. Las placas se incubaron en
posición invertida a 37 ºC durante 48 horas en condiciones de anaerobiosis (10% CO2).
Finalizada la incubación, se efectuó el recuento de las bacterias y se multiplicó por

el factor de dilución de la placa contada, expresándolo en logaritmos de unidades
formadoras de colonias por gramo (log ufc/g).
 Cocos gram + catalasa +
Para el recuento de estafilococaceas y micrococaceas se realizó en los medios de

agares Baird Parker (BP) enriquecido con yema de huevo y telurito potásico y manitol
con sal (MSA), respectivamente, según el procedimiento descrito por Pascual y
Calderón (1999). El cual, la siembra se realiza a partir de las diluciones decimales, se
añadió 100 µl sobre las superficies de BP y MSA. Acto seguido, se extendió el inóculo
con ayuda de varillas de vidrio estériles hasta quedar completamente absorbido por el
medio. Las placas se incubaron invertidas durante 48 horas a 37 ºC para agar BP y a 30
ºC en el caso de agar MSA.
Para el recuento, se eligieron las placas que presentara entre 30 y 300 colonias. Se
contaron todas las colonias de la placa con el contador de colonias y las multiplicamos
por el factor de dilución. El resultado se expresó en logaritmos de unidades formadoras
de colonias por gramo (log ufc/g).
La presencia de S. aureus se evidenció en el agar BP por la aparición de colonias de

color negro azabache, brillante, convexas, de 2-3 mm de diámetro y rodeadas de un halo
de precipitación transparente.
 Enterobacteriaceae totales
El recuento de enterobacterias totales se realizó en el medio de cultivo agar bilis

glucosa rojo neutro cristal violeta (VRBG) se siguió el procedimiento descrito en medio
sólido por Pascual y Calderón (1999). A partir de las diluciones decimales se añadió
100 µl sobre la superficie bien seca de agar VRBG. El inóculo se extendió con ayuda de
101
Material y Métodos
varillas de vidrio estériles hasta quedar completamente absorbido por el medio. Las
placas se cubrieron con 10-15 ml adicionales del mismo medio (doble capa), a fin de
evitar el crecimiento excesivo y la extensión de las colonias, lo que facilita su recuento.
Las placas se incubaron en posición invertida a 37 ºC durante 24 horas.
Se eligieron las placas que presentaban entre 30-300 colonias de color violeta rojizo
por fermentación de la glucosa con formación de ácido rodeadas de un precipitado
también de color violeta por fermentación de los ácidos biliares del medio y se calculó
el número de unidades formadoras de colonias por el factor de dilución correspondiente.
Los resultados se dieron en logaritmos de unidades formadoras de colonias por gramo
(log ufc/g).
 Enterobacteriaceae lactosa positiva (coliformes)
El recuento de enterobacterias lactosa positiva se realizó en el medio de cultivo agar

bilis lactosa rojo neutro cristal violeta (VRBA) se siguió el procedimiento descrito por
Pascual y Calderón (1999). A partir de las diluciones decimales se añadió con pipetas
100 µl sobre la superficie bien seca de agar VRBA. El inóculo se extendió con ayuda de
varillas de vidrio estériles hasta quedar completamente absorbido por el medio. Las
placas se cubrieron con 10-15 ml adicionales del mismo medio (doble capa), a fin de
evitar el crecimiento excesivo y la extensión de las colonias, lo que facilita su recuento.
Las placas se incubaron en posición invertida a 30±1 ºC durante 24 horas.
Las sales biliares y el cristal violeta del medio inhibe la población microbiana Gram
positiva, apareciendo colonias (>0,5 mm de diámetro) de color rojo púrpura rodeadas de
una zona de precipitación de color violeta, debido a la fermentación de la lactosa y a la
precipitación de las sales biliares. Para el recuento se eligieron las placas que contenían
entre 30-300 colonias típicas, expresando los resultados en logaritmos de unidades
formadoras de colonias por gramo (log ufc/g). Para la confirmación se transfirieron
cinco colonias típicas de cada placa a tubos que contenían un 2% de caldo verde
brillante lactosa bilis (BGBL), se incubaron a 32 ºC durante 24 horas. La reacción se
consideró positiva cuando se observó presencia de gas en la campana de fermentación,
por lo menos en 1/10 parte de su volumen como consecuencia de la fermentación de la
lactosa con formación de ácido y gas en presencia de sales biliares.
102
Material y Métodos
 Escherichia coli
Para determinar la presencia de Escherichia coli se siguió el procedimiento descrito

por Pascual y Calderón (1999). Se partió de los resultados obtenidos de
Enterobacteriaceae lactosa positivas (coliformes), confirmándolos en agar eosina azul
de metileno (LEVINE). Para ello se procedió a sembrar con un asa de siembra estéril en
la superficie bien solidificada de las placas con el agar, incubando a 44,5 ºC durante 24-
48 horas.
Las colonias de E. coli sobre agar levine miden 2-3 mm de diámetro, son planas o
ligeramente cóncavas, con centro oscuros, casi negros y en un elevado número de casos,
al reflejarse la luz sobre ellas se observa un brillo metálico verdoso. Las muestras que
presentaban crecimiento en agar Levine las considerábamos positivas de E. coli.
 Mohos y Levaduras
El recuento de levaduras y mohos se realizó según recomendaciones de la APHA

(1985). La siembra se realizó por homogenización en masa, se añadió en placas de Petri
estériles 1 mL de las diluciones. Posteriormente se adicionaron unos 15 mL de agar con
glucosa y patata (PDA) acidificado con una solución de ácido tartárico al 10%.
Una vez las placas sembradas y solidificadas, se llevaron a incubación a 25 ºC durante

5 días, y transcurrido ese tiempo se seleccionaron aquellas placas cuyo número de colonias
esté comprendido entre 0 y 30 (0 y 50) y se realizó por separado el recuento de mohos y
levaduras.
Los resultados los expresamos en logaritmos de unidades formadoras de colonias por

gramo (log ufc/g) tanto en el caso de recuentos de mohos como de levaduras.
 Clostridium sulfito-reductores
La determinación de Clostridium sulfito-reductores se realizó según la norma ISO

15213: 2003. De cada dilución se sembró 1 mL en tubos con agar sulfito sódico,
polimixina, sulfadiazina (SPS) licuado y regenerado a 47-50 ºC. La siembra se llevó a cabo
introduciendo la pipeta con el inóculo hasta el fondo del tubo y depositándolo lentamente
de abajo a arriba. Una vez solidificado el medio, se colocó una capa de 2-3 ml del medio
103
Material y Métodos
SPS en la superficie y se incubó a 46 ºC durante 24-48 horas en condiciones de

anaerobiosis.
Pasado el tiempo de incubación, el número de colonias negras debido a la formación

de sulfuro ferroso a partir de sulfito crecidas en los tubos se multiplicó por el factor de
dilución y así obtuvimos el número de esporos de Clostridium sulfito-reductasa por gramo
de muestra.
 Salmonella spp.
La investigación de Salmenella spp. en 25 g de muestra se realizó según la norma ISO

6579: 2002 que incluye tres etapas fundamentales:
- Preenriquecimiento: en bolsas de Stomacher estériles se pesaron 25 g de muestra.

Se añadieron 225 mL de agua de peptona tamponada (BPW) y se homogenizaron durante
2 minutos. Se incubó dicha mezcla a 30-35 ºC durante 24 horas.
- Enriquecimiento selectivo: tras la incubación se pipeteó 1 mL del cultivo de

preenriquecimiento en tubos que contenían 100 mL de caldo tetrationato-bilis-verde
brillante (Müller-Kauffmann), y se incubó a 42-43 ºC durante 24 horas.
- Siembra en medio de agar selectivo para salmonela: se procedió a sembrar con un

asa de siembra estéril en la superficie bien solidificada de las placas de agar xilosa lisina
desoxicolato (XLD), se incubó a 37 ºC durante 24 horas.
Los resultados se expresaron como presencia o ausencia de Salmonella en 25 g de

muestra.
 Listeria spp.
La investigación de la presencia de Listeria se desarrollaron las fases sucesivas

siguientes (Roberts y col., 2000):
- Pre-enriquecimiento: en bolsas de Stomacher estériles se pesaron 25 g de

muestra. Se añadieron 225 mL de agua de peptona tamponada (BPW) al 1% y se
homogenizaron durante 2 minutos. Se incubó dicha mezcla a 30 ºC durante 24 horas.
104
Material y Métodos
- Enriquecimiento selectivo: en medio líquido selectivo con una concentración

completa de agentes selectivos (Caldo triptona soja-extracto de levadura: TSB-YE), se
pasó 100 μl del homogeneizado anterior a un tubo que contenía 10 ml de caldo TSB-YE e
incubar a 30 ºC durante 48 horas.
- Siembra en medio sólido selectivo: se procedió a sembrar con un asa de siembra

estéril en la superficie bien solidificada de las placas de agar Palcam, se incubó a 30 ºC
durante 24 horas.
Los resultados se expresaron como presencia o ausencia de Listeria spp en 25 g

de muestra.
III. 2.17. Análisis de las proteínas del lactosuero y las caseínas
III.2.17.1. Preparación de los extractos de proteínas del lactosuero y las caseínas
Las fracciones de proteínas del lactosuero se extrajeron de los quesos elaborados

siguiendo el procedimiento descrito por Enne y col. (2005). Las muestras (2 g) fueron
homogeneizadas (2 ciclos de 1 min cada uno) en agua doblemente destilada (5 ml) con
un homogeneizador Ultraturrax (Ika®-Werke, Staufen, Germany). Dado que en esta
fase se genera calor, se requiere un estricto tiempo de optimización para evitar la
degradación de las proteínas del lactosuero. Las muestras homogeneizadas fueron
descremadas mediante centrifugación (3000 rpm durante 20 min a 4º C). Nos quedamos
con el sobrenadante, donde se encuentran las proteínas del lactosuero. Se guardan a -80º
C hasta que son analizadas.
Las caseínas fueron obtenidas a partir de 1 g de muestra de queso, por

precipitación a pH 4,3, mediante la adición de 10 ml de buffer acetato - amonio 1 M
(Veloso y col., 2004). Se mantuvo la suspensión resultante durante 20 min a 8º C.
Después las muestras fueron centrifugadas durante 15 min a 3000 g a 4º C, para
recuperar las caseínas precipitadas. Las caseínas fueron diluidas en 10 ml de buffer
acetato - amonio 1 mM (pH 4,3), precipitadas de nuevo y centrifugadas durante 10 min
a 3000 g a 4º C. Este paso se repite dos veces. Para eliminar la grasa sobrante, las
muestras se lavan con 5 ml de acetona y se dejan secar a temperatura ambiente.
105
Material y Métodos
Finalmente, las caseínas secas se guardaron en un desecador a - 80º C hasta que fueron
analizadas.
III.2.17.2. Determinación de la concentración de proteínas y geles de

poliacrilamida (SDS y UREA-PAGE)
La concentración de proteínas se determinó siguiendo el método de Bradford,

usando 100 µl de extractos de proteínas solubles.
La hidrólisis de proteínas del lactosuero fue determinada mediante SDS-PAGE

(Mini-PROTEAN 3 system, Bio-Rad, Hercules, CA). Para ello, las proteínas del
lactosuero se separaron, empleando un gel de acrilamida discontinuo, con un gel
concentrador al 4 % y un gel separador al 15 % de acrilamida. Las muestras (15 µl)
fueron desnaturalizadas mediante coción durante 5 min en buffer Tris-HCl 0,0625 M, a
pH 6,8 con glicerol 20 %, SDS 2 %, y 2-mercaptoetanol, 5 %. El voltaje se mantuvo
constante a 90 mV para el gel concentrador y a 150 mV para el gel separador. Las
proteínas se visualizaron mediante tinción con azul brillante Comassie R-250 (0,25 %
p/v) en metanol 50 % (v/v) y ácido acético (10 %) (v/v). El exceso de tinción se eliminó
destiñendo con una solución de metanol 20 % (v/v) y ácido acético 5 % (v/v). Como
patrón de utilizó un marcador molecular de 205 kDa a 6,5 kDa (Sigma Chemical, St.
Louis, MO, USA). El análisis densitométrico de los geles se llevó a cabo con un
programa informático de análisis de imágenes (Genetools, SynGene, Cambridge, United
Kingdom).
La hidrólisis de caseínas fue determinada por la técnica UREA-PAGE (Mini-

PROTEAN 3 system, Bio-Rad, Hercules, CA). Se emplearon geles de acrilamida
discontinuos, compuestos por un gel concentrador (4 %) y un gel separador (15 %). El
buffer del gel concentrador era tris(hidroxymetil)aminometano 0,06 M (Tris), urea 8 M
a pH 6,8, y el buffer del gel separador era Tris 0,76 M, urea 8 M a pH 8,8. El buffer de
electroforesis era una solución de Tris 0,02 M, glycine 0,19 M. Las muestras de
caseínas (5 µl) fueron desnaturalizadas mediante coción durante 5 min en buffer Tris-
HCl 0,0625 a pH 6,8 con urea 10 M, glicerol, 20 % y 2-mercaptoetanol, 5 %. El voltaje
se mantuvo constante a 90 mV para el gel concentrador y a 150 mV para el gel
106
Material y Métodos
separador. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con azul brillante Comassie
R-250 (0,25 % p/v) en metanol 50 % (v/v) y ácido acético (10 %) (v/v). El exceso de
tinción se eliminó destiñendo con una solución de metanol 20 % (v/v) y ácido acético 5
% (v/v). Como patrón de utilizó la mezcla de caseínas bovinas (Sigma Aldrich, Co., St.
Louis, MO, USA (α, β and κ) a una concentración de 0,5 mg/ml de cada caseína,
disueltas en 5 ml de agua destilada. El análisis densitométrico de los geles se llevó a
cabo con un programa informático de análisis de imágenes (Genetools, SynGene,
Cambridge, United Kingdom).
III.2.18. Determinación del nitrógeno total

Se realizó la determinación del nitrógeno total por el método de Kjeldahl. Las
muestras de quesos picados (1 g) se colocaron en tubos Kjeldahl y se mezclaron con 15
g de K2SO4, 0,5 g de CuSO4, una punta de espátula de selenio y 20 ml de H2SO4.
Posteriormente se colocaron en el digestor a 420º C, para llevar a cabo el proceso de
digestión o mineralización, hasta que los tubos estuvieron de color verde esmeralda.
Una vez terminado el proceso de digestión se dejó enfriar 10 minutos y a

continuación, se le añadieron 100 ml de agua destilada a cada uno de los tubos Kjeldahl.
Se utilizó el Kjeltec System para llevar a cabo el proceso de destilación. Para

ello, se colocó cada tubo en el destilador y se le añadió NaOH al 35 %. Por otro lado, en
otra parte del destilador se colocó un matraz con 100 ml ácido bórico al 2 % y unas
gotas de indicador rojo de metilo-verde de bromocresol.
Por último, una vez terminado el proceso de destilación se llevó a cabo una
valoración HCl 0,1 N.
III.2.19. Determinación del nitrógeno no proteico y nitrógeno aminoacídico
Se determinó el nitrógeno no proteico mediante el método siguiendo los métodos

descritos por Johnson y de Moore y Steine para el nitrógeno no proteico y
aminoacídico, respectivamente, ambos descrito por Córdoba (1990).
107
Material y Métodos
III.2.19.1. Preparación del extracto

Para la determinación tanto del nitrógeno no proteico y como del nitrógeno
aminoacídico se preparó un extracto común (De Ketelaere y col., 1974). Se realizó un
homogeneizado de 4 g de muestra con 20 ml de ácido perclórico 0,6 N, seguidamente se
centrifugó durante 15 min a 4000 rpm, se filtró el sobrenadante con papel Whatman nº 54,
y se lavó el residuo con 5 ml de ácido perclórico 0,6 N. El filtrado se ajustó a pH 6 con
hidróxido potásico al 30%, filtrándose para eliminar el perclorato potásico y
enrasándose a 30 ml con agua destilada.
III.2.19.2. Cuantificación del nitrógeno no proteico (NNP)
El NNP se cuantificó mediante el método de Johnson, descrito por Córdoba

(1990). Se fundamenta en la reacción de los compuestos nitrogenados con ioduro
potásico mercúrico (Reactivo de Nessler) para dar, en solución alcalina, un complejo de
color naranja que se mide en un espectrofotómetro a 490 nm.
Para su determinación se desecó en un baño de arena a 120 ºC un tubo de ensayo

que contenía 0,1 ml del extracto exento de proteínas preparado anteriormente. A
continuación, se añadió 0,2 ml de ácido sulfúrico concentrado y se digirió a 120 ºC en
un baño de arena, donde se mantuvo el tiempo suficiente para que la solución fuese
transparente. Sucesivamente, se añadió 4,8 ml de agua destilada, 3 ml de NaOH 4 N y 2
ml de reactivo de Nessler. Se agitó y se dejó reaccionar durante 10 min. Transcurrido
este tiempo se midió la absorbancia refiriendo los resultados de las lecturas
colorimétricas a una recta patrón elaborada con una solución de sulfato amónico.
III.2.19.3. Cuantificación del nitrógeno aminoacídico (NA)

En primer lugar se procedió a la precipitación de los péptidos del extracto. Para
ello, se tomaron 5 ml del extracto preparado anteriormente, como se describe en el
apartado III.2.19.1., y se añadieron 5 ml de ácido sulfosalicílico al 10%. Se dejó al
menos durante 17 h en reposo a una temperatura entre 0-1º C. Seguidamente, se ajustó a
pH 6 con NaOH 4 N y se filtró. Finalmente se llevó a un volumen de 25 ml con agua
destilada. El NA se determinó según el método de Moore y Steinie, tal como describe
Córdoba (1990). Del extracto obtenido anteriormente se cogieron 0,5 ml y se añadieron
108
Material y Métodos
1,5 ml de reactivo de ninhidrina (2 g de ninhidrina y 0,3 g de hidridantina disueltos en

75 ml de etilenglicol monometiléter y 25 ml de tampón acetato sódico 4 N a pH 5,5). A
continuación se agitó y se mantuvo durante 20 min en un baño de agua hirviendo.
Posteriormente, se enfrió y se añadieron 8 ml de 1-propanol al 50%. Finalmente se
midió la absorbancia, a 570 nm, tras 10 min en oscuridad para favorecer el desarrollo
del color. Para este análisis se elaboró una recta patrón con concentraciones crecientes
del aminoácido leucina.
III.2.19.4. Índices de proteolisis

Se establecieron dos índices para expresar el grado de proteólisis provocada en
los quesos a lo largo del periodo de maduración. Por un lado se calculó el índice IP
(índice de proteólisis), que relaciona el NNP y el Nitrógeno Total, y por otro lado el
IGA (índice de generación de aminoácidos), con el que se relaciona el NA y el NNP.
Ambos índices se expresaron en % y se calcularon a los 2, 30 y 60 días de maduración.
III.2.20. Determinación de aminas biógenas
Para la detección de aminas biógenas en los quesos madurados, a los 60 días, se

prepararon las muestras siguiendo el método descrito por Krízek y Pelikánová (1998).
Para ello, se utilizó 10 gr de muestra previamente picada, que se homogenizó con 75 ml
de HClO4 0,6 M durante 1 hora. Posteriormente, la mezcla fue filtrada mediante papel
de filtro y se lavó con HClO4 0,6 M ajustando el volumen final a 100 ml. De ellos, 5 ml
fueron transferidos a un tubo de ensayo y añadimos 125 l de una solución del patrón
interno 1,7-heptanediamina (400 mg/l). La mezcla es entonces neutralizada añadiendo 1
ml de una solución de NaOH 9,8 M. Después de agitar, se añadieron 100 l de cloruro
de benzoilo al 99% agitando de nuevo los tubos de ensayo durante 2,5 minutos. Luego
se deja en un ultrasonido durante 15-20 minutos. Seguidamente, se añadieron 2,5 g de
NaCl y los tubos se agitaron durante 1 minuto.
Por último se realizaron dos lavados con 3 ml de dietil éter, se recogió la fase
superior y se evaporó mediante corriente de nitrógeno, resuspendiendo los residuos en
400 l de metanol-agua (1:1 v/v).
109
Material y Métodos
El análisis de las aminas biógenas fue realizado mediante electroforesis capilar

BECKMAN Pace System serie 5500 (Benito y col., 2007; Martín y col., 2007),
utilizando columnas suministradas por Beckman, silanizadas, de 75 µm de diámetro y
37 cm de longitud total. El capilar primero se lavó con 0,2 M de NaOH durante 10
minutos y agua desionizada durante 5 minutos. Después de cada carrera, la columna
capilar fue condicionada con lavados de 0,2 M de NaOH durante 2,5 minutos, agua
desionizada durante 2,5 minutos y 15 mM de tetraborato sodico, 40mM de SDS, y 25%
(v/v) de metanol a pH 9,45 durante 3 minutos. El último buffer fue utilizado como el
buffer de separación de Krízek y Pelikánová (1998). Las muestras fueron inyectadas
durante 3 segundos a una presión de 0,5 psi y separadas a 405 V/cm (15 kV) durante 3,5
minutos a 30 ºC. Las carreras fueron monitorizadas a 214 nm con un detector diode
array. La identificación de las aminas biógenas se realizó a partir del tiempo de
retención. Patrones de tiramina, triptamina, cadaverina, putrescina, histamina,
espermidina y espermina fueron utilizados para confirmar la identificación.
III.2.21. Extracción y cuantificación de la grasa
La extracción de grasa se realizó a los quesos elaborados al final de la

maduración (60 días). Se llevó a cabo mediante el método descrito por Bligh y Dyer
(1959), con algunas modificaciones.
Inicialmente fueron pesados 5 g de muestra, previamente picada, y se

homogenizaron con 15 ml de cloroformo: metanol en proporción 1:2, en un tubo de
centrífuga. Las muestras se homogenizaron durante 2 minutos y a continuación, se
centrifugaron a 6000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se recogió en un tubo de
centrífuga y el sedimento se lavó con 5 ml de cloroformo, que se homogenizó durante 30
segundos a la misma velocidad, y se centrifugó con las anteriores condiciones; se recogió
nuevamente y se unió en el tubo de centrífuga al obtenido anteriormente, con lo que la
relación final quedó de 2:2 (cloroformo: metanol). Posteriormente se realizó un lavado con
5 ml de agua con un 0,8 % de NaCl. Después de una breve agitación, se volvió a
centrifugar a 6000 rpm durante 5 minutos, obteniéndose dos fases claramente
diferenciadas, recogiéndose la superior con pipeta automática y pasteur. La fase inferior
(con la grasa) se pasó a un matraz erlenmeyer de boca esmerilada, a través de un filtro con
110
Material y Métodos
sodio sulfato anhidro. Posteriormente se procedió a la evaporación del cloroformo en un

rotavapor, recuperando la grasa con un poco del mismo en un vial previamente pesado. El
cloroformo utilizado para recuperar la grasa fue evaporado del vial a través de una
corriente de nitrógeno. Los viales fueron pesados antes y después de la adición de la grasa,
pudiendo hacer posible la cuantificación de la grasa por diferencia de pesadas.
III.2.22. Determinación del índice de acidez
El índice de acidez se determinó mediante el método recogido en la norma ISO

660 (2009) a las muestras de queso a los 60 días de maduración, para ello, se pesaron
500 mg de grasa en un eppendorf y se disolvieron en 0,25 ml de la mezcla de
disolventes neutralizada (éter dietílico y etanol 1:1 neutralizado con KOH 0,01 N). Se
añadieron 20 μl de fenolftaleína al 1 % y se valora con la disolución de KOH 0,01 N,
hasta coloración roja permanente. Una vez conseguida la coloración roja, el índice de
acidez lo calculamos con la siguiente fórmula:
A: ml de disolución de KOH (0,01 N) gastados
C: concentración de la disolución de KOH en mol/l
Pm: masa molar del KOH
Gr: peso en g de la muestra (grasa).
III.2.23. Determinación del contenido en malondialdehído (MDA) mediante el

test de ácido tiobarbitúrico (TBA)
El grado de oxidación lipídica se determinó a los quesos de los diferentes lotes

elaborados a los 60 días de maduración mediante el test del ácido tiobarbitúrico (TBA),
siguiendo el procedimiento descrito por Jørgensen y Sørensen (1996). Inicialmente se
pesaron 3 gr de queso picado en tubos de centrífuga. Posteriormente se añadieron 9 ml
de ácido tricloroacético (TCA, 1 gr de propilgalato, 1 gr de ácido
etilendiaminatetraacético (EDTA), y 75 gr de TCA por litro de agua mQ) y se
homogeneizó durante 45 segundos. A continuación las muestras se centrifugaron
111
Material y Métodos
durante 5 minutos a 10000 rpm y se filtraron durante 10 minutos. De cada muestra se

tomaron dos tubos de rosca a los que se les añadieron 3 ml del filtrado a cada uno.
Seguidamente se añadieron 3 ml de TBA (288,3 mg por cada 100 ml de agua mQ).
Posteriormente se introdujeron los tubos en un baño con agua a 100º C durante 40
minutos. Transcurrido este tiempo, se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 4500 rpm
durante 10 minutos. Una vez terminado el proceso, se llevó a cabo la medición de la
absorbancia en un espectrofotómetro a dos longitudes de onda, 532 y 600 nm. El blanco
estaba compuesto de 3 ml de TCA y otros tantos de TBA.
III.2.24. Determinación de compuestos volátiles

Para la extracción, separación, identificación y cuantificación de los compuestos
volátiles de los quesos al final de la maduración (60 días) se utilizó un sistema de
espacio de cabeza dinámico automatizado acoplado a un cromatógrafo de gases con
detector selectivo de masas.
Para su extracción se utilizó una fibra de microextracción en fase sólida de 75

µm de diámetro de carboxen-polidimetilsilosano (Ruiz y col., 1998). Se utilizaron 0,5 g
de muestra picada de los quesos que se introdujeron en un vial sellado por un septum.
Tras la perforación del septum por el sistema de inyección de la fibra, ésta fue expuesta
a la muestra durante 55 min a 40º C para obtener una óptima extracción de los
compuestos volátiles. La temperatura se consiguió sumergiendo dos tercios de vial en
un baño a temperatura regulable durante la extracción.
Tras la extracción de los volátiles la fibra fue inmediatamente llevada al inyector

del cromatógrafo de gases para el análisis de los volátiles captados.
Las condiciones cromatográficas empleadas para la separación de los compuestos

volátiles se exponen a continuación:
Tabla III.13. Condiciones cromatográficas
Temperatura inicial del horno: 35 ºC - 5 min

Rampa de temperatura: 4 ºC/min hasta 150 ºC
20 ºC/min hasta 250 ºC
112
Material y Métodos
250 ºC-5 min
Temperatura de la interfase: 180 ºC
Para la obtención del espectro de los distintos compuestos volátiles las condiciones
del detector selectivo de masas fueron las siguientes:
Tabla III.14. Condiciones del detector selectivo de masas
Impacto electrónico: 70 eV
Electrón multiplicador voltio (emv): 1756 V
Recogida de datos: 1 scan/seg.
Rango de iones: 20-365
La identificación de los compuestos volátiles se realizó mediante su espectro de

masas así como por su índice de Kovats calculado a partir del tiempo de retención del pico
con respecto al de los patrones de alcanos.
III.2.25. Determinación de aniones de los quesos
La determinación de los aniones cloruro sódico, acetato y lactato se llevó a cabo

mediante electroforesis capilar en zona (CZE), utilizando el equipo PACE 5500
(Beckman Instrument, Inc. Palo Alto, CA, USA) equipado con columnas de 50 mm de
diámetro, 27 cm de longitud total (20 cm hasta la ventana del detector) suminstradas por
Supelco (Tecknocroma, Barcelona, España). Se siguió el método descrito por
O’Flaherty et al. (2001) para el análisis de aniones inorgánicos y orgánicos.
Previamente al análisis, la muestra homogeneizada con agua destilada (1:50 p/v) se
filtró a través de un filtro de 0,2 mm.
El capilar en primer lugar se lavó con agua desionizada durante 10 minutos y

con buffer fosfato 90 mM (pH 6) (240 mM 2-hydropropyl-b-cyclodextrin) durante10
113
Material y Métodos
minutos. El último buffer fue empleado como buffer de separación. Después de cada
carrera, la columna capilar fue condicionada con lavados de agua desionizada durante 5
minutos y con buffer de separación durante 5 minutos. Las muestras fueron inyectadas
durante 20 segundos a una presión de 0,5 psi y separadas a 474 V/cm (27 kV) durante
20 minutos a 20 ºC. Las carreras fueron monitorizadas a 200 nm con un detector diode
array. Los diferentes aniones fueron identificados mediante su tiempo de retención.
III.2.26. Análisis instrumental de la textura
Se llevaron a cabo dos tipos de análisis de textura, utilizando un texturómetro

TA.XTA2i (Stable Micro Systems, Godalming, UK).
Por un lado se determinó la textura mediante test de compresión de los quesos a

lo largo del periodo de maduración, 2, 30 y 60 días. Se empleó una sonda cilíndrica de 4
mm de diámetro, la cual presiona sobre láminas de queso de 1,5 cm de espesor. Las
curvas de fuerza-tiempo fueron registradas a una velocidad de 1 mm/s y 10 mm de
distancia. La dureza (g) se define como el máximo pico de fuerza durante el ciclo de
compresión, la cohesividad (g s) es el área debajo de la primera curva, la adhesividad
(g) se identifica como el máximo pico negativo y el área F-T 2:3 (g s) es el área
negativa que encierra la curva.
Por otra parte se midió la untuosidad de los quesos elaborados a los 60 días de
maduración. Para ello se utilizó una probeta fija TTC de untuosidad. La parte inferior
del cono de la probeta se llenó con la muestra de queso con una espátula. Las curvas se
produjeron a una velocidad de 3 mm/s y una distancia de 25 mm. La firmeza (g) y el
trabajo de corte (g s) se corresponden con el pico máximo y el área bajo la curva,
respectivamente. El máximo pico negativo indica la pegajosidad (g) de la muestra y el
área máxima negativa es el trabajo de adhesión (g s).
Estas medidas se realizaron por triplicado, utilizando los tres quesos por lote
elaborados.
114
Material y Métodos
Figura III.21. Medición de la untuosidad de los quesos a los 60 días de maduración.
115
Material y Métodos
III.2.27. Análisis sensorial
Para llevar a cabo el análisis sensorial se realizaron las distintas pruebas: test
triangular, descriptivo y hedónico. Las pruebas del test triangular y el descriptivo se
realizaron con 15 jueces entrenados a los que se les presentaron lonchas finas (0,5 cm)
de los diferentes lotes de quesos al final de la maduración (60 días). Para las catas
hedónicas, se utilizó un panel compuesto por 17 catadores no entrenados.
III.2.27.1. Test triangular
Esta prueba se realizó según la norma UNE-EN ISO 4120:2004, consistió en

presentar a cada juez tres muestras, de las cuales dos eran iguales, teniendo que
identificar la muestra que era diferente (Larmond, 1977). Sabiendo que la probabilidad
de que el juez acierte al azar es de sólo 33,3%, se asegura que la prueba tiene una buena
sensibilidad.
La interpretación de las respuestas se llevó a cabo mediante datos basados en

tablas binomiales de p=1/3 (Roessler y col., 1978) en las que se suman el número de
respuestas correctas y dependiendo del número de jueces se hace la interpretación. En la
tabla binomial se encuentra, para el número de jueces que participan en una prueba, el
número mínimo de respuestas correctas para establecer diferencia significativa
(Larmond, 1977; Roessler y col., 1978).
116
Material y Métodos
III.2.27.2. Test descriptivo
Para la realización de este test se siguió la norma UNE 87024-2:1996 (ISO

8586-2:1994). Se seleccionaron una serie de cuestiones referentes a parámetros
relacionados con el olor, textura, aroma y gusto de los quesos.
Las percepciones de los catadores fueron señaladas en una escala con un rango
de 0 a 12. Los datos fueron integrados automáticamente para su posterior análisis
estadístico.
El protocolo de preguntas fue el siguiente:
Se va hacer una serie de preguntas sobre las características del queso. Indique su
intensidad sobre la línea continua.
Nombre
Fecha
Número de muestra
Análisis visual
De la Pasta
Color amarillo
Poco Mucho
Cerrada
Poco Mucho
Elástica
Poco Mucho
Untabilidad
Poco Mucho
117
Material y Métodos
Olor
“Leche de oveja”
Poco Mucho
Ácido
Poco Mucho
Textura (tras probar)
Firmeza
Poco Mucho
Cremosidad
Poco Mucho
Viscosidad
Poco Mucho
Jugosidad
Poco Mucho
Gusto
Salado
Poco Mucho
Amargo
Poco Mucho
Picante
Poco Mucho
Ácido
Poco Mucho
Astringente
Poco Mucho
118
Material y Métodos
Rancio
Poco Mucho
Aroma (Gusto +olor)
Aroma a “leche de oveja”
Poco Mucho
Intensidad
Poco Mucho
Persistencia
Poco Mucho
Otros aromas
Regusto
Poco Mucho
Desagradable
Poco Mucho
Rancio
Poco Mucho
Otros
Poco Mucho
TIPO
Queso Torta
119
Material y Métodos
III.2.27.3. Test hedónico
En este tipo de test, se utilizó un panel de catas no entrenado, compuesto por 17

catadores no entrenados. Las muestras fueron comparadas aleatoriamente evaluando su
aceptabilidad en grupos de dos para que todos lotes fueran enfrentados entre sí. La
escala de puntuación empleada fue del 0 al 12.
ACEPTABILIDAD
Poco Mucho
III.2.28. Estudio estadístico de los resultados

Las diferencias significativas y los grupos homogéneos de medias se
establecieron mediante un análisis de varianza (ANOVA) siguiendo los procedimientos
de una vía. Cuando el efecto de la interacción es significativo (P<0,05) se procedió a la
realización de un test de comparación de medias por el método TUKEY que determina
la diferencia mínima entre las medias de cada grupo para que ésta sea estadísticamente
significativa. También se establecieron las relaciones entre los diferentes parámetros
estudiados usando para ello la correlación de Pearson. Con el fin de determinar el peso
de los diferentes parámetros estudiados en la variabilidad de los lotes ensayados, se
realizó un análisis factorial de componentes principales. Para la clasificación de los
extractos de las flores en base a su actividad proteolítica se empleó el método jerárquico
de cluster.
120
IV. RESULTADOS
IV.1. CAPÍTULO I
En este capítulo se aborda la caracterización botánica, genética y fenotípica de cardos

silvestres, pertenecientes a diferentes especies de la familia Asteraceae, recogidos en
Extremadura. Se analiza la aptitud tecnológica de los extractos preparados a partir de
estos cardos para su uso como coagulante vegetal en la elaboración de “Torta del
Casar”. Estos resultados correspoden al objetivo 1 de este trabajo, y se estructuran en
los siguientes artículos:
IV.1.1. DNA typing methods for differentiation of wild cardoon used in the elaboration
of “Torta del Casar” cheese.
Enviado a la revista “Journal of Food Science”.
IV.1.2. Characterisation by protein profiles methods for detection of the vegetable

rennet (Cynara cardunculus) adulteration used in “Torta del Casar” cheese-making.
IV.1.3. Influencia de la preparación y almacenamiento del extracto de Cynara

carduculus en su actividad coagulante.
123
IV.1.1. DNA typing methods for differentiation of wild cardoon used in the
elaboration of “Torta del Casar” cheese.
Enviado a la revista “Journal of Food Science”
Journal of Food Science
DNA typing methods for differentiation of Cynara

cardunculus used in the elaboration of “Torta del casar”
cheese
Fo
Journal: Journal of Food Science
Manuscript ID: JFS-2012-0869
Section: 7-Sensory and Food Quality

r
Date Submitted by the Author: 26-Jun-2012

Pe
Complete List of Authors: Fernández, Margarita; University of Extremadura, Producción animal y

Ciencia de alimentos
Ordiales, Elena; Centro Tecnológico Agroalimentario Extremadura (CTAEX),
Agricultura
er
Benito, Maria Jose; University of Extremadura, Producción animal y Ciencia

de alimentos
Martin, Alberto; University of Extremadura, Producción animal y Ciencia de
alimentos
Re
Hernandez, Alejandro; University of Extremadura, Producción animal y

Ramos, Maria Guia; University of Extremadura, Producción animal y
vi
Keywords: cheese, Cynara cardunculus L., RAPD, SSR

ew
ScholarOne, 375 Greenbrier Drive, Charlottesville, VA, 22901

Page 1 of 29 Journal of Food Science
1 DNA typing methods for differentiation of Cynara cardunculus used in the
2 elaboration of “Torta del casar” cheese
3 Margarita Fernándeza; Elena Ordialesb; María J. Benitoa*; Alejandro Hernándeza;
4 Alberto Martina, María G. Córdobaa
5
a
6 Nutrición y Bromatología, Escuela de Ingenierías Agrarias, Universidad de
7 Extremadura, Ctra. de Cáceres s/n, 06071 Badajoz, Spain

b
8 Agricultura, Centro Tecnológico Agroalimentario Extremadura (CTAEX), Ctra.
Fo
9 Villafranco a Balboa Km. 1.2, Villafranco del Guadiana, 06195 Badajoz, Spain
r
10
Pe
11
12 *Corresponding author
er
13 Tel.: +34 924 286200; fax: +34 924 286201
14 E-mail address: [email protected]

Re
15 http://eia.unex.es
16
vi
ew

Journal of Food Science Page 2 of 29
17 SUMMARY
18 The purpose of this work was to develop a PCR method for the identification of
19 Cynara cardunculus used in the elaboration of “Torta del casar” cheese. 106
20 specimens were collected from different parts of the Extremadura region (Spain).
21 Morphological characterization was performed in situ at the time of sampling.
22 Comparison of the morphological data was by genotypic characterization.
23 Different genetic profiles were obtained using 7 random primers with the RAPD
24 technique. The best results for differentiation were obtained with the primer
Fo
25 OPAE10. For the SSR technique, 10 microsatellites were used, the best genetic
r
26 profiles being obtained with the microsatellite CMAFLP-24. All the specimens
Pe
27 were analyzed with both primers, showing that the method provided a fast and
28 accurate characterization of Cynara cardunculus that could be used for the

er
29 Protected Designation of Origin "Torta del Casar" as a tool for traceability and
30 control in the process of elaboration of the cheese. This is the first molecular
Re
31 characterization study made in Spain with populations of C. cardunculus.
32
vi
33 Keywords: cheese, Cynara cardunculus L., RAPD, SSR.

ew
34

35 Introduction
36 Cardoon is a non-domesticated robust perennial plant, characterized by its
37 rosette of large spiny leaves, branched flowering stems, and blue-violet flowers. It
38 belongs to the family of Asteraceae, tribe Cynareae, and is native to the
39 Mediterranean basin, where it colonizes dry and undisturbed areas (Portis and
40 others 2005a). The aspartic proteinases extracted from cardoon flowers of
41 various species of the genus Cynara L. (mainly Cynara cardunculus and, to a
42 lesser degree, Cynara humilis) called ‘cynarases’ or ‘cyprosins’ are among the
Fo
43 few plant-origin enzymes that have been used as a rennet in cheese making in
r
44 some Mediterranean countries. Some Spanish, Portuguese, French, and Italian
Pe
45 varieties of ewes’ milk cheese (Barbosa and others 1976) are made with aqueous
46 extracts of dried flowers from various species of the genus Cynara L. It is

er
47 normally used in the making of Portuguese “Serra” and “Serpa” cheeses (Vieira
48 de Sá and Barbosa 1972; Macedo and others 1993) and Spanish “Los
Re
49 Pedroches”, “La Serena”, and “Torta del Casar” cheeses (from ewes' milk) as
50 well as “Los Ibores” cheese (from goats' milk) and “Flor de Guía” cheese (from a
vi
51 mixture of ewes' and cows' milk) (Fernández-Salguero and others 1991).

ew
52 Other Cynara species, such as C. humilis L., are more abundant and also used in
53 the making of various traditional cheeses as a replacement or mixed with C.
54 cardunculus (Vioque and others 2000). These species are distinguished by their
55 conventional morphological descriptors (Valdés and others 1987), but when the
56 flowers are separated from the plants they cannot be distinguished.
57 The enzymes in these species vary in activity (Pires and others 1994; Fernández-
58 Salguero and Gómez, 1997). High levels of proteolytic enzymes in the flowers of

59 these cardoons are responsible for the effective clotting of the milk (Cordeiro and
60 others 1992).
61 “Torta del Casar” cheese is a semi-hard Spanish variety, recognised as the
62 Protected Designation of Origin “Torta del Casar” (Casar de Cáceres, Cáceres,
63 Spain). It is manufactured from raw Merino ewes’ milk coagulated with vegetable
64 rennet extracted only from Cynara cardunculus L. (cardoon) flowers. This cheese
65 is ripened for about 2 months. During that period, various physical, chemical,
66 microbiological, and organoleptic changes endow it with a peculiar aroma and

Fo
67 creamy flavour (particularly due to the use of the appropriate vegetable rennet)
r
68 that is highly appreciated in the region. The great heterogeneity of the rennet
Pe
69 used in “Torta del Casar” manufacture has a negative influence on the cheese’s
70 quality parameters, including low yield, lack of homogeneity of relevant sensorial

er
71 factors between batches, etc., that can lead to significant economic losses. In this
72 sense, it is necessary to establish a quality control method for the rapid

Re
73 differentiation of dried flowers of Cynara cardunculus, L. from those of other
74 species.
vi
75 Techniques based on nucleic acids are a quick, economic, and safe method for
ew
76 the characterization of plants. Specifically, DNA markers are widely established
77 for food authenticity purposes involving detection of plant material. Molecular
78 markers such as random amplified polymorphic DNAs (RAPD) (Lanteri and
79 others 2001; Sonnante and others 2002), amplified fragment length
80 polymorphism (AFLP) (Lanteri and others 2004b; Pagnotta and others 2004;
81 Sonnante and others 2004a,b), simple sequence repeats (SSRs) (Acquadro and
82 others 2003; Sonnante and others 2004b; Acquadro and others 2005a,b), and
83 inter-simple sequence repeat (ISSR) (Lanteri and others 2004a; Pagnotta and
4

84 others 2004) have been developed for the genetic mapping of globe artichoke
85 species.
86 Diversity assessments based on ISSR, RAPD, and AFLP have been described
87 for the globe artichoke types “Romanesco” (Pagnotta and others 2004; Trionfetti
88 Nisini and others 2007), “Spinoso sardo” (Lanteri and others 2001), “Violeto di
89 Sicilia” (Raccuia and others 2004; Portis and others 2005a), and “Spinoso di
90 Palermo” (Portis and others 2005a), and in both the cultivated and the wild
91 cardoon (Sonnante and others 2004a; Portis and others 2005b,c). Where AFLP
Fo
92 and ISSR have been used to generate DNA fingerprints from single plants
r
93 (Lanteri and others 2004a), a substantial level of variability has been
Pe
94 demonstrated within morphologically uniform populations. However, there have
95 been no studies of Cynara cardunculus’s molecular characterization in Spanish

er
96 populations.
97
Re
98 In this sense, PCR techniques have the potential of being an appropriate method
99 to clear characterize Cynara cardunculus used to obtain vegetable rennet in the

vi
100 production of “Torta del Casar" cheese. The aim of the present work was to apply
ew
101 the PCR methods RAPD and SSRs for a rapid and accurate differentiation of
102 Cynara cardunculus to avoid the problems with the conventional morphological
103 descriptors of the flowers used to obtain the rennet, and to be used as an
104 effective tool for traceability by the authorities of the Protected Designation of
105 Origin in the production of the “Torta del Casar" cheese.
106
107 Materials and Methods
108
5

109 Plant material
110 A total of 106 specimens of different species from Asteraceae family were
111 collected in different places of the Extremadura region (Spain). They were
112 separated into batches by morphological identification, performed in situ at the
113 time of sampling (Table 1). Photographs were taken of the plants, and the
114 classification was done according to Valdés and others (1987) for the
115 descriptions of relevant morphological features of these species and varieties.
116 Leaf materials of each sample were put into plastic bags, and kept under dry
Fo
117 conditions prior to assay in the laboratory.

r
118 Standard of these plants were obtained from the Research Service and
Pe
119 Technological Development, Finca ‘La Orden’, (Badajoz, Spain), for Cynara
120 cardunculus (CQ3-08, CQ4-08, CQ5-08), Cynara humilis (08), and Onopordum
er
121 nervosum (07). These were the reference plants used in this work.
122
Re
123 DNA isolation
124 The thistles’ flowers were triturated in a mincer followed by grinding in a mortar.
vi
125 DNA was isolated according to the method which includes CTAB as detergent in
ew
126 the extraction buffer described by Porebski and others (1997) with the
127 modifications of Hernández and others (2010). The samples were incubated at
128 65ºC for 30 min with 10 ml of extraction buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8), 20 mM
129 EDTA, 3 M NaCl, 2% (w/v) CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), and 0.2%
130 (v/v) of β-mercaptoethanol. The concentration and purity of the extracted DNA
131 were measured spectrophotometrically, and brought to a final value of 10 ng/µl
132 (Biophotometer, Eppendorf AG, 22331 Hamburg, Germany).
133
6

134 RAPD-PCR analysis of the DNA
135 The amplification of the RAPD-PCR was carried out under the following
136 conditions. Each 30 µl of reaction mixture contained 10 ng template DNA, 10 mM
137 Tris-HCl, pH 9.0, 3 mM MgCl2, 0.2 mM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP,
138 200 ng of primer, and 1 U DNA polymerase (Biotools, Madrid, Spain). A total of 7
139 RAPD-PCR primers were used (Table 2). Reaction without template DNA was
140 used as the negative control in all amplifications. Amplification was performed in
141 a MyCycler thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) with the following
Fo
142 cycling conditions: one cycle of 94ºC for 3 min; 35 cycles of 94ºC for 30 s,
r
143 annealing temperature of 45ºC for 1 min and 72ºC for 1 min; and a final extension
Pe
144 of 72ºC for 5 min. The amplification products were separated by electrophoresis
145 in 2% (w/w) agarose gels and detected by staining with ethidium bromide (0.5
er
146 µg/ml). A DNA molecular size marker VI of 2.1-0.15 kbp (Roche Farma, IN, USA)
147 was used to determine the size of the PCR products. Electrophoretic patterns
Re
148 were compared using Image Analysis Software (Genetools, SynGene,
149 Cambridge, United Kingdom).

vi
150
ew
151 Simple Sequence Repeat (SSR) analysis of cardoon DNA.
152 Ten SSR primers (Table 2) were used to amplify the DNA of the thistle species
153 studied. PCR reactions were performed in a final volume of 30 µl reaction mixture
154 containing 10 ng template DNA, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 2.0 mM MgCl2, 0.2 mM
155 each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, 0.2 µM of each primer, and 1 U DNA
156 polymerase (Biotools, Madrid, Spain). Reaction without template DNA was used
157 as the negative control in all amplifications. PCR was performed in a MyCycler
158 thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA), programmed for a hot start of 3 min at
7

159 94ºC; 35 cycles of 30 s at 94ºC, 1 min at the average of the melting temperatures
160 (Tm) of two flanking primers, and 1 min at 72ºC; plus a final extension of 5 min at
161 72ºC. All amplification products were separated by electrophoresis in 2% (w/w)
162 agarose gels and detected by staining with ethidium bromide (0.5 µg/ml). A DNA
163 molecular size marker VI of 2.1-0.15 kbp (Roche Farma, IN, USA) was used to
164 determine the size of the PCR products. Electrophoretic patterns were compared
165 using Image Analysis Software (Genetools, SynGene, Cambridge, United
166 Kingdom).
Fo
167
r
168 Data analysis
Pe
169 Each sample was amplified at least five times to verify reproducibility. RAPD-PCR
170 and SSRs products were scored as ‘‘presence’’ or ‘‘absence’’ of the

er
171 corresponding band and assigned a binary digit of 1 or 0, respectively. A data
172 matrix of individual markers containing the band scoring information was
Re
173 constructed. Similarities among isolates were estimated using the DICE
174 coefficient, with clustering based on the unweighted pair group method using
vi
175 average linkage (UPGMA) (NTSYS-PC version 2.0, Applied Biostatistics, Inc.).
ew
176
177 Results and Discussion
178 Morphological classification
179 After performing the in situ morphological classification according to Valdés and
180 others (1987), it was found that 1 Sylibum marianum, 1 Cirsium arvense, 9
181 Onopordun nervosum, 17 Cynara humilis, and 78 Cynara cardunculus specimens
182 had been collected (Table 1).
183
8

184 Analysis of RAPD-PCR primers with thistle species
185 Seven primers were used in this study (Table 2). These primers have previously
186 been employed for the characterization of different plant species (Sonnante and
187 others 2002; Lanteri and others 2003; Portis and others 2004; Hernández and
188 others 2010). The samples used to verify the accuracy of the primers were:
189 Onopordon nervosum 08 standard, CQ18 sample, Cynara cardunculus CQ3-08
190 standard, CQ38 sample, Cynara humilis 07 standard, and CQ12 sample.
191 Analysis of 7 RAPD-PCR primers produced a total of 79 distinct bands of PCR

Fo
192 among the 3 species of thistle studied: Onopordum nervosum, Cynara

r
193 cardunculus, and Cynara humilis (Table 2). The bands ranged from
Pe
194 approximately 168 to 1406 bp. The primers OPB07 and OPG12 used in this study
195 did not show profiles of bands in the Cynara cardunculus plants.
er
196 The OPB06, OPE19, and OPF08 primers showed profiles of different bands for
197 the species studied except for Cynara cardunculus for which there were only 3
Re
198 bands which were also found in Cynara humilis profiles.
199 Amplifications with the OPF05 primer showed similar profiles in the different
vi
200 samples amplified and the profiles presented low band intensity. Again, this
ew
201 primers were thus considered unsuitable.
202 In contrast, it is interesting that other authors (Lanteri and others 2003; Portis and
203 others 2004; Hernández and others 2010), report adequate profiles with a greater
204 number of bands using some of these primers in their studies with pepper
205 samples.
206 With the primer OPAE10, band profiles were obtained with a large number of
207 bands of appropriate intensity, obtaining different profiles for each species
208 studied. It was found that there were differences between samples belonging to
9

209 the species Cynara cardunculus (Figure 1). The bands ranged from
210 approximately 208 to 1193 bp, with a total of 14 polymorphic bands being
211 obtained.
212 Due to this success, the other primers were discarded and the analysis of all
213 samples collected was carried out with primer OPAE10.
214
215 Analysis of SSR primers with thistle species
216 To perform the SSR technique, we used 10 microsatellites (Table 3) previously

Fo
217 employed by Acquadro and others (2005a,b) for the characterization of natural
r
218 populations of Cynara cardunculus L. The samples used to verify the accuracy of
Pe
219 the primers were: Onopordon nervosum 08 standard, CQ18 sample, Cynara
220 cardunculus CQ3-08 standard, CQ38 sample, Cynara humilis 07 standard, and
er
221 CQ12 sample.
222 Analysis of 10 SSR reactions produced a total of 73 different bands among the 3
Re
223 thistle species studied: Onopordum nervosum, Cynara cardunculus, and Cynara
224 humilis (Table 3). The bands ranged from approximately 140 to 1523 bp. Six
vi
225 reactions done with the primers CMAFLP-04, CMAFLP-07, CMAFLP-13,

ew
226 CMAFLP-18, CMAFLP-21, and CMAFLP-110 did not show profiles of bands in
227 the Cynara cardunculus and Cynara humilis species. These results are in
228 disagreement with those obtained by Acquadro and others (2005a) since in their
229 study with Cynara cardunculus L. these primers amplified between 10 to 5 bands
230 for this species.
231 The primers CMAFLP-11 and CMAFLP-15 did not show good results for the
232 amplification of DNA obtained from Cynara cardunculus or Cynara humilis (Table
233 3). These results also disagree with those obtained by Acquadro and others
10

234 (2005 b) who obtained 5 amplification products for Cynara cardunculus L. with
235 primer CMAFLP-11 (Acquadro and others 2005b) and 6 with primer CMAFLP-15
236 (Acquadro and others 2005a). In the case of the samples belonging to the
237 species Onopordon nervosum, amplification with these microsatellite primers
238 produced profiles of 8 to 9 total bands with molecular weights between 839 to 193
239 bp.
240 The results obtained using primer CMAFLP-08 showed that the band profiles of
241 the samples belonging to the species Onopordon nervosum consisted of 7

Fo
242 polymorphic bands ranging between 842 and 270 bp. In the case of Cynara
r
243 cardunculus, the profiles consisted of 3 polymorphic bands, while Cynara humilis
Pe
244 only included 2 polymorphic bands, although the Cynara cardunculus and Cynara
245 humilis profiles were very similar. The present results with the primer CMAFLP-08
er
246 for Cynara cardunculus were very similar to those obtained by Acquadro and
247 others (2005a).

