Yyy

Bacteriología
práctica
para el Médico Veterinario
Nestor O. Stanchi
UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUYO

Fondo Editorial
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BACTERIOLOGÍA
PRÁCTICA
PARA EL
MÉDICO VETERINARIO
Nestor Oscar Stanchi
Colaboradores
María Sandra Arauz
Mercedes Gatti
Gerardo Leotta
Pablo Eduardo Martino
Florencia Pantozzi
Germán Blas Vigo
FONDO EDITORIAL
Stanchi , Néstor
Bacteriología práctica para el médico veterinario. - 1a ed. - San Juan : Uni-
versidad Católica de Cuyo, 2009.
200 p. ; 17x22 cm.
ISBN 978-950-559-225-8
1. Ciencias Veterinarias. 2. Bacteriología. I. Título

CDD 636.089
IMPRESO EN ARGENTINA
PRINTED IN ARGENTINA
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Esta edición de 100 ejemplares se terminó de imprimir en el mes de Julio de
2009.
Diseño: Dr. Nestor Oscar Stanchi Diseño de tapa: DCV Teresa Canevari
Revisión de estilo: Prof. Nora B. Vázquez
Los editores no se hacen solidarios con los conceptos vertidos en este libro. Los nombres
comerciales y marcas registradas así como sus dosis indicativas mencionadas en esta
obra, no significan de ninguna manera recomendación por parte de los autores ni de los
editores, sino que son sólo ejemplos para una mejor descripción de la información. Asimis-
mo las prescripciones de drogas y dosificaciones de los fármacos han sido aconsejadas
por la bibliografía científica pero no necesariamente cuentan con la autorización oficial
para su uso terapéutico con que se indican en las distintas partes de la obra.
Nestor Oscar Stanchi
Profesor Titular de Microbiología
Facultad de Ciencias Veterinarias
Universidad Nacional de La Plata
Decano de la Facultad de Veterinaria
Universidad Católica de Cuyo (San Luis)
Argentina
Colaboradores
María Sandra Arauz
Laboratorio Central
Eleatrice María de las Mercedes Gatti

Cátedra de Microbiología
Gerardo Leotta
Laboratorio de Microbiología de los Alimentos
Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Técnicas (CONICET)
Pablo Eduardo Martino

Comisión de Investigaciones Científicas
Cátedra de Microbiología
Florencia Pantozzi
Laboratorio de Diagnóstico e Investigaciones
Bacteriológicas. Cátedra de Microbiología Especial
Facultad de Ciencias Vetetinarias
Germán Blas Vigo

Cátedra de Microbiología.
Dedicatoria:
A nuestras familias
A nuestros maestros
PRefacio
El presente pretende ser un material de diagnóstico
bacteriológico práctico para profesionales veterinarios con
especial referencia a las muestras clínicas más comunes que
involucran a la práctica frecuente en veterinaria; pretendiendo
acercar a los veterinarios la posibilidad de incorporar, dentro
de las prestaciones profesionales el estudio microbiológico.
Actualmente, se están viviendo cambios sustanciales en
los aspectos profesionales en donde la incorporación de más y
mejores servicios no sólo proporciona un correcto diagnóstico,
sino que permite así instaurar un tratamiento preciso. Ade-
más, estos mejores resultados mejoran el rédito de los análisis
realizados y permite conservar al paciente-cliente. Un ejemplo
clásico son las otitis caninas, en donde el clínico instaura
normalmente un tratamiento sin estudiar el microorganismo
que la produce y menos aún su sensibilidad antimicrobiana,
en definitiva el dueño del animal luego de recorrer varios pro-
fesionales encuentra quien le realiza un estudio bacteriológico
y determina cuál es la bacteria y la droga a utilizar.
Intentamos abordar también fundamentos que ayuden a
una compresión del porqué se realizan. Algunos son repasos
de lo estudiado en las unidades académicas, pero no por ello
menos importantes. Incorporamos estrictamente las Familias
bacterianas de aerobios y anaerobios facultativos más fre-
cuentes en la clínica veterinaria, con la recomendación que
"si no logra identificar a la bacteria" debe enviarla a un
centro de mayor complejidad para cumplir tal objetivo. Este
centro puede ser desde un laboratorio de análisis clínicos
de medicina veterinaria o humana, hasta un laboratorio de
referencia de una Universidad o Institución Pública.
Índice general
Microorganismos nativos 7
Bioseguridad 13
Material de laboratorio bacteriológico 49
Esterilización 59
Marcha bacteriológica 71
Antibiograma 89
Procesamiento de muestras clínicas 97
Familias bacterianas de importancia clinica
en medicina veterinaria 109
Anexos 143
Rerencias bibliograficas 201
microbiota nativa
Para comprender a los microorganismos que producen
enfermedades primero hay que entender el concepto de mi-
croorganismo nativo. Un microorganismo nativo es aquel que
se encuentra normalmente en un animal. Sin embargo, no
todos los órganos y tejidos de un animal no deben presentar
colonización bacteriana, la sangre, cerebro, riñón, músculo,
entre otros, están normalmente libres de microorganiosmos.
Puede, excepcionalmente, encontrarse bacteremias normales
pos prandial. Por el contrario, las superficies de los tejidos (piel
y membranas mucosas) están constantemente en contacto con
microorganismos ambientales y son colonizados por otros. A
esta mezcla de microorganismos regularmente presente en
un sitio del animal se la denomina como microorganismos
nativos, microbiota nativa o también como microbiota (“flora”)
normal.
Los conocimientos acerca de la naturaleza de esta asocia-
ción entre el hospedador animal y los microorganismos nativos,
pero se considera que es una interacción dinámica. Tanto el
hospedador como su microbiota obtienen algún beneficio, por
lo tanto la asociación es principalmente mutualista. El hos-
pedador puede obtener de su microbiota muchos beneficios
como por ejemplo nutricionales o bien la competencia entre
los microorganismos nativos y los patógenos.
La microbiota normal está adaptada específicamente a
ciertos tejidos o superficies del animal, por interacción bio-
química entre los componentes superficiales del hospedador
que les permiten la adherencia y colonización. Esta microbiota
muestra una predilección para colonizar un tejido y la mayoría
de las bacterias son capaces de colonizar específicamente a
un tejido u órgano en particular utilizando sus propios com-
ponentes bacterianos uniéndose a receptores específicos.
Composición de los microorganismos

nativos
La microbiota en las diferentes especies animales, varía
de acuerdo a los receptores y a factores tales como edad, sexo,
dieta y temperatura del animal.
7
para el médico veterinario
Nestor O. Stanchi y Col.
Microbiota normal de la piel

La densidad y la composición de la microbiota normal
de la piel varía con el sitio anatómico. Las zonas de elevada
humedad permiten la actividad y crecimiento de densidades
relativamente altas de células bacterianas, pero en otros sitios
la población bacteriana disminuye notablemente.
La mayoría de los microorganismos que se encuentran
en la superficie de un animal, se alojan en las capas más
superficiales de la epidermis y las partes superiores de los
folículos pilosos. Consisten principalmente de Staphylococcus
epidermidis, Micrococcus spp., y Corynebacterium spp. Gene-
ralmente no son patógenos y se los considera comensales,
aunque se les asignaron papeles mutualísticos y parasitarios.
Ciertos patógenos potenciales como Staphylococcus aureus
en ocasiones se encuentran en la piel de la cara y manos en
el hombre, particularmente en individuos que son portadores
nasales. En este caso, el veterinario que esté relacionado con
la sanidad de alimentos, debe conocer bien esta posibilidad
ya que S. aureus puede ser responsable de importantes brotes
de intoxicaciones alimenticias. Cualitativamente, las bacterias
en la piel cerca de cualquier orificio del cuerpo pueden ser
similares a los hallados en él.
Microbiota normal del

tracto respiratorio
Como se explicó anteriormente, las narinas (orificios
nasales) se colonizan predominantemente con S. epidermidis
y Corynebacterium spp., y en algunas circunstancias con S.
aureus. Un gran número de especies bacterianas colonizan
el tracto respiratorio superior (nasofaringe), entre las que se
incluyen Streptococcus no hemolíticos y alfa-hemolíticos.
El tracto respiratorio bajo (bronquios y pulmones) están
libres de microorganismos, principalmente debido a la acción
de limpieza eficaz del epitelio ciliado. Cualquier bacteria que
alcanza el tracto respiratorio más bajo es barrida hacia arriba
por la acción de la capa mucociliar bronquial y es eliminada
por tos, estornudo o deglución. Si el epitelio del tracto res-
piratorio se daña, como en la neumonía viral, el individuo
puede tornarse susceptible a la infección por patógenos que
descienden de la nasofaringe.
8
Bacteriología Práctica
Microbiota normal de la cavidad oral
La presencia de nutrientes, detritus epiteliales y secre-
ciones de la boca lo tornan un hábitat favorable para una gran
variedad de microorganismos. Las bacterias orales incluyen
Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Staphylococcus spp.,
Corinebacterium spp. y un número diverso de anaerobios.
La boca presenta diferentes situaciones ecológicas con
la edad y esto corresponde a cambios en la composición de
la microbiota normal. La cavidad oral está compuesta de los
tejidos del labio, carrillos, lengua y paladar que se mantienen
húmedos por las secreciones de las glándulas salivales. La
cavidad oral de un animal antes de nacer es estéril, pero rápi-
damente se coloniza del ambiente y de la madre con el primer
alimento. La erupción de los dientes permite la colonización de
nuevas bacterias. Estas requieren una superficie no epitelial
para colonizar y persistirán mientras los dientes permanezcan.
La complejidad de la microbiota oral continúa aumentando con
el tiempo, incluyendo bacteroides y espiroquetas que pueden
colonizarla posteriormente.
Microbiota normal de la conjuntiva

Una variedad de bacterias puede cultivarse de la con-
juntiva normal pero el número de organismos es normalmente
bajo. S. epidermidis y ciertos coryneformes son los dominantes.
En algunas circunstancias pueden encontrarse S. aureus, al-
gunas especies de Streptococcus spp. y Haemophilus spp.
La conjuntiva se mantiene húmeda y sana debido a las
secreciones continuas de las glándulas lagrimales. El pestañeo
limpia la conjuntiva lava continuamente los objetos extraños,
incluso las bacterias. Las lágrimas también contienen sustan-
cias bactericidas como la lisozima. Los microorganismos tienen
escasas oportunidades de colonizar la conjuntiva si carecen
de mecanismos especiales para adherirse a las superficies
epiteliales y no tienen posibilidad de resistir el ataque por
ejemplo de la lisozima.

tracto urogenital
La orina es normalmente estéril y como el tracto urinario
se vacía cada pocas horas, los microorganismos tienen difi-
cultades en establecerse. La microbiota de la uretra anterior
consiste predominantemente de S. epidermidis, Enterococcus
9
faecalis y algunos Streptococcus spp. alfa-hemolíticos donde

su número no es abundante. Además, algunas bacterias del
tracto entérico (Eschericia coli, Proteus spp.) y Corynebacterium
que probablemente provienen de la piel, vulva o recto, en de-
terminadas ocasiones pueden encontrarse la uretra.
La vagina se coloniza poco después del nacimiento con
Corynebacterium spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,
algunas especies de la Familia Enterobacteriaceae (E. coli) y
principalmente de bacterias ácido lácticas (Lactobacillus).

tracto gastrointestinal
La microbiota bacteriana del tracto gastrointestinal de
los animales fue estudiada más exhaustivamente. La compo-
sición de la misma difiere entre las distintas especies y entre
distintos animales de una misma especie. La composición de
la microbiota también es influenciada por la edad, dieta, etc.
La microbiota del intestino grueso (colon) es cualitativa-
mente similar a la encontrada en materia fecal. Las poblaciones
de bacterias en el colon alcanzan niveles de 1011 bacterias
por gramo de materia fecal. Algunas especies de la Familia
Enterobacteriaceae, Enterococcus spp., Clostridium spp. y Lac-
tobacillus spp. se encuentran regularmente en gran número,
pero las especies predominantes son Bacteroides spp. y Bifi-
dobacterium spp. Estos organismos pueden llegar a superar
a E. coli de 1.000 a 10.000 veces. Esta microbiota normal se
caracteriza porque sintetiza y excreta vitaminas sobrepasando
la de sus propias necesidades y, de esta manera, pueden absor-
berse como nutrientes por el hospedador. Por ejemplo, E. coli
secreta vitamina K y ciertas vitaminas del grupo B. Además,
previene la colonización de la mucosa entérica por patógenos,
compitiendo por los sitios de adhesión o por los nutrientes
esenciales. Las bacterias intestinales producen una variedad
de sustancias entre las que se incluyen desde ácidos grasos
y peróxidos no específicos, a bacteriocinas muy específicas
que inhiben o matan otras bacterias no indígenas. Entre las
funciones de estas sustancias se describió la estimulación
del desarrollo de ciertos tejidos, como por ejemplo, del ciego y
ciertos tejidos linfáticos y la producción de anticuerpos. Los
componentes de la microbiota normal de un animal se com-
portan como antígenos y por consiguiente induce respuestas
inmunológicas.
10
Bacterias ruminales
Los rumiantes, como todos los animales herbívoros,
cuentan con las actividades enzimáticas y metabólicas de los
microorganismos para la digestión inicial de su comida y para
proporcionar luego su propio suministro de nutrientes.
El alimento de los rumiantes es principalmente carbohi-
dratos (celulosa) derivada de las plantas. La celulosa se degrada
inicialmente por la enzima celulasa secretada por bacterias
en el rumen. Esto produce un aumento de los carbohidratos
utilizables para las bacterias y, por ende, un aumento de la
cantidad de bacterias ruminales que utilizan estos compo-
nentes a través de la fermentación. Los productos finales de
la fermentación del metabolismo bacteriano son ácidos grasos
como butirato, lactato, propionato, acetato y formato, así como
succinato, dióxido de carbono e hidrógeno. Las bacterias me-
tanogénicas también componentes de la microbiota del rumen,
utilizan dióxido de carbono, hidrógeno y algunos ácidos grasos
(principalmente el acetato) producido por las bacterias fermen-
tadoras. La microbiota ruminal es diversa e incluye especies
que pueden atacar la celulosa, el almidón y la hemicelulosa.
Algunas especies de Bacteroides celulolíticos, Clostridium spp.
y Ruminococcus producen principalmente ácido succínico como
producto final. Streptococcus spp., Bacteroides spp. y Seleno-
monas spp., digieren el alimidón produciendo ácido fórmico,
láctico, butírico y propiónico.
11
Bioseguridad
La bioseguridad es un conjunto de medidas preventi-
vas, probadamente eficaces y reconocidas internacionalmente,
orientadas a proteger la salud y la seguridad del personal y
su entorno. Incluyen normas contra riesgos producidos por
agentes biológicos (microorganismos patógenos), físicos, quí-
micos y mecánicos. En los últimos años se incorporaron las
acciones o medidas de seguridad requeridas para evitar los
riesgos derivados del manejo de un organismo modificado ge-
néticamente, sus derivados o productos que los contengan.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) lleva años
dedicada a la tarea de difundir información sobre seguridad
y salud ocupacional, siendo la bioseguridad uno de los temas
de mayor importancia. En el año 1983 se publicó la primera
edición del "Manual de bioseguridad en el laboratorio" con los
objetivos de difundir la información y animar a los países a
desarrollar sus propios códigos de seguridad para el trabajo
con microorganismos patógenos en el laboratorio. En el año
2004 se publicó la tercera edición del manual y en ella se ac-
tualizó la información de las anteriores y se añadieron nuevos
capítulos que son respuesta a los cambios producidos en la
escena internacional, evaluación del riesgo, incremento de la
utilización de organismos modificados genéticamente, trans-
porte de materiales infecciosos, etc.
El ejercicio de la profesión de Médico Veterinario es,
dentro de las profesiones liberales, una de las que presenta
mayor probabilidad de sufrir accidentes laborales, ya que re-
gistra una alta incidencia de enfermedades zoonóticas y expone
a lesiones de origen traumático en el trabajo con animales;
riesgos químicos en las tareas de laboratorio y quirófanos, así
como riesgos físicos generados por el uso de equipos de radia-
ciones ionizantes. La mayor parte de este tipo de accidentes
y enfermedades está producida por el uso inadecuado de los
elementos de protección y el incumplimiento de medidas de
bioseguridad.
Riesgo biológico y
niveles de bioseguridad
El papel del veterinario es fundamental en la asignación
de responsabilidades para los programas de salud y seguridad
en el trabajo, bien sea en clínicas, zoológicos, laboratorios de
13
investigación, granjas entre otros. Las medidas de biosegu-
ridad están relacionadas con la habilidad para prevenir la
transmisión de agentes patógenos, así como para controlar su
diseminación hacia los humanos y hacia las instalaciones. Es
decir, que contempla prácticas de manejo dirigidas a reducir
la oportunidad que los agentes infecciosos ganen acceso o se
dispersen dentro de una unidad de producción, hospital, región
o país. Algunos factores que deben considerarse en el trabajo
con animales son los siguientes:
-El carácter de los animales, es decir, su grado de agre-
sividad y tendencia a morder o arañar.
-Sus endo y ectoparásitos naturales.
-Las zoonosis a las que son susceptibles.
-La posible diseminación de alérgenos.
Una forma corta y sencilla para definir el riesgo es la

siguiente: probabilidad de ocurrencia de un evento adverso
(peligro) y la magnitud de sus consecuencias.
El riesgo es por tanto, una condición futura, proporcional
a la envergadura (magnitud) del peligro y a la vulnerabilidad, a
las deficiencias objetivas que existen en los elementos expues-
tos para resistir o contrarrestar el peligro. El análisis de riesgo
consiste entonces en la cuantificación del número previsto de
vidas perdidas, personas lesionadas, daños a la propiedad y
perturbación de la actividad económica debido a un fenómeno
determinado, teniendo en cuenta la vulnerabilidad del territo-
rio u objetivo sometido a evaluación. En el riesgo biológico el
daño potencial se dirige a las personas o animales, y puede ser
causado por bacterias, hongos, parásitos, ADN recombinante,
plásmidos o productos celulares.
La OMS clasifica a los microorganismos infecciosos en
cuatro grupos en función del riesgo intrínseco. Las siguientes
definiciones fueron establecidas para su utilización en el tra-
bajo de laboratorio.
Grupo de riesgo 1: microorganismos con escasas posibi-

lidades de causar enfermedades en humanos o en animales sin
riesgo o riesgo muy bajo para el individuo y la comunidad.
Grupo de riesgo 2: patógenos que pueden causar enfer-
medad en humanos y animales, pero es improbable que pre-
senten un problema serio para los trabajadores del laboratorio,
la comunidad, el ganado o el medioambiente. Las exposiciones
14
en el laboratorio pueden causar infecciones graves, pero exis-
ten tratamientos eficaces, hay medidas preventivas y el riesgo
de diseminación es limitado, estos patógenos representan un
riesgo individual moderadoy un riesgo comunitario bajo.
Grupo de riesgo 3: patógenos que usualmente causan
enfermedades graves en humanos y en animales, pero nor-
malmente, no se transmiten de un individuo infectado a otro.
Existen tratamiento y medidas preventivas eficaces. Este grupo
representa un riesgo individual altoy un riesgo comunitario
bajo.
Grupo de riesgo 4: patógenos que habitualmente causan
enfermedades graves en humanos y animales, y que pueden
ser rápidamente transmitidos, directa o indirectamente, de
un individuo infectado a otro. Normalmente el tratamiento no
está disponible y representan un riesgo individual y comuni-
tario alto.
Niveles de bioseguridad
en el laboratorio
El trabajo de los laboratorios clínicos y microbiológicos,
ya sea en el ámbito veterinario o humano, es complejo y cam-
biante, por lo que deben estar preparados para adaptarse a
las exigencias que en materia de salud pública impone el día a
día; un ejemplo de lo expuesto lo constituyen las enfermedades
infecciosas emergentes y re-emergentes. Existen requisitos y
procesos de seguridad en el laboratorio que incluyen procedi-
mientos y prácticas de bioseguridad. Sólo si las personas que
trabajan en los laboratorios conocen las normas de biosegu-
ridad y las aplican, pueden determinar su propia seguridad,
la de sus compañeros y de la comunidad. El personal de
laboratorio debe cumplir con las normas de bioseguridad y
los directivos de la institución deben cumplir con brindar las
facilidades para que estas normas sean aplicadas. Debe existir
una adaptación del trabajo de laboratorio al nivel de seguridad
pertinente, dado que no se puede exigir el riesgo cero. En la
práctica, cualquier actividad o proceso involucra algún grado
de riesgo y la evaluación de este es muy importante debido a
que si un riesgo particular no es identificado, los pasos para
reducirlo no pueden ser formulados por lo que de ocurrir
efectos adversos, los gastos en procedimientos de mitigación
pueden ser elevados.
Las instalaciones de los laboratorios se clasifican en
15
cuatro niveles de bioseguridad que están relacionados con los
grupos de riesgo en los que se clasifican los microorganismos
infecciosos.
-Laboratorio Básico - Nivel 1 de Bioseguridad
-Laboratorio Básico - Nivel 2 de Bioseguridad
-Laboratorio de Contención - Nivel 3 de Bioseguridad
-Laboratorio de Contención máxima - Nivel 4 de Biose-
guridad.
Esta clasificación está basada en un conjunto de aspec-

tos tales como: las características de diseño y construcción del
laboratorio, elementos de contención, equipos y procedimien-
tos de trabajo que se requieren para el trabajo con agentes
biológicos de los diferentes grupos de riesgo. En la normativa
española el término “nivel de bioseguridad” se corresponde con
el de “nivel de contención” y en ella se incluyen las medidas
específicas de contención para los niveles 2, 3 y 4.
En la tabla 1 se muestran algunos ejemplos de la relación
entre los grupos de riesgo, los niveles de bioseguridad requeri-
dos, la práctica de trabajo y el equipamiento de seguridad.
Tabla 1. Relación entre grupos de riesgo y niveles de bioseguridad,

prácticas y equipos de trabajo.
Grupo
Nivel de Tipo de
de Prácticas de laboratorio Equipos de seguridad
bioseguridad laboratorio
riesgo
Buenas prácticas de
Enseñanza, laboratorio (BPL) Ninguno en especial,
1 1. Básico
investigación Buenas técnicas trabajo en banco abierto
microbiológicas (BTM)
BPL, BTM más:
Servicio de salud • equipos de Trabajo en banco abierto

primario, protección más cabina de seguridad
2 2. Básico
diagnóstico, individual (EPI) biológica (CSB) para
investigación • señalización control de aerosoles
“Biopeligroso”
Nivel 2 más:
3 3. Contención
Diagnóstico, • accesos y CSB y otros dispositivos
investigación ventilación para todas las actividades
controlados
Nivel 3 más:
CSB clase III o trajes con
presión positiva
4. Contención Patógenos • esclusas de aire
4 combinados con CSB clase
máxima peligrosos • tratamiento de II, autoclaves de doble
residuos específico puerta, filtración del aire
Los materiales remitidos al laboratorio para su estudio son

potencialmente peligrosos, ya que pueden contener y transmitir
16
diversos patógenos microscópicos, por lo que su manipulación
responsable debe evitzar la contaminación del ambiente del
laboratorio así como del operador laboratorista, evitando la
difusión al medioambiente exterior mediante el agua de des-
hecho, las corrientes de aire, etc. Es frecuente la eliminación
incorrecta de las muestras una vez procesadas en piletas o
sanitarios ya que el material infeccioso vertido en la red cloacal,
sin planta depuradora, gana el curso de los ríos aumentando
la contaminación del medio ambiente. Las formas vegetativas
de bacterias, los mohos y levaduras así como la mayoría de los
virus son sensibles a la radiación UV y al calor húmedo, por
lo que si se dispone de un autoclave es recomendable su uso
para desechar el material luego de un proceso de esterilización
adecuado como residuo común.
Una de las muestras comúnmente recepcionada en el
laboratorio es la materia fecal, donde es frecuente la presencia
de huevos de helmintos o quistes de protozoarios. A modo de
ejemplo se cita que las larvas rhabditoideas (L1) de Strongyloi-
des stercolaris presentes en heces animales evolucionan en
pocas horas a larvas filariformes (L3) que atraviesan la piel
sana. Otros parásitos resultan muy resistentes a los desinfec-
tantes de uso común, registrándose por ejemplo, la evolución
a embrión de los huevos de Ascaris lumbricoides en material
fecal con 5-10 % de formol. Bacterias como Salmonella spp.,
Shigella spp., Campylobacter spp., virus como rotavirus, hepa-
titis y hongos oportunistas o patógenos primitivos pueden ser
ingeridos, inhalados o transportados al operador en especial
cuando la muestra es remitida para cultivo, donde no media
ningún tipo de conservante más que la refrigeración para
mantener la representatividad de la muestra.
Los laboratorios que manipulen materiales en los cua-
les exista incertidumbre acerca de la presencia de agentes
biológicos que puedan causar enfermedad en el hombre, pero
que no tengan como objetivo trabajar con ellos como tales,
cultivándolos o concentrándolos, deberían adoptar el nivel 2
de contención. Deberán utilizarse los niveles 3 y 4 siempre
que se sepa o sospeche que son necesarios, salvo cuando las
líneas directrices establecidas por las autoridades sanitarias
indiquen que conviene un nivel de contención menor.

17
Niveles de contención
en el laboratorio
Se reconocen en el laboratorio recursos y métodos se-
guros que reducen o eliminan la exposición a materiales po-
tencialmente peligrosos. Estos niveles de contención, dirigidos
al operador, personas del entorno y medioambiente, pueden
dividirse en primarios y secundarios.
El nivel de contención primario comprende la protec-
ción del personal y medio ambiente inmediato. La protección
personal demanda un operador con conocimiento de las Bue-
nas Prácticas de Laboratorio (BPL) y Buenas Técnicas Micro-
biológicas (BTM), capacitado para utilización de equipos y
dispositivos, chequeado en sus condiciones de salud y provisto
de vestimenta adecuada a la actividad que va a desarrollar.
La combinación entre las características de la edificación
y las prácticas operacionales constituye el nivel de contención
secundario cuya complejidad estará en relación al tipo riesgo con
que se trabaje.
El personal de laboratorio
En los laboratorios clínicos y de microbiología la pre-
paración del personal es de una importancia extrema, tanto
para lograr en los ensayos los resultados confiables como por
los aspectos de seguridad. El personal debe estar totalmente
consciente que la aplicación de las BPL y BTM son importantes
para garantizar los resultados de su trabajo, pero que también
son esenciales para la seguridad. Asegurar la preparación y
competencia del personal para la realización de su trabajo,
lo mismo sea si tienen que operar equipos, realizar ensayos,
preparar medios de cultivos u otra operación.
Dentro de la capacitación resulta esencial el conoci-
miento de las normas de conductas en el laboratorio y la
organización del trabajo de manera que el trabajador sepa a
quien dirigirse ante una dificultad. Por muy alta que sea la
tecnología con que se cuente, los resultados de su aplicación
siempre dependen del hombre y su motivación hacia el trabajo.
Es por ello la importancia que reviste asegurar la preparación
y competencia del personal de laboratorio. El personal nuevo
debe ser entrenado y sólo después de demostrada su capacidad
se le permitirá realizar el trabajo sin supervisión.
En la Tabla 2 se citan algunas indicaciones sobre prác-
ticas básicas para laboratorios de microbilogía según normas
internacionales.
18
Tabla 2. Prácticas básicas para laboratorios de microbiología
Requisitos Medidas
1 Evitar el contacto de En el laboratorio: no mantener comida ni
material peligroso con la bebidas; no fumar; no aplicar cosmético
piel y la boca Utilizar dispositivos para pipetear (no pipetear con la boca)
Evitar el u so de jeringuillas y material cortantes
Colocar cuidadosamente en contenedor
apropiado el material de vidrio a descartar (rotura)
2 Evitar la salida de Lavar la manos antes de comenzar el trabajo, a la sal ida del
material peligros de las laboratorio y después de tocar los materiales
áreas de la boratorios Usa r ropa de protección que no sale del
laboratorio
Decontami nar todo el material que sale del l aboratorio
Utilizar contenedores diseñados para traslado de material
Establecer un plan contra vectores
3 Evitar accidentes con Cubrir los cabellos largos

equipos Usar ropa de No usar joyas durante el trabajo
protección Permitir solo el uso por personal capacitado
4 Evitar la Prohibido la permanencia en el l aboratorio de cu alquier

contami nación de cosa no relacionada con los ensayos
material ajeno al
laboratorio
5 D isminuir los riegos en Establecido el plan de medida ante accidentes

accidentes Algunas medidas en este pla n pueden ser las siguientes:
Información inmediata al supervisor.
Derrame de medio de cu ltivo con material
infecci oso desinfectar el área con guantes
Es de suma importancia la vigilancia de la salud de todos

los trabajadores, que deberá realizarse siempre en términos
de confidencialidad, respetando siempre el derecho a la in-
timidad y la dignidad de la persona en lo que se refiere a su
estado de salud. La vigilancia de la salud será llevada a cabo
por el personal sanitario competente, por un especialista en
Medicina del Trabajo, sin perjuicio de la participación de otros
profesionales sanitarios con formación y capacidad técnica
acreditada, integrados todos ellos en el Servicio de Prevención
y Redes Epidemiológicas. En función del riesgo, la vacunación
específica deberá ser ofrecida a aquellos trabajadores que no
sean inmunes a los agentes biológicos a los cuales están ex-
puestos o vayan a exponerse.
Hay agentes infecciosos, con un efecto más pronun-
ciado y específico en la embarazada o en el feto. Se resumen
algunas de estas especies y sus efectos más importantes en
la Tabla 3.
Tabla 3. Efectos en la embarazada y el feto.
Agente biológico Efec to