Re
248 Finally, the primer CMAFLP-24 amplified all the samples, resulting in different
249 band profiles for each species. There even appeared different bands between
vi
250 samples belonging to the same species (Table 3, Figure 2). The bands ranged
ew
251 from approximately 1120 to 140 bp, and a total of 11 polymorphic bands were
252 obtained. Similar results were obtained by Acquadro and others (2005b) with
253 Cynara cardunculus.
254 Therefore, the analysis of the specimenes collected was carried out with the
255 CMAFLP-24 primer.
256
257 Analysis of collected thistle Asteraceae species by the RAPD-PCR and SSR
258 techniques
11

259 After analyzing the results obtained with the RAPD and SSR techniques, it was
260 found that the best profiles with largest numbers of total and polymorphic bands
261 were obtained with OPAE10 and CMAFLP-24 primers, respectively. For this
262 reason, these primers were chosen for the characterization of the 106 collected
263 samples.
264 The RAPD-PCR comparing the DNA band profiles of the 106 isolates and the 5
265 reference species yielded three main clusters (Figure 3, Table 4) on application of
266 the UPGMA dendrogram analysis. These groups corresponded to the results
Fo
267 obtained from the morphological characterization: one containing the samples
r
268 belonging to the species Onopordon nervosum (cluster I), another Cynara humilis
Pe
269 (cluster II), and the third Cynara cardunculus (cluster III). The CQ1 and CQ5
270 samples that were characterized morphologically as Sylibum marianum and

er
271 Cirsium arvense, respectively, were not grouped in any of these clusters. They
272 were very close genetically with percentages of similarity of 85%, and close to
Re
273 Onopordum nervosum (cluster I).
274 Cluster I grouped 9 of the collected samples with the Onopordum nervosum 07
vi
275 reference species with percentages of similarity of 55%. In Cluster I, three

ew
276 subgroups were distinguished by differences in the secondary bands (Table 4).
277 Samples from clusters I.2 and I.3 showed similar profiles with 6 common bands of
278 molecular weights of 887 to 208 bp, but in cluster I.2 there was no 540 bp band,
279 and in I.3 there appeared a band of 852 bp.
280 Cluster II grouped 17 samples with the Cynara humilis 08 reference, with
281 percentages of similarity of 40% (Figure 3, Table 4). All samples showed similar
282 profiles with 5 bands of molecular weights between 1184 to 314 bp, but
283 differences in the secondary bands which defined four subgroups. Samples in
12

284 cluster II.1 showed two additional amplification bands of 442 and 380 bp.
285 Samples grouped in cluster II.2 showed two secondary bands of 813 and 756 bp.
286 Cluster II.3 showed an identical profile of 6 amplification products of molecular
287 weights 1184 to 314 bp. And finally, cluster II.4 which was the most genetically
288 distant from the rest with percentages of similarity of 40% showed identical
289 profiles of three bands with molecular weights of 442, 380, and 314 bp.
290 Cluster III grouped 78 samples with the Cynara cardunculus references (CQ3-08,
291 CQ4-08, CQ5-08), with a 90% percent difference from the other two clusters.
Fo
292 Samples showed profiles of 7 common bands and several differences in the
r
293 secondary bands. Three subgroups with more than 60% similarities were found.
Pe
294 A greater genetic variation was thus present within this population. This is
295 consistent with the conclusions of Portis and others (2005a,b) and Sonnante and
er
296 others (2008).
297
Re
298 Very similar trees were obtained from distance measurements calculated from
299 the SSR data (Figure 4). In this figure one observes three major clusters each
vi
300 containing one of the species studied: Onopordon nervosum (cluster I), Cynara
ew
301 humilis (cluster II), and Cynara cardunculus (cluster III). The CQ1 and CQ5
302 samples were not grouped into any of these clusters, and showed greater
303 percentages of similarity than with the RAPD technique.
304 The distribution of each of the samples in different subclusters with the SSR
305 technique was also due to differences in secondary bands of low intensity, and
306 was very similar to that obtained with the RAPD study (Table 5).
307
13

308 In conclusion, both techniques have allowed all the thistle species from
309 Asteraceae family samples collected to be characterized accurately and rapidly.
310 Both marker systems showed that the studied species possess a remarkable
311 number of differences. A greater degree of genetic differentiation was found
312 among the Cynara cardunculus populations because there were more RAPD and
313 SSR polymorphic bands found in this group.
314 It has been demonstrated therefore that these techniques can be used as an
315 effective tool for traceability by the authorities of the Protected Designation of
Fo
316 Origin in the production of the “Torta del Casar" cheese.

r
317
Pe
318 Acknowledgements
319 The authors are grateful to M. Cabrero and C. Cebrián for technical assistance,
er
320 and to PDO “Torta del Casar” for technical support.
321
Re
322 References
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349 Efficicency of DNA typing methods for detection of smoked paprika

ew
350 “Pimentón de la Vera” adulteration used in the elaboration of dry-cured
351 iberian pork sausages. J. Agr. Food Chem. 58:11688-11694.
352
353 Lanteri S, Di Leo I, Ledda L, Mameli MG, Portis E. 2001. RAPD variation within
354 and among populations of globe artichoke (Cynara scolymus L.), cv
355 ‘Spinoso sardo’. Plant Breeding. 120:243–247.
356
15

357 Lanteri S, Acquadro A, Quagliotti L, Portis E. 2003. RAPD and AFLP assessment
358 of genetic variation among and within populations of a landrace of pepper
359 (Capsicum annuum L.) grown in north-west Italy. Genet. Resour. Crop
360 Ev. 50:723–735.
361
362 Lanteri S, Saba E, Cadinu M, Mallica GM, Baghino L, Portis E. 2004. Amplified
363 fragment length polymorphism for genetic diversity assessment in globe
364 artichoke. Theor. Appl. Genet. 108:1534–1544.

Fo
365
r
366 Lanteri S, Acquadro A, Saba E, Portis E. 2004. Molecular fingerprinting and
Pe
367 evaluation of genetic distances among selected clones of globe artichoke
368 (Cynara cardunculus L. var. scolymus L.) ‘Spinoso sardo’. J. Hortic. Sci.
er
369 Biotech. 79:863-870.
370
Re
371 Macedo AC, Malcata FX, Oliveira JC. 1993. The technology, chemistry and
372 microbiology of Serra cheese: a review. J. Dairy Sci. 76:1725-1739.

vi
373
ew
374 Pagnotta MA, Carderelli MT, Rey Muñoz NA, Tucci M, Saccardo F. 2004.
375 Assessment of genetic variation in artichoke of ‘Romanesco’ type by
376 molecular markers. Acta Hortic. 660:99–104.
377
378 Pires E, Faro C, Macedo I, Esteves C, Morgado J, Veríssimo P, Pareira D,
379 Gómez D. 1994. Flor de cardo versus quimosina no fabrico de queijos
380 artesanais. Quimica alimentaria. 54:66-68.
381
16

382 Porebski S, Bailey LG, Baum BR, 1997. Modification of a CTBA DNA extraction
383 protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol
384 components. Plant Mol. Biol. Rep. 15:8-15.
385
386 Portis E, Acquadro A, Comino C, Lanteri S. 2004. Effect of farmers´ seed
387 selection on genetic variation of a landrace population of pepper
388 (Capsicum annuum L.), grown in North-West Italy. Genet. Resour. Crop
389 Ev. 51:581-590.

Fo
390
r
391 Portis E, Acquadro A, Comino C, Mauromicale G, Saba E, Lanteri S. 2005a.
Pe
392 Genetic structure of island population of wild cardoon [Cynara
393 cardunculus L. var. sylvestris (Lamk) Fiori] detected by AFLPs and SSRs.
er
394 Plant Sci. 169:199-210.
395
Re
396 Portis E, Mauromicale G, Barchi L, Mauro R, Lanteri S. 2005b. Population
397 structure and genetic variation in autochtonous globe artichoke

vi
398 germplasm from Sicily Island. Plant Sci. 168:1591-1598.

ew
399
400 Portis E, Barchi L, Acquadro A, Macua JI, Lanteri S. 2005c. Genetic diversity
401 assessment in cultivated cardoon by AFLP (Amplified Fragment Length
402 Polymorphism) and microsatellite markers. Plant Breeding. 124:299–304.
403
404 Raccucia SA, Mainolfi A, Mandolino G, Melilli G. 2004. Genetic diversity in
405 Cynara cardunculus revealed by AFLP markers: comparison between
406 cultivars and wild types from Sicily. Plant Breeding. 123:280-284.
17

407
408 Sonnante G, De Paolis A, Lattanzio V, Perrino P. 2002. Genetic variation in wild
409 and cultivated artichoke revealed by RAPD markers. Genetic Resour.
410 Crop Ev. 49:247-252.
411
412 Sonnante G, De Paolis A, Pignone D. 2004a. Relationships among artichoke
413 cultivars and some related wild taxa based on AFLP markers. Plant
414 Genetic Resour. 1:125–133.

Fo
415
r
416 Sonnante G, Ippedico M, De Paolis A. 2004b. Microsatellite and AFLP markers in
Pe
417 a world artichoke collection. ISHS Acta Hortic. 660:61–68.
418
er
419 Sonnante G, Carluccio AV, De Paolis A, Pignone D. 2008. Identification of
420 artichoke SSR markers: molecular variation and patterns of diversity in

Re
421 genetically cohesive taxa and wild allies. Genet. Resour. Crop Ev.
422 55:1029–1046.
vi
423
ew
424 Trionfetti Nisini P, Crinò P, Pagnotta MA, Tavazza R, Ancora G. 2007. Recovery
425 and characterization of Italian artichoke traditional landraces of
426 ‘Romanesco’ type. ISHS Acta Hortic. 730:101–106.
427
428 Valdés B, Talavera S, Fernández-Galiano E. 1987. Flora Vascular de Andalucía
429 Occidental. Ketres Editora, S.A. Barcelona. España.
430
18

431 Vieira de Sá F, Barbosa M. 1972. Cheese-making with vegetable rennet from
432 cardo (Cynara cardunculus). J. Dairy Res.39:335-343.
433
434 Vioque M, Gómez R, Sánchez E, Mata C, Tejada L, Fernández-Salguero J. 2000.
435 Chemical and Microbiological Characteristics of Ewes’ Milk Cheese
436 Manufactured with Extracts from Flowers of Cynara cardunculus and
437 Cynara humilis as Coagulants. J. Agric. Food Chem. 48:451-456.
438
Fo
439
r Pe
er
Re
vi
ew
19

440 Figure 1. RAPD amplification patterns generated by the primer OPAE 10. Lane 1,
441 Onopordum nervosum 07 standard; lane 2, CQ18 sample; lane 3, Cynara
442 cardunculus CQ3-08 standard; lane 4, CQ38 sample; lane 5, Cynara humilis 08
443 standard; lane 6, CQ12 sample; lane M DNA molecular size marker VI of 2.1-0.15
444 kbp (Roche Farma, IN, USA).
445
446 Figure 2. SSR amplification patterns generated by the primer CMAFLP 24. Lane
447 1, Onopordum nervosum 07 standard; lane 2, CQ18 sample; lane 3, Cynara

Fo
448 cardunculus CQ3-08 standard; lane 4, CQ38 sample; lane 5, Cynara humilis 08
r
449 standard; lane 6, CQ12 sample; lane M DNA molecular size marker VI of 2.1-0.15
Pe
450 kbp (Roche Farma, IN, USA).
451
er
452 Figure 3. Dendrogram obtained using RAPD amplification patterns generated by
453 the primer OPAE 10 from cardoon species used as standards and collected in the
Re
454 field.
455
vi
456 Figure 4. Dendrogram obtained using SSR amplification patterns generated by

ew
457 the primer CMAFLP 24 from cardoon species used as standards and collected in
458 the field.
459
20

460 Table 1. Specimens collected and their morphological identification.
No. of
samples Morphological identification Samples
1 Sylibum marianum CQ1
1 Cirsium arvense CQ5
9 Onopordon nervosum CQ8 - CQ9 - CQ10 - CQ17 - CQ18 - CQ19 - CQ29-CQ68-CQ69
17 Cynara humilis CQ4 - CQ6 - CQ11 - CQ12 - CQ13 - CQ14 - CQ15 - CQ16 - CQ23 - CQ24
- CQ25 - CQ62 - CQ63 - CQ64 - CQ65 - CQ66 - CQ71
78 Cynara cardunculus CQ20 - CQ21 - CQ22 - CQ26 - CQ27 - CQ28 - CQ30 - CQ31 - CQ32 -
CQ33 - CQ34 - CQ36 - CQ37 - CQ38 - CQ39 - CQ40 - CQ41 - CQ42 -
Fo
CQ67 – CQ75 - CQ78 - CQ80 - CQ82 - CQ83 - CQ84 - CQ85 - CQ86 -
CQ87 - CQ88 - CQ89 - CQ103 - CQ104 - CQ108 - CQ109 - CQ110 -
r
CQ135
Pe
461
462
er
Re
vi
ew
21

Table 2. Primers, range of molecular weight, total and polymorphic bands, and species differentiation bands (characterized by molecular weight in bp)
amplified with RAPD primers.
Primers Primer sequence (5'-3')
OPB06 TGCTCTGCCC
Fo
Range of mol. wt.
(bp) bands
912 to 280
Total bands
10
Polymorphic
bands
9
Onopordon nervosum Cynara cardunculus Cynara humilis
rP
728, 631, 557, 438, 348 806, 590, 280 806, 590, 377, 280
OPB07 ACGCGCCCT 1190 to 168 10 9

1090, 869, 829, 760, 435, 300 --- 1190, 984, 760, 691, 435, 300
OPE19 ACGGCGTATG 1355 to 257 13

ee 12
1166, 939, 874, 811, 718, 648, 580,
OPF05 CCGAATTCCC 1406 to 250 13 12 rR 939, 580, 446
1111, 886, 647, 512, 345

1355, 811, 648
965, 886, 767, 710

535, 470, 446, 257
767, 710, 647, 569, 453, 407, 250
OPF08 GGGATATCGG 1244 to 392 12 11

ev
1060, 846, 687, 617, 439, 392 955, 795, 581 1244, 1060, 955, 917, 846, 687
OPG12
OPAE10
CTCCCAGGGT
CTGAAGCGCA
1114 to 445
1193 to 208
4
17
4
14
iew
1114, 1033, 472, 445
887, 689, 579, 509, 450, 345,

---
1072, 926, 854, 689,

---
305, 249, 208 509,305 1193, 753, 450, 345
TOTAL 1406 to 168 79 71 38 19 38
22

Table 3. Primers, range of molecular weight, total and polymorphic bands, and species differentiation bands (characterized by molecular weight in bp)
amplified with SSR primers.
Range of mol. wt. Polymorphic Cynara
Fo
Primers Primer sequence (5'-3') (bp) bands Total bands bands Onopordon nervosum cardunculus Cynara humilis
CGATAGCTCTTTCCCTTT
CMAFLP-04 614 to 197 5 5
ATGGGTGAGATTGGTTTAC
rP
614, 478, 355, 285, 197 --- ---
GGCTCCACCGTACTCCTA
CMAFLP-07 839 to 387 4 4
TCTCTCGTCAGTAAACCC 839, 622, 489, 387 --- ---
ee
AGGTGTGAAGGCTTCATC
CMAFLP-08 842 to 248 10 9 842, 703, 600, 474, 352, 314,
TCCCGAGATCCTTGACTCAG 270 539, 430, 314 539, 430
rR
GAAGGAGAAGCTTGATATCTG
CMAFLP-11 744 to 278 10 9
CATCCTCACGAGGACATC 744, 517, 383, 330, 306, 278 581, 420, 281 581, 420, 281
TTTGATCTTGTCCCTATATATATA
CMAFLP-13 436 to 314 2 2
CMAFLP-15
TCGGCTTTTCTGAATATC
TTGAGAGGGTTTTCCGAGAG
839 to 193 9 7 ev --- 436, 314 ---
iew
TAGGATGAGTCCTGAGTAAT 740, 548, 433, 268, 236, 193 839, 433 548
AAGTGTTGCATAATAACTTACC
CMAFLP-18 1523 to 388 10 9 1523, 1365, 1127, 915, 849, 730,
CCGAACAAATTGCTTACAA 501, 466, 388 --- 915, 730, 501
TAAATAGTTAGTGTTCTCGTTTG
CMAFLP-21 513 to 228 6 4
TGGGGTTGTATTGGTTG 513, 282, 228 357 ---
GCCCGTTCACACACAACA
CMAFLP-24 1120 to 140 13 11 955, 835, 731, 605, 319,
CAGGTTCTTTTTATACAGCAG 1120, 835, 731, 520, 402, 369 520, 369, 192 192, 140
AGTGGGTAAGTGGGGATG
CMAFLP-110 628 to 235 4 2
ATCTCCACATTTTCTCCTCC 628, 313 313 ---
TOTAL 1523 to 140 73 62 48 15 16
23

1 Table 4. Samples collected grouped into clusters by RAPD with OPAE 10 primer.
Identification
Clusters by Subcluster (no.

RAPD of samples) Samples RAPD
Cluster I (9) I.1 (4) CQ8, CQ9, CQ10, CQ68 Onopordon nervosum
I.2 (4) CQ17, CQ18, CQ19, CQ69 Onopordon nervosum
I.3 (1) CQ29 Onopordon nervosum
Cluster II (17) II.1 (5) CQ4, CQ6, CQ11, CQ62, CQ63 Cynara humilis
II.2 (5) CQ12, CQ13, CQ14, CQ64, CQ66 Cynara humilis
II.3 (5) CQ23, CQ24, CQ25, CQ65, CQ71 Cynara humilis
II.4 (2) CQ15, CQ16 Cynara humilis
Cluster III (78) III.1 (44) CQ20, CQ21, CQ22, CQ26, CQ27, CQ28, CQ34, Cynara cardunculus
Fo
CQ37, CQ38, CQ39, CQ47, CQ48, CQ49,
CQ50,CQ53, CQ56, CQ103, CQ104, CQ108,
CQ109, CQ110, CQ111, CQ112, CQ113, CQ114,
CQ115, CQ117, CQ118, CQ119, CQ120, CQ121,
CQ122, CQ123, CQ125, CQ126, CQ127, CQ128,
CQ129, CQ130, CQ131, CQ132, CQ133, CQ134,
r
CQ135
III.2 (21) CQ33, CQ51, CQ52, CQ54, CQ55, CQ40, CQ41, Cynara cardunculus
Pe
CQ42, CQ43, CQ57, CQ59, CQ60, CQ61, CQ67,

CQ78, CQ80, CQ82, CQ83, CQ85, CQ87, CQ89
er
CQ75, CQ84, CQ86, CQ88, CQ116, CQ124
2
Re
3
vi
ew
24

4 Table 5. Samples collected grouped into clusters by SSR with CMAFLP-24
5 primer.
Identification
Clusters by Subcluster (no. of

SSrs samples) Samples SSRs
Cluster I (9) I.1 (4) CQ8, CQ9, CQ10, CQ68 Onopordon nervosum
I.2 (4) CQ17, CQ18, CQ19, CQ69 Onopordon nervosum
I.3 (1) CQ29 Onopordon nervosum
Cluster II (17) II.1 (6) CQ4, CQ6, CQ15, CQ16, CQ62,CQ63 Cynara humilis
II.2 (6) CQ11, CQ23, CQ24, CQ25, CQ65, CQ71 Cynara humilis
II.3 (5) CQ12, CQ13, CQ14, CQ64,CQ66 Cynara humilis
Fo
Cluster III (67) III.1 (14) CQ20, CQ21, CQ22, CQ26, CQ27, CQ28, CQ57, Cynara cardunculus
CQ109, CQ110, CQ111, CQ113, CQ119, CQ121,
CQ134
r
CQ42, CQ43, CQ47, CQ48, CQ49, CQ50, CQ51,
CQ52, CQ53, CQ54, CQ55, CQ56, CQ88, CQ89,
Pe
CQ103, CQ104, CQ108, CQ112, CQ114, CQ116,

CQ115, CQ117, CQ118, CQ120, CQ122, CQ123,
CQ124, CQ125, CQ126, CQ127, CQ128, CQ129,
CQ130, CQ131, CQ132, CQ133, CQ135
er
CQ59, CQ60, CQ61, CQ67, CQ75, CQ78, CQ80,

CQ82, CQ83, CQ84, CQ85, CQ86, CQ87
Re
7
vi
ew
25

OPAE10
M 1 2 3 4 5 6 M
pb pb
2.176
2.176
1.766
1.766
1.230
1.033 1.230
1.033
653
653
517
453 517
394 453
394
298
298
234
234
220
220
Fo
FIGURE 1
r Pe
er
Re
vi
ew

CMAFLP-24
M 1 2 3 4 5 6 M
pb pb
2.176
1.766 2.176
1.766
1.230
1.033 1.230
1.033
653
653
517
453 517
394 453
394
298
234 298
234
220
220
Fo
FIGURE 2
r Pe
er
Re
vi
ew

CQ1
CQ5
I.1
Onopordum nervosum 07
Cluster I
I.2 (9 samples)
I.3
II.1
Cynara humilis 08
II.2
Cluster II
(17 samples)
II.3
Fo
II.4
r Pe
er
III.1
Re
Cynara cardunculus CQ5-08

vi
III.2
ew
Cluster III
(78 samples)
III.3
10 25 50 75 100
r=0.29
Correlation coefficient
Figure 3. RAPD
FIGURE 3

CQ1
CQ5
I.1
Onopordum nervosum 07
Cluster I
I.2
(9 samples)
I.3
II.1
Cynara humilis 08
II.2
Fo
Cluster II
(17 samples)
II.3
r Pe
III.1
er
Re
Cluster III
(78 samples)
III.2
vi
ew
III.3
10 25 r=0.33 50 75 100
Correlation coefficient
FIGURE 4

IV.1.2. Characterisation by protein profiles methods for detection of the vegetable
rennet (Cynara cardunculus) adulteration used in “Torta del Casar” cheese-
making.
1
2 Characterisation by Proteins Profiles Methods for Detection of the vegetable
3 rennet (Cynara cardunculus) Adulteration used in ‘‘Torta del Casar’’ cheese-
4 making
6 Ordiales, E.2; Martín, A.1; Benito, M.J.1; Ruiz –Moyano, S.1, Aranda, E.1, Córdoba, M. G.1*
1
7 Nutrición y Bromatología. Escuela de Ingenierías Agrarias, University of Extremadura, Ctra. de
8 Cáceres s/n, 06071 Badajoz, Spain.
2
9 Agricultura, Centro Tecnológico Nacional Agroalimentario Extremadura, CTAEX. Ctra.
10 Villafranco a Balboa, km 1.2. 06195 Villafranco del Guadiana, Badajoz, Spain.
11
12
13
14
15 *Author for correspondence. Tel.: +34 924286200; fax: +34 924286201.
16 E-mail address: [email protected] (M. G. Córdoba)
17 http://eia.unex.es/
18
19
20
159
21 ABSTRACT
22 The purpose of this work was to develop a procedure based on protein analysis by Sodium
23 Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) that can be used in the
24 determination of Cynara cardunculus dried flowers adulteration with other thistle species from
25 Asteraceae family, which dried flowers could be confused with, giving laid to a fraud in the
26 Torta del Casar cheese-making. Samples of flowers of different thistle’s species were collected
27 in Extremadura, in the southwest of Spain. Both methods, SDS-PAGE and FZCE (free zone
28 capillary electrophoresis) showed a high efficiency to discriminate Cynara cardunculus from
29 other thistle species properly. In addition, 172 samples of cardoon flowers (Cynara
30 cardunculus) grouped according to location, harvest year, and ripening stages were used in the
31 study. The SDS-PAGE method showed higher effectiveness in discriminating the technological
32 properties, milk-clotting and casein degradation activities, of vegetal rennets used in this study.
33 The SDS–PAGE technique allowed group aqueous extracts from flowers of C. cardunculus in
34 five different groups, which exhibited different ability to degrade the milk caseins.
35
36
37
38
39 Keywords: Cynara cardunculus, SDS-PAGE, protein profile, proteolitic activity, milk clotting
40 activity.
41
42
43
160
44 1. Introduction
45 “Torta del Casar” is a traditional cheese of Extremadura region, in the south-west of
46 Spain. It is made from raw ewe’s milk “Merino” and “Entrefina” in Cáceres province. It was
47 labeled with PDO (Protected Denomination of Origin) in accordance with the Regulations (CE)
48 1491/2003 of the European Commission. This cheese is characterized by a soft and spreadable
49 texture, a slightly bitter taste and strong aroma, due to the vegetable rennet used as coagulant,
50 an aqueous extract of Cynara cardunculus L. dried flowers. No starter culture is added and the
51 minimum time for ripening is 60 days. It is a well-known cheese with an increasing production
52 every year, since it is much appreciated by consumers for its high quality and unique flavor
53 (Delgado et al., 2010).
54 The extracts of the flowers of others Cynara species, C. humilis and C. scolymus, have
55 also been claimed to be effective as rennet (Silva and Malcata, 2000; Veríssimo et al., 1996).
56 Extracts from C. humilis were also used in the manufacture of ewe’s milk cheeses in Portugal
57 (Serra and Sherpa) and Spain (Los Pedroches, La Serena and Torta del Casar), especially when
58 C. cardunculus is scarce (Fernández –Salguero et al., 1999; Vioque et al., 2000). Also, milk
59 clotting activity was also found in flowers of Centeurea calcitrapa, Onopordum turcicum and
60 Sylibum marianum (Domingos et al., 1998; Tamer, 1993; Vairo Cavalli et al., 2005). All these
61 species belong to the Asteraceae family, and furthermore lie in the same tribe: Cardueae Cass.
62 = Cynarae Less. (Ariza – Espinar et al., 1998).
63 The milk clotting activity of these species is due to their content in aspartic proteinases,
64 named cardosins or cynarases (Heimgartner et al., 1990; Brodelius et al., 1995; Cordeiro et al.,
65 1998; White et al., 1999; Silva et al., 1999). These enzymes are similar, in terms of specificity
66 and activity, to chymosin and pepsin (Pires et al., 1994; Veríssimo et al., 1995), although the
67 proteolytic activity of cynarases appears to be less specific than of chymosin. This aspect is
68 suited to the manufacture of soft-bodied cheeses often associated with bitter tastes and relatively
69 low yields, such as “Torta del Casar” (Tavaria et al., 2001). The use of flowers with different
161
70 protease content due to the natural variability and seasonal climatic variations is responsible for
71 variations in the morpho-organoleptic characteristics of the cheese (Heimgartner et al., 1990).
72 Moreover the dried flowers of the thistle species studied can be confused with dried flowers of
73 C. cardunculus, which contributes to the lack of homogeneity in cheese making process, and it
74 involves a fraud in “Torta del Casar” cheeses labeled with PDO. In order to get high
75 homogeneity between cheese batches, enhance the cheese yield and its sensorial quality, it is
76 desirable to know the Cynara cardunculus plants collected in Extremadura. Thus, the
77 development of a method for the quality control of the aqueous extracts used as rennet would be
78 desirable for standardisation of the cheese-making process.
79 A protein profile study is suitable for such a purpose. Various works have described
80 methods based on protein patterns to control food quality (Barnwell et al., 1994; Toorop et al.,
81 1997; Skarpied et al., 2001; Bietz, 1994; Cancalon, 1995). Analyses of proteins in these
82 complex mixtures are presently performed mainly by SDS-PAGE methods. Sodium dodecyl
83 sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) whole-cell protein pattern analysis
84 offers the advantages of being fairly fast and easy and, when performed under highly
85 standardized conditions, of having a good level of taxonomic resolution at species or subspecies
86 level. SDS-PAGE protein profile analysis has been used successfully to identify LAB isolated
87 from wines and musts (Patarata et al., 1994), Italian ewe’s-milk cheeses (De Angelis et al.,
88 2001), and eggplants (Sánchez et al., 2003), to identify paprika varieties (Hernández et al.,
89 2006), to visualized cynarasas purified from Cynara scolymus and to monitor the hydrolysis of
90 caseins by the extracts from C. scolymus (Chazarra et al., 2007), from sunflower and albizia
91 seeds (Egito et al., 2007). SDS-PAGE methods has been defined as an efficient taxonomic tool
92 for rapid differentiation of the most common lactic acid species (Benito et al., 2008a) and
93 Staphylococcus species (Benito et al., 2008b) in dry fermented meat products. Capillary
94 electrophoresis (CE) may be used as an alternative method to SDS-PAGE, (Cancalon, 1995;
95 Manabe, 1999; Ordiales et al., 2012). CE methods involve a simple extraction of proteins and
96 small quantities of organic solvents in comparison with RP-HPLC. A subset of CE called free
162
97 zone capillary electrophoresis (FZCE) has been applied to the analysis of complex protein
98 systems. Numerous papers have reported the potential of FZCE to discriminate, or fingerprint,
99 foodstuffs such as cereals, paprika, cherries (Hernandez et al., 2007; Serradilla et al., 2008). In
100 last decade, CE has proved to be an efficient separation technique for the analysis of food
101 proteins in general (Frazier et al., 1999, 2000; Recio et al., 2001) and milk proteins in particular
102 (Recio et al., 1997). In fact, CE has been applied to monitoring proteolysis in cheese (Molina et
103 al., 1998; Otte et al., 1999), mainly in bovine cheese, but also in ewe and goat cheeses (Cattaneo
104 et al., 1996; Irogoyen et al., 1996; Molina et al., 2000; Ordiales et al., 2012). Moreover this
105 technique has been used to study the proteolysis of cheese produced with Cynara L. as
106 coagulant (Roseiro et al., 2003). Thus, both techniques FZCE and SDS-PAGE could be used for
107 the quality control of the extract used as rennet in “Torta del Casar” manufacture.
108 The aim of this work was to develop a procedure based on protein profile analysis that
109 can be used to control the technological quality of aqueous extracts used as rennet in ‘‘Torta del
110 Casar’’ manufacture.
111
112 2. Materials and Methods
113 2.1. Plant material
114 Several thistle species belonging to Asteraceae family were sampled. Leaves and flowers were
115 collected from different plants grown in field, in several parts of Extremadura region.
116 Morphological characterization was carried out in situ, in accordance with the guidelines of
117 Valdés et al. (1987) (Table 1). Flowers were collected individually from each thistle plant in
118 order to analyze the variability among plants within the same species. A total of 65 samples
119 were collected in 2006, from C. cardunculus, L., C. humilis, L., C. scolymus, L., Silybum
120 marianum (L) Goernt., and Onopordum nervosum, Boiss. species and 140 samples of C.
121 cardunculus during the seasons of the years 2007, 2008 and 2009 in the most representative
122 areas of Extremadura region (Table 2). They were grouped into 3 different ripening stages in
163
123 accordance with the cardoon flower’s phenological characteristics, ripening stage a (flowers
124 opening, only some styles, and stigmas are visible), b (flowers fully open, even with pollen) and
125 c (flowers begin to dry, so they are brownish, instead of violet colour). The collected samples
126 were transported to the laboratory to be dried and analyzed and there the flowers were separated
127 from the rest of the involucre. They kept at room temperature until they were dried and then
128 conserved in a cool dry place up to their utilization and analysis.
129
130 2.2. Extraction of coagulant extracts of proteins for SDS-PAGE and CE analysis
131 For the SDS-PAGE analysis an aqueous crude extract from dried flowers of different
132 Asteraceae species was prepared with 1 g of dried flowers in 5 mL of water and kept for 4 h at
133 room temperature. The homogenate was filtered through a Whatman filter No. 4.
134 Direct extraction of dried flowers from Asteraceae species with water may lead to components
135 other than proteins being removed and, consequently, poor resolution of FZCE. In fact, these
136 extracts may also contain compounds such as polysaccharides, polyphenols, anthocyanin,
137 tannins, DNA, free amino acids, and sugars that can potentially bind the inner walls of the silica
138 capillaries (Bean and Lookhart, 2001). Hence, a pre-extraction step was included, mixing 1 g of
139 the dried flower with methanol (3:10 w/v) for 5 min at room temperature, according Hernández
140 et al. (2006) method. Longer extraction time did not improve the effectiveness of the extraction.
141 The suspension vortexed periodically, centrifuged at 5800 g for 5 min and the supernatant was
142 collected. From an aliquot of 0.5 mL, methanol-soluble proteins were partially precipitated
143 (except for the most of the apolar protein fraction) with chloroform (1:2 v/v) and centrifuged at
144 24000 g for 5 min. The pellets were cleansed twice with chloroform, and then suspended in 100
145 µL of 30% (v/v) acetonitrile according to the protocol described by Hernandez et al. (2006).
146 Cardosins standars have been purified from C. cardunculus flowers according to Sidrach et al.
147 (2005) with some modification. Stigmas (100 g) were ground in a food mixer and
148 homogeneized in 800 mL 50 mM aqueous citrate buffer (pH 3.0), containing 1 M NaCl to
164
149 prevent non-specific proteinase binding to the filter membrane in the following ultrafiltration
150 step. The ground homogenate was filtered through muslin to remove most of the solid residue.
151 After centrifugation of the homogenate at 24000 rpm for 20 min, the supernant was filtered
152 through a Whatman 4 filter paper. The resulting solution constituted the crude extract, which
153 was concentrated and dialyzed by ultrafiltration (Pellicon XL PXB010A50, Millipore) against
154 25 mM Tris-HCl buffer, pH 7.6 coupled to FPLC system equipped with a UV detector at 214
155 nm and a fraction collector FRAC-950 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
156 After sample application, the enzymes were displaced with step gradients of 0.30, 0.35 and 0.5
157 M NaCl in the previous buffer. The fractions that contain the cardosins were collected. Before
158 FCZE analysis, cardosin fractions were concentrated and dialyzed by ultrafiltration (Pellicon-2
159 PLCGC10, Millipore Corp.) against ultrapure water.
160
161 2.2.1. SDS-PAGE analysis of coagulant extracts proteins
162 The proteins for SDS-PAGE, extracted as described above, were mixed with 30 µL of PAGE
163 loading buffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 20% (w/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 5% (w/v) β-
164 mercaptoethanol, 0.025% (w/v) bromophenol blue) and incubated at 99º C for 5 min for protein
165 denaturing. The electrophoresis conditions were those described by Laemmli (1970), and the
166 concentrations for acrylamide (29:1 acrylamide/bisacrylamide) in the gels were 4% (w/v) for
167 staking gels, and 15% (w/v) for separating gels. Gels were cast and run in a Miniprotean III
168 device (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). The molecular mass marker kits (Sigma
169 Chemical Co., St. Louis, MO) contain proteins from 6.5 to 205 kDa. The gels were
170 subsequently stained with 0.5% (w/v) Coomassie blue (G-250) dissolved in 45% (v/v) water,
171 45% (v/v) methanol, and 10% (v/v) glacial acetic acid for 30 min and destained with a solution
172 consisting of 20% (v/v) methanol, 10% (v/v) glacial acetic acid, and 70% (v/v) distilled water
173 for 4 h. A computer image analysis program (Genetools, Synoptics Ltd., Cambridge, U.K.) was
174 used for the densitometric analysis of the gel electrophoresis.
165
175
176 2.2.2. FZCE analysis of coagulant extracts proteins
177 The protein extracts were previously filtrated through a 0.2 µm filter and analyzed by FZCE.
178 The separations were done on an automated PACE 5500 device (Beckman Instruments, INC.,
179 Palo Alto, CA). To minimise the interaction of proteins with the column wall, basic pH values
180 were chosen to make the run buffer. Run buffer was prepared with HPLC-grade water obtained
181 from a Mili-Q water purification system, and consisted of 8.75 mM phosphate 20.6 mM
182 tetraborate at a nominal pH of 9. This buffer has been successfully used for the determination of
183 vegetable proteins by FZCE (Flurer et al., 2000; Hernández et al., 2006, 2007). Uncoated fused
184 silica capillaries of 75 µm i.d. and 57 cm total length (50 cm to window detector) were used
185 (Supelco, Tecknocroma, Barcelona, Spain). The capillaries were initially conditioned with 100
186 mM NaOH for 10 min, and then with de-ionized water for 5 min. They were rinsed between
187 separations for 2 min with 100 mM NaOH, for 2 min with de-ionized water, and then with
188 separation buffer for 2 min. When not in use, the capillaries were rinsed with 100 mM NaOH
189 for 10 min, followed by water for 10 min, and finally dried by nitrogen gas for 10 min. The
190 separation voltage was 263 V/cm (15 kV) and the separation temperature was 23º C. The
191 wavelength used to monitor the assays was 254 nm. Samples were injected under pressure (0.5
192 psi) for 5 s and the protein spectra were monitored from 190 to 300 nm with a PACE diode
193 array detector (Beckman Instrument Inc., Palo Alto, CA, USA). Protein peaks were identified
194 using correct migration times and UV absorbance spectra. The Beckman P/ACE Station
195 (Version 1.21) software package was used to store, manipulate and compare the
196 electroferograms.
197
198 2.3. "In vitro" casein proteolytic activity
199 The dried flowers extracts were prepared by macerating 0.25 g of dried flowers in 5 mL of
200 water (corresponding to a proportion of 50 g in 1 L), at room temperature for 4 h. The
166
201 homogenate was filtered through a Whatman filter No. 4. The substrate used for degradation by
202 extracts consisted of a mix of bovine caseins (Sigma Aldrich, Co., St. Louis, MO, USA) (  ,  ,
203 y k), at a concentration of 0.5 mg/mL of each casein, dissolved in 5 mL of distilled water. The
204 dried flowers extracts were macerated with the casein mix, at 2.5% of extract (v/v), for 2 h at
205 room temperature, to allow the casein degradation. After this time the extracts with degraded
206 caseins were denatured by adding 30 µL of PAGE loading buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8,
207 20% (w/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 5% (w/v) β-mercaptoethanol, 0.025% (w/v) bromophenol
208 blue) and incubated at 99º C for 5 min. The electrophoresis conditions and the analysis method
209 used were described above.
210
211 2.4. Milk clotting activity assay
212 This assay was performed only for C. cardunculus samples. For milk-clotting assays, 0.5 g of
213 each cardoon sample was softened in 75 mL of ultrapure water for 1 and 24 h. The rennet
214 clotting time of these coagulant extracts was measured according to a standard method
215 (NILAC™; NIZO, Ede, The Netherlands) described by Tavaria et al. (2001). The substrate was
216 prepared by dissolving 12 g of low-heat bovine skimmed milk powder in 100 mL of 0.01 M
217 CaCl2 (pH 6.5) at 30 ºC. The enzymatic assay was performed using 0.2 mL of coagulant extract
218 added to 2 mL of reconstituted skim milk, and the clotting time was determined by visual
219 inspection. One rennet unit (R.U.) was defined as the amount of crude enzyme extract needed to
220 coagulate 10 mL of reconstituted low-heat processed skim milk at 30 ºC in 100 s (FIL-IDF
221 157/1992). Determinations were quadruplicated, and the mean of each set of four data was taken
222 as the datum point.
223 2.5. Antimicrobial activity
224 The culture collection strains used as standards to develop this method were: Listeria
225 monocytogenes CECT 934, Listeria monocytogenes CECT 911, Escherichia coli CECT 4267,
167
226 Staphylococcus aureus CECT 976, Bacillus cereus CECT 131, Yersinia enterocolitica CECT
227 559, Lactobacillus plantarum CECT 223, Lactobacillus brevis CECT 216, Lactobacillus sakei
228 ssp. carnosus CECT 5766, Lactobacillus curvatus CECT 904, Leuconostoc mesenteroides ssp.
229 Mesenteroides CECT 394, Pediococcus pentosaceus CECT 923. Strain Salmonella enteritidis
230 (1263) from Centro Tecnológico Nacional Agroalimentario Extremadura (CTAEX) were also
231 used as standard. The strains were grown in broth (BHI for non-lactic bacteria and MRS for
232 lactic bacteria) for 48 h at 30 or 37º C according to the strain. The C. cardunculus flower
233 extracts were prepared by macerating 50 g of dried flowers in 1 L of water for 24 h at room
234 temperature, adjusted to 6.5 pH, using NaOH as neutralizer, and then were filter-sterilized (0.22
235 µm). The ability of C. cardunculus flower extracts to avoid the growth of pathogenic bacteria
236 and lactic acid bacteria was evaluated by following the microbial growth at 37º C for 1 day with
237 an automated turbidometer Bioscreen C. Analysing System (Labsystems, Findland). The optical
238 density was measured with a wide band filter (OD 420-580 nm). Inocula of 5% in a total
239 volume of 210 µL. MRS and BHI broth without supplements, and adjusted to 6.5 pH, were used
240 as control media. The inhibition of the flower extracts was determined by comparing the growth
241 rates with those obtained with controls. Optical densities below 200, 400 and 600 arbitrary
242 absorbance units (AAU) respect to control were considered as low, moderate and high
243 antimicrobial activities, respectively.
244
245 2.6. Statistical analysis
246 Statistical analysis of the data was carried out using SPSS for Windows, 15.0. (SPSS Inc.,
247 Chicago, Illinois, USA). Mean values of the technological and analytical parameters (FZCE
248 peaks or SDS–PAGE bands) were studied by one-way analysis of variance (ANOVA) and
249 separated by Tukey’s honest significant differences test (P < 0.05). The relationships between
250 the technological parameters and FZCE peak area or SDS–PAGE band intensity values were
251 evaluated by Pearson correlation coefficients. A principal component analysis (PCA) was
168
252 performed on the analytical parameters to study the relationships between the protein profiles of
253 the vegetable rennet and the proteolytic activity against caseins.
254
255 3. Results and Discussion
256 3.1. SDS-PAGE protein profile of different thistle Asteraceae species
257 Table 3 shows the polypeptide bands profiles obtained for each thistle species belonging to
258 Asteraceae family. Protein profile determined by SDS-PAGE analysis showed a total of 15
259 polypeptide bands with an approximate molecular mass range of 13–67 kDa. As seen in Table
260 3, quantitative differences were detected by comparing the densitograms of the thistle species.
261 Cynara cardunculus protein profile presents 9 bands. The bands more intense, 16.7 and 28.3
262 kDa, and 13.5 and 30.2 kDa, corresponded to cardosin A and cardosin B, respectively. The rest
263 of the bands of this species belong to procardosin A (45 and 55 kDa) and procardosin B (60.2
264 kDa), as was described by Ramalho Santos et al. (1997). The mature form of cardosin A (31
265 kDa) was detected, in callus tissue cells along with a band of 45 kDa and one of 55 kDa. The
266 band of 45 kDa is frequently observed and has been described as corresponding to non-
267 dissociated chains of the enzyme (Ramalho Santos et al., 1998). Regarding cardosin B it was
268 detected the 64 kDa band (60.2 kDa in our survey), corresponding to the precursor and the 55
269 kDa band, similar to what was observed for cardosina A. Also, these authors have reported that
270 the band of 55 kDa may correspond to an intermediate form of cardosins without the
271 prosegment, hypothesis supported by the already documented cleavage sites for cardosin A,
272 Arg68-Asp69, Asn309-Gly310 and Ser414-Thr415, although the 55 kDa band was not detected
273 in thistle flowers (Ramalho – Santos, et al., 1997; Vieira, et al., 2001), but in the seeds or leaves
274 (Pereira, et al., 2008).
275 The specie Cynara scolymus shows a protein profile composed of 10 polypeptide bands with an
276 approximate molecular mass range 13.5 to 60.2 kDa. Bands corresponding to cardosin A and
277 cardosin B show the same intensity than C. cardunculus, while the 60.2 kDa band was
169
278 significantly less intense than that of C. cardunculus (Sidrach et al., 2005). On the other hand,
279 Cynara humilis protein profile is defined by 6 polypeptide bands corresponding to the
280 characteristic bands of cardosin A (16.7 and 28.3 kDa), and other less intense bands (55, 60.2
281 and 66.2 kDa), which would correspond to procardosin forms (Ramalho Santos et al., 1998).
282 However, the species C. humilis no polypeptide bands corresponding to the enzyme cardosina B
283 (Esteves et al., 1995). Cardosins A and B represent the best characterized floral Aspartic
284 Proteases, together with cyprosins (Brodelius et al., 98; Cordeiro et al., 94). Regarding the
285 specie Silybum marianum, this profile shows 3 proteins SDS-PAGE bands, two of them, of
286 approximately 35 and 64 kDa, were not present in the rest of the studied species and Onopodum
287 nervosum showed a protein SDS-PAGE profile formed by bands of approximately 30, 32, 59
288 and 67 kDa, which were different from the protein profile of the rest of the studied species. In
289 this sense, the different protein profile observed allowed us to differentiate among the 5 thistle
290 species from Asteraceae family studied. Therefore, the analysis of proteins by SDS-PAGE
291 could be considered as a potentially useful tool for characterizing thistle species belonging
292 Asteraceae family studied.
293
294 3.2. FZCE protein profile to identify C. cardunculus from other thistle species
295 To explore the potential of the FZCE method to distinguish thistle Asteraceae species, the inter-
296 species differences were evaluated. The electropherograms obtained by FZCE under the
297 optimized conditions had a total of 24 well-defined peaks for all of the species analyzed (Figure
298 1). As seen in Table 4, qualitative and quantitative differences were detected by comparing the
299 electropherograms of the thistle Asteraceae batches. The analysis of methanol-soluble proteins
300 from the Silybum marianum species showed of the peaks 8, 9, 12 and 14, not detected in the
301 other species studied. Onopordum nervosum shows peaks 1, 4, 6, 22 and 24 not detected in the
302 other thistle batches. Likewise, peaks 11 and 15 showed significant differences between batches
303 of the O. nervosum and Cynara species. C. humilis species showed of the peaks 3, 5, 7 and 23
304 absent in the other Cynara species. Peak 15 was significantly greater for C. humilis and C.
170
305 scolymus respect to C. cardunculus. The area of the peak 16 was greater in the C. cardunculus
306 and C. scolymus than for C. humilis, whereas, peak 21 was significantly greater in the C. humilis
307 samples. On the other hand, C. cardunculus and C. scolymus showed similar profiles, in fact,
308 both species show the same peaks defining their profiles, except for peak 15, which was
309 significantly greater for C. scolymus than for C. cardunculus. This similarity between C.
310 cardunculus and C. scolymus is justified by these species had a common ancestor (Foury, 1989;
311 Rottenberg and Zohary, 1996; Raccuia et al., 2004). The peak 11 of C. cardunculus, C.
312 scolymus and C. humilis could be included the purified cardosins A and B (Ordiales et al.,
313 2012). However, other peaks such as 15, 16 and 17 could correspond to cardosins with different
314 charge due to the different glycosylation levels (Sidrach et al., 2005). In fact, these mentioned
315 peaks showed both symmetries and absorbance spectra similar to the purified cardosins.
316 Therefore, these results showed that the FZCE method is able to discriminate thistle species
317 from Asteracea family. The effectiveness of this technique the FZCE in discriminating of
318 vegetable varieties have been previously described for authentication of the smoked paprika and
319 the “Picota” type sweet cherry varieties (Hernández et al., 2007; Serradilla et al., 2008).
320 Therefore thistle Asteraceae species studied can be distinguished by their FZCE protein profile,
321 as much for the migration time peaks, as for the area of the peaks. This analytical method could
322 be used to identify the origin of the dried flower batches bought by cheese factories, in order to
323 avoid fraud, and guarantee the authenticity of vegetable rennet used in the PDO “Torta del
324 Casar” manufacture.
325
326 3.3. Proteolytic activity of different Asteraceae species and their relationship with the
327 CE and SDS-PAGE profiles
328 In Figure 2 appear the proteolytic activity of the aqueous extracts from the thistle samples
329 studied of each Asteraceae species on α, β and κ-casein. The value α-casein degradation, C.
330 cardunculus hydrolyzed this casein in an 89.83%, which was a stronger proteolytic activity than
171
331 the rest of the species, except for C. scolymus (80.56%). In concern to κ-casein degradation, C.
332 scolymus, C. humilis and C. cardunculus could degrade it almost totally, 100%, 89.38% and
333 99.74%, respectively, and this proteolytic activity was significantly higher than O. nervosum
334 (67.49%) and S. marianum (44.92%). Respect to β-casein % of degradation of C. cardunculus
335 and O. nervosum was slightly higer than the rest of the species, but no significant differences
336 were found. Tavaria et al. (2001) reported that C. cardunculus a higher proteolytic activity on α-
337 than on β-casein, but the values of the degradation percentage were generally lower than those
338 found in our study. Cavalli et al. (2005) reported that S. marianum extract produced extensive
339 degradation of αs-caseins but only a slighter degradation of β-casein, but we observed that the
340 most degraded casein by this species was β-casein. In this sense, Sousa and Malcata (1998)
341 found similar rates of hydrolysis on α- and β-casein by dry flowers of C. cardunculus. In our
342 study, proteolytic activity observed for C. cardunculus was higher, than the rest of the thistle
343 species from Asteraceae family, for the three caseins studied.
344 The PCA analysis of the FZCE and SDS-PAGE profiles and proteolytic activity on α, β and k-
345 caseins showed major differences between Asteraceae species (Figure 3). The first axis
346 accounted for 22.38 % of the variance and was mainly defined by proteolytic activity on α and
347 κ-caseins, SDS-PAGE bands of 16.7, 28.3, 30.2 and 60.2 kDa, and the FZCE peaks 10, 11, 13,
348 15, 16, 17 and 20. These variables would be strongly correlated between them. The second axis
349 (PC2, 16.29 % of the variance) includes FZCE peaks 3, 5, 21 and 23, SDS-PAGE bands of 45
350 and 55 kDa and the proteolytic activity on β-casein (% degradation). These parameters FZCE
351 peaks 8, 9, 12 y 14, and SDS-PAGE bands 35 y 64 kDa were clearly associated with samples of
352 S. marianum, whereas FZCE peaks 1, 4, 6, 7, 22 y 24, and SDS-PAGE bands of 30, 32, 59 y 67
353 kDa were related to O. nervosum. Proteolytic activity on α, β and κ-caseins were explained by
354 the positive axis of PC1 and were associated with samples of C. cardunculus and C. humilis,
355 which could indicate the increased proteolytic activity of these varieties
356 3.4. Proteolytic activities and milk-clotting activity of the aqueous extracts of C.
357 cardunculus and their relationship with the SDS-PAGE profiles
172
358 Table 5 lists the milk-clotting and proteolytic activities of the aqueous extracts from the cardoon
359 samples studied at different stages, locations, and years of harvest. The value ranges of milk-
360 clotting are 0.120–0.235 and 0.148–0.282 RU/ml for 1 and 24 h of maceration, respectively.
361 Extracts of C. cardunculus collected in Portugal showed milk-clotting values around 18
362 R.U./ml, when prepared 15 times more concentrated (Tavaria et al., 2001). In our study to the
363 factor investigated maduration stage, no significant differences were found in milk-clotting
364 values or in proteolytic activities on the casein fractions. Nevertheless, as for the factor
365 investigated location, the samples of location 16 showed the highest mean values (P < 0.05)
366 after 1 h maceration, while considering milk-clotting values for extracts prepared after 24 h
367 maceration, samples from location L6 showed the highest mean values (P < 0.05). Respect to
368 the proteolytic activity, samples collected in L19 showed the highest degradation values (%)
369 against the three caseins studied. Similar results were found for samples collected in locations
370 L14 and L16 against α-casein (P<0.05). Cordeiro et al. (1994) studied the proteolytic and milk-
371 clotting activities of mature flower extracts collected at 8 different locations in Portugal, which
372 showed some variation in proteolytic activity while the milk-clotting activity was essentially the
373 same for all extracts. With respect to the factor investigated year of harvest, samples harvested
374 in 2009 showed higher proteolytic activity on β an k-casein than samples collected in 2007 and
375 2008.
376 Table 6 lists the correlations between the analytical parameters (SDS-PAGE band intensities)
377 and the milk-clotting and proteolytic activities. The intensities of SDS-PAGE bands were not
378 correlated with clotting activities. Bands 6 and 7, of 32 and 30.2 kDa respectively were strongly
379 and positively correlated with all caseins degradation. Moreover, 55 kDa and 13.5 kDa bands
380 were positively correlated with β- and k-casein degradation. Positive correlations were also
381 found between intensities of the bands of 60.2 and 20.7 kDa and proteolytic activity against β-
382 casein.
383 The proteolityc ativity on α, β and k-casein by SDS-PAGE comparing the protein
384 patterns of the 140 Cynara cardunculus plants harvested in 2007, 2008 and 2009 yielded five
173
385 clusters (Figure 4). The cardoon cluster or group number 1 is characterized by a strong
386 degradation of α (72.13%) and k (83.33%) -casein and a very slight degradation of β-casein. A
387 total of 9.3% of the samples belonged to this first group, with an average of clotting activity of
388 0.115 RU after 1 hour of maceration, and 0.142 RU after 24 hours of maceration. A 69.23 % of
389 the samples of this group were harvested in 2007, and a 69.23 % of samples were collected in
390 the flower ripening stage “c”. The most of the samples belonging cluster 1 was picked up in
391 localization L14. The second cluster, on the other hand, includes a 49.3% of the C. cardunculus
392 samples, which are able to degrade both caseins in an 88.02%, 65.98% and 91.76%
393 respectively, so these samples could be considered the most proteolytic plants. They showed the
394 highest values of clotting activity, 0.182 and 0.227 RU after 1 hour and 24 hours of maceration,
395 respectively. A 53.6% of these samples were collected in 2007, and a 47.8% of them belonged
396 to flower ripening stage “b”. The most of these samples were harvested in localizations L2 and
397 L6. With respect to cluster 3, the samples grouped (8.6%) can’t degrade the caseins more than
398 50% in all cases. These samples showed a clotting activity of 0.132 RU (1 hour of maceration)
399 and 0.186 RU (24 hours of maceration). The most of these samples were picked up in 2008,
400 while a 50% of them were corresponded with flower ripening stage “c”. A third part of the
401 samples of this cluster was harvested in the location L1, other third in L6 and last third between
402 L2 y L19. The samples in the cluster 4 (25.7%) showed a high degradation of α (85.35%) and β
403 (70.38%)-casein and a lower capacity to degrade k-casein (38.85%). Its clotting activity of
404 0.156 RU and 0.180 RU after 1 hour and 24 hours of maceration. The 55.6% of the samples
405 were harvested in 2007, and a 52.8% of the samples were picked up in flower ripening stage
406 “b”. The most of these samples (41.7%) were grown in localization L2. Lastly, samples in
407 cluster 5 (7.1%) showed very low degradation of β (4.25%) and k (8.31%)-casein, and slight
408 degradation of α-casein (51.22%). The average clotting activity for these samples was 0.158 RU
409 and 0.194 RU after 1 hour and 24 hours respectively. The most of these samples (70%) were
410 harvested in 2007, and a 50 % of them belonged to flower ripening stage “b”. A 30% of the
411 samples of cluster 5 were collected in the location L3 and the same percentage in L5.
174
412
413 3.5. Antimicrobial activity of aqueous extracts of C. cardunculus.
414 The aqueous extracts from dried flowers of C. cardunculus, used as vegetable rennet in the
415 Torta del Casar cheese-making, don’t showed an inhibitory effect on selected microorganisms
416 studied.
417
418 Conclusions
419 It is possible to distinguish between Asteraceae species applying FZCE and SDS-PAGE
420 analysis, as each species is defined by a FZCE and SDS-PAGE characteristic protein profile,
421 which allows us differ these species. These different protein profiles are involved in the
422 different proteolytic activity of each Asteraceae species on milk caseins.
423 These results show that there is high variability among Cynara cardunculus populations,
424 concerning its ability to degrade milk caseins in the cheese-making of Torta del Casar, therefore
425 it would be necessary to know which of the plants have a desirable influence on the whole
426 process and the sensory attributes of Torta del Casar cheese, with the aim of growing this plants
427 under controlled conditions and cheese factories, associated to PDO, could have available the
428 best C. cardunculus plants for producing the vegetable rennet with the desirable technological
429 quality.
430
432 The authors are grateful to M. Cabrero and C. Cebrián for technical assistance and PDO “Torta
433 del Casar” for technical support.
434
435 References
175
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573
574
575
576
577
578
579
181
580 Figure 1. FZCE protein profiles of different species. 1. Silybum marianum; 2.
581 Onopordum nervosum; 3. Cynara humilis; 4. Cynara cardunculus; 5. Cynara scolymus.
582 Figure 2. Proteolytic activity of flower extracts of different thistle Asteraceae species
583 studied on milk caseins by SDS-PAGE. A2: Silybum marianum; A6: Cynara humilis;
584 A61, A19: Onopordum nervosum; A33, A45, A28: Cynara cardunculus; A64: Cynara
585 scolymus (A). Proteolytic activity of flower extracts of different thistle Asteraceae
586 species studied on milk caseins, expressed in % degradation (B).
587 Figure 3. Principal component analysis of the FZCE and SDS-PAGE profiles and
588 proteolytic activity on α, β and κ-caseins of extracts from Asteraceae species: plane 1–2
589 of variable plot (A); Distribution of thistle Asteraceae species samples according to
590 plane 1–2 of a factorial correspondence analysis (B).
591 Figure 4. Dendrogram of Cynara cardunculus samples grouped according to their
592 proteolitic activity on milk caseins.
593
594
595
596
597
598
599
600
601
182
602 Table1. Morphological characterization of thistle species studied from Asteraceae
603 family.
Silybum Onopordon Cynara Cynara Cynara