Campylobacter fetus Neumonía,bacteriemia, mortinato
Treponema pallidum Sífilis congénita
Cytomegalovirus Bajo peso fetal, sordera, mortina to
Herp es simplex virus Ictericia, microcefalia
Coccidioidosis diseminada en la madre,
Coccidioides immitis
nacimientos prematuros y mortinato.
19
Equipo de protección individual (EPI)
Los equipos de protección individual son dispositivos
de los que se dispone con el objetivo de evitar o disminuir los
riesgos que amenazan la salud y la seguridad en el trabajo,
sin dejar de contemplar el confort. El operador debe controlar
y prevenir las infecciones, ya sea hacia si mismo como entre
los pacientes externos e internados. Es necesario actuar con
conciencia en el manipuleo de materiales y equipos que se
utilizan en los distintos procedimientos ya que pueden ser
potenciales portadores de agentes infecciosos. Además tomar
todas las precauciones de barrera en el tratamiento de los
pacientes y el manejo de los materiales con ellos utilizados,
como así también el material orgánico (sangre, orina, etc.) por
lo que deben utilizarse cada vez que se prevea contacto con
estos materiales contaminados. Para que la protección perso-
nal constituya una respuesta eficaz a un problema de riesgo
profesional, es preciso conocer plenamente la naturaleza del
propio riesgo y su relación con el medio ambiente de trabajo
en su conjunto.
El operador debe estar capacitado respecto del tipo de
equipo que utiliza, si es EPI de un solo uso (de usar y tirar) o
reutilizables y, en este segundo caso, cuál es la duración del
servicio razonablemente previsible antes que sea necesario
sustituirlos. Estas decisiones pueden ser muy obvias, como
ocurre en el caso de los guantes o mascarillas de protección
respiratoria de un solo uso; pero en muchas otras ocasiones es
preciso evaluar con atención si resulta eficaz reutilizar trajes
o guantes protectores contaminados por el uso anterior. La
decisión de desechar o reutilizar un dispositivo protector caro
debe adoptarse después de estimar con detenimiento el riesgo
de exposición que implicaría para un trabajador la degradación
de la protección o la contaminación del propio dispositivo. Los
programas de mantenimiento y reparación del equipo deben
prever la toma de decisiones de este tipo. Es reglamentario que
todos los equipos de protección individual vayan acompañados
de un folleto explicativo del fabricante y que estén certificados
y homologados por la norma vigente. Se pueden encontrar des-
de cascos, tapones para los oídos, gafas o pantallas faciales,
mascarillas respiratorias, guantes, vestuario laboral, calzado
de seguridad hasta equipos antiácidos. Los equipos que pue-
den ser necesarios en algún momento en un laboratorio de
biotecnología o de tipo biológico son básicamente:
20
-Protección del cuerpo y vestimenta: en general,
deben tenerse en cuenta que el personal de los laboratorios
de biotecnología y de tipo biológico que está en contacto con
materiales contaminados no debe usar en dichos lugares de
trabajo su ropa de calle, el vestuario que sirve como protec-
ción personal no debe salir nunca del lugar de uso a otros
lugares ajenos al de trabajo y no se debe utilizar ropa de
calle que aumente la superficie corporal expuesta (pantalones
cortos, sandalias, etc.). Como parte del vestuario de protección
se incluyen las batas, guardapolvos o delantales preferible-
mente abrochados a la espalda y con los puños elásticos; en
ocasiones, es conveniente utilizar polainas o cubrezapatos.
Los delantales pueden ser también de caucho; evitan la posi-
bilidad de contaminación por la salida explosiva o a presión
de sangre o líquidos corporales. La ropa laboral debe ser ser
cómoda, ligera y segura, generalmente de de poliéster o algo-
dón resultando confortables para la piel del trabajador. Existe
ropa laboral desechable que es de un solo uso y está orientada
a satisfacer requisitos específicos dentro del sector laboral;
pueden ser de tela o plástico dependiendo del uso debiéndose
evaluar el nivel de exposición y la resistencia física del equipo
siendo recomendable los buzos que protegen al trabajador
desde la cabeza hasta las piernas y como cualquier equipo
de protección debe llevar obligatoriamente marcas relativas
a talla, marca del fabricante, referencia del modelo, fecha de
fabricación y normativa vigente. Los gorros se utilizan con el
fin de evitar en el trabajador el contacto por salpicaduras por
material contaminado y además evita la contaminación con
los cabellos del trabajador. Para niveles de alto riesgo biológi-
co en el trabajo son de elección los trajes tipo Tyvec o similar
existiendo equipos con ventilación positiva.
-Protección de manos: manoplas y guantes de segu-
ridad, estos últimos pueden cu-
brir parte del antebrazo y brazo,
aportando protección total contra
riesgos mecánicos, térmicos, quími-
cos, eléctricos y contra microorga-
nismos. Los guantes de seguridad,
como cualquier equipo de protec-
ción individual, se clasifican en tres
categorías: guantes de seguridad de
categoría I (protegen contra riesgos
Figura 1 Traje tipo Tyvec
21
leves), guantes de seguridad de categoría II (evitan lesiones gra-
ves o muerte) y guantes de seguridad de categoría III (protegen
contra lesiones graves o la muerte). Los tipos de guantes más
comunes utilizados en el labotario son los térmicos y los de
latex dentro de otros existentes como piel flor, tipo americano
(de serraje vacuno), nitrilo y anticorte. Los guantes térmicos
como su nombre indica, están diseñados para trabajar a al-
tas o bajas temperaturas. Los guantes de altas temperaturas
están forrados con gran cantidad de algodón o algodón con
carnaza y los guantes para bajas temperaturas deben ser
impermeables para no dejar pasar el frío y la humedad; ante
deformaciones o desgarros deben sustituirse. Los guantes de
caucho natural (látex), sintético (neopreno) y los de plástico
permiten un perfecto ajuste permitiendo una gran sensibilidad
al tacto, deben de ser los adecuados para el trabajo a realizar y
también de la talla correcta para el trabajador para su mayor
comodidad. Los guantes de látex, pueden deteriorarse de for-
ma prematura por una exposición excesiva a la luz solar por
lo que deben conservarse en lugar fresco y seco. Los guantes
de látex ideales deben estar libre de polvos y tener el menor
número de productos químicos residuales de fabricación. No
se deben usar guantes de látex cuando se toquen productos
hechos a base de petróleo, solventes y productos químicos, ya
que pueden destruir este material. Se utilizan guantes de latex
cuando el trabajador sanitario presente heridas no cicatrizadas
o lesiones dérmicas exudativas o rezumantes, cortes, lesiones
cutáneas; cuando se realicen curaciones o toma de muestra en
heridas frescas o infectadas y también cuando sea necesario
mantener medidas de asepsia para realizar procedimientos
invasivos (colocación de sondas, punción lumbar o pleural,
intubación endotraqueal, etc), intervenciones quirúrgicas y
suturas. Los guantes pueden ser reemplazados por manoplas
cuando se manipulan sondas, drenajes, se aspiran secrecio-
nes o se higieniza a los pacientes, se manipula ropa sucia o
se vacían o limpian, orinales, frascos, etc. Los guantes son
quizás las prendas de protección más empleadas, aunque no
siempre se siguen correctamente las normas elementales de
uso sobre las que se citan recomendaciones como lavarse las
manos obligatoriamente al quitarlos quedando restringido su
uso a las operaciones frente a las que es necesario protegerse
(ejemplo no es aceptable tomar el teléfono o abrir puertas con
los guantes puestos). Además los guantes no deben usarse
22
por más de 20 min, ya que pierden su
capacidad protectiva, debiéndoselos re-
emplarzar luego de ese período.
-Protección ocular: la protección
ocular es obligatoria en muchos lugares
para proteger a los trabajadores contra
peligros tales como mecánicos (impac-
tos, polvo), químicos (salpicaduras de Figura 2. Gafas de
líquidos), radiaciones (infrarrojos, ul- protección
travioleta), térmicos (líquidos calientes,
llamas) y eléctricos (contacto directo). Se pueden reducir las
lesiones oculares mediante el uso del apropiado equipo para la
protección ocular, donde se deben combinar la comodidad, la
seguridad y la buena ventilación. La protección ocular puede
ser de caras paralelas, de formas cuadradas o rectangulares
y de cualquier dimensión, para las pantallas de protección.
Existen dos tipos de protección ocular: gafas de protección
(de montura universal o montura integral) y pantallas de
protección (pantalla facial, pantalla de mano, pantalla facial
integral y pantalla facial montada). La información acerca de
la obligatoriedad de usar protección ocular debe colocarse a la
vista de todos los trabajadores y visitantes. Algunos modelos
se pueden sobreponer a lentes correctoras personales. En el
laboratorio son de uso común las antiparras, lentes o gafas
de protección o seguridad con protección lateral para el pro-
cesamiento de muestras de riesgo, para operar ciertos equipos
así como para las etapas de lavado material reciclable.
-Protección respiratoria: los equipos de protección res-

piratoria protegen las vías respiratorias del trabajador contra
amenazas de origen externo, pueden tener distintas formas,
debiendo cubrir siempre boca y nariz, para proteger de posi-
bles agentes tóxicos. Antes de utilizar protección respiratoria,
se debe identificar los contaminantes presentes, entender el
efecto de los contaminantes y seleccionar el equipo adecuado
ya que debe estar siempre diseñado para el tipo de trabajo que
se realiza y para los materiales que se usan. Hay que evitar
siempre que el equipo reduzca la capacidad visual, provoque
irritaciones cutáneas y dificulte lo menos posible la respiración
del usuario. La protección respiratoria sólo se puede utilizar
por espacios de tiempo relativamente cortos, no es aconsejable
trabajar en el caso de las máscaras más de dos horas seguidas.
23
Existen mascarilla higiénicas descartables (barbijos), plegables
con filtro así como máscaras para polvo nocivo, sustancias de
mediana toxicidad, humo y polvo, vapores orgánicos y otras
con válvula para vapores ácidos. La protección respiratoria
más utilizada en los laboratorios biológicos básicos son las
mascarillas desechables (barbijos) que ayudan a proteger
contra los posibles contaminantes presentes en el área de
trabajo reduciendo su concentración a niveles por debajo de
los límites de exposición ocupacionales, deben utilizarse una
sola vez. El material de filtro en los barbijos más sencillos
puede ser tela o papel y material blando para el interior en
contacto a cara del usuario; su duración de dependerá del
nivel de contaminación, del ritmo de la respiración, del calor,
de la humedad y de los factores higiénicos. Estos factores va-
ría de un lugar de trabajo a otro, por lo tanto el criterio puede
variar también de un lugar a otro, desechándose por medidas
sanitarias en última instancia al terminar la jornada laboral.
Existen barbijos rígidos que brindan mayor protección como
los utilizados para procesamiento de muestras donde se sos-
pecha la presencia de Mycobacterias, y aunque solo por el nivel
de laboratorio se realice el examen microscópico directo (sin
cultivo) para lo que se utilizan barbijos tipo 3M 9970 o HEPA,
de 90% de efectividad para partículas de 3 micrones o menos,
recomendándose su uso aun bajo campana.
Aunque existen equipos que ofrecen un alto grado de
protección, nunca un EPI debe ser sustituto de una buena
práctica de trabajo. Por otra parte, la utilización de un equipo
equivocado puede crear un riesgo adicional al trabajador al
inspirar en éste un falso sentido de seguridad. Únicamente se
utilizarán aquellos equipos de protección individual que lleven
la marca de conformidad y vigencia.
Técnicas de laboratorio estándar

y normas de higiene
Las técnicas de laboratorio estándar refieren al se-
guimiento estricto de las buenas prácticas de laboratorio y
técnicas de laboratorio. Como parte de estas prácticas esta
el desarrollo en cada laboratorio de procedimientos escritos
de rutina, en el que se especifiquen los pasos para minimizar
riesgos biológicos, químicos y físicos.
24
A continuación se resume un conjunto de normas de
higiene personal:
- El lavado de manos debe realizarse al comenzar y
terminar la jornada y después de realizar cualquier técnica
que puede implicar el contacto con material infeccioso. Dicho
lavado se realiza con agua y jabón líquido, aunque situaciones
especiales demandan el empleo de sustancias antimicrobianas.
El secado de las manos debe efectuarse con toallas de papel
desechables o corriente de aire.
- No comer, beber, fumar, aplicarse cosméticos, ni guar-
dar o almacenar alimentos o bebidas en el área de trabajo del
laboratorio.
- No pipetear con la boca.
Como buenas prácticas de laboratorio pueden reco-

mendarse las siguientes:
- Evitar que en las manos haya cortes, abrasiones u
otras lesiones cutáneas que permitan una mejor penetración
de agentes biológicos. En este caso es obligatorio el uso de
guantes para todas las tareas.
- Utilizar una buena técnica y un buen material para
evitar la contaminación de las manos.
- Lavarse las manos con agua y jabón inmediatamente
después de cualquier accidente de contaminación con sangre y
una vez terminado el trabajo, incluso si se utilizan guantes.
- Utilizar la ropa adecuada. Una mancha de sangre re-
salta inmediatamente sobre una prenda blanca o verde.
- No reencapuchar las agujas ni desacoplarlas de la
jeringa. Colocar ambas en un recipiente de plástico rígido
imperforable.
- Sellar bien los recipiente de muestras. Si están man-
chados de sangre, limpiarlos con un desinfectante como, por
ejemplo, solución de hipoclorito con 0,1% de cloro libre (1 g/L,
1000 ppm), o productos detergentes.
- Si se produce un pinchazo o un corte, lavarse la herida
concienzudamente con agua y jabón, favoreciendo la hemo-
rragia.
- Toda contaminación de las manos u otra parte del
cuerpo con sangre y todo pinchazo o corte se comunicarán al
responsable de seguridad e higiene y al servicio médico.
- En trabajos de investigación en los que se emplee
material de vidrio es preferible utilizar jeringas con ajuste de
25
bayoneta para evitar que la aguja se separe de la jeringa o
utilizar una jeringa con aguja incorporada.
Otras técnicas correctas en el laboratorio son:

- Utilizar el mechero como barrera entre el operador y
la muestra.
- Introducir el ansa metálica cuando se encuentre car-
gada con material infeccioso en un frasco con arena y alcohol
70º antes de esterilizar en fuego directo. El alcohol en el frasco
deberá sobrepasar en 2 cm el nivel de la arena.
- Llenar cuidadosamente la jeringa para evitar la for-
mación de burbujas y espuma en el material que se va a
inyectar.
- Evitar, si es posible, el empleo de jeringas para mezclar
líquidos infecciosos.
- Si se extraen líquidos de viales a presión diferente de
la atmosférica, envolver la aguja y el tapón del recipiente con
un algodón empapado en un desinfectante apropiado antes de
retirar la aguja del tapón de caucho del frasco.
- Expulsar el exceso de líquido y las burbujas de la jerin-
ga, manteniéndola verticalmente en un algodón empapado en
un desinfectante apropiado o en un frasquito lleno de algodón
de rama estéril.
- Utilizar las centrifugas con precaución para evitar ro-
turas y aerosoles contaminantes.
- Utilizar, si la peligrosidad lo indica, la cabina de segu-
ridad biológica.
- Sujetar adecuadamente a los animales.
Resulta indispensable para las buenas prácticas de
laboratorio definir los conceptos de esterilización y desinfec-
ción. La esterilización implica la muerte o remoción de todos
los microorganismos vivos, para lo cual se utilizan recursos
físicos como el calor, filtración por membrana, y radiaciones.
La desinfección se refiere a la eliminación de la infectividad
potencial de un material determinado, que conlleva necesaria-
mente la eliminación de los microorganismos viables pudiendo
o no concluir en esterilidad para la cual se utilizan agentes
químicos. Estos agentes químicos, a su vez por su modo de
acción no específico, afectan tanto microorganismos como cé-
lulas de tejidos por lo que su concentración y sus componentes
limitan el uso sobre determinados sustratos. Se define como
antiséptico al agente químico bacteriostático o bactericida
26
que se aplica sobre tejidos vivos dado que en determinadas
concentraciones solo causan ligero daño tisular mientras que
reciben el nombre de desinfectantes los utilizados sobre ob-
jetos inanimados. Surge entonces que estos agentes químicos
pueden comportarse como antisépticos o desinfectantes según
su uso y composición química pudiendo resultar en algunos
casos muy corrosivos, irritantes o tóxicos por lo tanto no apli-
cables a la piel o los tejidos.
La eficacia de los desinfectantes está limitada por la
presencia de materia orgánica, por lo que los tiempos de apli-
cación de los mismos disminuirá cuando el instrumental que
se deba desinfectar esté limpio.
En función de los microorganismos manipulados, se re-
dactarán las instrucciones de desinfección en las que consten
los desinfectantes y las diluciones a las que se deban emplear.
Hay que tener en cuenta que las fórmulas de los productos
desinfectantes comerciales presentan grandes diferencias, por
lo que es esencial seguir las indicaciones del fabricante.
En la tabla 4 se presenta un listado de productos quími-
cos empleados habitualmente como desinfectantes:
Tabla 4. Listado de productos químicos desinfectantes.

T ipo Concetra Acción Mecanism o Ven tajas In convenientes Efecto
ción sobre el
utilizada hum ano
Al coholes 60- 90% bacteri cida - -no manchas -i nactivado por _
(etanol , fungi cida desna tu raliz -no irrita materia orgánica
isopropanol ) viricida a proteínas -i nflamable
Compuesto 0,4-1,6% bacteri cida - incremeta -económico - no bacterias irritante;
de amonio fungi cida permeabl ilid G ram (-) tóxico
cuaternario viricida a d celular - pude actuar
como fuente de
inactivación de
materia orgánica
Compuestos 0,4-0,5% bacteri cida desna tu raliz económico tóxico; corrosivo; irritante
fenólicos fungi cida a ción permiso residuos tóxico;
viricida proteinas corrosivo
(tubrculoci da)
Iodóforos 75 ppm bacteri cida i odación y estable; caro; inactivados irritante
fungi cida oxidación de acción por materia de piel y
viricida proteinas residual orgánica mucosas
tubrculocida
G lutaraldehi 2,0% bacteri cida entrecru zami no corrosivo; vapores tóxico;
do fungi cida ento de inafectado irritantes; tóxico irritante
viricida proteinas por otros
tubrculocida compuestos
esporicida
H ipoclorito 500 ppm bacteri cida i nactivación económico tóxico: corrosivo; tóxico;
( cloro fungi cida enzimáti ca inactivado por corrosivo
l ibre) viricida materia orgánica
tubrculocida
Peróxido de 3,0% bacteri cida radicales estable corrosivo; caro -
hidrógeno fungi cida l ibres
viricida
tubrculocida
esporicida
El empleo de productos químicos permite desinfectar a

temperatura ambiente los instrumentos y superficies que no
resisten el calor seco o la temperatura elevada
27
El producto desinfectante debe tener un amplio espectro
de actividad y una acción rápida e irreversible, presentando la
máxima estabilidad posible frente a ciertos agentes físicos, no
debe deteriorar los objetos que se han de desinfectar ni tener
un umbral olfativo alto ni especialmente molesto.
Todos los materiales reusables deberán descontaminarse
antes de su lavado y esterilización. Para la descontaminación
de instrumentales especiales, equipos de lentes, etc. se utilizará
glutaraldehido al 2% (30 minutos), por ser menos corrosivo.
La solución de glutaraldehido tiene una duración promedio de
aproximadamente 28 días, pero su actividad esta relacionada
con el uso y la carga microbiana de los elementos tratados,
por lo que se controlará diariamente su pH con los testigos
provistos, hasta establecer el promedio del servicio. Como
decontaminante de rutina se recomienda el uso de lavandina:
solución 1:10 de blanqueador doméstico recién preparada, que
tiene 1000 a 10.000 ppm de cloro disponible; también el empleo
de amoníaco. Los contenedores de vidrio se desinfectan con
ácido fénico al 5% durante 24 h, después debe desecharse el
contenido para lavar con detergente y agua el envase.
Debe tenerse en cuenta que por su propia función, des-
trucción de microorganismos, muchos desinfectantes tienen
características de toxicidad importantes para el hombre, por lo
que se deberán adoptar las medidas de protección y prevención
adecuadas y seguir siempre las instrucciones para su aplica-
ción, contenidas en la etiqueta y en las fichas de seguridad.
Los desinfectantes que se utilicen deben estar adecuadamente
etiquetados según la normativa correspondiente
La gestión de residuos debe ser considerada como una
parte importante de la seguridad en los laboratorios. Los dese-
chos que se generan pueden estar contaminados por microor-
ganismos o contener sustancias químicas tóxicas y peligrosas.
Además de la normativa general establecida, en función de la
legislación vigente, en materia de residuos biosanitarios, se
recomienda que en el mismo laboratorio o dentro de la instala-
ción, exista algún sistema para el tratamiento de los residuos
producidos (por ejemplo, esterilización por autoclave).
Los residuos biocontaminados y especiales se trans-
portan en los propios recipientes en los que se depositan por
empresas habilitadas para su tratamiento. Los recipientes,
impermeables, resistentes a ácidos, álcalis y de cierre hermé-
tico no deben superar de un volumen de 60 L para deshechos
28
sólidos y el tiempo de almacenamiento en el laboratorio (alma-
cenamiento intermedio) no debe superar las 24 h, el cual se
cuenta una vez que el recipiente fue llenado y cerrado.
Etiquetas y pictogramas de los

productos químicos
El etiquetado reglamentario de las sustancias y los pre-
parados peligrosos es un medio sencillo para informar y alertar
sobre los peligros relacionados con su utilización. Cuando los
productos son transvasados a otros envases, la etiqueta debe-
rá ser sistemáticamente reproducida. Las etiquetas informan
inmediatamente sobre el producto, evitando confusiones y
errores a la hora de utilizarlo. Pueden presentar símbolos de
peligro, así como un número restringido de indicaciones sobre
los riesgos y sobre las medidas de prevención a adoptar resul-
tando imprescindible en caso de accidente porque brinda las
indicaciones necesarias sobre el comportamiento a seguir en
caso de accidente como ilustra la siguiente figura 3.
Figura 3. Pictogramas de productos químicos.
1 Identificación del producto: nombre químico de la sustancia o nombre co-

mercial del preparado.
2 Composición: para los preparados relación de sustancias peligrosas pre-
sentes, según concentración y toxicidad.
3 Responsable de la comercialización: nombre, dirección y teléfono.
4 Identificación de peligros.
5 Descripción del riesgo.
6 Medidas preventivas.
29
Resulta importante almacenar los reactivos, separando
aquellos cuya evaporación o sublimación pueda resultar conta-
minante para otros, o que deterioren la etiqueta de los frascos
que los contiene. Se debe mantener un control estricto de la
existencia de los mismos. Se exige por la ISO/IEC 17025 y por
todas las guías de BPL, que cada solución reactiva preparada
en el laboratorio, incluyendo las de uso microbiológico y los
medios de cultivo, esté identificada con una etiqueta apropiada,
indicando como mínimo los siguientes datos:
-Nombre de la solución
-Identificación específica (lote de la solución)
-Tipo de solución (reactivo, valorada, buffer, indicador)
-Concentración de la solución (p/v, v/v, %, N o M)
-Factor de corrección de la concentración (para solucio-
nes valoradas)
-Condiciones de almacenamiento
-Fecha de preparación
-Fecha de vencimiento
-Nombre o iniciales de la persona que la preparó
Es recomendable que los últimos tres datos señalados

con letra roja se coloquen en una pequeña etiqueta separada,
de manera que el resto de la información se mantenga aparte
en una etiqueta mayor y definitiva, y así no tenga que ser cam-
biados ante cada nueva preparación. Es útil que la etiqueta
mayor permanente, se cubra con un material impermeable
al agua (como PVC autoadhesivo transparente) y se oriente a
todos los analistas que viertan la solución por el lado contrario
a la etiqueta.
Independientemente de la etiqueta, es necesario man-
tener un registro de la preparación de las soluciones, el cual
permite seguir la trazabilidad de la misma. Para ello, el regis-
tro debe reflejar la siguiente información: código del lote de
agua purificada utilizada en su preparación; cantidad total de
solución preparada; nombre, número de lote, procedencia y
cantidad de cada reactivo (o medio de cultivo) empleado en su
preparación; descripción simplificada de las operaciones ejecu-
tadas durante su preparación y cálculos realizados; referencia
bibliográfica; fecha de preparación y fecha de vencimiento;
nombre y firma del analista responsable de la preparación, y
nombre y firma de la persona que supervisa.
Los riesgos de la exposición crónica (a largo plazo), el
30
contacto y la reactividad en un laboratorio, son críticos para
el personal que manipula sustancias. Para el manejo seguro
de sustancias de laboratorio y su almacenamiento se utilizan
métodos codificados en colores permitiendo almacenar juntos
los productos que tiene igual color, siguiendo las recomenda-
ciones de seguridad para cada clase de sustancias y también
separando los productos con incompatibilidades específicas
dentro de cada color. Los colores, tipos de almacenamiento
y clases de sustancias pueden ser las que se observan en la
Tabla 5.
Tabla 5. Característica de las sustancia y tipo de almacenamiento.

Color Lugar de almacenamiento Característica
AZUL área segura tóxico.
ROJO área especial inflamable.
AMARILLO aislado y lejos de materiales combusti- reactivo.
bles o inflamables
VERDE área general para sustancia químicas riesgo moderado
BLANCO Área especial anticorrosivo corrosivo
Los pictogramas son una serie de signos tratados con una

síntesis formal de tal manera que transmiten el concepto de
forma rápida y tienen la particularidad de actuar en sistema.
En la Tabla 6 se observan los más frecuentes según el riesgo
que involucran en los productos químicos.
Tabla 6. Pictogramas más frecuentes en productos químicos.
31
32
Bioseguridad en el embalaje y
transporte de sustancias infecciosas
El sistema básico de triple embalaje consta de tres capas
como muestra la figura 4. El primer recipiente (a) es el que
contiene la muestra, debe ser etiquetado, puede ser de vidrio
o plástico, a prueba de filtraciones e impermeable. El cierre
debe ser hermético, preferiblemente a rosca y sujeto en forma
segura con alambre o cinta adhesiva. Este recipiente primario
se envuelve, en forma individual, con material absorbente (c) en
cantidad suficiente ante eventual derrame o choque (algodón
hidrófilo o toalla de papel absorbente). El recipiente secunda-
rio (b) contiene al (los) recipiente (s) primario (s) debiendo ser
resistente, tolerar un rango de temperatura de -40 a 55 ºC e
impermeable a filtraciones. Externamente se colocan las no-
tas, solicitudes, protocolos, etc. que quedan contenidas en la
envoltura exterior (e). Ante sustancias perecederas se incluye
el recipiente secundario en una caja térmica con hielo seco o
común, identificando, por ejemplo “Mantener congelación entre
- 2 a - 4 ºC” (siempre fuera del recipiente secundario).
El dióxido de carbono sólido (hielo seco) es una mercancía
peligrosa (explosivo) cuando se transporta por vía aérea o ma-
rítima, debiendo registrarse en las instrucciones de embalaje
el peso neto contenido dentro del bulto. Por otra parte, está
estrictamente prohibido que los pasajeros lleven sustancias
infecciosas con ellos o en su equipaje de mano cuando viajan en
compañías aéreas internacionales. Para transporte en avión de
pasajeros, debe tenerse en cuenta que se permite una cantidad
33
neta de sustancia de 50 g o 50 mL registrada en el embalaje,
no aplicable para sangre o productos de sangre. En avión de
carga u otro medio el límite por paquete es de 4 kg - 4 L de
sustancia infecciosa identificada.
El transporte de las sustancias infecciosas requiere sólo
la etiqueta de “sustancia infecciosa”. La etiqueta de sustancias
infecciosas tiene forma de diamante y un tamaño de 100 mm
x 100 mm. La parte inferior de la etiqueta debe llevar escrito
las palabras “SUSTANCIA INFECCIOSA” como se observa en
la figura 5.
Figura 4. Embalaje correcto.
b
c
a
e
Figura 5. Rótulo de sustancia infecciosa.
34
Las instalaciones y
condiciones ambientales
El diseño y construcción de un laboratorio, lo que en se-
guridad biológica se conoce como contención o barrera secun-
daria, contribuye a la protección del personal de laboratorio,
personas que se localizan fuera del laboratorio y protege a las
personas de la comunidad frente a posibles escapes acciden-
tales de agentes infecciosos.
Se recomienda una separación eficaz entre áreas vecinas
en las que se realicen actividades incompatibles y que se tomen
todas las medidas para prevenir la contaminación cruzada,
incluyendo el control al acceso y el diseño de las diferentes
dependencias. En general, el acceso debe ser restringido al
personal autorizado y formado para el manejo de agentes infec-
ciosos. No deben entrar en el mismo, familiares ni amigos.
Para un nivel 2 de contención es suficiente que la puerta del
laboratorio pueda cerrarse con llave, mientras que para el
nivel 3 la puerta debe ser doble, además de recomendarse un
cambio de ropa.
Una de las formas más efectivas de reducir al mínimo el
riesgo de contaminación cruzada es mediante la construcción
del laboratorio según un diseño “sin camino de regreso”, o sea
según un flujo recto de las operaciones. Cuando esto no sea
posible, deben tomarse medidas alternativas, como realizar
los procedimientos de manera secuencial, o la separación de
actividades en el tiempo o en el espacio.
En general, es conveniente que existan áreas separa-
das o claramente designadas para las siguientes actividades:
recepción y almacenamiento de muestras; preparación de las
muestras, áreas analíticas y áreas de apoyo (preparación de
medios de cultivo y reactivos, esterilización y descontamina-
ción, almacenamiento, lavado de material, etc.). El área de
lavado puede compartirse con otras partes del laboratorio,
siempre que se tomen las debidas precauciones para evitar
la transferencia de trazas de substancias que podrían afectar
negativamente al crecimiento microbiano. La conveniencia de
la separación física debe juzgarse considerando los parámetros
específicos del laboratorio, por ejemplo, número de ensayos
realizados, tipo de ensayos, etc.
Resulta importante también asegurar el orden y la
limpieza del laboratorio, y en el caso de los laboratorios de
microbiología es necesario preparar procedimientos para es-
35
tas operaciones. Con el objetivo de reducir el riesgo de conta-
minación y facilitar las labores de limpieza y desinfección, se
recomiendan una serie de medidas como las que se presentan
a continuación, sin que éstas sean exhaustivas:
- uniones cóncavas entre suelo, paredes y techos.
- iluminación empotrada en los techos.
- las áreas de trabajo deben estar debidamente ventila-
das, lo que puede conseguirse mediante ventilación natural o
forzada, o mediante el uso de unidades de aire acondicionado,
equipadas con filtros para el polvo en la entrada de aire.
- disponer de suficiente espacio para almacenamiento.
- las tuberías que transportan líquidos no deben pasar
por encima de las superficies de trabajo, a no ser que estén
provistas de un revestimiento herméticamente sellado.
- no se recomienda el empleo de cortinas y persianas
internas en las ventanas.
Si esto fuera inevitable, deben estar incluidas en el pro-
grama de limpieza regular del laboratorio.
- utilización de pantallas solares exteriores.
- las paredes, techos, suelos y superficies de trabajo
deben ser lisas, de material no absorbente y fácil de limpiar
y desinfectar.
- no se recomiendan los azulejos como material de recu-
brimiento de las superficies de trabajo, las mesadas y bancos de
trabajo deben ser resistentes al calor moderado, a disolventes
orgánicos, ácidos y álcalis.
- minimizar la apertura de puertas y ventanas durante
la realización de los ensayos.
- los armarios, estanterías, equipos y material de labo-
ratorio deben estar colocados de forma que se evite la acumu-
lación de polvo y se facilite su limpieza. Se recomienda el uso
de armarios hasta el techo.
- utilizar lavamanos, existentes dentro del mismo la-
boratorio, de accionamiento no manual recomendándose la
existencia de lavaojos para casos de emergencia.
Para mantener las condiciones ambientales que se

requiere para los ensayos microbiológicos, la limpieza y des-
infección son cruciales. Por ello se establecerá un programa
documentado de limpieza y desinfección que tenga en cuenta
los resultados de la vigilancia de las condiciones ambientales y
la posibilidad de contaminación cruzada. Cuando la situación
36
lo exija, la vigilancia tendrá en cuenta los niveles de biocon-
taminación tanto del aire como de las superficies de trabajo.
Se definirán los recuentos máximos de microorganismos que
se consideren aceptables y estarán dispuestas las medidas a
tomar para corregir las situaciones en que se sobrepasen estos
límites. Estas medidas incluyen, por ejemplo:
- limpieza y desinfección a fondo del laboratorio (inclu-
yendo superficies de trabajo y filtros del aire acondicionado).
- incremento de la frecuencia de las operaciones de lim-
pieza y desinfección.
- modificaciones en los procedimientos de limpieza y
desinfección.
- Cambio de desinfectantes.
Las instalaciones pueden contar con distintos equipos

ventilados con diversidad de uso por personal capacitado.
Las campanas de gases, también denominadas campanas
extractoras de gases, consisten en un recinto ventilado que
captura los humos y vapores procedentes de la manipulación
de los productos químicos en el laboratorio. Son útiles en la
contención del riesgo químico, pero no ofrece protección alguna
frente a riesgos biológicos. Las cabina de flujo laminar son
recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a
través de un filtro HEPA (acrónimo del término anglosajón High
Efficiency Particulate Air) es decir Purificador de Alta Eficiencia
de Partículas suspendidas en el Aire, barriendo la superficie
de trabajo. El flujo de aire puede ser vertical u horizontal. Es-
tas cabinas ofrecen protección únicamente al material que se
maneja en su interior, pero nunca al operador. Las cabinas
de seguridad biológica o gabinetes de seguridad (GS) son
equipos que proporcionan una barrera de contención para
trabajar de forma segura con agentes infecciosos. Permiten
proteger según su diseño y clasificación al trabajador, medio
ambiente y al producto. Son una combinación de elementos
electromecánicos/electrónicos y procesos físicos que impulsan
el aire a través de unos filtros especiales de gran superficie
estratégicamente situados, que tienen una eficiencia mínima
de retención de partículas del 99,99 %, cuando el tamaño de
las mismas es de 0,3 µm. Se las divide en tres clases como se
presenta en la Tabla 7.
37
Tabla 7. Clases de filtros.
Clase GS clase I GS clase II GS clase III
Características Con apertura frontal Con apertura frontal Á rea de trabajo

a través de la cual a través de la cual totalmente cerrada
se realizan las se realizan la s y se opera a través
operaciones en el operaciones en el de una barrera física
interior. Filtrado interior. Filtrado aire de (como guantes
aire de entrada entrada y de salida mecánicos unidos al
gabinete)
Filtrado aire de
entrada y aire de
salida tratado.
Protección Operador Operador O perador y
ambiente
Retención en la <10 UFC por ensayo <10 U FC por No aplicable
apertura en posición ensayo en posición
operador operador
Protección del No aplicable <5 UFC por ensayo No aplicable

Producto
Contaminación No aplicable <2 UFC por ensayo No aplicable
cruzada
Figura 6. CBS Clase III.
1.- Manómetro 2.- Ventilación 3.- Purificador de aire 4.- Luz fluorescente y ultravio-
leta
38
Señales de seguridad y salud
en el trabajo
La señalización en bioseguridad, referida a un objeto,
actividad o situación determinada, propone una indicación o
una obligación relativa a la seguridad o a la salud en el trabajo,
mediante una señal en forma de panel, un color, una señal
luminosa o acústica, una comunicación verbal o una señal
gestual según proceda.
Cabe destacar que las instalaciones cumplirán con los
requisitos de diseño según los niveles seguridad determinados
por los agentes microbianos y muestras con que se trabaje y
que condicionan su habilitación. Los laboratorios deben tener
en cada puerta la indicación del personal que tiene acceso,
además tener colocado el signo gráfico del tipo de riesgo que
se maneja en él. En la Tabla 8 se exponen algunos conceptos
de confección de cartelería aplicados universalmente.
Tabla 8. Señales de seguridad
Tipo de Color
señal F orma
de seguridad geom étrica
Pictograma Fondo Borde Ba nda
prohibición redonda Negro b lanco rojo rojo

luc ha con tra rectangular o Blanco rojo
incendio cuadrado
obligación redonda Blanco azul b lanco o azul
adv ertenica trian gular Negro amarillo negro
salvam ento rectangular o Blanco ve rde blanco o
o socorro cuadrada verde
La tabla 9 muestran las señales más frecuentes de

prohibición, material contra incendio, obligación, advertencia
y seguridad más utilizadas en el ámbito de laboratorio.
39
Tabla 9. Señales más frecuentes.
Prohibición: Forma redonda:

Consiste en un pictograma negro sobre fondo
blanco, bordes y banda (transversal descendente
de izquierda a derecha atravesando el pictogra-
ma a 45° respecto a la horizontal) rojos (el rojo
debe cubrir como mínimo el 35% de la superficie
de la señal).
Material contra incendio. Forma rectangu-

lar o cuadrada
Pictograma blanco sobre fondo rojo (el rojo
debe cubrir como mínimo el 50% de la su-
perficie de la señal).
40
Obligación: forma redonda.
Pictograma blanco sobre fondo azul (el azul
debe cubrir como mínimo
el 50% de la superficie de la señal).
Advertencia: forma triangular.

Pictograma negro sobre fondo amarillo o amarillo
anaranjado con bordes negros, el amarillo o amarillo
anaranjado debe cubrir como mínimo el 50% de la
superficie de la señal).
41
Seguridad: forma rectangular o cuadrada:
Pictograma blanco sobre fondo verde (el verde
debe cubrir como mínimo el 50% de la super-
ficie de la señal).
Una correcta señalización de las tuberías de la instala-

ciones permite identificar por el color el fluido transportado,
universalmente válidas son las siguientes señalizaciones:
Tabla 10. Señalización de tuberías.
Color de
Fluido transportado
identificación
Verde Agua (fría)
Anaranjado Vapor de agua
Azul Aire comprimido
Amarillo Combustible (líquido o gaseoso)
Gris Vacío
Negro Electricidad
Rojo Elemento de lucha contra el fuego
Notificación y registro de accidentes

Todos los laboratorios deben contar con procedimien-
tos dirigidos a actuar en casos de accidentes. Los riesgos del
operador en estas áreas se dividen en no biológicos, y riesgos
específicos o biológicos. Los riesgos no biológicos pueden ser
químicos, físicos, o eléctricos. Lo más importante ante un
42
accidente en el laboratorio es tenerlo previsto, simular su
ocurrencia como mínimo una vez al año, discutir las medidas
a adoptar, sacar las conclusiones pertinentes e implementar
las medidas correctivas pertinentes.
Algunos accidentes no biológicos pueden ser:

- heridas cortantes, punzantes y abrasivas, resbalones,
que se deben lavar con abundante agua y jabón, desinfectar
y consultar al médico responsable sobre el procedimiento a
seguir considerando el producto manipulado.
- inhalación e ingestión accidental, que demanda el
traslado del accidentado al servicio médico de emergencia y
la reseña de la sustancia ingerida.
Dentro de los riesgos biológicos pueden citarse:

- derrames en la recepción o procesamiento de las mues-
tras que demanda la utilización de guantes y desinfectante de
acuerdo a la normativa.
- ruptura en la centrífuga de material infeccioso, para lo
que el personal capacitado, utilizando ropa, guantes y antipa-
rras de seguridad cubrirá el material derramado con solución
desinfectante manteniendo cerrada la centrífuga durante 30
min para proceder a continuación descartando convenien-
temente el material roto, separándolo del recuperable, para
desinfectar con alcohol etílico 70º también la cuba.
- mordeduras, quedando bajo evaluación médica inme-
diata su tratamiento ya que en caso de arañas o serpientes
puede ser mortal. No colocar hielo sobre la herida porque
agrava los daños en caso de serpientes y arañas.
- ingesta o inhalación como errores básicos de pipeteo o
por comer o beber en el área de trabajo con material biológico,
las acciones se dirigen a aislar el microorganismo involucrado
para un tratamiento y atención médica inmediata.
- salpicadura de ojo, el personal debe entrenarse conti-
nuamente en llegar con los ojos cerrados al lavador de ojos,
abrir los ojos y permitir que el agua fluya por unos minutos
reportando luego el accidente al servicio médico.
- contaminación de la piel o mucosas, en el caso de la
piel intacta lavar profusamente con agua y jabón, en todos los
casos se participa al servicio médico.
Dentro de las medidas a adoptar en caso de accidentes
debe contar con un equipo médico para coordinar el posible
seguimiento y quimioprofilaxis o tratamiento específico.
43
El riesgo de incendio debe estar previsto en el plan de
emergencia, convenientemente diseñado por un profesional
capacitado en la higiene y seguridad en el trabajo. Si el riesgo
es alto y la ocupación del laboratorio elevada, el local debe
disponer de dos salidas con puertas que se abran hacia el ex-
terior para la evacuación ordenada e inmediata del personal.
Cuando concluya la evacuación del laboratorio, deben cerrarse
las puertas, a no ser que existan indicaciones en sentido con-
trario por parte de los equipos de intervención.
En áreas donde se trabajan con elevados voltajes, suele
ocurrir deficiente mantenimiento del cableado de los equipos,
de las instalaciones eléctricas y falta de disyuntores como ele-
mento de seguridad que incrementan el riesgo de incendio.
El laboratorio debe estar dotado de extintores portátiles
adecuados a los tipos de fuegos posibles, debiendo el personal
del laboratorio conocer su funcionamiento. Los extintores de-
ben estar colocados a una distancia de los puestos de trabajo
que los hagan rápidamente accesibles, no debiéndose colocar
objetos que puedan obstruir dicho acceso. En la Tabla 11 se
citan los tipos de extintores más utilizados y sus posibilidades
de uso.
Tabla 11. Tipos de extintores y usos.
Tipo Utilización No utilizar en
Agua Papel, madera, telas Incendios eléctricos,

líquidos inflamables,
Nieve carbónica Líquidos y gases inflamables, metales en combustión
metales alcalinos, incendios
eléctricos
Polvo de CO2 Líquidos y gases inflamables, Metales alcalinos, papel.

incendios eléctricos
Espuma Líquidos inflamables Incendios eléctricos
Bromoclordifluorometano Líquidos inflamables, incendios

(BCF) eléctricos
Existen códigos creados para la utilización específica de

los cuerpos de bomberos que establecen mediante etiquetas un
sistema de identificación de riesgos para que ante un eventual
incendio o emergencia, las personas afectadas puedan recono-
cer los peligros de los materiales respecto del fuego, aunque
estos no resulten evidentes.
44
La NFRA (Nacional FIRE Protection Association) de
EE.UU., desarrolló un sistema estandarizado indicador de
características de riesgo para la identificación de peligro.
Consiste en una etiqueta en forma de rombo en la que consta
el nombre del material y cuatro divisiones en su interior con
un color asignado en cada caso y una codificación numérica.
En cada una de las secciones se coloca en número el grado de
peligrosidad: 0, 1, 2, 3, 4; siendo en líneas generales el cero (0)
el menos peligroso, aumentando la peligrosidad hasta llegar a
cuatro (4), nivel mas alto. Los colores de cada sección indican
el tipo de riesgo: azul se reserva para el riesgo para la salud,
rojo para el riesgo de incendio, amarillo para la reactividad y
blanco se reserva para la información de riesgo especial como
indica la figura 7.
Figura 7 Rombo NFPA 704.

Bioseguridad en la certificación y
acreditación de los laboratorios
A principios de la década de los 60 del pasado Siglo, sur-
ge en la industria farmacéutica el concepto de buenas prácticas
de laboratorio (BPL), en principio dirigidas a los laboratorios
de control de medicamentos pero luego fueron expandidas a
otros campos como los laboratorios clínicos, de toxicología,
45
control de alimentos, diagnóstico veterinarios, entre otros. Se
sumó a esto, la necesidad de demostrar que los resultados de
los laboratorios eran confiables, la presión de un mundo que
exigía la seguridad en los productos que consume (algunos tan
delicados como los medicamentos y alimentos), el incremento
de la competencia comercial, la globalización del mercado, el
desarrollo tecnológico que conlleva industrias y laboratorios
potentes y automatizados, el aumento de la cultura de los
consumidores y la consolidación del papel de los Estados como
rectores de políticas y ejecutivos del control para velar por la
seguridad de su población.
Un laboratorio puede alcanzar buenos resultados en sus
ensayos con la aplicación de las BPL. Sin embargo, si tiene
clientes externos que le solicitan un trabajo con confianza de-
mostrada, debe acreditarse. La acreditación es un proceso que
conlleva no solo el cumplimiento de las BPL sino también de los
requisitos establecidos por normas. Es un proceso donde los
laboratorios deben contratar a una organización, independiente
y reconocida, para que los evalúe y avale la garantía de sus
resultados, brindando confianza a los clientes justificándose
su costo financiero cuando el ámbito de acción lo requiere.
Se debe conocer que la acreditación de los laboratorios no
es más que una actividad de las muchas que tiene la evaluación
de conformidad que se diseña para proveer demostración de
que los requerimientos especificados, relativos a los productos,
procesos, sistemas, personas y organización, se cumplimen-
tan. Por tanto, para realizar una evaluación de conformidad,
primeramente se debe contar con los requerimientos especifi-
cados que en la mayoría de los casos se encuentran en normas
reconocidas y aprobadas internacionalmente. Para una mejor
comprensión de lo expresado, las siguientes son definiciones
dadas por la ISO 17000. La certificación es el aval dado por
una tercera parte a los productos, procesos, sistemas y per-
sonas como demostración de que cumplen con sus especifi-
caciones. Mientras que la acreditación es el reconocimiento
otorgado, por una tercera parte, a organizaciones evaluadoras
de conformidad como aval de que cumplen con los requisitos
especificados y de que son competentes como evaluadores.
Como los laboratorios son precisamente organizaciones eva-
luadoras de conformidad deben ser acreditados.
La aplicación de las BPL y el cumplimiento de los re-
quisitos necesarios para la acreditación (norma ISO/IEC
46
17025:2005) ayudan a una correcta organización del trabajo
con un ahorro de tiempo y recursos materiales y humanos,
por lo que siempre resulta beneficioso.
Todos los laboratorios, independientemente de su ta-
maño y objeto de trabajo, deben cumplir con los requisitos
planteados por el Capítulo 4 de la norma ISO/IEC 17025 que
establece los requisitos para una gestión sólida por ejemplo. Sin
embargo, para cumplimentar los requisitos del Capítulo 5 que
define los requisitos para la competencia técnica en los tipos
de ensayos o de calibraciones que el laboratorio lleva a cabo,
se debe considerar el tipo de trabajo que realiza el laboratorio.
Por ejemplo, en los laboratorios de microbiología dentro de los
reactivos son muy importantes los medios de cultivo, lo cual
no se aplica a un laboratorio de ensayos químicos. Por esta
razón, la ISO/IEC 17025 plantea, en su Anexo B, que los re-
quisitos especificados están expresados en términos generales
y podría ser necesaria alguna aplicación: entendiéndose por
aplicaciones a una elaboración de los requisitos establecidos
en forma general en esta Norma Internacional, para campos
específicos de ensayo y de calibración, tecnologías de ensayo,
productos, materiales, o ensayos o calibraciones determina-
dos. Se reconoce que en determinados casos, las aplicaciones
pueden ser bastante amplias, como cuando se trata de campos
enteros de ensayo y para ello puede ser necesario preparar un
documento de aplicación por separado que complemente a
esta Norma Internacional. Amparados por este anexo, varias
organizaciones y bloques de países como los europeos, elabo-
raron guías específicas con aplicaciones para la acreditación
de laboratorios de microbiología.
En este capítulo se expusieron los aspectos más im-

portantes de la bioseguridad en el laboratorio. Es requisito
indispensable conocerlos antes de iniciar cualquier actividad
de laboratorio microbiológico. Los niveles requeridos de acuer-
do a la complejidad de los mismos deben ser minuciosamente
evaluados aún en caso de ser un laboratorio básico o que "se
inicia" para responder adecuadamente en caso de accidente.
47
MATERIAL DE
LABORATORIO BACTERIOLÓGICO
El material de uso corriente en el laboratorio, implica
un número muy grande de elementos, sin embargo bajo los
aspectos de este libro, que son netamente prácticos de la
bacteriología, se mencionarán aquellos que son utilizados con
mayor frecuencia. Los materiales resaltados en «negrita» son
indispensables en el laboratorio bacteriológico.
MATERIALES E INSTRUMENTOS
TUBO DE HEMÓLISIS: son cortos y finos, se utilizan

sobre todo en algunas pruebas serológicas y para realizar prue-
bas bioquímicas y fisiológicas para la tipificación bacteriana,
como por ejemplo triple azúcar hierro (TSI), rojo de metilo y
Voges Proskauer, entre las pruebas más utilizadas. Cantidad
mínima para un laboratorio que se inicia: 100 tubos.
TUBO DE ENSAYO: el más usado es de 16 cm x 18
mm de diámetro, aunque existen de varios tamaños y pueden
poseer reborde; deben ser de vidrio de buena calidad, neutro,
transparente e incoloro, que no se torne opaco con los conti-
nuos lavados. Se destinan a la contención de los distintos tipos
de medios de cultivo. Cantidad mínima para un laboratorio
que se inicia: 100 tubos.
TUBO DE CENTRÍFUGA: miden 10 cm x 10 mm, pue-
den tener fondo redondo o cónico y se emplean para decantar
suspensiones. Existen de vidrio o plástico. En el primer caso
deben responder a las mismas características de los tubos de
ensayo. Cantidad mínima para un laboratorio que se inicia:
20 tubos.
TAPONES PARA TUBOS DE HEMÓLISIS, DE ENSAYO
Y DE CENTRÍFUGA: son tapones de caucho, polipropileno, u
otro material. Deben ser autoclavables. Cantidad necesaria:
de acuerdo a la cantidad de tubos.
GRADILLAS: se utilizan para colocar los tubos de he-
mólisis, de ensayo y de centrífuga. Se comercializan de metal,
plástico o aluminio, de diferentes tamaños y capacidad. Can-
tidad necesaria para un laboratorio que se inicia: 2 gradillas
con capacidad de colocar 50 tubos de cada tipo. Total: 6
gradillas.
49
CRIOTUBOS: son tubos de plástico con tapa a rosca que

se utilizan principalmente para conservar aislamientos bacte-
rianos, por lo cual deben estar estériles. Los criotubos deben
ser autoclavables, y se comercializan no estériles (tapas a rosca
por un lado y tubos por otro) o estériles, aunque esta última
opción es más costosa. Cantidad mínima para un laboratorio
que se inicia: 50 criotubos.
GRADILLAS PARA CRIOTUBOS: se utilizan para colocar
criotubos, generalmente tienen una capacidad de 50 tubos.
Cantidad mínima para un laboratorio que se inicia: 1.
CAJA PARA CRIOTUBOS: se utilizan para conservar
criotubos. Se comercializan de cartón, de plástico (con tapa
y sin tapa). Las más recomendables son las cajas de plástico
con tapa para evitar que se pierdan los criotubos. Cantidad
mínima para un laboratorio que se inicia: 2.
PORTAOBJETOS: láminas de vidrio rectangular de
bordes biselados, de 76 x 25 x 1 mm; deben ser totalmente
transparentes y libres de rayas que al colocarles colorantes
induzcan a error. Cantidad mínima para un laboratorio que
se inicia: 4 cajas de 100 unidades.
CUBREOBJETOS: láminas delgadas de vidrio con medi-
das que oscilan entre 15 a 22 mm de lado y 0,17 a 0,20 mm de
espesor. Cantidad mínima para un laboratorio que se inicia:
4 cajas de 100 unidades.
PLACAS DE PETRI: recipientes de vidrio circulares
compuestos por dos tapas de diferente tamaño, con 6, 8 o 10
cm de diámetro y 15 o 20 mm de altura; se las emplea para
cultivos. Comercialmente se encuentran también placas de
polipropileno descartables. Cantidad mínima para un labo-
ratorio que se inicia: 60 de vidrio (8 a 10 cm de diámetro) y 1
caja de 300 unidades de placas descartables.
ERLENMEYER: recipiente de paredes finas, base plana,
cuerpo cónico y cuello cilíndrico corto; empleado para preparar
o contener medios de cultivo o líquidos en general. Cantidad
mínima para un laboratorio que se inicia: 1 erlenmeyer de 1
litro y 2 de 500 ml.
PIPETAS GRADUADAS: tienen una escala graduada nu-
merada indicador del volumen contenido; pueden ser de enrase
simple o doble. Para el laboratorio de bacteriología con enrase
simple son más prácticas. Si se desea medir con precisión, las
de doble enrase son más exactas. Actualmente se dispone en
el mercado de pipetas graduadas descartables y estériles, que
50
son más aconsejables, aunque su costo es mayor. Cantidad
mínima para un laboratorio que se inicia: 10 pipetas de 1 ml,
10 pipetas de 5 ml y 10 pipetas de 10 ml si son de vidrio, y 50
de cada una si son descartables.
PIPETAS PASTEUR: se forma por calentamiento y estira-
miento de un tubo de vidrio ablandado a la llama; tiene de 4
a 8 mm en su parte tubular, que al estirarse se torna capilar;
por no tener graduación se usan para siembras o medición de
pH. Cantidad mínima en un laboratorio: 20.
PIPETAS AUTOMÁTICAS: instrumento de precisión para
transferencia de líquidos en volúmenes que van desde 0,5 µl
a 1 ml; y con sistemas de desplazamiento de fluidos variable
(aire o con émbolo). El dispensador puede ser de canal único o
múltiple. En el extremo de estas pipetas se coloca una punta de
plástico (tip) de tamaño variable según el volumen a desplazar
y la capacidad de la pipeta. Son útiles para sembrar pequeños
volúmenes, especialmente para laboratorios que realizan sero-
logía. El principal inconveniente que presentan estas pipetas es
el costo. Cantidad mínima para un laboratorio que se inicia: no
son indispensables, pero de acuerdo al presupuesto son más
prácticas las de volumen variable que las fijas, aunque sean
más caras (y con el tiempo pierden precisión). Se recomienda
una pipeta automática de 100-1000 µl, una de 50-200 µl y
otra de 0,5-10 µl.
PUNTAS PARA PIPETAS AUTOMÁTICAS: son necesarias
para utilizar las pipetas automáticas. Son de plástico y se las
puede esterilizar para su reutilización mediante eterilización
húmeda en autoclave (aunque se recomienda su descarte).
Se comercializan de diferentes tamaños según la pipeta y el
volumen a transferir. Cantidad mínima para un laboratorio
que que se inicia: 1 bolsa de 1000 puntas de 1 ml y 1 bolsa
de 1000 puntas de 200 µl.
PROPIPETA: es una pera de goma que contiene válvu-
las que permiten el llenado y vaciado de pipetas de vidrio sin
necesidad de aspirar mediante la boca, indispensables para la
bioseguridad en el laboratorio. Cantidad mínima para un labo-
ratorio que se inicia: 2. No son muy caras y pueden ahorrarle
muchos contratiempos y dinero en infecciones adquiridas en
el laboratorio. Cantidad mínima en un laboratorio: 2.
VARILLA DE VIDRIO: son varillas macizas y se utilizan
para homogeneizar medios de cultivo, suspensiones, etc. Can-
tidad mínima en un laboratorio: 2.
51
ESPÁTULA DE DRIGALSKY: se la utiliza para siembra

en superficies extensas de medios de cultivo. Se las comer-
cializa descartables o de vidrio. Artesanalmente se las puede
obtener calentando el extremo de una varilla o pipeta Pasteur
y acodándola en forma triangular. Cantidad mínima en un
laboratorio: 4.
ESPÁTULA PARA PESAR MEDIOS Y REACTIVOS: poseen
un extremo en forma de cuchara y el otro en forma de espátula,
son metálicas y se comercializan de diferentes tamaños. Para
pesar medios de cultivo se recomiendan las de mayor tamaño.
DESCARTADOR PARA PIPETAS: son sumamente
necesarios en caso de utilizar pipetas de vidrio. Pueden ser
verticales u horizontales, deben tener capacidad suficiente
como para descartar 20 pipetas como mínimo y deben con-
tener hipoclorito de sodio al 10%. Cantidad mínima para un
laboratorio que se inicia: 1.
TACHOS DE RESIDUOS: en general se los utiliza de
plástico rígido, de 50 a 70 cm de alto por 40 cm de diámetro
en la boca. Para un laboratorio que se inicia se recomiendan
2 tachos de residuos, 1 para desechos biológicos (con bolsa
roja) y otro para desechos generales (con bolsa negra). Para
ello se recomienda tener una reserva de 100 bolsas de ambos
colores.
GUANTES DESCARTABLES: si bien muchos laboratoris-
tas no usan guantes en sus trabajos, las normas de biosegu-
ridad aconsejan el uso de guantes en todas las tareas en que
se manipulen muestras o material potencialmente infeccioso.
Cantidad mínima: 2 cajas de 100 guantes.
DESCARTADORES PARA PUNTAS DE PIPETAS AUTO-
MÁTICAS: son de plástico, se los puede fabricar con los envases
vacios de los medios de cultivo. Deben contener hipoclorito
de sodio al 10%. Cantidad mínima para un laboratorio que se
inicia: 1 para cada tipo de punta utilizada.
JERINGAS: se las utiliza para filtrar diferentes solu-
ciones que no pueden ser esterilizadas por autoclave, como
por ejemplo soluciones de carbohidratos. Se las comercializa
estériles y descartables, con diferentes capacidades: 1 ml,
5 ml, 10 ml, 25 ml o 50 ml. No es necesario adquirirlas con
aguja. Cantidad mínima para un laboratorio que se inicia: 10
jeringas de cada una.
FILTROS: se los utiliza para filtrar diferentes soluciones
52
que no pueden ser esterilizadas por autoclave, como por ejem-
plo soluciones de carbohidratos. Poseen 3 componentes, un
extremo adaptado al pico de la jeringa por el cual va a pasar el
líquido a filtrar (no estéril), el filtro propiamente dicho (cerrado
herméticamente) y un extremo por el cual va a salir el líquido
filtrado (estéril). Se los comercializa estériles y descartables.
Son costosos, pero facilitan muchísimo el proceso de filtración
positiva para pequeños volúmenes. Cantidad mínima para un
laboratorio que se inicia: 1 caja de 30 unidades.
CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN: son de suma utili-
dad para controlar el proceso de filtración por autoclave. Hay
distintos métodos para controlar la operación de esterilización
en autoclave, pero el método químico es el más utilizado en los
laboratorios de diagnóstico bacteriológico debido a que es sen-
cillo, rápido y económico. Este método consiste en introducir
papeles que contienen sustancias que a determinada tempera-
tura cambian de color (generalmente a 120 ºC). Estos papeles
se obtienen como cintas adhesivas o tajetas, las cuales indican
que se llegó a dicha temperatura pero no el tiempo durante
el cual se mantuvo. Cantidad mínima para un laboratorio que
se inicia: 1 caja de tarjetas o un rollo de cinta.
PISETAS: son recipientes de plástico, con tapa a rosca,
y un pico vertedor. Se las utiliza para contener alcohol 70º, y
decontaminar los instrumentos utilizados en bacteriología y
la mesada de trabajo. Cantidad mínima para un laboratorio
que se inicia: 2.
PAPEL METALIZADO: se utiliza para envolver o tapar el
material previo al proceso de esterilización. Cantidad mínima
para un laboratorio que se inicia: 1 rollo.
MANGO DE KOLLE: constituido por una varilla metálica
con un mango aislante de ebonita; en el extremo opuesto se
fija un alambre fino de platino o microm, de calentamiento
rápido a la llama y de acuerdo a su terminación se denomina:
ansa en anillo (extremo en anillo cerrado), ansa recta (extremo
aguzado) y espátula (extremo aplanado); este instrumento se
utiliza en siembras. Cantidad mínima para un laboratorio que
se inicia: 1 ansa en aguja y 1 ansa en anillo.
MECHERO DE BUNSEN: formados por una base y un
tubo metálico vertical; el gas penetra por un tubo lateral y pre-
senta un orificio que permite la entrada de aire. Para fabricar
pipetas Pasteur, en el pico se coloca un accesorio aplanado
(«mariposa») que aumenta la superficie de acción de la llama.
53

TRÍPODE: elemento metálico constituido por un aro
sostenido por tres pies; se emplea como apoyo para recipientes
que deben ser sometidos a la acción del calor. Conviene en-
cargarlos a un herrero. Cantidad mínima para un laboratorio
que se inicia: 1.
POLICUBETA: placa múltiple de 96 celdas con fondo
redondeado, cónico o plano, construidas en poliestireno y
esterilizables por radiación; poseen una gran claridad óptica
y medidas estándar que permiten su utilización en variados
equipos; se emplean en microanálisis por lo general de tipo
serológico (hemaglutinación, inhibición de la hemaglutinación,
fijación de complemento, etc.). Cantidad mínima en un labo-
ratorio que se inicia: 1 caja de 50 unidades.
APARATOS
MICROSCOPIO ÓPTICO: en los laboratorios bacterio-
lógicos se utilizan los microscopios compuestos, los cuales
presentan dos sistemas ópticos: un objetivo y un ocular. Ambas
lentes positivas se sitúan en los extremos de un tubo con un
eje óptico común. El objeto a estudiar se coloca delante del
objetivo, lente de gran potencia que forma una imagen real
pero invertida del objeto. El ocular actúa como una lupa y
forma una imagen real, aumentada de tamaño y no-invertida.
El microscopio óptico está integrado por el estativo y el siste-
ma óptico. El primero está formado por el tubo, la platina, la
columna y el pie. El tubo es el encargado de sostener el ocular
en la parte superior. En la parte inferior del tubo se encuentran
los objetivos. La platina es una plataforma rígida ubicada en
forma perpendicular al eje óptico. La platina se aleja o acerca
al objeto mediante dos tornillos, uno macrométrico y el otro
micrométrico. La columna sostiene el tubo con su sistema
óptico, la platina, el condensador, el diafragma y el sistema
de iluminación. La parte óptica está formada por los objetivos
y los oculares situados por encima de la platina y por el con-
densador, el diafragma, el espejo y la fuente de iluminación por
debajo de ella. En la mayoría de los microscopios modernos, el
espejo fue eliminado porque la luz incide directamente sobre
el condensador. Cantidad mínima para un laboratorio que se
inicia: 1 de buena calidad.
AUTOCLAVE DE CHAMBERLAND: está formado por
una caldera cilíndrica de doble pared, una fuente calórica
54
(eléctrica o gas) y en la parte superior una corona de bulones
con los que se cierra; en la tapa se encuentran un manómetro,
una válvula de seguridad, una espita y un aro de caucho que
produce un cierre hermético; en el interior (a cierta altura del
fondo) hay una placa cribada o rejilla en donde se deposita el
material a esterilizar para que no contacte con el agua colo-
cada por debajo.
En la actualidad existen autoclaves automáticos que
no varían en su fundamento pero sí difieren en su estructura
y manejo. En este caso, la autoclave presenta una marmita,
espita, manómetro y tapa de cierre hermético (que se ajusta
con una llave central), pero además tiene ficha de encendido
eléctrico, temporizador, regulador automático de la tempera-
tura y espita de salida inferior; también tiene una alarma o
timbre para anunciar la finalización del proceso de autocla-
vado. Cantidad mínima para un laboratorio que se inicia: 1.
Si el trabajo es poco, puede iniciarse con una olla a presión
grande (ver esterilización para mayores detalles).
ESTUFA DE CULTIVO: caja rectangular de triple pared
con dos puertas frontales (la interna es de vidrio), estantes
interiores, fuente calórica (resistencia eléctrica). Por mantener
una temperatura óptima de 35 a 37 ºC, es el equipo indicado
para incubar microorganismos en el laboratorio. Cantidad mí-
nima para un laboratorio que se inicia: 1. Si en el laboratorio
se cultivarán hongos es necesario otra estufa para cultivarlos
a 28 ºC y para que no se contaminen las placas sembradas
con bacterias.
HORNO O ESTUFA DE ESTERILIZACIÓN: gabinete
metálico aislado con fibra de vidrio u otro material. Eléctrico,
con temperaturas de hasta 300 ºC; que esteriliza por calor seco,
puede adaptarse un horno de cocina que funcione bien (sin
pérdidas de calor) en este caso destinarlo sólo a esterilización.
ESTUFA DE SECADO: similar a la estufa de esterili-
zación pero se la utiliza para secar el material en un rango
de 60 a 100 ºC. Cantidad mínima para un laboratorio que se
inicia: 1. Se puede utilizar la estufa de esterilización con una
temperatura menor.
HORNO MICROONDAS: son los mismos hornos micro-
ondas de uso doméstico. Se los utiliza para fundir los medios
de cultivo antes de su fraccionamiento en placas o tubos, para
favorecer la disolución de determinados reactivos o medios
55
de cultivo previamente a la esterilización. Precaución: antes

de la compra verificar la altura interior ya que los erlenmeyer
de 500 ml usualmente no entran. Cantidad mínima para un
HELADERA: empleada para conservar muestras, reac-
tivos, antibióticos, etc. Si bien existen heladeras destinadas
especialmente para laboratorios, se pueden utilizar heladeras
domésticas. Precaución: si se van a almacenar drogas volátiles
o explosivas, éstas sólo pueden colocarse en refrigeradores
especiales. Si es posible se recomienda utilizar una helade-
ra con freezer. Cantidad mínima para un laboratorio que se
inicia: 1.
CONGELADORAS: empleadas para conservar micro-
organismos o sueros por largo tiempo, su temperatura es de
-10° a -80°C; se puede utilizar una heladera con freezer de -20
ºC. Si se desea conservar sustancias por debajo de ese límite,
deben emplearse termos especiales con nitrógeno líquido de
-196ºC. Cantidad mínima de congeladoras para un laboratorio
que se inicia: 1.
CENTRÍFUGA: equipo empleado para separar líquido de
partículas en suspensión aplicando la fuerza centrífuga y apro-
vechando las diferentes densidades de los elementos; los tubos
deben equilibrarse antes de la centrifugación; existen diversos
modelos con variaciones en capacidad, velocidad de centrifu-
gado, etc. Es importante para analizar ciertos elementos como
por ejemplo orina en donde el sedimento es de fundamental
importancia para correlacionar los hallazgos bacteriológicos.
Cantidad mínima en un laboratorio que se inicia: 1.
BALANZA: aparato de precisión empleado para pesar
diversos elementos; existen distintos tipos:
BALANZA GRANATARIA: antiguamente, las balanzas
granatarias constaban de dos platillos y se empleaban pesas
de 1 a 1000 g. Actualmente, son digitales y constan de un solo
platillo. No sirven para pesar con precisión pero en bacteriología
se las utiliza para pesar los medios de cultivo en donde puede
tolerarse pequeñas desviaciones. Cantidad mínima para un
BALANZA ANALÍTICA: de gran precisión, consta de dos
platillos, tienen una capacidad máxima de 200 g y una preci-
sión de 0,1 a 0,2 mg.
BALANZA ANALÍTICA ELECTRÓNICA: tienen las mismas
ventajas que la anterior pero poseen un sólo platillo; la lectura
56
se realiza en una escala óptica digital.
PHMETRO: instrumento destinado a medir el pH de
distintos medios entre ellos los de cultivo. Su manejo no es
complejo pero requiere cuidado para no romper el electrodo y
mantenerlo en condiciones óptimas en el tiempo. Actualmente,
se comercializan equipos económicos y accesibles. También es
muy práctico utilizar tiras de pH. Se las comercializa en dife-
rentes rangos, por lo que una tira que abarque de 5 a 9 cubrirá
la mayoría de las reacciones del laboratorio. Sin embargo, las
tiras tienen un rango de error mayor y su lectura es más sub-
jetiva. Cantidad conveniente para un laboratorio que se inicia:
1 pHmetro o 1 tira de pH (o caja de tiras individuales).
BAÑO TÉRMICO (BAÑO DE MARÍA): consta de un re-
cipiente con agua en el que se colocan gradillas metálicas con
el material a calentar; el calor se obtiene por medio de una
resistencia eléctrica y se controla por medio de un termostato,
la temperatura se verifica mediante un termómetro. No es un
elemento indispensable en bacteriología, pero sí, si se realizan
pruebas serológicas y bioquímica sanguínea. Cantidad mínima
en un laboratorio que se inicia: 1.
VORTEX: es un agitador eléctrico con una superficie de
goma para colocar tubos de ensayo, de hemólisis o de cen-
trífuga (o microcentrífuga). Se lo utiliza para homogeneizar
suspensiones bacterianas, particularmente antes de conservar
un cultivo o bien para el conteo viable. También se lo utiliza
para facilitar la disolución de solutos en solventes, como por
ejemplo carbohidratos y agua destilada, o antibióticos y so-
lución fisiológica. Cantidad mínima en un laboratorio que se
inicia: 1.
CABINA DE SEGURIDAD BIOLÓGICA: son equipos «ba-
rridos» por aire estéril, el aparato aspira aire ambiental conta-
minado, lo filtra y lo expulsa en el área de trabajo a través de
la campana impidiendo la introducción de microorganismos
en el medio ambiente. Existen diferentes tipos de cabinas de
bioseguridad. Las cabinas de tipo I expulsan el aire estéril ho-
rizontalmente, por lo cual no se pueden utilizar para trabajar
con microorganismos patógenos debido al riesgo de infección
del operario. Las cabinas de tipo II expulsan el aire vertical-
mente y son las adecuadas para el trabajo bacteriológico. En
estos equipos no es necesario utilizar un mechero y los traba-
jos bacteriológicos no son afectados por la corriente de aire.
Cantidad mínima en un laboratorio que se inicia: 1.
57
58
ESTERILIZACIÓN
En la práctica de laboratorio es necesario conocer la
metodología mediante la cual se puedan eliminar o al menos
controlar o disminuir la carga bacteriana en determinado
ambiente. Para poder trabajar con microorganismos puros es
necesario que los mismos sean cultivados en medios estériles;
la toma de muestra debe realizarse también con elementos
estériles, de tal forma que otros microorganismos contami-
nantes no puedan hacer variar o enmascarar los resultados
del estudio bacteriológico.
Existen bacterias en los instrumentos de laboratorio, en
el polvo y en las manos. Los microorganismos son ubicuos, lo
que justifica la necesidad de la esterilización. El uso de instru-
mentos y vestimenta estériles en las operaciones quirúrgicas
demuestra la necesidad de variados métodos para eliminar
las bacterias.
De la misma manera, todo medicamento inyectable no
debe contener microorganismo alguno, las vacunas, los ele-
mentos de cirugía, etc. deben cumplir con el mismo requisito:
esterilidad.
La esterilidad indica la ausencia total de formas viables
de microorganismos. No existen grados de esterilidad, es por
lo tanto un término absoluto. Un objeto nunca puede estar
«parcialmente» estéril. El término esterilización se refiere a los
procedimientos que conducen a la destrucción, o separación
de toda forma de vida, macro, micro o sub-microscópica. Los
procedimientos para lograr la esterilización son variados, pero
todos apuntan a eliminar totalmente a los microorganismos.
Otros términos utilizados son asepsia (sin sepsis), que consiste
en evitar la sepsis mediante procedimientos que intentan impe-
dir la introducción de microorganismos y reducir el número de
los que están presentes; o antisepsia (contra la sepsis), que es
el proceso que se aplica al tejido vivo con el objeto de prevenir
la multiplicación de las formas vegetativas de las bacterias y
provocar la sepsis. La desinfección consiste en la destrucción
de los microorganismos patógenos en estado vegetativo que
se encuentran sobre elementos inertes.
ESTERILIZACIÓN POR MÉTODOS FÍSICOS

En este capítulo se tratará detalladamente a los agentes
físicos como método de esterilización, ya que son los métodos
59
más comunes en el laboratorio de bacteriología.
ESTERILIZACIÓN POR CALOR

El calor es el método más confiable para la esteriliza-
ción. La destrucción de una población bacteriana por medio
del calor es un proceso gradual y la cinética de destrucción
es exponencial. Existen dos formas de empleo del calor en el
laboratorio: calor seco que corresponde al fuego directo y al
aire caliente, y el calor húmedo, producido por la ebullición,
el vapor de agua a presión (autoclave), la tindalización y la
pasteurización.
El efecto del calor seco se debe a la desnaturalización
proteica, lesiones de oxidación y efectos tóxicos por niveles
elevados de electrólitos. Al carecer de agua, el número de gru-
pos polares de una cadena peptídica es menor y requiere más
energía para abrir las moléculas, por lo cual resulta menos
eficiente que el calor húmedo. El efecto letal del calor húmedo
por encima de determinada temperatura se atribuye a la desna-
turalización y coagulación de las proteínas, pero lo que sucede
en realidad es un proceso más complejo y es la coagulación
quien enmascara otros fenómenos que ocurren en la célula. La
producción de interrupciones en las cadenas únicas de ADN
puede considerarse el primer fenómeno de efecto letal. Por
otro lado el calor actúa alterando la integridad funcional de la
membrana celular, permitiendo la salida de sustancias.
ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