marianum nervosum humilis cardunuclus scolymus
Plant
height 3 3 0.2 - 0.6 0.4 - 1 1.4 - 2
(m)
Square
section, Striated Striated
green – Striated lenghwise, 35 lengthwise
Stem
white lenghwise mm, yellowish and
colored, and spines brunched
column form
Pinnatisects,
Arching,
peciolated, with
Spiny margin, deeply
ovoid segments
Alternate, Lobulated, deeply lobed,
at bottom and
Leaves sessile, pinnate pinnatisect pinnate, silvery,
upper leaves
and spiny and spiny tomentose glaucous-
are sessile,
underside green, 50-82
tomentose
cm long
underside
with an erect,
Globose with
lanceolated,
several
Involucre flat and Globose Globose
leathery bracts
spiny bracts
files
files
Several ovate –
Intermediate Leathery, lanceolated, Pointed,
Purple,
Bracts bracts line with serrated leathery, erect leathery
lanceolated
a terminal spine margin bract files, with grenn
spiny peack
Discoid, Round but
Brunches, 2-6 discoid
Capítulas Solitary discoid terminal and slightly
ovoid. panicles
solitary elongated
Flowers Purple Purple-pink Blue or white Blue Purple-blue
Pyramid,
Ovoid, smooth tetragon with
Obovoid (6-7 Obovoid,
with an apical four winged
Obovoid, mm), smooth, smooth, gray
collar white ribs in the
pink or with 2-4 ribs. color.
colored. Pappus upper part.
white, Feathery Feathery
(15-22 mm) Feathery
Achenes feathery pappus (25-35 pappus in
with several pappus (30-40
pappus (5,5- mm) in the the base and
hair lines, mm) in the
10 (14)) mm base and rough rough in the
soldered in a base and
in the tip tip
basal ring rough in the
tip
604
605
606
183
607 Table 2. Samples of different thistle species from Asteraceae family studied, according
608 to the maduration stage, year and localization of harvest.
Code Specie Maduration Stage1 Year Localization Nº

A1 S. marianum b 2006 L7 Talayuela 1
A2 S. marianum b 2006 L1 Balboa-Talavera 1
A3 S. marianum b 2006 L2 Ctra. Mérida-Madrid 1
A4-A5 Cynara humilis b 2006 L4 Canal Lobón 2
A6-A11 Cynara humilis b 2006 L8 Ctra. Cáceres 6
A12-A13 Cynara humilis b 2006 L9 Villar del Rey 2
A14-A17 O. nervosum b 2006 L10 Badajoz 4
A18-A20 O. nervosum b 2006 L1 Balboa-Talavera 3
A21 O. nervosum b 2006 L11 Berlanga 1
A22 C. scolymus b 2006 L12 Cáceres 1
A23 C. cardunculus b 2006 L5 Puebla de la Calzada 1
A24-A26 C. cardunculus b 2006 L13 Villafranco del Guadiana 3
A27-A29 C. cardunculus b 2006 L11 Berlanga 3
A30-A31 C. cardunculus b 2006 L6 Sancha Brava 2
A32-A36 C. cardunculus b 2006 L14 Montijo – La Nava S. 5
A37-A39 C. cardunculus b 2006 L3 La Albuera 3
A40-A41 C. cardunculus b 2006 L15 Santa Marta-Solana 2
A42 C. cardunculus b 2006 L16 Cruce Montijo 1
A43-A54 C. cardunculus b 2006 L2 Ctra. Mérida - Madrid 12
A55-A56 Cynara humilis b 2006 L10 Badajoz 2
A57-A60 Cynara humilis b 2006 L17 Casar de Cáceres 4
A61-A62 O. nervosum b 2006 L1 Balboa-Talavera 2
A63-A65 C. scolymus b 2006 L13 Villafranco del Guadiana 3
A66-A70 C. cardunculus b (2)2, c (3) 2007 L5 Puebla de la Calzada 5
A71-A79 C. cardunculus a (4), b (2), c (3) 2007 L3 La Albuera 9
A80-A94 C. cardunculus a (5), b (4), c (6) 2007 L6 Sancha Brava 15
A95-A109 C. cardunculus a (4), b (8), c (3) 2007 L14 Montijo – La Nava S. 15
A110-123 C. cardunculus a (4), b (3), c (7) 2007 L16 Cruce Montijo 14
A124-140 C. cardunculus b (12), c (5) 2007 L2 Ctra. Mérida - Madrid 17
A141-142 C. cardunculus b 2008 L12 Cáceres 2
A143-148 C. cardunculus b (2), c (4) 2008 L18 La Orden-Guadajira 6
A149-159 C. cardunculus b (3), c (8) 2008 L1 Balboa-Talavera 11
A160-168 C. cardunculus b (6), c (3) 2008 L14 Montijo – La Nava S. 9
A169-183 C. cardunculus b (8), c (7) 2008 L2 Ctra. Mérida-Madrid 15
A184-189 C. cardunculus b (3), c (3) 2008 L3 La Albuera 6
A190-197 C. cardunculus b (4), c (4) 2008 L6 Sancha Brava 8
A198-205 C. cardunculus b (4), c (4) 2009 L19 Alcántara 8
Total 205
1
609 a: flower is opening, only some styles and stigmas are visible; b: flower fully open, even with pollen; c:
610 flower begins to dry, so some styles and stigmas are brownish; stigmas and styles are dried.
2
611 (X): number of samples, harvested in indicated year and location and in the maduration stage
612 symbolized by a, b, c or d.
3
613 Geographic coordinates: L1: 38º 54' 8,82" N 6º 43' 59,9" W, L2: 38º 50' 34,8" N 6º 57' 39,73" W, L3:
614 38º 45' 6,73" N 6º 48' 10,42" W, L4: 38º 52’ 29,07” N 6º 45’ 11,50” W, L5: 38º 53' 59,94" N 6º 51'
615 12,43" W, L6: 38º 56' 32,78" N 6º 20' 23,16" W, L7: 39º 59’ 7,44” N 5º 35’ 21,59” W, L8: 39º 19’ 30,53”
616 N 6º 29’ 54,41” W, L9: 39º 8’ 5,03” N 6º 51’ 13,63” W, L10: 38º 54’ 23,07” N 6º 58’ 15,10” W, L11: 38º
617 17’ 23,93” N 5º 49’ 48,00” W, L12: 39º 26’ 19,40” N 6º 22’ 52,95” W, L13: 38º 53’ 55,65” N 6º 53’
618 15,99” W, L14: 38º 55’ 20,77” N 6º 35’ 57,79” W, L15: 38º 37’ 55,93” N 6º 37’ 0,20” W, L16: 38º 55’
619 16,44” N 6º 57’ 23,19” W, L17: 39º 35’ 31,47” N 6º 23’ 30,03” W, L18: 38º 51’ 17,61” N 6º 41’ 20,37”
620 W, L19: 39º 42’ 25,67” N 6º 53’ 5,49” W.
621
622
184
623 Table 3. Peak areas of proteins determined by SDS-PAGE in the studied species
624 harvested in 2006.
aprox Cynara Cynara Cynara Sylibum Onopordom

Band
MW cardunculus scolymus humilis marianum nervosum P
1 13.5 10346 b 41631 b nd a nd a nd a 0.017
2 16.7 36866 b 29857 b 23618 b nd a nd a 0.001
3 20.7 24178 b 22636 b nd a nd a nd a 0.002
4 28.3 20419 b 21558 b nd a nd a nd a 0.000
5 30 nd a nd a nd a nd a 16878 b 0.004
6 30.2 96704 b 85583 b 87591 b nd a nd a 0.000
7 32 25331 c 28314 c nd a
nd a 9782 b 0.000
8 35 nd a nd a nd a 9123 b nd a 0.000
9 37.3 13154 b 12577 b nd a nd a nd a 0.000
10 45 8909 b 9026 a nd a 8567 b nd a 0.003
11 55 4924 b 5213 a 5607 b nd a nd a 0.001
12 59 nd a nd a nd a nd a 2690 b 0.000
13 60.2 10256 b 7271 b 1617 c nd a nd a 0.000
14 64 nd a nd a nd a 7179 b nd a 0.000
15 66.2 12371 b nd a 6761 b nd a nd a 0.000
16 67 nd a nd a nd a nd a 5948 b 0.003
a, b, c
625 Means in lines without common letters are significantly different (p<0,05).
626
627
628
629
630
631
185
632 Table 4. Analytical parameters and peak areas of proteins determined by FZCE under
633 optimized conditions in different species studied harvested in 2006.
Peak migration time UAAa

peak
CMTb RDSc Sylibum Onopordom Cynara Cynara Cynara P

% marianum nervosum humilis cardunculus scolymus
1 8.799 5.437 0a 19936 b 0a 0a 0a 0.000
2 9.436 3.826 0a 9126 ab 0a 28686 b 21369 b 0.001
3 9.037 1.504 0a 0a 38756 b 0a 0a 0.000
4 9.241 6.916 0a 11543 b 0a 0a 0a 0.000
5 9.402 3.336 0a 0a 84587 b 0a 0a 0.000
6 9.749 6.605 0a 11362 b 0a 0a 0a 0.000
7 10.580 6.816 0a 19446 b 26776 b 0a 0a 0.000
8 11.372 1.337 71901 b 0a 0a 0a 0a 0.000
9 11.573 1.725 1025215 b 0a 0a 0a 0a 0.000
10 11.882 2.720 0a 0a 0a 37510 b 47256 b 0.000
11 12.226 3.443 0a 25361 a 329950 b 369612 b 294333 b 0.020
12 12.554 1.822 3038036 b 0a 0a 0a 0a 0.000
13 13.132 2.881 0a 0a 60901 b 97861 b 96520 b 0.004
14 13.633 1.885 14519 b 0a 0a 0a 0a 0.000
15 13.648 3.886 0a 12919 a 258426 c 165915 b 262987 c 0.000
16 14.786 2.127 0a 0a 25347 b 132069 c 145542 c 0.001
17 15.201 2.958 0a 0a 245866 b 401758 b 245868 b 0.001
18 15.367 3.460 0c 0c 0c 0c 0c
19 15.540 2.778 0c 0c 0c 0c 0c
20 15.637 2.136 0a 0a 20094 b 29466 b 32118 b 0.016
21 15.971 1.025 0a 0a 1847112 c 86211 b 64138 b 0.000
22 16.129 2.580 0a 9977 b 0a 0a 0a 0.000
23 16.488 1.818 0a 0a 57005 b 0a 0a 0.000
24 17.585 1.114 0a 6199 b 0a 0a 0a 0.000
634
186
635 Table 5. Clotting and casein proteolysis activities of vegetable rennets obtained from cardoon flowers grouped according to maturation stage,
636 location, and harvest year.
Clotting activity (R.U.) after maceration % Degradation of the PAGE-SDS bands

Sample grouping 1 hour 24 hours α-caseins β-casein κ-casein
Mean SD Mean SD1 Mean SD Mean SD Mean SD
Maturation stage2
a 0.175 ± 0.069 0.199 ± 0.613 80.742 ± 17.914 60.225 ± 27.876 64.643 ± 34.658
b 0.172 ± 0.078 0.202 ± 0.093 82.398 ± 18.075 59.017 ± 27.921 69.783 ± 31.293
c 0.153 ± 0.062 0.201 ± 0.082 78.035 ± 18.523 51.001 ± 28.324 68.037 ± 32.655
P3 0.272 0.995 0.416 0.227 0.838
Location2
L1 0.141ab ± 0.024 0.187ab ± 0.043 74.159ab ± 21.419 51.378abc ± 17.668 78.140ab ± 15.249
L2 0.156ab ± 0.051 0.191ab ± 0.618 84.390ab ± 18.271 68.000ab ± 23.827 66.718ab ± 30.312
L3 0.169ab ± 0.034 0.202ab ± 0.065 73.198ab ± 20.357 47.273abc ± 27.813 44.317bc ± 33.824
L5 0.179ab ± 0.035 0.144ab ± 0.028 55.830b ± 32.814 20.496c ± 28.179 4.962c ± 11.095
L6 0.205ab ± 0.083 0.282a ± 0.151 74.870ab ± 20.341 54.041abc ± 23.761 71.018ab ± 30.342
L12 0.206ab ± 0.033 0.182ab ± 0.065 74.280ab ± 14.538 48.090abc ± 47.716 76.160ab ± 17.027
L14 0.120b ± 0.041 0.148b ± 0.041 86.328a ± 8.887 42.967bc ± 34.875 72.102ab ± 30.906
L16 0.235a ± 0.126 0.209ab ± 0.069 86.044a ± 8.257 67.492ab ± 17.548 78.011ab ± 30.999
L18 0.155ab ± 0.053 0.210ab ± 0.058 83.722ab ± 15.626 38.797bc ± 6.976 83.583ab ± 11.347
L19 0.126b ± 0.025 0.199ab ± 0.037 87.864a ± 9.459 87.650a ± 9.357 97.941a ± 2.046
P 0.000 0.000 0.006 0.000 0.000
Year
2007 0.175 ± 0.086 0.212 ± 0.105 81.258 ± 17.832 51.850b ± 30.708 69.542b ± 35.831
2008 0.155 ± 0.045 0.187 ± 0.055 77.430 ± 19.169 55.733b ± 23.061 63.133b ± 26.066
2009 0.126 ± 0.025 0.199 ± 0.037 87.867 ± 9.459 87.651a ± 9.357 97.941a ± 2.045
P 0.086 0.247 0.219 0.002 0.013
1
SD: Standard deviation.
2
Maturation stage and location: as in table 1.
3
637 P-values.
187
638 Table 6. The relevant SDS-PAGE bands of the Cynara cardunculus rennets studied:
639 correlations with technological properties, proteolytic activity and clotting activity.
Correlation
Clotting activity (R.U.) Degradation of caseins (%)
SDS- PAGE bands
after maceration
1 hour 24 hours α-caseins β-casein κ-casein
1 2
b1 66.2 0.238 0.347 0.395 0.043 0.368
b2 60.2 -0.165 -0.072 0.212 0.264(*) 0.210
b3 55 -0.238 0.045 0.100 0.357(*) 0.448(**)
b4 45 -0.105 0.008 -0.323 -0.249 0.387
b5 37.3 -0.306 -0.060 -0.341 0.620(**) 0.369
b6 32 -0.047 0.012 0.264(**) 0.446(**) 0.310(**)
b7 30.2 -0.071 0.017 0.215(*) 0.369(**) 0.327(**)
b8 28.3 -0.244 -0.007 0.079 -0.031 0.282
b9 20.7 -0.414(*) -0.204 0.154 0.458(*) -0.002
b10 16.7 -0.221 -0.038 0.162 0.176 0.073
b11 13.5 -0.126 0.005 0.094 0.386 (**) 0.304 (*)
1 2
band number (PAGE), kilodaltons (PAGE); * P<0.05; ** P<0.01.
640
641
642
188
643 Figure 1.
140000
120000
100000
Sylibum marianum
12
80000 9
60000
40000
8
20000 14
0
140000
-20000
120000
100000
0 Onopordum
5 nervosum
10 15 20
80000
60000
40000
6 11
20000 4 7
1 2 15 22 24
0
-20000
140000
0 5 10 15 20
120000 20
100000
Cynara humilis 21
80000
11
60000
15
40000
130000 5
3 13 16 23
20000 7
110000 17
0
-20000
90000
0 Cynara scolymus
5 10 15 20
70000
13
AAU
11
17
50000 15
2 10 16
30000
20
21
10000
-10000
140000
0 Cynara cardunculus
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
min
120000 11
100000 13 17
80000
15
60000 10
2
40000 16
20
20000 21
0
-20000
0 5 10 15 20
644
645
646
647
189
648 Figure 2.
649 A.
M Caseins A2 A6 A61 A19 A33 A45 A28 A64
84
66
55
45
36
29
24
20
14,2
6,5
650
651 B.
652
653 Sticks with different letters above differ significantly (P<0.05).
654
655
190
656 Figure 3.
657
658
S. marianum; O. nervosum; C. scolymus; C. humilis; C. cardunculus
659
660
191
661 Figure 4.
662
25 % 20 % 15 % 10 % 5% 0%
A76, A103, A104, A106, A107, A108,

A109, A134, A136, A142, A146, A156,
A165
Cluster 1
A71, A72, A80, A81, A83, A84, A85,
A87, A88, A89, A92, A93, A94, A101,
A102, A105, A111, A112, A116, A117,
A118, A119, A120, A121, A122, A125,
A126, A127, A128, A129, A130, A131,
A132, A135, A137, A138, A141, A143,
A144, A145, A147, A148, A149, A150,
A151, A152, A153, A154, A160, A161,
A162, A168, A174, A182, A184, A185,
Cluster 2 A186, A187, A189, A191, A192, A195,
A198, A199, A200, A201, A202, A203,
A204, A205
A82, A91, A155, A157, A158, A159,

A175, A181, A193, A194
Cluster 3
A69, A70, A73, A77, A78, A79, A90,
A97, A98, A99, A100, A110, A113,
A114, A115, A123, A124, A133, A139,
A140, A163, A164, A166, A167, A170,
Cluster 4 A171, A172, A173, A176, A177, A178,
A179, A180, A183, A196,
A66, A67, A68, A74, A75, A95, A96,

A188, A190, A197,
Cluster 5
663
192
IV.1.3. Influencia de la preparación y almacenamiento del extracto de Cynara
cardunculus en su actividad coagulante.
193
1 Influencia de la preparación y almacenamiento del extracto de Cynara cardunculus
2 en su actividad coagulante.
4 Elena Ordiales1, M. José Benito2, Alberto Martín2, M. Guía Córdoba2*
1
6 Agricultura, Centro Tecnológico Nacional Agroalimentario Extremadura, CTAEX.
7 Ctra. Villafranco a Balboa, km 1,2. 06195 Villafranco del Guadiana, Badajoz.
2
8 Nutrición y Bromatología. Escuela de Ingenierías Agrarias, Universidad de Extremadura,
9 Ctra. de Cáceres s/n, 06071 Badajoz.
10
11 [email protected]
12 http://eia.unex.es/
13
14
195
15 Resumen
16 En este artículo se recoge la influencia que ejercen diferentes parámetros

17 relacionados con el método de preparación del extracto para su uso como cuajo vegetal
18 en el proceso de elaboración del queso, en una de sus propiedades tecnológicas más
19 relevantes, su actividad coagulante. Se estudian los efectos de la concentración del
20 extracto, el tiempo de maceración en agua, la cantidad del extracto que se añade a la
21 leche, en su capacidad para coaular la leche. Se compara la actividad coagulante de
22 extractos pertenecientes a diferentes muestras de Cynara cardunculus, preparados con
23 las mismas variables, y se estudia la influencia del año de recolección de la muestra, el
24 estado de maduración de la flor y la localización. Finalmente se aborda cómo puede
25 influir el almacenamiento del extracto preparado en su actividad coagulante.
26
196
27 1. Introducción
28 La coagulación de la leche por medio de un cuajo es un paso esencial durante la

29 elaboración del queso, y es el resultado de tres fases diferentes pero que se solapan: a) la
30 hidrólisis de κ-caseína da lugar a la desestabilización de las micelas de caseínas, b) la
31 agregación de las micelas de caseínas desestabilizadas, c) la gelificación (Dalgleish,
32 1992). Durante la coagulación de las caseínas se forma un gel a modo de matriz, que
33 atrapa o retiene grasa, agua y algunos componentes solubles de la leche.
34 La actividad coagulante ha sido atribuida a la relativamente alta concentración

35 de proteinasas aspárticas, especialmente en los tejidos florales de Cynara cardunculus
36 (Barros y Malcata, 2004). La mayor parte de la actividad coagulante que se añade a la
37 leche se pierde en el suero, solo un máximo del 15 % de la actividad coagulante añadida
38 a la leche permanece en la cuajada tras la elaboración, dependiendo de factores como el
39 tipo de coagulante, el ratio de diferentes enzimas en mezclas, la temperatura durante la
40 elaboración, la variedad de queso y el nivel de humedad en el queso final (Guinee y
41 Wilkinson, 1992).
42 Según Irigoyen y col. (2000) la actividad coagulante del cuajo empleado es uno
43 de los factores que tiene mayor importancia en la degradación de las caseínas,
44 similarmente el origen de la enzima coagulante usada (animal, microbiana o vegetal)
45 puede condicionar el nivel de proteólisis, de modo que las enzimas vegetal y
46 microbianas rompen β- caseína más rápido que las enzimas animales.
47 La actividad coagulante está relacionada con la habilidad de la enzima para

48 romper o hidrolizar κ-caseína en la región del péptido Phe105-Met106, que es específico
49 en el proceso de elaboración del queso. Según los resultados de Campos y col. (1990),
50 el extracto de cardo muestra una especificidad más amplia y ataca varios péptidos
51 unidos, lo que significa que presenta un menor ratio de actividad coagulante
52 relativa/actividad proteolítica. Por tanto, deberían introducirse modificaciones en el pH
53 y la temperatura para mejorar las condiciones de coagulación durante la elaboración de
54 queso.
55 El primer paso de la elaboración del queso es la coagulación de la leche, lo cual

56 implica la unión mediada enzimáticamente de κ-caseína al péptido Phe105-Met106.
57 Además de esta actividad coagulante, las enzimas del cuajo se quedan atrapadas en la
197
58 cuajada, donde provocarán la ruptura de proteínas durante la maduración del queso
59 (Dalgleish, 1987, Fox, 1989) y por tanto, son las responsables de la liberación de varios
60 péptidos con funciones bioquímicas, reológicas y sensoriales en el queso (Dalgleish,
61 1987).
62 La actividad coagulante disminuye cuando aumenta la temperatura de le leche

63 disminuye cuando aumenta el pH de la leche, aumenta al aumentar la concentración
64 enzimática, aumenta con mayores concentraciones de calcio.
65 La actividad coagulante de las cynarasas presentes en las flores de C.

66 cardunculus sobre la leche, las convierte en enzimas adecuadas para elaborar quesos de
67 pasta blanda, y se asocian con sabores amargos y bajos rendimientos relativamente
68 (Tavaria y col., 2001). Desde el siglo XIX varias metodologías han sido empleadas para
69 caracterizar la actividad coagulante sobre la leche, estando la mayoría de ellas basadas
70 en la observación de la formación de la cuajada sobre un sustrato de leche (Soxhlet,
71 1877; Berridge, 1952). Sin embargo, estos métodos carecen de la definición de la
72 actividad coagulante total (Andrén, 1998), lo cual ha sido adecuadamente solucionado
73 por el IDF Standard 157ª: 1997.
74 Sousa y Malcata (1998) definieron la actividad coagulante en base a Unidades

75 de Coagulación (RU), de modo que una unidad coagulante (RU) se define como la
76 cantidad de extracto necesaria para coagular 10 ml de leche a 30º C durante 100
77 segundos. Por su parte, Chazarra y col. (2007) definieron una unidad de fuerza del cuajo
78 o actividad coagulante (RS) como el número de volúmenes de leche coagulada por cada
79 volumen de cuajo en 40 minutos a 35º C.
80
81 2. Material y Métodos
82 2.1. Material biológico
83 Para llevar a cabo este estudio se parte de muestras de flores de cardo,

84 pertenecientes a la especie Cynara cardunculus. Se recogieron en zonas representativas
85 de Extremadura, donde crecen las plantas de esta especie, en las campañas 2006 a 2009.
86 Las flores se recolectaron entre los meses de junio y julio de cada campaña, en tres
87 estadios de maduración, inicio de floración, plena floración y flor senescente.
198
88 Las flores recolectadas se separan del involucro en uno de los laboratorios de la
89 Escuela de Ingenierías Agrarias, dejando los estigmas y estilos a secar. Una vez secos,
90 se guardaron las flores de cada muestra por separado, en bolsas de plástico y se
91 mantuvieron en lugar seco, a temperatura ambiente, hasta su utilización.
92 Las muestras de flores de cardo (C. cardunculus) empleadas en este estudio se

93 muestran en la Tabla 1.
94
95 2.2. Preparación de los extractos
96 Para poner a punto el método descrito por Sousa y Malcata (1998) los extractos
97 de flores de C. cardunculus se prepararon a partir de flores secas, picadas y
98 homogeneizadas. Se pesaron 0,5 g de flores y se dejaron macerando en 0,75 ml de agua
99 destilada durante 24 h, a temperatura ambiente. El extracto que se obtiene es filtrado a
100 través de papel de filtro Whatman nº 4, antes de ser usado. La cantidad de extracto
101 acuoso añadido a la leche para la realización de estos ensayos es del 10 % (0,2 ml de
102 extracto en 2 ml de leche), salvo cuando este parámetro sea la variable del ensayo.
103
104 2.2.1. Concentración de los extractos
105 Para el desarrollo de este ensayo los extractos acuosos se preparan como se
106 describe anteriormente, cambiando las cantidades de flores secas y picadas de cardo, a
107 macerar en 100 ml de agua destilada. Se ensayaron 6 concentraciones de flores, como se
108 muestra en la Tabla 2. El tiempo de maceración fue de 24 horas, y la muestra de cardo
109 empleada fue la misma (A30).
110
111 2.2.2. Tiempo de maceración de los extractos
112 Para evaluar la influencia del tiempo de maceración de los extractos se establece
113 un ensayo, en el que se preparan extractos de dos muestras de cardos, A30 y A49, a tres
114 concentraciones diferentes (P1, P4 y P6: Tabla 2) y se ensayan los tiempos de
115 maceración de 16 h, 4 h, 2 h y 1 h.
116
117 2.2.3. Cantidad de extracto añadida a la leche
118 Para diseñar este ensayo se tienen en cuenta las cantidades utilizadas por otros
119 autores y queserías enmarcadas en la DOP Torta del Casar. Las cantidades se extracto a
199
120 ensayar fueron 0,5 %, 1 %, 3 % y 5 %. La concentración con la que se prepararon los
121 extractos fue P4 (Tabla 2). Se incluyen como variables dos tiempos de maceración para
122 todas las muestras, 30 min y 24 h. Las muestras de cardo empleadas en este caso fueron
123 A30, A206 y A208.
124
125 2.2.4. Comparación entre muestras de Cynara cardunculus
126 Con este estudio se compara la actividad coagulante de las muestras de cardo,
127 estudiando la influencia del estado de maduración de la flor, la localización y el año de
128 recolección. Para ello todas las muestras se prepararon bajo las mismas condiciones, a la
129 concentración P4 (5 g flores secas y picadas/100 mL de H2O), se ensayaron dos tiempos
130 de maceración, 1 h y 24 h, la cantidad de extracto añadida a la leche fue del 3 %.
131
132 2.2.5. Almacenamiento y refrigeración de los extractos
133 Los extractos preparados con la muestra de cardo A30, con las concentraciones
134 P1, P4, P5 y P6 (Tabla 2), macerados durante 24 h, añadidos a la leche a un 3 %, se
135 mantuvieron en condiciones de refrigeración durante 1 y 7 días, tras analizar, recién
136 preparados, su actividad coagulante.
137
138 2.3. Análisis de actividad coagulante
139 La actividad coagulante se determinó según el método estándar (NILACTM;

140 NIZO, Ede, The Netherlands) usando leche descremada en polvo bovina. El sustrato fue
141 preparado disolviendo 12 g de leche en polvo en 100 ml de CaCl2 0,01 M (pH 6,5) a 30º
142 C. La leche fue empleada como un sustrato estándar y homogéneo, aunque los extractos
143 de cardo testados se usan sobre leche cruda entera de oveja en la elaboración de los
144 quesos.
145 Se llevaron a cabo varios ensayos enzimáticos, variando las condiciones de

146 preparación de los extractos . En todos los casos el extracto acuoso de cardo se añadió a
147 2 ml de leche reconstituida y el tiempo de actividad coagulante fue determinado
148 visualmente.
149 Una unidad de cuajado (R.U.) se define como la cantidad de extracto acuoso de
150 cuajo que se necesita para cuajar 10 ml de leche descremada reconstituida a 30º C en
200
151 100 s (FIL-IDF 157/1992). Las determinaciones se realizaron por cuadruplicado y la
152 media de cada cuatro datos se consideró como dato.
153
154 2.4. Perfiles de proteínas de los extractos
155 Las proteínas extraídas como se ha descrito anteriormente para su análisis

156 mediante SDS-PAGE se mezclaron con 30 µl de buffer PAGE de carga (62,5 mM Tris-
157 HCl, pH 6,8, 20 % (p/v) glicerol, 2 % (p/v) SDS, 5 % (p/v) β-mercaptoetanol, 0,025 %
158 (p/v) bromofenol azul) y fueron incubadas a 99º C durante 5 min para la
159 desnaturalización de las proteínas. Las condiciones de electroforesis son las descritas
160 por Laemmli (1970), y las concentraciones para la acrilamida (29:1
161 acrilamida/bisacrilamida) en los geles fue de 4 % (p/v) para el gel concentrador, y de 15
162 % (p/v) para el gel separador. Los geles fueron montados y pinchados en un dispositivo
163 Miniprotean III (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).
164 Para determinar el peso molecular de las distintas fracciones se utilizó un patrón
165 de proteínas constituido por miosina (205 kDa), β-Galactosidasa (116kDa), Fosforilasa
166 B (97 kDa), albúmina (66 kDa), Glutámico desidrogenasa (55 kDa), ovoalbúmina (45
167 kDa), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (36 kDa), anhigrasa carbónica (29 kDa),
168 tripsinógeno (24 kDa), inhibidor de la tripsina (20 kDa), α-lactoalbúnina (14,2 kDa) y
169 aprotinina (6,5 kDa), suministrado por la casa comercial de SIGMA.
170 El tampón utilizado para la carrera fue Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS al
171 0,1%, pH 8,3. Las electroforesis se realizaron a 100 w los primeros 20 min y a 150 w
172 hasta el final de la carrera. Una vez finalizado el desarrollo electroforético, los geles
173 fueron tratados con una solución de tinción constituida por 0,25 g de azul de Comassie
174 R-250 en una solución 1:1 metanol-agua al 90 % y ácido acético al 10 % durante 15
175 minutos, transcurrido los cuales fueron desteñidos en una solución de metanol al 30 % y
176 ácido acético al 10 %.
177 Se utilizó un programa informático de análisis de imágenes (Genetools,

178 Synoptics Ltd., Cambridge, U.K.) para el análisis densitométrico del gel de
179 electroforesis.
201
180 2.5. Actividad proteolítica de los extractos
181 Los extractos se prepararon como se describe en el apartado 2.2. El sustrato

182 empleado para la degradación por parte de los extractos consistió en una mezcla de
183 caseínas bovinas (Sigma Aldrich, Co., St. Louis, MO, USA (α, β and κ) a una
184 concentración de 0,5 mg/ml de cada caseína, disueltas en 5 ml de agua destilada. Los
185 extractos de flores secas se maceraron con la mezcla de caseínas, a 2,5 % de extracto
186 (v/v) durante 2 horas, a temperatura ambiente, para permitir la degradación de las
187 caseínas. Después de este tiempo, los extractos junto con las caseínas degradadas fueron
188 desnaturalizados mediante adición de 30 µl de buffer de carga PAGE (Tris-HCl 6,25
189 mM, pH 6,8, glicerol 20 % (p/v), SDS 2 % (p/v), β-mercaptoetanol 5 % (p/v), azul
190 bromofenol 0,025 % (p/v)) e incubación a 99º C durante 5 min. Las condiciones de
191 electroforesis y el método de análisis empleados se describieron en el apartado 2.4.
192
193 2.6. Análisis estadísticos
194 Los análisis estadísticos de los datos fueron llevados a cabo con el programa
195 SPSS para Windows, 15.0. (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Los valores medios de
196 actividad coagulante fueron estudiados mediante análisis de la varianza (ANOVA) de 1
197 vía, y para evaluar si existen diferencias significativas entre los tratamientos ensayados
198 se utilizó el test de Tukey (P ≤ 0,05).
199
200 3. Resultados y Discusión
201 3.1. Influencia de la concentración del extracto
202 La Tabla 3 muestra los resultados obtenidos de actividad coagulante para las
203 diferentes concentraciones ensayadas. Se observa que el valor más bajo de actividad
204 coagulante se encontró para la muestra con la concentración P1, la más baja, con valor
205 de actividad coagulante significativamente inferior al resto de concentraciones
206 ensayadas. Por otra parte, la muestra de cardo A30 a la concentración P6, mostró el
207 mayor valor de actividad coagulante, superior significativamente al resto de las
208 concentraciones ensayadas. Por tanto se observa que un extracto preparado a mayor
202
209 concentración (g flores/ml H2O), tarda menos tiempo en cuajar la leche, es decir,
210 muestra mayor actividad coagulante.
211 Algunos de estos extractos se sometieron a electroforesis capilar, mediante la

212 técnica SDS-PAGE, para analizar el perfil proteico por un lado, y para estudiar su
213 actividad proteolítica por otro lado.
214 En la Figura 1 se observa que las muestras de extracto preparadas con mayor
215 concentración, presentaron un perfil proteico con bandas con mayor intensidad que las
216 muestras de menor concentración. Igualmente, el efecto de la concentración de extracto
217 se refleja en la actividad proteolítica del extracto sobre las caseínas, de forma que los
218 extractos más concentrados degradaron las caseínas con mayor intensidad.
219
220 3.2. Influencia del tiempo de maceración del extracto
221 La Tabla 4 muestra los resultados del ensayo en el que se compara la actividad
222 coagulante de dos extractos, A30 y A49, a tres concentraciones diferentes, en cuatro
223 tiempos de maceración. Para la muestra de cardo A30, a la concentración P1, el mayor
224 valor de actividad coagulante se obtuvo tras 4 horas de maceración, siendo superior
225 significativamente al resto de los tiempos ensayados, mientras que el valor más bajo de
226 actividad coagulante para la concentración P1 se encontró con 2 horas de maceración.
227 Para los extractos preparados a la concentración P4, el mayor valor de actividad
228 coagulante se encontró tras 16 h de maceración, superior significativamente al valor
229 encontrado tras 4 horas de maceración. En cuanto a los extractos preparados a la
230 concentración P6, no se encontraron diferencias significativas para los diferentes
231 tiempos de maceración. Teniendo en cuenta todas las variables, el mayor valor de
232 actividad coagulante para esta muestra de cardo se obtuvo con la concentración P6, tras
233 1 h de maceración, y el menor valor para la concentración P1, tras 2 horas de
234 maceración.
235 Parece que tiene más influencia sobre la actividad coagulante la concentración
236 del extracto que el tiempo de maceración, ya que parece que con alta concentración se
237 obtiene una alta actividad coagulante con menor tiempo de maceración. Para la
238 concentración P4, la actividad coagulante fue la misma con 1, 2 y 4 horas, siendo mayor
239 para 16 h de maceración.
203
240 Para el extracto preparado con la muestra de cardo A49, para la concentración
241 P1, el mayor valor de actividad coagulante se obtuvo tras 4 horas de maceración,
242 superior significativamente al resto de los tiempos ensayados. El mayor valor de
243 actividad coagulante para la concentración P4 se encontró tras 4 horas de maceración,
244 difiriendo significativamente sólo del valor del extracto preparado tras 2 h de
245 maceración. En cuanto a los extractos a la concentración P6, el valor de actividad
246 coagulante fue mayor para el extracto tras 4 h de maceración, diferente de forma
247 significativa al extracto preparado tras 2 h de maceración. Con este extracto,
248 considerando todas las variables ensayadas, se puede decir que el mayor valor de
249 actividad coagulante se encontró para el extracto preparado con la concentración P6 tras
250 4 h de maceración, mientras que el valor más bajo lo presentaron los extractos de P1,
251 tanto a 1 h, como tras 16 h de maceración. Para las tres concentraciones ensayadas, los
252 mayores valores de actividad coagulante se obtuvieron con los extractos preparados tras
253 4 horas de maceración.
254 A la vista de estos resultados se puede afirmar que con 4 horas de maceración de
255 los extractos sería suficiente para obtener alta actividad coagulante, en lugar de 24 h,
256 con lo que se evitan crecimientos microbianos.
257 A través de la Figura 2 se observa la influencia de la concentración de los

258 extractos en la intensidad de las bandas del perfil, siendo los perfiles con mayor
259 intensidad los que corresponden a los extractos más concentrados (P6). En cambio, no
260 se aprecian diferencias en la intensidad de las bandas en base al tiempo de maceración
261 de los extractos. En cuanto a la actividad proteolítica de estos extractos sobre las
262 caseínas, en la Figura 3 se observa diferente degradación de las caseínas para extractos
263 preparados con diferente concentración, sin encontrar diferencias por el tiempo de
264 maceración.
265
266 3.3. Influencia de la cantidad de extracto añadida a la leche
267 En la Tabla 5 se muestran los resultados de la actividad coagulante obtenidos

268 con cuatro cantidades diferentes de extracto que se añade al sustrato de leche, con dos
269 tiempos de maceración, para tres muestras de cardo. Estos extractos se prepararon con
270 la concentración P4 (5 g/100 ml H2O).
204
271 Para un mismo tiempo de maceración se observa que a mayor cantidad de
272 extracto añadida, mayor actividad coagulante, con diferencias significativas entre las
273 cantidades de extracto. Esta afirmación se puede aplicar a las tres muestras de cardo y
274 los dos tiempos de maceración. En este caso parece que ejerce más influencia sobre la
275 actividad coagulante la cantidad de extracto añadida a la leche, que el tiempo de
276 maceración del extracto, de forma que la actividad coagulante de los extractos que se
277 añaden a la misma cantidad fue estadísticamente igual entre sí, a pesar de haberse
278 preparado con diferentes tiempos de maceración. Tan solo los extractos añadidos al 5 %
279 de la muestra A208 fueron significativamente diferentes entre sí.
280
281 3.4. Influencia del estado de maduración de la flor, la localización y el año de

282 recolección.
283 Tras analizar los resultados de actividad coagulante de las muestras de cardo, recogidas
284 en tres años diferentes, tres estados de maduración y varias localizaciones, no se
285 observan diferencias significativas entre los extractos preparados con las muestras para
286 los diferentes años de recolección, los estados de maduración de la flor, ni considerando
287 la localización donde fueron recogidas. Por tanto la actividad coagulante de un extracto
288 no se influenciada por ninguna de estas tres variables, año de recolección, estado de
289 maduración de la flor y localización.
290 En la Figura 5 se muestra el perfil proteico de 4 muestras de extracto, preparadas

291 con la misma concentración, P4 (5 g/100 ml H2O), y el mismo tiempo de maceración, 1
292 hora. Se observa que las diferentes muestras presentan el mismo perfil en cuanto a
293 bandas se refiere, pero no en la intensidad de dichas bandas. Estas diferencias en la
294 intensidad de las bandas de los perfiles proteicos se traducen en diferente actividad
295 proteolítica sobre las caseínas, de modo que los perfiles con bandas más intensas, fueron
296 los más proteolíticos.
297
298 3.5. Influencia del almacenamiento y refrigeración del extracto
299 Tras mantener los extractos acuosos de la muestra A30 (P1, P4, P5 y P6) en
300 refrigeración durante 1 día y 7 días, se analizó la actividad coagulante y se comparó con
205
301 la actividad coagulante obtenida con el extracto recién preparado. Los resultados se
302 muestran en la Tabla 8.
303 Para la concentración P1, la actividad coagulante de los extractos fue

304 significativamente inferior tras 1 día en refrigeración, respecto al extracto recién
305 preparado y tras 7 días refrigerado. Sin embargo, para la concentración P5, el extracto
306 que mostró mayor actividad coagulante fue el que estuvo 1 día refrigerado, diferente
307 significativamente al resto, mientras que la actividad coagulante más baja se encontró
308 para el extracto recién preparado. Con las concentraciones del extracto, P4 y P6, se
309 observa que la actividad coagulante del extracto aumenta con el tiempo de refrigeración,
310 existiendo diferencias significativas entre los extractos.
311 Por tanto parece que la actividad coagulante de los extractos no se reduce al
312 mantenerlos en refrigeración al menos durante 7 días, pudiendo observar incluso un
313 incremento en la actividad coagulante.
314 Tavaira y col. (2001) estudiaron los efectos del almacenamiento y liofilización
315 de los extractos de Cynara cardunculus en la degradación de caseínas ovinas y caprinas.
316 Observaron que la actividad coagulante tiende a disminuir con el tiempo de
317 almacenamiento, de forma que extractos frescos, almacenados a 4º C mostraron una
318 disminución del 65 % de su actividad coagulante tras 4 semanas, con una pérdida del 22
319 % en la segunda semana. Afirman que la actividad proteolítica sobre α- y β-caseína
320 aumentaba tras 1 semana en refrigeración y disminuía entre la semana 1 y 2 de
321 almacenamiento.
322
323 Referencias
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349 of extracts of Cyanra cardunculus on the degradation of ovine and caprine
350 caseins. Food chemistry, 72, 79 – 88.
351
352
353
207
354 Figura 25. Perfil proteico y actividad proteolítica sobre caseínas de tres muestras de
355 extracto preparados a partir de la muestra A30, a diferentes concentraciones.
356 Figura 26. Perfiles proteicos de extractos de las muestras de cardos A49 y A30,
357 preparados a dos concentraciones diferentes, P4 y P6, y con dos tiempos de maceración
358 diferentes, 1 y 2 horas.
359 Figura 27. Actividad proteolítica de extractos de las muestras de cardos A49 y A30,
360 preparados a dos concentraciones diferentes, P4 y P6, y con dos tiempos de maceración
361 diferentes, 1 y 2 horas.
362 Figura 28. Actividad coagulante del extracto preparado con las muestras A30, A206 y
363 A208 con diferentes cantidades y tiempos de maceración.
364 Figura 5. Perfil proteico y actividad proteolítica de extractos de diferentes muestras de

365 cardo, preparados a la misma concentración y mismo tiempo de maceración.
366
208
Tabla 1. Identificación de las muestras de Cynara cardunculus empleadas en este estudio.
Código Año Estado maduración Localización

A23 2006 b Puebla de la Calzada
A27 2006 b Berlanga
A28 2006 b Berlanga
A30 2006 b Sancha Brava
A36 2006 b Montijo - La Nava de S.
A38 2006 b La Albuera
A40 2006 b Sta. Marta - Solana
A42 2006 b Cruce de Montijo
A35 2006 b Montijo - La Nava de S.
A44 2006 b Mérida - Madrid, km 300
A83 2007 a Sancha Brava
A85 2007 c Sancha Brava
A126 2007 b Ctra. Mérida - Madrid
A129 2007 b Ctra. Mérida - Madrid
A116 2007 a Cruce de Montijo (Ctra. CC)
A117 2007 b Cruce de Montijo (Ctra. CC)
A118 2007 c Cruce de Montijo (Ctra. CC)
A119 2007 a Cruce de Montijo (Ctra. CC)
A120 2007 b Cruce de Montijo (Ctra. CC)
A206 2007 b DO Torta del Casar
A141 2008 b Quesería El Castúo, Cáceres
A142 2008 b Quesería El Castúo, Cáceres
A147 2008 b Finca La Orden, Guadajira
A148 2008 c Finca La Orden, Guadajira
A169 2008 b Mérida. Autovia A-V. Cáceres.
367 A170 2008 c Mérida. Autovia A-V. Cáceres.
209
368 Tabla 15. Concentraciones de flores de cardo en agua empleadas para la preparación de los
369 extractos
Código Flores secas picadas (g)/100 mL H2O
P1 0,65
P2 1,5
P3 2,5
P4 5
P5 7
P6 10
370
371 Tabla 16. Actividad coagulante de las muestras de cardo A30, a diferentes concentraciones.
Muestra Concentración Actividad coagulante (R.U./ml)
P1 0,65 g/100 ml H2O 0,065 ± 0,005 a
P2 1,5 g/100 ml H2O 0,132 ± 0,003 b
P3 2,5 g/100 ml H2O 0,208 ± 0,036 c
P4 5 g/100 ml H2O 0,300 ± 0,003 d
P5 7 g/100 ml H2O 0,377 ± 0,017 e
P6 10 g/100 ml H2O 0,604 ± 0,060 f
a
372 Valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente (P<0,05).
373
374
375
376
377
378
210
379 Tabla 17. Actividad coagulante de dos muestras de cardo, a tres concentraciones diferentes, y
380 con cuatro tiempos de maceración.
381
Tiempo A30 A49
maceración (h) P1 P4 P6 P1 P4 P6
0,059 0,490 1,627 0,044 0,366 1,627

1
±0b ± 0,004 ab ± 0,050 a ± 0,003 a ± 0,052 ab ± 0,050 ab
0,051 0,485 1,511 0,054 0,285 0,570

2
± 0,001 a ± 0,007 ab ± 0,058 a ± 0b ± 0,002 a ± 0,014 a
0,083 0,467 1,054 0,075 0,480 1,992

4
± 0d ± 0,025 a ± 0,139 a ± 0,001 c ± 0,080 b ± 0,069 b
0,061 0,588 0,885 0,045 0,441 0,920

16
± 0,002 c ± 0,006 b ± 0,009 a ± 0,001 a ± 0,079 ab ± 0,008 ab
a
382 Valores en la misma columna seguidos de la misma letra no difieren
383 significativamente (P<0,05).
384
211
385 Tabla 18. Actividad coagulante (R.U./ml) de tres muestras de cardo diferentes, con dos tiempos
386 de maceración distintos, y cuatro cantidades de extracto.
Tiempo Cantidad
A30 A206 A208
maceración (h) (%)
0,5 0,032 ± 0,004 a 0,041 ± 0,002 a 0,041 ± 0,003 a

1 0,061 ± 0,008 a 0,048 ± 0,012 a 0,064 ± 0,004 b
24
3 0,239 ± 0,083 bc 0,189 ± 0,136 ab 0,135 ± 0,018 c
5 0,247 ± 0,043 bc 0,296 ± 0,187 b 0,180 ± 0,002 d
0,5 0,030 ± 0,003 a 0,029 ± 0,002 a 0,044 ± 0,016 a
1 0,057 ± 0,015 a 0,041 ± 0,004 a 0,050 ± 0,003 ab
0,5
3 0,182 ± 0,001 b 0,174 ± 0,002 ab 0,120 ± 0 c
5 0,284 ± 0,002 c 0,283 ± 0,002 b 0,213 ± 0,001 e
a
387 Valores en una misma columna, seguidos por la misma letra no difieren
388 significativamente (P<0,05).
389
390
391 Tabla 19. Actividad coagulante de los extractos recogidos en los diferentes años y en los
392 distintos estados de maduración de la flor.
Año RU/ml Estado maduración RU/ml
2006 0,153 ± 0,038 a 0,175 ± 0,032
2007 0,183 ± 0,061 b 0,165 ± 0,056
2008 0,162 ± 0,046 c 0,162 ± 0,038
393
394
395
396
397
398
212
399 Tabla 20. Actividad coagulante de los extractos recogidos en diferentes localizaciones.
Localización RU/ml
Sancha Brava 0,200 ± 0,060
Cáceres 0,193 ± 0,039
Balboa –Talavera 0,150 ± 0,022
Ctra. Madrid - Mérida 0,141 ± 0,039
La Albuera 0,162 ± 0,036
La Orden - Guadajira 0,195 ± 0,069
Cruce Montijo 0,181 ± 0,059
Berlanga 0,171 ± 0,027
Montijo – La Nava S. 0,138 ± 0,068
400
401 Tabla 21. Actividad coagulante de extractos sin refrigerar y tras refrigeración durante 1 y 7 días.
Recién preparado 1 día en refrigeración 7 días en refrigeración

C2006
(R.U./ml) (R.U./ml) (R.U./ml)
P1 0,065 ± 0,005 b 0,050 ± 0,005 a 0,062 ± 0 b
P4 0,300 ± 0,003 a 0,721 ± 0,005 b 0,851 ± 0,014 c
P5 0,377 ± 0,017 a 1,516 ± 0,037 c 0,711 ± 0,015 b
P6 0,604 ± 0,060 a 0,903 ± 0,018 b 1,311 ± 0,118 c
a
402 Valores en una misma fila, seguidos por la misma letra no difieren significativamente
403 (P<0,05).
404
405
213
406 Figura 1.
M P5 (70g/L) P4 (50g/L) P2 (15g/L) 97 M Control P5 (70g/L) P4 (50g/L) P2 (15g/L)

97 84
84 66
66 55
55 45
36
45
36
29
29 24
24
20
20
14,2 14,2
6,5 6,5
407
408
409 Figura 2.
M P4 A49 P4 A49 P6 A49 P6 A49 P4 A30 P4 A30 P6 A30 P6 A30

1 hora 2 horas 1 hora 2 hora 1 hora 2 horas 1 hora 2 horas
97
84
66
55
45
36
29
24
20
14,2
6,5
410
411
412
413
414
415
214
416 Figura 3.
M Control P4 A49 P4 A49 P6 A49 P6 A49 P4 A30 P4 A30 P6 A30 P6 A30

1 hora 2 horas 1 hora 2 horas 1 hora 2 horas 1 hora 2 horas
84
66
55
45
36
29
24
20
14,2
6,5
417
418 Figura 4.
419
420
421
215
422
423
424
425
426
216
427 Figura 5.
428
M A30 A23 A28 A50 M Control A30 A23 A28 A50

97
97 84
84 66
66 55
55 45
36
45
36
29
29 24
24
20
20
14,2 14,2
6,5 6,5
429
430
431
432
217
IV.2. CAPÍTULO II
En este capítulo, que aborda el objetivo 2 de este trabajo, se estudia la influencia de los
diferentes años de recolección, y los estados de maduración de la flor de Cynara
cardunculus, en el momento de su recolección, sobre las características sensoriales de
los quesos elaborados. Para llevar a cabo este estudio se emplearon técnicas basadas en
perfiles de proteínas. Se elaboraron quesos tipo “Torta del Casar” con 16 muestras de
cardo (C. cardunculus) seleccionadas por sus características tecnológicas. Este capítulo
consta del arículo:
IV.2.1. Technological characterisation by free zone capillary electrophoresis

(FZCE) of the vegetable rennet (Cynara cardunculus) used in “Torta del Casar”
cheese-making
Food Chemistry, 133, 227-235
219
Food Chemistry 133 (2012) 227–235
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Food Chemistry
journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchem
Analytical Methods
Technological characterisation by free zone capillary electrophoresis (FCZE)

of the vegetable rennet (Cynara cardunculus) used in ‘‘Torta del Casar’’
cheese-making
Elena Ordiales b, Alberto Martín a,⇑, María José Benito a, Alejandro Hernández a, Santiago Ruiz-Moyano a,
María de Guía Córdoba a
a
Nutrición y Bromatología, Escuela de Ingenierías Agrarias, Universidad de Extremadura, Ctra. de Cáceres s/n, 06071 Badajoz, Spain
b
Agricultura, Centro Tecnológico Agroalimentario Extremadura (CTAEX), Ctra. Villafranco a Balboa Km. 1,2, Villafranco del Guadiana, 06080 Badajoz, Spain
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: The purpose of this work was to develop a procedure based on protein analysis by free zone capillary
Received 10 August 2011 electrophoresis (FZCE) that can be used as an alternative to other methods in the determination of the
Received in revised form 2 December 2011 technological quality of vegetable rennet to use in ‘‘Torta del Casar’’ cheese-making. Samples of cardoon
Accepted 10 January 2012
flowers (Cynara cardunculus) grouped according to location, harvest year, and ripening stages were used
Available online 17 January 2012
in the study. For the FZCE, a protocol for extracting the methanol-soluble proteins was tested. This
method was found to give good repeatability of the corrected migration time (CMT), and showed higher
Keywords:
effectiveness in discriminating the technological properties (milk-clotting and casein degradation activ-
Cynara cardunculus
Technological characterisation
ities) of vegetal rennets than the SDS–PAGE technique. In addition, three peaks found in the FZCE electro-
Protein profile pherograms were examined as a good tool to predict the impact of vegetable rennet on the creaminess
FZCE and overall acceptability of the ‘‘Torta del Casar’’ cheese.
Cheese Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction sin. This aspect is suited to the manufacture of soft-bodied cheeses

often associated with bitter tastes and relatively low yields, such as
‘‘Torta del Casar’’ is a high quality Spanish cheese marketed un- ‘‘Torta del Casar’’ (Tavaria, Sousa, & Malcata, 2001).
der the Registry of the Protected Designation of Origin ‘‘Torta del However, traditional aqueous extracts are made from flowers of
Casar’’ (Casar de Cáceres, Cáceres, Spain) in accordance with the diverse C. cardunculus varieties harvested at different flower ripen-
Regulation (CE) (1491/2003) of the European Commission. This ing stages and mixed with other parts of the plant. In addition, the
cheese is produced in the Extremadura region, in the south-west milk clotting activity of the flowers shows great variability mainly
of Spain, and it is characterised by its soft and buttery texture, related to the drying conditions (Martins, Vasconcelos, & Sousa,
yellowish-coloured paste, intense flavour, and its peculiar, slightly 1996). This great heterogeneity of the rennet used in ‘‘Torta del
bitter taste. It is made from whole raw ewe’s milk by enzymatic Casar’’ manufacture has a negative influence on the cheese quality
clotting using as coagulant an aqueous extract of dried wild car- parameters, including low yield, lack of homogeneity of relevant
doon (Cynara cardunculus) flowers (Macedo, Faro, & Pires, 1993). sensorial factors between batches, etc., that it can lead to signifi-
Aqueous extracts of cardoon flowers have been used for centu- cant economic losses. Thus, the development of a method for the
ries as rennets in traditional ewe’s milk cheesemaking in the quality control of the aqueous extracts used as rennet would be
Iberian Peninsula (Roseiro, Barbosa, Ames, & Wilbey, 2003). Flow- desirable for standardisation of the cheese-making process.
ers of C. cardunculus contain aspartic proteinases named cardosins A protein profile study is suitable for this purpose. Various
or cynarases (Brodelius, Cordeiro, & Pais, 1995; Heimgartner et al., works have described methods based on protein patterns to con-
1990; Silva & Malcata, 1999). These enzymes are similar, in terms trol food quality (Bietz, 1994; Cancalon, 1995; Hernández, Martín,
of specificity and activity, to chymosin and pepsin (Pires et al., Aranda, Bartolomé, & Córdoba, 2007; Serradilla et al., 2008).
1994; Veríssimo, Esteves, Faro, & Pires, 1995), although the prote- Analyses of proteins in these complex mixtures are presently per-
olytic activity of cynarases appears to be less specific than chymo- formed mainly by sodium dodecylsulfate (SDS)–polyacrylamide
gel electrophoresis (SDS–PAGE) and reversed-phase high perfor-
⇑ Corresponding author. Tel.: +34 924 286200; fax: +34 924 286201. mance liquid chromatography (RP-HPLC). However, this technique
E-mail address: [email protected] (A. Martín). involves many manual steps, including gel preparation in gel
URL: http://eia.unex.es (A. Martín). molds, setting the gel molds in an electrophoresis apparatus,
0308-8146/$ - see front matter Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.foodchem.2012.01.012
228 E. Ordiales et al. / Food Chemistry 133 (2012) 227–235
sample injection, removal of gels from the molds, staining and 2.2. Milk-clotting activity assay
destaining of the gels, etc. (Bietz, 1994). To quantify the stained
proteins, further manual steps are required for the densitometry For milk-clotting assays, 0.5 g of each cardoon sample was soft-
or image analysis of the stained gel. Capillary electrophoresis ened in 75 mL of ultrapure water for 1 and 24 h. The rennet clot-
(CE) may be used as an alternative method since it offers several ting time of these coagulant extracts was measured according to
advantages over SDS–PAGE, such as more rapid analysis, detection, a standard method (NILAC™; NIZO, Ede, The Netherlands) de-
on-column quantification, and increased efficiency and resolution scribed by Tavaria et al. (2001). The substrate was prepared by dis-
(Cancalon, 1995; Manabe, 1999). In addition, CE methods involve solving 12 g of low-heat bovine skimmed milk powder in 100 mL
a simple extraction of proteins and small quantities of organic sol- of 0.01 M CaCl2 (pH 6.5) at 30 °C. The enzymatic assay was per-
vents in comparison with RP-HPLC. A subset of CE called free zone formed using 0.2 mL of coagulant extract added to 2 mL of recon-
capillary electrophoresis (FZCE) has been applied to the analysis of stituted skim milk, and the clotting time was determined by
complex protein systems. In the last decade, CE has proved to be an visual inspection. One rennet unit (R.U.) was defined as the amount
efficient separation technique for the analysis of food proteins in of crude enzyme extract needed to coagulate 10 mL of reconsti-
general (Recio, Ramos, & López-Fandiño, 2001) and milk proteins tuted low-heat processed skim milk at 30 °C in 100 s (FIL-IDF
in particular (Recio, Amigo, & López-Fandiño, 1997). In fact, CE 157/1992). Determinations were quadruplicated, and the mean of
has been applied to monitoring proteolysis in cheese (Otte, Ardö, each set of four data was taken as the datum point.
Weimer, & Sorensen, 1999), mainly in bovine cheese, but also in
ewe and goat cheeses (Cattaneo, Nigro, Toppino, & Denti, 1996). 2.3. ‘‘In vitro’’ casein proteolytic activity
Moreover this technique has been used to study the proteolysis
of cheese produced with Cynara L. as coagulant (Roseiro, The dried flower extracts were prepared by macerating 0.25 g of
Gómez-Ruiz, García-Risco, & Molina, 2003). Thus, FZCE might be dried flowers in 5 mL of water (corresponding to a proportion of
useful for the quality control of the extract used as rennet in ‘‘Torta 50 g in 1 L) at room temperature for 4 h. The homogenate was fil-
del Casar’’ manufacture. tered through a Whatman filter paper No. 4. The substrate used for
The aim of this work was to develop a procedure based on pro- degradation by the extracts consisted of a mix of bovine caseins
tein profile analysis that can be used to control the technological (Sigma Aldrich, Co., St. Louis, MO, USA) (a, b, and j), at a concen-
quality of aqueous extracts used as rennet in ‘‘Torta del Casar’’ tration of 0.5 mg/mL of each casein, dissolved in 5 mL of distilled
manufacture. water. The dried flower extracts were macerated with the casein
mix, at 2.5% of extract (v/v), for 2 h at room temperature to allow
2. Materials and methods casein degradation. After this time the extracts with degraded
caseins were denatured by adding 30 lL of SDS–PAGE loading buf-
2.1. Plant material and rennet extract preparation fer (62.5 mM Tris–HCl, pH 6.8, 20% (w/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 5%
(w/v) b-mercaptoethanol, 0.025% (w/v) bromophenol blue) and
Samples of cardoon (C. cardunculus, L.) used in this study were incubated at 99 °C for 5 min.
identified previously in accordance with the guidelines of Valdés, The electrophoresis conditions were those described by Lae-
Talavera, and Fernández-Galiano (1987). They were collected from mmli (1970), and the concentrations of acrylamide (29:1 acrylam-
six locations during the seasons of the years 2007 and 2008, and ide/bisacrylamide) in the gels were 4% (w/v) for stacking gels and
grouped into 3 different ripening stages in accordance with the 15% (w/v) for separating gels. Gels were cast and run in a Minipro-
cardoon flower’s phenological characteristics (Table 1), ripening tean III device (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). The molecular
stage a (flowers opening, only some styles, and stigmas are visible), mass marker kits (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) contained pro-
b (flowers fully open, even with pollen) and c (flowers begin to dry, teins from 6.5 to 205 kDa. The gels were subsequently stained with
so they are brownish, instead of violet colour). The collected flow- 0.5% (w/v) Coomassie blue (G-250) dissolved in 45% (v/v) water,
ers were dried and kept in a cool dry place until use. 45% (v/v) methanol, and 10% (v/v) acetic acid for 30 min, and de-
stained with a solution consisting of 20% (v/v) methanol, 10% (v/
Table 1 v) acetic acid, and 70% (v/v) distilled water for 4 h. A computer im-
Sample information of cardoon flowers used to prepare the vegetable rennets.
age analysis program (Genetools, Synoptics Ltd., Cambridge, UK)
Sample Maturation stageA Year LocalizationB was used for the densitometric analysis of the gel electrophoreses.
M1 b 2007 L2 Ctra. Mérida – Madrid
M2 a 2007 L3 La Albuera 2.4. Extraction of proteins from coagulant extracts for SDS–PAGE and
M3 b 2007 L2 Ctra. Mérida – Madrid CE analysis
M5 b 2008 L4 Mérida. Autovia A-V. Cáceres
M6 c 2007 L6 Sancha Brava For SDS–PAGE analysis, the proteins were directly extracted
M7 b 2008 L1 Canal de Balboa after a filtering step from the same coagulant extracts used for
M8 c 2007 L6 Sancha Brava in vitro casein proteolytic activity assays. Direct extraction of car-
M9 c 2007 L3 La Albuera doon samples with water may lead to components other than pro-
M10 c 2008 L1 Canal de Balboa
teins being removed, and the consequent poor resolution of the
M12 a 2007 L3 La Albuera FZCE. In particular, plant extracts may also contain compounds
M13 c 2007 L5 Puebla de la Calzada such as polysaccharides, polyphenols, anthocyanin, tannins, DNA,
M14 b 2008 L4 Mérida. Autovia A-V. Cáceres. free amino acids, and sugars that could potentially bind to the in-
ner walls of the silica capillaries (Bean & Lookhart, 2001). Hence, a
M16 b 2008 L4 Mérida. Autovia A-V. Cáceres.
pre-extraction step was included, mixing 1 g of cardoon with
A
a, flower is opening, only some styles and stigmas are visible; b, flower fully methanol (3:10 w/v) for 5 min at room temperature. Longer
open, even with pollen; c, flower begins to dry, so some styles and stigmas are
extraction times did not improve the effectiveness of the extrac-
brownish.
B
Geographic coordinates: L1: 38°540 8,8200 N 6°430 59,900 W, L2: 38°500 34,800 N
tion. The suspension vortexed periodically, centrifuged at 5800g
6°570 39,7300 W, L3: 38°450 6,7300 N 6°480 10,4200 W, L4: 38°570 0,3000 N 6°160 53,0300 W, L5: for 5 min, and the supernatant was collected. From an aliquot of
38°530 59,9400 N 6°510 12,4300 W, L6: 38°560 32,7800 N 6°200 23,1600 W, L7: 38°540 23,5400 N 0.5 mL, methanol-soluble proteins were partially precipitated
6°470 3700 W. (except for the most of the apolar protein fraction) with chloroform
E. Ordiales et al. / Food Chemistry 133 (2012) 227–235 229
(1:2 v/v) and centrifuged at 24,000g for 5 min. The pellets were ewe’s milk to which no starter cultured was added. Each batch
cleansed twice with chloroform, and the pigment-free pellets were was clotted using a C. cardunculus L. rennet, corresponding to the
collected and then suspended in 100 lL of 30% (v/v) acetonitrile samples listed in Table 1. The aqueous extracts from the cardoon
according to the protocol described by Hernández, Martín, Aranda, C. cardunculus L. were prepared from 50 g of dried flowers in 1 L
Bartolomé, and Córdoba (2006). of water, leaving them to macerate for 24 h, and adding 10 mL of
Cardosins standards have been purified from C. cardunculus this extract per litre of milk at 28–30 °C, for each 32 L batch. After
flowers according to Sidrach, García-Canovás, Tudela, and Rodrí- pressing, the cheeses were immersed in a salt solution (16% (w/v)
guez-López (2005) with some modification. Stigmas (100 g) were NaCl) for 4 h. The ripening took place at a temperature of 5–10 °C
ground in a food mixer and homogenised in 800 mL 50 mM aque- and relative humidity of 85–90% throughout the ripening period of
ous citrate buffer (pH 3.0), containing 1 M NaCl to prevent non-spe- 60 days. Three cheeses of each batch were randomly taken for
cific proteinase binding to the filter membrane in the following analysis after 60 days of ripening.
ultrafiltration step. The ground homogenate was filter through
muslin to remove most of the solid residue. After centrifugation 2.7. Sensory evaluation
of the homogenate at 24,000 rpm for 20 min, the supernatant was
filtered through a Whatman filter paper No. 4. The resulting solu- Eighteen panelists previously selected and trained under ISO
tion constituted the crude extract, which was concentrated and dia- standards (UNE-ISO 4121-2006) with samples of ‘‘Torta del Casar’’
lysed by ultrafiltration (Pellicon XL PXB010A50, Millipore) against were asked to characterise the sensory quality of the batches se-
25 mM Tris–HCl buffer, pH 7.6. This concentrated solution was di- lected according to the protein profile of the cardoon used for the
rectly loaded in a Q-Sepharose Fast Flow column equilibrated with clotting stage. The cheeses were cut into slices of approximately
25 mM Tris–HCl buffer, pH 7.6 coupled to FPLC system equipped 5 mm thickness. The slices were equilibrated for 30 min at room
with a UV detector at 214 nm and a fraction collector FRAC-950 temperature before serving. Descriptive analyses were made
(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). After sample according to international standard methods. Twenty-four parame-
application, the enzymes were displaced with step gradients of ters related to colour, appearance, texture, taste, odour, and flavour
0.30, 0.35, and 0.5 M NaCl in the previous buffer. The fractions that were assessed using a structured line scale with intensity descrip-
contain the cardosins were collected. Before FCZE analysis, cardosin tors at the end points (1, low; 10, high). Samples were three-digit
fractions were concentrated and dialysed by ultrafiltration (Pell- coded and the order of serving was determined by random permu-
icon-2 PLCGC10, Millipore Corp.) against ultrapure water. tation. Two panel replicates were carried out on each sample. The
response to each indicator was taken as the mean of the panelistś re-
2.5. SDS–PAGE and FZCE analysis of coagulant extract proteins sponses. In addition to the descriptive test, a panel of 17 untrained
consumers evaluated the samples for overall acceptability.
The SDS–PAGE analysis of the rennet extract proteins was per-
formed under the above conditions for the casein proteolytic activ-
2.8. Statistical analysis
ity determination. For the FZCE analysis, the protein extracts were
previously filtered through a 0.2 lm filter. The separations were
Statistical analysis of the data was carried out using SPSS for
done on an automated PACE 5500 device (Beckman Instrument,
Windows, 15.0. (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Mean values of
Inc., Palo Alto, CA, USA). To minimise the interaction of proteins
the technological and analytical parameters (FZCE peaks or SDS–
with the column wall, basic pH values were chosen to make the
PAGE bands) were studied by one-way analysis of variance
run buffer. Run buffer was prepared with HPLC-grade water ob-
(ANOVA) and separated by Tukey’s honest significant differences
tained from a Milli-Q water purification system, and consisted of
test (P 6 0.05). The relationships between the technological
20.6 mM tetraborate, 8.75 mM phosphate at a nominal pH of 9 with
parameters and FZCE peak area or SDS–PAGE band intensity values
20% of acetonitrile. Uncoated fused silica capillaries of 75 lm i.d.
were evaluated by Pearson correlation coefficients. A principal
and 57 cm total length (50 cm to window detector) were used
component analysis (PCA) was performed on the analytical param-
(Supelco, Tecknocroma, Barcelona, Spain). The capillary was ini-
eters and sensorial data to study the relationships between the
tially conditioned with 100 mM NaOH for 10 min, and then with
protein profiles of the vegetable rennet and the sensory quality
de-ionised water for 5 min. They were rinsed between separations
of the cheeses. The efficiency of the selected analytical parameters
for 2 min with 20 mM NaOH, for 2 min with de-ionised water, and
(FZCE peaks or SDS–PAGE bands) as quality control markers of the
then with separation buffer for 2 min. When not in use, the capillar-
rennet was evaluated by Pearson correlation coefficients, and ver-
ies were rinsed with 100 mM NaOH for 10 min, followed by water
ified by linear regression analysis.
for 10 min, and finally dried by nitrogen gas for 10 min. The separa-
tion voltage was 263 V/cm (15 kV) and the separation temperature
was 23 °C. The wavelength used to monitor the assays was 214 nm. 3. Results and discussion
Samples were injected under pressure (0.5 psi) for 5 s and the pro-
tein spectra were monitored from 190 to 300 nm with a PACE diode 3.1. FZCE and SDS–PAGE comparison
array detector (Beckman Instrument Inc., Palo Alto, CA, USA). For
the determination of the analytical parameters, a negative acetoni- To explore the potential of the FZCE method to control the tech-
trile peak visualised at 254 nm was used to normalise peak areas nological quality of aqueous extracts, the analytical parameters
and to calculate the corrected migration times (CMTs) of the peaks. were evaluated and compared with those of the SDS–PAGE
For comparison of CZE profiles, protein peaks were characterised technique.
using corrected migration times and UV absorbance spectra. The Aqueous extract from sample M1 were used to evaluate the
Beckman P/ACE Station (Version 1.21) software package was used FZCE analysis for methanol-soluble proteins. The resolution and
to store, manipulate, and compare the electropherograms. migration times for methanol-soluble proteins were appropriate
for use with the FZCE protocol proposed (Fig. 1). The proteins were
2.6. ‘‘Torta del Casar’’ cheese-making procedure resolved in 20 min and separated into 18–22 well-defined peaks
and shoulders. Only the 10 most relevant peaks were studied. With
A total of 16 different batches of ‘‘Torta del Casar’’ were manu- respect to the analytical parameters, the FZCE method was found
factured, of 10 cheeses each batch, from unpasteurised Merino to give good repeatability of the CMT with coefficients of variation
B Profileheight
140
130
120
110
100
90
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Rf distancedowntrack
Fig. 1. Electropherogram of methanol-soluble proteins (A) and densitogram of aqueous extract proteins of dried Cynara cardunculus flowers (B).
(RSD%; n = 5) of <2% for most of the proteinaceous compounds ana- These results showed that the proposed FZCE protocol for meth-
lysed. According to CMT, the purified cardosins A and B are in- anol-soluble protein assay is a potentially useful method for mon-
cluded in the peak 4 (Fig. 1). However, others peak such as 3, 6, itoring the technological quality of the aqueous extracts used as
and 7 could correspond to cardosins with different charge due to rennet in ‘‘Torta del Casar’’ manufacture.
different glycosylation levels (Sidrach et al., 2005). In fact, these With respect to SDS–PAGE, the densitograms showed a total of
mentioned peaks showed both symmetries and absorbance spectra 9 different polypeptide bands with an approximate molecular
similar to the purified cardosins. mass in the range 13.5–66.2 kDa (Fig. 1). The step of protein
Table 2
Clotting and casein proteolysis activities of vegetable rennets obtained from cardoon flowers grouped according to maturation stage, location, and harvest year.
Sample grouping Clotting activity (R.U./ml) after maceration % Degradation of the SDS–PAGE bands
1h 24 h a-Caseins b-Casein j-Casein
Mean ± SDA Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD
Maturation stageB
a 0.142 ± 0.032 0.173 ± 0.081 64.92 ± 35.29 41.72 ± 36.71 53.51 ± 38.83
b 0.131 ± 0.025 0.164 ± 0.024 93.16 ± 6.72 77.07 ± 13.85 75.90 ± 23.14
c 0.160 ± 0.027 0.271 ± 0.151 79.06 ± 16.96 44.70 ± 25.02 52.29 ± 38.71
PC 0.188 0.201 0.124 0.055 0.431
LocationB
1 0.141 ± 0.037 0.182 ± 0.036 91.42 ± 4.50 62.28 ± 7.54 89.09 ± 1.65
2 0.133 ± 0.024 0.149 ± 0.019 98.51 ± 2.01 79.63 ± 5.64 99.10 ± 1.40
3 0.158 ± 0.031 0.217 ± 0.119 71.88 ± 27.34 53.22 ± 30.53 41.28 ± 32.17
4 0.118 ± 0.020 0.159 ± 0.009 90.23 ± 6.42 78.53 ± 20.22 55.04 ± 1.45
6 0.169 ± 0.017 0.347 ± 0.171 80.37 ± 17.99 38.33 ± 7.65 77.42 ± 26.14
P 0.303 0.326 0.447 0.203 0.059
Year
2007 0.154 ± 0.026 0.233 ± 0.134 77.60 ± 23.30 49.12 ± 29.30 58.06 ± 38.64
2008 0.127 ± 0.027 0.168 ± 0.023 90.71 ± 5.10 72.03 ± 17.26 68.66 ± 18.69
P 0.076 0.311 0.242 0.130 0.547
A
SD, standard deviation.
B
Maturation stage and location: as in Table 1.
C
P-values.
Table 3
Results of the relevant FZCE peaks and SDS–PAGE bands of the vegetable rennets studied at different maturation stages, and correlations with technological properties.
StageA Correlation
a b c P Clotting activity (R.U.) after maceration Degradation of caseins
1h 24 h a-Caseins b-Casein j-Casein
FZCE
p1 15.82B 11.11 17.52 0.364 0.082 0.28 0.131 0.287* 0.032
p2 63.02 61.50 71.82 0.883 0.029 0.149 0.075 0.238 0.119
p3 + 4 219.59 426.15 420.36 0.420 0.428** 0.211 0.052 0.227 0.299*
p5 23.00 106.09 56.93 0.219 0.278 0.316 0.089 0.232 0.17
p6 111.57 221.18 143.29 0.510 0.419** 0.151 0.227 0.464** 0.018
p7 26.62 57.99 88.12 0.755 0 0.175 0.13 0.191 0.237
p8 13.94 33.83 97.07 0.603 0.007 0.145 0.029 0.097 0.183
p9 23.75b 224.56a 32.40b 0.032 0.134 0.28 0.173 0.473** 0.113
p10 75.22 128.83 100.04 0.913 0.141 0.068 0.234 0.229 0.413**
Total 572.52 1271.23 1027.54 0.355 0.31 0.039 0.234 0.468** 0.375
SDS–PAGE
b1 (66.2 kDa) 0.00C 2.24 0.87 0.282 0.15 0.312 0.302 0.421** 0.229
b2 (60.2 kDa) 6.26 10.62 6.02 0.359 0.34 0.204 0.14 0.25 0.054
b3 (37.3 kDa) 0.00 1.77 1.04 0.599 0.226 0.232 0.142 0.224 0.211
b4 (32.0 kDa) 17.83a 5.92b 3.64b 0.010 0.247 0.044 0.093 0.126 0.079
b5 (30.2 kDa) 33.88 21.98 18.75 0.133 0.284 0.022 0.108 0.161 0.137
b6 (28.3 kDa) 38.14 45.32 37.40 0.560 0.233 0.334 0.297 0.182 0.092
b7 (20.7 kDa) 0.00 5.18 2.14 0.345 0.029 0.283 0.288 0.502** 0.272
b8 (16.7 kDa) 0.00 3.08 5.96 0.254 0.493** 0.486** 0.17 0.001 0.188
b9 (13.5 kDa) 13.10 13.81 9.03 0.357 0.167 0.039 0.196 0.015 0.133
A
Maturation stage: as in Table 1.
B
FZCE peak area.
C
SDS–PAGE band intensity.
*
P < 0.05.
**
P < 0.01.
precipitation by chloroform in the methanol soluble protein also a priori be considered as a potentially useful tool for character-
extraction procedure for the CZE analysis involved a loss of most ising the technological properties of this vegetable rennet.
of the apolar protein fraction with respect to the whole protein ex-
tract used in the SDS–PAGE analysis. Hence, the resolution of more 3.2. Milk-clotting and proteolytic activities of the aqueous extracts and
proteins by CE than by PAGE may be attributed to the method. their relationship with the CE and SDS–PAGE profiles
Although less effectiveness of this technique than the FZCE in dis-
criminating vegetable varieties has been described (Cancalon, Table 2 lists the milk-clotting and proteolytic activities of the
1995; Hernández et al., 2006; Manabe, 1999), in our study there aqueous extracts from the cardoon samples studied at different
were relevant differences in the overall polypeptide profiles of stages, locations, and years of harvest. The value ranges of
the proteins from the 16 samples of aqueous extract studied. milk-clotting are 0.118–0.169 and 0.149–0.347 RU/ml for 1 and
Therefore, the analysis of proteins of cardoon by SDS–PAGE could 24 h of maceration, respectively. Tavaria et al. (2001) reported
1
A
0.8 p3+4
Acceptability Juiciness
Viscosity Creaminess
0.6 Elastic
Yellow
p7
16.7 kDa
Component 2 (17.17 %)
p8 Spreadability
0.4
p5 Creamy
0.2 No holes p10 20.7 kDa
13.5kDa
p2 O-Acid
p9 p6 37.3 kDa F-Intensity
0 Bitter
20.7kDa Salty F-Ewe's milk F-Persistence
O-Ewe's milk p1 T-Acid
Firmness Astringent
66.2kDa
-0.2 O-Rancid Af tertaste
Pungent
-0.4
28.3 kDa
Unpleasant
-0.6 F-Rancid
13.5 kDa
32 kDa
-0.8 60.2 kDa
30.2 kDa
-1
-1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
B 1
0.8 66.2 kDa
p6 Salty
20.7 kDa
0.6
p5 37.3 kDa T-Acid
Unpleasant Bitter
0.4 p9
p10 F-Intensity
O-Acid
O-Rancid Af tertaste Pungent
Astringent
0.2 Yellow O-Ewe's milk F-Rancid
Firmness 13.5 kDa p3+4 F-Persistence
p7 p8 F-Ewe's milk
0
No holes 16.7 kDa
60.2 kDa Juiciness Creaminess
-0.2 Spreadability
p2 Elasticity Viscosity Creamy
13.5 kDa p1
-0.4 30.2 kDa
Acceptability 32 kDa
-0.6 20.7 kDa
28.3 kDa
-0.8
-1
-1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Fig. 2. Principal component analysis of the CE peaks, SDS–PAGE bands, and sensorial parameters (The prefixes T, O, and F refer to attributes of texture, odour and flavour,
respectively): plane 1–2 of variable plot (A); plane 1–3 of variable plot (B).
milk-clotting values around 18 R.U./mL for 15 times more concen- showed the highest mean values (P < 0.1) of b-casein degradation.
trated extracts of C. cardunculus collected in Portugal. These A similar result was found for samples of location 2 in the case of
authors also found a higher proteolytic activity on a- than on b- j-casein degradation activity. Cordeiro, Xue, Pietrzak, Pais, and
casein, but the values of the degradation percentage were gener- Brodelius (1994) studied the proteolytic and milk-clotting activi-
ally lower than those found in our study. With respect to the factor ties of mature flower extracts collected at 8 different locations in
investigated (stage, location, and year), no significant differences Portugal, which showed some variation in proteolytic activity
were found in milk-clotting values or in proteolytic activities on while the milk-clotting activity was essentially the same for all ex-
the casein fractions, although the samples of ripening stage b tracts. Therefore, these factors have proved ineffective as criteria
Measured creaminess values
Regression standardized predicted values
B
Measured overall acceptability values
Regression standardized predicted values
Fig. 3. Scatter plot of measured versus predicted values of attribute creaminess (A) and overall acceptability (B) derived from the PLSR analysis of CE peaks 3 + 4 and 6.
for selecting the flowers of C. cardunculus that are technologically a-subunit of cardosin B (Sousa & Malcata, 1998). Other bands were
appropriate for the production of vegetable rennet in the elabora- tentatively identified by their molecular weights as procardosins
tion of ‘‘Torta del Casar’’. (66.2 and 60.2 kDa), intermediate form cardosin (38 kDa), other
Table 3 lists the mean values of the CE peak areas and a-subunits of cardosins (30.2 kDa), and b-subunits of cardosins
SDS–PAGE band intensities from the cardoon samples grouped by (16.7 and 13.5 kDa; Sampaio, Fortes, Cabral, Pais, & Fonseca,
different stages of harvest. In general, no relevant differences in 2008; Verissimo et al., 1996). However, these protein bands may
the FZCE electroferograms were associated with the ripening stage. also include other enzymes present in the cardoon tissue (López-
Only peak 9 was higher in the samples of stage b. Similar results Molina et al., 2003).
were obtained for SDS–PAGE densitograms since only the protein Table 3 also lists the correlations between the analytical param-
band 4 of apparent molecular weight of 32 kDa showed differ- eters (CE peak areas and SDS–PAGE band densities) and the milk-
ences, in this case being more intense in cardoon samples clotting and proteolytic activities. The areas of peaks 3 + 4 and 6
harvested in the initial stage. This band would correspond to the were strongly positively correlated (P < 0.01) with clotting activity
values after 1 h of maceration and with the j and b casein proposed that this technique be used routinely for the quality con-
degradation, respectively. Positive correlations were also obtained trol of the vegetable rennet used in the manufacturing process for
for peaks 9 and 10 with respect to b and j casein degradation, the Registry of the Protected Designation of Origin ‘‘Torta del
respectively. In addition, the sum of the peak areas was positively Casar’’.
correlated with the b-casein degradation activity. According to
their casein degradation activities, the above mentioned peaks Acknowledgements
may include active cardosins or their precursors. Given that card-
osin B has broader specificity (like pepsin) than cardosin A (like The authors are grateful to M. Cabrero and C. Cebrián for tech-
chymosin; Verissimo et al., 1996), the area of peaks 3 + 4 and 10, nical assistance and PDO ‘‘Torta del Casar’’ for technical support.
correlated with j-casein degradation, may be mainly related to
cardosin A, despite of the deglycosilated cardosin B standard is in-
cluded in peak 4. On the other hand, the area of peaks 6 and 9, cor- References
related with b-casein degradation, may be mainly related to
Bean, S. R., & Lookhart, G. L. (2001). Recent developments in high performance
cardosin B. capillary electrophoresis of cereal proteins. Electrophoresis, 22, 1503–1509.
With respect to the SDS–PAGE band analysis, the intensities of Bietz, J. A. (1994). Fractionation of wheat gluten proteins by capillary
bands of 66.2 and 20.7 kDa showed strong correlation with electrophoresis. In Gluten proteins (pp. 404–413). Detmold, Germany:
Association of Cereal Research.
b-casein degradation; while the band 8 of 16.7 kDa, probably Brodelius, P. E., Cordeiro, M. C., & Pais, M. S. (1995). Aspartic proteinases (cyprosins)
including b-subunits of cardosin A, were positively correlated with from Cynara cardunuclus spp. flavescens cv. cardoon: Purification,
clotting activities (Table 3). These results showed that CE and characterisation, and tissue-specific expression. Advances in Experimental
Medicine and Biology, 362, 255–266.
SDS–PAGE methods could a priori both be useful for the technolog- Cancalon, P. F. (1995). Capillary electrophoresis: A useful technique for food
ical characterisation of the aqueous extracts of flowers of analysis. Food Technology, 49, 52–58.
C. cardunculus. For that, it is necessary to know the impact of these Cattaneo, T. M. P., Nigro, F., Toppino, P. M., & Denti, V. (1996). Characterization of
ewe’s milk by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, 721,
vegetable rennets with their different CE and SDS–PAGE profiles on 345–349.
the sensory properties of the ‘‘Torta del Casar’’ cheese. Cordeiro, M. C., Xue, Z. T., Pietrzak, M., Pais, M. S., & Brodelius, P. E. (1994). Isolation
and characterization of an cDNA from flowers of Cynara cardunculus encoding
cyprosin (an aspartic proteinase) and its use to study the organ-specific
3.3. Relationship between the CE and SDS–PAGE profiles of aqueous expression of cyprosin. Plant Molecular Biology, 24, 733–741.
extracts and the sensorial analysis of the ‘‘Torta del Casar’’ cheese Heimgartner, U., Pietrzak, M., Geertsen, R., Brodelius, P., Silva Figueredo, A. C., & Pais,
M. S. (1990). Purification and partial characterization of milk clotting proteases
from flowers of Cynara cardunculus. Phytochemistry, 29, 1405–1410.
The PCA analysis of the sensory descriptive attributes, overall
Hernández, A., Martín, A., Aranda, E., Bartolomé, T., & Córdoba, M. G. (2006).
scores, and CE and SDS–PAGE profiles showed major differences Detection of smoked paprika ‘‘Pimentón de la Vera’’ adulteration by free zone
between cheese samples (Fig. 2). The first axis accounted for capillary electrophoresis (FZCE). Journal of Agricultural and Food Chemistry,
21.45% of the variance and was mainly defined by flavour intensity 54(12), 4141–4147.
Hernández, A., Martín, A., Aranda, E., Bartolomé, T., & Córdoba, M. G. (2007).
and persistence, and pungent, astringent, and bitter taste, but also Application of temperature-induced phase partition of proteins for the
by texture descriptors such as softness (contrary to firmness) and detection of smoked paprika adulteration by free zone capillary
spreadability. An increased valuation of these attributes could be electrophoresis (FZCE). Food Chemistry, 105, 1219–1227.
International Organization for Standarization (ISO). UNE-ISO 4121-2006. Sensory
partially related to a non-specific proteolytic activity of the vegeta- analysis-guidelines for the use of quantitative response scales; ISO: Geneva,
ble rennet, but also mainly to other factors such as microbial pro- Switzerland.
teolytic activity. In fact, no relevant correlations were found Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680–685.
between any major CE peak or SDS–PAGE band and PC 1 (Fig. 2). López-Molina, D., Heering, H. A., Smulevich, G., Tudela, J., Thorneley, R. N. F., García-
The second axis (PC 2; 17.17% of the variance) includes overall Canovás, F., et al. (2003). Purification and characterization of a new cationic
acceptability, viscosity, juiciness and to a lesser extent, creaminess, peroxidase from fresh flowers of Cynara scolymus, L. Journal of Inorganic
Biochemistry, 94, 243–254.
together with the CE peak 3 + 4 and SDS–PAGE band of 16.7 kDa at Macedo, I. Q., Faro, C. J., & Pires, E. V. (1993). Specificity and kinetics of the milk-
the top of the figure, whereas the unpleasant flavour descriptor, to- clotting enzyme from Cardoon (Cynara cardunculus, L.) toward bovine k-casein.
gether with several SDS–PAGE bands (13.5, 30.2, 32.0, and Journal Agriculture of Food Chemistry, 41, 1537–1540.
Manabe, T. (1999). Capillary electrophoresis of proteins for proteomic studies.
60.2 kDa), are at the bottom. As has been shown previously, both
Electrophoresis, 20, 3116–3121.
CE peaks 3 + 4 and SDS–PAGE band 16.7 kDa also have a strong cor- Martins, A. P. L., Vasconcelos, M. M. P., & Sousa, R. B. (1996). Thistle (Cynara
relation with clotting activity, as does the CE peak 6. However, this cardunculus, L.) flower as a coagulant agent for cheesemaking: Sort
last peak did not correlate positively with overall acceptability or characterization. Lait, 76, 437–477.
Pires, E., Faro, C., Macedo, I., Esteves, C., Morgado, J., Veríssimo, P., et al. (1994). Flor
the creaminess descriptor. On the contrary, the relationship be- do cardo versus quimosina no fabrico de queijos artesanais. Revista da Sociedade
tween overall acceptability and CE peak 6 was negative, according Portuguesa de Química, 54, 66–68.
to the correlation analysis (P value <0.1) and PC 3 (14.41% of the Otte, J., Ardö, Y., Weimer, B., & Sorensen, J. (1999). Capillary electrophoresis used to
measure proteolysis in cheese. Bulletin International Dairy Federation, 337,
variance) represented in Fig. 2. With the aim of confirming peaks 10–16.
3 + 4 and 6 as quality control markers, a partial least-squares Recio, I., Ramos, M., & López-Fandiño,, R. (2001). Capillary electrophoresis for the
regression (PLSR) method was used. The model (r = 0.626) indi- analysis of food proteins of animal origin. Electrophoresis, 22, 1489–1502.
Recio, I., Amigo, L., & López-Fandiño, R. (1997). Assessment of the quality of dairy
cated that 39.2% of the variation in the descriptor ‘‘creaminess’’ products by capillary electrophoresis of milk proteins. Journal of
could be predicted from the areas of the selected CE peaks, as is Chromatography B, 697, 231–242.
shown in Fig. 3. Likewise, the model for the overall acceptability Regulation (CE) 1491/2003 of European commission of 25 of august: Registration of
the protected designation of origin ‘‘Torta del Casar’’ in the register of protected
(r = 0.650) indicated that up to 42% of its variation could be pre- designations of origin and the protected geographic indications.
dicted from these marker peaks. In contrast, the analysis by PLSR Roseiro, L. B., Barbosa, M., Ames, J. A., & Wilbey, R. A. (2003). Cheesemaking with
of the SDS–PAGE bands correlated with clotting or proteolytic vegetable coagulants – The use of Cynara L. for the production of ovine milk
cheeses. International Journal Dairy Technology, 56, 76–85.
activities did not show good results.
Roseiro, L. B., Gómez-Ruiz, J. A., García-Risco, M., & Molina, E. (2003). Vegetable
One can conclude that the present protocol of methanol-soluble coagulant (Cynara cardunculus) use evidenced by capillary electrophoresis
protein extraction from aqueous extracts of C. cardunculus flowers permits PDO Serpa cheese authentication. Lait, 83, 343–350.
and the FZCE analysis procedure provide a fast, economic, and effi- Sampaio, P. N., Fortes, A. M., Cabral, J. M. S., Pais, M. S., & Fonseca, L. P. (2008).
Production and characterization of recombinant Cyprosin B in Sacharomyces
cient method for the technological characterisation of this vegeta- cerevisiae (W303–1A) strain. Journal of Bioscience and Bioengineering, 105(4),
ble rennet in the processing of ‘‘Torta del Casar’’. We have therefore 305–312.
Serradilla, M. J., Martín, A., Aranda, E., Hernández, A., Benito, M. J., López- Tavaria, F. K., Sousa, M. J., & Malcata, F. X. (2001). Storage and lyophilization effects
Corrales, M., et al. (2008). Authentication of ‘‘Cereza del Jerte’’ sweet cherry of extracts of Cynara cardunculus on the degradation of ovine and caprine
varieties by free zone capillary electrophoresis (FZCE). Food Chemistry, 111, caseins. Food Chemistry, 72, 79–88.
457–461. Valdés, B., Talavera, S. & Fernández-Galiano, E. (1987). In: Flora vascular de Andalucía
Sidrach, L., García-Canovás, F., Tudela, J., & Rodríguez-López, J. N. (2005). Occidental. Ketres Editora, S.A. Barcelona: España.
Purification of cynarases from artichoke (Cynara scolymus, L.): Enzymatic Veríssimo, P., Esteves, C., Faro, C., & Pires, E. (1995). The vegetable rennet of Cynara
properties of cynarase A. Phytochemistry, 66, 41–49. cardunculus L. contains two proteinases with chymosin and pepsin-like
Silva, S. V., & Malcata, F. X. (1999). On the activity and specificity of cardosin B, a specificities. Biotechnology Letters, 17, 621–626.
plant proteinase on ovine caseins. Food Chemistry, 67, 373–378. Verissimo, P., Faro, C., Moir, A. J., Lin, Y., Tang, J., & Pires, E. (1996). Purification,
Sousa, M. J., & Malcata, F. X. (1998). Proteolysis of ovine and caprine caseins in characterization, and partial amino acid sequencing of two new aspartic
solution by enzymatic extracts from flowers of Cynara cardunculus. Enzyme proteinases from fresh flowers of Cynara cardunuclus, L. European Journal
Microbiology and Technology, 22, 305–314. Biochemistry, 235, 762–768.
IV.3. CAPÍTULO III
El objetivo 3 planteado en este trabajo se aborda en este capítulo, en el que se estudia la

influencia de las diferencias encontradas entre muestras de Cynara cardunculus, en
cuanto a sus características tecnológicas como cuajo, en las características físico –
químicas y sensoriales en los quesos tipo “Torta del Casar” elaboradas. También se
estudia la influencia de la microbiología presente en las características del producto
final. Este capítulo consta de los siguientes artículos:
IV.3.1. Influence of technological properties of vegetable rennet (Cynara cardunculus)

on the texture of “Torta del Casar” cheese.
Enviado a la revista “Journal of Dairy Science”
IV.3.2. Proteolysis effect of Cynara cardunculus rennet from different plant selected for
being used in the elaboration of “Torta del Casar” cheese.
Enviado a la revista “Food Control”
IV.3.3. Role of authoctonous microorganisms on the texture characteristics of the

tradictional cheese “Torta del Casar”.
229
IV.3.1. Influence of technological properties of vegetable rennet (Cynara
cardunculus) on the texture of “Torta del Casar” cheese.
Enviado a la revista “Journal of Dairy Science”.
231
Journal of Dairy Science
Influence of technological properties of vegetable rennet

(Cynara cardunculus) on the texture of “Torta del Casar”
cheese
Journal: Journal of Dairy Science

Fo
Manuscript ID: JDS-12-5836
Article Type: Research

r
Date Submitted by the Author: 14-Jun-2012

Pe
Complete List of Authors: Ordiales, Elena; Centro Tecnológico Agroalimentario Extremadura (CTAEX),
Agricultura
Martín, Alberto; Extremadura University, Nutricion y Bromatologia
Benito, Maria; Extremadura University, Nutricion y Bromatologia
er
Fernández, Margarita; Extremadura University, Nutricion y Bromatologia

Casquete, Rocio; Extremadura University, Nutricion y Bromatologia
Cordoba, Maria de Guia; Extremadura University, Nutricion y Bromatologia
Key Words: Biotechnology, soft-bodied cheese, vegetable rennet

Re
vi
ew
ScholarOne support: (434) 964 4100

Page 1 of 25 Journal of Dairy Science
1 Influence of technological properties of vegetable rennet (Cynara cardunculus) on
2 the texture of “Torta del Casar” cheese.
4 E. Ordiales,* A. Martín1,† M. J. Benito†, M. Fernández,† R. Casquete,† M. G.
5 Córdoba †
7 *Agricultura, Centro Tecnológico Agroalimentario Extremadura (CTAEX), Ctra.
8 Villafranco a Balboa Km. 1.2, Villafranco del Guadiana, 06195 Badajoz, Spain.
Fo
9
r
10 † Nutrición y Bromatología, Escuela de Ingenierías Agrarias, Universidad de
Pe
11 Extremadura, Ctra. de Cáceres s/n, 06071 Badajoz, Spain.
12
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1
21 Corresponding author
22 Tel.: +34 924 286200; fax: +34 924 286201
25

Journal of Dairy Science Page 2 of 25
26 ABSTRACT
27 The purpose of this work was to investigate the influence of technological properties of
28 vegetable rennet on the texture of “Torta del Casar” cheese to establish the parameters
29 that can be useful for quality control of this coagulant. A total of 16 batches of cardoon
30 flowers (Cynara cardunculus) grouped according to location, harvest year, and ripening
31 stage were used to make aqueous coagulant extracts in which clotting and casein
32 proteolytic activities were determined. The physicochemical, microbial, textural, and
33 sensorial properties of the "Torta del Casar" cheeses were evaluated during ripening,
Fo
34 and then related to the technological properties of the vegetable rennet batches used for
r
35 their elaboration. Although the differences in the clotting and proteolytic activities of
Pe
36 vegetable rennets were not attributable to the factors studied, they had a relevant impact
37 on both the physico-chemical parameters in the initial processing stages of "Torta del
er
38 Casar” and the texture and sensorial analysis of the final product. The level of in vitro
39 degradation of caseins by the aqueous extract used (specifically the activity against α-
Re
40 casein and κ-casein/β-casein degradation ratio) were found to be good tools with which
41 to predict the effect of vegetable rennet on the rheological properties of the “Torta del
vi
42 Casar" cheese.
ew
43
44
45 Keywords: vegetable rennet, clotting activity, proteolytic activity, texture, soft-bodied
46 cheese.
47
48

49 INTRODUCTION
50 “Torta del Casar” is a high quality Spanish cheese marketed under the Registry
51 of the Protected Designation of Origin “Torta del Casar” (Casar de Cáceres, Cáceres,
52 Spain) in accordance with Regulation (CE) 1491/2003 of the European Commission.
53 This type of cheese is made from raw ewe´s milk, using only the dried flowers of the
54 plant Cynara cardunculus as rennet, and without any deliberate addition of a starter.
55 Extracts of C. cardunculus are reported as containing two proteinases, cardosin

Fo
56 A and cardosin B (Sousa, 1993; Veríssimo et al., 1995, 1996). Studies of their
r
57 specificity and kinetics on the oxidized B-chain of insulin show that cardosin A has
Pe
58 cleavage specificity similar to chymosin, whereas cardosin B resembles pepsin (Faro et
59 al., 1992; Veríssimo et al., 1995; Ramalho-Santos et al., 1996). Cardosins are
er
60 characterized by high milk-clotting activity, cleaving the peptide bond Phe105-Met106 in
61 bovine (Macedo et al., 1993) and ovine κ-casein (Sousa and Malcata, 1998). In addition
Re
62 to a clotting activity similar to that of chymosin, this vegetable rennet also displays a
63 strong proteolytic action in vitro. This activity eventually leads to extensive breakdown
vi
64 of the caseins in the cheese matrix (Macedo and Malcata, 1996), producing cheese
ew
65 characterized by a soft buttery texture and the development of a typical aroma and a
66 slightly piquant and creamy flavour (Galán et al., 2008; Tavaria et al., 2001). This
67 aspect is well suited to the manufacture of the soft-bodied “Torta del Casar” cheeses
68 often associated with bitter tastes and relatively low yields.
69 Traditional aqueous extracts are made from Cynara cardunculus flowers of
70 diverse natural populations harvested at different flower ripening stages and mixed with
71 other parts of the plant. In addition, the milk clotting activity of the flowers shows great
72 variability mainly related to the drying conditions (Martins et al., 1996). This major
3

73 heterogeneity of the rennet used in “Torta del Casar” manufacture has a negative
74 influence on the cheese´s quality parameters, including low yield, lack of homogeneity
75 between batches of relevant sensorial factors, such as texture parameters (Tunick,
76 2000). Thus, technological quality control of the aqueous extracts used as rennet would
77 be desirable for standardization of the cheese-making process. Rheological properties
78 are important monitors of quality control in cheese processing and in scientific research
79 (Park, 2007).
Fo
80 The objective of this work was to study the effect of the clotting and proteolytic
81 activities of different aqueous extracts of Cynara cardunculus used as rennet on the

r
82 texture quality of “Torta del Casar” cheese.