Puede ser clasificado en calor directo, como la llama del
mechero de Bunsen. Pasando los objetos por la llama es útil
para esterilizar tijeras y pinzas que se sumergen previamente
en alcohol y se dejan flamear fuera de la llama del mechero
para evitar que se destemplen, pero aún así, no es el método
de elección para esterilizar el material de cirugía. También se
emplea en forma rutinaria para esterilizar el
asa del mango de Kolle, antes y después de
efectuar una siembra.
Este mismo método se emplea para
destruir animales de laboratorio infectados
y otros materiales de desecho infectados en
hornos crematorios.
El calor seco puede aplicarse en forma
indirecta mediante el uso de hornos de este-
60
rilización por aire caliente. En éstos se requiere de 160-170ºC
durante una a dos horas. Se recomienda para elementos de
vidrio (placas de Petri, pipetas, erlenmeyer) o de metal. No
se emplean para material de caucho, papel o telas porque se
queman, ni tampoco para medios de cultivo. Hay que tener
en cuenta que el vidrio en el proceso
térmico puede variar su tamaño has-
ta en un 5% (y no vuelve a su estado
previo al enfriarse) por lo que no es
recomendable este proceso cuando
es necesario utilizar el material para
mediciones volumétricas exactas.
Dentro de un horno no venti-
lado se produce una estratificación
del calor. La temperatura más alta
se encuentra en la bandeja inferior vacía y la más baja en
la bandeja superior llena. Esta estratificación es de tener en
cuenta cuando se acopian grandes cantidades de materiales
por las distintas temperaturas que existen en diferentes pun-
tos del horno. Con un sistema de ventilación forzada se logra
uniformar las temperaturas dentro del horno, solucionando
así este problema.
ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO

a) Esterilización por calor húmedo con presión.
EL AUTOCLAVE.
Para obtener una perfecta operación de esterilización se
debe conocer el funcionamiento del autoclave y el significado
de los términos en uso. Cuando a un líquido cualquiera, se le
aplica calor, se calienta hasta cambiar de estado y pasar a su
forma gaseosa. La temperatura que alcanza un líquido para pa-
sar al estado gaseoso se llama punto de ebullición. Este punto
no se altera aunque se aplique más calor al sistema. Mientras
el líquido está recibiendo calor, aumenta su temperatura, hasta
llegar al punto de ebullición, momento en el cual se necesita
calor extra, para vencer la presión que ejerce la atmósfera sobre
la superficie del líquido y convertirse en vapor; esta cantidad
extra de calor se llama calor de vaporización.
El fenómeno descrito en los párrafos anteriores se
produce exactamente en direcciones opuestas; si el vapor
es enfriado llega a convertirse en líquido y en ese cambio de
estado emite exactamente el mismo calor extra que recibió
61
para convertirse en vapor. Este fenómeno se

denomina condensación.
El vapor dentro del autoclave choca con
elementos fríos (el material a esterilizar), de
esta forma el vapor se enfría y se condensa,
entregando en este caso 539 calorías/gramo; al
condensarse se contrae y se retrae el volumen.
El agua de condensación vuelve al sistema para
ser nuevamente calentada y retornar al ciclo.
EL autoclave utilizada con mayor fre-
cuencia en los laboratorios bacteriológicos es el
de tipo Chamberland. Este es uno de los más sencillos, existen
modelos verticales, horizontales y de diferentes tamaños, pero
todos con en el mismo principio. Están constituidos por una
caldera de cobre batido y estañado interiormente, sostenido
por una cámara metálica. En su parte inferior lleva una fuente
calórica, gas o electricidad. En la parte superior lleva una tapa
que debe poseer los siguientes elementos: a) un termómetro
indicador de temperatura que generalmente se extiende en el
rango de 100 a 200 ºC, b) un manómetro (indicador de pre-
sión) expresada en libras/pulgada cuadrada, en Kg/cm2, o en
atmósferas. A veces el termómetro y manómetro se encuentran
en un solo indicador, teniendo en cuenta la relación entre
ambas. Normalmente en el laboratorio se emplea 1 atmósfera
de presión (sobre la presión atmosférica) que corresponde a
121 ºC. Podría utilizarse mayor presión y por lo tanto mayor
temperatura pero no es habitual en el laboratorio de diag-
nóstico bacteriológico, c) una espita que sirve para eliminar
el aire durante el calentamiento, proceso denominado purga,
d) una válvula de seguridad que permite el escape del vapor
a presión que hay en el interior, cuando excede la adecuada.
En el interior del autoclave se encuentra un enrejado y lámina
cribada, sobre la cual se apoya el material a esterilizar.
En los autoclaves modernos, se van re-
emplazando estos elementos por sistemas au-
tomáticos que facilitan su manejo y garantizan
la mayor eficacia de la esterilización (regulador
automático de temperatura, presión, purgado y
tiempo, etc.).
62
Relación entre presión y temperatura
Presión en atmósferas Presión en libras Temperatura en ºC
0 0 100
1 15 121
El purgado del autoclave es uno de los procesos más

importantes a tener en cuenta para su manejo. Este consiste
en abrir la espita cuando comienza el ciclo de calentamiento,
al principio saldrá por la espita solamente aire, luego aire mez-
clado con vapor y posteriormente solo vapor. En este momento
se desplazó todo el aire del interior del autoclave y se tiene
que cerrar la espita. Es necesario tener en cuenta además el
volumen del elemento a esterilizar. De esto se desprende que
en todo ciclo de esterilización por autoclave es necesario final-
mente tener en cuenta que existe un tiempo de calentamiento
(aproximadamente 20 min), un tiempo de penetración (que de-
penderá del volumen que deberá penetrar el calor hasta llegar
al centro del mismo), un tiempo de muerte más un tiempo de
seguridad (15 min), y un tiempo de enfriamiento.
Práctica de manejo del autoclave

El manejo del autoclave es relativamente sencillo. El mé-
todo que seguidamente se detalla debe extrapolarse y adaptarse
a una olla a presión si fuera necesario.
1. Controle que el autoclave posea suficiente cantidad de
agua (agua corriente aunque se prefiere agua destilada) para
todo el proceso. Si funciona sin agua, se quemarán las juntas,
se podrán disolver ciertos sellados y la tornarán riesgosa para
usos posteriores, un autoclave es en definitiva una caldera que
podría explotar. Recomendación: en caso de haber funcionado
sin agua, recomendamos hacerla revisar y que se le practique
una prueba de presión.
2. Coloque los elementos a esterilizar dentro del autoclave
SEPARADOS entre sí. Para que el calor se distribuya homogé-
neamente entre los elementos a autoclavar.
3. Cierre el autoclave y ajuste las mariposas en forma
enfrentada.
4. Verifique que la espita esté abierta.
5. Encienda la fuente calórica.
6. Una vez que comience a salir vapor de agua por la espi-
ta, controle que ésta salga en forma contínua durante 5 min.
63
7. Cierre la espita. Comenzará a aumentar la presión

interna. CONTROLE PERMANENTEMENTE. Cuando llegue a
una atmósfera de presión (sobrepresión con respecto a la at-
mosférica), disminuya la fuerza de la fuente calórica y controle
para que se mantenga en 1 atmósfera.
8. Controle el tiempo en 15-20 minutos.
9. Apague la fuente calórica y deje que baje sola la presión
y temperatura. NO “AYUDE” a bajar la temperatura con trapos
fríos ni con ninguna otra forma “original” de bajar la tempe-
ratura ya que alteraría los elementos que esteriliza. Cuando
ésta llegue a cero, abra el autoclave y retire los elementos es-
terilizados llevándolos a una estufa de secado. Hay autoclaves
que realizan el proceso de secado en forma automática pero
son más difíciles de operar y mucho más caras (autoclaves
Schaerer). Otros autoclaves modernos, generalmente eléctricas,
realizan el proceso en forma totalmente automática, sólo hay
que encenderlas y al terminar el proceso sonará una alarma
que indicará el fin de la esterilización.
Controles de esterilización para el autoclave

Hay distintos métodos para controlar la operación de
esterilización en autoclave. Uno de ellos, el método químico,
consiste en introducir papeles que contienen sustancias que
a determinada temperatura cambian de color, generalmente
a 120 ºC. Estos papeles se obtienen como cintas adhesivas o
tarjetas, las cuales indican que se llegó a dicha temperatu-
ra pero no el tiempo durante el cual se mantuvo. El método
químico es el más utilizado en los laboratorios de diagnóstico
bacteriológico debido a que es sencillo, rápido y económico.
El método biológico es el más seguro, consiste en introducir
entre los elementos a esterilizar un tubo con un trozo de
papel de filtro embebido en un cultivo de un microorganis-
mo esporulado, resistente a altas temperaturas (Geobacillus
stearothermophilus) además es apatógeno y fácil de cultivar).
Luego de realizar la esterilización se lleva el papel a un medio
de cultivo y se incuba 24 h a 37 ºC. La falta de desarrollo
indicará que la esterilización fue correcta (se eliminaron las
esporas bacterianas). Este método presenta el inconveniente
de tener que esperar 24 h antes de poder usar los materiales
procesados. El método físico de termocuplas, consiste en un
electrodo ubicado en el interior del autoclave que va conectado
por fuera a una aguja inscriptora que registra en un gráfico la
64
temperatura en función del tiempo de esterilización. Cualquier
variación de temperatura por debajo de la necesaria se debe
agregar como tiempo extra de esterilización.
Método alternativo para la esterilización por calor húmedo

bajo presión
En los puntos anteriores se explicaron los conceptos
teóricos referente a la esterilización utilizando el autoclave.
Si bien puede seguirse estrictamente lo arriba mencionado,
también es posible su implementación mediante alternativas,
a veces mucho más económicas y accesibles.
La respuesta práctica al reemplazo del autoclave es la
olla a presión. Existen distintas marcas pero conviene con-
seguir una buena y grande ya que se le dará un uso mayor
que en la cocina hogareña. No poseen manómetro, aunque
puede colocarse, por lo tanto no es posible conocer la presión
interna, pero sí traen una válvula de seguridad, que debe ser
controlada. Conviene realizar en alguna herrería una rejilla
inferior (aluminio cribado). Por otro lado el control de esteri-
lidad no es fácil de realizar, por este motivo conviene realizar
algunas pruebas para regular el tiempo de permanencia en
la olla a presión. Como se mencionó anteriormente el tiempo
de permanencia en el autoclave es de 15 min como mínimo.
Para el control y puesta a punto de la olla podría esterilizarse
una placa de Petri con medio de cultivo y algún microorga-
nismo termo resistente sembrado en su interior (Geobacillus
stearothermophilus), en distintos tiempos (ejemplo: 15, 20 y
30 min) dejarlas incubando en estufa y verificando si hay o
no desarrollo bacteriano.
El uso de la olla a presión NO es una recomendación,
sino más bien una alternativa para el laboratorio que se ini-
cia, en corto tiempo será necesario que el laboratorio posea
un autoclave.
b) Esterilización por calor

húmedo sin presión.
Ebullición. El agua en ebu-
llición alcanza una temperatura de
100 ºC, la cual destruye en unos
10 min, las formas vegetativas de la
mayoría de las bacterias y algunos
virus. Las esporas y ciertos virus,
65
como el de la hepatitis humana o encefalomielitis equina no son

inactivados. Es un método útil para higienizar o disminuir la
carga bacteriana en forma rápida y con equipo sencillo ciertos
elementos como jeringas y utensilios varios.
Pasteurización. Es un método de higienización mediante
el cual se reduce la carga bacteriana en ciertos productos. No
es una técnica de esterilización, ya que se eliminan solamente
las formas vegetativas de los microorganismos. Se aplica a
sustancias que no toleran la temperatura de esterilización sin
perder sus caracteres organolépticos. Louis Pasteur la empleó
por primera vez en la conservación de vinos y actualmente
se utiliza sobre todo en la industria de la alimentación (leche
y derivados, vino, cerveza). El fundamento del método es un
shock de calor (diferencia abrupta de temperatura). Para esta-
blecer la temperatura y tiempo adecuados, se tiene en cuenta
la resistencia de los patógenos que con mayor frecuencia se
encuentran en el producto (leche: Mycobacterium tuberculosis
y Coxiella burnetti). Hay varios tipos de pasteurización: 1) baja
que se realiza a 62 ºC durante 30 min, 2) alta que se realiza a
72 ºC 15 seg, y 3) ultra alta temperatura (UHT) que se realiza a
100 ºC durante 2 seg. Como se mencionó, estas temperaturas
solamente reducen la carga de microorganismos por lo que no
se deben descuidar las medidas de higiene que buscan evitar
la contaminación previa o posterior al proceso.
Sustancias que no resisten el autoclavado

Algunos reactivos, como por ejemplo los carbohidratos,
sangre, suero y vitaminas entre otros, no pueden ser sometidos
al autoclave, ya que en el proceso perderían su estructura fun-
cional. En estos casos el método de elección es la filtración.
ESTERILIZACION POR FILTRACIÓN

Se entiende por filtración al pasaje de un líquido a tra-
vés de una sustancia porosa que retiene los microorganismos
contenidos en él.
Actualmente, se utilizan membranas filtrantes, que son
fundamentalmente de tres tipos: 1) las membranas de acetato
o nitrato de celulosa, 2) las membranas de filamentos orgáni-
cos, y 3) las membranas nucleares de policarbonatos. Si bien
existen distintas formas tales como «cartuchos filtrantes» útiles
para filtrar grandes volúmenes de líquidos u otros fluidos como
el aire, se describen los discos filtrantes, de uso habitual en
66
bacteriología, ya que el fundamento del mecanismo de filtra-
ción es el mismo.
Los filtros en forma de discos de membrana son los más
usados. Están compuestos por ésteres de celulosa (acetato
o nitrato de celulosa) y contienen millones de poros micros-
cópicos de tamaño uniforme. La porosidad puede variar de
0,01 a 10 µm. El diámetro mínimo de los poros da la medida
del filtro.
Sistemas de filtración
Filtración con presión positiva. La filtración con pre-
sión positiva se utiliza para esterilizar diferentes soluciones y
suspensiones en la industria de vacunas y farmacéutica, entre
otras, para lo cual se emplean mecanismos a gran escala. En
este apartado nos referiremos al sistema de filtración que se
utiliza habitualmente en un laboratorio de diagnóstico bacterio-
lógico. La filtración positiva se realiza en los siguientes pasos:
1) introducir el líquido a filtrar en una jeringa, se recomienda
dejar una pequeña cámara de aire para que todo el líquido
pase por el filtro, 2) abrir el envase en el que se encuentra el
filtro y en el extremo contrario al émbolo de la jeringa colocar
el filtro estéril, 3) colocar el extremo del filtro por el cual a salir
el líquido filtrado en un tubo estéril y ejercer presión positiva
con el émbolo de la jeringa, el líquido va a pasar por el filtro
ejerciendo cierta resistencia, 4) cerrar muy bien el tubo con
el líquido estéril hasta su utilización, 5) descartar el filtro y la
jeringa utilizados. Los filtros no deben ser reutilizados.
Si las soluciones a filtrar se encuentran
muy contaminadas, se recomienda filtrar el
líquido en sucesivas veces para lograr su este-
Jeringa rilización, pasando desde filtros de mayor diá-
metro de poro (clarificación) a filtros con menor
portafiltro diámetro de poro (esterilización). Dependiendo
Filtro de la cantidad y tipo de partículas que posea el
elemento original, será la cantidad de veces que
será necesario realizar el proceso.
Líquido ESTERILIZACION POR

estéril
RADIACIONES
La energía se transmite a través del espacio
Filtro jeringa en una gran variedad de formas, entre las cuales
67
se encuentran las radiaciones. Dentro de éstas se encuentran

las electromagnéticas de alta energía o ionizantes y otras de
baja energía o no ionizantes.
Esterilización por radiaciones ionizantes.

Comprende a los rayos alfa, beta, gamma y Röntgen
(Rayos X) los cuales poseen suficiente energía para desplazar
a los electrones fuera de las moléculas e ionizarlos, mediante
una reacción en cadena. Cuando estas radiaciones pasan a
través de las células se produce hidrógeno libre, radicales
hidroxilo y algunos peróxidos que ocasionan diferentes tipos
de daño intracelular. Como el daño recae en una gran varie-
dad de constituyentes celulares, las radiaciones ionizantes
son poco específicas en sus efectos pero tienen alto poder de
penetración. Su utilización no es habitual en el laboratorio
bacteriológico.
Esterilización por radiaciones no ionizantes.

Comprende a las radiaciones ultravioletas (UV) e infrarro-
jas (IR). La porción UV incluye radiaciones desde 150 a 3900
Å. Las de mayor eficacia como bactericida son las de 2650 Å.
La luz solar está parcialmente compuesta por luz UV pero la
mayoría de las longitudes de onda corta son filtradas por la
atmósfera terrestre (ozono, nubes, etc.), y están restringidas
en la superficie terrestre a una amplitud de 2870 a 3900 Å
por lo que la luz solar tiene acción microbicida pero en grado
limitado. La luz UV es absorbida por muchos materiales ce-
lulares, pero es en los ácidos nucleicos donde causa el mayor
daño. Esta absorción se efectúa sobre todo en sus bases piri-
mídicas donde puede formar un dímero entre 2 bases vecinas
que, a menos que sea desdoblado por enzimas intracelulares
específicas, inhibe la replicación del ADN. Se pueden obtener
lámparas que emiten luz UV en su región más efectiva (2600
a 2700 Å). Son de uso difundido en quirófanos, salas de en-
vasado de vacunas y ambientes en general, como así también
en la industria de la alimentación para envases y superficies
contaminadas, aunque su efectividad real en estos casos es
discutible, debido a que la luz UV tiene muy poca capacidad de
penetrar la materia, por ejemplo una pequeña capa de vidrio
resta gran capacidad de radiación.
68
PREPARACIÓN DEL MATERIAL
PARA SU ESTERILIZACIÓN
Material nuevo. Se debe lavar con detergentes biode-
gradables (detergente de laboratorio), enjuagar con abundante
agua corriente, luego con agua destilada, escurrir, dejar secar,
tapar los tubos y frascos con tapones de algodón y por último
envolver con papel (por unidad o grupo) asegurando la envol-
tura con hilo.
Material utilizado o contaminado. Se debe esterilizar
en autoclave para evitar contaminaciones, se eliminan los de-
sechos y finalmente se procede a limpiar y acondicionar según
se indica para material nuevo.
Preparación del material a esterilizar en horno de es-
terilización. Es recomendable que los tubos de vidrio, pipetas
y placas de Petri de vidrio se esterilicen envueltas en papel de
madera. Los erlenmeyer, frascos, etc. deben esterilizarse con
la boca cubierta con papel metalizado (puede utilizarse el de
cocina aunque es aconsejable uno de mayor espesor) o con
un tapón de algodón cubierto de gasa y asegurado con papel
madera e hilo.
Preparación del material a esterilizar en autoclave.
Es recomendable que las gradillas con tubos y sus respectivas
tapas conteniendo medios de cultivo sean cubiertas con papel
metalizado o papel madera asegurado con hilo para evitar que
se acumule agua del autoclave. Los tapones de los tubos de-
ben estar parcialmente cerrados para que pueda penetrar el
vapor y asegurar una correcta esterilización. Los erlenmeyer,
frascos y recipientes con medios de cultivo deben esterilizarse
con la boca cubierta con papel metalizado o con un tapón de
algodón cubierto de gasa y asegurado con papel madera e hilo.
Luego de la esterilización por autoclave, conviene llevarlos a
estufa de secado.
69
MARCHA BACTERIOLOGICA
Con este nombre se designa la serie ordenada de pasos
que se deben seguir para obtener correctamente un aisla-
miento e identificación bacteriano. Algunos autores incluyen
el antibiograma en la marcha bacteriológica, siempre luego de
obtener un aislamiento puro e identificarlo. Los pasos de la
marcha bacteriológica son los siguientes:
1. Recolección de la muestra.
2. Observación en fresco.
3. Coloración.
4. Cultivo, aislamiento y reaislamiento.
5. Identificación bacteriana: coloración, estudios bio-
químicos y fisiológicos, seroagrupamiento y estudios comple-
mentarios.
6. Antibiograma.
1. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
Una muestra obtenida en forma adecuada es uno de los
pasos más importantes en el diagnóstico de una infección,
debido a que los resultados de las pruebas de diagnóstico de
enfermedades infecciosas dependen de la selección, el tiempo y
el método de obtención de las muestras. Las bacterias crecen,
proliferan y mueren, son susceptibles a muchas sustancias
químicas y pueden encontrarse en sitios anatómicos diferentes
y en líquidos y tejidos corporales distintos durante la evolución
de las enfermedades infecciosas. El aislamiento de un agente
infeccioso es muy importante en la formulación de un diagnós-
tico, y es útil para un posterior tratamiento. La muestra debe
obtenerse del sitio donde sea más probable que se encuentre
el microorganismo y se manejará de tal forma que favorezca
la supervivencia y proliferación del mismo.
Cualquier tipo de microorganismo aislado de sangre,
líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial o cavidad pleural,
orina por punción, es un hallazgo con valor diagnóstico. Por
el contrario, muchas zonas del cuerpo tienen una microbiota
normal, que puede ser alterada por influencias endógenas o
exógenas. La obtención de microorganismos potencialmente
patógenos de las vías respiratorias, gastrointestinal o génitouri-
naria, de heridas o de piel debe considerarse en el contexto
de la microbiota normal de cada sitio particular. Para obtener
una correcta interpretación de los resultados bacteriológicos
71
y arribar a un diagnóstico definitivo, es importante considerar

los resultados obtenidos en el análisis clínico del paciente.
A continuación se enumeran algunas reglas generales
que se aplican a la recolección de muestras:
• La cantidad de material debe ser el suficiente para po-
der realizar el estudio, aunque debe primar el sentido común.
Por ejemplo, para un análisis bacteriológico de materia fecal, no
es necesario enviar 500 g de muestra, ya que es suficiente con
una pequeña cantidad contenida en un hisopo embebido.
• La muestra debe ser representativa del proceso infec-
cioso.
• Hay que evitar que se contamine la muestra utilizan-
do sólo equipos estériles y trabajar asépticamente durante la
recolección.
• Debe enviarse la muestra al laboratorio y examinarse
con prontitud. Puede ser útil un medio de transporte como por
ejemplo Stuart o Cary-Blair.
• Es muy importante conocer si el paciente fue tratado
con antimicrobianos antes de obtener las muestras para el
estudio bacteriológico. Si fue así, se requiere suspender su
utilización y repetir la toma de muestra varios días después.
Dependerá de la farmacocinética del antibiótico usado, pero
a los fines prácticos no menos de 5 días de suspensión de la
administración del antimicrobiano. En casos excepcionales
puede realizarse estudios "intra-tratamiento".
• Las muestras deben enviarse refrigeradas a 4 ºC.
Esto es para evitar el desarrollo bacteriano de la microbiota
acompañante y evitar obtener resultados erróneos. Si se en-
vía el material desde largas distancias se debe procurar que
sea en horario nocturno (especialmente en verano) ya que las
muestras pueden viajar en colectivos por largas horas con
altas temperaturas que pueden permitir el crecimiento de la
microbiota acompañante.
Microorganismos nativos
(microbiota normal)
Como se mencionó en el primer capítulo, la población de
microorganismos que residen en piel y membranas mucosas de
animales normales (sanos) son considerados microorganismos
nativos o también llamados microbiota normal. La piel y las
mucosas hospedan siempre a una gran variedad de microor-
ganismos, los cuales pueden ser divididos en dos grupos:
72
A) La microbiota residente, está compuesta de diferentes
géneros microbianos habitualmente constantes, los cuales
se encuentran en un sitio determinado; si la microbiota re-
sidente se modifica, se puede restablecer espontáneamente
con rapidez.
B) La microbiota transitoria está formada por micro-
organismos no patógenos o sólo potencialmente patógenos,
hospedados en la piel o las mucosas durante horas, días o
semanas. La microbiota transitoria proviene del ambiente y
en general no produce enfermedad. Los miembros de la mi-
crobiota transitoria son generalmente de poca significancia,
en tanto que si la microbiota residente sufre alteraciones, los
microorganismos transitorios pueden colonizar, proliferar y
producir enfermedad.
Importancia de los microorganismos nativos: microorga-
nismos como Salmonella spp. se consideran patógenos siempre
que se localizan en un paciente. Sin embargo, numerosas in-
fecciones se producen por microorganismos que son miembros
permanentes o transitorios de la microbiota normal, por ejem-
plo E. coli, que forma parte de la microbiota gastrointestinal
normal y también es la causa más común de las infecciones
urinarias. De igual manera, la gran mayoría de las infecciones
bacterianas mixtas por anaerobios son causadas por microor-
ganismos miembros de la microbiota normal.
Aislar en un cultivo de lavado bronquial numerosos ba-
cilos gramnegativos de especies como Klebsiella pneumoniae
mezcladas con bacterias nasofaríngeas normales, se considera
causa de neumonía, ya que no es normal encontrar K. pneu-
moniae en abundancia en la microbiota nasofaríngea.
2. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
Observación en fresco
El microorganismo es visualizado sin colorear. En este
método las bacterias permanecen vivas. Es un método sencillo,
ya que se colocan las bacterias diluidas en solución fisiológica
(o agua de canilla) sobre un portaobjetos, luego se le coloca el
cubreobjetos y se observa al microscopio en 100X y 400X.
Entre las ventajas de la observación en fresco se incluye
la rápida preparación, y la posibilidad de observar la forma del
microorganismo, la agrupación, la movilidad y la reproducción.
Esta última, si colocamos el preparado en un microscopio con
platina térmica (poco usual en la práctica).
73
Algunas desventajas de la observación en fresco son la

dificultad de interpretar la observación para un operador inex-
perto, y la imposibilidad de observar estructuras o atributos
morfológicos.
Observación en fresco
Entre porta y cubreobjetos. Se coloca sobre el portaob-
jetos una gota de cultivo bacteriano y sobre ella se aplica un
cubreobjetos sin retener burbujas de aire; luego se fijan porta
y cubre con parafina.
Con fondo oscuro. En este caso la muestra se coloca entre
porta y cubreobjetos pero el microscopio posee un condensa-
dor especial que por medio de un diafragma central impiden
el paso de los rayos luminosos centrales, mientras que los
rayos periféricos tienen una incidencia oblicua a nivel de la
muestra. Si los rayos luminosos encuentran partículas a nivel
de objeto, sufrirán una desviación en su trayecto y penetrarán
en el objetivo permitiendo observar las bacterias iluminadas
periféricamente semejando un cielo estrellado. Si por el contra-
rio los rayos luminosos no encuentran ningún elemento forme
a nivel de objeto, seguirán su marcha sin sufrir desviaciones
lo que permitirá observar un campo microscópico totalmente
oscuro, sin partículas brillantes. Este método se usa sólo para
ciertos microorganismos como leptospiras, campilobacterias,
treponemas y borrelias.
La preparación microscópica coloreada

Ventajas y desventajas de las preparaciones microscó-
picas coloreadas:
Las ventajas de realizar una coloración bacteriana inclu-
yen la posibilidad de observar estructuras internas y clasificar
a los microorganismos según si aceptan o no un determinado
colorante, por ejemplo en la coloración de Gram. La principal
desventaja es que en la preparación coloreada la bacteria está
muerta y por lo tanto no se pueden visualizar las manifesta-
ciones vitales del microorganismo.
Coloración simple: interviene un sólo colorante, todo
se tiñe del mismo color. Por ejemplo la tinción con azul de
metileno.
Coloración diferencial: son coloraciones especiales que se
utilizan para colorear una estructura particular de la bacteria,
por ejemplo esporos, flagelos, cápsula, y gránulos metacromá-
ticos, entre otros.
74
3. COLORACIÓN
Las bacterias vivas son transparentes y el examen di-
recto hace difícil el estudio de sus detalles morfológicos. Para
observar la morfología, afinidad tintorial y variedad de las bac-
terias presentes en una muestra, se debe realizar un estudio
tintorial previo. Para la coloración de las bacterias se utilizan
diversos colorantes.
Se considera como colorante a toda sustancia capaz de
transmitir color a otro elemento. Los colorantes más usados
en bacteriología son básicos, o sea que colorean los compo-
nentes ácidos de una bacteria como por ejemplo el ADN, ARN
y proteínas. Algunos ejemplos de colorantes básicos son los
siguientes: azul de metileno, violeta de Genciana, fucsina bá-
sica y verde de Malaquita. Los colorantes ácidos como eosina,
fucsina ácida y azul de anilina no son usados normalmente
en bacteriología.
Las bacterias reaccionan de modo distinto ante los di-
ferentes colorantes, lo que ayuda a su clasificación. Entre las
coloraciones utilizadas con mayor frecuencia en bacteriología
se encuentra el método de Gram, el cual permite dividir a las
bacterias en dos grandes grupos grampositivas y gramnegati-
vas, orientando así al bacteriólogo en la elección de los medios
de cultivo y las pruebas de identificación que va a utilizar.
Mordientes y decolorantes
Se denomina mordiente a los agentes químicos o físicos
que fijan el colorante a las bacterias o le permiten penetrar
más profundamente. Entre los mordientes químicos se en-
cuentran el aceite de anilina, el fenol y el ioduro potásico; y
entre los mordientes físicos se incluye el calor. Una vez que el
microorganismo fue coloreado y el colorante fue fijado por la
acción del mordiente, no es sencillo eliminarlo. Sin embargo,
las bacterias varían en su estructura y en ciertas bacterias
es posible eliminar el colorante mediante la utilización de
sustancias decolorantes, tales como los alcoholes diluidos,
acetona, éter y ácidos orgánicos. En estos casos, las bacterias
decoloradas se tiñen con un colorante de contraste.
COLORACIÓN DE GRAM
La coloración de Gram permite agrupar a las bacterias
en dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta
diferenciación se debe a la constitución de la pared bacte-
75
riana. Las bacterias grampositivas poseen una pared gruesa

compuesta principalmente por peptidoglicanos, ácido teicoico,
ácido lipoteicoico y lípidos. La pared de las bacterias gramne-
gativas posee una capa de peptidoglicano, de menor proporción
que las bacterias grampositivas, la cual se encuentra rodeada
de una membrana externa formada por fosfolípidos, lipolisa-
cáridos y lipoproteínas.
La coloración de Gram consiste en teñir el extendido
bacteriano con violeta de Genciana o cristal violeta, someter-
la a la acción de un mordiente (solución de Lugol), lavar con
alcohol o alcohol-acetona hasta eliminar el colorante y teñir
luego con un colorante de contraste, como la fucsina básica o
safranina. Cuando se aplica el violeta de Genciana, el colorante
es tomado por la pared de todas las bacterias presentes en la
muestra, tanto positivas como negativas, al incorporar el lugol,
el colorante se complejiza con el mordiente y en la decolora-
ción las bacterias grampositivas sufren una deshidratación
que disminuye la permeabilidad debido al cierre de los poros
de la capa de peptidoglicanos, y el complejo colorante-lugol
es retenido en su pared tiñendo las bacterias de violeta. Por
el contrario, la decoloración en las bacterias gramnegativas
provoca la disolución de la cubierta lipídica y aumenta la
permeabilidad de la pared, el alcohol arrastra los lípidos uni-
dos al complejo colorante-lugol fuera de las bacterias y por lo
tanto estas quedan incoloras, permitiendo su
contra-coloración con safranina, tiñéndose
de rosado.
Pasos metodológicos de la coloración de

Gram:
1. EXTENDIDO: con ansa, extender una
gota de líquido sobre el portaobjetos. Si la
muestra es sólida, tocar con el ansa y emul-
sionarla en una gota de solución fisiológica
estéril colocada en el portaobjetos.
2. SECADO: al aire caliente, con leve
movimiento de vaivén; en este paso se eli-
mina el exceso de líquido, pero las bacterias
continúan vivas.
3. FIJADO: el método de Koch consiste
en pasar tres veces el portaobjetos por la llama
con un ángulo de 45°; evitar el calentamiento
76
excesivo que carbonice la muestra.
4. COLORACION: se cubre el extendido
con el colorante primario (violeta de Genciana
o cristal violeta) y se deja actuar durante 1
min.
5. PRIMER LAVADO: se realiza con agua
de canilla.
6. MORDIENTE: se cubre el extendido
con un mordiente químico (solución de Lugol) y se deja actuar
durante 1 min.
7. DECOLORANTE: se toma el portaojetos con una pinza
y se coloca inclinado, se lava por arrastre con alcohol o acetona
hasta que no se elimine más colorante.
8. SEGUNDO LAVADO: se realiza con agua de canilla.
9. COLORACION DE CONTRASTE: se cubre el extendido
con el colorante secundario (fucsina diluida o safranina) y se
deja actuar no más de 45 seg.
10. TERCER LAVADO: se realiza con agua de canilla.
11. SECADO: se realiza con el aire caliente alrededor
del mechero.
Extendido, seca- Cristal violeta Lavado

do y fijado Lugol Fucsina diluida
Alcohol/acetona
77
12. OBSERVACION: se coloca una gota de aceite de in-

mersión sobre el extendido coloreado. La observación se realiza
utilizando la lente de inmersión (x 100). No se usa cubreobjetos.
Se recomienda la utilización de aceites de inmersión que no
sean cancerígenos.
13. INTERPRETACION: las bacterias grampositivas se
observarán de color azul y las bacterias gramnegativas de
color rojas o rosadas. Otras características útiles para consi-
derar son a) tamaño y forma de las bacterias, b) disposición,
c) presencia o ausencia de estructuras específicas (esporos,
gránulos metacromáticos, etc.). El bacteriólogo debe evaluar
todas estas características junto con aquellas observadas en
el cultivo. Es importante considerar que algunas reacciones
de tinción pueden ser variables, particularmente si se parte
de un cultivo muy joven o muy viejo. La morfología observable
tras la coloración de Gram de la mayoría de las bacterias es
característica sobre todo cuando los extendidos se preparan
a partir de un reaislamiento de 18 a 24 h.
4. CULTIVO
Para comprender mejor la etapa de cultivo se deben
considerar algunos conceptos relacionados con el metabolismo
respiratorio de las bacterias. La respiración bacteriana invo-
lucra cualquier reacción química por la cual se libera energía
para los procesos vitales; la transformación de la energía puede
tener lugar aeróbica o anaeróbicamente. En base a este concep-
to se puede clasificar a las bacterias en aerobias, anaerobias,
anaerobias facultativas, microaerófilas y capnófilas. En este
libro desarrollaremos únicamente el cultivo de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas.
Bacterias aerobias: son bacterias que requieren oxígeno
como aceptor terminal de electrones y no proliferan en condi-
ciones de anaerobiosis (es decir en ausencia de oxígeno).
Bacterias anaerobias: son bacterias que no emplean
oxígeno para su proliferación y metabolismo, sino que obtienen
su energía de reacciones fermentativas. Una definición fun-
cional de anaerobios, es que requieren una tensión reducida
de oxígeno para crecer y no proliferan en la superficie de un
medio sólido en una atmósfera ambiente con 10 % de dióxido
de carbono. Las especies de Bacteroides y Clostridium, son
ejemplos de anaerobios (las bacterias anaerobias no se incluyen
en los objetivos de este libro).
78
Bacterias anaerobias facultativas: son bacterias que
proliferan mediante procesos oxidativos, utilizando oxígeno
como aceptor terminal de electrones, o en anaerobiosis em-
pleando reacciones de fermentación para obtener energía,
sobreviven tanto en condi-ciones aeróbicas como anaeróbicas.
Estas bacterias son patógenas comunes. Streptococcus spp. y
algunas especies de la Familia Enterobacteriaceae (por ejemplo:
E. coli) están entre los numerosos anaerobios facultativos que
causan enfermedad.
Bacterias microaerófilas: son bacterias que requieren
menor tensión de oxígeno y lo utilizan como aceptor terminal de
electrones. Este grupo bacteriano no prolifera en la superficie
de un medio sólido en presencia de aire, y sólo determinadas
especies lo hacen en anaerobiosis. Por ejemplo, algunas espe-
cies de Streptococcus son microaerófilos.
Bacterias capnófilas o capnóicas: son bacterias que
desarrollan mejor en presencia de anhídrido carbónico a una
concentración del 3 al 10 %.
MEDIOS DE CULTIVO
Una vez comprendido el concepto de metabolismo res-
piratorio analizaremos en qué consiste la etapa de cultivo. Se
denomina cultivo al proceso de propagar microorganismos
brindándoles las condiciones ambientales adecuadas. Los
microorganismos en crecimiento se multiplican y por lo tanto
requieren nutrientes. Se entiende por medio de cultivo a una
sustancia o conjunto de sustancias que reúnan las condicio-
nes que permitan la multiplicación in vitro de las bacterias
que allí se siembran. Los requisitos a tener en cuenta deben
ser los siguientes:
a) pH: generalmente cercano a la neutralidad.
b) composición química: debe responder a las exigencias
nutritivas del organismo a cultivar.
c) esterilidad: el medio de cultivo debe ser estéril para
evitar que los microorganismos ambientales no interfieran en
el desarrollo de la cepa que pretendemos cultivar y por ende
en la interpretación de los resultados.
d) humedad: los medios de cultivo deben tener una canti-
dad óptima de humedad para permitir el desarrollo bacteriano.
Luego de un tiempo, inclusive cuando son mantenidos en re-
frigeración, los medios se desecan y pierden las características
apropiadas para el desarrollo bacteriano.
79
e) componentes básicos: peptona (10 g), cloruro de sodio