Pe
83 MATERIALS AND METHODS

er
84 Plant Material
Re
85 The samples of cardoon (Cynara cardunculus, L.) used in this study were
86 identified previously in accordance with the guidelines of Valdés et al. (1987). They
vi
87 were collected from six locations during the seasons of the years 2007 and 2008, and
ew
88 grouped into 3 different ripening stages in accordance with the cardoon flower’s
89 phenological characteristics (Table 1) (Ordiales et al., 2012), ripening stage a (flowers
90 opening, only some styles and stigmas visible), b (flowers fully open, even with pollen),
91 and c (flowers begin to dry, so that they are brownish, instead of violet). The collected
92 flowers were dried and kept in a cool dry place until use.
93 Milk-clotting Activity

94 For the milk-clotting trials, 0.5 g aliquots of each cardoon sample were softened
95 in 75 ml of ultrapure water for 1 h and 24 h. The rennet clotting time of these coagulant
96 extracts was measured according to a standard method (NILACTM; NIZO, Ede, The
97 Netherlands) described by Tavaria et al. (2001). The substrate was prepared by
98 dissolving 12 g of low-heat bovine skimmed milk powder in 100 mL of 0.01 M CaCl2
99 (pH 6.5) at 30ºC. The enzymatic assay was performed using 0.2 mL of coagulant extract
100 added to 2 mL of reconstituted skim milk, and the clotting time was determined by
101 visual inspection. One rennet unit (R.U.) was defined as the amount of crude enzyme
Fo
102 extract needed to coagulate 10 mL of reconstituted low-heat processed skim milk at

r
103 30ºC in 100 s (FIL-IDF 157/1992). Determinations were quadruplicated, and the mean
Pe
104 of each set of four data was taken as the datum point.
105 In vitro Casein Proteolytic Activity

er
106 The dried flower extracts were prepared by macerating 0.25 g of dried flowers in
Re
107 5 mL of water (corresponding to a proportion of 50 g in 1 L) at room temperature for 4
108 h. The homogenate was filtered through a Whatman No. 4 filter. The substrate used for
vi
109 degradation by the extracts consisted of a mix of bovine caseins (Sigma Aldrich, Co.,
ew
110 St. Louis, MO, USA) ( α , β , and κ), at a concentration of 0.5 mg/mL of each casein,
111 dissolved in 5 ml of distilled water. The dried flower extracts were macerated with the
112 casein mix, at 2.5% of extract (vol/vol), for 2 h at room temperature to allow casein
113 degradation. After this time the extracts with degraded caseins were denatured by
114 adding 30 µL of SDS-PAGE loading buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% (wt/vol)
115 glycerol, 2% (wt/vol) SDS, 5% (wt/vol) β-mercaptoethanol, 0.025% (wt/vol)
116 bromophenol blue) and incubated at 99º C for 5 min.

117 The electrophoresis conditions were those described by Laemmli (1970), and the
118 concentrations of acrylamide (29:1 acrylamide/bisacrylamide) in the gels were 4%
119 (wt/vol) for stacking gels and 15% (wt/vol) for separating gels. The gels were cast and
120 run in a Miniprotean III device (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). The molecular
121 mass marker kits (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) contained proteins from 6.5 to
122 205 kDa. The gels were subsequently stained with 0.5% (wt/vol) Coomassie blue (G-
123 250) dissolved in 45% (vol/vol) water, 45% (vol/vol) methanol, and 10% (vol/vol)
124 acetic acid for 30 min, and destained with a solution consisting of 20% (vol/vol)
Fo
125 methanol, 10% (vol/vol) acetic acid, and 70% (vol/vol) distilled water for 4 h. A
r
126 computer image analysis program (Genetools, Synoptics Ltd., Cambridge, U.K.) was
Pe
127 used for the densitometric analysis of the gel electrophoreses.
128 “Torta del Casar” Cheese-making Procedure

er
129 A total of sixteen batches of “Torta del Casar” were manufactured, of 10 cheeses
Re
130 each batch, from unpasteurized Merino ewe’s milk to which no starter cultured was
131 added. Each batch was clotted using a C. cardunculus L. rennet, corresponding to the
vi
132 samples listed in Table 1. The aqueous extracts from the cardoon C. cardunculus L.
ew
133 were prepared from 50 g of dried flowers in 1 L of water, leaving them to macerate for
134 24 h, and adding 10 mL of this extract per litre of milk at 28–30ºC, for each 32 L batch.
135 After pressing, the cheeses were immersed in a salt solution (16% (wt/vol) NaCl) for 4
136 hours. The ripening took place at a temperature of 5–10ºC and relative humidity of 85–
137 90% throughout the ripening period of 60 days. Three cheeses of each batch were
138 randomly taken for analysis after 2, 30 and 60 days of ripening.
139 Physico-chemical Parameters

140 The moisture content of the cheeses was determined by dehydration at 100ºC to
141 a constant weight by the ISO recommended methods (ISO, 1973). Water activity (Aw)
142 was determined using an FA-St/1 apparatus from GBX (France Scientific Instrument).
143 The pH was measured using a Crison mod. 2002 pH meter (Crison Instruments,
144 Barcelona, Spain). Total protein was determined by the Kjeldahl method (International
145 Dairy Federation (IDF), 1993), with a Kjeltec system 1002 distilling unit (Tecator,
146 Hoganas, Sweden). Fat content was determined by the Gerber method as described by
147 the Netherlands Standard NEN 3059 (1969).

Fo
148 The yield was determined as the quantity of cheese obtained from a volume of
r
149 milk, expressed as %. Cutting time was considered to be the time needed for curd to be
Pe
150 formed, from the moment rennet is added to the moment the curd is cut.
er
151 Microbial Count

Re
152 For the microbial counts and isolates, 10 g aliquots of each cheese sample were
153 taken aseptically, transferred to sterile plastic pouches, 10-fold diluted with 1% peptone
vi
154 water (Pronadisa, Alcobendas, Madrid, Spain), and homogenized for 120 s using the
ew
155 laboratory Stomacher Lab-Blender 400 (Seward Lab., London, England). Serial 10-fold
156 dilutions were prepared from the same solution and inoculated onto agar plates.
157 Plate count agar (PCA, Oxoid) was used for mesophilic aerobic bacteria counts
158 at 30ºC for 48 h, and for psychrotrophs for 7 days at 7ºC. LAB were grown in MRS
159 agar (Oxoid) whose pH was adjusted to 5.6 with acetic acid (10%), incubating at 37ºC
160 for 2 days under anaerobic conditions. The Gram positive catalase positive (GPCP)
161 cocci counts were determined in MSA agar (Oxoid) at 30ºC for 48 h, counting typical
162 colonies.

163 Texture
164 Two different instrumental texture analyses were performed using a TA.XTA2i
165 texture analyzer (Stable Micro Systems, Godalming, UK).
166 Texture compression analysis (TCA) of the samples was performed at room
167 temperature, using a cylindrical probe of 4 mm diameter. The procedure involved
168 cutting slices approximately 1.5 cm thick. Force–time curves were recorded at a cross-
169 head speed of 1 mm s−1 and 10 mm distance. Hardness (g), defined as maximum peak
Fo
170 force during a compression cycle, cohesiveness (g s), area under the positive curve,
r
171 adhesiveness (g), maximum negative peak, and F-T 2:3 area (g s), area under the
Pe
172 negative curve, were evaluated at 2, 30, and 60 days of the process.
173 A texture spreadability analysis (TSA) was also performed at 60 days of

er
174 ripening using a TTC Spreadability Fixture probe. The samples were packed into the
175 lower cone with a spatula. The curves were produced at a test speed of 3 mm s−1 and 25
Re
176 mm distance. Firmness (g) and work of shear (g s) will be the maximum peak and the
177 area under the first curve. The maximum negative peak indicates the stickiness (g) of
vi
178 the sample, and the maximum negative area is taken as the work of adhesion (g s).
ew
179 Sensory Evaluation
180 Fifteen panelists, previously selected and trained under ISO standards with
181 samples of “Torta del Casar” cheese, were asked to characterize the sensory quality of
182 the batches selected according to the protein profile of the cardoon used for the clotting
183 stage. The cheeses were cut into slices of approximately 5 mm thickness. The slices
184 were equilibrated for 30 min at room temperature before serving. Descriptive analyses
185 were made according to international standard methods. Eight parameters related to

186 appearance (creamy, no holes, elastic, spreadability) and texture (firmness, creaminess,
187 viscosity, juiciness) were assessed using a structured line scale with intensity
188 descriptors at the end points (1, low; 10, high). The samples were three-digit coded and
189 the order of serving was determined by random permutation. Two replicate panels
190 performed for each sample. The response to each indicator was taken as the mean of the
191 panellists´ responses. In addition to this descriptive test, a panel of 17 untrained
192 consumers evaluated the samples for overall acceptability.

Fo
193 Statistical Analysis
r
194 Statistical analysis of the data was carried out using SPSS for Windows, 15.0.
Pe
195 (SPSS Inc. Chicago, Illinois, USA). Descriptive statistics of the vegetable rennet
196 activities were determined, and the evolution of the physicochemical, microbial, and
er
197 texture parameters of the cheese batches were studied by one-way analysis of variance
198 (ANOVA), and separated by Tukey’s honest significant differences test (P ≤ 0.05). The
Re
199 relationships between the enzymatic activities of the aqueous extracts and the physico-
200 chemical parameters of the cheeses after 2 days of ripening were evaluated in terms of
vi
201 Pearson correlation coefficients. A principal component analysis (PCA) was performed
ew
202 on the technological properties of vegetable rennet, the texture parameters and sensorial
203 data of the final product to study the relationships between the clotting and proteolytic
204 activities of the vegetable rennet and the texture quality of the cheeses. The efficiency
205 of the selected coagulant parameters as quality control markers of the rennet was
206 evaluated in terms of Pearson correlation coefficients, and verified by linear regression
207 analysis.

208 RESULTS AND DISCUSSION
209 Technological Properties of the Vegetable Rennets
210 Table 1 presents the results for the technological properties of the vegetable
211 rennets. They showed relevant differences in both clotting and proteolytic values among
212 the samples studied. These differences were not at the level of the maturation of the
213 cardoon or its location since a high intra-group variability was observed in both factors
214 (data not shown). Cordeiro et al. (1994) studied the proteolytic and milk-clotting
Fo
215 activities of mature flower extracts collected at 8 different locations in Portugal. They
r
216 found some variation in proteolytic activity, but for the milk-clotting activity they did
Pe
217 not appreciate any significant differences among the locations corresponding to extracts.
218 The value ranges for milk-clotting were 0.092-0.185 and 0.136-0.512 RU/ml for 1 and
er
219 24 hours of maceration, respectively. Tavaria et al. (2001) reported milk-clotting values
220 of around 18 RU/mL for 15 times more concentrated extracts of Cynara cardunculus
Re
221 collected in Portugal. They also found greater proteolytic activity on α- than on β-
222 casein. In the present study, the α-casein degradation varied from 24.39% (sample M15)
vi
223 to 100% (samples M1 and M3), and the β-casein and κ-casein degradation ranges were
ew
224 4.32-91.55% and 4.21-98.43%, respectively (Table 1). Silva and Malcata (1999) also
225 found that αs-caseins were hydrolysed faster than β-caseins in in vitro trials. This is
226 comparable to the case in cheese, since it has been reported that β-casein is less
227 susceptible to proteolysis than αs-caseins in the manufacture of raw ewe’s milk cheese
228 in which extracts of C. cardunculus are used as coagulant (Sousa and Malcata, 1997;
229 Roa et al., 1999).
230 Influence of Vegetable Rennets on Cutting Time, Curd Yield, and the
231 Physicochemical Properties of Fresh Cheese

10

232 Table 2 lists the descriptive statistics of cutting time and curd yield for the
233 batches studied, and the physicochemical characteristics of the fresh cheeses with 2
234 days of ripening. These data were correlated with the technological properties of the
235 vegetable rennets used for their elaboration. The cutting time varied between 35 and 75
236 min, and showed a negative correlation with the clotting activity of the aqueous extract
237 after 24 h of maceration. However, this parameter was also positively correlated with
238 unspecified proteolytic activity against whole caseins (Table 2). Although some studies
239 have examined the gelling properties of the proteases present in plant coagulants, no
Fo
240 data were available in the literature concerning the properties of each cardosin and its
r
241 independent contribution to the overall milk-clotting activity and gelling properties.
Pe
242 Silva et al. (2003) showed that different cardosins have very different rheological
243 properties, as well as from chymosin. This type of knowledge is important in order to
er
244 rationally reduce the variability in cheesemaking using C. Cardunculus extracts.

Re
245 The mean value of the curd yield was low (23.8%), confirming previous results
246 (Agboola et al., 2009). Mas Mayoral et al. (1991) report slightly lower cheese yields
vi
247 with values between 16.5 and 20%. This parameter was not clearly linked to clotting
ew
248 activities but had a positive correlation with the degradation of κ-casein, the primary
249 stage of milk coagulation.
250 With respect to the physicochemical parameters of the fresh cheeses, the mean
251 values of moisture and pH were 56.61% and 6.85 respectively and aw ranged from 0.96
252 to 0.99. Sanjuán et al. (2002) studied the influence of vegetable rennet on the
253 physicochemical characteristics of the soft cheese "Los Pedroches" during ripening. At
254 2 days of ripening, moisture of cheeses was 51.63 %, the pH was 5.6, and aw 0.98. pH
255 values were positively correlated with the whole proteolytic activity of the aqueous
11

256 extracts, a fact attributable to the buffer effect generated by the products of protein
257 hydrolysis (Shammet et al., 1992).
258 For the protein and fat percentages, the mean values were 16.72 and 25.31,
259 respectively, in agreement with other studies (Mas Mayoral et al., 1991). In addition,
260 the total protein showed a positive correlation with the clotting activity of the vegetable
261 rennet extract after 1h of maceration (Table 2), together a negative correlation with
262 moisture (P < 0.1). Better curd gelling associated with clotting activities of the
Fo
263 vegetable rennet may, at last partially, explain these results.
r
264 Evolution of Physicochemical, Microbial, and Texture Parameters during Cheese
Pe
265 Ripening
266 The evolution of the physicochemical parameters during ripening is presented in

er
267 Figure 1. There were significant differences (P < 0.05) in moisture and pH values
Re
268 during cheese ripening, with decreases until the end of processing. The mean moisture
269 values varied from 56.61 (2 days of ripening) to 40.81 (60 days of ripening), and the pH
vi
270 values ranged from 6.85 (2 days of ripening) to 5.65 (60 days of ripening). The results
ew
271 were similar to those obtained for other soft cheeses (Roa et al., 1999; Sanjuán et al.,
272 2002). These pH changes may reflect the major metabolic activity of lactic acid bacteria
273 in this type of ewe´s milk cheese.
274 The mean counts of total viable bacteria and LAB were greater than 8 log CFU
275 g-1 throughout ripening with high variability in the initial stage (2 days of ripening). In
276 the case of the GPCP cocci, the counts for during ripening were essentially constant
277 with values close to 7 log cfu g−1 (Figure 1). No correlation was observed between
278 coagulant extract activity and the counts of these microbial groups. The counts of TVC,
12

279 LAB, and GPCP cocci were similar to those found in other fresh soft cheeses clotted
280 with vegetable rennets. Lactic acid bacteria appear to be the predominant microbial
281 groups in Serra da Estrela cheese (Tavaira et al., 1998), in which they eventually reach
282 viable numbers of ca. 7 log cfu g-1 by the time of consumption (Pintado et al., 2010).
283 Obviously, regardless of the vegetable rennet´s characteristics, these high levels of
284 microorganisms during ripening may be playing a relevant role in the development of
285 the sensory characteristics of "Torta del Casar" cheese, including its texture.
Fo
286 Figure 1 also shows the textural changes in TCA hardness, cohesiveness,
287 adhesiveness, and area F-T 2:3 of cheese samples during maturation. The hardness and
r
288 cohesiveness values decreased, mainly at the end of ripening, whereas adhesiveness and
Pe
289 area F-T 2:3 had the lowest values at 30 days of ripening. The values of the TCA
290 parameters found in the present work are concordant with those observed in other
er
291 cheeses made with vegetable rennet. In the case of TCA, hardness and adhesiveness
Re
292 were much lower than in cheeses elaborated with animal rennet (Agbola et al., 2009).
293 The mean values of the TCA parameters may be attributed to extensive proteolysis in
vi
294 this type of cardoon-coagulated cheese. Differences in the technological properties of

ew
295 the vegetable rennet may condition the sensorial characteristics of "Torta del Casar"
296 cheese.
297 Effect of Vegetable Rennets on Sensorial Characteristics of “Torta del Casar” Cheese
298 The PCA of the descriptive sensory attributes, overall scores, texture parameters,
299 and technological properties of vegetable rennets showed major differences among
300 cheese samples elaborated with different coagulant extracts after 60 days of ripening
301 (Figure 2). The first axis accounted for 29.83% of the variance, and was mainly defined
302 by sensorial descriptors such as softness (contrary to firmness (SD4)), spreadability

13

303 (SD3), viscosity (SD6), juiciness (SD7), and creaminess (SD5); but also by the clotting
304 activity of the rennet after 24 h of maturation (CA24), and to a lesser extent, overall
305 acceptability (SH1). Specifically, the values of viscosity and creaminess, and overall
306 acceptability in the sensorial analysis of the cheeses showed significant positive
307 correlations with the clotting activities of the aqueous extracts used after 24 h of
308 maturation. A high valuation of these attributes could thus be partially related to this
309 activity of the vegetable rennet, but also to other factors such as microbial proteolytic
310 activity (Macedo et al., 1996; Tavaira and Malcata, 2003). With respect to the
Fo
311 proteolytic activity of the vegetable extracts on casein fractions (β-casein (PAb) α-
r
312 casein (PAa), and κ-casein (PAk)), they were not clearly associated with any PC, and
Pe
313 their explained variability was distributed over the three PCs studied.
314 The second and third axes (28.30 and 11.57% of the variance, respectively) were
er
315 defined by most of the texture parameters, and to a lesser extent by overall acceptability
Re
316 and the in vitro proteolytic degradation of caseins. A significant negative correlation
317 was found between the in vitro whole casein degradation of the vegetable rennets and
vi
318 the TSA parameters firmness (TS1) and work of shear (TS2) of cheeses with 60 days of
ew
319 ripening, evidence for the influence of the vegetable extract´s characteristics on the final
320 texture properties of “Torta del Casar” cheese. This effect was translated to the overall
321 acceptability, but it not was clearly related to descriptive attributes of the sensory
322 analysis. Indeed, the sensory descriptor creaminess (SD5) was located opposite β-casein
323 degradation with respect to PC1 axis, showing a significant negative correlation. It is
324 possible that the increase in this non-specific activity on casein micelles affects the
325 coagulation process when, resulting in a less cream product.
326 To confirm the influence of the technological characteristics of the vegetable
14

327 rennet on the rheological properties of "Torta del Casar" cheese, a partial least-squares
328 regression (PLSR) method was used. The model (r = 0.688) indicated that 47.4 % of the
329 variation in the TSA parameter “work of shear” of cheeses could be predicted from the
330 level of in vitro degradation of caseins by the aqueous extract used. Concretely from the
331 α-casein degradation and the κ-casein/β-casein degradation ratio as is shown in Figure
332 3.
333 CONCLUSIONS
Fo
334 One can conclude that the differences in the clotting and proteolytic activities of
r
335 vegetable rennets used in the elaboration of soft-type cheeses have an important impact
Pe
336 on both the physicochemical parameters in initial stages and the texture and sensorial
337 properties of final product. Clotting activity after 24 h of maceration and the intensity of
er
338 β-casein degradation correlated with sensorial creaminess. The whole casein
339 degradation capacity of the aqueous extracts conditioned the TSA parameters such as
Re
340 firmness and work of shear. We therefore proposed the use of both clotting activity after
341 24 h of maceration and in vitro casein degradation for the routine quality control of the
vi
342 vegetable rennet used in the manufacturing process of “Torta del Casar” cheeses for the
ew
343 Registry of their Protected Designation of Origin.
344 ACKNOWLEDGEMENTS
345 The authors are grateful to M. Cabrero and C. Cebrián for technical assistance,
346 and to PDO “Torta del Casar” for technical support.
15

347 REFERENCES
348 Agboola, S. O., H. H. Chan, J. Zhao, and A. Rehman. 2009. Can the use of Australian
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359 Galán, E., F. Prados, A. Pino, L. Tejeda, and J. Fernández-Salguero. 2008. Influence of
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r
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Pe
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Re
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vi
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439 proteinases from fresh flowers of Cynara cardunuclus, L. Eur. J. Biochem.
440 235:762 – 768.
441 19

442 Figure 1 Evolution of pH and moisture (A), microbial counts for TVC, LAB and GPCP
443 cocci, (B) and hardness, adhesiveness, cohesiveness, and area F-T 2:3 (C) of
444 manufactured cheeses throughout their ripening period.
445
446 Figure 2 Principal component analysis of the descriptive sensory attributes, overall
447 scores, texture parameters of cheeses, and technological properties of vegetable rennets.
448 Sensory descriptors: spreadability (SD3), softness (SD4), viscosity (SD6), juiciness
449 (SD7), creaminess (SD5); Overall acceptability (SH1); Clotting activities: after 1h of
Fo
450 maceration (CA1), after 24h of maceration (CA24); Proteolytic activity against β-casein
r
451 (PAb), α-casein (PAa), κ-casein (PAk); Texture spreadability analysis: firmness (TS1),
Pe
452 work of shear (TS2), stickiness (TS3), work of adhesion (TS4); Texture compression
453 analysis: adhesiveness (TC1), cohesiveness (TC2), Area F-T 2:3 (TC3), hardness
er
454 (TC4).
455
Re
456 Figure 3 Scatter plot of measured versus predicted values of attribute creaminess of
457 cheeses derived from the PLSR analysis of the α-casein degradation and the κ-casein/β-
vi
458 casein degradation ratio of vegetable rennets.

ew
459
20

460 Figure 1
A pH Moisture
8 70
7 60
6 50
Moisture values
5
pH values
40
4
30
3
2 20
1 10
0 0
Fo
0 10 20 30 40 50 60 70
Days
461
r
B TVC LAB GPCP cocci

Pe
12
10
er
8
log cfu g−1
4
Re
0
vi
0 10 20 30 40 50 60 70
Days
462
ew
C Hardness Cohesiveness Adhesiveness Area F-T 2:3
1000 0
900 -20
800 -40
Cohesiviness (g.sec)
Area F-T 2:3 (g.sec)
700 -60
Adhesiviness (g)
Hardness (g)
600 -80
500 -100
400 -120
300 -140
200 -160
100 -180
0 -200
0 10 20 30 40 50 60 70
Days
463
21

Figure 2
Fo ● Acceptability
♦ Clotting activities
TC3 ►
TC1
► SD1
rP ■ Proteolytic activities
▲ Sensory descriptor
► Texture compression analysis
ee
PAk ▲ SD2
■ ▲ ◄ Texture spreadability analysis
PAb■ ■ ●
PAa SH1
SD4 ▲
CA1 ♦
SD7
CA24 ♦
▲
▲ SD6
▲SD8
SD3▲▲
rR
SD5
◄ TS3
ev
TS4
◄ iew
TS1 TC4
◄ TC2►►
◄TS2
22

Figure 3
12000
L13
11000
L15
c 10000
e
s
*g
ra 9000
e
h
S 8000 L10
f L16
o 7000 L3
kr
Fo
L7 L11
o
W 6000 L2L12L5
L1 L14
L6
5000 L9
r
L4
4000 L8
Pe
-2 -1 0 1 2 3
Regression standarized predicted values
er
Re
vi
ew
23

Table 1. Technological characteristics of the Cynara cardunculus rennets for cheese

batch manufacture.
Clotting activity Proteolytic activity (%)
Maturation
Sample Localization2 (RU)
stage1
24 h 1h α-casein β-casein k-casein
M1 b L2 0.188 0.170 100 83.61 91.67
M2 a L3 0.193 0.128 88.83 69.08 80.48
M3 b L2 0.136 0.117 100 75.64 100
M4 c L6 0.512 0.164 71.10 41.21 98.43
M5 b L4 0.165 0.128 89.19 71.78 87.48
Fo
M6 c L6 0.138 0.135 57.47 47.56 47.93

M7 b L1 0.170 0.137 88.24 67.61 90.25
r
M8 c L6 0.359 0.155 94.05 47.06 95.44

Pe
M9 c L3 0.161 0.185 74.08 65.99 24.06

M10 c L1 0.156 0.115 94.60 56.94 87.92
M11 c L3 0.243 0.128 90.55 74.97 21.79
er
M12 a L3 0.148 0.092 81.53 56.07 71.04

M13 c L5 0.230 0.171 53.06 10.09 4.21
Re
M14 b L4 0.163 0.095 82.93 55.23 54.17

M15 a L3 0.218 0.146 24.39 4.32 9.01
M16 b L4 0.149 0.131 92.79 91.55 54.24
vi
1
a: flower is opening, only some styles and stigmas are visible; b: flower fully open, even with pollen; c:
ew
flower begins to dry, so some styles and stigmas are brownish.

2
Geographic coordinates: L1: 38º 54' 8.82" N 6º 43' 59.9" W, L2: 38º 50' 34.8" N 6º 57' 39.73" W, L3: 38º 45'
6.73" N 6º 48' 10.42" W, L4: 38º 57' 0.30" N 6º 16' 53.03" W, L5: 38º 53' 59.94" N 6º 51' 12.43" W, L6: 38º
56' 32.78" N 6º 20' 23.16" W, L7: 38º 54' 23.54" N 6º 47' 37" W.
24

Table 2. Descriptive statistics of the physicochemical parameters of the cheese batches studied at 2 days of ripening, and correlations with
technological properties of the vegetable rennets used.
Correlations
Fo
Clotting activity
Descriptive Statistics
Physicochemical (R.U.) after Degradation of caseins
parameters maceration
Moisture
pH
N
16
16
Mean
56.61
6.85
SD Min Max
0.12 6.62 6.99

rP
2.56 52.90 62.99
24h
-0.154
0.038
1h
-0.357
0.165
α-caseins
-0.096
β-casein
0.018
0.577* 0.528*
κ-casein
-0.310
0.570*
aw
Protein (%)
16
16
0.97
16.72
0.01 0.96 0.99
1.13 15.29 19.32 ee
-0.135
0.235
0.274
0.696**
0.289
-0.183
0.264
0.002
0.558*
-0.178
Fat (%) 16 25.31 2.47 19.69 29.43 0.098
rR 0.131 0.117 -0.156 0.361
Cutting time (min) 16 54.25 10.69 35.00 75.00
Yield (%) 16 23.8 2.0 21.0 27.0

-0.480+
-0.254
-0.090
0.135 ev0.712** 0.576*
0.368 0.309
0.702**
0.484+
+P<0.1
* P<0.05.
** P<0.01.
iew
25

IV.3.2. Proteolysis effect of Cynara cardunculus rennet from different plant
selected for being used in the elaboration of “Torta del Casar” cheese.
Enviado a la revista “Food Control”
259
Elsevier Editorial System(tm) for Food Control
Manuscript Draft
Manuscript Number:
Title: Proteolytic effect of Cynara cardunculus rennet from different plants selected for use in the
elaboration of "Torta del Casar" cheese
Article Type: Research Article
Keywords: Torta del Casar, Cynara cardunculus L., proteolysis, biogenic amines, sensorial.
Corresponding Author: Dr. Maria Jose Benito,
Corresponding Author's Institution: Universidad de Extremadura
First Author: Elena Ordiales
Order of Authors: Elena Ordiales; Maria Jose Benito; Alberto Martin; Margarita Fernández; Alejandro
Hernández; Maria G Ordiales
Abstract: The purpose of this work was to analyze the influence of rennet from different C. cardunculus
plants, selected for its clotting and proteolytic activity on caseins, on the characteristics of
manufactured ''Torta del Casar'' cheeses. After classifying the cardoon according to its proteolytic
activity into five groups of greater or lesser activity, 16 batches of cheeses were made with rennet
derived from different wild cardoon plants. We observed a major development of the proteolysis
during ripening leading to the generation of non-protein nitrogen compounds. Especially noteworthy
was the relationship of AN generation with rennet clotting activity after 24 hours of maceration, and
the fact that the production of biogenic amines was not related to the proteolytic activity of the rennet.
The activities of the rennet observed "in vitro" were also developed "in vivo" in the cheeses, with the
different rennets used affecting the final sensory characteristics of cheeses. The rennet with high
clotting activity at 24 h was positively correlated with the creaminess, viscosity, and acceptability of
the cheese. However, the high proteolytic activity rennet negatively influenced the acidity, bitterness,
and creaminess parameters. Therefore the most appropriate cardoons for making this cheese are those
with higher clotting activities and moderate proteolytic activities especially on β-casein. The use of
controlled and characterized cardoons in the manufacturing process of ''Torta del Casar'' is
fundamental to obtaining the homogeneous product demanded by the ''Torta del Casar'' Registry of the
Protected Designation of Origin.
Suggested Reviewers: Lourdes Cabezas

[email protected]
They work with this kind of cheeses and proteolysis
Jose Fernandez Salguero

[email protected]
F. Xavier Malcata
[email protected]
Cover Letter
ESCUELA DE INGENIERÍAS AGRARIAS
NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA
Carretera de Cáceres s/n
06071-Badajoz (Spain)
Teléfono: +34 924 286200 ext 86270
Fax: +34 924 286201
E-MAIL:[email protected]
4 July 2012
Please find enclosed the manuscript entitled “Proteolytic effect of Cynara

cardunculus rennet from different plants selected for use in the elaboration of “Torta
del Casar” cheese” to be considered for publication in the Food Control.
Mailing address: Nutrición y Bromatología. Escuela de Ingenierías Agrarias. Universidad

de Extremadura. 06071-Badajoz. Spain.
Phone: 0034 924 286200 ext 86270. Fax: 0034 924286201.
E-mail: [email protected]
Authors:
Elena Ordiales (Centro Tecnológico Agroalimentario Extremadura (CTAEX))
Maria J. Benito (University of Extremadura, Spain)
Alberto Martín (University of Extremadura, Spain)
Margarita Fernández (University of Extremadura, Spain)
Alejandro Hernández (University of Extremadura, Spain)
María de Guía Córdoba (University of Extremadura, Spain)
In this manuscript the objective was to analyze the influence of rennet from different C.
cardunculus plants, selected for its clotting and proteolytic activity on caseins, on the
characteristics of manufactured „„Torta del Casar‟‟ cheeses. After classifying the cardoon
according to its proteolytic activity into five groups of greater or lesser activity, 16 batches
of cheeses were made with rennet derived from different wild cardoon plants. We observed
a major development of the proteolysis during ripening leading to the generation of non-
protein nitrogen compounds. Especially noteworthy was the relationship of AN generation
with rennet clotting activity after 24 hours of maceration, and the fact that the production of
biogenic amines was not related to the proteolytic activity of the rennet. The activities of the
rennet observed “in vitro” were also developed “in vivo” in the cheeses, with the different
rennets used affecting the final sensory characteristics of cheeses. The rennet with high
clotting activity at 24 h was positively correlated with the creaminess, viscosity, and
acceptability of the cheese. However, the high proteolytic activity rennet negatively
influenced the acidity, bitterness, and creaminess parameters. Therefore the most
appropriate cardoons for making this cheese are those with higher clotting activities and
moderate proteolytic activities especially on β-casein. The use of controlled and
characterized cardoons in the manufacturing process of „„Torta del Casar‟‟ is fundamental
to obtaining the homogeneous product demanded by the „„Torta del Casar‟‟ Registry of the
Protected Designation of Origin.
Yours sincerely,
María José Benito
*Research Highlights
Research Highlights
Authors analyze the influence of C. cardunculus rennet, selected for its clotting and proteolytic
activity, on the characteristics of ‘‘Torta del Casar’’. The appropriate cardoons for making this
cheese were those with higher clotting and moderate proteolytic activities. The use of
controlled and characterized cardoons is fundamental to obtaining the homogeneous product
demanded by the ‘‘Torta del Casar’’ Registry of the Protected Designation of Origin.
*Manuscript
Click here to view linked References
1 Proteolytic effect of Cynara cardunculus rennet from different
2 plants selected for use in the elaboration of “Torta del Casar”
3 cheese
4 Ordiales, E.a; Benito, M.J.b*; Martin, A.b, Fernández, M.b; Hernández, A.b;
5 Córdoba, M.G. b
6
a
7 Agricultura, Centro Tecnológico Agroalimentario Extremadura (CTAEX), Ctra.
8 Villafranco a Balboa Km. 1.2, Villafranco del Guadiana, 06195 Badajoz, Spain
b
9 Nutrición y Bromatología, Escuela de Ingenierías Agrarias, Universidad de
10 Extremadura, Ctra. de Cáceres s/n, 06071 Badajoz, Spain
11
12
13
15 Tel.: +34 924 286200; fax: +34 924 286201
18
1
19 ABSTRACT
20 The purpose of this work was to analyze the influence of rennet from
21 different C. cardunculus plants, selected for its clotting and proteolytic activity on
22 caseins, on the characteristics of manufactured „„Torta del Casar‟‟ cheeses. After
23 classifying the cardoon according to its proteolytic activity into five groups of
24 greater or lesser activity, 16 batches of cheeses were made with rennet derived
25 from different wild cardoon plants. We observed a major development of the
26 proteolysis during ripening leading to the generation of non-protein nitrogen
27 compounds. Especially noteworthy was the relationship of AN generation with
28 rennet clotting activity after 24 hours of maceration, and the fact that the
29 production of biogenic amines was not related to the proteolytic activity of the
30 rennet. The activities of the rennet observed “in vitro” were also developed “in
31 vivo” in the cheeses, with the different rennets used affecting the final sensory
32 characteristics of cheeses. The rennet with high clotting activity at 24 h was
33 positively correlated with the creaminess, viscosity, and acceptability of the
34 cheese. However, the high proteolytic activity rennet negatively influenced the
35 acidity, bitterness, and creaminess parameters. Therefore the most appropriate
36 cardoons for making this cheese are those with higher clotting activities and
37 moderate proteolytic activities especially on β-casein. The use of controlled and
38 characterized cardoons in the manufacturing process of „„Torta del Casar‟‟ is
39 fundamental to obtaining the homogeneous product demanded by the „„Torta del
40 Casar‟‟ Registry of the Protected Designation of Origin.
41
2
42 Keywords: Torta del Casar, Cynara cardunculus L., proteolysis, biogenic
43 amines, sensorial.
44
3
45 Introduction
46 Proteolysis in cheese during ripening plays a vital role in the development
47 of texture and flavour, and has been the subject of several reviews (Fox &
48 McSweeney, 1996). Proteolysis contributes to textural changes of the cheese
49 matrix, due to breakdown of the protein network, decrease in a w through water
50 binding by liberated carboxyl and amino groups, and increase in pH, which
51 facilitates the release of sapid compounds during mastication. It contributes
52 directly to flavour and to off-flavour (e.g., bitterness) of cheese through the
53 formation of peptides and free amino acids as well as liberation of substrates
54 (amino acids) for secondary catabolic changes, i.e., transamination, deamination,
55 decarboxylation, desulfuration, catabolism of aromatic amino acids, and reactions
56 of amino acids with other compounds (Sousa et al., 2001). However, proteolysis
57 can also produce biogenic amines (BAs) in high amounts through the activity of
58 amino acid decarboxylases. Excessive consumption of these amines can be a
59 health concern because their unbalanced uptake by the human organism can
60 generate diseases of different degrees of severity due to their action on the
61 nervous and gastrointestinal systems, and on blood pressure.
62 The high quality Spanish cheese “Torta del Casar” is produced in the
63 Extremadura region, in the south-west of Spain, and is characterized by its soft
64 and buttery texture, yellowish-coloured paste, intense flavour, and its peculiar,
65 slightly bitter taste. It is made from whole raw ewe‟s milk by enzymatic clotting
66 using as coagulant an aqueous extract of dried wild cardoon (Cynara
67 cardunculus) flowers (Macedo, Faro, & Pires, 1993). This cheese is a marketed
68 under the Registry of the Protected Designation of Origin “Torta del Casar”
4
69 (Casar de Cáceres, Cáceres, Spain) in accordance with the Regulations (CE)
70 1491/2003 of the European Commission.
71 Extracts of C. cardunculus are reported to contain two proteinases,
72 cardosin A and cardosin B (Sousa, 1993; Verissimo, Esteves, Faro, & Pires,
73 1995; Verissimo, Faro, Moir, Lin, Tang, & Pires, 1996). Cardosins are
74 characterized by high milk-clotting activity (Macedo, Faro, & Pires, 1993; Sousa &
75 Malcata, 1998) and also display a strong proteolytic action in vitro, which
76 eventually leads to extensive breakdown of the caseins in the cheese matrix
77 (Macedo & Malcata, 1996), producing cheese characterized by a soft buttery
78 texture and the development of a typical aroma and a slightly piquant and creamy
79 flavour (Galán, Prados, Pino, Tejeda, & Fernández-Salguero, 2008). Aqueous
80 extracts of cardoon flowers have been used for centuries as rennets in traditional
81 ewe‟s milk cheesemaking in the Iberian Peninsula (Roseiro, Barbosa, Ames &
82 Wilbey, 2003).
83 These traditional aqueous extracts are made from flowers of diverse C.
84 cardunculus plants harvested at different flower ripening stages and mixed with
85 other parts of the plant. Hence, the milk clotting activity of the flowers shows great
86 heterogeneity in their use for of the rennet used in “Torta del Casar” manufacture.
87 This fact has a negative influence on the cheese‟s quality parameters, including
88 low yield, and lack of homogeneity of relevant sensorial factors between batches,
89 such as texture parameters. Thus, the technological quality control of the
90 aqueous extracts used as rennet would be desirable for standardization of the
91 cheese-making process.
5
92 The aim of this work was to analyze the influence of different C.
93 cardunculus populations, characterized by their clotting and proteolytic activity
94 against caseins, on the characteristics of manufactured „„Torta del Casar‟‟
95 cheeses.
96
97 Materials and Methods
98 2.1. Plant material
99 Samples of cardoon (Cynara cardunculus, L.) used in this study were
100 identified in accordance with the guidelines of Valdés, Talavera, & Fernández-
101 Galiano (1987). Sixteen plants were collected from different locations during the
102 seasons of the years 2007 and 2008 (Ordiales, Martín, Benito, Hernández, Ruíz-
103 Moyano, & Córdoba, 2012). The collected flowers were dried and kept in a cool
104 dry place until use.
105 2.2. Milk-clotting activity assays
106 For the milk-clotting assays, 0.5 g of each cardoon sample was softened in
107 75 ml of ultrapure water for 1 and 24 h. The rennet clotting time of these
108 coagulant extracts was measured according to a standard method (NILACTM;
109 NIZO, Ede, The Netherlands) described by Tavaria, Sousa, & Malcata (2001).
110 The substrate was prepared by dissolving 12 g of low-heat bovine skimmed milk
111 powder in 100 mL of 0.01 M CaCl2 (pH 6.5) at 30ºC. The enzymatic assay was
112 performed using 0.2 mL of coagulant extract added to 2 mL of reconstituted skim
113 milk, and the clotting time was determined by visual inspection. One rennet unit
6
114 (R.U.) was defined as the amount of crude enzyme extract needed to coagulate
115 10 mL of reconstituted low-heat processed skim milk at 30ºC in 100 s (FIL-IDF
116 157/1992). Determinations were quadruplicated, and the mean of each set of four
117 data was taken as the datum point.
118 2.3. “In vitro” casein proteolytic activity
119 The dried flower extracts were prepared by macerating 0.25 g of dried
120 flowers in 5 mL of water (corresponding to a proportion of 50 g in 1 L) at room
121 temperature for 4 h. The homogenate was filtered through a Whatman filter No. 4.
122 The substrate used for degradation by the extracts consisted of a mix of bovine
123 caseins (Sigma Aldrich, Co., St. Louis, MO, USA) (  ,  , and κ), at a
124 concentration of 0.5 mg/mL of each casein, dissolved in 5 ml of distilled water.
125 The dried flower extracts were macerated with the casein mix, at 2.5% of extract
126 (v/v), for 2 h at room temperature to allow casein degradation. After this time the
127 extracts with degraded caseins were denatured by adding 30 µL of SDS-PAGE
128 loading buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% (w/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 5%
129 (w/v) β-mercaptoethanol, 0.025% (w/v) bromophenol blue) and incubated at 99ºC
130 for 5 min.
131 The electrophoresis conditions were those described by Laemmli (1970),
132 and the concentrations of acrylamide (29:1 acrylamide/bisacrylamide) in the gels
133 were 4% (w/v) for stacking gels and 15% (w/v) for separating gels. Gels were
134 cast and run in a Miniprotean III device (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).
135 The molecular mass marker kits (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) contained
136 proteins from 6.5 to 205 kDa. The gels were subsequently stained with 0.5%
7
137 (w/v) Coomassie blue (G-250) dissolved in 45% (v/v) water, 45% (v/v) methanol,
138 and 10% (v/v) acetic acid for 30 min, and destained with a solution consisting of
139 20% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid, and 70% (v/v) distilled water for 4 h. A
140 computer image analysis program (Genetools, Synoptics Ltd., Cambridge, U.K.)
141 was used for the densitometric analysis of the gel electrophoresis.
142
143 2.4. “Torta del Casar” cheese-making procedure
144 A total of sixteen different batches of “Torta del Casar” were manufactured,
145 of 10 cheeses each batch, from unpasteurized Merino ewe‟s milk to which no
146 starter cultured was added. Each batch was clotted using different C. cardunculus
147 L. rennets, corresponding to the 16 plants collected as before. The aqueous
148 extracts from the cardoon C. cardunculus L. were prepared from 50 g of dried
149 flowers in 1 L of water, leaving them to macerate for 24 h, and adding 10 mL of
150 this extract per litre of milk at 28–30ºC, for each 32 L batch. After pressing, the
151 cheeses were immersed in a salt solution (16 % (w/v) NaCl) for 4 hours. The
152 ripening took place at a temperature of 5–10ºC and relative humidity of 85–90 %
153 throughout the ripening period of 60 days. Three cheeses of each batch were
154 randomly taken for analysis after 2, 30, and 60 days of ripening.
155
156 2.5. Physicochemical analysis
157 The weight losses of the cheeses were measured through the differences
158 of consecutives weights from the initial weight to the final weight at day 60 of
8
159 ripening. The pH was measured using a Crison mod. 2002 pH meter (Crison
160 Instruments, Barcelona, Spain). Total protein was determined by the Kjeldahl
161 method (International Dairy Federation (IDF), 1993), with a Kjeltec system 1002
162 distilling unit (Tecator, Hoganas, Sweden).
163 The yield was determined as the quantity of cheese obtained per volume
164 of milk, expressed in %. The cutting time is the time needed for curd to form, from
165 when the rennet is added to when the curd is cut.
166
167 2.6. Microbial counts
168 For the microbial counts and isolates, 10 g aliquots of each cheese sample were
169 taken aseptically, transferred to sterile plastic pouches, 10-fold diluted with 1%
170 peptone water (Pronadisa, Alcobendas, Madrid, Spain), and homogenized for
171 120 s using the laboratory Stomacher Lab-Blender 400 (Seward Lab., London,
172 England). Serial 10-fold dilutions were prepared from the same solution and
173 inoculated onto agar plates.
174 Plate count agar (PCA, Oxoid) was used for mesophilic aerobic bacteria counts at
175 30ºC for 48 h and for psychrotrophs for 7 days at 7ºC. LAB were grown in MRS
176 agar (Oxoid) of which the pH was adjusted to 5.6 with acetic acid (10%),
177 incubating at 37ºC for 2 days under anaerobic conditions. The Staphylococcus
178 counts were determined in Baird Parker agar (BP; Oxoid) supplemented with
179 potassium tellurite and egg yolk emulsion at 37ºC for 48 h, and black colonies
180 were counted.
181
182 2.7. Analysis of whey and casein proteins

9
183 2.7.1. Preparation of whey and casein protein extracts
184 The whey protein fractions were extracted from cheese as described in the
185 literature (Enne, Elez, Fondrini, Bonizzi, Feligini, & Aleandri, 2005). Samples (20
186 g) were homogenized (2 cycles of 1 min each) in doubly distilled water (30 ml)
187 with an Ultraturrax homogenizer (Ika®-Werke, Staufen, Germany). Since this step
188 is heat-producing, a strict time optimization was required to avoid whey protein
189 degradation. The homogenized samples were skimmed by centrifugation (2000 ×
190 g for 15 min at 4 °C). Casein was precipitated at its isoelectric point by adding 1M
191 hydrochloric acid and centrifuging at 2500 × g for 10 min at 4°C.
192 Caseins were obtained from 1g of cheese samples by precipitation at pH 4.3, by
193 the addition of 10 ml of 1 M ammonia–acetate buffer at 8ºC for 20 min (Veloso,
194 Teixeira, Peres, Mendoça, & Ferreira, 2004). Then the samples were centrifuged
195 for 15 min at 3000 g at 4ºC to recover the precipitated caseins. The caseins were
196 dispersed in 10 ml of 1 mM ammonia–acetate buffer (pH 4.3), precipitated again,
197 and centrifuged for 10 min at 3000 g at 4ºC. This procedure was repeated twice.
198 In order to eliminate the remaining fat, the sample was washed with 5 ml acetone
199 and left to dry at room temperature. Finally, the dried powdered casein was
200 stored at -80ºC until analysis.
201
202 2.7.2. Protein concentration and polycrylamide gels (SDS and UREA PAGE)
203 The protein concentration was determined following the Bradford method using
204 100 μl of the soluble protein extracts.
205 Whey protein hydrolysis was detected by SDS-PAGE (Mini-PROTEAN 3 system,
206 Bio-Rad, Hercules, CA). For this, whey protein extracts were electrophoresed
207 using 4% acrylamide in stacking gels and 15% acrylamide in separating gels.
10
208 Samples (15 µl) were denatured by boiling for 5 min in 0.0625 M Tris–HCl buffer
209 at pH 6.8 with 20% glycerol, 2% SDS, and 5% 2-mercaptoethanol. A molecular
210 weight marker from 205 kDa to 6.5 kDa (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)
211 was used as standard. The potential was kept constant at 90 mV for the stacking
212 gel and at 150 mV for the separating gel. Proteins were visualized by Coomassie
213 brilliant blue R-250 staining (0.25% (w/v), in 50% (v/v) methanol and 10% (v/v)
214 acetic acid). The excess stain was washed out by destaining with a solution of
215 20% (v/v) methanol and 5% (v/v) acetic acid. A computer image analysis program
216 (Genetools, SynGene, Cambridge, United Kingdom) was used for the
217 densitometric analysis of the gels.
218 Casein protein hydrolysis was detected by UREA-PAGE. Casein protein extracts
219 were electrophoresed using 4% acrylamide in stacking gels and 12% acrylamide
220 in separating gels. The stacking gel buffer was 0.06 M
221 tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris), 8 M urea at pH 6.8, and the separating
222 gel buffer was 0.76 M Tris, 8 M urea at pH 8.8. The electrophoresis buffer was a
223 solution of 0.02 M Tris, 0.19 M glycine. Samples (5 µl) were denatured by boiling
224 for 5 min in 0.0625 M Tris–HCl buffer at pH 6.8 with 10 M urea, 20% glycerol, and
225 5% 2-mercaptoethanol. Standard proteins α, β, and κ caseins (Sigma Chemical,
226 St. Louis, MO, USA) were used as standard. A computer image analysis program
227 (Genetools, SynGene, Cambridge, United Kingdom) was used for the
228 densitometric analysis of the gels. Electrophoresis was developed as above.
229
230 2.8. Non-protein nitrogen and amino acid nitrogen analysis
231 Non-protein nitrogen (NPN) was determined by the Nessler method using 4 g of
232 sample after protein precipitation with 0.6 M perchloric acid. Amino acid nitrogen
11
233 (AN) was determined from the 0.6 M perchloric acid protein precipitation fraction
234 after peptide precipitation with 10% sulfosalicylic acid (Benito et al., 2005).
235
236 2.9. Biogenic amine production (BA)
237 & Pelikánová (1998). A 10 g sample
238 was homogenized and then shaken in a closed Erlenmeyer flask with 75 mL of
239 0.6 M HClO4 for 1 h. The mixture was filtered through a filter paper, washed with
240 HClO4 and the volume adjusted to 100 mL. In accordance with the expected
241 amine content, 5 mL of acidic extract was transferred to a test tube, the volume
242 adjusted to 5 mL with HClO4, and then spiked with 125 μL of internal standard
243 solution (1,7-heptanediamine, 400 mg L−1). The mixture was then made alkaline
244 by adding 1 mL of 9.8 M NaOH solution. After brief vortexing, 100 μL of pure
245 benzoyl chloride was added. The test tube was shaken for 2.5 min. Then it was
246 allowed to stand in the water bath of the laboratory ultrasound cleaner for 15–20
247 min. Subsequently 2.5 g of NaCl were shaken with the solution for 1 min. This
248 was followed by a two-step extraction with 3 mL of diethyl ether. Combined
249 extracts (1 ml in each step) were dried under a stream of hot air. The dry residue
250 was dissolved in 400 μL of methanol–water (1:1, v/v). The biogenic amines were
251 assayed by micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC) (Benito et al.
252 2007; Martín et al. 2007) using an automated PACE 5500 (Beckman Instrument
253 Inc., Palo Alto, CA, USA.
254
255 2.10. Sensory analysis
256 At the end of ripening, a quantitative descriptive analysis was performed by a
257 trained panel of 15 judges to evaluate differences in flavour and aroma