(5 g) y agua destilada (1000 ml).
Entre las finalidades de un medio de cultivo se incluyen:

1) el aislamiento de microorganismos en colonias puras, 2) el
estudio de características culturales, 3) el estudio de activi-
dades metabólicas, 4) la preparación de vacunas y antígenos,
5) la conservación de cepas bacterianas en colección, 6) la
obtención de grandes masas microbianas para estudios físicos
y químicos, 7) la obtención de bacterias con fines industriales
(preparación de productos lácteos, vitivinícolas, antibióticos,
enzimáticos y ensilajes).
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

A) POR SU CONSISTENCIA
Líquido: también denominado caldo, posee elementos
nutritivos esenciales disueltos generalmente en agua desti-
lada.
Semisólido: su consistencia es leve y se obtiene agre-
gando agar al caldo; también se lo conoce como agar blando
o agar punción.
Sólido: llamado también agar estría y agar duro o placa,
obtiene su consistencia por el agregado de una mayor cantidad
de agar al caldo original (15 g/l).
B) POR SU FINALIDAD
Común o simple: es aquél medio de cultivo que contiene
los elementos mínimos que permiten el desarrollo de la mayor
parte de las bacterias no exigentes.
Enriquecido: es un medio simple con el agregado de
sustancias que aumentan su poder nutritivo (sangre, suero,
extracto de levadura, vitaminas) en proporción del 1 al 10%.
Selectivo: es el medio que por acción de uno o más ele-
mentos que lo integran favorece el desarrollo de determinados
grupos bacterianos e inhibe el crecimiento de otros. Ejemplo:
agar manitol salado para Staphylococcus, que contiene una
elevada concentración de cloruro de sodio soportada casi ex-
clusivamente por este Género bacteriano. Caldo selenito para
Salmonella, que se emplea como medio de enriquecimiento
preliminar en el aislamiento de Salmonella spp. ya que inhibe
el crecimiento de las bacterias coliformes y de los enterococos.
Agar sangre con polimixina B y neomicina para Streptococcus
spp. hemolíticos del grupo A, los antibióticos inhiben el desa-
80
rrollo de los bacilos gramnegativos.
Diferencial: se denomina así al medio que por el ataque
a un sustrato permite distinguir diferentes especies bacteria-
nas con características morfológicas y tintoriales similares.
Ejemplo: agar CLDE para el análisis de orina.
Selectivo y diferencial: es un medio de cultivo que
contiene elementos que inhiben el desarrollo de determinadas
bacterias y favorece el desarrollo de otras, permitiendo además
diferenciar las colonias de estas últimas mediante su acción
sobre determinados sustratos. Ejemplo: agar MacConkey para
identificar Géneros de la Familia Enterobacteriaceae.
Especial: por las sustancias que lo integran, este medio
cumple con las exigencias vitales de determinados microorga-
nismos que únicamente en ellos pueden desarrollar en forma
óptima.
PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO

En la actualidad, en los laboratorios de bacteriología
se utilizan medios de cultivo comerciales y su preparación
es muy sencilla. Se debe pesar la cantidad indicada en el
prospecto o envase del medio elegido, añadir agua destilada,
dejar humectar y hervir en horno microondas. Posteriormente
ajustar el pH si es necesario, fraccionar y esterilizar en auto-
clave (principalmente medios líquidos), o esterilizar primero
y fraccionar después (principalmente medios sólidos). En el
Anexo II se describe detalladamente la preparación de todos
los medios de cultivo mencionados en este libro.
SIEMBRA DE UNA MUESTRA O UN CULTIVO BACTERIANO

EN UN MEDIO DE CULTIVO
Para comprender mejor la siembra de una muestra o
de un cultivo bacteriano en un medio de cultivo vamos a con-
siderar algunos conceptos, tales como curva de crecimiento
bacteriano, colonia, población, aislamiento y cepa.
Curva de crecimiento bacteriano. Las bacterias como
organismos procariotas se multiplican por fisión binaria,
la mayoría de las bacterias de importancia clínica tiene un
tiempo de generación de 20 min a 2 h. En cada generación se
duplica el número de individuos. Este crecimiento exponencial
o logarítmico existiría en condiciones ideales si no hubiera
agotamiento del medio de cultivo, acumulación de metabolitos
tóxicos y variación de pH, entre otros. La curva de crecimien-
81
to bacteriano consta de cuatro

fases: 1) fase de adaptación o
latencia, 2) fase de crecimiento
exponencial o logarítmico, 3) fase
estacionaria o de meseta, 4) fase
de muerte.
Colonia. Es la forma de
desarrollo en los medios de cul-
tivo sólidos y se origina a partir
de una sola bacteria; al estudiar sus características se deben
tener en cuenta forma, tamaño, color, bordes, altura, superficie
y aspecto o consistencia.
Población. Es el desarrollo bacteriano en medios de
cultivo líquidos, en donde no pueden diferenciarse entre sí
los distintos microorganismos; las características más impor-
tantes son: turbidez o transparencia del medio; formación de
velo superficial (consistencia, espesor y cantidad) y presencia
de sedimento (aspecto, cantidad y coloración).
Para obtener colonias aisladas se pueden realizar diferen-
tes procedimientos, como por ejemplo diseminación, dilución
y métodos de aislamiento especiales.
Aislamiento. Es un cultivo bacteriano puro que aún no
fue estudiado ni identificado.
Cepa. Es un cultivo bacteriano puro identificado y ca-
racterizado.
AISLAMIENTO
Proceso o conjunto de métodos que deben aplicarse para
conseguir bacterias en cultivo puro, separando las bacterias
que se desea estudiar de la microbiota contaminante. Se trata
del aislamiento y el crecimiento inicial de microorganismos
mediante la siembra de una muestra clínica. Una vez que se
obtuvieron colonias aisladas estas pueden ser transplantadas
a distintos medios.
Para obtener colonias aisladas y de esta manera comen-
zar la identificación y caracterización bacteriana se pueden
emplear las siguientes estrategias:
I. DISEMINACIÓN EMPLEANDO UNA SOLA PLACA

Se debe colocar una ansada de la muestra en estudio
en un punto periférico de la placa, y con el ansa, trazar una
estría apretada de poca extensión; quemar y enfriar el ansa.
82
Posteriormente, se debe rea-
lizar una primera siembra
ciega arrastrando material
de la estría primaria al medio
sin sembrar; quemar y enfriar
nuevamente el ansa. Luego,
realizar una segunda siembra
ciega arrastrando material
de la segunda estría al me-
dio nuevo, y sin esterilizar el
ansa, trazar una estría final de agotamiento en el medio sin
sembrar e incubar. El número de colonias disminuirá de la
primera a la última estría, permitiendo el aislamiento buscado.
Es importante considerar que las placas se incuban con la
tapa hacia abajo para evitar que la condensación de agua que
se forma en la placa disemine nuestra siembra, malogrando y
atrasando la etapa de cultivo.
II. DISEMINACIÓN EMPLEANDO VARIAS PLACAS

Se debe colocar una ansada del material problema en un
punto periférico del medio de cultivo de la primera placa; con
una espátula de Drigalsky previamente flameada y fría, exten-
der por toda la superficie del medio. Posteriormente, repetir la
diseminación por las demás placas sin esterilizar la espátula ni
tomar nueva muestra, de esta forma se produce el agotamiento
del material y un número decreciente de colonias en las placas
subsiguientes. El número de colonias disminuirá de la primera
a la última placa, permitiendo el aislamiento buscado.
III. DILUCIÓN
Este método se utiliza para realizar el conteo viable. Si
bien esta estrategia no es utilizada rutinariamente para obtener
colonias aisladas de una muestra clínica, es de suma utilidad
para determinar la cantidad de bacterias en un urocultivo, en
un gramo o militro de un alimento, o bien para cuantificar un
cultivo bacteriano o una vacuna viva.
IV. MÉTODOS DE AISLAMIENTO ESPECIALES

Shock de calor. Consiste en someter al cultivo conta-
minado a una temperatura de 80 ºC de 15 a 30 min; así se
eliminan las formas vegetativas y solamente quedan viables
los esporos.
83
Temperaturas disgenesicas de cultivo. Los medios

sembrados se incuban a 44,5 ºC (± 0,5 ºC); a esta temperatura
dentro de los coliformes solamente desarrolla E. coli permitien-
do su aislamiento de los contaminantes.
Filtración. Utilizando cualquier membrana filtrante, y
por medio del efecto tamiz por el que actúa el filtro de super-
ficie, quedarán retenidas en la misma las partículas de mayor
tamaño que los poros de la membrana.
Medios de cultivo disgenesicos. Se denominan así
los medios que tienen poder selectivo sobre algunas debido a
determinados componentes que los integran (cloruro de sodio,
bilis, alcohol feniletílico). Estos medios pueden favorecer el
desarrollo de determinados microorganismos, o bien detener
o disminuir la proliferación de bacterias no deseadas.
Sustancias quimicas. Para tratar muestras mixtas se
utiliza el alcohol etílico de 50º durante 1 h; así crecerán selec-
tivamente solo los microorganismos que forman esporas.
TRANSPLANTE
También llamado repique, resiembra o subcultivo, es el
pasaje de las bacterias viables de un cultivo a un medio fresco.
Existen las siguientes posibilidades:
1. Medio LIQUIDO a medio LIQUIDO
Se realiza con ansa o pipeta Pasteur, y siempre se debe
homogeneizar luego del transplante.
2. Medio LIQUIDO a medio SOLIDO
El ansa cargada se lleva al fondo del tubo con agar es-
tría, se la apoya sobre el medio de cultivo y se siembra con
un movimiento de zigzag a medida que se la extrae. También
se puede realizar de un medio líquido a una placa con medio
sólido, en este caso se procede como se describió en obtención
de colonias aisladas en una placa.
3. Medio SOLIDO a medio LIQUIDO
Con ansa o aguja se lleva el inóculo (una colonia aislada)
y se lo deposita sobre las paredes del tubo, contactando con
el caldo.
4. Medio SOLIDO a medio SOLIDO
Con ansa o aguja se lleva el inóculo (una colonia aislada),
se repite la siembra en estría descripta anteriormente.
REAISLAMIENTO
Reaislamiento es el procedimiento utilizado con mayor
84
frecuencia en los laboratorios de bacteriología clínica para ob-
tener cultivos puros. Luego de la siembra de una muestra en
un medio de cultivo sólido es posible observar colonias aisladas
compatibles con el cuadro clínico. Se debe tomar una de estas
colonias aisladas y realizar el reaislamiento, el cual consiste
en el transplante de una sola colonia sospechosa de un me-
dio sólido a un medio sólido por diseminación. El objetivo del
reaislamiento es obtener un cultivo puro del microorganismo
a estudiar.
5. IDENTIFICACION BACTERIANA
COLORACIÓN
Se debe realizar la coloración de Gram a partir del reais-
lamiento para confirmar que estamos estudiando la misma
bacteria que observamos en el cultivo primario.
ESTUDIOS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS
Tienen como finalidad la identificación de bacterias mor-
fológicamente similares mediante la evidencia de las diferentes
actividades bioquímicas y fisiológicas. Para lograr nuestro co-
metido utilizamos medios de cultivo diferenciales en los cuales
se agrega el o los sustratos que posteriormente serán utilizados
por los aislamientos bacterianos en estudio.
Las pruebas bioquímicas quizás sean la parte más difícil
y tediosa de comprender, aprender y realizar, especialmente
para los médicos veterinarios que quieren resultados prácticos.
Sin embargo, son indispensables para la identificación de las
bacterias. El estudio del fundamento de su realización sentará
las bases para la realización de las pruebas propiamente di-
chas. Luego obviamente podrían “saltearse” estos contenidos
e ir directamente a la práctica, esto es: realizar la prueba y ver
sus resultados, pero como profesionales es mucho más inte-
resante comprender el fundamento por el cual las bacterias
producen los respectivos resultados.
Por otro lado este libro está planteado específicamente
como PRÁCTICO, entonces tratamos de ser muy sintéticos y
claros para que no resulte abrumador el número de prueba
bioquímicas, para reflejar sólo aquellas imprescindibles para
las bacterias que componen el temario.
Recordemos que las pruebas bioquímicas y fisiológicas
tienen como finalidad la identificación de bacterias morfológi-
camente y tintorialmente similares mediante la evidencia de
las diferentes actividades bioquímicas y fisiológicas. Entonces
85
utilizamos medios de cultivo diferenciales en los cuales se agre-

ga el o los sustratos que posteriormente serán utilizados por
las bacterias a estudiar. Es muy importante tener en cuenta
que para realizar correctamente estas pruebas es necesario
partir de un cultivo puro, o sea procedente de un sólo tipo
microbiano.
Por otro lado, existen comercialmente métodos rápidos de
identificación de distintas marcas como el API (diferente para
cada tipo de microorganismos) que permite la identificación
bacteriana en menor tiempo. Lamentablemente, están ideados
para la identificación de bacterias de origen humano, por lo
tanto, muchos Géneros y especies bacterianas de importancia
veterinaria no se pueden identificar por medio de ellos.
En el apartado “Familias bacterianas de importancia
clínica en Medicina Veterinaria” se enumeran las pruebas
bioquímicas que habitualmente se utilizan para la identifica-
ción de las principales especies bacterianas de importancia
clínica. Asimismo, en el Anexo III se describe detalladamente
la forma en que se preparan e interpretan estas pruebas.
SEROAGRUPAMIENTO
El seroagrupamiento consiste en la detección del li-
popolisacárido de los antígenos somáticos (O) mediante téc-
nicas inmunológicas. Estas técnicas, se basan en la unión
del antígeno (Ag O) con anticuerpos específicos (Ac anti-O).
En un laboratorio de diagnóstico bacteriológico básico, el se-
roagrupamiento se realiza principalmente para determinadas
especies de la Familia Enterobacteriaceae, mediante técnicas
inmunológicas secundarias, como por ejemplo la aglutinación
en placa. Para ello, se enfrenta un cultivo bacteriano joven (24
horas) con anticuerpos unidos a partículas de látex (comercia-
les) o con antisueros de referencia. Se deben colocar dos gotas
de 20 ml de solución fisiológica cada una, en un portaobjetos o
en una placa de vidrio, luego se descarga con el ansa en anillo
una pequeña porción de una colonia aislada en ambas gotas y
se homogeniza. Finalmente, en una de las gotas se descargan
20 ml del antisuero (Ac anti-O) y se vuelve a homogenizar. De-
bajo del portaobjetos se debe colocar con una luz y mediante
suaves movimientos rotatorios se observa la formación de
pequeños grumos de aglutinación. En la gota sin antisuero
no se debe observar aglutinación, si es así el aislamiento está
autoaglutinado debido a que se encuentra en fase rugosa (R).
86
En este último caso se considera que el resultado de la prue-
ba no es válido. Si es imprescindible obtener el resultado se
puede intentar revertir el aislamiento en estudio a fase lisa (S)
mediante sucesivos repiques en un medio enriquecido como
por ejemplo agar sangre y repetir la prueba.
Una vez obtenido el serogrupo, se puede completar la
caracterización mediante la determinación de los antígenos
flagelares (H) y capsulares (K). Sin embargo, para ello se re-
comienda remitir los aislamientos a centros especializados en
el tema.
CONSERVACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS

La conservación de los aislamientos obtenidos de mues-
tras clínicas es de suma importancia para realizar un diag-
nóstico final correcto. En muchos casos no es posible realizar
un diagnóstico bacteriológico final en un laboratorio con
condiciones mínimas, y los aislamientos deben ser remitidos
a centros de referencia.
En la actualidad existen numerosos métodos para la
conservación de aislamientos o cepas bacterianas. Los micro-
organismos mantenidos a bajas temperaturas, se consideran
en latencia, ya que no desarrollan actividad metabólica detec-
table. Entre los métodos más utilizados en bacteriología clínica
podemos mencionar la conservación en agar blando a 4 °C y
la congelación (-20 y -70 ºC).
Conservación en agar blando. Se prepara el agar blan-
do, disolverlo en horno microondas y fraccionarlo en criotubos
no estériles. Posteriormente, se autoclavan los criotubos con
el agar blando y se conservan en la heladera a 4°C. Cuando
se obtiene un cultivo puro, se siembra con ansa en punta y se
incuba a 37 °C durante 20 h, luego se debe observar que haya
crecimiento bacteriano, se rotula el criotubo convenientemente
y se conserva en la heladera a 4 °C.
Conservación a -20 o -70 °C. En los procedimientos de
congelación a -20 y -70 ºC, el enfriamiento inicial provoca la
muerte de un porcentaje de la población debido a la formación
de cristales que rompen la pared bacteriana. Sin embargo,
la mayoría de las bacterias congeladas permanecen viables
durante largo tiempo.
Los procesos de congelamiento y descongelamiento
repetidos producen un efecto más destructivo sobre los mi-
croorganismos. El efecto destructivo parece depender de dos
87
fenómenos: a) la formación de cristales de hielo que producen

lesiones sobre las membranas, otro aparentemente más im-
portante, b) la formación de cristales de hielo extracelular que
causa la salida del agua desde el interior de la célula, dando
como resultado aumento de la concentración intracelular de
electrólitos y desnaturalización de las proteínas. Con la lesión
de la membrana celular se produce la salida de compuestos
intracelulares y por ende la muerte celular.
Procedimiento: se prepara caldo cerebro corazón con un
20 a 30% de glicerol y se fracciona en criotubos no estériles.
Posteriormente, se autoclavan los criotubos. Cuando se obtie-
ne un cultivo puro, se recolecta el crecimiento bacteriano con
ansa en anillo y se resuspende en el caldo cerebro corazón más
glicerol. Luego se agita bien el criotubo (si es posible en un
vortex) y se conserva en el freezer a -20 o -70 °C. Otra posibi-
lidad es incubar una colonia proveniente de un reaislamiento
en un caldo cerebro corazón o tripticasa de soja, e incubarlo
a 37 °C durante 20 h. Luego se coloca 1 ml del caldo con el
crecimiento bacteriano en criotubos estériles conteniendo 0,4
ml de glicerol estéril. Posteriormente, se agita bien el criotubo
(si es posible con un vortex) y se conserva en el freezer a -20
o -70 °C.
ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS
Son estudios que se realizan para llegar a una identifica-
ción mucho más exacta de los aislamientos bacterianos. Entre
estos se incluyen: a) estudios de proteínas constitutivas por
medio de la técnica de electroforesis, b) amplificación de ADN
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), c) hibri-
dización de ADN o ARN, d) utilización de sondas, y e) técnicas
de subtipificación como electroforesis en campo pulsado.
88
Pruebas de Sensibilidad
Antimicrobiana (ANTIBIOGRAMA)
Método de Difusión en Agar

La sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos in vitro
se puede determinar por varios métodos. La prueba de difusión
en agar se utiliza de rutina en muchos laboratorios clínicos en
bacterias de desarrollo rápido y también para algunas bacterias
con requerimientos nutricionales especiales. A continuación
se describen el procedimiento y las aplicaciones de esta me-
todología estandarizada.
Indicaciones para la realización de los

test de sensibilidad
Las pruebas de sensibilidad están indicadas para cual-
quier microorganismo capaz de producir un proceso infeccioso
que requiera tratamiento antimicrobiano. También en los casos
en que la bacteria infectante sea capaz de mostrar resistencia
a los antibióticos usados habitualmente para tratamiento.
Las pruebas de identificación y sensibilidad a los anti-
microbianos se deben realizar sobre cada uno de los microor-
ganismos potencialmente patógenos aislados de una muestra
clínica
Reactivos para la Prueba de difusión por

Disco.
Controles de calidad internos
a) Agar Müeller Hinton

El agar Müeller Hinton se considera el mejor de los me-
dios disponibles para las pruebas de sensibilidad de rutina
por las siguientes razones:
- Demuestra buena reproducibilidad lote a lote en las
pruebas de sensibilidad.
- Tiene bajo contenido de inhibidores de sulfonamidas,
trimetoprima y tetraciclina.
- Es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las
bacterias patógenas.
- Existen muchos datos y experiencia recopilados que
avalan las pruebas de sensibilidad realizadas con este medio
89
Preparación del medio

El agar Müeller Hinton debe prepararse a partir de la
base deshidratada de acuerdo a las recomendaciones del fa-
bricante.
Inmediatamente después de esterilizar dejar enfriar en
baño de agua hasta 45-50 ºC.
Colocar el medio en placas de vidrio o plástico de piso
plano hasta un nivel aproximado de 4 mm. Esto corresponde a
60-70 ml de medio para placas de 150 mm de diámetro interno
y 25 a 30 ml para las de 100 mm.
Dejar enfriar a temperatura ambiente antes de usar.
Las placas que no se usan en el día pueden mantenerse en
refrigerador (2-8 ºC).
Las placas con más de 7 días de preparación no son
adecuadas para las pruebas de sensibilidad salvo que se ha-
yan conservado envueltas en bolsas de plástico para evitar la
desecación.
La esterilidad de cada lote de placas debe controlarse in-
cubando una muestra representativa por el término de 24 h a
30-35 ºC.
pH
El agar debe tener un pH de 7,2-7,4 a temperatura am-
biente y debe determinarse después de su solidificación. Si
el pH es demasiado bajo los aminoglucósidos, quinolonas y
macrólidos parecerán menos activas mientras que las tetraci-
clinas parecerán tener mayor actividad. Si el pH es demasiado
alto se podrían esperar los efectos opuestos.
- Macerar la cantidad de agar necesaria para sumergir
el bulbo del electrodo del pHmetro.
- Dejar solidificar la cantidad necesaria de agar alrede-
dor del bulbo del electrodo del pHmetro de modo que quede
cubierto y medir.
Humedad
Las placas no deben presentar exceso de humedad en la
superficie. Si esto ocurre se deben colocar abiertas en estufa a
35 ºC o en cabina de flujo laminar durante 10 a 30 min.
Efecto de la timina o timidina

Los medios que contienen excesiva cantidad de timina o
timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfona-
90
midas y trimetoprima, produciendo así zonas más pequeñas,
menos nítidas o sin halo que pueden dar como resultado un
informe de falsa resistencia.
Para evaluar cada lote de Müeller Hinton en su contenido
de timidina se debe utilizar una cepa control de Enterococcus
faecalis ATCC® 29212 o ATCC® 33186 que se prueba frente
a discos de trimetoprima/sulfametoxazol.
Un medio adecuado mostrará un halo de inhibición claro
y definido de 20 mm o más. En los medios con alto contenido en
timidina se observarán zonas de inhibición con colonias dentro
del halo, menores de 20 mm o sin zona de inhibición. Para
evitar realizar este paso se recomienda comprar lotes de marcas
reconocidas y certificadas de su contenido en timidina.
Efectos por variación en la composición de cationes di-

valentes
La variación de cationes divalentes, principalmente
Ca++ y Mg++ afectarán los resultados con tetraciclinas y ami-
noglucósidos frente a Pseudomonas aeruginosa. Un excesivo
contenido en cationes reducirá la zona de inhibición, mientras
que bajas concentraciones producirán en efecto contrario. Un
exceso de Zinc podrá reducir las zonas de inhibición de los
carbapenemes.
Control de Calidad
Las normas de control de calidad son altamente reco-
mendables en su realización a efectos de lograr resultados
confiables.
El objetivo de un programa de control de calidad es el
monitoreo de:
- la exactitud y precisión (reproducibilidad) de la prueba
de sensibilidad
- la calidad de los reactivos usados en el ensayo
- el desempeño de las personas que llevan a cabo las
pruebas
Cepas de referencia para control de calidad

Escherichia coli ATCC® 25922, Staphylococcus aureus
ATCC® 25923, Psdeudomonas aeruginosa ATCC® 27853.
La cepa de E. coli ATCC® 35218 productora de
β-lactamasa ha sido designada sólo para el control de cali-
dad de los discos que contengan la combinación antibiótico
91
β-lactámico- Inhibidor de β-lactamasa, tales como sulbactama,

ácido clavulánico y tazobactama.
El Enterococcus faecalis ATCC® 29212 ó 33186 se utili-
zan para controlar los niveles de timina o timidina en el agar
Müeller Hinton.
La cepa de E. faecalis ATCC® 29212 se utiliza también
para controlar los discos de alta carga de aminoglucósidos
(GEN 120 μg y STR 300 μg)
Los diámetros de los halos de inhibición para estas cepas
deben estar dentro de los límites establecidos en la Tabla 3 del
documento del CLSI/NCCLS. Klebsiella pneumoniae ATCC®
700603 se usa como control de calidad en la determinación
de ESBL (β-lactamasa de Espectro Extendido) y la tabla de
referencia es la 2A de dicho documento.
Almacenamiento de los discos de Antibióticos

Los envases comerciales están diseñados para proteger
de la humedad a los discos de papel para pruebas de sensi-
bilidad. Los mismos deberán ser almacenados de la siguiente
manera:
- Mantenerlos refrigerados a 8 ºC o en freezer a -14 ºC
o menos.
- Los discos que contienen drogas de la familia de
β-lactámicos deben mantenerse congelados para mantener
su potencia, dejando en la heladera sólo el envase que está
siendo utilizado. Las drogas más inestables (imipenem, ce-
faclor y β-lactámicos- inhibidores de β-lactamasa) deben ser
mantenidos congelados hasta el día de uso.
- Los discos deben ser sacados del refrigerador o freezer
1 ó 2 h antes a fin de lograr un equilibrio con la temperatura
ambiente antes de ser abiertos.
- Una vez que el cartucho fue abierto debe ser colocado
en un contenedor hermético que contenga una sustancia de-
secante apropiada. Cuando el indicador del desecador usado
cambia de color debe interpretarse como un exceso de hume-
dad y reemplazarse.
- Use sólo los discos que no han alcanzado la fecha de
vencimiento indicada por los fabricantes y que hayan pasado
el control de calidad interno.
92
Turbidez estándar para la preparación del inóculo
Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una
suspensión de Sulfato de Bario como estándar de turbidez (0,5
de la escala de Mc Farland) o su equivalente óptico (suspensión
de partículas de látex).
Para la preparación del estándar 0,5 de Mc Farland ver
anexo.
Procedimiento para la realización del

Test de Difusión por Disco
Preparación del inóculo
Método de desarrollo previo
Seleccionar 3 a 5 colonias aisladas de igual morfología de
la placa de cultivo. Prepare una suspensión en 4 o 5 ml de un
caldo apropiada (tripteína soya) tocando la parte superior de
cada colonia. Incubar a 35 ºC hasta que este alcance o exceda
la turbidez del estándar (2-6 h); ajustar la turbidez del inóculo
con solución salina o caldo hasta que su densidad óptica se
asemeje a la del tubo 0,5 de la escala de Mc Farland. Esta
suspensión contendrá aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/ml
para E. coli ATCC 25922. Para ajustar la densidad del inóculo
se pueden utilizar equipos fotométricos o por comparación
visual contra el estándar. Para este procedimiento utilizar luz
adecuada y mirar los tubos contra un fondo blanco con líneas
negras como contraste.
Método directo de inoculación a partir de colonia aislada

Seleccionar 3 a 5 colonias aisladas de igual morfología
de la placa de cultivo no selectivo de 18 a 24 h de incuba-
ción (Agar sangre). Preparar una suspensión salina o caldo
apropiado (Tripteína soja) tocando la parte superior de cada
colonia. La suspensión debe ser ajustada a la escala 0,5 de
Mc Farland. Esta suspensión contendrá aproximadamente 1
a 2 x 108 UFC/ml para E. coli ATCC 25922. Para ajustar la
densidad del inóculo se pueden utilizar equipos fotométricos
o por comparación visual contra el estándar. Para este pro-
cedimiento utilizar luz adecuada y mirar los tubos contra un
fondo blanco con líneas negras como contraste.
Inoculación de las placas

Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo
sembra las placas de Müeller Hinton con un hisopo estéril.
93
Presionar el hisopo contra las paredes del tubo por encima del
nivel líquido a fin de escurrir el exceso de inóculo.
Inocular la superficie seca del Müeller Hinton por hiso-
pado en tres direcciones rotando la placa 60º cada vez para
asegurar una completa distribución del inóculo. Como paso
final se debe hisopar la circunferencia de la placa. De esta ma-
nera se deberían obtener zonas de inhibición uniformemente
circulares y desarrollo homogéneo.
Dejar la tapa de la placa abierta de 3 a 5 min, pero no
más de 15 min antes de aplicar los discos para que el exceso
de humedad superficial sea absorbido.
NOTA: No se debe usar nunca cultivos “over-night” en
medio líquido ni otros inóculos no estandarizados para el hi-
sopado de las placas.
Aplicación de los discos de antibióticos en las placas ino-

culadas
Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculada
con pinza estéril o dispensador, aplicando una ligera presión
a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro.
Debido a que algunas drogas difunden casi instantá-
neamente, un disco no debe ser reubicado una vez que tomó
contacto con la superficie del agar. No deben colocarse más
de 12 discos por placa de 150 mm y no más de 5 por placa
de 100 mm.
Incubar las placas invertidas a 35 ºC dentro de los 15
min posteriores a que los discos fueron aplicados.
Lectura de las placas e interpretación de resultados

Después de 16 a 18 h de incubación examinar cada placa
y medir los diámetros de las zonas de inhibición. El desarrollo
bacteriano en la placa deberá ser confluente, la aparición de
colonias aisladas indica un inóculo bajo por lo que el ensayo
debe repetirse. Se debe medir el diámetro de la zona de inhi-
bición incluyendo el diámetro del disco, utilizando calibre o
regla, sosteniendo la placa sobre un fondo negro e iluminada
con luz reflejada.
Finalmente deberá tener en cuenta el área que no
muestre desarrollo obvio a ojo desnudo, no incluyendo velo de
crecimiento o colonias muy pequeñas. Las colonias de tamaño
significativo que crezcan dentro de la zona clara deberán ser
subcultivadas, reidentificadas y reensayadas. Proteus spp.
94
podría presentar “swarming” dentro de la zona de inhibición
lo que deberá ser ignorado. En medios suplementados con
sangre, se deberá medir la zona de inhibición del crecimiento,
no la zona de hemólisis (Streptococcus spp.).
Los tamaños de la zona de inhibición serán interpretados
en las tablas correspondientes y los organismos se informarán
sensibles, intermedios o resistentes frente al antimicrobiano
ensayado.
Microorganismos con requerimientos

nutricionales especiales
El medio de Müeller Hinton descrito anteriormente para
patógenos aerobios de rápido crecimiento no es adecuado para
el desarrollo de microorganismos con requerimientos nutricio-
nales especiales. Cuando se deban probar microorganismos de
este tipo, el medio, los procedimientos de control de calidad y
las categorías de interpretación deben ser adaptados para cada
uno de ellos (Streptococcus spp. y Actinobacillus spp.).
Streptococcus spp.
El medio recomendado es el agar Müeller Hinton suple-
mentado con 5% de sangre de carnero desfibrinada.
Actinobacillus spp.
El medio recomendado es el agar Müeller Hinton – Cho-
colate en atmósfera del 5 - 7 % de CO2.
Interpretación de los resultados del

Método de Difusión por disco
Está basada en la respuesta in vitro de una bacteria a
un antimicrobiano en los niveles que éste alcanza en sangre
o tejidos con una dosificación habitual.
Para la mayoría de las drogas los diámetros de la zona
de inhibición fueron desarrollados primariamente comparan-
do los diámetros de inhibición con las CIMs (Concentración
Inhibitoria Mínima) de un gran número de aislamientos,
incluyendo cepas con mecanismos de resistencia relevantes
para cada una de las drogas. Las CIMs y los diámetros de
inhibición correspondiente, fueron analizados en relación
con la farmacocinética de la droga para dosis habituales. El
criterio tentativo de interpretación in vitro ha sido analizado
95
en relación a estudios de eficacia clínica en el tratamiento de

patógenos específicos.
Categorías de Interpretación
Sensible (S): Esta categoría implica que una infección
dada por la cepa en estudio puede ser tratada apropiada-
mente con la dosis de antibiótico recomendada para el tipo
de infección y la especie infectante, a menos que hubiera
contraindicaciones.
Intermedio (I): Incluye cepas cuya CIM a un determinado
antibiótico puede ser alcanzada en sangre y tejidos. Esta cate-
goría sugiere que puede alcanzarse éxito clínico aumentando
la concentración del antimicrobiano en el sitio de la infección,
siempre que las dosis usadas puedan ser incrementadas (Ej:
ß-lactámicos) o que se concentren fisiológicamente en el tejido
infectado (Ej: ß-lactámicos y quinolonas en orina).
Resistente (R): Las cepas resistentes no son inhibidas por
las concentraciones séricas normalmente alcanzadas a dosis
habituales y caen en el rango donde son comunes mecanismos
específicos de resistencia microbiana (Ej: ß-lactamasas) y la
eficacia clínica no ha sido comprobada.
96
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
UROCULTIVO
La infección urinaria implica la colonización de la orina
por bacterias infectantes y la invasión de diferentes órganos
del aparato urinario por parte de éstas.
Para realizar el diagnóstico de las infecciones urinarias
en el laboratorio se realiza el urocultivo. El primer paso es la
obtención de la orina en forma estéril. La muestra de elección
es la obtenida por cistocentesis, realizando una punción en la
región suprapúbica donde se encuentra la vejiga. Sin embargo,
no suele practicarse esta metodología y se recurre habitual-
mente al cateterismo o en su defecto a la técnica denominada
“al acecho” (esperar la emisión espontánea de orina). La orina
se debe recoger en un frasco estéril, de boca ancha y con cierre
hermético, preferentemente con tapa a rosca. La muestra se
debe mantener refrigerada a 4 ºC hasta su procesamiento (no
más de 24 h).
Anamnesis
Al recibir la muestra es conveniente realizar un cues-
tionario sobre datos del animal para orientarnos a la inter-
pretación del resultado. Nombre, edad, sexo, preñez, tiempo
de retención urinaria, si orina con mayor frecuencia que lo
habitual, si tiene manifestaciones de dolor al orinar, si tuvo
infección urinaria previa, motivo del urocultivo, si tiene fiebre,
medicación que está tomando (especialmente antibióticos), si
consume mayor cantidad de líquido.
Determinación del pH
El pH urinario tiene gran valor. En condiciones de acidez
o alcalinidad elevada el desarrollo bacteriano es más lento.
Además un pH elevado hace sospechar presencia de bacterias
desdobladoras de urea (Proteus spp.), habitualmente asociado
a litiasis o alteraciones funcionales urodinámicas.
La determinación se realiza con tiras de papel o agre-
gando unas gotas de azul de bromotimol, (indicador de pH)
que vira al color verde a pH neutro, al azul a pH alcalino y al
amarillo a pH ácido.
97
Determinación de la densidad
La orina de muy alta o baja densidad no permite el de-
sarrollo bacteriano. Por ejemplo, Escherichia coli se multiplica
muy lentamente por debajo de 1.005 y por encima de 1.030.
La determinación se realiza por medio de densitómetro
de pequeño tamaño luego de haber sembrado la muestra. En
la práctica raramente se realiza este estudio aisladamente,
sólo se complementa cuando se solicita el estudio de orina
completa, para esto se emplean tiras reactivan que determinan
la densidad urinaria sin necesidad del densímetro.
Sedimento urinario
El sedimento urinario suele ser revelador, salvo cuando
el foco séptico no comunica directamente con la orina, o luego
de un tratamiento antibiótico que enmascara el cuadro.
La orina se centrifuga a 3000 rpm durante 5 min, se
descarta el sobrenadante y se coloca una gota del “culot” entre
porta y cubreobjetos. Se observa en microscopio óptico con
objetivo de 10X y luego de 40X.
Los elementos a considerar son:

a) leucocitos: importa la cantidad y no la calidad de los
mismos. A partir de cinco leucocitos por campo se considera
significativo, salvo en animales neutropénicos que su ausencia
siempre es significativa.
b) hematíes: en este caso importa más la calidad que la
cantidad. Si aparecen crenados se puede sospechar la presen-
cia de bacterias desdobladoras de urea.
c) cilindros: la aparición de cilindros leucocitarios es
significativo de infección renal. En orinas con baja densidad y
proteinuria con presencia de leucocitos y bacterias en el sedi-
mento, buscar este tipo de cilindros. Existen otro tipo de cilin-
dros que no están relacionados con una infección urinaria.
d) bacterias: debe considerarse cantidad, forma, agrupa-
Sistema de evaluación del sedimento urinario