12
258 parameters. This procedure involved cutting slices approximately 0.5 cm thick.
259 Samples were three-digit coded, and the order of serving was determined by
260 random permutation. Two panel-replicates were carried out for each sample. The
261 response to each indicator was determined as the mean value of the panelist‟s
262 responses. In an additional hedonic test, a panel of 17 untrained consumers
263 evaluated the samples for overall acceptability.
264
266 For the cardoon plants‟ classification based on their in vitro casein proteolytic
267 activity, the hierarchical clustering method was employed, based on average
268 linkage using SPSS 15.0 (SPSS Inc Chicago, IL, USA). The statistical analysis of
269 the data was carried out using one-way analysis of variance, and the means were
270 separated by Tukey‟s honest significant difference test using SPSS for Windows,
271 15.0. The relationships between the enzymatic activities of the rennets and the
272 physicochemical parameters of the cheeses were evaluated by Pearson
273 correlation coefficients. A principal component analysis (PCA) was performed on
274 the enzymatic activities of the rennets and the physicochemical parameters of
275 cheeses at 2 days of ripening.
276
277
278 Results and Discussion
279 Figure 1 shows the results regarding the classification of the cardoon plants and
280 their proteolytic activity in vitro, indicating the clotting activity of each cluster. Five
281 clusters were obtained, with three supergroups of the cardoon plants classified as
13
282 very, moderately, or scarcely proteolytic, this last being the case of samples M13
283 and M15 (Fig. 1). The cardoon plants of cluster 1 are characterized by a strong
284 degradation of α- and κ-casein (84 and 81%, respectively), and moderately
285 degraded β-casein (54%). Cluster 2 groups cardoons with a moderate proteolytic
286 activity on β-casein (67%), and great intensity on α- and κ-casein (88 and 83%,
287 respectively). The cardoons in cluster 3 showed a moderate degradation of κ-
288 casein (54%), but intense degradation of α- and β-casein (93 and 92%,
289 respectively). The degradation of α-casein was intense (82%), of β-casein
290 moderate to high (70%) for cardoons of cluster 4, with κ-casein being degraded to
291 a lesser degree (23%). Finally, the cardoons of cluster 5 moderately degraded α-
292 casein (39%), and showed a very low proteolytic activity on β- (10%) and κ-
293 casein (9%).
294 After classifying the cardoons, 16 batches of cheeses were made with
295 rennet derived from the different cardoon plants. Figure 2 presents the principal
296 component analysis (PCA) of the proteolytic parameters of the cheeses at 2 days
297 of ripening with the clotting and proteolytic activity of the 16 cardoon rennets used
298 for the cheese making.
299 The first axis accounted for 35.25% of the variance and was mainly
300 defined by proteolysis parameters such as degradation of α-, β-, and κ-caseins,
301 and also by cutting time and yield of the cheeses at 2 days of ripening, with
302 positive correlations between the parameters. The second axis (PC 2; 14.33% of
303 the variance) was related to clotting activity of the rennets at 2 days of ripening.
14
304 Batches 1, 2, 3, 6, 7, 10, and 16 were positively related to the casein
305 degradation, cheese yield, and the cutting time of the curd. Batches 13 and 15
306 were negatively correlated with parameters as cheese yield, degradation of α-, β-,
307 and κ-casein, and the clotting time. The same trend was observed for batches 9
308 and 11, but to a lesser extent.
309 Thus, the cardoon plants that had high proteolytic activity in vitro, also
310 showed this activity in the cheeses. The contrary behavior was very evident for
311 those plants classified as scarcely proteolytic (M13 and M15). These cardoon
312 plants used as rennets will therefore have different effects on the development of
313 the sensorial characteristics of the cheeses.
314 Figure 3 shows the evolution of different parameters during processing.
315 The pH values ranged from 6.85 at the beginning of the ripening time to 5.65 at
316 60 days of ripening. The pH is of great importance in cheese ripening due to its
317 influence on the proteolytic activity. Proteolytic activity in cheese is determined
318 mainly by the levels and type of residual rennet, salt and moisture ratio,
319 temperature of ripening, and changes in pH during ripening (Lawrence, Creamer
320 & Gilles, 1987). Over the ripening time, we observed a decrease in cheese
321 weight, by 1.35% at 2 days of ripening, to 33.41% at the end of the period
322 studied.
323 The evolution of the microorganism counts during processing is shown in
324 Figure 3. Total aerobic mesophilic counts had increased from 9.3 to 10.4 log CFU
325 /g in the cheeses after 60 days of ripening in all batches, and from 8.2 to 9.3 for
326 psychrotrophs. Similar results have been found in other traditional cheeses.
15
327 Galán, Cabezas, & Fernández-Salguero (2012) worked with cheese elaborated
328 using powered plant coagulant (C. cardunculus) and found stable counts for total
329 viable organisms of 8.7 log CFU/g throughout ripening time.
330 With respect to LAB, all the batches showed a statistically significant
331 increase, reaching levels higher than 8 log CFU/g after 60 days, and for
332 staphylococci the counts stayed stable until the end of the process at levels
333 around 6.5 log CFU/g. This growth of LAB is coherent with the evolution of the pH
334 values during the processing. Stable levels of Staphylococcus sp. of 6.5 log
335 CFU/g were found throughout ripening time. In other work, micrococci and LAB
336 counts remained constant in cheeses elaborated using C. cardunculus coagulant,
337 with counts of 5.3 log CFU/g for micrococci, and 8.7 log CFU/g for LABs (Galán
338 et al., 2012).
339 Regarding the evolution of parameters related to proteolysis throughout
340 the cheese ripening (Table 1), caseins were degraded, with their content in the
341 cheese decreasing from 283.99 mg g-1 at the beginning of the ripening process to
342 226.49 mg g-1 at the end. As a consequence, the level of whey proteins in the
343 cheeses was higher at 60 days (262.27 mg g-1) of ripening than at 2 days (171.23
344 mg g-1). It seems that the whey protein content stabilized between 30 and 60
345 days of ripening time. The NPN and AN concentrations increased during ripening
346 due to the breakdown of caseins, from 2.05 at 2 days to 3.55 mg g-1 at 60 days of
347 ripening for NPN, and from 0.59 mg/g to 1.63 mg/g for AN. Mas Mayoral,
348 González Crespo, & Nieto Villaseca (1991) recorded an increase in IP (NPN/NT)
349 from 3.94% at 3 d following manufacture to 13% at the end of ripening time for
350 “Torta del Casar” cheese. Sanjuán, Millán, Saavedra, Carmona, Gómez, &
16
351 Fernández-Salguero (2002) reported for “Los Pedroches” cheeses, manufactured
352 with vegetable (C. cardunculus) rennet, that TN values ranged from 5.92 g/100 g
353 at 2 days of ripening to 6.04 g/100 g DM at 60 days of ripening. Moreover, the
354 content of NPN and AN in these cheeses increased throughout the ripening
355 period. Similar results were obtained for “La Serena” cheese after 60 days of
356 ripening (Núñez, Fernández del Pozo, Rodríguez Martín, Gaya, & Medina, 1991).
357 Soluble nitrogen components at the beginning of the process in these cheeses
358 are produced mainly by the action of Cynara cardunculus proteases (Roa, López,
359 & Mendiola, 1999; Galán et al., 2012), although microorganisms are responsible
360 for proteolysis from the middle to the end of the process. The degradation of
361 water insoluble nitrogen, and therefore the production of water soluble nitrogen, is
362 mainly driven by residual rennet trapped in the cheese matrix, which hydrolyses
363 α-casein (Creamer & Olson, 1982; Dulley, 1974).
364 The results obtained for the protein content after two days of ripening were
365 positively correlated with coagulant activity (1 hour), with the higher the protein
366 content, the greater the coagulant activity (1 h). Among factors that affect milk
367 coagulation, casein concentration plays an important role (St-Gelais & Haché,
368 2005). Caron, St-Gelais, & Pouliot (1997) observed that coagulation was delayed
369 (long coagulation time) in milk with high protein content relative to milk with a low
370 protein concentration. Moreover, the casein content was negatively correlated
371 with coagulant activity (24 h) at 30 and 60 days of ripening, with the higher the
372 rennet clotting activity (24 h), the lower the content of casein at 30 and 60 days.
373 This is due to the greater degradation of caseins. Van Hekken and Holsinger
374 (2000) observed that rennet coagulation properties were related not only to
17
375 casein concentration but also to the proportion of α-casein and β-casein present
376 in the milks. In parallel with the evolution of the casein, the rennet coagulant
377 activity (24 h) influenced the AN content of the cheese at 30 and 60 days of
378 ripening. The correlation is positive, meaning that the greater the coagulant
379 activity (24 h), the greater the content of AN in the cheese at 30 and 60 days of
380 ripening due to the effect of the degradation of caseins.
381 The effect of proteolysis during processing is also shown in Figure 4 for the
382 UREA and SDS-PAGE gels. The casein profile evolved throughout ripening,
383 showing a gradual degradation of caseins (86% for α- casein and 74% for β-
384 casein) in all samples. Concomitant with this decrease in concentration of these
385 caseins was an increase of nitrogen compounds derived from proteins. The same
386 was the case for whey proteins, which decreased throughout the process, but
387 peptides deriving from casein hydrolysis appeared during the ripening.
388 Proteolysis, the ratio of β- to k- caseins, has been used as a basis to classify
389 cheeses (Fox, 1993; Sousa, 2001). Macedo and Malcata (1996) studied the
390 hydrolysis of α- and β-caseins during the ripening of “Serra” cheese by
391 polyacrylamide gel electrophoresis. They observed that, by the end of ripening,
392 the α- and β-caseins had undergone extensive degradation, up to 82 and 76%,
393 respectively. However, other authors found that, while α-casein decreased
394 throughout ripening, β-casein only decreased slightly, confirming its greater
395 resistance to enzyme hydrolysis (Fernández-Salguero & Sanjuán, 1999). The
396 hydrolysis of β-caseins seems to be related to the type of rennet (Macedo and
397 Malcata, 1996).
18
398 Compounds derived from protein degradation contribute to cheese flavour
399 and to the development of the correct texture.
400 With respect to the biogenic amine content of the cheese (Table 1), no
401 influence was found of the rennet used for cheese making. The levels of the
402 amines were lower than in other reports of this kind of products (Contreras,
403 Izquierdo, Allara, García, Torres, & Céspedes, 2007).
404 The results thus show a major development of proteolysis in the cheeses
405 during ripening, resulting in the generation of AN corresponding to greater clotting
406 activity of the rennet without any increase of biogenic amine (BA) production.
407 Table 2 presents the parameters of the sensorial analysis of the cheeses
408 at the end of the ripening period, and their correlation with the characteristics of
409 the rennet. The degradation of β-casein was positively correlated with the
410 compactness of the cheese paste, while degradation of the casein is negatively
411 correlated with the acidic taste. The degradation of β-casein appears to
412 negatively influence the creaminess of the cheese, with the greater the
413 degradation the less the creaminess. Some authors suggest that β-casein might
414 be essential for the hardening of curd (St. Gelais et al., 2005). Likewise, β-casein
415 degradation was negatively correlated with the bitter taste of the cheese, ie, the
416 less the degradation, the more bitter the taste.
417 The κ-casein degradation was negatively correlated with the aftertaste of
418 the cheese, with the less the κ-casein degradation, the greater the aftertaste in
419 the cheese.
19
420 The clotting activity (24 h) influenced the creaminess, viscosity, the type of
421 cheese and its acceptability, with a positive correlation in all cases. Thus, the
422 greater the value of clotting activity, the greater the values of creaminess,
423 viscosity, the “Torta” type of cheese, and the acceptability. Cardoon coagulation
424 leads to significantly softer, yellower, and creamier cheeses (Agboola, Chan,
425 Zhao, & Rehman, 2009).
426 Therefore the most appropriate cardoons for making this cheese are those
427 which show greater clotting activity and moderate proteolytic activity on β-casein
428 mainly, suggesting that the plants of Cluster 1 (Figure 1) provide rennets with
429 desirable characteristics for the cheese. A high ratio of clotting-to-β-casein
430 proteolytic activity is an essential parameter for the classification of the cardoons
431 used in the “Torta del Casar” process.
432 One can conclude that the technological characteristics of this vegetable
433 rennet indeed influence the „„Torta del Casar‟‟ final product, with the clotting and
434 proteolytic activity being the fundamental parameters that determine these final
435 characteristics. So the use of controlled and characterized cardoons in the
436 manufacturing process of „„Torta del Casar‟‟ is fundamental to obtaining the
437 homogeneous product demanded by the Registry of the Protected Designation of
438 Origin „„Torta del Casar‟‟.
439
441 The authors are grateful to M. Cabrero and C. Cebrián for technical assistance
442 and PDO „„Torta del Casar‟‟ for technical support.
20
443
444 References
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557 European Journal Biochemistry. 235, 762 – 768.
558
559
25
560 Figure 1. Dendrogram obtained from the proteolytic and clotting activities of
561 cardoon plants with different similarity percentages.
562 Figure 2. Principal component analysis of the proteolysis parameters in cheeses
563 at 2 days of ripening, and technological properties of vegetable rennets: plane 1–
564 2 of variable plot (A); Distribution of cheese batches depending on their
565 classification group on the dendrogram obtained from the proteolytic and clotting
566 activities of cardoon plants according to plane 1–2 of a factorial correspondence
567 analysis (B).
568 Figure 3. Evolution of different parameters during processing.
569 Figure 4. Evolution of proteins during processing. (A) Urea-Page with casein
570 protein extracts from cheeses at 2, 30, and 60 days of ripening. M, standard
571 proteins α, β, and κ caseins. (B) SDS-Page with whey protein extracts from
572 cheeses at 2, 30, and 60 days of ripening. M, molecular weight marker.
573
26
Tables 1 and 2
Table 1. Protein changes of cheeses made with different rennets and the correlations of these characteristics with the clotting and proteolytic activity of the
rennet.
Correlations
Descriptive statistics Clotting activity (R.U.)
Degradation of caseins
after maceration
N Mean SD Min Max 24h 1h α-caseins β-casein κ-casein
% Protein 16 16.72 1.13 15.29 19.32 0.235 0.696** -0.183 0.002 -0.178
Whey protein (mg/g)
a
2 days 16 171.8 42.4 112.1 302.6 -0.082 -0.318 0.025 -0.032 0.137
b
30 days 16 261.3 53.7 165.2 344.7 0.12 -0.33 -0.216 -0.282 -0.055
b
60 days 16 262.4 34.1 203.4 320.0 0.046 -0.148 0.089 0.028 0.025
Caseins (mg/g)
c
2 days 16 285.8 39.2 222.7 373.7 -0.467 -0.101 0.085 0.243 0.279
b
30 days 16 244.5 31.7 178.6 311.6 -0.596* -0.046 0.117 0.379 0.232
a
60 days 16 226.5 26.0 188.4 283.1 -0.556* -0.17 0.242 0.369 0.43
NPN (mg/g)
a
2 days 16 2.05 0.47 1.36 2.82 -0.039 -0.361 0.206 0.098 0.39
b
30 days 16 2.81 0.46 2.03 3.68 0.409 0.031 -0.021 0.055 0.127
c
60 days 16 3.54 0.90 2.20 6.02 -0.026 -0.354 -0.302 -0.166 -0.275
AN (mg/g)
a
2 days 16 0.60 0.10 0.45 0.78 0.013 -0.37 -0.198 -0.119 -0.486+
b
30 days 16 1.19 0.24 0.70 1.63 0.500* -0.116 -0.344 -0.278 -0.293
c
60 days 16 1.63 0.40 1.16 2.49 0.568* 0.094 0.056 -0.105 -0.193
BA (mg/g 60 days)
a
Putrescine 16 0.069 0.084 nd 0.408 0.098 -0.194 -0.269 -0.349 -0.096
a
Cadaverine 16 0.148 0.494 nd 0.493 0.13 -0.052 -.768** -.539* -0.473
a
Triptamine 16 0.006 0.018 nd 0.066 0.078 -0.094 -0.123 -0.030 -0.078
a
Spermidine 16 0.012 0.018 nd 0.103 -0.308 -0.363 0.128 0.164 -0.028
1
a
Spermine 16 0.224 0.404 nd 0.446 0.384 -0.219 0.283 0.037 0.097
a
Tiramine 10 0.036 0.097 nd 0.575 0.127 -0.212 -0.374 -0.096 -0.523
a
Means of the same parameter in the same column without a common superscript letters (a-c) differ significantly (P<0.05)
+ P<0.1.
* P<0.05.
** P<0.01.
nd: not detected
2
Table 2. Descriptive statistics of the sensorial attributes of the batches studied. and correlations with technological properties of the vegetable rennets used.
Correlation
Descriptive statistics Clotting activity
(R.U.) after Degradation of caseins
Sensorial attributes maceration
N Mean SD Min Max 24h 1h α-caseins β-casein κ-casein
Compact paste 16 5.61 0.65 4.10 6.60 0.009 -0.082 0.418 0.534* 0.182
Acid odour 16 3.88 0.61 2.72 5.06 -0.043 -0.399 -0.454 -0.576* -0.432
Hardness 16 4.18 0.66 2.95 4.99 -0.317 -0.087 0.31 0.494 0.187
Creaminess 16 4.79 0.77 3.50 6.01 0.507* 0.028 -0.337 -0.532* -0.227
Viscosity 16 4.01 0.94 2.66 5.45 0.657** -0.064 -0.209 -0.367 -0.273
Salty 16 4.68 0.47 3.68 5.70 -0.402 -0.345 -0.092 -0.058 -0.206
Bitter 16 3.21 0.47 2.47 3.94 0.13 -0.344 -0.298 -0.519* -0.138
Pungent 16 1.43 0.36 0.92 2.02 -0.246 -0.076 -0.139 -0.062 -0.275
Acid 16 3.89 0.58 2.89 4.86 -0.146 -0.403 -0.222 -0.364 -0.334
Astringent 16 1.78 0.37 1.10 2.55 -0.16 -0.058 -0.376 -0.383 -0.37
Rancid 16 0.72 0.17 0.48 1.07 -0.195 -0.055 -0.017 -0.188 0.103
Aroma intensity 16 6.11 0.46 5.22 6.85 -0.062 -0.043 -0.381 -0.351 -0.453
Aftertaste 16 5.83 0.40 5.34 6.60 0.053 0.002 -0.482 -0.430 -0.550*
Kind of cheese “Torta” 16 4.24 0.81 2.80 5.39 0.515* -0.198 -0.247 -0.354 -0.272
Acceptability 16 6.01 0.56 5.18 6.88 0.504* 0.176 -0.127 -0.127 -0.016
* P<0.05.
** p<0.01.
3
Figures 1-4
Figure 1
75 % 80 % 85 % 90 % 95 % 100 %
CA (RU/mL) (24h): 0.269; (1h): 0.127 M4, M5, M8, M12, M14
α-casein: 83.76%; β-casein: 54.27%;

κ-casein: 81.31%
Cluster 1
CA (RU/mL) (24h): 0.163; (1h): 0.134
M1, M2, M3, M6, M7, M10

κ-casein: 83.04%
Cluster 2
M16
CA (RU/mL) (24h): 0.149; (1h): 0.131 α-casein: 92.79%; β-casein: 91.55%;
κ-casein: 54.24%
Cluster 3
CA (RU/mL) (24h): 0.202; (1h): 0.156 M9, M11

κ-casein: 22.93%
Cluster 4
CA (RU/mL) (24h): 0.224; (1h): 0.159

M13, M15
Cluster 5 κ-casein: 8.69%
1
Figure 2
1
0.8 β-casein
0.6 degradation
Component 3 (14.33%)
AN Caseins
0.4 Cutting time
0.2
Whey
0 CA1h α-casein
NPN degradation
-0.2 %PRO
Yield
-0.4 k-casein
-0.6 degradation
CA 24h
-0.8
-1
-1 -0.5 0 0.5 1
1.5 Batch 6
Batch 8
1
Batch 12 Batch 10
0.5 Batch 15
Batch 11
Batch 4
0
Batch 13 Batch 7 Batch 3
-0.5 Batch 14 Batch 2 Batch 16 Batch 1
-1
Batch 9
-1.5
-2
Batch 5
-2.5
-3
-2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2
2
Figure3
Weight Loss (%) pH
40 8
35 7
30 6
Weight Loss values
25 5
pH values
20 4
15 3
10 2
5 1
0 0
2 30 60
Days
Aerobic mesophilic Psychro. LAB Staphylococci
11
10
9
8
log CFU g-1
7
6
5
4
3
2
0 10 20 30 40 50 60 70
Days
3
Figure 4
A) M 2 days 30 days 60 days
k casein
b casein
a casein
B) M 2 days 30 days 60 days
205
116
97
84
66
55
45
36
29
24
20
14.2
6.5
4
IV.3.3. Role of authoctonous microorganisms on the texture characteristics of the
tradictional cheese “Torta del Casar”.
297
1 Role of autochthonous microorganisms on the texture characteristics of the traditional
2 cheese “Torta del Casar”.
4 Elena Ordialesa; María José Benitob*; Alberto Martínb, Margarita Fernándezb; Rocío Casqueteb;
5 María de Guía Córdoba b
a
7 Agricultura, Centro Tecnológico Agroalimentario Extremadura (CTAEX), Ctra. Villafranco a
8 Balboa Km. 1.2, Villafranco del Guadiana, 06195 Badajoz, Spain
b
9 Nutrición y Bromatología, Escuela de Ingenierías Agrarias, Universidad de Extremadura, Ctra.
10 de Cáceres s/n, 06071 Badajoz, Spain
11
12
13
15 Tel.: +34 924 286200; fax: +34 924 286201
18
298
19 Abstract
20 The aim of the present work was to investigate the effect of the autochthonous microorganism on
21 the development of texture and sensory characteristics in the traditional cheeses ‘‘Torta del
22 Casar”. In addition, determine the microorganisms that play an important role in the development
23 of the texture characteristic of these cheeses. The counts in the raw materials show that the lactic
24 acid bacteria population in cheese comes mainly from milk, while psychrotrophs and enterococci
25 population comes from the rennets. The counts in cheese during the ripening process showed that
26 the diferentes populations increased from the beginning to 30 days of ripening, and remain
27 constant or decreased slightly at the end of ripening.
28 The microbial effect in the primary proteolysis was low and only the enterococci group was
29 positively correlated with AN and IGA at 30 days of ripening, and NPN and IP at 60 days. About
30 the texture parameters, it was observed how the psychrotrophos, lactic acid bacteria, lactococci
31 and enterococci were positively correlated with adhesiviness parameters; and enterobacteria and
32 coliforms were negatively correlated. In the sensory analysis, psychrotrophos, lactic acid bacteria,
33 lactococci, and staphylococci were positively correlated with the creaminess and viscosity data
34 were. In conclusion, microorganisms have shown a decisive influence on the studied parameters
35 related to proteolysis and texture along the ripening process, emphasizing the role of lactic acid
36 bacteria, lactococci and enterococci. Thus, to control the process, it would be advisable the control
37 of these microorganisms development, being essential the development of an autochthonous
38 starter culture suitable for this traditional product.
39
40 Keywords: Torta del Casar, autochthonous microorganisms, proteolysis, texture.
41
299
42 1. Introduction
43 “Torta del Casar” is a high quality Spanish cheese marketed under the Registry of the
44 Protected Designation of Origin “Torta del Casar” (Casar de Cáceres, Cáceres, Spain) in
45 accordance with the Regulations (CE) 1491/2003 of the European Commission. This type of
46 cheese is made from raw sheep’s milk only with the dried flowers of the plant Cynara
47 cardunculus as rennet and without any deliberate addition of a starter. This cheese is much
48 appreciated by consumers for its high quality and unique flavour. The use of Merino ewe’s raw
49 milk and plant coagulant provides characteristic slightly bitter taste and a spreadable texture
50 (Delgado et al., 2010). Texture is an important characteristic of cheese in deciding consumer
51 acceptability. Proteolysis contributes to cheese matrix textural changes due to the protein network
52 breakdown. Physicochemical changes exert, in turn, a major influence upon the rheological and
53 sensory properties of the final cheese as perceived by consumers, which determine their
54 preference and eventual acceptability; appearance and texture are indeed the primary features at
55 stake during cheese purchase (Pereira et al., 2009).
56 Several microorganisms, including bacteria, yeasts and moulds, are present in cheese
57 throughout ripening. Hence, they contribute to maduration, either directly via their methabolic
58 activity, or indirectly via release of enzymes into the cheese matrix, after autolysis. These
59 microorganisms come from the raw materials used in the cheese manufacture, the rennet and the
60 raw milk. Although most of the microflora of raw milk comprises lactic acid bacteria (LAB), e.g.
61 Lactococcus and Lactobacillus spp., other microorganisms as coliforms, Staphylococcus spp.,
62 Enterococcus, Pseudomonas, etc. are also very frequently and have to be controlled because of
63 the potential public health hazards of some of this kind of microorganism (Almeida et al., 2007).
64 Rennet also plays an important role in the onset and development of much of the microorganism
65 that appears in the cheeses, and in this case, there are no studies developed regarding the
66 identification and characterization thereof. The activities of these contaminating microorganisms
67 affect the characteristics of the final cheese. In particular, the action of LAB via initial
68 fermentation of lactose and breakdown of proteins, or via more complex catabolic reactions later
300
69 during ripening, is a well-known contributor to the organoleptic features perceived in the final
70 cheese (Menéndez et al., 2000). Degradation of proteins, carbohydrates and fat is also due to the
71 microorganism activities which directly influence the taste and texture of the cheese.
72 Proteolysis in cheese during ripening plays a vital role in the development of texture as
73 well as flavour (Fox and McSweeney, 1996). Proteolysis contributes to textural changes of the
74 cheese matrix, due to breakdown of the protein network, decrease in a w through water binding by
75 liberated carboxyl and amino groups and increase in pH (Sousa et al., 2001).
76 Primary proteolysis releases large to medium-sized peptides from caseins; these can be
77 further degraded into small peptides and eventually FFA, as part of a process known as secondary
78 proteolysis. The former plays an essential role in the development of proper cheese texture,
79 whereas secondary proteolysis is more directly implicated with cheese flavour; hence, both are of
80 great importance to assure a well-balanced breakdown of curd proteins (caseins) (Visser, 1993).
81 The main proteolytic agents in the ripening process are the rennet or clotting enzymes retained in
82 the curd, and the proteases and peptidases from microorganisms (Fox and Law, 1991).
83
84 The aim of the present work was to investigate the effect of the autochthonous microorganism on
85 the development of texture and sensory characteristics in the traditional cheeses ‘‘Torta del
86 Casar”. In addition, determine the microorganisms that play an important role in the development
87 of the texture characteristic of these cheeses.
88
89 2. Materials and Methods
90 2.1. “Torta del Casar” cheese-making procedure
91 A total of sixteen different batches of “Torta del Casar” were manufactured, of 10 cheeses each
92 batch, from unpasteurized Merino ewe’s milk to which no starter cultured was added. Each batch
301
93 was clotted using different C. cardunculus L. rennets, corresponding to the 16 plants collected as
94 Ordiales et al. (2012). The aqueous extracts from the cardoon C. cardunculus L. were prepared
95 from 50 g of dried flowers in 1 L of water, leaving them to macerate for 24 h, and adding 10 mL
96 of this extract per litre of milk at 28–30º C, for each 32 L batch. After pressing, the cheeses were
97 immersed in a salt solution (16 % (w/v) NaCl) for 4 hours. The ripening took place at a
98 temperature of 5–10º C and relative humidity of 85–90 % throughout the ripening period of 60
99 days. Three cheeses of each batch were randomly taken for analysis after 2, 30 and 60 days of
100 ripening.
101 2.2. Microbiological analysis
102 Microbiological analysis was performed to raw milk, rennets and cheeses made from those raw
103 materials.
104 For the microbial counts and isolates, 10 g aliquots of each sample were taken aseptically,
105 transferred to sterile plastic pouches, 10-fold diluted with 1% peptone water (Pronadisa,
106 Alcobendas, Madrid, Spain), and homogenized for 120 s using the laboratory Stomacher Lab-
107 Blender 400 (Seward Lab., London, England). Serial 10-fold dilutions were prepared from the
108 same solution and inoculated onto agar plates.
109 Plate count agar (PCA, Oxoid) were used for mesophilic aerobic bacteria counts at 30ºC for 48 h
110 and for psychrotrophs for 7 days at 7ºC. Lactic acid bacteria (LAB) were grown in MRS agar
111 (Oxoid) of which the pH was adjusted to 5.6 with acetic acid (10%), incubating at 37ºC for 2 days
112 under anaerobic conditions and lactococci on M-17 agar (M-17,Oxoid) at 30 °C for 48 h. The
113 Staphylococcus and Micrococcus counts were determined in MSA agar (Oxoid) at 30ºC for 48 h,
114 and for Staphylococcus Baird Parker agar (BP; Oxoid) was also used supplemented with
115 potassium tellurite and egg yolk emulsion at 37ºC for 48 h, and black colonies were counted.
116 Total enterobacteria (Gram-negative and cytochrome oxidase-negative) were inoculated on Violet
117 Red Bile Glucose agar (VRBG; Oxoid), the plates were covered with a layer of the same medium
118 before incubation at 37ºC for 24 hours, and colonies that were rose-coloured and surrounded by a
302
119 halo of purple precipitate were counted. Violet Red Bile Agar (VRBA) was used for coliform
120 counts and the inoculated plates of this medium were also covered with a layer of the same
121 medium before incubation at 30ºC for 48 h. Typical dark red colonies (>0.5 mm in diameter)
122 surrounded by a zone of precipitated bile acids were considered as coliforms for the counts.
123 Moulds and yeasts were isolated on acidified Potato Dextrose Agar (PDA; Oxoid) with 5%
124 sulfuric acid and incubated at 26ºC for 96 h.
125 2.3. Moisture, water activity, and pH determination
126 The moisture content of the cheeses was determined by dehydration at 100ºC to constant weight
127 by the ISO recommended methods (ISO, 1973). Water activity (Aw) was determined using an
128 FA-St/1 apparatus from GBX (France Scientific Instrument). The pH was measured using a
129 Crison mod. 2002 pH meter (Crison Instruments, Barcelona, Spain).
130 2.4. Parameters related to protein fraction
131 Whey and caseins protein analysis: The whey protein fractions were extracted from cheese as
132 (Enne et al., 2005). Samples (20 g) were homogenized (2 cycles of 1 min each) in doubly distilled
133 water (30 ml) with an Ultraturrax homogenizer (Ika®-Werke, Staufen, Germany). Since this step
134 is heat-producing, a strict time optimization was required to avoid whey proteins’ degradation.
135 The homogenized samples were skimmed by centrifugation (2000 × g for 15 min at 4 °C). Casein
136 was precipitated at its isoelectric point by adding 1M hydrochloric acid and centrifuging at 2500 ×
137 g for 10 min at 4 °C.
138 Caseins were obtained from 1g of cheese samples by precipitation at pH 4.3, by the addition of 10
139 ml of 1 M ammonia–acetate buffer at 8ºC during 20 min (Veloso et al., 2004). Then the samples
140 were centrifuged for 15 min at 3000 g at 4ºC, to recover the precipitated caseins. The caseins were
141 dispersed in 10 ml of 1 mM ammonia–acetate buffer (pH 4.3), precipitated again and centrifuged
142 for 10 min, at 3000 g, at 4ºC. This procedure was repeated twice. In order to eliminate the
143 remaining fat, the sample was washed with 5 ml acetone and left to dry at room temperature.
303
144 Finally, the dried powdered casein was stored at -80 ºC until analysis. The protein concentration
145 was determined following the Bradford method using 100 μl of the soluble protein extracts.
146 Non-protein nitrogen and amino acid nitrogen analysis: Non-protein nitrogen (NPN) was
147 determined by the Nessler method using 4 g of sample after protein precipitation with 0.6 M
148 perchloric acid. Amino acid nitrogen (AN) was determined from the 0.6 M perchloric acid protein
149 precipitation fraction after peptide precipitation with 10% sulfosalycilic acid (Benito et al., 2005).
150 Two index have been used to analyze the proteolysis degree found in cheeses, IP (% proteolysis
151 rate) as the relation between NPN and TN, and IGA (% amino acids generation rate), which
152 relates AN to NPN.
153 2.5. Texture analysis
154 Two different instrumental texture analyses were performed using a TA.XTA2i texture analyzer
155 (Stable Micro Systems, Godalming, UK).
156 Texture compression analysis (TCA) of the samples was performed at room temperature, using a
157 cylindrical probe of 4 mm diameter. The procedure involved cutting slices approximately 1.5 cm
158 thick. Force–time curves were recorded at a cross-head speed of 1 mm s−1 164 and 10 mm
159 distance. Hardness (g), defined as maximum peak force during a compression cycle, cohesiveness
160 (g s), area under the positive curve, adhesiveness (g), maximum negative peak, and F-T 2:3 area
161 (g s), area under the negative curve, were evaluated at 2, 30, and 60 days of the process.
162 A texture spreadability analysis (TSA) was also performed at 60 days of ripening using a TTC
163 Spreadability Fixture probe. The samples were packed into the lower cone with a spatula. The
164 curves were produced at a test speed of 3 mm s−1 170 and 25 mm distance. Firmness (g) and
165 work of shear (g s) will be the maximum peak and the area under the first curve. The maximum
166 negative peak indicates the stickiness (g) of the sample, and the maximum negative area is taken
167 as the work of adhesion (g s).
168
304
169 2.6. Sensory evaluation
170 Fifteen panelists, previously selected and trained under ISO standards with samples of “Torta del
171 Casar” cheese, were asked to characterize the sensory quality of the batches selected according to
172 the protein profile of the cardoon used for the clotting stage. The cheeses were cut into slices of
173 approximately 5 mm thickness. The slices were equilibrated for 30 min at room temperature
174 before serving. Descriptive analyses were made according to international standard methods.
175 Parameters related to appearance and texture were assessed using a structured line scale with
176 intensity descriptors at the end points (1, low; 10, high). The samples were three-digit coded and
177 the order of serving was determined by random permutation. Two replicate panels performed for
178 each sample. The response to each indicator was taken as the mean of the panelists’ responses. In
179 addition to this descriptive test, a panel of 17 untrained consumers evaluated the samples for
180 overall acceptability in base of kind of cheese.
181
183 Statistical analysis of the data was carried out using SPSS for Windows, 15.0. (SPSS Inc.
184 Chicago, Illinois, USA). Descriptive statistics of the vegetable rennet activities were determined,
185 and the evolution of the physicochemical, microbial, and texture parameters of the cheese batches
186 were studied by one-way analysis of variance (ANOVA), and separated by Tukey’s honest
187 significant differences test (p ≤ 0.05). The relationships between the microorganism counts and
188 protein, texture and sensorial parameters analyzed on the cheeses were evaluated in terms of
189 Pearson correlation coefficients.
190
191 3. Results and Discussion
192 Microbial counts in raw materials
305
193 The counts in the raw materials are shown in Table 1. It can be observed that highest counts of
194 enterobacteria and coliforms were found in the rennets, while milk would provide higher amount
195 of lactic acid bacteria, lactococci, enterococci, staphylococci, micrococci and molds to the cheese.
196 The correlations of the cheese counts at 2 day of ripening with the counts from rennets and milk,
197 raw materials used in the processing of cheese batches, are shown in Table 2. The results show
198 that the lactic acid bacteria population in cheese after 2 days of ripening comes mainly from milk,
199 while psychrotrophs and enterococci population comes from the rennets. This indicates that it
200 would be important to monitor and identify the microorganisms that provide the raw materials and
201 more specifically the rennets, which have never been studied, as they may have great significance
202 in the final product as well as health consumer. On the other hand, the microbiological
203 contamination of the milk is expected to exert an influence upon the final characteristics of the
204 cheese (Pintado et al., 2010). The raw milk microbiota is an essential component of many
205 traditional cheese varieties and plays important roles during both cheese manufacture and ripening
206 (Beresford et al., 2001). Thus, Lactic acid bacteria (LAB) and other indigenous microflora seem
207 to occupy a central role in cheese – making and the generation of the distinctive flavor of cheeses
208 (Buchin et al., 1998; Leroy and DeVuyst, 2004; Abriouel et al., 2008).
209
210 Microbial counts in cheese during processing
211 Table 3 shows the counts in cheese during the ripening process. The coliforms and enterobacteria
212 populations increased slightly from the beginning to 30 days of ripening, and decreased modestly
213 at the end of ripening. The aerobic mesophilic bacteria slightly increased while the psychrotrophs
214 remained around 9.2 log CFU/g throughout ripening process. Lactobacilli increased between the
215 beginning and middle, to remain constant until 60 days of ripening while lactococci decreased
216 slightly at the end of ripening. The population of enterococci increased at the beginning of the
217 process and staphylococci and micrococci remained constant throughout the cheese ripening.
218 Finally molds and yeasts decreased moderately from the beginning to the end of cheese ripening.
306
219 Some authors have obtained similar results in the different microbial groups that develop in the
220 cheese (Tavaira et al., 1998; Galán et al., 2012).
221 Within the LAB group Enterococcus is the most controversial genus, because their natural
222 habitat is the mammalian intestinal tract and their presence in foodstuffs has usually been related
223 to poor standards of hygiene during manufacture (López – Díaz et al., 1995). However, in recent
224 years, some studies into microbiota of many traditional cheeses in Mediterranean countries have
225 indicated that they may well play an important role in the ripening of these cheeses, probably
226 through proteolysis, and lipolysis, hence contributing to their typical sensory characteristics
227 (Foulquié Moreno et al., 2006).
228
229 Moisture, water activity, and pH changes
230 The pH of the cheeses decreased along maturation, moderately at the beginning from 6.85
231 to 5.86, reaching pH values of 5.65 at 60 days of ripening (Figure 1A). The moisture of the
232 cheeses decreased progressively during ripening, from 56.6% to 40.8% at 60 days. The same
233 evolution was observed for the water activity of cheeses, decreasing from 0.97 to 0.95 (30 days)
234 and 0.94 at the end of the process. The results were similar to those obtained for other soft cheeses
235 (Roa et al., 1999; Sanjuán et al., 2002). The pH is of great importance in cheese ripening due to its
236 influence on the proteolytic activity. These pH changes may reflect the major metabolic activity
237 of lactic acid bacteria in this type of ewe´s milk cheese.
238
239 Changes in the nitrogen fraction during processing
240 Figure 1B shows the evolution of different parameters related to proteins along the
241 ripening process. Whey proteins increased from 171 to 262 mg/g until 30 days of ripening,
242 remaining constant until the end of ripening. However, the caseins decreased gradually during
307
243 ripening, from 284 to 226 mg/g, because of proteolysis mediated primarily by rennet, and then
244 by the microorganisms present in the process (Pintado et al., 2010; Pereira et al., 2010). The
245 whey proteins increase was due to casein breakage which generated soluble peptides extracted
246 with whey proteins. Similarly, the amount of NPN in cheese increased during the ripening
247 from 2.05 to 3.55 mg N/g, and the amount of AN, from 0.59 to 1.63 mg N/g. Proteolysis rates,
248 IP and IGA, also showed higher values during the process, proving the proteolysis effect
249 during the whole process. This effect seems to be more intense in the second part of the
250 ripening, indicating the possible influence of microorganisms in this activity. Similar results
251 were obtained for different authors (Núñez et al., 1991; Macedo and Malcata, 1997; Vioque et
252 al., 2000) traditional cheeses coagulated with vegetable rennet.
253 In this way, the different parameters related to proteolysis were correlated with the
254 microbial counts from the different ripening days (Table 4). At the beginning of the process (2
255 days), it was not showed correlation with microbial counts. This indicates that the microbial
256 effect in the primary proteolysis is low, as was indicated above. Proteolysis at this stage would
257 be related to the rennet. However, as ripening progresses the microbial effect on these
258 parameters was more evident. It was showed that the enterococci group was positively
259 correlated with AN and IGA at 30 days of ripening, and NPN and IP at 60 days. This suggests
260 the importance of this microbial group in the proteolysis developed during the process. Other
261 microbial groups that were positively correlated with the proteolysis parameters, were the
262 psychrotroph, lactobacilli, lactococci and staphylococci at the end of processing (60 days).
263 So these are the microbial groups that seem more related to protein degradation in
264 these products. Proteolysis increases the level of free amino acids and peptides which leads to
265 enhanced flavor intensity and accelerates cheese ripening (Corsetti et al., 1998; Franklin et al.,
266 1963; Lane et al., 1996; Lynch et al., 1996; McSweeney et al., 1993).
267 Texture, and sensory analyses
308
268 In the Texture compression analysis (TCA) results of the parameters evolution along
269 the maturation are shown in Figure 2A. Hardness and cohesiveness were gradually decreased
270 during ripening, while the values of adhesiveness and Area F-T 2:3 were higher as it advanced
271 processing. The hardness and cohesiveness decrease of cheeses indicate a higher proteolysis
272 (Awad et al., 2005), and the adhesiveness increase indicates the ability of proteins to interact
273 with water (Pastorino et al., 2003), which take place during ripening.
274 Thus, in the texture spreadability analysis (TSA) at 60 days, the mean values of the
275 parameters of firmness and work of shear were 7100 g and 6750 g s respectively (Figure 2B).
276 The average value of stickiness was 4750 g (absolute value), while the work of adhesion
277 showed a mean of 484 g s (absolute value).
278 These data were correlated with microbial counts obtaining the results showed in
279 Table 5. Again, counts at 2 days did not correlate with almost any texture parameter, indicating
280 the lower effect of the microorganisms at the beginning of the process. The early change in the
281 texture is attributed to a number of factors such as proteolysis of casein network by rennet
282 (Lucey et al., 2003).
283 It can be observed how the microbial groups that are positively correlated with
284 adhesiviness parameters were psychrotrophos, lactic acid bacteria, lactococci and enterococci
285 with the counts found at 2, 30 and 60 days. Instead, enterobacteria and coliforms were
286 negatively correlated, rising to highlight the negative effect of these microbial groups in the
287 texture of the cheeses. This group also correlated negatively with hardness and cohesiveness at
288 60 days, so an increase of these organisms produces a large softening of the product.
289 Similar results were obtained in the sensory analysis (Table 6). In which the microbial
290 groups that were positively correlated with the creaminess and viscosity data were
291 psychrotrophos, lactic acid bacteria, lactococci, and staphylococci. The group of lactic acid
292 bacteria and lactococci with the acidity parameter, and these same groups and enterococci
309
293 were positively correlated with the intensity. In all these cases the sensory parameters were
294 correlated with the counts found after 2 days of ripening. Finally, as to the overall evaluation
295 by the type of cheese “Torta del Casar” were psychrotrophos, lactic acid bacteria, lactococci,
296 enterococci and staphylococci counts, which were positively correlated with this parameter.
297 In conclusion, microorganisms have shown a decisive influence on the studied
298 parameters related to proteolysis and texture along the ripening process, emphasizing the role
299 of lactic acid bacteria, lactococci and enterococci. Thus, to control the process, it would be
300 advisable the control of these microorganisms development, being essential the development
301 of an autochthonous starter culture suitable for this traditional product.
303 The authors are grateful to M. Cabrero and C. Cebrián for technical assistance, and to PDO “Torta
304 del Casar” for technical support.
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401
402
314
403 Figure 1. Moisture content, and pH values during the process of “Torta del Casar” cheeses (1A).
404 Evolution of proteolysis parameters during the ripening of the cheese “Torta del Casar” (1B).
405
406 Figure 2. Evolution of Texture compression analysis (TCA) parameters during the ripening of the
407 cheese “Torta del Casar” (2A) and texture spreadability analysis (TSA) parameters at 60 days of
408 ripening (2B).
409
315
410 Figure 1
411 1A
8 70
7 60
6
50
Moisture, %
5
40
pH
4
30
3
20
2
1 10
0 0
2 day 30 day 60 day
Ripening time
pH Moisture
412
413
414 1B
350 5,0
Whey proteins and Caseins, mg prot/g cheese
4,5
300
4,0
NPN and AN, mg N/g cheese
250 3,5
IP and IGA, %
3,0
200
2,5
150
2,0
100 1,5
1,0
50
0,5
0 0,0
2 day 30 day 60 day
Ripening time
Whey Caseins IP IGA NPN NA

415
316
416 Figure 2
417 2A
800
700
Cohesiviness and Area FT 2:3 (gsec)
600
Hardness and Adhesiviness (g)
500
400
300
200
100
0
Hardness Cohesiveness Adhesiveness Area FT2:3
-100
-200
-300
2 day 30 day 60 day
418
419
420 2B
12000
10000
Work of Shear and Work of Adhesion, gsec
8000
Firmness and Stickiness, g
6000
4000
2000
0
Firmness Work of Shear Stickiness Work of Adhesion
-2000
-4000
-6000
-8000
421
317
422 Table 1. Counts of the rennets and the raw milk (raw materials)
Descriptive Statistics Vegetable rennets Milk

N Mean SD Min Max N Mean SD Min Max
VRBA 16 4,23 1,46 1,00 5,79 16 3,60 0,72 2,78 5,00
VRBG 16 4,37 1,91 0,60 6,90 16 3,52 0,62 2,70 4,74
PCA 16 5,28 1,53 2,48 8,70 16 5,95 2,34 4,00 11,72
PCA(psi) 16 4,67 1,81 <1 7,15 16 0,90 1,79 <1 4,30
MRS 16 2,74 2,29 <1 5,28 16 4,15 0,88 3,25 5,43
M17 16 3,89 2,17 <1 5,71 16 5,10 2,76 <1 10,48
SB 16 1,83 1,34 <1 3,75 16 3,58 0,78 2,60 5,83
BP 16 1,10 1,52 <1 5,08 16 4,28 0,46 3,85 5,46
BP(con halo) 16 0,42 1,12 <1 3,85 16 3,49 1,17 <1 4,95
MSA 16 3,82 1,91 0,30 6,85 16 4,38 0,48 3,89 5,46
PDA(moho) 16 5,33 2,03 2,78 9,08 16 2,98 0,85 2,00 4,85
PDA(lev) 16 4,87 2,46 <1 8,30 16 1,54 1,72 <1 4,48
Pseudomona 16 2,00 2,18 <1 5,36 16 2,66 1,55 <1 4,48
SPS 16 0,14 0,53 <1 2,00 16 0,79 0,97 <1 2,00
4231
424
318
425 1 Table 2. Correlations of the cheeses counts in at 2 days of ripening with the rennets and raw milk counts
Vegetable rennet Milk

VRBA -0,287 -0,006
VRBG 0,197 -0,089
PCA 0,203 -0,013
PCA(PSI) 0,465+ 0,002
MRS 0,356 0,448+
M17 0,421 -0,295
SB 0,543(*) 0,426
BP 0,116 0,165
MSA 0,135 0,059
PDA(MOHO) -0,108 -0,279
426 PDA(LEV) -0,423 -0,361
427 + P<0.01
428 * P<0.05
429
319
430 Table 3. Counts in cheeses along the ripening process (log CFU/g)
2 days 30 days 60 days

N Mean SD Min Max Mean SD Min Max Mean SD Min Max
VRBA 16 7.2 0.96 5.8 9.1 7.9 0.76 6.8 8.8 6.7 0.75 5.6 7.6
VRBG 16 7.3 1.05 5.7 9.0 7.9 0.94 5.9 9.1 6.8 0.68 5.7 7.6
PCA 16 8.9 1.20 6.7 11.7 9.4 0.41 8.8 10.2 9.4 0.65 8.5 11.1
PCA(psi) 16 8.2 1.08 6.0 9.8 9.3 0.48 8.3 10.2 9.3 0.66 8.7 11.1
MRS 16 8.0 1.14 5.8 9.8 9.1 0.49 8.4 10.3 8.9 0.51 8.5 10.4
M17 16 8.1 1.02 6.1 9.5 8.8 0.44 7.8 9.4 8.2 1.07 6.9 10.4
SB 16 6.7 0.92 5.3 7.5 7.6 0.38 7.0 8.4 7.6 0.42 7.0 8.3
BP 16 6.3 0.76 4.9 7.6 6.3 0.65 5.4 7.6 6.6 1.43 4.5 8.7
BP(con halo) 16 3.1 2.52 <1 6.5 2.1 2.17 <1 4.6 2.5 1.72 <1 4.2
MSA 16 6.9 0.91 5.5 8.8 7.2 0.49 6.4 7.9 6.9 0.43 6.2 7.8
PDA(moho) 16 4.6 1.92 2.3 8.6 3.3 1.07 2.0 6.0 4.2 0.98 2.6 6.4
PDA(lev) 16 4.5 1.53 2.8 8.2 4.0 0.54 3.1 4.8 4.1 1.97 2.4 8.2
Pseudomona 16 3.5 3.61 <1 7.6 7.7 0.56 6.9 8.7 6.7 0.42 5.9 7.3
SPS 16 1.5 1.53 <1 4.0 1.1 1.58 <1 3.6 0.3 0.74 <1 2.0
431
432
320
433 1 Table 4. Correlations of microbiological counts with proteolysis parameters along the cheese ripening. (Only shown those data in which there was correlation)
2
30 days 60 days
Whey Caseins NA IGA Whey Caseins NPN NA IP IGA
VRBA --(30) ++(2) --(30) --(30)
VRBG ++(60) --(30)
PCA --(30) ++(2)
PCA(psi) ++(60)
MRS ++(60)
M17 --(30) ++(60) ++(60)
SB +++(30,
++(30) +++(2, 30) +++(30) +++(30) --(30)
60)
BP ++(30)
MSA --(30) ++(30) ---(30) --(30)
PDA(moho) --(30)
PDA(lev) ++(60) --(60)
3 + positive correlation P<0.1
4 ++ positive correlation P<0.05.
5 +++ positive correlation P<0.01.
6 - negative correlation P<0.1
7 -- negative correlation P<0.05.
8 --- negative correlation P<0.01.
9 (2) microbial counts at 2 days
435
436
437
321
438 Table 5. Correlations of microbiological counts with Texture compression analysis (TCA) parameters (at 2, 30 y 60 days of ripening) and texture spreadability
439 analysis (TSA) parameters (at 60 days of ripening). (Only shown those data in which there was correlation)
TCA TSA
2 days 30 days 60 days 60 days
Cohesiviness Adhesiviness Cohesiviness Adhesiviness Area F-T 2:3 Hardness Cohesiviness Adhesiviness Area F-T 2:3 Work of Shear Adhesiviness Work of Adhesion
(g.seg) (g) Hardness (g) (g.seg) (g) (g.seg) (g) (g.seg) (g) (g.seg) (gsec) (g) (gsec)
VRBA --(30) --(30) ++(30) ---(30, 60) ---(30, 60)
VRBG --(30) --(30) ---(30, 60) --(30)---(60)
PCA --(30) --(30)
PCA(ps) ++(2)
MRS +++(2) ++(2) ++(2)
+++(2)
M17 --(2) ++(30) ++(2) +++(60) +++(60)
SB +++(2) +++(2) +++(2)
BP ++(30) --(30) ++(30) --(30) ++(30) ---(60) ---(60)
MSA --(60)
molds ---(2) ---(2) ---(2) --(2)
yeast --(2) ++(2) ---(2) --(2) --(2)++(60) --(2)
322
449
450
451
323
452 Table 6. Correlations of microbiological counts with sensory analysis parameters. (Only shown those data in which there was correlation)
Ewe Kind of cheese

no holes elastic spreadability creaminess viscosity juiciness acidity Intensity
cheese “Torta del Casar”
VRBA --(60) ++(2)
VRBG ++(2) --(60)
PCA
PCApsi ++(2) ++(2) ++(2) ++(2) ++(2)
MRS ++(2) ++(2) ++(2) ++(2) ++(2)
M17 ++(2) ++(2,60) +++(30) +++(2) +++(2)
SB --(30, 60) ---(60) ++(2) ++(2)
BP --(30) --(30) ++(2) ++(2) +++(2) +++(2)
MSA --(30) ++(2) ++(2) --(30)
PDAm ++(60) --(2) --(2) --(2)
PDAlev --(30) --(30) --(30)
324
462
463
464
325
V. DISCUSIÓN
Discusión
V.1. Caracterizar los cardos silvestres recolectados en la región extremeña para la

elaboración de la “Torta del Casar”.
Este trabajo ha permitido llevar a cabo la caracterización de las especies de cardos
silvestres que crecen en Extremadura, tanto a nivel morfológico, como molecular,
fenotípico y tecnológico. La DOP “Torta del Casar” autoriza el empleo de la especie de
cardo Cynara cardunculus como cuajo para la elaboración de este tipo de queso. Por
esta razón, una vez caracterizadas y diferenciadas las especies de cardo, el trabajo se
centró en la caracterización de esta especie y en su capacidad para ser empleada como
cuajo vegetal.
Las especies de cardo que se incluyen en este trabajo fueron seleccionadas porque
crecen en Extremadura y presentan flores, que una vez recolectadas, secas y picadas,
pueden ser confundidas entre sí. Las queserías que elaboran el queso “Torta del Casar”
compran el cuajo listo para ser utilizado, es decir, flores de cardo secas y picadas, por lo
tanto imposible distinguir si pertenecen a C. cardunculus o a alguna de las otras
especies de cardo de la familia Asteraceae o a una mezcla de las mismas. El uso de un
cuajo formado por flores pertenecientes a especies diferentes a C. cardunculus o a una
mezcla de especies, puede conllevar a problemas en la elaboración del queso, lo cual
redundaría en pérdidas económicas, además de suponer un fraude para la DOP “Torta
del Casar”.
V.1.1. Caracterización morfológica

La toma de las muestras de las diferentes especies de cardo en campo se realizó
según la guía de Valdés y col. (1987), utilizando esta guía para la clasificación y
caracterización morfológica de las muestras. Se trabaja con las especies Silybum
marianum, Onopordum nervosum, Cirsium arvense, Cynara humilis, Cynara scolymus
y Cynara cardunculus, todas ellas pertenecientes a la familia Asteraceae, subfamilia
Carduoideae, tribu Cynarae y subtribu Carduinae.
329
Discusión
V.1.2. Caracterización genética

La caracterización molecular de las especies de cardo objeto de este estudio se
realizó mediante las técnicas RAPDs y SSRs. En primer lugar se seleccionaron los
cebadores más adecuados para cada una de estas dos técnicas y posteriormente se
analizaron las muestras de cardo de las diferentes especies.
Se utilizaron 7 cebadores, los cuales fueron previamente empleados para la

caracterización de diferentes cultivares (Sonnante y col., 2002; Lanteri y col., 2003;
Portis y col., 2004; Hernández y col., 2010). El análisis de 7 cebadores RAPD-PCR
produjo un total de 79 bandas distintas de PCR entre las tres especies de cardos,
Onopordum nervosum, Cynara cardunculus y Cynara humilis. Estas bandas oscilaron
aproximadamente entre 168 y 1406 pb. Con el cebador OPAE10 se obtuvieron perfiles
con un gran número de bandas, de adecuada intensidad, obteniendo diferentes perfiles
para cada especie estudiada. Se encontró que había diferencias entre muestras
pertenecientes a la especie C. cardunculus. Las bandas oscilaron aproximadamente
entre 208 y 1193 pb, y se obtuvieron un total de 14 bandas polimórficas. Debido a estos
resultados, se descartaron los otros cebadores y se analizaron todas las muestras con el
cebador OPAE10.
Para llevar a cabo la técnica SSR se usaron 10 microsatélites, previamente

utilizados por Acquadro y col. (2005a, b) para la caracterización de las poblaciones
naturales de Cynara cardunculus, L. Los análisis de las reacciones de 10 SSR
produjeron un total de 71 bandas diferentes entre las tres especies de cardo estudiadas,
Onopordum nervosum, Cynara cardunculus y Cynara humilis. Las bandas oscilaron
aproximadamente de 140 a 1523 pb. Los resultados obtenidos con estos cebadores para
las diferentes especies estudiadas no fueron coherentes con los de Acquadro y col.
(2005a), salvo para el caso del cebador CMAFLP-08 para las plantas de Cynara
cardunculus. El cebador CMAFLP-24 amplificó todas las muestras, resultando en
diferentes perfiles de bandas para cada especie, e incluso aparecieron diferentes bandas
entre muestras que pertenecían a C. cardunculus. Las bandas oscilaron entre 1120 y 140
pb, y se obtuvieron un total de 11 bandas polimórficas. Resultados similares fueron
mostrados por Acquadro y col. (2005a) con las poblaciones de C. cardunculus. En este
sentido, el análisis de las muestras recolectadas se llevó a cabo con el cebador
CMAFLP-24.
330
Discusión
Después de analizar los resultados obtenidos con las técnicas RAPD y SSR se
encontró que los mejores perfiles, con el mayor número de bandas polimórficas se
obtuvieron con los cebadores OPAE10 y CMAFLP-24 para cada una de las técnicas.
Por esta razón, estos cebadores se eligieron para la caracterización de las muestras
recogidas.
Con la técnica RAPD-PCR se compararon los perfiles de bandas de ADN de las

muestras de cardos y las muestras patrón de las 5 especies, resultando tres grupos, uno
de ellos contiene las muestras de la especie O. nervosum, otro agrupa las muestras de C.
humilis, y el tercer grupo está compuesto por las muestras pertenecientes a C.
cardunculus. Las muestras clasificadas morfológicamente como Silybum marianum y
Cirsium arvense no se agruparon en ninguno de estos tres grupos, estando
genéticamente muy cercanas, con un porcentaje de similitud del 85 % y cercanas a la
especie O. nervosum.
El primero de estos grupos agrupa 9 de las muestras recolectadas con el patrón

O. nervosum 07, con porcentajes de similitud del 55 %. Se distinguen tres subgrupos
por diferencias en bandas secundarias, en concreto se diferencian entre sí por las bandas
de 540 pb y la de 852 pb. El segundo de los grupos aglutina 17 muestras con el patrón
de Cynara humilis 08, con porcentajes de similitud de 40 %. Todas las muestras
mostraron perfiles similares de 5 bandas de pesos moleculares entre 1184 y 314 pb, pero
se detectaron diferencias a nivel de bandas secundarias, que dividieron este grupo en 4
subgrupos. Las muestras del subgrupo 1 mostraron dos bandas de amplificación
adicionales, de 442 y 380 pb. Las muestras del subgrupo 2 presentaron dos bandas
secundarias de 813 y 756 pb. El subgrupo 3 mostró un perfil idéntico de 6 productos de
amplificación, con pesos moleculares entre 1184 y 314 pb. Finalmente, el subgrupo 4,
que fue el más alejado genéticamente del resto, con porcentaje de similitud de 40 %,
mostró perfiles idénticos de tres bandas, con pesos moleculares de 442, 380 y 314 pb.
Por otra parte, el tercer grupo engloba 78 muestras con el patrón Cynara cardunculus,
que fue un 90 % diferente de los otros dos grupos, estando claramente diferenciados.
Las muestras presentaron perfiles de 7 bandas comunes y varias diferencias en las
bandas secundarias. Se encontraron tres subgrupos con más del 60 % de similitud. Por
tanto, se deduce una gran variabilidad genética dentro de la población de C.
cardunculus. Esta afirmación es consistente con las conclusiones de Portis y col. (2005).
331
Discusión
Se obtuvieron árboles similares a partir de las muestras de cardos, mediante la

técnica SSR. Se observan tres grupos mayores, que contienen cada una de las especies
estudiadas, O. nervosum, C. humilis y C. cardunculus, y las muestras Silybum
marianum y Cirsium arvense no se agruparon en ninguno de estos grupos. Estas dos
muestras mostraron porcentajes de similitud mayores que con la técnica RAPD.
La distribución de cada muestra en diferentes subgrupos con la técnica SSR se

debió también a diferencias en las bandas secundarias de baja intensidad, y fue muy
similar a la obtenida con la técnica RAPD.
Con estos resultados se pone de manifiesto que ambas técnicas permiten

caracterizar de una forma rápida y adecuada todas las muestras de cardos de la familia
Asteraceae estudiadas. Ambos sistemas de marcadores mostraron que las tres
poblaciones poseen un remarcable número de diferencias. El mayor grado de
diferenciación genética se encontró entre las poblaciones de C. cardunculus, debido al
mayor número de bandas polimórficas RAPD y SSR, que fueron encontradas en el
grupo de C. cardunculus. Esta variabilidad genética encontrada especialmente para las
poblaciones naturales de C. cardunculus (variedad sylvestris), puede traducirse en
variaciones en los perfiles bioquímicos de los cuajos empleados en la elaboración del
queso, afectando las características del producto final.
Se ha demostrado que estas técnicas pueden ser usadas como un método efectivo
para conseguir la autenticidad y trazabilidad del cuajo por la DOP del queso “Torta del
Casar”.
V.1.3. Caracterización fenotípica

La caracterización fenotípica de las diferentes especies de cardo de la familia
Asteraceae se realizó en base al perfil de proteínas que contienen las flores de estas
plantas, que son el órgano que se emplea para la obtención del cuajo vegetal en el
proceso de elaboración del queso. Los perfiles de proteínas se analizaron con las
técnicas SDS-PAGE y FZCE.
El análisis de los perfiles de proteínas de las diferentes especies de cardo

estudiadas, llevado a cabo mediante la técnica SDS-PAGE, mostró un total de 15
bandas con unos pesos moleculares en el intervalo de 13 a 67 kDa. Se observan
332
Discusión
diferencias cuantitativas en los densitogramas obtenidos para cada una de las especies
de cardo estudiadas. El perfil de C. cardunculus presenta 9 bandas, las más intensas, de
16,7 y 28,3 kDa, y 13,5 y 30,2 kDa, corresponden a las cardosinas A y B,
respectivamente. El resto de las bandas que presenta esta especie pertenecen a
procardosina A (45 y 55 kDa) y procardosina B (60,2 kDa), como describe Ramalho
Santos y col. (1997). La forma madura de cardosina A (31 kDa) se detectó en células
del tejido calloso con una banda de 45 kDa y otra de 55 kDa. La banda de 45 kDa se
observa frecuentemente y se ha descrito que corresponde a cadenas no disociadas de la
enzima (Ramalho Santos, 1998). Respecto a la cardosina B, se detectó la banda de 64
kDa (60,2 kDa en nuestro estudio), que se corresponde con el precursor y la banda de 55
kDa, similar a la observada para cardosina A. Estos autores sugieren que la banda de 55
kDa puede corresponderse con una forma intermedia de cardosinas, aunque esta banda
no fue detectada en flores de cardo (Ramalho – Santos, y col., 1997; Vieira, y col.,
2001), sino en semillas o en hojas (Pereira, y col., 2008). La especie Cynara scolymus
presenta un perfil de proteínas formado por 10 bandas polipeptídicas, en un rango de
peso molecular de 13,5 a 60,2 kDa. Las bandas que corresponden a las cardosinas A y B
mostraron la misma intensidad que las de C. cardunculus, mientras que la banda de 60,2
kDa fue significativamente menos intensa que la encontrada en C. cardunculus (Sidrach
y col., 2005). Por otra parte, el perfil de proteínas de Cynara humilis queda definido por
5 bandas polipeptídicas, correspondiendo a las bandas características de cardosina A
(16,7 y 30,2 kDa) y otras bandas menos intensas (55, 60,2 y 66,2 kDa), las cuales
podrían corresponder a formas de procardosinas, como sugieren Ramalho Santos y col.
(1998). En este perfil no se aprecian las bandas correspondientes a cardosina B, en
concordancia con Esteves y col. (1995), que afirmaba que las flores de C. humilis no
contienen cardosina B. Las cardosinas A y B representan las proteasas aspárticas mejor
caracterizadas, junto con las cyprosinas (Brodelius y col., 1998; Cordeiro y col., 1994).
Respecto a la especie Silybum marianum, su perfil mostró 3 bandas proteicas, dos de
ellas de 35 y 64 kDa aproximadamente, no se encontraron en el resto de las especies
estudiadas en este trabajo. Por último, el perfil de Onopordum nervosum se caracterizó
por bandas de 30, 32, 59 y 67 kDa aproximadamente, las cuales no se observaron en los
perfiles del resto de especies estudiadas. En este sentido, los diferentes perfiles de
proteínas obtenidos con la técnica SDS-PAGE, permiten diferenciar las 5 especies de
cardo pertenecientes a la familia Asteraceae estudiadas.
333
Discusión
Los electroferogramas obtenidos al aplicar la técnica FZCE a las especies de

cardo englobadas en este trabajo, mostraron un total de 24 picos bien definidos,
encontrando diferencias cuantitativas y cualitativas entre las especies de cardo. El perfil
de la especie Silybum marianum estaba definido por los picos 8, 9, 12 y 14, que no se
encontraron en el resto de las especies de cardo. Onopordum nervosum mostró un perfil
formado por los picos 1, 4, 6, 22 y 24, los cuales tampoco se observaron en el resto de
las especies estudiadas. Los picos 11 y 15 fueron significativamente diferentes entre las
muestras de O. nervosum y las especies del género Cynara. La especie Cynara humilis
mostró un perfil compuesto por los picos 3, 5, 7 y 23, ausentes en los perfiles de las
otras especies del género Cynara. El pico 15 fue significativamente mayor para C.
humilis y C. scolymus respecto a C. cardunculus. El área del pico 16 fue mayor para las
especies C. cardunculus y C. scolymus que para la especie C. humilis, mientras que el
pico 21 fue significativamente superior para las muestras de la especie C. humilis. Por
otra parte, las muestras de C. cardunculus y C. scolymus mostraron perfiles similares,
de hecho, ambas especies mostraron perfiles definidos por los mismos picos, excepto el
pico 15, que fue significativamente mayor para C. scolymus que para C. cardunculus.
Esta similitud entre estas dos especies se justifica porque proceden de un ancestro
común (Foury, 1989; Rottenberg y Zohary, 1996; Raccuia y col., 2004). El pico 11 de
las especies del género Cynara podría incluir las cardosinas purificadas A y B (Ordiales
y col., 2012). Sin embargo, otros picos, como 15, 16 y 17, podrían corresponderse a
cardosinas con diferente carga, debido a su diferente nivel de glicosilación (Sidrach y
col., 2005). Por tanto, estos resultados demuestran que el método FZCE puede
discriminar las especies de cardo de la familia Asteraceae estudiadas. La efectividad de
este método para discriminar entre variedades de otros vegetales ha sido previamente
descrita para la autentificación de variedades de pimentón (Hernández y col., 2007) y de
variedades de cereza tipo “Picota” (Serradilla y col., 2008).
Además, se empleó este método para estudiar la variabilidad en la especie C.

cardunculus. Comparando los electroferogramas de esta especie se encontraron
diferentes perfiles, lo cual permite dividir las muestras de C. cardunculus, recogidas en
la campaña de 2006, en tres grupos. Estos tres grupos mostraron 9 picos con el mismo
tiempo de retención, pero dos de los grupos mostraron 2 picos más, los picos 18 y 19.
Estos tres grupos también se diferencian por las áreas de los picos que los definen.
334
Discusión
Este método analítico podría emplearse para identificar el origen de las flores
secas de los cardos empleados como cuajo en las queserías, con el fin de evitar fraudes,
y garantizar la autenticidad del cuajo.
V.1.4. Caracterización tecnológica

Para estudiar la actividad proteolítica de los cuajos de las diferentes especies de
cardo estudiadas se parte de los extractos acuosos obtenidos por maceración en agua de
las flores secas y picadas. Se evaluó la capacidad de degradación de las caseínas de la
leche, α, β, y κ-caseína, por parte de los extractos o cuajos. Cynara cardunculus
hidrolizó α-caseína en un 89,83 %, mostrando una actividad proteolítica sobre esta
caseína superior que el resto de las especies, salvo C. scolymus, que degradó α-caseína
en un 80,56 %. En cuanto a la degradación de κ-caseína, las especies del género Cynara
pudieron degradarla prácticamente en su totalidad, mostrando una actividad proteolítica
superior que las especies O. nervosum (67,49 %) y S. marianum (44,92 %) para esta
caseína. Respecto a β-caseína, la degradación por parte de C. cardunculus y O.
nervosum fue ligeramente superior a la del resto de las especies estudiadas, aunque no
se apreciaron diferencias significativas. Tavaira y col. (2001) afirmaron que C.
cardunculus presenta mayor actividad proteolítica sobre α-caseína que sobre β-caseína,
pero los valores encontrados por ellos fueron generalmente menores que los obtenidos
en este trabajo. Cavalli (2005) afirmó que el extracto de S. marianum produjo una gran
degradación de αs-caseínas, y solo una degradación ligera de β-caseína, aunque en
nuestro estudio observamos que esta especie degradó con mayor intensidad β-caseína.
En ese sentido, Sousa y Malcata (1998) encontraron similares valores de degradación de
α- y β-caseína por los extractos de C. cardunculus. En nuestro estudio los valores de
actividad proteolítica de los extractos de C. cardunculus sobre las caseínas fueron
mayores que los observados para el resto de las especies estudiadas.
Se realizó un análisis de componentes principales en base a los perfiles proteicos

obtenidos con las técnicas SDS-PAGE y FZCE, y la actividad proteolítica sobre las
caseínas de la leche, de las diferentes especies de cardo de la familia Asteraceae
estudiadas. El primer eje explicaba el 22,38 % de la varianza y estaba definido por la
actividad proteolítica sobre α y κ-caseína, las bandas SDS-PAGE de 16,7, 28,3, 30,2 y
60,2 kDa, y los picos FZCE 10, 11, 13, 15, 16, 17 y 20. El segundo eje, explica el 16,29
335
Discusión
% de la varianza, y se define por los picos FZCE 3, 5, 21 y 23, las bandas SDS-PAGE
de 45 y 55 kDa y la actividad proteolítica sobre β-caseína. Según este análisis de
componentes principales, las muestras de las diferentes especies estudiadas se
agruparon entre sí y se diferencian del resto, en base a las variables con las que se
correlacionan cada una de ellas. De modo que las muestras de S. marianum se
correlacionaban con los picos FZCE 8, 9, 12 y 14, y las bandas SDS-PAGE de 35 y 64
kDa. Por otro lado, las muestras de la especie O. nervosum parecen estar
correlacionadas con los picos FZCE 1, 4, 6, 7, 22 y 24, y las bandas SDS-PAGE de 30,
32, 59 y 67 kDa. Las muestras que pertenecen a las especies del género Cynara no
aparecen tan separadas entre sí, aunque se observan tres grupos diferenciados. Las
muestras de la especie C. humilis se correlacionan con los picos FZCE 3, 5, y 21, las
bandas SDS-PAGE de 37,3 y 55 kDa, y la actividad proteolítica sobre β-caseína. Se
observa que las muestras de C. scolymus y de C. cardunculus se correlacionan con el
resto de variables.
Debido a que la especie de mayor interés de las incluidas en este trabajo es

Cynara cardunculus, por ser la especie autorizada por la DOP “Torta del Casar” para
ser utilizada como cuajo vegetal, se profundiza en su caracterización tecnológica,
partiendo de la variabilidad encontrada para esta especie, a nivel molecular y de perfiles
proteicos. De modo que este trabajo es el primero que aborda la diferenciación entre y
dentro de las poblaciones de C. cardunculus, lo cual resulta especialmente interesante
en Extremadura, pues esta planta también se emplea como cuajo en la elaboración de
otros quesos típicos de la región.
De los resultados obtenidos en este trabajo se deduce que la actividad coagulante

de los extractos es una de las características que definen la calidad tecnológica del
cuajo, por tanto se incluye un estudio de los factores que pueden influir en la actividad
coagulante que presentan los extractos de las plantas de C. cardunculus. Concretamente
se estudia la influencia de la concentración de extracto en la obtención del cuajo, el
tiempo de maceración, la cantidad de cuajo que se aporta a la leche, el almacenamiento
en refrigeración del extracto, así como la influencia en la actividad coagulante del año,
la localización y el estado de maduración de la flor en el momento de su recolección.
336
Discusión
En cuanto a la concentración del extracto, se observó que los extractos

preparados a menor concentración presentaron menores valores de actividad coagulante,
de forma que se comprobó que a mayor concentración (g flores secas y picadas/ml
agua) del extracto, mayor actividad coagulante. Se aplicó la técnica SDS-PAGE a estos
extractos para estudiar su perfil proteico y su actividad proteolítica sobre las caseínas y
se observó que las muestras de extracto preparadas con mayor concentración,
presentaron un perfil proteico con bandas con mayor intensidad que las muestras de
menor concentración. Igualmente, el efecto de la concentración de extracto se reflejó en
la actividad proteolítica del extracto sobre las caseínas, de forma que los extractos más
concentrados degradaron las caseínas con mayor intensidad. La actividad coagulante del
cuajo empleado es uno de los factores que influye sobre la mayor o menor degradación
de las caseínas (Irigoyen y col., 2000).
Respecto a la influencia del tiempo de maceración en la actividad coagulante

del extracto, se comparó la actividad coagulante de dos extractos, A30 y A49, a tres
concentraciones diferentes, en cuatro tiempos de maceración.
Para la muestra de cardo A30, para la concentración de 0,65 g/100 ml, el mayor
valor de actividad coagulante se obtuvo tras 4 horas de maceración, siendo superior
significativamente al resto de los tiempos ensayados. Para los extractos preparados a la
concentración 5 g/100 ml, el mayor valor de actividad coagulante se encontró tras 16 h
de maceración, superior significativamente al valor encontrado tras 4 horas de
maceración. En cuanto a los extractos preparados a la concentración 10 g/100 ml, no se
encontraron diferencias significativas para los diferentes tiempos de maceración.
Teniendo en cuenta todas las variables, el mayor valor de actividad coagulante para esta
muestra de cardo se obtuvo con la concentración 10 g/100 ml, tras 1 h de maceración, y
el menor valor para la concentración 0,65 g/100 ml, tras 2 horas de maceración.
Para el extracto preparado con la muestra de cardo A49, para las tres
concentraciones ensayadas, los mayores valores de actividad coagulante se obtuvieron
con los extractos preparados tras 4 horas de maceración. Con este extracto,
considerando todas las variables ensayadas, se puede decir que el mayor valor de
actividad coagulante se encontró para el extracto preparado con la concentración 10
g/100 ml tras 4 h de maceración, mientras que el valor más bajo lo presentaron los
extractos de 0,65 g/100 ml, tanto a 1 h, como tras 16 h de maceración.
337
Discusión
Parece que tiene más influencia sobre la actividad coagulante la concentración

del extracto que el tiempo de maceración, ya que parece que con alta concentración se
obtiene una alta actividad coagulante con menor tiempo de maceración.
Se aplicó la técnica SDS-PAGE a estos extractos y se observó la influencia de la

concentración de los extractos en la intensidad de las bandas del perfil, siendo los
perfiles con mayor intensidad los que corresponden a los extractos más concentrados
(10 g/100 ml). En cambio, no se apreciaron diferencias en la intensidad de las bandas en
base al tiempo de maceración de los extractos. En cuanto a la actividad proteolítica de
estos extractos sobre las caseínas, se observó diferente degradación de las caseínas para
extractos preparados con diferente concentración, sin encontrar diferencias por el
tiempo de maceración.
Se estudió la influencia de la cantidad de cuajo añadido a la leche en la actividad

coagulante, para lo que se ensayaron cuatro cantidades diferentes de extracto que se
añade al sustrato de leche, con dos tiempos de maceración, para tres muestras de cardo.
Para un mismo tiempo de maceración se observa que a mayor cantidad de extracto
añadida, mayor actividad coagulante, con diferencias significativas entre las cantidades
de extracto. Esta afirmación se puede aplicar a las tres muestras de cardo y los dos
tiempos de maceración. En este caso parece que ejerce más influencia sobre la actividad
coagulante la cantidad de extracto añadida a la leche, que el tiempo de maceración del
extracto, de forma que la actividad coagulante de los extractos que se añaden a la misma
cantidad fue estadísticamente igual entre sí, a pesar de haberse preparado con diferentes
tiempos de maceración. Tan solo los extractos añadidos al 5 % de la muestra A208
fueron significativamente diferentes entre sí.
Tras analizar los resultados de actividad coagulante de las muestras de cardo,

recogidas en tres años diferentes, tres estados de maduración y varias localizaciones, no
se observan diferencias significativas entre los extractos preparados con las muestras
para los diferentes años de recolección, los estados de maduración de la flor, ni
considerando la localización donde fueron recogidas. Por tanto la actividad coagulante
de un extracto no se influenciada por ninguna de estas tres variables. Se estudió el perfil
proteico de 4 muestras de extracto, preparadas con la misma concentración, 5 g/100 ml
H2O, y el mismo tiempo de maceración, 1 hora. Se observa que las diferentes muestras
presentan el mismo perfil en cuanto a bandas se refiere, pero no en la intensidad de
338
Discusión
dichas bandas. Estas diferencias en la intensidad de las bandas de los perfiles proteicos
se traducen en diferente actividad proteolítica sobre las caseínas, de modo que los
perfiles con bandas más intensas, fueron los más proteolíticos. Ello significa que la
actividad coagulante es diferente en cada una de las muestras de cardo recogidas.
Finalmente se estudió la influencia del tiempo de almacenamiento en refrigeración

del extracto en su actividad coagulante. Para la concentración 0,65 g/100 ml, la
actividad coagulante de los extractos fue significativamente inferior tras 1 día en
refrigeración, respecto al extracto recién preparado y tras 7 días refrigerado. Sin
embargo, para la concentración 7 g/100 ml, el extracto que mostró mayor actividad
coagulante fue el que estuvo 1 día refrigerado, diferente significativamente al resto,
mientras que la actividad coagulante más baja se encontró para el extracto recién
preparado. Con las concentraciones del extracto, 5 g/100 ml y 10 g/100 ml, se observa
que la actividad coagulante del extracto aumenta con el tiempo de refrigeración,
existiendo diferencias significativas entre los extractos. Por tanto parece que la actividad
coagulante de los extractos no se reduce al mantenerlos en refrigeración al menos
durante 7 días, pudiendo observar incluso un incremento en la actividad coagulante.
Tavaira y col. (2001) estudiaron los efectos del almacenamiento y liofilización de los
extractos de Cynara cardunculus en la degradación de caseínas ovinas y caprinas.
Observaron que la actividad coagulante tiende a disminuir con el tiempo de
almacenamiento, de forma que extractos, almacenados a 4º C mostraron una
disminución del 65 % de su actividad coagulante tras 4 semanas, con una pérdida del 22
% en la segunda semana. Afirman que la actividad proteolítica sobre α- y β-caseína
aumentaba tras 1 semana en refrigeración y disminuía entre la semana 1 y 2 de
almacenamiento.
V.2. Evaluar la influencia que los diferentes años y estadios de maduración en la

recolección del cardo ejercen sobre las características sensoriales de las tortas.
Teniendo en cuenta la gran variabilidad encontrada entre plantas de Cynara
cardunculus a nivel molecular y de perfil de proteínas, se pretende estudiar la influencia
de esta variabilidad en las características del producto final, ya que esta variabilidad
puede ser una de las razones de la falta de homogeneidad que se relaciona con el queso
“Torta del Casar”. Así mismo se plantea la necesidad de conocer si otras variables,
339
Discusión
como el año de recolección, y el estado de maduración de la flor en el momento de

recolección, influyen en la heterogeneidad del cuajo y por tanto, del queso.
Este estudio se basa en el análisis de perfiles de proteínas de los extractos acuosos

de 16 muestras de plantas diferentes de C. cardunculus, los cuales se obtuvieron
aplicando dos técnicas, FZCE y SDS-PAGE. Para investigar el potencial del método
FZCE para controlar la calidad tecnológica de los extractos acuosos, los parámetros
analíticos fueron evaluados y comparados con aquellos obtenidos con la técnica SDS-
PAGE.
Con las 16 muestras de cardo mencionadas se elaboraron 16 lotes de quesos tipo

“Torta del Casar”, a través de los que se estudió la influencia de las diferencias en las
propiedades tecnológicas de los cuajos en las características de los quesos.
La resolución y los tiempos de migración para las proteínas solubles en metanol

fueron apropiadas para usarlas con el protocolo de FZCE propuesto. Las proteínas
fueron resueltas en 20 minutos y separadas en 18-22 picos y hombros bien definidos.
Sólo se estudiaron los 10 picos más relevantes del perfil de proteínas. Respecto a los
parámetros analíticos, se encontró que el método FZCE ofrece buena repetitividad de
los CMT con coeficientes de variación (RSD %; n = 5) de < 2 % para la mayoría de los
compuestos proteicos analizados. Según el CMT, las cardosinas purificadas A y B,
estarían incluidas en el pico 4. Sin embargo, otros picos como el 3, 6 y 7 podrían
corresponder a cardosinas con diferente carga, debido a los diferentes niveles de
glicosilación (Sidrach y col., 2005). De hecho, los picos mencionados mostraron
simetría y espectro de absorbancia similares a los de las cardosinas purificadas. Los
resultados muestran que el protocolo FZCE propuesto para el ensayo de proteínas
solubles en metanol es un método potencialmente útil para controlar la calidad
tecnológica de los extractos acuosos usados como cuajo en la elaboración de la “Torta
del Casar”.
Respecto a la técnica SDS-PAGE, los densitogramas muestran un total de 9 bandas

polipeptídicas diferentes, con un peso molecular en el rango de 13,5 a 66,2 kDa. El paso
de precipitación de proteínas mediante cloroformo en el procedimiento de extracción de
proteínas solubles en metanol para análisis de CZE conlleva una pérdida de la fracción
apolar de la proteína, respecto al extracto de proteína entera para el análisis SDS-PAGE.
Por tanto, la resolución de más proteínas mediante CZE que mediante PAGE podría ser
340
Discusión
atribuida al método. A pesar de la menor efectividad de la técnica SDS-PAGE respecto

a FZCE a la hora de discriminar variedades vegetales, ha sido empleada por varios
autores con este fin (Cancalon, 1995; Hernández y col., 2006; Manabe, 1999). En
nuestro estudio hay relevantes diferencias en todos los perfiles polipeptídicos de
proteínas de las 16 muestras de extractos acuosos estudiados. Por tanto, el análisis de
proteínas de cardo mediante SDS-PAGE podría ser también una herramienta
potencialmente útil para caracterizar las propiedades tecnológicas de este cuajo vegetal.
Se estudió la relación entre las actividades coagulantes y proteolíticas de los

extractos acuosos de las muestras de cardo de diferentes localizaciones, años de
recolección y estados de maduración de la flor. Los valores de actividad coagulante
oscilaron entre 0.118-0.169 y 0.149-0.347 UR/ml para 1 hora y 24 horas de maceración,
respectivamente. Tavaria y col. (2001) obtuvieron valores de actividad coagulante en
torno a 18 UR/ml para extractos 15 veces más concentrados de Cynara cardunculus
recogidos en Portugal. Estos autores también encontraron una mayor actividad
proteolítica sobre α que sobre β-caseína, pero los valores de porcentajes de degradación
fueron generalmente más bajos que los encontrados en nuestro estudio. Respecto al
factor investigado (estado maduración, localización y año de recolección) no se
encontraron diferencias significativas en los valores de actividad coagulante y actividad
proteolítica sobre fracciones de caseínas, aunque las muestras en el estadio b de
maduración mostraron el mayor valor medio de degradación de β-caseína (P<0,01). Un
resultado similar fue encontrado para muestras de la localización “Ctra. Mérida –
Madrid” en el caso de la degradación de k-caseína. Cordeiro y col. (1994) estudiaron las
actividades proteolítica y coagulante de extractos de flores maduras recogidas en 8
localizaciones diferentes de Portugal, las cuales mostraron alguna variación en la
actividad proteolítica, mientras la actividad coagulante fue esencialmente la misma para
todos los extractos. Por tanto, se ha demostrado que estos factores son ineficaces como
criterio para seleccionar las flores de Cynara cardunculus que son apropiadas
tecnológicamente para la producción de cuajo vegetal en la elaboración de “Torta del
Casar”.
Respecto a la relación del estado de maduración de la flor con el perfil CE y la

intensidad de las bandas SDS-PAGE de las muestras de cardos, en general no se
apreciaron diferencias relevantes en los elecroferogramas FZCE, sólo el pico 9 fue más
alto en las muestras del estado b. Resultados similares fueron obtenidos con los
341
Discusión
densitogramas SDS-PAGE dado que sólo la banda proteica 4, de peso molecular

aparente 32 kDa mostró diferencias, en este caso, siendo más intensa para los cardos
recogidos en el estado inicial. Esta banda podría corresponderse a la subunidad α de
cardosina B (Sousa y Malcata, 1998). Otras bandas fueron cautelosamente identificadas
por sus pesos moleculares como procardosinas (66,2 and 60,2 kDa), forma intermedia
de cardosina (38 kDa), otra α-subunidad (30,2 kDa) de cardosinas y β-subunidades de
cardosinas (16,7 y 13,5 kDa) (Sampaio y col., 2008; Verissimo y col., 1996). Sin
embrago, estas bandas de proteínas también pueden incluir otras enzimas presentes en el
tejido del cardo (López-Molina y col., 2003).
Considerando las correlaciones entre los parámetros analíticos (áreas de los picos
CE e intensidades de las bandas SDS-PAGE) y las actividades coagulante y proteolítica,
se puede afirmar que las áreas de los picos 3+4 y 6 están fuerte y positivamente
correlacionadas (P<0,01) con los valores de la actividad coagulante tras 1 hora de
maceración y con la degradación de β y k-caseína respectivamente. Además la suma de
las áreas de los picos estaba positivamente correlacionada con la degradación de β-
caseína. Según sus valores de actividad proteolítica o de degradación de las caseínas, los
picos arriba mencionados pueden incluir cardosinas activas o sus precursores. Dado que
la cardosina B tiene una especificidad más amplia (como pepsina) que cardosina A
(como quimosina) (Veríssimo y col., 1996), los picos 3+4 y 10, correlacionados con la
degradación de k-caseína, pueden relacionarse con cardosina A, mientras que los picos
6 y 9, correlacionados con la degradación de β-caseína, pueden relacionarse con
cardosina B.
Respecto al análisis de bandas SDS-PAGE, la intensidad de las bandas de 66,2 y

20,7 kDa mostraron fuerte correlación con la degradación de β-caseína, mientras que las
banda 8, de 16,7 kDa, probablemente incluye β-subunidades de cardosina A, estaban
positivamente correlacionadas con actividad coagulante. Estos resultados mostraron que
los métodos CE y SDS-PAGE podrían ser útiles a priori para la caracterización
tecnológica de los extractos acuosos de Cynara cardunculus. Por ello, es necesario
conocer el impacto del cuajo vegetal con diferentes perfiles CE y SDS-PAGE en las
propiedades sensoriales de los quesos “Torta del Casar”.
342
Discusión
Para conseguir este propósito se elaboraron 16 lotes de quesos tipo “Torta del
Casar”, cada uno con una de las muestras de cardo (C. cardunculus) estudiadas y se
analizaron, entre otros aspectos, los atributos sensoriales de los quesos obtenidos.
El análisis de componentes principales (PCA) de los atributos descriptivos

sensoriales, la puntuación general, y los perfiles CE y SDS-PAGE mostraron diferencias
importantes entre las muestras de quesos elaborados. El primer eje explicaba el 21,45 %
de la varianza y estaba principalmente definido por la intensidad del flavor y la
persistencia, y sabor picante, astringente y amargo, pero también por los descriptores de
textura como blandura (lo contrario que dureza) y untabilidad. Un incremento en la
valoración de estos atributos podría estar parcialmente relacionado con la actividad
proteolítica no específica del cuajo vegetal, pero también con otros factores como la
actividad proteolítica microbiana. De hecho, no se encontraron correlaciones relevantes
entre ningún pico importante del perfil CE o las bandas del perfil obtenido mediante
SDS-PAGE y PC1. El segundo eje (PC 2; 17,17 % de la varianza) incluye la
aceptabilidad global, viscosidad, jugosidad y en menor medida, la cremosidad, junto
con el pico 3+4 de CE y la banda SDS-PAGE de 16,7 kDa, mientras que el descriptor
de flavor desagradable, junto con varias bandas SDS-PAGE (13,5; 30,2; 32,0 y 60,2
kDa). Como ha sido mostrado anteriormente, el pico CE 3+4 y la banda SDS-PAGE de
16,7 kDa también mostraron una fuerte correlación con la actividad coagulante, como el
pico CE 6. Sin embargo, este último pico no se correlacionó positivamente con los
descriptores de la aceptabilidad global y la cremosidad. Por el contrario, la relación
entre la aceptabilidad global y el pico CE 6 fue negativa, según el análisis de correlación
(P value <0,1) y PC3 (14,41 % de la varianza). Con el propósito de confirmar los picos
3+4 y 6 como marcadores de control de calidad, se empleó un método de regresión de
mínimos cuadrados (PLSR). El modelo (r = 0,626) indica que el 39,2 % de la variación
del descriptor cremosidad podría ser predicho a partir de las áreas de los picos CE
seleccionados. Así mismo, el modelo para la aceptabilidad global (r = 0,650) indicó que
hasta un 42 % de esta variación podría ser predicha a partir de estos picos marcadores.
Por el contrario, el análisis mediante PLSR la correlación de las bandas SDS-PAGE con
la actividad proteolítica y coagulante no mostraron buenos resultados.
Como conclusión de este apartado cabe destacar que el protocolo de extracción de

proteínas solubles en metanol, de extractos de flores de C. cardunculus y el
procedimiento de análisis de FZCE, constituyen un procedimiento rápido, económico y
343
Discusión
eficiente para la caracterización tecnológica del cuajo vegetal en el procesado de “Torta

del Casar”. Por tanto, proponemos que esta técnica podría ser usada para el control de
calidad rutinario del cuajo vegetal usado en la elaboración del queso con DOP “Torta
del Casar”.
V.3. Estudiar las modificaciones en las características físico – químicas,

microbiológicas y sensoriales que la utilización de los diferentes cardos
recolectados generan en las tortas elaboradas.
En primer lugar se estudió la influencia de las características tecnológicas de los
cuajos en la textura del queso “Torta del Casar”, así como en los parámetros
relacionados con la proteólisis del queso a lo largo de su maduración y las
consecuencias a nivel sensorial. Finalmente se recoge la influencia de la microflora
presente en el queso a lo largo del proceso de maduración del queso, tanto en la textura,
como en el perfil de compuestos volátiles.
V.3.1. Influencia de las propiedades tecnológicas del cuajo en la textura del queso
Torta del Casar.
Las diferencias detectadas en las propiedades tecnológicas de los cuajos, no se
muestran a nivel de maduración del cardo o la localización, observando una alta
variabilidad intra-grupo en ambos factores, como se comentaba anteriormente. En este
estudio, la degradación de α-caseína osciló de 24,39 (muestra M15) al 100 % (muestras
M1 y M3), mientras que la degradación de β-caseína y κ-caseína osciló entre 4,32 –
91,55 % y 4,21 – 98,43 % respectivamente. Tavaira y col. (2001) encontraron mayor
actividad proteolítica sobre α y β-caseína. Silva y Malcata (1999) también observaron
que αs-caseínas eran hidrolizadas más rápido que β-caseína en ensayos in vitro. Esta
observación es comparable con lo que ocurre en el queso, dado que ha sido afirmado
que β-caseína es menos susceptible a la proteólisis que αs-caseínas en la elaboración de
quesos de leche cruda de oveja, en la que se emplean extractos de C. cardunculus como
cuajo (Sousa y Malcata, 1997; Roa y col., 1999).
Se correlacionaron las características tecnológicas de los cuajos con los

parámetros tiempo de corte, rendimiento de cuajada y las características físico –
344
Discusión
químicas de los quesos a los 2 días tras su elaboración. El tiempo de corte osciló entre
35 y 75 minutos y mostró una correlación negativa con la actividad coagulante de los
extractos tras 24 h de maceración. Sin embargo, este parámetro estaba positivamente
correlacionado con la actividad proteolítica inespecífica sobre las caseínas. Aunque
algunos estudios se han realizado sobre las propiedades gelificantes de las proteasas
presentes en los coagulantes vegetales, no hay datos disponibles respecto a las
propiedades de cada cardosina, y su contribución independiente a la actividad
coagulante global y las propiedades gelificantes. Silva y col. (2003) mostraron que las
cardosinas exhiben un comportamiento reológico diferente entre ellas, y también si se
comparan con la quimosina. Este conocimiento es importante con el fin de reducir
racionalmente la variabilidad en la elaboración de los quesos, empleando extractos de C.
cardunculus.
El valor medio de rendimiento de la cuajada para los quesos estudiados fue bajo
(23,8 %) confirmando resultados previos (Agboola y col., 2009). Mas Mayoral y col.
(1991) encontraron rendimientos en queso ligeramente inferiores que el obtenido en este
estudio, en torno a 16,5 y 20 %. Este parámetro no está claramente unido a las
actividades coagulantes, pero mostró una correlación positiva con la degradación de κ-
caseína, la primera fase de la coagulación de la leche.
Con respecto a los parámetros físico-químicos de los quesos frescos, los valores
medios de humedad y pH fueron de 56,61 % y 6,85, respectivamente, mientras que la aw
osciló entre 0,96 a 0,99. Sanjuán y col. (2002) estudiaron la influencia del cuajo vegetal
en las características físico – químicas del queso “Los Pedroches” durante la
maduración. A los 2 días de maduración la humedad de los quesos era 51,63 %, el valor
de pH era 5,6 y el de la aw, de 0,975. Los valores de pH estaban positivamente
correlacionados con la actividad proteolítica de los extractos acuosos, lo cual se atribuye
al hecho del efecto buffer generado por los productos de la hidrólisis de proteínas
(Shammet y col., 1992).
A lo largo del proceso de maduración, los valores de los parámetros físico –

químicos de los quesos evolucionaron. El pH de los quesos disminuyó a lo largo de la
maduración, moderadamente al principio, de 6,85 a 5,86, alcanzando valores de 5,65 a
los 60 días de maduración. El pH es de gran importancia en la maduración del queso
debido a su influencia en la actividad proteolítica. Estos cambios de pH pueden indicar
345
Discusión
la relevante actividad metabólica de las bacterias ácido lácticas en este tipo de queso de
oveja. La actividad proteolítica en el queso está determinada principalmente por el nivel
y tipo de cuajo residual, el ratio sal/humedad, la temperatura de maduración y los
cambios de pH durante la maduración (Lawrence y col., 1987). Heimgartner y col.
(1990) observaron que durante la maduración del queso el pH alcanzaba el valor de
5,31, que está próximo al óptimo para la actividad del cuajo vegetal.
A lo largo del periodo de maduración, se observó una disminución del peso del
queso, de 1,35 % a los 2 días de maduración, hasta 33,41 % menor peso del queso al
final de la maduración. El valor medio de humedad osciló entre 56,61 (2 días de
maduración) a 40,81 (60 días de maduración). La actividad de agua de los quesos
disminuyó progresivamente durante la maduración, desde 0,972 a 0,952 (30 días) y a
0,946 al final del proceso. Los resultados son similares a los obtenidos para otros quesos
de pasta blanda (Roa y col., 1999; Sanjuán y col., 2002).
Para los porcentajes de proteína y grasa, los valores medios fueron 16,72 y 25,31
respectivamente, en consonancia con otros autores (Mas Mayoral y col., 1991).
Además, la proteína total mostró correlación positiva con la actividad coagulante del
cuajo usado tras 1 h de maceración, junto con una relación negativa con los valores de
humedad. Una cuajada mejor gelificada asociada a altos valores de actividad coagulante
del cuajo explicaría estos resultados.
Los recuentos medios de bacterias viables totales y LAB fueron superiores a 8

log ufc/g durante todo el proceso de maduración, mostrando alta variabilidad en etapa
inicial (2 días de maduración). Los recuentos de aerobios mesófilos se incrementó desde
9,3 a 10,4 log ufc/g en el queso tras 60 días de maduración en todos los lotes y de 8,2 a
9,3 log ufc/g en el caso de psicrotrofos. Respecto a staphylococos los recuentos
permanecieron estables hasta el final del proceso en niveles en torno a 6,5 log ufc/g. En
el caso de GPCP cocci, los recuentos de este grupo microbiano durante la maduración
presentaron valores constantes cercanos a 7 log ufc/g, y no se observó relación entre las
actividades coagulantes del extracto y los recuentos de estos grupos microbianos. Los
recuentos de TVC, LAB y GPCP cocci fueron similares a los encontrados en otros
quesos de pasta blanda elaborados con cuajo vegetal. LAB aparecen como el grupo
microbiano predominante en el queso Serra da Estrela (Tavaira y col., 1998), en los que
finalmente alcanzaron valores de 107 en el momento de su consumo (Pintado y col.,
346
Discusión
2010). Este crecimiento de LAB es coherente con la evolución del pH durante el

proceso. De la misma forma, los recuentos de Micrococaceas y LAB se mantuvieron
constantes en quesos elaborados con C. cardunculus como cuajo vegetal, con recuentos
en torno a 5,3 log ufc/g para las primeras y de 8,7 log ufc/g para LAB. (Galán y col.,
2012). Obviamente, considerando las características del cuajo vegetal, estos altos
niveles de microorganismos durante la maduración pueden jugar un papel relevante en
el desarrollo de las características sensoriales de “Torta del Casar”, incluyendo la
textura.
En cuanto a los cambios en la textura a lo largo de la maduración, los valores de

dureza y cohesividad disminuyeron, principalmente al final de la maduración, mientras
que la adhesividad y el área F-T 2:3 mostraron los valores más bajos a los 30 días de
maduración. Los valores encontrados en este estudio están en consonancia con los
observados por otros autores en quesos elaborados con cuajo vegetal. En el caso de la
dureza y la adhesividad, son mucho más bajos que en quesos elaborados con cuajo
animal (Agboola y col., 2009). Estos valores medios pueden ser atribuidos a la gran
proteólisis en estos quesos cuajados con el cardo C. cardunculus. Las diferencias
encontradas entre las propiedades tecnológicas del cuajo vegetal empleado pueden
condicionar las características sensoriales de “Torta del Casar”.
El análisis de Componentes Principales de los atributos sensoriales, puntuación

global, parámetros de textura, y otras propiedades tecnológicas de los cuajos, mostró
grandes diferencias entre las muestras de quesos elaborados con diferentes cuajos tras
60 días de maduración. El primer eje explica el 29,83 % de la varianza y estaba definido
principalmente por descriptores sensoriales como la blandura (contrario a la dureza),
untabilidad, viscosidad, jugosidad y cremosidad, pero también por la actividad
coagulante del cuajo después de 24 h de maceración, y en menor medida, la
aceptabilidad global. Concretamente, los valores de los descriptores de viscosidad y
cremosidad y aceptabilidad global en el análisis sensorial de los quesos mostraron
correlaciones positivas de forma significativa con la actividad coagulante del cuajo tras
24 h de maceración. Por tanto, una alta valoración de estos atributos puede estar
parcialmente relacionada con la actividad coagulante del cuajo, pero también con otros
factores como la actividad proteolítica microbiana (Macedo y col., 1996; Tavaira y
Malcata, 2003). Con respecto a la actividad proteolítica de los extractos sobre las
347
Discusión
caseínas, no parecen estar claramente relacionadas con ningún PC y su variabilidad

explicada se distribuye por los tres PCs estudiados.
Los ejes segundo y tercero (28,30 y 11,57 % de la varianza respectivamente)

definieron la mayoría de los parámetros de textura y en menor medida la aceptabilidad
global y la degradación proteolítica de las caseínas in vitro por el extracto acuoso. Una
correlación significativa negativa existe entre la degradación de caseínas in vitro de los
cuajos y los parámetros del análisis de la untabilidad (textura), firmeza y trabajo de
corte de los quesos con 60 días de maduración, evidenciando la influencia de las
características del cuajo en las propiedades de la textura de “Torta del Casar”. Este
efecto se traslada a la aceptabilidad global, pero no estaba claramente relacionado con
los atributos descriptivos del análisis sensorial. Incluso un descriptor sensorial como la
cremosidad estaba localizado en posición opuesta a la degradación de β-caseína
respecto al eje PC1, mostrando una correlación negativa. Es posible que un incremento
de la actividad inespecífica sobre las micelas de caseínas afecte al proceso de
coagulación en la elaboración del queso, resultando en un producto menos cremoso.
Con el propósito de confirmar la influencia de las propiedades tecnológicas del

cuajo vegetal en la calidad sensorial de “Torta del Casar”, se empleó el método de
regresión parcial de mínimos cuadrados (PLSR). El modelo (r = 0,688) indica que un
47,4 % de la variación en el parámetro de textura “trabajo de untar” del queso podría ser
predicho a partir de la degradación de las caseínas del cuajo, específicamente la
actividad contra α-caseína, y el ratio de degradación κ-caseína/β-caseína.
De este apartado se puede extraer la conclusión de que las diferencias en las

actividades coagulante y proteolítica de los cuajos empleados en la elaboración de
quesos de pasta blanda tienen un importante impacto en los parámetros físico-químicos
de los quesos en la fase inicial, así como en la textura y el análisis sensorial en el
producto final. La actividad coagulante tras 24 h de maceración y la intensidad de
degradación de β-caseína han sido relacionadas con la cremosidad como parámetro
descriptivo. Por otro lado, la capacidad de degradación de las caseínas de los extractos
condiciona los parámetros de untuosidad, como la firmeza y el trabajo de untar. Por
tanto, se propone el uso de la actividad proteolítica y coagulante del cuajo (con 24 h de
maceración) para el control de calidad rutinario del cuajo vegetal empleado en la
elaboración de los quesos bajo la Denominación de Origen Protegida “Torta del Casar”.
348
Discusión
V.3.2. Influencia de las propiedades tecnológicas del cuajo en la proteólisis del

queso “Torta del Casar”
Con el objetivo de estudiar la influencia de las características tecnológicas del

cuajo vegetal (C. cardunculus) en la proteólisis generada en el queso y sus
características al final de la maduración, se parte de la clasificación de los 16 cardos
empleados para la obtención de los cuajos, con los que se elaboraron los 16 lotes de
quesos, en base a su actividad proteolítica.
Se obtuvieron cinco clusters o grupos. Los cardos englobados en el cluster 1