Células Células Células Eritrocitos Leucocitos Fibras de Cristales Cilindros Bacterias
epiteliales epiteliales epiteliales mucus
escamosas transición renales
escasa ídem ídem 1 ídem escasa escasa escasa 0
< 5 x campo <5 x campo ausencia
regular ídem idem 2 ídem regular regular regular 1
5-10 x campo 5-10 x campo presencia
abundantes ídem ídem 3 ídem abundante abundante abundante
>10 x campo >10 x campo
98
Microbiota comensal Patógenos potenciales Medios de aislamiento
(contaminantes) recomendados
Staphylococcus coagulasa Escherichia coli Agar sangre de oveja 5%
negativa
Bacilos diftéricos Especies de Klebsiella, Agar MacConkey o agar
Enterobacter y Serratia eosina azul de metileno
Escherichia coli y otros Proteus mirabilis y otras Agar CLDE
coliformes especies de Proteus
Lactobacillus Especies de Enterococcus Agar sangre de oveja al 5%
Estreptococcus alfa- Staphylococcus aureus y Agar sangre de oveja al 5%
hemolíticos Staphylococcus saprophyticus,
Corynebacterium jeikeium
Especies de Acinetobacter
Bacillus Pseudomonas aeruginosa y Agar Cetrimide
otras Pseudomonas
ción y movilidad. En presencia de las mismas, se puede realizar

una coloración de Gram al sedimento que deberá coincidir
con las bacterias que desarrollen en el cultivo. En la práctica
raramente se recurre a realizar este paso.
Siembra
Luego de homogeneizar la muestra se siembran 20 µl
de orina con ansa calibrada en los medios adecuados. Esto
nos permite realizar el conteo viable y expresar el resultado en
Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml). Por
ejemplo: si desarrollan 100 colonias x 200 = 2 x104 UFC/ml.
En la práctica la muestra se siembra en medio CLDE,
utilizándose otros medios de cultivo en caso de sospecha de una
infección bacteriana específica. Para esto, es necesario siempre
mantener la muestra de orina refrigerada, hasta terminar el
estudio bacteriológico. De esta forma si es necesario recurrir
a una nueva siembra puede realizarse a partir de la muestra
refrigerada. Se utiliza agar sangre en caso de sospechar de
microorganismos exigentes.
Antibiograma
Se realiza por el método de difusión en agar y se prueban
antimicrobianos específicos para infección urinaria: ampicilina,
cefalotina, trimetoprima-sulfametoxazol, nitrofuranos, fluoro-
quinolonas, ácido nalidíxico, gentamicina, cefalosporinas de
tercera generación.
Conteo viable a partir de orina

Este método permite tener una aproximación de la can-
tidad de bacterias que se encuentran en la muestra de orina.
Este dato es importante ya que, si bien la orina es estéril, en
99
el proceso normal de micción, al pasar por la uretra se con-

tamina con las bacterias presentes en ésta, en el prepucio o
vulva. Debido a esto, se considera infección urinaria cuando
el número de bacterias supera 103 UFC/ml. Es importante
además tener en cuenta las condiciones de conservación de
la muestra, si bien debería mantenerse refrigerada, suele su-
ceder que no llegue en esta forma al laboratorio, por lo que
el número de bacterias puede ser mayor por un proceso de
reproducción bacteriana.
COPROCULTIVO
El estudio bacteriológico de la materia fecal se denomina
coprocultivo. Se recomienda realizar un coprocultivo en el caso
de diarreas u otros trastornos digestivos, como así también en
animales hospitalizados bajo tratamiento. Estos animales no
responden fácilmente a la terapia a consecuencia de que sus
mecanismos específicos de defensa contra la infección se hallan
deprimidos por la excesiva secreción endógena de esteroides o
por la administración de dosis elevadas de esteroides sintéticos.
Esto puede aplicarse, por ejemplo, a los equinos enfermos de
salmonelosis que, con frecuencia es una enfermedad ocasio-
nada como consecuencia de una cirugía mayor.
Toma de muestra
Limpiar los alrededores del ano con solución fisiológica
estéril, humedecer un hisopo de algodón en caldo nutritivo e
introducirlo en el recto. En animales grandes por tacto rectal,
se puede enviar la materia fecal dentro del guante. Se puede
enviar en un frasco estéril o tomar un hisopado directamente
de esta.
Cuando se sospeche de Salmonella spp. como agente
causal, tomar varias muestra de heces a lo largo del día, por-
que el resultado negativo de una muestra que fue sembrada
en medios sólidos no es concluyente. En este caso mejor que
utilizar hisopos, se debe recoger mayor cantidad de heces fecal
del recto por manipulación digital. Para favorecer el crecimien-
to selectivo de Salmonella, es más adecuado cultivar material
fecal en caldo de preenriquecimiento como agua peptonada
bufferada, luego en caldo de enriquecimiento como caldo te-
trationato y luego a medio sólido selectivo y diferencial como
agar entérico hektoen e incubar la placa por 24-48 h a 37 ºC
(para más detalles ver Salmonella).
100
MUESTRAS DE APARATO RESPIRATORIO
Muchos Géneros bacterianos producen infecciones
respiratorias en diferentes especies animales (Staphylococcus
spp., Streptococcus spp., Pasteurella spp., etc). Las muestras
que se pueden enviar al laboratorio cuando se sospecha de
una infección respiratoria en los animales son: hisopado de la
cavidad nasal (si hay mucha secreción externa limpiar la nariz
y luego introducir el hisopo en la cavidad nasal). Si el animal
murió y se le realiza la necropsia se puede enviar: tráquea,
bronquios y pulmón, enteros o una sección de los mismos. Al
llegar al laboratorio el pulmón será sumergido en alcohol y se
flamea en la llama del mechero Bunsen. Luego se coloca en
un mortero con solución fisiológica estéril y se macera con el
pilón. Se toma una o dos ansada del interior del mortero y se
siembra en agar sangre, agar chocolate y EMB. Se incuban
por 24-48 h a 37 ºC y continua la marcha bacteriológica de
acuerdo al microorganismo presente en la muestra. En el caso
de recibir tráquea o bronquio, se corta el órgano y se pasa
un hisopo embebido en solución fisiológica estéril o caldo
peptonado por el interior. Luego se siembra en los medios de
cultivos ya descriptos. El hisopo de cavidad nasal se siembra
directamente en los medios de cultivo.
OTOCULTIVO
Concepto de otitis externa
La otitis externa se define como la inflamación aguda o
crónica del epitelio que reviste el canal auditivo externo, pu-
diéndose extender hacia el pabellón auricular. En Medicina
Veterinaria si bien todas las especies animales pueden padecer
de una otitis, los caninos son los más afectados y dentro de
estos existe una predisposición racial. Se presenta con mayor
frecuencia (80%) en perros de orejas péndulas como el Cani-
che Miniatura, Cocker Spaniel y Labrador. Los ejemplares de
estas razas poseen orejas largas, con abundante crecimiento
piloso en el canal auditivo y pabellones que se pliegan hacia
abajo, restringiendo la circulación de aire y activando con esto
las infecciones. Entre las razas de orejas erectas, el Ovejero
Alemán es la más predispuesta a padecer otitis.
En la epizootiología de la otitis externa, podemos esta-
blecer causas:
1) Primarias: éstas causan la inflamación inicial como
por ejemplo, objetos extraños, tales como aristas vegetales
101
(«colas de zorro») en los perros que frecuentan campos, pará-

sitos como el Otodectes cynotis, Sarcoptes scabiei y Demodex
e hipersensibilidad como atopía.
2) Predisponentes: la conformación del canal auricular,
enfermedades obstructivas (pólipos), humedad persistente
luego de baños o inmersiones, ya que al aumentar el conteni-
do hídrico del estrato córneo disminuye la protección normal
del mismo, pudiendo llegar a la maceración, lo que crea un
medio excelente para la multiplicación de bacterias y hongos.
También en los perros que viajan en vehículos y sacan la ca-
beza hacia afuera.
3) Causales: microorganismos (bacterias y hongos) y
otitis media. La otitis externa bacteriana primaria es de muy
baja incidencia, pero si se crea un ambiente propicio, ya sea
por una anatomía predispuesta o por alteraciones en el medio
ambiente del canal auricular, una vez que se inicia la inflama-
ción, se producen las infecciones secundarias.
Toma de muestra
Para realizar el diagnóstico de las otitis externas en el
laboratorio se lleva a cabo la técnica del otocultivo. El pri-
mer paso es la obtención de la muestra en forma estéril de
un paciente sin previa terapia antibiótica o de lo contrario,
suspender la misma 4 a 5 días antes de la toma. Para hacer
la extracción de la muestra se debe realizar una limpieza del
pabellón auricular con alcohol (solución fisiológica estéril) y
luego secar la zona con gasa estéril a efectos de no contaminar
la muestra. Se utiliza un hisopo comercial que viene separado
del medio de transporte en dos tubos de plásticos cerrados al
vacío. De esta manera podemos utilizar el envase donde viene
el hisopo estéril, cortando el extremo inferior, como cobertor
y convertirlo en un hisopo cubierto. Así colocamos el cobertor
en el orificio del conducto auditivo externo (CAE) e introduci-
mos con una pinza desde el otro extremo el hisopo en el CAE,
realizamos movimientos rotatorio suaves e introducimos el
hisopo nuevamente en el cobertor. Inmediatamente después
colocamos la muestra en el envase que contiene el medio de
transporte (medio Stuart).
Una vez obtenida la muestra se debe enviar al labora-
torio antes de las 24 h, acompañada de una breve anamnesis
con los datos del paciente (raza, sexo, edad -ver protocolo de
envío de muestra).
102
Siembra
Cuando la muestra llega al laboratorio se realiza la siem-
bra en medios enriquecidos (agar sangre) y medios selectivos
(agar EMB o agar MacConkey), con el hisopo en el primer
trazo y luego se disemina la muestra en un segundo, tercer y
cuarto trazo con el ansa de anillo previamente esterilizada en
la llama del mechero Bunsen. El objetivo de este paso es la
obtención de colonias aisladas en el tercer o cuarto trazo para
la observación clara de la morfología. Estas placas se incuban
a 37 ºC durante 24 h.
Una vez terminada la siembra, se realiza un extendido
con el hisopo de la muestra sobre un portaobjetos bien limpio y
desengrasado (con alcohol). Se fija tres veces sobre la llama del
mechero y se realiza la primera coloración de Gram se observa
con objetivo de inmersión (observación microscópica directa).
Este paso es fundamental ya que nos indica la presencia de
células, bacterias y hongos (Malassezia spp.). Cabe aclarar que
muchas otitis son resistentes por la presencia de este último
microorganismo mencionado, por omitir su diagnóstico con la
observación directa.
Pasadas las 24 h de incubación se retiran las placas
sembradas de la estufa de cultivo, para observar si hubo o
no crecimiento bacteriano. Un cultivo se considera negativo
como tal, a los efectos de las bacterias patógenas de interés
veterinario, cuando no existe crecimiento después de 48 h de
incubación.
Si a las 24 o 48 h se observa crecimiento bacteriano se
realiza la segunda coloración de Gram, tomando una colonia
desarrollada en el 3º o 4º trazo. De acuerdo a la morfología y
tinción obtenida se sigue la marcha ya indicada. Por último se
realiza el antibiograma con los antibióticos en forma de mono-
discos o multidiscos de acuerdo al microorganismo aislado.
En la siguiente tabla se enumeran los microorganismos
más comúnmente aislados en otocultivos.
Microorganismo Gram Morfología

Streptococcus pyogenes + coco
Staphylococcus aureus + coco
Pseudomonas aeruginosa - bacilo corto
Proteus mirabilis - bacilo corto
Escherichia coli - bacilo corto
103
MUESTRAS DE PIEL Y HERIDAS

Las infecciones de heridas, tanto de origen endógeno
como exógeno, son generalmente debidas a bacterias y oca-
sionalmente a micobacterias y hongos.
La muestra debe ser representativa del proceso infec-
cioso, por ejemplo los microorganismos aislados del orificio
de una fístula no reflejan la etiología de la misma sino que
normalmente son contaminantes. Como premisa debe reco-
gerse una cantidad suficiente de muestra para asegurar un
examen apropiado.
La toma de muestra con hisopos estériles tiene la ventaja
de ser económica y fácil, pero la desventaja está principalmente
en la escasa cantidad de muestra, insuficiente para realizar
cultivos múltiples, ya que solamente se recupera el 10% de
las bacterias contenidas en él. Estos no son válidos para re-
cuperación de bacterias anaerobias, por lo que se prefiere la
punción aspiración en aguja y jeringa estéril.
Toma de muestra
Para llevar a cabo la toma de muestra debe realizarse
una limpieza de la zona con solución fisiológica estéril a efec-
tos de eliminar las costras, detritus celulares y secreciones
muy purulentas. Una vez limpia la herida ya sea quirúrgica o
traumática se realiza la punción.
Las biopsias pueden ser necesarias cuando las heridas
son crónicas, así como quemaduras y heridas traumáticas,
tras la limpieza y debridación de las mismas. Deben enviarse
en recipientes estériles de origen comercial.
Todas las muestras deben identificarse con los datos
del paciente y acompañarse de una breve anamnesis con las
indicaciones del análisis solicitado y enviarse inmediatamente
al laboratorio de microbiología en forma refrigerada.
Siembra
Una vez llegada la muestra al laboratorio, se realiza la
siembra en medios enriquecidos (agar sangre) y selectivos
sólidos (agar EMB o MacConkey) con el hisopo haciendo el
primer trazo y luego la diseminación con el ansa en anillo.
En el caso de biopsias se toma una pinza y tijera estériles, se
realiza un corte de superficie y se siembra por contacto con la
parte profunda del corte sobre los mismos medios.
Luego se hace un extendido para efectuar la coloración
104
de Gram. Se incuban las placas sembradas a 37 ºC durante 24
h siguiendo todos los pasos de la marcha general. Es impor-
tante recordar que si sospechamos de anaerobios deberíamos
sembrar en medios y condiciones anaeróbicas.
Enfermedades bacterianas y microorganismos aerobios
aislados en piel en las diferentes especies. Los microorganis-
mos que habitualmente producen infecciones en diferentes
especies animales son: Staphylococcus spp., Streptococcus
spp., Pseudomonas spp. En porcinos en caso de erisipela cu-
tánea se aísla Erysipelothrix rhusiopathiae. También producen
infecciones cutáneas en esta especie Streptococcus equisimilis
y Staphylococcus hyicus que produce dermatitis exudativa.
MUESTRAS DE LECHE
Se denomina mastitis a la infeccion o inflamacion de la
glándula mamaria, la cual puede producirse por diferentes
causas: físicas, químicas o biológicas. Esta última es la más
importante y dentro de los microorganismos los principales
productores de mastitis son las bacterias. En la actualidad
se reconocen más de 100 especies bacterianas como agentes
etiológicos de mastitis subclínicas y clínicas. La mastitis sub-
clínica es la forma de la enfermedad en la cual no se observan
cambios detectables en la glándula mamaria y no hay cambios
o anormalidades en la leche. Sin embargo, puede detectarse
la presencia de bacterias productoras de mastitis mediante
el cultivo de muestras de leche, como así también procesos
inflamatorios de la glándula mamaria mediante la utilización
de pruebas especiales como el conteo celular somático. La
mastitis clínica es la condición en la cual los procesos infla-
matorios de la glándula mamaria y anormalidades en la leche
son fácilmente observables. Por ejemplo: la mama se encuentra
inflamada, hay dolor al tacto, enrojecimiento y se encuentra
caliente. Los cambios en la leche consisten en flóculos, coágu-
los, pus o leche de apariencia acuosa son los que se observan
con mayor asiduidad.
Toma de muestra
Antes de recolectar una muestra de leche es imprescin-
dible desinfectarse las manos y secarlas antes de manipular
la glándula mamaria. Las mamas sucias tienen que ser lava-
das con agua, secadas con papel, desinfectadas con alcohol
(principalmente los pezones) y dejar que se evapore el alcohol.
105
Descartar los primeros chorros de la leche que se encuentran

contaminados con bacterias de la piel. Es conveniente observar
la leche en busca de anormalidades tales como pus o coágulos.
Se debe tener mucho cuidado de no tocar el pezón desinfec-
tado antes de tomar la muestra. Destapar el frasco colector y
colocarlo en un ángulo de 45º mientras se recoge la muestra.
Una muestra representativa debe contener como mínimo 1 a
2 ml de cada cuarto mamario. La muestra debe ser tomada
del cuarto afectado o de los 4 cuartos según la finalidad del
estudio. El frasco colector debe tener un cierre hermético y se
debe completar hasta ¾ de su capacidad. La muestra debe
enviarse refrigerada o congelada y debe estar perfectamente
identificada: propietario o establecimiento, identificación de
la vaca, cuarto muestreado o leche compuesta (4 cuartos) y
la fecha de remisión. También se puede analizar la leche de
tanque que es la del conjunto de vacas en ordeñe.
Siembra
Se recomienda sembrar los siguientes medios de cultivo:
1) agar sangre, para la búsqueda de bacterias nutricionalmente
exigentes, 2) EMB, para la búsqueda de enterobacterias, 3)
agar manitol salado, para la busqueda de Staphylococcus, 4)
medio de Edwards para la busqueda de Streptococcus. Previo
a la siembra de la muestra se debe agitar la leche, luego se
siembran 10 ml (0,01 ml) de leche en cada medio de cultivo,
a excepción del EMB en el cual se siembran 100 ml (0,1 ml)
debido a que frecuentemente se encuentran menos de 100
bacterias por ml. Finalmente se incuban las placas a 35-37 ºC
por 24-48 horas, si es necesario se puede prolongar el periodo
de incubación según la bacteria en estudio. Se recomienda
leer el anexo II en el cual se detallan los componentes de cada
uno de estos medios de cultivo y como se realiza la lectura e
interpretación del desarrollo bacteriano.
Entonces, es posible aislar diferentes bacterias que
deben ser identificadas mediante pruebas bioquímicas. Entre
estas bacterias se inclyen Streptococcus, Staphylococcus, co-
liformes. Otras bacterias, como por ejemplo Mycoplasma, son
muy exigentes para crecer y su aislamiento e identificación se
realiza en laboratorios especializados.
106
Principales bacterias productoras de mastitis
Las bacterias con capacidad de causar mastitis se pue-
den dividir en dos grupos de acuerdo al origen de la infección:
A) patógenos contagiosos y B) patógenos ambientales.
A) Patogenos contagiosos. Los patógenos contagiosos
ingresan a la glándula mamaria a través del canal del pezón.
Se encuentran bien adaptados para sobrevivir y crecer en
la mama y causan infecciones que pueden durar semanas,
meses o años. La glándula infectada es la principal fuente de
infección de los patógenos contagiosos en un rebaño lechero
y la transmisión a un cuarto infectado u a otro animal ocurre
principalmente durante el ordeñe.
A.1- Streptococcus agalactiae
Es un agente común de mastitis cuya erradicación de un
rebaño lechero es posible. Muchas vacas infectadas muestran
pocos signos clínicos de mastitis como leche anormal, pero
usualmente tienen altos conteos de células somáticas. Un
descenso de la producción lechera casi siempre acompaña a
la infección. La mastitis causada por Streptococcus agalactiae
puede ser sospechada si en el animal o en la leche de tanque
los conteos de células somáticas comienzan a aumentar y se
mantienen altos, especialmente cuando la leche de tanque tiene
un recuento de 1.000.000 células/ml o más alto. Ocasional-
mente, altos conteos bacterianos en la leche ocurren cuando
la glándula infectada disemina gran cantidad de Streptococcus
agalactiae en la leche.
A.2- Staphylococcus aureus
Es mucho más difícil de erradicar que el Streptococcus
agalactiae, pero se puede llegar a controlar. La glándula in-
fectada es el principal origen de la infección. Rápidamente
coloniza la piel lesionada del pezón y el canal del pezón y pasa
a la glándula mamaria. La mastitis causada por Staphylococcus
aureus produce más daño al tejido mamario que el Strepto-
coccus agalactiae y disminuye la producción lechera hasta el
45% por cuarto y un 15% por vaca infectada. No se observan
generalmente altos conteos bacterianos en la leche de tanque
en mastitis producidas por S. aureus. Sin embargo, cuando el
número de vacas infectadas aumenta, el conteo celular somá-
tico aumenta, resultando en una pérdida de la calidad de la
leche. Rebaños con recuentos celulares somáticos de la leche
de tanque con 300.000 a 500.000 células/ml frecuentemente
tienen una alta prevalencia de S. aureus. La bacteria daña el
107
tejido secretorio mamario, se profundiza la infección, forma

abscesos y finalmente amuralla o tabica la bacteria por forma-
ción de cicatrices en el tejido mamario. Este último fenómeno
es parcialmente responsable por la baja tasa de curación de
las infecciones producidas por S. aureus en la terapia antibió-
tica de la mastitis. Por lo tanto, en estadios tempranos de la
infección, el daño es mínimo y reversible. Cuando se forman
los abscesos mamarios, liberan S. aureus que comienzan el
proceso infeccioso en otras áreas de la glándula y se produce
un daño irreversible de la mama.
A.3- Mycoplasma spp.
Es un microorganismo altamente contagioso. Es mu-
chísimo menos común que la infección por S. aureus y S.
agalactiae y generalmente es diagnosticado cuando la terapia
antibiótica no funciona.
B) Patógenos ambientales. Los patógenos ambientales

primarios incluyen dos tipos de bacterias: los coliformes y
las especies de Streptococcus que “no-agalactiae”. Estos otros
Streptococcus son referidos como “Streptococcus ambienta-
les”, y entre las especies de mayor importancia se encuentran
Streptococcus dysgalactiae y Streptococcus uberis. La fuente
primaria de los patógenos ambientales son los alrededores de
los corrales y galpones donde se alojan las vacas.
B.1- Coliformes. Las bacterias coliformes que causan

mastitis incluyen: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Kle-
bsiella oxytoca y Enterobacter aerogenes. La tasa de infección
por coliformes es aproximadamente cuatro veces más elevada
durante el período de secado que durante la lactación.
B.2- Streptococcus “ambientales”. La tasa de nuevas

infecciones (el número de nuevas vacas infectadas por día) es
más alto durante el período de secado que durante la lacta-
ción. Sin terapia antibiótica en el secado, la tasa de infección
se incrementa dramáticamente en las primeras dos semanas
del secado y luego durante las dos semanas previas al parto.
108
FAMILIAS BACTERIANAS DE
IMPORTANCIA CLINICA EN
MEDICINA VETERINARIA
1. Familia Streptococcaceae
1.1. Género Streptococcus
Características generales
Las especies del Género Streptococcus son cocos gram-
positivos que se agrupan de a pares o en cadenas, son inmó-
viles, no esporulados y algunas especies pueden presentar
cápsula. Son anaerobios facultativos y para algunas especies
es necesario incubarlos en atmósfera con dióxido de carbono.
Requieren para su crecimiento medios ricos en nutrientes como
agar sangre o agar chocolate y no crecen en medios básicos
como agar tripticasa de soja y agar nutritivo. Son catalasa
negativos. Las especies del Género Streptococcus presentan
una considerable variedad ecológica, fisiológica, serológica y
genética. Estas especies se dividen en dos grandes grupos de
acuerdo a sus características hemolíticas: 1) beta-hemolíticos
y 2) alfa hemolíticos. Entre los primeros se incluyen S. pyoge-
nes, S. agalactiae, S. dysgalactiae subespecie dysgalactiae, S.
dysgalactiae subespecie equisimilis, S. equi subespecie equi, S.
equi subespecie zooepidemicus, y S. canis. Entre las especies
de Streptococcus alfa-hemolíticos se incluyen S. pneumoniae, S.
bovis, S. equinus, S. gallolyticus, S. infantarius, S. pasterianus,
S. lutetiensis, S. suis, S. viridans, S. mutans, S. salivarius, S.
anginosus, S. sanguinis, y S. mitis.
La envoltura y la pared celular de Streptococcus spp.
recuerdan a las correspondientes de Staphylococcus spp. La
cápsula, si es que existe, es polisacarídica y anti-fagocítica,
en S. pyogenes y de S. equi está formada por ácido hialurónico
no antigénico y constituye la base para la tipificación de S.
pyogenes.
S. pneumoniae y S. agalactiae poseen una cápsula con
antígenos diferentes que constituyen la base de su serotipifi-
cación. De las varias proteínas de la pared celular, la proteína
M es antifagocítica (S. pyogenes- Streptococcus spp. del grupo
A) y es posible que actúe como adhesina (S. equi). Los grupos
serológicos de Lancefield, uno de los pasos en la identificación
109
de Streptococcus spp., están definidos por los polisacáridos de

la pared celular (sustancia C, antígeno de grupo) y se designan
mediante letras mayúsculas (de la A a la V).
Factores de virulencia
Entre los factores de virulencia del Género Streptococcus
se encuentran las fimbrias, la cápsula, la pared, y numerosas
toxinas.
Las fimbrias son las adhesinas de varias especies de
Streptococcus. Los peptidoglicanos de la pared bacteriana
pueden provocar inflamación, fiebre y la multiplicación de
los linfocitos, in vitro se comporta como dermonecrótico y
citotóxico.
Las exotoxinas de S. pyogenes incluyen las hemolisinas
(estreptolisinas C y S), la hialuronidasa, la DNAsa, la NADasa,
la proteasa, la estreptoquinasa (una fibrinolisina) y una toxina
pirógena codificada en fagos, responsable del sarpullido de la
escarlatina en el humano. La mayoría de estas toxinas inducen
respuestas inmunes a lo largo de la infección. En Streptococcus
spp. de origen animal existen toxinas equivalentes. Los efectos
sobre el agar sangre se utilizan para dividir a Streptococcus
spp. en tres grupos:
1. Streptococcus spp. alfa-hemolíticos no destruyen los
eritrocitos pero originan un halo alrededor de las colonias en
el que el agar sangre adquiere un tono verde. La mayoría de
las especies de Streptococcus comensales de los animales son
alfa-hemolíticos.
2. Streptococcus spp. beta-hemolíticos destruyen los
eritrocitos y producen halos de claridad transparente alre-
dedor de las colonias. La mayoría de los tipos patógenos son
beta-hemolíticos.
3. Streptococcus spp. gamma son anhernolíticos. La
mayoría son apatógenos.
Si bien el término «viridans» significa enverdecimiento, el

grupo viridans de Streptococcus se define por sus reacciones
bioquímicas y comprende a los tipos gamma y alfa. La acción
del factor CAMP combinada sobre el agar sangre produce zo-
nas de hemólisis de mayor tamaño y más transparentes que
cualquiera de los dos agentes solos. Esta reacción tiene valor
diagnóstico (ver Anexo III).
Principales enfermedades causadas por las especies del
110
Género Streptococcus.
1. Infecciones de las vías respiratorias altas con linfoade-
nitis (caballos, cerdos, gatos, cobayos, humanos), sobre todo
en los individuos jóvenes.
2. Infecciones respiratorias de los recién nacidos e infec-
ciones septicémicas de los potros, los lechones, los cachorros
y de los bebés.
3. Neumonías secundarias y complicaciones (caballos,
primates, pequeños carnívoros, humanos).
4. Infecciones piógenas no relacionadas con el tracto
respiratorio (infecciones del tracto génito urinario, mastitis
bovina).
Los animales de sangre caliente contienen una micro-
biota residente de Streptococcus spp. en las mucosas de las
vías respiratorias altas, del tracto genital inferior y de la mayor
parte del tracto alimentario.
Morfología y tinción
Las especies del Género Streptococcus tienen una forma
esférica característica y en algunas circunstancias se pueden
observar de forma alargada muchas veces por el uso de anti-
bióticos. Miden aproximadamente 1 µm de diámetro. Se dividen
en un solo plano, agrupándose de a pares o en cadenas. La
formación de cadenas es variable, aunque algunas especies (S.
equi) siempre las forman. Los cultivos jóvenes son gramposi-
tivos. En los exudados y en los cultivos viejos, de más de 18
h, los microorganismos se tiñen con frecuencia como gram-
negativos. Algunas especies poseen cápsula, principalmente
S. pneumoniae, y otras poseen fimbrias. En la mayoría de las
especies de Streptococcus spp., excepto en S. equi, existen sub-
divisiones serológicas. S. pyogenes tiene unos 70 inmunotipos,
basados en la proteína M y en otras proteínas, mientras que
S. pneumoniae tiene más de 80 tipos capsulares. Cuando S.
equi pierde la cápsula, sus colonias mucoides se convierten
en colonias lisas. En S. pyogenes este cambio de la forma lisa
a la rugosa va acompañada de la pérdida de la proteína M y
de la virulencia. También existen formas L.
Características culturales
Debido a la incapacidad de este Género bacteriano de
generar muchos aminoácidos y vitaminas, el grado de exigen-
cia varía según la especie. Habitualmente se utilizan medios
111
de cultivo a los que se le agregan sangre o suero del 5% al

10%. También se pueden emplear medios selectivos como por
ejemplo: agar Parcker con azida sódica. El medio selectivo
y diferencial para el aislamiento de Streptococcus spp. es el
medio de Edwards.
En los medios sólidos las colonias de Streptococcus spp.
son pequeñas (a diferencia de Staphylococcus spp.) de forma
redonda con bordes regulares y convexos, transparentes u
opacas, con un diámetro que varía de 0,5 a 2 mm. Las cepas
capsuladas dan colonias de tipo mucoide. Se desarrollan a
partir del 1º al 3º día de incubación a 37 ºC. Son anaerobios
facultativos y se logra un mejor crecimiento de algunas cepas
cuando se incuban en tensión reducida de oxígeno atmosférico
o con una concentración de dióxido de carbono del 3 al 10%.
Las especies del Género Streptococcus spp. tienen ne-
cesidades de crecimiento bastante exigentes que son ade-
cuadamente satisfechas por los medios que contienen sangre
o suero. Algunas especies de Streptococcus, variantes en el
aspecto nutritivo (NWS-Streptococo nutricionalmente variable)
necesitan una suplementación de clorhidrato de piridoxal al
0,002%.
Tras su incubación a 37 ºC durante toda la noche,
Streptococcus spp. crece formando colonias transparentes,
que generalmente tienen un diámetro de menos de 1 mm.
Las especies capsuladas, como por ejemplo S. equi, producen
colonias de mayor tamaño y de aspecto mucoide. Las especies
patógenas crecen mejor a 37 ºC.
Identificación bioquímica y fisiológica

La primera característica a ser evaluada frente a un coco
grampositivo es la presencia de catalasa. Las especies de Strep-
tococcus son catalasa negativas y se diferencian rápidamente
de Staphylococcus spp. que son catalasa positiva (Anexo III).
Luego es imprescindible evaluar la tolerancia a medios con
sales biliares al 40% y con cloruro de sodio al 6,5%, ya que las
especies de Streptococcus son negativas para ambas pruebas en
las cuales las especies de Enterococcus pueden desarrollar.
Algunas especies de Streptococcus de interés en veteri-
naria, particularmente por producir mastitis bovina son: S.
agalactiae, S. dysgalactiae subespecie dysgalactiae, S. uberis
y S. bovis. En la siguiente tabla se presentan las pruebas bio-
químicas mediante las que se pueden diferenciar.
112
Especie
Prueba
S. agalactiae S. dysgalactiae S. uberis S. bovis
CAMP + - V -
Voges Proskauer + - + +
Fermentación de sorbitol - V + -
Esculina - - + +
S. pyogenes y S. canis son especies relacionadas con infec-

ciones en pequeños animales. En la siguiente tabla se pre-
sentan las pruebas bioquímicas mediante las que se pueden
diferenciar.
Especie
Prueba
S. pyogenes S. canis
Hemólisis beta Beta
Fermentación de trehalosa + -
Fermentación de lactosa + -
CAMP - +
S. equisimilis, S. equi y S. zooepidemicus son especies

relacionadas con enfermedades en equinos. En la siguiente
tabla se presentan las pruebas bioquímicas mediante las que
se pueden diferenciar.
Especie
Prueba
S. equisimilis S. equi S. zooepidemicus
Hemólisis beta beta Beta
Fermentación de trehalosa + - -
Fermentación de sorbitol - - +
Fermentación de lactosa - +
S. porcinus y S. suis son especies relacionadas con infec-

ciones en cerdos. En la siguiente tabla se presentan las pruebas
bioquímicas mediante las que se pueden diferenciar.
S. suis S. porcinus
Hemólisis - /α β
Voges-Proskauer - +
Na Cl 6% - +
Lactosa + -
Inulina + -
Manitol - +
Sorbitol - +
CAMP - +
113
Resistencia
Los Streptococcus spp. beta-hemolíticos son capaces de
sobrevivir durante semanas en el pus seco. A temperaturas
comprendidas entre 55-60 ºC son destruidas en un plazo de
30 min, y son inhibidos por las concentraciones de cloruro
sódico del 6,5% y de bilis del 40% (excepto S. agalactiae),
del 0,1% de azul de metileno, así como por las temperaturas
bajas (10 ºC) y elevadas (45 ºC). Los Streptococcus del grupo
viridans son distintos en cuanto a su resistencia al calor y a
la bilis. Únicamente S. pneumoniae es soluble en bilis. Los
Streptococcus spp. toleran la azida sódica a una concentra-
ción del 0,002%, que es la que se utiliza en los medios para el
aislamiento de esta especie bacteriana. Los Streptococcus spp.
patógenos suelen ser sensibles a las penicilinas, a las cefalos-
porinas, a la eritromicina, al cloramfenicol y a las asociaciones
trimetroprima sulfamidas; algunas cepas son resistentes a los
aminoglucósidos y a la tetraciclina.
1.2. Género Enterococcus

El Género Enterococcus es ubícuo en la materia fecal de
humanos y animales, en el agua, en plantas y en alimentos
de origen animal, como por ejemplo, en la leche. Su hábitat es
el intestino de humanos y animales. Son causantes de neu-
monías, mastitis, vaginitis, endocarditis, septicemia. Dentro
del Género Enterococcus las especies de mayor importancia
por su poder patógeno son: E. faecalis, E. faecium y E. bovis.
Son muy parecidos a las especies del Género Streptococcus
(antiguamente pertenecían a este Género bacteriano). Son muy
resistentes ya que crecen a temperaturas de 45 °C, en medios
con bilis al 40%, en caldo con una concentración del 6,5% de
cloruro de sodio y a pH 9,5.
A continuación se muestra una tabla con los caracteres
bioquímicos y fisiológicos para la identificación de E. faeca-
lis, E. faecium y E. bovis, las especies de importancia clínica
veterinaria.
114
Especies
Prueba
E. faecalis E. faecium E. bovis
PYR + + -
Producción de arginina decarboxilasa + + -
Hidrólisis del almidón - - +
Piruvato + - -
Fermentación de Arabinosa - + V
2. Familia Micrococcaceae
2.1. Género Staphylococcus
Los integrantes del Género Staphylococcus, son cocos
grampositivos, de 0,5-1,5 µm de diámetro, catalasa y coagu-
lasa positivo, que se encuentran aislados, en pares, tétradas
o formando racimos irregulares. Son inmóviles, anaerobios
facultativos, no formadores de esporos, generalmente no
capsulados o con limitada formación de cápsula. El Género
Staphylococcus se compone actualmente de 33 especies, 17
de las cuales pueden ser encontradas en la piel y las mucosas
del hombre y los animales. La colonización de determinadas
especies de Staphylococcus es especie-específica, S. hyicus
afecta al ganado porcino y S. intermedius a perros y gatos.
Asimismo, esta especie fue aislada en el hombre a partir de
heridas producidas por mordeduras de perros. S. delphini y
S. felis causan procesos infecciosos en delfines y gatos do-
mésticos, respectivamente. Algunos de los Staphylococcus
patógenos para el hombre y los animales producen la enzima
coagulasa. Entre los Staphylococcus coagulasa positivos se
debe diferenciar a S. aureus subesp. aureus, de S. aureus
subesp. anaerobius, S. coagulans, S. hyicus, S. intermedius,
y S. delphini. Entre los Staphylococcus coagulasa negativos
aislados con mayor frecuencia en infecciones se encuentran
S. epidermidis y S. saprophyticus.
Las cepas de S. aureus presentan una amplia gama de
factores de virulencia:
1. Proteínas de superficie que promueven la colonización
de tejidos del hospedador.
2. Invasinas que promueven la difusión bacteriana en
los tejidos (leucocidina, quinasas, hialuronidasa)
115
3. Factores de superficie que inhiben la fagocitosis (cáp-

sula, Proteína A)
4. Propiedades bioquímicas que refuerzan su superviven-
cia en los fagocitos (carotenoides, producción de catalasa).
5. Enmascaramiento inmunológico (Proteína A, coagu-
lasa, factor coagulante).
6. Las toxinas perjudiciales de membrana que lisa la
membrana celular eucariótica (hemolisinas, leucotoxina, leu-
cocidina).
7. Exotoxinas que dañan los tejidos del hospedador o por
otra parte provoca síntomas de enfermedad (toxina-alfa, toxina-
beta, toxina-delta, toxina-gamma, toxinas exfoliativas).