(M4, M5, M8, M12, M14) se caracterizan por una fuerte degradación sobre α y κ-
caseína (84 y 81% respectivamente), mientras que degradaron de forma moderada β-
caseína (54%). El cluster 2 (M1, M2, M3, M6, M7, M10) agrupa a los cardos con
moderada actividad proteolítica sobre β-caseína (67%), que degradaron con mucha
intensidad α y κ-caseína (88 y 83% respectivamente). Los cuajos agrupados en el cluster
3 (M16) degradaron moderadamente κ-caseína (54%), mientras que la degradación de
α- y β-caseína fue intensa (93% y 92%). La degradación de α-caseína fue intensa
(82%), moderada – alta en el caso de β-caseína (70%), para los cuajos del cluster 4 (M9,
M11), sin embrago degradaron κ-caseína con menor intensidad (23%). Por último, los
cuajos del cluster 5 (M13, M15) degradaron α-caseína moderadamente (39%), mientras
que mostraron una baja actividad proteolítica sobre β y κ-caseína (10 y 9%,
respectivamente).
Atendiendo a la actividad coagulante media de los cuajos englobados en cada

cluster, los mayores valores fueron observados en los cluster 1 y 5, tanto tras 24 h de
maceración (0,269 RU/ml; 0,224 RU/ml). Los cluster 2 y 3 presentaron los valores más
bajos de actividad coagulante tras 24 h de maceración (0,163 y 0,149 RU/ml). Tras 1 h
de maceración de los extractos, los valores más altos de actividad coagulante se
encontraron en los cluster 4 y 5 (0,156 RU/ml; 0,159 RU/ml), mientras que los valores
más bajos de actividad coagulante se encontraron para los cluster 2 y 3 (0,134 RU/ml;
0,131 RU/ml).
349
Discusión
Mediante el análisis de Componentes Principales se relacionaron los parámetros

proteolíticos del queso a los 2 días de maduración con la actividad proteolítica y la
actividad coagulante de los cuajos empleados. El primer eje (PC1) explica el 35,25 % de
la varianza y fue definido principalmente por los parámetros de degradación de α, β y κ-
caseínas, el tiempo de corte y el rendimiento encontrados en el queso a los 2 días de
maduración, mostrando una correlación positiva entre ellos. El segundo eje (PC2, 14,33
% de la varianza) está relacionado con la actividad coagulante de los cuajos. Los lotes 1,
2, 3, 6, 7, 10 y 16 están positivamente correlacionados con la degradación de las
caseínas, el rendimiento del queso y el tiempo de corte de la cuajada. Los lotes 13 y 15
están negativamente correlacionados con parámetros tales como el rendimiento del
queso, la degradación de α, β y κ-caseínas y el tiempo de cuajado. La misma tendencia
se observa para los lotes 9 y 11, pero en menor medida. Por tanto, las plantas de cardo
que presentaron alta actividad proteolítica in vitro, también mostraron esa actividad en
los quesos. Por tanto, es evidente que las plantas de cardo utilizadas como cuajo
influirán de forma diferente en el desarrollo de las características sensoriales de los
quesos.
Considerando la evolución de los parámetros relacionados con las proteínas a lo

largo de la maduración, se observó que las proteínas del lactosuero aumentaron de 171 a
262 mg/g hasta la mitad de la maduración, permaneciendo constantes hasta el final de la
maduración. Sin embargo, las caseínas disminuyeron gradualmente durante la
maduración, desde 284 a 226 mg/g, debido a la proteólisis, mediada primeramente por
el cuajo, y después por los microorganismos presentes en el proceso (Pintado y col.,
2010; Pereira y col., 2010). Las proteínas del lactosuero aumentaron debido a la rotura
de las caseínas, lo que generó péptidos solubles extraídos con las proteínas del
lactosuero. Similarmente, la cantidad de NPN en el queso aumentó durante la
maduración de 2,05 a 3,55 mg N/g, y la cantidad de NA, de 0,59 a 1,63 mg N/g. Los
índices de proteólisis, IP e IGA, también mostraron mayores valores durante el proceso,
demostrando el efecto de la proteólisis durante todo el proceso. Este efecto parece ser
más intenso en la segunda parte de la maduración, indicando la posible influencia de los
microorganismos en esta actividad. Resultados similares obtuvieron diferentes autores
(Núñez y col. 1991; Macedo y Malcata, 1997; Vioque y col., 2000) en quesos
tradicionales elaborados con cuajo vegetal. Mas Mayoral y col. (1991) registraron un
incremento en IP (NPN/NT) de 3,94 % a los 3 días tras la elaboración, a 13 % al final
350
Discusión
del proceso de maduración para el queso “Torta del Casar”. Sanjuán y col. (2002)
encontraron en queso “Los Pedroches”, elaborado con cuajo vegetal (C. cardunculus)
que los valores de NT oscilaron de 5,92 g/100 g a los 2 días de maduración, a 6,04
g/100 g (materia seca) a los 60 días de maduración, además el contenido de NPN y AN
en este queso aumentó a lo largo de la maduración. Resultados similares se obtuvieron
para el queso de La Serena tras 60 días de maduración (Núñez y col., 1991). Los
componentes de N solubles al principio del proceso del queso son producidos
fundamentalmente por la acción de las proteasas de Cynara cardunculus (Roa y col.,
1999; Galán y col., 2012), aunque los microorganismos son responsables de la
proteólisis desde la mitad al final del proceso de maduración. La degradación de
nitrógeno insoluble en agua, y por tanto la producción de nitrógeno soluble en agua, es
principalmente llevada a cabo por el cuajo residual que queda atrapado en la matriz del
queso, el cual hidroliza α-caseína (Creamer y Olson, 1982; Dulley, 1974).
Se correlacionaron los parámetros de las características tecnológicas de los

cuajos con los parámetros relativos a la proteólisis del queso y se observó por una parte,
que el contenido de proteína tras 2 días de maduración, estaba positivamente
correlacionado con la actividad coagulante del cuajo (1 h de maceración), de modo que
a mayor contenido en proteínas, mayor actividad coagulante (1 h). Entre los factores
que afectan a la coagulación de la leche, la concentración de caseínas juega un
importante papel (St-Gelais y Haché, 2005). Caron y col. (1997) observaron que la
coagulación se retrasaba (mayor tiempo de coagulación) en la leche con alto contenido
de proteína relativo a leche con baja concentración de proteína. Además, el contenido de
caseínas estaba negativamente correlacionado con la actividad coagulante (24 h de
maceración), a los 30 y 60 días de maduración, por tanto a mayor actividad coagulante
del extracto preparado tras 24 h de maceración, menor contenido de caseínas a los 30 y
60 días, lo cual se debe a la gran degradación de las caseínas. Van Hekken y Holsinger
(2000) observaron que las propiedades de coagulación del cuajo no estaban relacionadas
solo con la concentración de caseínas, sino también con la proporción de α-caseína y β-
caseína, presentes en la leche. Paralelamente a la evolución de las caseínas, la actividad
coagulante del cuajo (24 h de maceración) influyó en el contenido de NA del queso a
los 30 y 60 días de maduración, con una correlación positiva, lo que significa que a
mayor valor de actividad coagulante (24 h), mayor contenido de NA en el queso, a los
30 y 60 días de maduración, debido al efecto de la degradación de caseínas.
351
Discusión
Aunque la proteólisis y la evolución de las propiedades viscoelásticas son

procesos intrínsecos en la maduración del queso, parecen ser relativamente insensibles a
las variaciones en la starting wild microflora. La evolución del índice de maduración
(WSN/TN) explica la liberación de péptidos grandes y solubles en agua directamente a
partir de las caseínas. Este fenómeno es causado principalmente por el cuajo residual
retenido en la cuajada tras la elaboración, por tanto las bacterias no son relevantes en
este evento. La liberación de péptidos de medio y pequeño tamaño es el resultado de la
acción combinada del cuajo y las enzimas microbianas a partir de los anteriormente
mencionados péptidos grandes, previamente liberados por las enzimas del cuajo. Las
enzimas de las bacterias son actores relevantes durante las dos últimas fases de la
proteólisis (liberación de péptidos de bajo peso molecular y amino ácidos libres). Sin
embargo, la apariencia relativamente lenta de aminoácidos libres puede también ser
debida a su considerable captación como fuente de nitrógeno, durante la fase de
crecimiento exponencial de las bacterias viables (Pereira y col., 2010). Como se
esperaba, las diferentes fracciones de nitrógeno soluble aumentaron con el tiempo de
maduración, aunque la carga inicial contaminante no influyó en esos parámetros
(Pereira y col., 2010).
Los cambios en la flexibilidad y debilidad final de la estructura de las caseínas

son el resultado de la proteólisis (Pereira y col., 2010). Una transición gradual de una
red inicial dominada por las proteínas del suero desnaturalizadas ligadas a la superficie
de las micelas, a una red dominada por interacciones caseína – caseína a menor pH
(Haque y col., 2001), como resultado del metabolismo de LAB, probablemente explica
nuestras observaciones. Además, la ruptura del citrato por LAB conlleva a la
producción de CO2, lo que puede también influir en la textura de ciertos productos
fermentados (Fox y col., 1993).
El conjunto de reacciones normalmente denominadas como proteólisis

secundaria resultan de la acción del cuajo residual y las proteinasas autóctonas de la
leche, además de la microflora adventicia (Tavaira y col., 2003). Tendencias similares
han sido descritas por Vioque y col. (2000) en queso de leche de oveja coagulada con C.
cardunculus y por Macedo y Malcata (1997) para el queso Serra da Estrela.
Tavaira y col. (2003) y otros autores que han estudiado los cuajos vegetales
(Macedo y Malcata, 1997; Fernández-Salguero y col., 1999) refuerzan la afirmación que
352
Discusión
la fuerte acción proteolítica de C. cardunculus aumenta considerablemente el inventario

de sustratos fermentables, que contienen nitrógeno, en estos quesos. Esta evidencia
sugiere que las proteasas del cuajo vegetal posen baja actividad peptidasa, de acuerdo
con Sousa y Malcata (1997) y Reis y col. (2000), que refuerzan la hipótesis de que las
peptidasas sintetizadas por los microorganismos adventicios, son las únicas presentes en
estos quesos, y por tanto, los principales vectores de la liberación de FAA (Tavaira y
col., 2003).
Se utilizaron las técnicas UREA y SDS-PAGE para observar el efecto de la

proteólisis durante el proceso de maduración. Trujillo y col. (2000) y Pino y col. (2009)
utilizaron estas técnicas para estudiar la actividad proteolítica de diferentes cuajos
vegetales, sobre caseína ovina. El perfil de caseínas evolucionó a lo largo de la
maduración, mostrando una degradación gradual de las caseínas en todas las muestras
(86 % para α-caseína y 74 % para β-caseína). Esto produce una disminución en la
concentración de éstas, así como un incremento de los compuestos nitrogenados
derivados de las proteínas. Lo mismo ocurrió con las proteínas del lactosuero, con una
disminución a lo largo del proceso, pero aparecieron los péptidos derivados de la
hidrólisis de las caseínas a lo largo de la maduración. La proteólisis, el ratio de β- a κ-
caseínas, ha sido considerada una base para la clasificación de los quesos (Fox, 1993;
Sousa, 2001).
Macedo y Malcata (1996) estudiaron la hidrólisis de αs- y β-caseínas durante la

maduración del queso Serra mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en
diferentes momentos de la maduración y observaron que a los 35 días de maduración,
αs- y β-caseínas sufrieron una fuerte degradación, hasta 82 y 76 % respectivamente. Sin
embargo, otros autores encontraron que α-caseína disminuyó con la maduración,
mientras que β-caseína mostró una ligera reducción, confirmando una mayor resistencia
a la hidrólisis de β-caseína por parte de la enzima (Fernández –Salguero y Sanjuán,
1999). La inusual hidrólisis de β-caseína (la degradación de αs- y β-caseínas ocurre con
similar intensidad en el queso Serra) parece estar relacionada con el tipo de cuajo
(Macedo y Malcata, 1996). La degradación de α-caseína está mucho más influenciada
por la actividad coagulante del cuajo empleado, de modo que a mayor actividad
coagulante, mayor hidrólisis de estas caseínas (Irigoyen y col., 2000). Marcos y col.
353
Discusión
(1979) afirmaron que, en general, αs1-caseína fue degradada con mayor intensidad que
β-caseína.
El significante ratio de degradación de αs-caseínas solo tras 7 días puede indicar

que la microflora juega un importante papel en la hidrólisis de esta proteína,
especialmente si se asume que las enzimas de C. cardunculus no hidroliza αs-caseínas
tan rápidamente como β-caseínas y que la microflora del queso Serra está formada
mayoritariamente por LAB mesofílicas y Coliformes, el número de los cuales alcanza
106 ufc/g de queso solo tras 7 días (Macedo y col., 1995; 1996).
Con respecto al contenido de aminas biógenas en queso, no se encontró

influencia por parte del cuajo empleado en la elaboración del queso. Los niveles de
aminas fueron inferiores comparados con los encontrados en este tipo de productos
(Contreras y col., 2007). Por tanto, estos resultados muestran un importante desarrollo
de la proteólisis en los quesos durante la maduración, resultando en la generación de
NA a una mayor actividad coagulante del cuajo, lo cual no implica un aumento de la
producción de aminas biógenas. La producción de aminas biógenas ha sido relacionada
con la actividad microbiana del queso, de forma que durante la maduración del queso, la
microflora hidroliza las cadenas polipéptidicas liberando aminoácidos, sustrato de las
enzimas descarboxilasas microbianas para la producción de aminas biógenas (Silla,
1996). Las Enterobacterias y LAB (Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc y
Pediococcus) son bacterias que poseen enzimas descarboxilasas de los aminoácidos, y
por tanto son potencialmente productoras de aminas biógenas (Fernández y col., 1999;
Moret y col., 1992; Novella y col., 2000; Vale y col., 1998; Vasundhara y col., 1999).
Respecto a la correlación entre los parámetros de análisis sensorial del queso al

final del periodo de maduración con las características del cuajo, se observa que la
degradación de β-caseína estaba positivamente correlacionada con la pasta cerrada del
queso, mientras que la degradación de esta caseína está negativamente correlacionada
con el gusto ácido del queso. La degradación de β-caseína parece influir en la
cremosidad del queso, con una correlación negativa, de forma que a mayor degradación,
menor cremosidad. Algunos autores sugieren que β-caseína podría ser esencial para la
dureza de la cuajada (St. Gelais y col., 2005). De la misma manera la degradación de β-
caseína está negativamente correlacionada con el gusto amargo del queso, es decir, a
menor degradación, mayor amargor.
354
Discusión
El amargor en el queso es más frecuentemente debido a péptidos hidrofóbicos y

es generalmente considerado un defecto, aunque notas amargas pueden contribuir a un
deseable flavor en el queso maduro. Los péptidos amargos se forman principalmente
por la acción del cuajo y las proteinasas del starter y el amargor ocurre en quesos
cuando estos péptidos se acumulan en excesiva concentración, ya sea como resultado de
sobre producción, o de una inadecuada degradación por enzimas microbianas. Ciertas
secuencias en las caseínas son particularmente hidrofóbicas y, cuando se escinden por
proteinasas, pueden dar lugar a amargor. Los péptidos amargos de αs1-caseína están
predominantemente en la región de los residuos 14-34, 91-101 y 143-151, mientras que
los péptidos amargos de β-caseína están en los residuos 46-90, y particularmente en el
hidrofóbico C-terminus. La quimosina es importante en la producción de péptidos
amargos, dado que el cuajo residual en la principal proteinasa en muchas variedades de
queso, y su primera acción sobre β-caseína libera péptidos extremadamente
hidrofóbicos. Un bajo ratio de actividad coagulante respecto actividad proteolítica
resulta en péptidos amargos en queso maduro (Sousa, 2001).
Por otra parte, la degradación de κ-caseína estaría correlacionada negativamente

con la persistencia encontrada en el queso, de forma que una menor degradación de κ-
caseína aumenta la persistencia en el queso.
La actividad coagulante (24 h) influye en la cremosidad, la viscosidad y el tipo

de queso y aceptabilidad del queso, con una correlación positiva en todos los casos, esto
es que parece que a mayor valor de actividad coagulante, mayor valor de cremosidad,
viscosidad, y favorece el tipo de queso “Torta” y una mayor aceptabilidad.
La mayor actividad proteolítica en la ruptura de las caseínas y los productos

primeramente degradados en los quesos con cuajo vegetal de C. cardunculus dieron
lugar a una textura más blanda y cremosa (Galán y col., 2008; Agboola y col., 2009).
Por tanto, los cuajos más apropiados para la elaboración de estos quesos, son
aquellos que presentan una alta actividad coagulante y una moderada actividad
proteolítica sobre β-caseína principalmente, sugiriendo que las plantas de cardo
agrupadas en el cluster 1 proporcionarían características deseables en el queso. Un alto
ratio de actividad coagulante sobre actividad proteolítica es una herramienta esencial
para la clasificación de los cardos usados en el procesado de “Torta del Casar”.
355
Discusión
De estos resultados se deduce que las características tecnológicas del cuajo

vegetal influyen en el producto final “Torta del Casar”, siendo la actividad coagulante y
proteolítica del cuajo, los parámetros fundamentales que determinan las características
finales. De modo que el uso de plantas de cardo (C. cardunculus) controladas y
caracterizadas en la elaboración de “Torta del Casar” es fundamental para obtener un
producto homogéneo demandado por la Denominación de Origen Protegida “Torta del
Casar”.
V.3.3. Influencia de los microorganismos en las características de la textura del

queso “Torta del Casar”
En primer lugar se estudió la procedencia de los microorganismos que aparecen en

el queso. Se observó que los mayores recuentos de enterobacterias y coliformes se
encontraron en los cuajos, mientras que la leche suministra los mayores recuentos de
bacterias ácido-lácticas, lactococos, enterococos, staphylococos, micrococos y mohos y
levaduras al queso. Las correlaciones de los recuentos de los quesos a los 2 días de
maduración con los recuentos de la leche y el cuajo usados en la elaboración de los lotes
de quesos revelaron que la población de bacterias ácido-lácticas en el queso a los 2 días
de maduración procede principalmente de la leche, mientras que las poblaciones de
psicrotrofos y enterococos proviene de los cuajos. Esto indica que sería importante
monitorizar e identificar los microorganismos que proceden de las materias primas y
específicamente de los cuajos, los cuales no han sido estudiados, ya que pueden ejercer
gran influencia en el producto final, así como en la salud del consumidor. Por otra parte,
se espera que la contaminación microbiológica de la leche ejerza influencia sobre las
características finales del queso (Pintado y col., 2010). La microbiota de la leche cruda
es un componente esencial de muchas variedades de quesos tradicionales y juega
importantes funciones durante la elaboración y la maduración del queso (Beresford y
col., 2001). Por tanto, las bacterias ácido-lácticas (LAB) y otra flora indígena parecen
desarrollar una función relevante en la elaboración del queso y en la generación del
distintivo flavor de los quesos (Buchin y col., 1998; Leroy y DeVuyst, 2004; Abriouel y
col., 2008).
356
Discusión
En cuanto a la evolución de los recuentos de los microorganismos durante la

maduración del queso, las poblaciones de coliformes y enterobacterias incrementaron
levemente desde el inicio a los 30 días de maduración, y disminuyeron modestamente
hasta el final de la maduración. Las bacterias aerobias mesófilas aumentaron levemente
mientras que los psicrotrofos permanecieron en torno a 9,2 log ufc/g a lo largo de la
maduración. Los lactobacilos aumentaron entre el principio y la mitad, para permanecer
constantes hasta los 60 días de maduración, mientras que los lactococos disminuyeron
levemente hasta el final de la maduración. La población de enterococos aumentó al
inicio del proceso y los staphylococos y micrococos permanecieron más o menos
constantes a lo largo de la maduración del queso. Finalmente mohos y levaduras
disminuyeron moderadamente desde el inicio al final de la maduración. Algunos autores
han obtenido resultados similares en diferentes grupos microbianos que se desarrollan
en el queso (Tavaira y col., 1998; Galán y col., 2012).
Dentro del grupo LAB, enterococos es el género más controvertido, porque su

hábitat natural es el tracto intestinal de los mamíferos y su presencia en alimentos ha
sido usualmente relacionada con pobres condiciones higiénicas durante la elaboración
(López – Díaz y col., 1995). Sin embrago, en los últimos años, algunos estudios sobre la
microflora de muchos quesos tradicionales de países mediterráneos indican que este
grupo puede jugar un papel importante en la maduración de estos quesos,
probablemente a través de la proteólisis y lipolisis, contribuyendo así a sus típicas
características sensoriales (Foulquié Moreno y col., 2006).
Se correlacionaron los parámetros de proteólisis con los recuentos microbianos de

diferentes días a lo largo de la maduración. Al inicio del proceso (2 días) no se
observaron correlaciones, lo cual indica que el efecto de los microorganismos en la
proteólisis primaria es bajo, como se mencionaba anteriormente. La proteólisis a este
nivel estaría relacionada con el cuajo. No obstante, según avanza el proceso de
maduración, el efecto de los microorganismos en estos parámetros fue más evidente. Se
observó que el grupo de enterococos estaba positivamente correlacionado con AN e
IGA a los 30 días de maduración, y con NPN e IP, a los 60 días de maduración. Esto
sugiere la importancia de este grupo microbiano en la proteólisis desarrollada durante la
maduración. Otros grupos microbianos que se correlacionan positivamente con los
parámetros de la proteólisis fueron los psicrotrofos, lactobacilos, lactococos y
357
Discusión
staphylococos al final del proceso (60 días). De modo que estos son los grupos
microbianos que parecen estar más relacionados con la degradación de las proteínas en
estos productos. La proteólisis aumenta el nivel de aminoácidos libres y péptidos, que
dan lugar a una mejora en la intensidad del flavor y acelera la maduración del queso
(Corsetti y col., 1998; Franklin y col., 1963; Lane y col., 1996; Lynch y col., 1996;
McSweeney y col., 1993).
En cuanto al análisis de textura a compresión la dureza y la cohesividad

disminuyeron gradualmente durante la maduración, mientras que los valores de
adhesividad y área F-T 2:3 fueron más altos según avanzó la maduración. La
disminución de la dureza y cohesividad del queso indica una mayor proteólisis (Awad y
col., 2005) y el incremento de la adhesividad indica la habilidad de las proteínas para
interaccionar con el agua (Pastorino y col., 2003), lo cual tiene lugar durante la
maduración.
En el análisis de untuosidad a los 60 días, los valores medios de firmeza y trabajo de

untar fueron 7100 g y 6750 gs respectivamente. El valor medio de la pegajosidad fue de
4750 g (valor absoluto) mientras que el trabajo de adhesión mostró un valor medio de
484 gs (valor absoluto). Estos datos se correlacionaron con los recuentos microbianos, y
se observó que los recuentos a los 2 días tras la elaboración de los quesos no había
correlaciones con ningún parámetro de textura, indicando el bajo efecto de los
microorganismos al principio del proceso. El cambio temprano en la textura se atribuye
a un número de factores como la proteólisis de las caseínas mediada por el cuajo (Lucey
y col., 2003). Se puede observar cómo los grupos microbianos que se correlacionaron
positivamente con los parámetros de adhesividad fueron psicrotrofos, bacterias ácido
lácticas, lactococos y enterococos, con los recuentos encontrados a los 2, 30 y 60 días.
Por el contrario, enterobacterias y coliformes estaban negativamente correlacionados,
poniendo de manifiesto el efecto negativo de estos grupos microbianos en la textura de
los quesos. Este grupo también estaba negativamente correlacionado con la dureza y
cohesividad a los 60 días, por tanto, un incremento de estos microorganismos produce
una gran falta de firmeza (blandeza) al producto.
Resultados similares se encontraron en el análisis sensorial, en el cual los grupos

microbianos positivamente correlacionados con la cremosidad y viscosidad del queso
fueron psicrotrofos, bacterias ácido-lácticas, lactococos y staphylococos. El grupo de las
358
Discusión
bacterias ácido-lácticas y lactococos, con el parámetro de acidez, y estos mismos grupos

y enterococos estaban positivamente correlacionados con la intensidad. En todos los
casos, los parámetros sensoriales estaban correlacionados con los recuentos encontrados
después de los 2 días de maduración. Finalmente, la aceptabilidad global por el tipo de
queso “Torta del Casar” estaba correlacionada positivamente con los recuentos de
psicrotrofos, bacterias ácido-lácticas, lactococos, enterococos y staphylococos.
En conclusión, los microorganismos han mostrado una influencia decisiva en los

parámetros estudiados relativos a la proteólisis y la textura a lo largo del proceso de
maduración, enfatizando el papel de las bacterias ácido-lácticas, lactococos y
enterococos. Por tanto, para controlar el proceso, sería deseable controlar estos
microorganismos, siendo esencial el desarrollo de un cultivo starter adecuado para este
producto tradicional.
V.4. Ceder a la DOP “Torta del Casar” el cardo más adecuado para la obtención
de las mejores tortas.
Gracias a la realización de este estudio es posible ceder a la DOP “Torta del
Casar” no solo los resultados sobre las características que deben presentar los cuajos
que se emplean en el proceso de elaboración de la “Torta del Casar” para conseguir
mejores quesos, sino también algunos ejemplos de las plantas de Cynara cardunculus
de las que proceden estos cuajos. Dado que se demuestra la gran variabilidad que exiet
entre las poblaciones y dentro de las poblaciones de Cynara cardunculus de
Extremadura, lo que redunda en cuajos muy heterogéneos en cuanto a sus características
tecnológicas. Además se pone a disposición de la DOP “Torta del Casar” una serie de
técnicas analíticas, como SDS-PAGE y FZCE, que puede implantar como herramientas
en el control de calidad rutinario, con las que puede garantizar la autenticidad del cuajo,
la trazabilidad del proceso, y conocer las características tecnológicas de los cuajos
previamente a su utilización en la elaboración del queso.
Otro de los aspectos que se aborda en este trabajo, y que podrá ser de utilidad
para los elaboradores de “Torta del Casar” es la influencia de diferentes parámetros de
la preparación de los cuajos a partir de las flores de Cynara cardunculus, en la actividad
359
Discusión
coagulante del cuajo, una de las características tecnológicas más influeyentes en las
características del queso.
Conocidas las propiedades tecnológicas de los cuajos, es posible, con los

métodos desarrollados en este trabajo, predecir la influencia de los cuajos en las
características del queso al final de su proceso de maduración, tanto en lo que se refiere
a las características físico – químicas, la textura y las características sensoriales.
Se ha determinado la influencia que ejerce el cuajo en la porteolisis que se

produce en el queso a lo largo del proceso de maduración, siendo relevante su influencia
en la conocida como primera proteólisis. La microflora presente en el queso, sin
embrago, es la responsable de la proteólisis que ocurre en la segunda parte de la
maduración del queso, redundando también en las características finales del queso. El
origen de estos microorganismos es por un lado la leche cruda que se emplea en el
proceso, y por otro, el cuajo, el cual no se somete a ningún proceso para la reducción de
su carga microbiana. Este aspecto se recoge en este estudio por primera vez y se reconce
la influencia de los microorganismos que aporta el cuajo en el producto final. Tanto la
leche como el cuajo, presentan elevadas cargas microbianas, no solo de
microorganismos que favorecen la proteólisis y aportan características de calidad al
queso, sino también microorganismos indeseables, que pueden comprometer la calidad
del producto final, y suponer un riesgo sanitario.
Por tanto, se sugiere la utilización de cultivos iniciadores para controlar el

proceso de maduración del queso, evitando la proliferación de microorganismos
indeseables, pero también se considera necesario incluir métodos para reducir la carga
microbiana del cuajo, sin influir en sus propiedades tecnológicas.
En base a toda esta información, la DOP “Torta del Casar” está en disposición
de seleccionar los mejores cardos de la especie Cynara cardunculus, en cuanto a sus
características tecnológicas, con el fin de cultivarlo y así tener asegurado el suministro
de un cuajo de calidad, de cara a su repercusión en las características del queso, y con el
que poder acotar la heterogeneidad del producto final, debida a este ingrediente.
360
VI. CONCLUSIONES
Concluisones
1. Las diferentes especies de cardo de la familia Asteraceae estudiadas han sido

caracterizadas y pueden ser identificadas con cualquiera de las técnicas
utilizadas, morfológicamnte, por biología molecular, a través de sus perfiles de
proteínas, FZCE y SDS-PAGE, y mediante su actividad proteolítica. Con estas
técnicas se han analizado plantas individuales de Cynara cardunculus de varias
poblaciones de Extremadura y se ha encontrado un nivel de variabilidad genética
sustancial entre diferentes poblaciones de Extremadura y dentro de poblaciones
morfológicamente uniformes. Los perfiles proteicos de las flores de las
diferentes especies de cardo, permiten la diferenciación y caracterización de
dichas especies. Se ha determinado el perfil típico de cada una de las especies
estudiadas, tanto mediante la técnica SDS-PAGE, como con la técnica FZCE.
Con la técnica FZCE se ha puesto de manifiesto la variabilidad genética
existente entre las poblaciones de C. cardunculus.
2. Las técnicas, moleculares y las que determinan el perfil de proteínas de las flores
de las diferentes especies, se consideran como una herramienta potencialmente
útil para garantizar la autenticidad y la trazabilidad del cardo empleado como
cuajo en la elaboración de “Torta del Casar”. El uso de plantas de cardo (C.
cardunculus) caracterizadas, en base a su actividad coagulante y proteolítica, en
la elaboración de “Torta del Casar” es fundamental para obtener un producto
homogéneo demandado por la Denominación de Origen Protegida “Torta del
Casar”.
3. La actividad coagulante que presenta el extracto de Cynara cardunculus es

diferente para cada planta. La localización, el estado de maduración de la flor y
el año de recolección son factores que no influyen en la actividad coagulante. La
actividad coagulante de un extracto varía con la concentración con la que se
prepara, así como con la cantidad de extracto que se añade a la leche. El tiempo
de maceración del extracto ejerce menos influencia que los factores anteriores.
Los extractos pueden mantenerse en refrigeración hasta una semana sin que se
reduzca su actividad coagulante.
363
Conclusiones
4. Los factores año de recolección, localización y estado de maduración de la flor

son ineficaces como criterio para seleccionar las flores de Cynara cardunculus
que son apropiadas tecnológicamente para la producción de cuajo vegetal en la
elaboración de “Torta del Casar”. Se proponen modelos de predicción basados
en las características tecnológicas de los cuajos, de forma que se pueda conocer
previamente a la elaboración del queso, las características sensoriales que puede
aportar al producto final, dentro del margen de acción o influencia del cuajo en
las características del producto final.
5. Las diferencias en las actividades coagulante y proteolítica de los cuajos tienen

un importante impacto en los parámetros físico-químicos de los quesos en la
fase inicial, así como en la textura y el análisis sensorial en el producto final. La
actividad coagulante tras 24 h de maceración y la intensidad de degradación de
β-caseína han sido relacionadas con la cremosidad. La capacidad de degradación
de las caseínas de los extractos condiciona los parámetros de untuosidad, como
la firmeza y el trabajo de untar. Se emplea el método de regresión parcial de
mínimos cuadrados (PLSR) para predecir la textura del queso a partir de la
degradación de las caseínas del cuajo, el cual (r = 0,688) indica que las
características tecnológicas del cuajo influyen en un 47,4 % sobre el parámetro
de textura “trabajo de untar” del queso.
6. Las características tecnológicas del cuajo vegetal influyen en el producto final

“Torta del Casar”, siendo la actividad coagulante y proteolítica del cuajo, los
parámetros fundamentales que determinan las características finales del queso.
Los cuajos más apropiados para la elaboración de estos quesos, son aquellos que
presentan una alta actividad coagulante y una moderada actividad proteolítica
sobre β-caseína principalmente. Un alto ratio de actividad coagulante sobre
actividad proteolítica es una herramienta esencial para la clasificación de los
cardos usados en el procesado de “Torta del Casar”.
7. Los microorganismos han mostrado una influencia decisiva en los parámetros

estudiados relativos a la proteólisis y la textura a lo largo del proceso de
maduración, enfatizando el papel de las bacterias ácido lácticas, lactococos y
enterococos. Por tanto, para controlar el proceso, sería deseable controlar estos
364
Concluisones
microorganismos, siendo esencial el desarrollo de un cultivo starter adecuado

para este producto tradicional.
365
VII. BIBLIOGRAFÍA
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400
VIII. RESUMEN
Resumen
El objetivo de este estudio fue caracterizar las especies de cardo silvestres de

Extremadura, a nivel morfológico, molecular, fenotípico y tecnológico, así como
evaluar la influencia del año de recolección y el estado de maduración de la flor del
cardo, y el uso de diferentes plantas de cardo Cynara cardunculus en las características
finales del queso. Se recogieron un total de 205 muestras de cardo de las especies
Silybum marianum, Cirsium arvense, Onopordum nervosum, Cynara humilis, Cynara
scolymus y Cynara cardunculus, de diferentes localizaciones de la región de
Extremadura. Todas ellas pueden ser perfectamente caracterizadas y diferenciadas
mediante técnicas moleculares, en concreto RAPD y SSRs, perfiles de proteínas FZCE
y SDS-PAGE, y a través de su actividad coagulante y proteolítica frente a las caseínas
de la leche.
La especie Cynara cardunculus es la que autoriza la DOP “Torta del Casar” para ser
empleada como cuajo vegetal, por ello, una vez identificada y caracterizada, el trabajo
se centra en estudiar la influencia de esta planta en las características finales del queso
“Torta del Casar”.
Se encontró gran variabilidad genética entre y dentro de las poblaciones de Cynara

cardunculus recogidas en Extremadura, lo que se tradujo en diferentes perfiles
proteicos, así como en diferencias a nivel de propiedades tecnológicas del cuajo,
actividad coagulante y proteolítica. Se estudia la influencia de esta variabilidad en las
características del producto final, ya que puede ser una de las razones de la falta de
homogeneidad que se relaciona con el queso “Torta del Casar”. Para ello se elaboraron
16 lotes de quesos tipo “Torta del Casar” a partir de 16 muestras diferentes de C.
cardunculus. Las propiedades físico-químicas, microbiológicas, de textura y sensoriales
de “Torta del Casar” fueron evaluadas durante la maduración de los quesos y
relacionadas con las propiedades tecnológicas de los cuajos usados en su elaboración.
Se desarrolló un procedimiento basado en el análisis de proteínas mediante FZCE,

para muestras de cardo (C. cardunculus), en función de la localización, año de
recolección y estado de maduración de la flor. Para la técnica FZCE se empleó un
protocolo de extracción de proteínas solubles en metanol. Este método presentó buena
repetibilidad de los tiempos de migración y mostró mayor efectividad para distinguir las
propiedades tecnológicas (actividad coagulante y actividad proteolítica) de los cuajos
que la técnica SDS-PAGE. Además, tres de los picos encontrados en los
403
Resumen
electroferogramas FZCE pueden considerarse como una buena herramienta para

predecir el impacto de los cuajos en la cremosidad y en la aceptabilidad global del
queso “Torta del Casar”.
Las diferencias encontradas entre las plantas de C. cardunculus en cuanto a su

actividad coagulante y proteolítica no se deben al año de recolección, ni a la
localización, ni tampoco al estado de maduración de la flor. Sin embrago, estas
diferencias ejercen gran influencia tanto en los parámetros físico-químicos de los quesos
al inicio de la maduración, como en la textura y el análisis sensorial del producto final.
La actividad coagulante del extracto, tras 24 h de maceración, y la intensidad de
degradación de β-caseína se consideran como una buena herramienta para predecir el
impacto del cuajo vegetal en la cremosidad del queso “Torta del Casar”.
A lo largo de la maduración de los quesos se observó una importante proteólisis que

dio lugar a la generación de compuestos nitrogenados no proteicos. Se destaca la
relación entre la actividad coagulante (24 h de maceración) y la generación de nitrógeno
aminoacícido, y el hecho de que las aminas biógenas no estaban relacionadas con la alta
actividad del cuajo. El cuajo con alta actividad coagulante (24 h de maceración) influyó
en la cremosidad, la viscosidad, el tipo de queso y la aceptabilidad del queso. Sin
embargo, la alta actividad proteolítica del cuajo influyó negativamente en los
parámetros de acidez, amargor y cremosidad. De modo que la planta de cardo más
apropiada para obtener el cuajo será aquella que muestre una alta actividad coagulante y
una moderada actividad proteolítica sobre β-caseína.
Analizada la influencia del cuajo sobre las características del producto final, y
teniendo en cuenta que no todos los cambios que ocurren en la matriz del queso se
deben al cuajo, se aborda la influencia de la microbiología en las características finales
de “Torta del Casar”, siendo el cuajo una de las fuentes de los microorganismos que
actúan en este producto.
Los recuentos en las materias primas muestran que la población de bacterias ácido
lácticas del queso procede principalmente de la leche, mientras que las poblaciones de
psicrotrofos y enterococos proviene de los cuajos. La correlación entre los parámetros
de proteólisis y los recuentos microbianos revela que el efecto de los microorganismos
en la proteólisis primaria es baja y el grupo de los enterococos influye sobre NA e IGA
a los 30 días de maduración, y NPN e IP a los 60 días. Los psicrotrofos, bacterias ácido
404
Resumen
lácticas y enterococos condicionan la adhesividad, y las enterobacterias y coliformes

ejercen una influencia negativa sobre la textura. Los grupos microbianos que influyen
en la cremosidad y la viscosidad son psicrotrofos, bacterias ácido lácticas, lactococos y
staphylococos. Sería deseable controlar el desarrollo de las bacterias ácido lácticas,
lactococos y enterococos, en la elaboración de “Torta de Casar”, siendo esencial el
desarrollo de un cultivo iniciador adecuado a este producto tradicional.
405
ÍNDICE
Índice
I.-INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1
I.1. EL QUESO ............................................................................................................................. 3
I.1.1. Definición de queso ......................................................................................................... 3
I.1.2. Producción de queso a nivel mundial, nacional y regional .............................................. 3
I.1.3. Tipos de quesos más importantes .................................................................................... 8
I.1.4. La Torta del Casar.......................................................................................................... 14
I.1.4.1. Descripción de la Torta del Casar ........................................................................... 14
I.1.4.2. Proceso de elaboración de la Torta del Casar ......................................................... 15
I.1.4.3. Características de calidad de la Torta del Casar...................................................... 17
I.1.4.4. Flora característica de la Torta del Casar ................................................................ 18
I.1.4.5. Presencia de aminas biógenas en quesos ................................................................ 21
I.1.4.6. Proteólisis................................................................................................................ 23
I.1.4.7. Lipolisis .................................................................................................................. 24
I.1.4.8. Compuestos volátiles en el queso ........................................................................... 27
I.2. EL CUAJO ............................................................................................................................ 30
I.2.1. Características del cuajo ................................................................................................ 30
I.2.2. Cynara cardunculus, L. ................................................................................................. 35
I.2.2.1. Descripción de Cynara cardunculus, L. ................................................................. 35
I.2.2.2. Otros usos de Cynara cardunculus ......................................................................... 37
I.2.3. Caracterización del cardo usado como cuajo vegetal .................................................... 38
I.2.3.1. Caracterización Morfológica................................................................................... 39
I.2.3.2. Caracterización Molecular ...................................................................................... 39
I.2.3.3. Caracterización mediante análisis de proteínas....................................................... 40
I.2.4. Obtención del cuajo para la elaboración de la “Torta del Casar” .................................. 42
I.2.5. Enzimas presentes en las flores de “Cynara cardunculus”............................................ 42
I.2.6. Actividad proteolítica del cuajo obtenido de Cynara cardunculus ................................ 47
I.2.7. Actividad coagulante del cuajo procedente de Cynara cardunculus ............................. 51
I.2.8. Actividad antimicrobiana de Cynara cardunculus ........................................................ 53
I.2.9. Problemas asociados a la utilización del cuajo procedente de Cynara cardunculus en la
actualidad ................................................................................................................................ 54
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 57
III. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................. 61
III.1. Material .............................................................................................................................. 63
III.1.1. Reactivos químicos y medios de cultivo ..................................................................... 63
iii
Índice
III.1.2. Aparatos ...................................................................................................................... 63

III.1.3. Material biológico ....................................................................................................... 68
III.2. Métodos .............................................................................................................................. 74
III.2.1. Toma de muestras de cardos de diferentes especies (2006). Toma de muestras de
Cynara cardunculus (2007-09). .............................................................................................. 74
III.2.2. Caracterización morfológica ....................................................................................... 75
III.2.3. Extracción de ADN ..................................................................................................... 75
III.2.4. Análisis de AND mediante técnicas RAPD-PCR ....................................................... 76
III.2.5. Análisis de ADN mediante microsatélites (SSRs) ...................................................... 81
III.2.6. Extracción de proteínas del cuajo vegetal para análisis mediante SDS-PAGE. .......... 85
III.2.7. Perfil de proteínas del cuajo mediante SDS-PAGE .................................................... 85
III.2.8. Extracción de proteínas del cuajo vegetal para análisis mediante FZCE. ................... 87
III.2.9. Perfil de proteínas del cuajo mediate FZCE ................................................................ 87
III.2.10. Purificación de cardosinas ......................................................................................... 88
III.2.11. Determinación de la actividad proteolítica del cuajo ................................................ 89
III.2.12. Determinación de la actividad coagulante del cuajo ................................................. 89
III.2.13. Determinación de la actividad antimicrobiana del cuajo .......................................... 90
III.2.14. Elaboración de quesos tipo “Torta del Casar”........................................................... 92
III.2.15. Análisis de los parámetros físico – químicos ............................................................ 98
III.2.16. Determinaciones microbiológicas ........................................................................... 100
III.2.16.1. Preparación de las muestras para análisis microbiológico ............................... 100
III.2.16.2. Recuentos ......................................................................................................... 100
III. 2.17. Análisis de las proteínas del lactosuero y las caseínas ........................................... 105
III.2.17.1. Preparación de los extractos de proteínas del lactosuero y las caseínas ........... 105
III.2.17.2. Determinación de la concentración de proteínas y geles de poliacrilamida (SDS
y UREA-PAGE) ................................................................................................................ 106
III.2.18. Determinación del nitrógeno total ........................................................................... 107
III.2.19. Determinación del nitrógeno no proteico y nitrógeno aminoacídico ...................... 107
III.2.19.1. Preparación del extracto ................................................................................... 108
III.2.19.2. Cuantificación del nitrógeno no proteico (NNP)............................................. 108
III.2.19.3. Cuantificación del nitrógeno aminoacídico (NA) ............................................ 108
III.2.19.4. Índices de proteolisis ........................................................................................ 109
III.2.20. Determinación de aminas biógenas ......................................................................... 109
III.2.21. Extracción y cuantificación de la grasa ................................................................... 110
III.2.22. Determinación del índice de acidez......................................................................... 111
iv
Índice
III.2.23. Determinación del contenido en malondialdehído (MDA) mediante el test de ácido

tiobarbitúrico (TBA) ............................................................................................................. 111
III.2.24. Determinación de compuestos volátiles .................................................................. 112
III.2.25. Determinación de aniones de los quesos ................................................................. 113
III.2.26. Análisis instrumental de la textura .......................................................................... 114
III.2.27. Análisis sensorial..................................................................................................... 116
III.2.27.1. Test triangular .................................................................................................. 116
III.2.27.2. Test descriptivo ................................................................................................ 117
III.2.27.3. Test hedónico ................................................................................................... 120
III.2.28. Estudio estadístico de los resultados ....................................................................... 120
IV. RESULTADOS................................................................................................................... 121
IV.1. CAPÍTULO I ................................................................................................................... 123
IV.1.1. DNA typing methods for differentiation of wild cardoon used in the elaboration of
“Torta del Casar” cheese. ...................................................................................................... 125
IV.1.2. Characterisation by protein profiles methods for detection of the vegetable rennet
(Cynara cardunculus) adulteration used in “Torta del Casar” cheese-making. .................... 157
IV.1.3. Influencia de la preparación y almacenamiento del extracto de Cynara cardunculus en
su actividad coagulante. ........................................................................................................ 193
IV.2. CAPÍTULO II .................................................................................................................. 219
IV.3. CAPÍTULO III ................................................................................................................. 229
IV.3.1. Influence of technological properties of vegetable rennet (Cynara cardunculus) on the
texture of “Torta del Casar” cheese....................................................................................... 231
IV.3.2. Proteolysis effect of Cynara cardunculus rennet from different plant selected for
being used in the elaboration of “Torta del Casar” cheese. ................................................... 259
IV.3.3. Role of authoctonous microorganisms on the texture characteristics of the tradictional
cheese “Torta del Casar”. ...................................................................................................... 297
V. DISCUSIÓN......................................................................................................................... 327
V.1. Caracterizar los cardos silvestres recolectados en la región extremeña para la elaboración
de la “Torta del Casar”. ......................................................................................................... 329
V.1.1. Caracterización morfológica .................................................................................. 329
V.1.2. Caracterización genética......................................................................................... 330
V.1.3. Caracterización fenotípica ...................................................................................... 332
V.1.4. Caracterización tecnológica.................................................................................... 335
V.2. Evaluar la influencia que los diferentes años y estadios de maduración en la recolección
del cardo ejercen sobre las características sensoriales de las tortas. ..................................... 339
v
Índice
V.3. Estudiar las modificaciones en las características físico – químicas, microbiológicas y

sensoriales que la utilización de los diferentes cardos recolectados generan en las tortas
elaboradas.............................................................................................................................. 344
V.3.1. Influencia de las propiedades tecnológicas del cuajo en la textura del queso Torta
del Casar. ........................................................................................................................... 344
V.3.2. Influencia de las propiedades tecnológicas del cuajo en la proteólisis del queso
“Torta del Casar”............................................................................................................... 349
V.3.3. Influencia de los microorganismos en las características de la textura del queso
“Torta del Casar”............................................................................................................... 356
V.4. Ceder a la DOP “Torta del Casar” el cardo más adecuado para la obtención de las
mejores tortas. ....................................................................................................................... 359
VI. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 361
VII. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 367
VIII. RESUMEN ....................................................................................................................... 401
vi

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ESCUELA DE INGENIERÍAS AGRARIAS

DEPARTAMENTO DE PRODUCCIÓN ANIMAL Y

CARACTERIZACIÓN DEL CARDO (Cynara

Memoria que presenta la Ingeniera

Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Ctra Cáceres s/n

María de Guía Córdoba Ramos, Profesora Titular del Área de Nutrición y

Que la Tesis Doctoral titulada “Caracterización del cardo (Cynara cardunculus, L)

Lo que firma en Badajoz a Lunes, 2 de julio de 2012.

Fdo: María de Guía Córdoba Ramos

Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Ctra Cáceres s/n

Que la Tesis Doctoral titulada “Caracterización del cardo (Cynara cardunculus, L)

Lo que firma en Badajoz a Lunes, 2 de julio de 2012.

Fdo: Alberto Martín González

Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Ctra Cáceres s/n

María José Benito Bernáldez, Profesora Titular del Área de Nutrición y

Que la Tesis Doctoral titulada “Caracterización del cardo (Cynara cardunculus, L)

Lo que firma en Badajoz a Lunes, 2 de julio de 2012.

Fdo: María José Benito Bernáldez

Esta es mi pequeña y humilde contribución a un producto que está llevando el nombre de mi

A Mariano Cabrero porque siempre creyó en mí y en mi proyecto, por su interés y su

la electricidad y la energía atómica, la voluntad.

I.1.1. Definición de queso

a) Coagulación total o parcial de la proteína de la leche, leche

I.1.2. Producción de queso a nivel mundial, nacional y regional

En España se produjeron 312900 t de queso, en 2009, según los datos del

Nº ganaderías inscritas Nº cabezas inscritas Nº industrias inscritas

Analizando la evolución de los datos de producción de leche y queso en los

A lo largo de la vida de la DOP Torta del Casar se ha constatado un cambio en el

Internacional 2 23,6 26,1 31,3 31,2 24,6 14,5 12,6 12,4

La DOP “Queso de La Serena” ampara a quesos elaborados a partir de leche

La producción de leche para la elaboración del “Queso de La Serena” ha ido

certificadas en este tiempo ha seguido la misma tendencia, de forma que en 2006 se

I.1.3. Tipos de quesos más importantes

Existen seis familias de queso de oveja importantes: blanco o fresco, de

El queso Roquefort es el tipo de queso azul de leche de oveja más importante,

El queso Ossuau-Iraty se elabora en el suroeste de Francia, a partir de leche de

Broccio es un queso de suero producido en Córcega, que recibió la DOP en

En Grecia existe gran tradición en la producción de quesos. Un 39 % de la

El queso Feta es el queso griego tradicional más famoso. Es de pasta blanda,

El queso Galotyri es de tipo blando, con textura untuosa y cremosa, producido

El queso Graviera Kritis es un queso duro elaborado en Creta, a partir de leche

Otro tradicional queso griego, de pasta dura es Kefalograviera, elaborado con

De ellos, el más famoso es el queso Pecorino Romano, elaborado con queso de

El queso Pecorino Sardo es un queso semicocinado producido en Cerdeña, a

A diferencia de estos quesos italianos, Pecorino Toscano es un queso de pasta

La mayoría de los quesos portugueses se fabrican siguiendo métodos

El queso Azeitao es un queso de textura semi-blanda, con pocos o ningún

Castelo Branco es un tipo de queso de textura semi – blanda, de la parte centro-

El queso portugués más tradicional es Serra da Estrela, producido en las

En España existen seis DOP de quesos elaborados con leche de oveja,

El queso Manchego se elabora con leche pasterizada o cruda de oveja

Idiazábal es un queso de textura semidura o dura, producido en el País Vasco y

ahumado que se aplica al tercer mes del proceso de maduración, mediante la

El queso Roncal es de pasta dura, elaborado en Navarra, con leche cruda de

En Zamora se produce el queso Zamorano, de pasta dura, elaborado a partir de

El Queso de la Serena se caracteriza por su pasta semi-blanda y se produce en el