Género Staphylococcus
Las infecciones causadas por Staphylococcus spp. pue-
den ser endógenas o exógenas, por inhalación, por contacto
directo o por ingestión. Portadores sanos e infectados actúan
como reservorios. En general, Staphylococcus spp. participa
en procesos purulentos como osteomielitis, artritis, absesos,
conjuntivitis, otitis, piómetra, infecciones urinarias, y flemo-
nes. S. aureus causa una variedad de infecciones supurativas
(formadoras de pus) y enfermedades toxigénicas en humanos
y animales, causa lesiones superficiales como tumoraciones,
orzuelos y furunculosis; infecciones más serias como neu-
monía, mastitis, flebitis, meningitis e infecciones del tracto
urinario; profundas, como osteomielitis, botriomicosis y
endocarditis. S. aureus es causa principal de la infección de
heridas quirúrgicas e infecciones adquiridas en los hospitales.
S. intermedius causa diferentes infecciones en perros y gatos,
como por ejemplo absesos, piodermias, otitis, conjuntivitis y
mastitis. S. hyicus produce epidermitis exudativa y poliartritis
en cerdos. Las especies de Staphylococcus coagulasa negativa
aislados con mayor frecuencia en procesos infecciosos de los
animales, particularmente asociados con mastitis en bovinos,
son: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. chromogenes, S. hae-
molyticus, S. carnosus, S. simulans y S. xylosus. En cabras, S.
epidermidis, S. caprae y S. chromogenes.
Staphylococcus spp. son células absolutamente esféricas
aproximadamente de 0,5 a 1,5 µm de diámetro. En las tinciones
116
directas de las muestras clínicas se encuentran aislados, en
pares o formando pequeñas cadenas. Cuando provienen de un
cultivo de agar nutritivo, los cocos se disponen en agrupaciones
que recuerdan un racimo de uvas. Esta disposición se debe a
que Staphylococcus spp. se divide en dos planos. La configu-
ración de los cocos ayuda a distinguir a Staphylococcus spp.
de Streptococcus spp. que son células ligeramente oblongas
que normalmente crecen en cadenas, ya que se dividen en
uno sólo plano.
Las especies del Género Staphylococcus no presentan exi-
gencias nutritivas. En medios sólidos forman colonias redondas
de 1 a 2 mm de diámetro, de contornos netos y superficie lisa,
opaca o mucoide. S. aureus forma una colonia amarilla bas-
tante grande en medio rico, S. epidermidis tiene una colonia
blanca relativamente pequeña. En agar sangre muchas espe-
cies de Staphylococcus son hemolíticas y producen una zona
de hemólisis alrededor de las colonias. S. aureus es a menudo
hemolítico en agar sangre, mientras que S. epidermidis no es
hemolítico. Staphylococcus spp. son anaerobios facultativos
que crecen por respiración aeróbica o por fermentación dando
principalmente ácido láctico. S. aureus pueden crecer en un
rango de temperatura de 15 a 45 ºC y a concentraciones de
cloruro de sodio tan altas como 15 %. S. aureus siempre debe
ser considerado un patógeno potencial; la mayoría de las cepas
de S. epidermidis son no patógenas y puede jugar un papel
proteccionista incluso en un hospedador como microbiota nor-
mal. El principal medio selectivo y diferencial utilizado para el
cultivo de Staphylococcus es el agar manitol salado.

Una vez que se obtuvo un cultivo puro, y se confirmó la
morfología típica del Género, se realizan las pruebas de catalasa
(positiva) y citocromo-oxidasa (negativa). Una vez identificado
el Género, las especies se agrupan en dos según la capacidad
de producir la enzima coagulasa. Las pruebas básicas para
diferenciar a Staphylococcus coagulasa positivos son: a) uti-
lización de carbohidratos (manitol, maltosa, trehalosa), y b)
Voges Proskauer. Los criterios básicos para la identificación
de Staphylococcus coagulasa negativos se basan en la incapa-
cidad de producir coagulasa, la prueba de citocromo-oxidasa,
Voges Proskauer, producción de ureasa, beta-galactosidasa y
117
la producción de ácido a partir de carbohidratos.
Voges Proskauer
Reducción de
Especie de
Trehalosa
Staphylococcus
Maltosa
Lactosa
Manitol
Manosa
nitrato
DNAsa
ONPG
aureus ssp. aureus + + + - + + + + +
aureus ssp. anaerobius + - - - + - ND - -
schleiferi ssp. coagulans + + + ND - V V + -
hyicus + - + - - + - + +
intermedius + - + + V V V + +
delphini - - + ND + + + + -

ND: no determinado. V: variable.
Resistencia
Staphylococcus spp. son las bacterias no esporuladas
con mayor capacidad de resistencia. En los exudados sopor-
tan la desecación durante semanas; mantienen la viabilidad
a -30°C en medios líquidos y a 60 °C, durante 30 min; tole-
ran las fluctuaciones de pH entre 4 y 9 y, como se mencionó
anteriormente, soportan altas concentraciones de cloruro de
sodio. Las especies de Staphylococcus spp. son inhibidas por
las sales biliares, colorantes bacteriostáticos, como el cristal
violeta, y por desinfectantes como la clorhexidina. Es impor-
tante considerar que Staphylococcus spp. puede presentar
resistencia a determinados antibióticos, entre los que se in-
cluyen las penicilinas, oxacilina, gentamicina, eritromicina,
cloranfenicol y tetraciclina.
3. Familia Enterobacteriaceae
La Familia Enterobacteriaceae agrupa un conjunto de
bacilos gramnegativos, no esporulados, aerobios o anaerobios
facultativos, que no producen la enzima citocromo-oxidasa.
Este último aspecto es fundamental en la clínica para dife-
renciarla de la Familia Pseudomonadaceae que es citocromo-
oxidasa positivo. Las especies de la Familia Enterobacteriaceae
se caracterizan por fermentar la glucosa y reducir los nitratos a
nitritos. Su hábitat natural es el intestino del hombre y de los
118
animales, entre los cuales hallamos saprófitos y patógenos que
provocan infecciones entéricas y septicémicas. Estos microor-
ganismos se encuentran en el agua, la tierra, los vegetales y
los alimentos. Pueden ser simbiontes, saprófitos o parásitos.
La Familia Enterobacteriaceae está compuesta por un número
importante de Géneros, cuya descripción detallada no es objeti-
vo de este libro. En Medicina Veterinaria y bajo el propósito de
esta obra los Géneros de mayor importancia son: Escherichia,
Salmonella, Klebsiella, Enterobacter y Proteus.
La mayoría de los organismos de la Familia Enterobacte-
riaceae comparten las siguientes características: son bacilos
gramnegativos de 2-4 µm por 0,4-0,6 µm, no esporulados y
algunas de las especies pueden ser móviles.
La morfología de las colonias es variable entre los di-
ferentes Géneros, se las puede hallar lisas y regulares, otras
tienden a invadir la placa (Proteus spp.) o pueden ser mucosas
(Klebsiella spp.). En general, no son microorganismos exigentes
y se pueden utilizar medios de cultivos selectivos y diferenciales
para separarlos de la microbiota acompañante. La temperatura
óptima de crecimiento es de 20-40 °C.

En la tabla siguiente se presentan las principales ca-
racterísticas de identificación utilizadas para separar algunos
Géneros de la Familia Enterobacteriaceae. Estas características
pueden ser utilizadas para categorizar un aislamiento descono-
cido en uno de los 14 Géneros tabulados. Las cuatro pruebas
bioquímicas básicas para la identificación de las especies de
la Familia Enterobacteriaceae son indol, rojo de metilo, Voges
Proskauer y citrato (IMViC). La distinción dentro del Género se
efectúa de igual forma, aunque teniendo en cuenta los criterios
determinantes de las diversas especies. Si bien, en la tabla
general se presenta la mayoría de los Géneros que conforman
la Familia Enterobacteriaceae, en esta obra se presentarán
las tablas para la identificación de las principales especies de
importancia en Medicina Veterinaria.
119
Características antigénicas
Las especies de la Familia Enterobacteriaceae poseen
diferentes antígenos:
1. Antígeno somático (O), está determinado por la natu-
raleza de los azucares de las cadenas laterales del lipololisa-
carido (LPS) de la membrana externa. Algunos cambios en la
longitud de esas cadenas laterales determinan si la cepa es lisa
(S) o rugosa (R). En las cepas R las cadenas son muy cortas o
inexistentes. Ello determina el aspecto de las colonias en me-
dios sólidos, las colonias S son brillantes, húmedas y de bordes
netos; y las R son secas, opacas y de bordes irregulares. Los
antígenos somáticos son termoestables y permiten clasificar
en serogrupos a las bacterias de una misma especie.
2. Antígeno flagelar (H), sólo se expresan en las cepas
móviles. Son proteínas específicas denominadas flagelinas,
termolábiles e inactivadas por el alcohol.
3. Antígeno capsular (K), son de naturaleza polisacárida
y no están presentes en todas las bacterias de esta Familia.
Características claves para la identificación de los principales Géneros

de la Familia Enterobacteriaceae
TSI
Género RM VP IND CIT FAD URE MOV LIS ARG ORN ONPG
Glu Lac SH2
Escherichia + + - + - + - - - V + V V +
Shigella + - - + - V - - - - - - V V
Edwardsiella + - + + - + - - - + + - + -
Salmonella + - + + - - + - - + + V + -
Citrobacter + V V + - V + - V + - V V +
Klebsiella + + - - + V + - + - + - - +
Enterobacter + + - - + - + - V + V V + +
Hafnia + - - V + - - - - + + - + +
Pantoea + - - V V V V V V + - - - +
Serratia + - - V + - + - - + + - + +
Proteus + - + + V V V + + + - - V -
Morganella + - - + - + - + + + - - + -
Providencia + - - + - + + + V V - - - -
Yersinia + - - + - V - - V - - - + +
TSI: triple azucar hierro, Glu: utilización de glucosa, Lac: utilización de lac-
tosa, SH2: ácido sulfhídrico. RM: rojo de metilo. VP: Voges Proskauer. IND:
120
producción de indol. CIT: crecimiento en agar citrato. FAD: producción de
fenilalanina desaminasa. URE: producción de ureasa. MOV: movilidad. LIS:
lisina decarboxilasa. ARG: arginina decarboxilasa. ORN: ornitina decarboxi-
lasa. ONPG: o-nitrofenil-beta-d-galactopiransido. V: variable.
Resistencia
Las especies de la Familia Enterobacteriaceae están
ampliamente distribuidas en el medio ambiente (suelo, agua,
plantas, alimentos, efluentes) y habitan el tracto intestinal de
los animales y del hombre. Sin embargo, algunas especies ocu-
pan nichos ecológicos muy limitados (Salmonella Gallinarum
en el intestino de las aves). Es importante considerar que las
especies de Enterobacteriaceae son excretadas en la materia
fecal al medio ambiente, donde la mayoría de ellas pueden
permanecer viables y mantienen su capacidad reproductiva.
Son sensibles al hipoclorito de sodio (10%), al formol (2%) y a
los amonios cuaternarios. Estas sustancias pueden utilizarse
para descontaminar superficies inertes como por ejemplo las
mesadas de trabajo en un laboratorio bacteriológico.
3.1. Género Escherichia

De las 5 especies del Género Escherichia, E. coli es la
más estudiada. El conocimiento acerca de las otras 4 especies
es limitado. E. coli es un componente natural y esencial de la
microbiota bacteriana del intestino del hombre y los animales.
La mayoría de las cepas no son patógenas y residen en el co-
lon. La diferente patogenicidad de esta bacteria en individuos
aparentemente sanos es atribuible a la posesión de una va-
riedad de factores de virulencia específicos. En hospedadores
con compromiso del sistema inmune, E. coli puede ser un
excelente patógeno oportunista. Actualmente, las cepas de
origen humano y animal que causan enfermedad intestinal
se clasifican en 6 categorías. Esta clasificación se basa en:
1) evidencia epidemiológica, 2) características fenotípicas, 3)
características clínicas de la enfermedad que producen, y 4)
factores de virulencia específicos. Las categorías reconocidas de
E. coli diarreigénicos incluyen: E. coli enteropatógeno (EPEC),
E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enteroinvasivo (EIEC),
E. coli enteroagregativo (EAggEC), E. coli de adherencia difusa
(DAEC), y E. coli enterohemorrágico (EHEC).
121
Los principales factores de virulencia de E. coli inclu-
yen:
1. Adhesinas fimbriales: F1 (adhesinas universales sin
especificidad de especie animal), F4 (adhesina con especifi-
cidad preferentemente para cerdos neonatos), F5 (adhesinas
halladas en cepas aisladas de bovinos, porcinos y ovinos), F6
(adhesina identificada en cepas aisladas de cerdos y conejos),
F41 (adhesina hallada en cepas aisladas de bovinos y porcinos),
F165 (presente en cepas aisladas de cerdos).
2. Intimina: adhesina responsable de la unión íntima
de la bacteria al enterocito y de la desorganización de las
microvellosidades. Es el principal factor de virulencia de las
cepas EPEC.
3. Toxinas: endotoxinas (LPS). Enterotoxinas LT (termola-
bil) y ST (termoestable) asociadas con diferentes enfermedades
intestinales en cerdos y bovinos, son los principales factores de
virulencia de las cepas ETEC. Toxinas Shiga (Stx) asociadas a
la enfermedad de los edemas del cerdo y al síndrome urémico
hemolítico en el hombre.
4. Factor necrotizante citotóxico (CNF): caracterizado por
provocar enteritis en animales.
Principales enfermedades causadas por E. coli

Las enfermedades más importantes causadas por E.
coli son:
1. Bovinos: mastitis de curso agudo y subagudo en va-
cas, ocasionando mastitis parenquimatosa, hemorrágica y en
ocasiones necrotizante; septicemia y diarrea de terneros.
2. Porcinos: diarrea colibacilar de los lechones lactantes
y destetados; diarrea en lechones en etapa de crecimiento (3-4
semanas); septicemia; enterotoxemia del lechón destetado y
enfermedad de los edemas en animales adultos; síndrome de
metritis-mastitis-agalaxia de la cerda.
3. Pequenos rumiantes: coliseptisemia e infecciones en
corderos; diarrea colibacilar y neonatal del cordero.
4. Conejos: disentería de los conejos.
5. Equinos: enteritis, abortos, cuadro febril, con debilidad
e invasión de órganos y articulaciones en potrillos.
6. Caninos: diarrea de perros, infecciones urinarias.
7. Aves: infecciones en piel y tejido subcutáneo (der-
matitis necrótica); infecciones respiratorias, aerosaculitis;
122
coligranulomatosis; septicemia, poliserositis fibrinosa; infec-
ciones genitales.
8. En todas las especies puede causar infecciones de
la mucosa urogenital y respiratoria, infecciones de heridas y
retardo en la curación de las heridas.
E. coli es un bacilo recto, gramnegativo, pero también
puede presentar forma cocoide, mide de 2 a 6 mm, puede ser
móvil o no móvil, su agrupamiento puede presentarse solo o
de a pares, y solo algunas cepas poseen cápsula.
E.coli crece a 37 ºC en medios nutricionales comunes
(agar nutritivo), en medios enriquecidos (agar sangre), y en los
medios selectivos (MacConkey, EMB). En la forma S las colo-
nias son redondas de superficie lisa, de color gris blanquecinas
y brillantes. Además de estas se pueden encontrar colonias
mucosas. Las colonias R son más pequeñas secas con bordes
irregulares. Una proporción de las cepas son hemolíticas, en
general estas cepas son patógenas.

E.coli se caracteriza por fermentar la glucosa y la lactosa,
producir indol, son rojo de metilo positivo, Voges Proskauer
negativo, citrato negativo, urea negativo, lisina decarboxilasa
positivo, ornitina decarboxilasa positivo.
Serotipificación
Los antígenos somáticos, capsulares y flagelares permi-
ten efectuar la serotipificación de las cepas aisladas, empleando
antisueros específicos elaborados en conejos contra los distin-
tos antígenos O, H y K. En los laboratorios bacteriológicos de
rutina sólo es posible realizar el seroagrupamiento basado en
la identificación del antígeno O. La serotipificación completa
(O:H:K) es de interés clínico, ya que existe relación entre de-
terminados serotipos y su patogenicidad. Sin embargo, esta
relación no es absoluta y puede presentar excepciones, por lo
cual es recomendable utilizar métodos complementarios para
identificar los diferentes factores de virulencia.
123
3.2. Género Salmonella

El Género Salmonella fue objeto de sucesivas modificacio-
nes a través de los años, en lo que respecta a su nomenclatura
y taxonomía. Sin embargo, todavía se siguen utilizando muchos
de los métodos descriptos y desarrollados por Edwards y Ewing
en la década del 40. Estudios de ADN mediante técnicas de
hibridación demostraron que el Género Salmonella está cons-
tituido por 2 especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori
(grupo V). Salmonella enterica está compuesta por 6 subespe-
cies: S.enterica subesp. entérica (grupo I), S.enterica subesp.
salamae (grupo II), S. enterica subesp. arizonae (grupo IIIa),
S. enterica subesp. diarizonae (grupo IIIb), S. enterica subesp.
houtenae (grupo IV), y S. enterica subesp. indica (grupo VI). La
anterior clasificación taxonómica dividía el Género Salmonella
en grupos. A su vez, las subespecies de Salmonella enterica
y la especie Salmonella bongori se dividen en más de 2400
serovariedades, que están definidas en función de diferentes
asociaciones de factores antigénicos somáticos O y flagelares
H. La especie tipo es Salmonella enterica.
La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y
de los animales de sangre caliente pertenecen a la especie ente-
rica subespecie enterica (grupo I). Dado que las serovariedades
no tienen nivel taxonómico de especie, sus nombres escapan al
dominio del Código Internacional de Nomenclatura Bacteriana
y por ello deben escribirse en letra tipo romano, no en itálica,
de la siguiente manera: Salmonella enterica subesp. enterica
serovariedad Typhimurium, a los fines prácticos: Salmonella
Typhimurium. Las serovariedades pertenecientes a las sub-
especies restantes y a Salmonella bongori, de baja incidencia
en patología humana o animal, se designan con el nombre de
la subespecie, seguido de la fórmula antigénica, por ej: Sal-
monella grupo IV 50:b:- (Salmonella enterica subesp. houtenae
50:b:-). Los nombres de las serovariedades están comprendidos
en el esquema de Kauffmann-White, publicado por el Centro
Colaborador de la OMS de Referencia e Investigaciones de
Salmonella, del Instituto Pasteur de París, Francia.
Los miembros del Género Salmonella están ampliamente
distribuidos en la naturaleza, se los encuentra como comensales
y como patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos
domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un am-
plio espectro de enfermedades en el hombre y los animales.
124
Las siguientes serovariedades de Salmonella pueden ser
diferenciadas sobre la base de su epidemiología y significancia
clínica en animales y hombres.
1) Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi B y C son
causa de una enfermedad específica de los humanos: el tifus
o fiebre tifoidea.
Salmonella Paratyphi B, raramente puede infectar a di-
ferentes especies animales, tales como: aves silvestres, peces,
cangrejos, caracoles, etc.
2) Salmonella que infectan a diferentes especies animales
y que son transmisibles al humano. Este grupo incluye a la
mayoría de las serovariedades, siendo el prototipo Salmonella
Typhimurium. En todos los animales la infección es latente (lo
más usual) o se presenta con sintomatología clínica (diarrea,
septicemia) especialmente en animales jóvenes. También son
causa de intoxicación alimentaria.
3) Salmonella que causan enfermedades en animales y
muy raramente se transmiten a los humanos. Están adaptados
a una especie animal en particular. Las siguientes serovarie-
dades forman parte de este grupo: S. Dublin, causa salmo-
nelosis en el ganado vacuno o causa infecciones latentes. S.
Gallinarum y S. Pullorum agentes del tifus aviar en gallinas
adultas, y de la pullorosis o diarrea blanca bacilar en pollitos. S.
Abortusovis, S. Abortusequi, S. Abostusbovis producen aborto
en ovejas, equinos y bovinos, respectivamente.
1. Adhesinas: la bacteria puede adherirse a uno o más
tipos de células en el tejido intestinal a través de apéndices
proteicos denominados fimbrias. Estas posibilitan que la bac-
teria entre en contacto con la célula huésped y luego permite
la interacción de factores que estimulan la migración transe-
pitelial de neutrófilos.
2. Genes de virulencia codificados en plásmidos: La ma-
yoría de las serovariedades no tifoideas contienen un plásmido
que forma parte de algunos de los determinantes de virulencia
de Salmonella involucrados en la supervivencia y proliferación
en la célula hospedadora.
3. Toxinas: la toxina más estudiada es la toxina de Sal-
monella Typhimurium. Es una proteína termolábil, su acción
citotóxica y enterotóxica es muy similar a la toxina colérica y
la toxina termolábil (LT) de E. coli.
125
4. Islas de patogenicidad y sistemas de secreción: Sal-

monella tiene un complejo ciclo de vida y posee ciertas herra-
mientas moleculares que le permiten expresar la virulencia.
Entre estas se encuentran las islas de patogenicidad (IPS) y
los sistemas de secreción tipo III (SST III).

Género Salmonella
1. Bovinos: septicemia, neumonías, artritis y diarrea en
terneros. En adultos suelen observarse casos esporádicos de
curso benigno.
2. Equinos: abortos, metritis, diarrea sanguinolenta, po-
liartritis, abscesos en las extremidades, fistulas en la cruz.
3. Aves: pullorosis, diarrea blanca bacilar, tifus aviar. Se
puede observar degeneración de folículos, ooforitis, peritonitis,
trastorno del estado general, afección de ovarios, testículos, y
órganos parenquimatosos.
4. Pequeños rumiantes: abortos, metritis, septicemia,
neumonía, diarrea.
5. Porcinos: infección septicémica aguda que afecta prin-
cipalmente a los lechones recientemente destetados, se puede
observar cianosis, neumonía, y diarrea.
6. Roedores: septicemia en ratas y ratones.
7. Reptiles: infecciones latentes causadas por S. arizonae,
son fuente de infección para el hombre.
Las especies del Género Salmonella son cocobacilos o
bacilos gramnegativos de 0,5-0,8 µm x 1-3,5 µm. Frecuente-
mente se agrupan en una sola célula o en cadenas muy cortas.
Son móviles por flagelos perítricos. La excepción es Salmonella
Gallinarum y Pullorum que son las únicas serovariedades
inmóviles.
Un correcto diagnóstico e identificación de Salmonella
depende principalmente del cultivo. La metodología a usar
consta de tres pasos:
1) Preenriquecimiento: este paso es indispensable cuan-

do se procesan muestras en las cuales el microorganismo
está presente en pequeño número o en un medio que no es
126
el adecuado y se encuentran células dañadas o estresadas,
como por ejemplo: alimentos desecados, calentados a altas
temperaturas, irradiados o en muestras de animales que re-
ciben antibióticoterapia o son portadores asintomáticos. Se
pueden utilizar los siguientes medios de preenriquecimiento:
agua peptonada bufferada, caldo lactosado, caldo tripticasa
soja, caldo nutritivo. El preenriquecimiento recomendado es
el agua peptonada bufferada. Se debe sembrar la muestra en
proporción de 1/10, ejemplo: 20 g de materia fecal en 180
ml de medio de preenriquecimiento. Incubar a 37 °C durante
16-20 h.
2) Enriquecimiento: estos medios contienen sustancias

inhibidoras las cuales suprimen el crecimiento de bacterias
contaminantes de la muestra y al mismo tiempo brindan me-
jores condiciones para el desarrollo de Salmonella y permite
que éstas se puedan multiplicar. Existen diferentes medios que
se utilizan para el enriquecimiento, como son el caldo selenito
y el caldo tetrationato, entre otros. Se debe tomar un mililitro
del caldo de preenriquecimiento y sembrar en 10 ml de caldo
de enriquecimiento. Incubar a 37 °C durante 24 h.
3) Cultivo en medios sólidos: cuando la muestra proviene

de un animal con sintomatología clara de salmonelosis (diarrea)
o se procesa un órgano porque se sospecha que se produjo
una infección generalizada se puede sembrar directamente en
medio sólido. Los medios que pueden ser utilizados en esta
etapa son: agar entérico hektoen, agar SS y agar XLD, entre
otros. Es recomendable adicionar 10-20 µg/ml de novobiocina
a estos medios, para inhibir el crecimiento en toda la superficie
de la placa (swarmming) de Proteus spp. Se debe tomar una
ansada del caldo de enriquecimiento y sembrar en cualquiera
de estos medios. Incubar a 37 °C durante 24-48 h. Repicar las
colonias sospechosas a un medio no selectivo (agar tripticasa
soja, agar nutritivo) y si se encuentran en cultivo puro, con-
servarlas y realizarles las pruebas bioquímicas.

En las siguientes tablas se presentan los caracteres bio-
químicos diferenciales de las subespecies de Salmonella.
127
Malonato
Gelatina
Tartrato
Salicina
Dulcitol
Sorbitol
Lactosa
Mucato
ONPG
S. enterica subesp. enterica (I) + - - - + + + - -
S. entrica subesp. salamae (II) + - + + + - + - -
S. enterica subesp. arizonae (IIIa) - + + + + - + - -
S. enterica subesp. diarizonae (IIIb) - + + + + - - - +
S. enterica subesp. houtenae (IV) - - - + + - - + -
S. enterica subesp. indica (VI) d d - + - - + - d
S. bongori (V) + + - - + - + + -
+ 90% o más de los resultados positivos, - 90% o más de los resultados ne-
gativos, d: diferentes reacciones.
La mayoría de las serovariedades (99,8 %) aisladas

del hombre y los animales de sangre caliente pertenecen a
Salmonella enterica subesp. enterica (I) y tienen propiedades
bioquímicas características.
Prueba bioquímica S. enterica subesp. enterica
Lactosa -
ONPG -
SH2 +
Glucosa +/con gas
Dulcitol +
Adonitol -
Lisina decarboxilasa +
Ornitina decarboxilasa +
Arginina dehidrolasa +
Urea -
Indol -
Gelatina -
Rojo de metilo +
Voges-Proskauer -
Citrato de Simmons +
Malonato -
En el caso de Salmonella, con las pruebas bioquímicas

solamente llegamos a determinar el Género. Para conocer la
serovariedad tenemos que enviar el aislamiento a un centro de
referencia que en Argentina es el Instituto Nacional de Enfer-
medades Infecciosas INEI-ANLIS «Dr. Carlos G. Malbrán».
128
3.3. Género Klebsiella
Las especies del Género Klebsiella se encuentran en el
intestino y en la mucosa de la nasofaringe de los animales y del
hombre, como así también en el agua y la tierra. Una caracte-
rística morfológica importante en Klebsiella es la presencia de
cápsula, la cual le confiere la propiedad de producir colonias
muy mucosas. La especie modelo de importancia veterinaria
es Klebsiella pneumoniae.
Los factores de virulencia de Klebsiella pneumoniae son
fimbrias y en algunas cepas la capacidad de producir una
enterotoxina. Sin embargo, las especies de Klebsiella son con-
sideradas de baja virulencia.
Género Klebsiella
1. Equinos: K. pneumoniae se aísla con frecuencia del
tracto genital (cuello del útero, pene, secreción de las glándulas
genitales accesorias y esperma). En los sementales constitu-
yen una microbiota de transición y no causan infección. Sin
embargo, en las yeguas causa metritis, cervicitis y aborto. El
semental es responsable de la difusión del microorganismo
en el momento de la cubrición. Por consiguiente, la presencia
de bacterias del Género Klebsiella en el tracto genital de la
yegua debe considerarse como sospechosa. El empleo de an-
tibioticoterapia debe estar precedido de un antibiograma. En
algunas ocasiones se suele aislar K. pneumoniae de afecciones
respiratorias tales como sinusitis o neumonía, y de heridas
infectadas.
2. Bovinos: Klebsiella spp. es aislada en casos de diarrea
del ternero. El cuadro clínico es igual que el ocurrido en la
diarrea causada por E. coli enterotoxigénico. K. pneumoniae
y Enterobacter aerogenes son agentes etiológicos de mastitis
agudas.
3. Cerdos: K. pneumoniae es agente secundario de infec-
ciones del aparato respiratorio tales como neumonía y rinitis
atrófica. En raras ocasiones Klebsiella spp. es causante de
mastitis en la cerda.
4. Otras especies: las especies del Género Klebsiella se
aíslan esporádicamente de lesiones diversas de varias especies
(neumonías, abscesos, septicemias, gastroenteritis). Citemos
129
especialmente las infecciones rebeldes de las vías urinarias

del perro.
Se caracterizan por presentar forma de bacilo capsula-
do, de 0,3-1,5 x 0,6-6 mm, y se agrupan solos, de a pares o en
cortas cadenas.
El Género Klebsiella no es exigente y sus especies desa-
rrollan en los medios de uso habitual. Las colonias son mu-
cosas, pero el grado depende de la cepa y del medio, pudiendo
perderse estas características en sucesivos repiques.

Klebsiella pneumoniae se caracteriza por fermentar la
glucosa y la lactosa. Es rojo de metilo e indol negativo, y Vo-
ges Proskauer, citrato y urea positivo. En la siguiente tabla
se presentan las diferencias bioquímicas entre las principales
especies de Klebsiella que podrían tener importancia en Me-
dicina Veterinaria.
Prueba
K. pneumoniae K. ozaenae K. oxytoca
bioquímica
Indol - - +
Rojo de metilo - + V
Voges Proskauer + - +
Ureasa + - +
Malonato + - +
3.4. Género Enterobacter

Los miembros de este Género bacteriano se encuentran
en el medio ambiente (agua, suelo, plantas, etc.) y en el tracto
digestivo de los animales. Por esto último, son aislados de
muestras de origen animal. Las especies del Género Entero-
bacter que tienen importancia veterinarias son: Enterobacter
cloacae y Enterobacter aerogenes.
130
Género Enterobacter
Este Género es considerado de baja patogenicidad, ya
que en la mayoría de los casos su aislamiento está asociado
con la colonización de las mucosas a partir del medio am-
biente. Sin embargo, se atribuye importancia clínica en los
siguientes casos:
1) Equinos: aborto e infección del aparato genital, in-
fertilidad.
2) Bovinos: aborto, mastitis.
3) Porcinos: agalaxia.
4) Otras especies: infecciones urinarias, retardo de la
curación de heridas, neumonías, enteritis e infecciones ge-
neralizadas.
Enterobacter, como la mayoría de las bacterias gramnega-
tivas, presenta lipopolisacáridos (LPS) en la pared celular que
actúan como endotoxinas. Además, se demostró que algunas
especies del Género Enterobacter pueden producir una toxina
similar a la toxina Shiga, pero esta no reviste importancia en
Medicina Veterinaria.
Son bacilos gramnegativos que se agrupan en solos, de
a pares o en cortas cadenas.
Crece en los medios que se utilizan de rutina para las
enterobacterias. En los medios diferenciales que contienen lac-
tosa se caracteriza por utilizar este carbohidrato. Las colonias
son grandes, mucosas y brillantes.
Identificación bioquímica
Tabla para la identificación de las especies de importan-
cia del Género Enterobacter
131
Especies
Prueba
E. cloacae E. aerogenes
Lisina - +
Ornitina + +
Indol - -
Voges-Proskauer + +
Arginina + -
.
3.5. Género Proteus

Si bien las especies del Género Proteus no están asocia-
das con frecuencia a enfermedades en animales, vamos a des-
cribir brevemente sus características debido a que su hallazgo
en el laboratorio bacteriológico es muy frecuente. Proteus spp.
está ampliamente distribuido en la naturaleza y participa en la
degradación de sustancias orgánicas. Su principal habitat es
el tracto gastrointestinal del hombre y los animales. Con fre-
cuencia, el aislamiento de Proteus spp. a partir de una muestra
clínica se debe a una contaminación y no tiene importancia.
Las especies más importantes en Medicina Veterinaria son P.
mirabilis y P. vulgaris. Ambas especies producen “swarming”,
una característica muy particular de Proteus spp. P. mirabilis
es aislado de muestras animales con mayor frecuencia que P.
vulgaris. Las dos especies son patógenos facultativos y son res-
ponsables de las mismas enfermedades. En caballos producen
endometritis e infecciones urogenitales. En bovinos producen
mastitis y endometritis, sepsis, gastroenteritis y artritis. En
cerdos producen diarrea e infecciones del tracto urinario. En
perros y gatos producen infecciones del tracto urinario, otitis
externa y sepsis. Es muy común que produzca infecciones
latentes en el prepucio de toros. Es importante como agente
de putrefacción en los alimentos.
Este Género no es exigente y crece en los medios de
cultivo habituales. En la siguiente tabla se presentan las prue-
bas bioquímicas mínimas para la identificación de P. mirabilis
y P. vulgaris.
132
Proteus
Pruebas bioquímicas
mirabilis vulgaris
Fenilalanina desaminasa + +
Indol - +
Producción de ácido sulfhídrico + +
Hidrólisis de gelatina + +
Citrato V V
Ornitina decarboxilasa + -
4. Familia Pseudomonadaceae
Pseudomonas
La Familia Pseudomonadaceae está integrada por bacilos
gramnegativos curvados o rectos, móviles por flagelos polares.
Aerobios estrictos, su metabolismo es respiratorio, nunca fer-
mentativo. El crecimiento se produce desde 4 ºC hasta 43ºC.
Tienen capacidad para utilizar compuestos orgánicos de car-
bono como única fuente de energía. Son catalasa positivos y
usualmente citocromo-oxidasa positivos.
Se incluyen en la Familia cuatro Géneros: Pseudomo-
nas, Xantomonas, Frateuria y Zoogloea. La diferenciación de
los cuatro Géneros es difícil y el Género Zoogloea está situado
tentativamente en esta Familia. El Género más significativo en
campo médico o veterinario es Pseudomonas. La especie tipo
es Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa está distribuida
en el suelo, líquidos cloacales, agua de riego e intestino, piel y
membranas mucosas de seres humanos y animales.
Recientemente se ha encontrado atractiva para micro-
biólogos y para el biólogo molecular la investigación de pro-
ductos bioactivos como la endotoxina, enzimas, piocianina,
plásmidos y los potenciales genéticos de Pseudomonas. Estos
microorganismos poseen un antígeno O (lipopolisacárido)
somático que es un marcador tipo-específico estable. Estas
especies de Pseudomonas son diferenciables en 18 tipos por
aglutinación de células enteras. El antígeno proteico común
preparado de la endotoxina es termo inestable y tiene diversa
bioactividad como inmunogenicidad no específica, efecto adyu-
vante, inducción de interferón, e inhibición del crecimiento de
133
células tumorales. Produce varios productos bioactivos en los

medios de cultivo. Cada producto participa supuestamente en
la patogenicidad de la bacteria. El pigmento, soluble en agua,
verde azulado y el castaño son producidos por muchas cepas
de esta especie. La mayoría de los tintes son fluorescentes.
El papel del pigmento en la patogénesis no es conocido clara-
mente. La producción de enzimas como proteasas, fosfolipasa
C y elastasa son consideradas importantes para la patogeni-
cidad. Especialmente la fosfolipasa C estimula la hemorragia
y garantiza necrosis y la elastasa es responsable de lesión de
córnea. La mayoría de las cepas de Pseudomonas producen
exotoxinas que inhiben la síntesis proteica, la necrosis de los
tejidos y una sustancia bactericida llamada piocianina. Como
otras bacterias gramnegativas, P.aeruginosa muestra endo-
toxina. Esta endotoxina muestra efectos bioactivos variables
como adyuvante, pirógeno, efecto de inducción de interferón
y efecto necrotizante tumoral
.
Género Pseudomonas
En Medicina Veterinaria se reconoció a Pseudomonas
como agente etiológico de septicemia del pollo, la mastitis
bovina, la neumonía del conejo, la otitis externa en el ratón y
del perro. Cualquier descarga purulenta que elimine pus de as-
pecto verdoso será sospechosa de infección por Pseudomonas.
P. aeruginosa es conocido como agente causal del «pus azul»,
de allí el origen del sinónimo piociánico. Esta enfermedad fue
una infección espontánea común en animales y humanos, sin
embargo, se observó que la infección por P. aeruginosa es una
de las enfermedades iatrogénicas más serias, en particular
debido a su alta mortalidad. La infección de heridas por que-
maduras, y neumonías en diferentes especies animales, otitis
externa en caninos, e infecciones iatrogénicas como la infección
urogenital luego del uso de catéteres o lavados intrauterinos
realizados con agua no esterilizada que frecuentemente está
contaminada con P. aeruginosa. Produce infecciones urinarias,
cardíacas y conjuntivitis. La neumonía hemorrágica del visón
es una infección aguda usual en término de su alta mortalidad
y contracción sin ninguna enfermedad de base. Otro proble-
ma de suma importancia es la colonización en las tuberías y
tanques de frío en la industria lechera, formando biofilm y de
esta manera contaminando el producto lácteo y deteriorando la
134
calidad del mismo. Produce enzimas proteolíticas y lipolíticas
destruyendo las proteínas y grasas de la leche.
Dos tipos de colonias principales pueden ser observa-
das en medios sólidos comunes. Una grande, de 3 a 5 mm
de diámetro, lisa, con bordes ondulados y el centro elevado
y la otra pequeña, de 2 mm de diámetro, rugosa y convexa.
Los materiales clínicos son en general, buenas fuentes para
observar colonias grandes, mientras que las pequeñas se ob-
tienen comúnmente en la naturaleza. Las células son rectas
o bastones curvados gramnegativas, móviles con un flagelo
polar. El tamaño es de 1,5 a 3 µm de largo por 0,5 µm de an-
cho y muestran pleomorfismo. Los pilis están localizados en
un extremo siendo receptores para bacteriófagos y tienen un
papel en su adherencia a las células animales.
Los miembros de este Género están caracterizados por su
habilidad para crecer en medios simples, de reacción neutra,
a expensas de una gran variedad de compuestos orgánicos
simples. Crece en medios comunes óptimamente a 37 ºC bajo
condición aeróbica estricta. No tiene exigencias nutritivas, por
lo tanto crece en medios comunes como agar triticasa soya y
agar nutritivo. Crece en agar MacConkey y en todos los medios
utilizados para el crecimiento de enterobacterias. En caldo la
bacteria crece formando una membrana en la superficie. La
mayoría de las cepas producen un pigmento soluble en agua
que puede diferir entre azul, verde a amarillo y algunas veces
rojo oscuro. Un medio sólido que contenga ácido nalidíxico
y cetrimide es recomendado como medio de aislamiento de
muestras clínicas.

Pseudomonas aeruginosa tiene un olor característico que
las identifica fácilmente y que recuerda un olor frutal o a man-
zanas. Las cepas aisladas pueden ser transferidas a medio King
A para mostrar su capacidad de producir piocianina, este pig-
mento es producido únicamente por la P. aeruginosa, de color
azul-verdoso que se difunde por el medio de cultivo importante
para su identificación. A la cepa que produzca piocianina se le
realizará una prueba de O-F (Oxidación-Fermentación) para
135
valorar la actividad de descomposición oxidativa de la gluco-

sa. La prueba de la citocromo-oxidasa, arginina dihidrolasa,
crecimien-to a 41 ºC. El serotipo de la especies será decidido
por aglutinación celular. Las Pseudomonas pueden producir 4
pigmentos: piocianina, pioverdina, de color amarillo-verdoso,
piorrubina, de color rojo y la piomelanina de color marrón-
negruzco. Dentro del Género Pseudomonas, el grupo que es
capaz de producir pigmentos fluorescentes son los que se aíslan
con mayor frecuencia en la clínica veterinaria y humana y por
lo tanto es importante llegar a una buena identificación de los
mismos. En este grupo encontramos 3 especies: P. aerugino-
sa, P. fluorescens y P. putida. A continuación de muestran las
características bioquímicas y fisiológicas para la identificación
de Pseudomonas productoras de pigmentos fluorescentes.
Especie
Prueba
P. aeruginosa P. fluorescens P. putida
Crecimiento a 4 ºC - + +
Gelatinasa + + -
Reducción de nitratos + + -
Producción de piocianina + - -
Producción de fluoresceína + + -
Resistencia
Es bien conocido que los miembros tienen fuertes po-
tenciales de adaptación o resistencia ambientales. Debido a
que Pseudomonas obtiene fácilmente resistencia a produc-
tos químicos y aún a desinfectantes, crea problemas en los
hospitales especialmente humanos pero puede ser fuente de
contaminación en hospitales veterinarios. La fácil adquisición
de resistencia a los antibióticos en estas cepas es uno de los
problemas más importantes desde el punto de vista terapéu-
tico. Entre los mecanismos de resistencia a los antimicrobia-
nos se incluyen: 1) resistencia natural que es codificada en el
cromosoma; 2) por mecanismos de mutación como la imper-
meabilidad de la pared que impide la entrada del antibiótico,
y el eflujo, mecanismo por el cual es expulsado el antibiótico
al exterior rápidamente, impidiendo que se llegue a la concen-
tración necesaria del antibiótico dentro de la célula bacteriana.
136
Este mecanismo también le sirve para sobrevivir en ambientes
muy desfavorables ya que elimina sustancias nocivas para la
bacteria; 3) adquirida, mediante plásmidos que son transferi-
dos fundamentalmente por conjugación de otra bacteria que
le confiere la resistencia.
5. Familia Pasteurellaceae
La Familia Pasteurellaceae está constituida por 9 Géne-
ros, de los cuales Pasteurella es el Género tipo. Otros Géneros
de importancia en veterinaria son Haemophilus y Actinobacillus,
sin embargo no serán desarrollados en esta obra debido a son
microorganismos exigentes y su aislamiento es dificultoso en
un laboratorio bacteriológico básico.
5.1. Género Pasteurella

La pasteurelosis es considerada una enfermedad zoo-
nótica cuyo principal reservorio se encuentra en los animales
domésticos y silvestres. Es comensal de membranas y mucosas
de las vías respiratorias altas, cavidad oral, tracto genital y
digestivo de mamíferos y aves. Además, es comensal del tracto
respiratorio y de la cavidad oral de perros (40 %) y gatos (70 %).
Los animales domésticos padecen diferentes presentaciones
de pasteurelosis: cólera aviar, neumonía porcina, septicemia
hemorrágica bovina e infecciones que afectan a conejos, cabras
y ovejas. Estas enfermedades tienen un gran impacto econó-
mico, principalmente en los animales de cría intensiva como
cerdos y aves. Las infecciones más frecuentes en el hombre
están asociadas con mordeduras o arañazos de perros y gatos.
En Argentina, el primer aislamiento de Pasteurella se realizó
en 1939, el primer caso de pasteurelosis humana se describió
en 1950, y en la década de 1970 se reconoció a P. multocida
como agente etiológico de pasteurelosis en aves, porcinos,
conejos y bovinos.
Todos los miembros de este Género son microorganismos
gramnegativos, aerobio-anaerobios facultativos, no esporula-
dos e inmóviles. Según el Comité Internacional sobre Siste-
mática de Procariotes la especie tipo del Género Pasteurella
es P. multocida.
137
Se considera que todas las cepas de P. multocida son
potencialmente patógenas, y que bajo ciertas circunstancias
son capaces de producir enfermedad en los animales. Algunas
cepas son más virulentas que otras, debido a la expresión de
varios factores de virulencia:
1. Cápsula: las bacterias con cápsula rica en polisacári-
dos resisten la fagocitosis, y por lo tanto serían más virulentas
que las cepas homólogas acapsuladas. Las cepas de P. mul-
tocida se clasifican en 5 grupos según el tipo capsular: A, B,
D, E y F. Se considera que la cápsula es el principal factor de
virulencia de P. multocida, aunque no el único, ya que algunas
cepas acapsuladas fueron muy virulentas.
2. Proteínas de membrana externa (OMP): fueron es-
tudiadas en forma exhaustiva debido a sus propiedades
inmunogénicas, pero sólo algunas de estas proteínas fueron
consideradas como posibles factores de virulencia. La mayoría
de las cepas de P. multocida presentan un sistema de recu-
peración de hierro, mediante el cual son capaces de captar
este elemento en condiciones de restricción. Este sistema es
uno de los factores de virulencia asociado a las proteínas de
membrana externa.
3. Toxinas: todas las cepas de P. multocida presentan
endotoxinas, que ocasionan los cambios vasculares generali-
zados en las septicemias, pero sólo algunas cepas producen
exotoxinas. La exotoxina más estudiada es una dermonecro-
toxina que causa la rinitis atrófica del cerdo.
4. Determinantes moleculares: la mayoría de la infor-
mación disponible al respecto no se refiere a los genes aso-
ciados con la virulencia de P. multocida. Una excepción es la
descripción del gen toxA, responsable de la codificación de la
dermonecrotoxina. Otros genes de P. multocida que pueden ser
identificados son: el gen de la adenilato ciclasa y el gen oma87.
Sin embargo, aún no se conoce si son genes de virulencia.

Género Pasteurella
Rumiantes: septicemia hemorrágica bovina; neumonía
y bronconeumonía en terneros; mastitis y aborto en bovinos;
infecciones respiratorias en ovinos y caprinos.
Porcinos: rinitis atrófica; bronconeumonía, neumonía
enzoótica.
138
Carnívoros: rinitis y conjuntivitis en gatos; abscesos cu-
táneos y heridas por mordeduras en perros y gatos; infección
latente de faringe y tonsilas.
Conejos: rinitis, conjuntivitis y bronconeumonía.
Aves: cólera aviar agudo, subagudo y crónico.
Pasteurella multocida es una bacteria gramnegativa,
inmóvil, capsulada y no esporulada de 0,2 a 0,4 µm de ancho
por 0,6 a 2,5 µm de largo. Su forma puede ser cocobacilar o
bacilar, con una evidente coloración bipolar al ser teñida con
la coloración de Gram. Sin embargo, luego de varios repiques
tiende a ser pleomórfica y puede agruparse en cadenas cortas
o presentar aspecto filamentoso.
Pasteurella multocida desarrolla bien en agar chocolate y
agar sangre de carnero, aunque se describieron varios medios
selectivos para su aislamiento. En agar sangre esta bacteria
presenta colonias lisas, de color gris y con un diámetro de 0,5
a 2 mm después de 24 h de incubación con 10% de dióxido
de carbono. No produce hemólisis y no desarrolla en medios
entéricos selectivos. La temperatura óptima para el crecimiento
es de 37 ºC y el pH óptimo varía entre 6,2 y 9,0. A menudo
los cultivos emanan un olor característico debido a la gran
producción de indol.

Luego de realizar un aislamiento presuntivo de P. multoci-
da, se debe realizar la identificación bioquímica. La mayoría de
las especies del Género se caracterizan por producir catalasa,
citocromo-oxidasa e indol, reducir nitrato, utilizar glucosa,
manosa y sacarosa, y por no crecer en agar MacConkey, y no
producir hemólisis ni ureasa. Asimismo, P. multocida presenta
3 subespecies P. m. multocida, P. m. gallicida y P. m. septica.
139
Subespecie
Propiedades bioquímicas
multocida septica gallicida
Hemólisis - - -
Oxidasa + + +
Catalasa + + +
Crecimiento en agar MacConkey - - -
Producción de indol + + +
Reducción de nitrato + + +
Ureasa - - -
Ornitina decarboxilasa + + +
Fermentación de glucosa + + +
Fermentación de maltosa - - -
Fermentación de lactosa V - -
Fermentación de galactosa + + +
Fermentación de xilosa V + +
Fermentación de manitol + + +
Fermentación de trehalosa V + -
Fermentación de arabinosa - - V
Fermentación de sorbitol + - +
Fermentación de dulcitol - - +
Además, P. m. multocida, P. m. gallicida y P. m. septi-

ca pueden presentar diferentes biotipos. A continuación se
presentan los biotipos de 30 cepas de Pasteurella multocida
aisladas de aves, cerdos y humanos en Argentina y de 3 cepas
de referencia.
140
Biotipos
Propiedades bioquímicas
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ornitina decarboxilasa + + + + + + + - +
Producción de indol - + + + + + + + +
Fermentación de arabinosa - - - - - + - + +
Fermentación de dulcitol - - - - - + + + +
Fermentación de sorbitol + + + + - + + + +
Fermentación de trehalosa + + - - + - - - -
Fermentación de xilosa + + + + + + - - -
Fermentación de lactosa - - - + - - - - -
Subespecie m a m m m s b g c g g g
N = 33 1 4 16 2 4 1 1 3 1
a P. multocida subespecie multocida, b P. m. septica, c P. m.

gallicida
Serotipificación
Los esquemas de tipificación utilizados con mayor fre-
cuencia para P. multocida incluyen 5 tipos capsulares (A, B,
D, E, F) y 16 serotipos somáticos (1-16). Actualmente, los tipos
capsulares se pueden determinar por PCR. Sin embargo, para
obtener los serotipos somáticos se sigue utilizando la prueba de
inmunodifusión. En la Argentina no se realizan rutinariamente
y están restringidos a estudios de investigación.
5.2. Género Mannheimia

Este Género junto con P. multocida son patógenos impor-
tantes en animales domésticos, pueden provocar enfermedades
severas y pérdidas económicas significativas en la industria
relacionada con la cría de ganado vacuno, porcino y aves de
corral. La especie tipo es M. haemolytica y en ocasiones es
considerada agente etiológico primario y en otras agente etio-
lógico secundario.
Los principales factores de virulencia de M. haemolytica
son: la cápsula, el lipopolisacárido de membrana externa,
proteínas y lipoproteínas de membrana externa, leucotoxinas,
141
enzimas extracelulares y neuraminidasa.

Género Mannheimia
Rumiantes: septicemia hemorrágica bovina; neumonía
del ternero; mastitis, neumonías y septicemia. Septicemia de
los corderos, mastitis hasta gangrenosa en hembras adultas;
neumonía en ovinos de engorde.
Aves: infecciones del tracto respiratorio, septicemia,
salpingitis de la gallina y el pavo.
Mannheimia haemolytica es una bacteria gramnegativa,
inmóvil, no esporulada que mide 0,2 a 0,5 µm de ancho por
1,2 a 2 µm de largo. Son aerobios-anaerobios facultativos. Su
forma puede ser cocobacilar o bacilar.
Mannheimia haemolytica desarrolla bien en agar choco-
late y agar sangre de carnero, aunque se describieron varios
medios selectivos para su aislamiento. En agar sangre esta
bacteria presenta colonias lisas, de color gris y con un diáme-
tro de 0,5 a 2 mm después de 24 h de incubación con 10% de
dióxido de carbono. Produce beta-hemólisis y desarrolla en
agar MacConkey, estas características permiten diferenciarla
claramente de P. multocida. La temperatura óptima para el
crecimiento es de 37 ºC y el pH óptimo varía entre 6,2 y 9,0.

Las cepas de M. haemolytica se caracterizan producir
hemólisis, desarrollar en agar MacConkey, producir citocromo-
oxidasa y catalasa, reducir nitrato, y producir ácido a partir
de glucosa, maltosa, manitol, trehalosa, sorbitol y galactosa.
No produce indol, ni ureasa, ni ácido a partir de arabinosa.
Las cepas pueden dividirse en dos biotipos A (aislado frecuen-
temente de bovinos) y B (aislado frecuentemente de ovinos).
Las cepas del biotipo A producen ácido a partir de arabinosa y
xilosa, pero no a partir de trehalosa y salicina. Por el contrario
las cepas del biotipo B producen ácido a partir de la trehalosa
y la salicina pero no a partir de la xilosa y la arabinosa. Si bien
el nombre de esta especie sugiere una actividad hemolítica del
microorganismo, esta característica por lo general se observa
solamente en los aislamientos frescos.
142
Diagrama de flujo para la identificación simplificada
Cocos Gram positivos
de bacterias grampositivas más comunes en la prác-
tica de laboratorio.
Prueba de Las colonias utilizadas no pueden provenir de

Catalasa Agar Sangre ni agar chocolate

Positiva Negativa
Staphylococcus Streptococcus
Medio
Bilis-Esculina
Coagulasa
Ennegrecimiento No ennegrece
Positivo Streptococcus sp.
Negativo del medio
Staphylococcus
Staphylococcus sp. Enterococco
aureus (más
común)
S. hyicus Hemólisis
S. intermedius
Tipificación
alfa beta
serológica
S.dysgalactiae S.pyogenes
S.uberis S.agalactiae
S.fecalis S.zooepidemicus
S.suis S.equi
S.equisimilis
143
144
Bacilos Gram Diagrama de flujo para la identificación de Bacilos Gram negativos
negativos más comunes en la práctica de laboratorio
Puede sembrarse al mismo momento

Kligler ambos medios Kligler y SIM, e Indol
adelantándose el diagnóstico
Nestor O. Stanchi
y
Lactosa Lactosa
Positivas Negativas
E.coli Salmonella
Shigella
Col.
Klebsiella
Citrobacter Proteus
Aerobacter Pseudomonas
Serratia Aeromonas SIM
Arizona
Ureasa Indol
H2S H2S
H2S H2S Positivo Positivo
Positivo Negativo
Positivo Negativo Proteus Shigella
Salmonella Shigella
Citrobacter E.coli Móviles Proteus
Proteus Pseudomonas
No móviles
Arizona Klebsiella Salmonella Aeromonas
Aeromonas Klebsiella
Serratia Proteus Shigella
Aerobacter Pseudomonas Salmonella
Aeromonas polorum y
gallinarum
Indol Salmonella
Confirmar con
serología
Pseudomonas puede confirmase por la prueba
de Oxidasa en esta etapa o incluso al inicio de
Negativo Positivo la marcha en caso de sospecha clínica
Klebsiella E.coli
Serratia
Aerobacter
Serratia y Aerobacter
Presencia de Confirmar por otras La prueba de INDOL puede realizarse en el agua triptonada destinada a la suspensión para el antibiograma
Cápsula pruebas o derivar a
Klebsiella laboratorio de
referencia
ANEXO I - PREFIJOS DEL SISTEMA
INTERNACIONAL DE UNIDADES
Prefijo Símbolo Multiple
exa (E) 1018
peta (P) 1015
tera (T) 1013
giga (G) 109
mega (M) 106
kilo (k) 103
hecto (h) 102
deka (da) 101
deci (d) 10-1
centi (c) 10-2
mili (m) 10-3
micro (m) 10-6
nano (n) 10-9
pico (p) 10-12
fempto (f) 10-15
atto (a) 10-18
145
ANEXO II – MEDIOS DE CULTIVO

En este anexo describiremos detalladamente los medios
de cultivo mencionados en esta obra según su finalidad.
MEDIOS DE CULTIVO COMUNES O SIMPLES

Son aquellos medios de cultivo que contienen los ele-
mentos mínimos para el desarrollo de la mayor parte de las
bacterias no exigentes.
AGAR TRIPTICASA DE SOJA (ATS)

Medio utilizado para el cultivo de microorganismos no
exigentes.
Composición
Triptona 15 g
Soitona 5g
Cloruro de sodio 5g
Agar 15 g
Agua destilada 1000 ml
pH final 7,3 ± 0,2
Preparación
1. Disolver 40 g del polvo comercial en un litro de agua destilada.
2. Calentar en horno microondas hasta disolución completa.
3. Para preparar tubos en pico de flauta, fraccionar alícuotas de 5-7
ml del medio en tubos de ensayo.
4. Para preparar placas, autoclavar el erlenmeyer conteniendo el
medio.
5. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.
6. Para preparar los tubos en pico de flauta, colocarlos en posición
inclinada y dejar solidificar.
7. Para preparar las placas, colocar 15-20 ml del medio por cada placa
de Petri y dejar solidificar.
8. Conservar a 4 ºC.
Técnica
Sembrar el aislamiento en estudio en una placa o en un
tubo e incubar a 37 °C durante 24 h.
CALDO TRIPTICASA DE SOJA (CTS)

exigentes.
Cuando se menciona calentar en microondas también puede hacerse en baño

de maría.
146
Composición
Triptona 15 g
Soitona 5g
Cloruro de sodio 5g
pH final 7,3 ± 0,2
Preparación
2. Alicuotar 3 ml en tubos de ensayo.
4. Dejar enfriar y conservar a 4 ºC.
Técnica
Sembrar el aislamiento en estudio en un tubo e incubar
a 37°C durante 24 h.
AGAR BLANDO
Medio utilizado para la conservación de los aislamientos
a 4°C.
Composición
Se utiliza CTS y 5 g de agar por litro.
Preparación
1. Disolver 40 g del polvo de CTS, adicionar 5 g de agar y un litro de
agua destilada (no es necesario preparar un litro).
3. Alicuotar 1 ml en criotubos.
Técnica
Sembrar el aislamiento en estudio en un criotubo por
punción e incubar a 37°C durante 24 h. Conservar a 4 ºC.
AGAR NUTRITIVO
exigentes.
Composición
Infusión de carne 1g
Extracto de levadura 2g
Peptona 5g
Cloruro de sodio 5g
Agar 15 g
pH final 7,4 ± 0,2
147
Preparación
3. Para preparar tubos en pico de flauta, fraccionar alícuotas de 5-7
ml del medio en tubos de ensayo.
4. Para preparar placas, autoclavar el erlenmeyer conteniendo el
medio.
6. Para preparar los tubos en pico de flauta, colocarlos en posición
inclinada y dejar solidificar.
7. Para preparar las placas colocar 15-20 ml del medio por cada placa
de Petri y dejar solidificar.
Técnica
CALDO NUTRITIVO
exigentes.
Composición
Infusión de carne 1g
Peptona 5g
Cloruro de sodio 5g
pH final 7,4 ± 0,2
Preparación
2. Alicuotar 3-5 ml en tubos de ensayo.
Técnica
a 37 °C durante 24 h.
PLATE COUNT AGAR

Medio utilizado para el conteo viable.
Composición
Extracto de levadura 2,5 g
Tripteína 5 g
Glucosa 1 g
Agar 15 g
pH final 7 ± 0,2
148
Preparación
1. Disolver 23,5 g del polvo en un litro de agua destilada.
4. Alicuotar 15-20 ml del medio por cada placa de Petri, y dejar so-
lidificar.
MEDIO DE STUART
Medio utilizado para el transporte de muestras clínicas
Composición
Tioglicolato de sodio 0,9 g
Glicerofosfato de sodio 10 g
Cloruro de calcio 0,1 g
Azul de metileno 0,002 g
Agar 3 g
pH final 7,4 ± 0,2
Preparación
1. Disolver 14,1 g del polvo comercial en un litro de agua destilada (no
es necesario preparar un litro).
4. En caso de realizar la toma de muestra con un hisopo, agregar un
hisopo al tubo.
Técnica
Para tomar una muestra con un hisopo, retirar el hi-
sopo, colectar la muestra y colocar el hisopo más la muestra
en el tubo con el medio de Stuart. Conservar a 4 ºC hasta su
procesamiento.
MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDOS

Son medios de cultivo simples con el agregado de sustan
cias que aumentan su poder nutritivo (sangre, suero, extracto
de levadura, vitaminas) en proporción del 1 al 10%.
AGAR MÜELLER HINTON (MH)

Medio de cultivo utilizado para aislamiento y cultivo de
bacterias exigentes en su nutrición y prueba de sensibilidad
a antimicrobianos
Composición
Infusión de carne 300 g
Casaminoácidos 17,5 g
149
Almidón 1,5 g
Agar 17 g
pH final 7,2 ± 0,2
Preparación
1. Resuspender 38 g del polvo comercial en un litro de agua destilada.
3. Dejar enfriar hasta una temperatura de 50 ºC
4. Dispensar 25 ml del medio por cada placa para obtener una capa
de 4 mm de espesor.
5. Conservar a 4 ºC. Las placas así conservadas pueden utilizarse
hasta 4 días después de su preparación.
Técnica
Depende de su utilización. Si las placas de MH se utilizan
para aislamiento bacteriano se debe sembrar el aislamiento en
estudio en una placa e incubar a 37°C durante 24 h.
AGAR SANGRE
El agar sangre se utiliza como medio enriquecido para
el desarrollo de determinadas bacterias y para evidenciar la
capacidad de producir hemólisis.
Composición del agar base sangre
Infusión de corazón 375 g
Peptona de carne 10 g
Cloruro de sodio 5g
Agar 15 g
pH final 7,4 ± 0,2
El agar base sangre es adicionado con 5% de sangre. Se

puede utilizar sangre de diferentes especies, pero la sangre
utilizada habitualmente en bacteriología es ovina. Una de las
opciones disponibles para obtener sangre es comprarlas en co-
mercios especializados. También los veterinarios que trabajan
con equinos, cabras o conejos (animales de los que usualmente
se obtiene suero y sangre) pueden obtener sangre de estas
especies en forma «prácticamente gratuita». Sin embargo, es
necesario que la misma sea obtenida en forma estéril.
El procedimiento para obtener sangre estéril es el si-
guiente:
1. Depilar la zona de extracción.
2. Realizar la antisepsia prolijamente del sitio de punción
con alcohol-iodado.
3. Dejar actuar 5 minutos el antiséptico, ya que los mi-
150
croorganismos no mueren inmediatamente.
4. Realizar la punción en un solo movimiento sin tocar
la aguja por ningún motivo. No conviene extraer grandes vo-
lúmenes, ya que si se contamina resulta oneroso tener que
descartarlos. En el caso de grandes animales puede trabajar
con una jeringa de 50 ml ya que, 25 ml son suficientes para
preparar 500 ml de agar sangre o agar chocolate.
5. Si lo que desea es sangre (y no suero) debe colocar 1
ml de citrato de sodio en la jeringa previamente para evitar que
la sangre coagule. Si bien lo correcto es trabajar con sangre
desfibrinada, es posible realizarlo de esta forma alternativa.
El desfibrinado puede realizarse mediante perlas de vidrio.
Luego de extraer la sangre coloque un capuchón de la jeringa
sin la aguja. El proceso de tapar la aguja si bien podría evitar
contaminación agregada, es un procedimiento sumamente
riesgoso, ya que es la forma más común de producir accidentes
de laboratorio (inoculación de sangre potencialmente riesgosa).
Una vez en el laboratorio se debe traspasar la sangre a un
tubo estéril. Es sumamente importante que la sangre no se
encuentre contaminada. Si dejamos que esta sola bacteria se
multiplique en la jeringa o en el tubo pronto tendremos todas
las placas contaminadas.
6. Preparar el agar sangre lo antes posible.
Preparación
1. Resuspender 40 g del polvo comercial de agar base sangre en un
450 ml de agua destilada.
3. Colocar en un baño térmico hasta que alcance 45°C.
4. Adicionar la sangre (5% = 25 ml), homogenizar y distribuir en placas
de Petri estériles.
5. Si antes de agregar la sangre, la temperatura del agar base es de
80°C, se obtiene agar chocolate.
Técnica
Sembrar la cepa en estudio en agar sangre e incubar a
37 °C durante 24 a 48 h.
Interpretación de la producción de hemólisis
1) alfa-hemólisis: color verdoso hemólisis parcial con
eritrocitos intactos medio sin cambio
2) beta-hemólisis: hemólisis completa o total que permite
visualizar un halo transparente alrededor de la colonia.
3) hemolisina negativa: sin cambio (llamado también
gama-hemólisis).
151
AGAR CEREBRO CORAZÓN

Medio utilizado para el cultivo de microorganismos que
requieren mayores cuidados.
Composición
Infusión de cerebro de ternero 7,7 g
Infusión de corazón de buey 9,8 g
Proteosa peptona 10 g
Glucosa 2 g
Cloruro de sodio 5 g
Fosfato disódico 2,5 g
Agar 15 g
pH final 7,4 ± 0,2
Preparación
4. Alicuotar 15-20 ml del medio por cada placa de Petri y dejar soli-
dificar.
Técnica
Sembrar el aislamiento en estudio en una placa e incubar
CALDO CEREBRO CORAZÓN

Composición
Infusión de cerebro de ternero 7,7 g
Infusión de corazón de buey 9,8 g
Proteosa peptona 10 g
Glucosa 2 g
pH final 7,4 ± 0,2
Preparación
Técnica
152
MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS
Son aquellos medios de cultivo que por acción de uno
o más elementos que lo integran favorecen el desarrollo de
determinados grupos bacterianos e inhiben el crecimiento de
otros.
CALDO SELENITO
Caldo utilizado para el enriquecimiento selectivo de
Salmonella spp.
Composición
Selenito de sodio 4g
Digestión pancreática de caseína 5g
Lactosa 4g
Fosfato disódico 3g
Fosfato monopotásico 7g
Preparación
3. Alicuotar 9 ml en tubos de ensayo.
Técnica
Sembrar 1 ml del caldo de pre-enriquecimiento en 9 ml
de caldo selenito e incubar a 37 °C durante 24 h.
CALDO TETRATIONATO
Caldo utilizado para el enriquecimiento selectivo de
Salmonella spp.
Composición
Medio base
Peptona 5 g
Sales biliares 1 g
Carbonato de calcio 10 g
Tiosulfato de sodio 30 g
pH final 8,4 ± 0,2

Solución iodo iodada
Iodo 6g
Ioduro de potasio 5g
Agua destilada 20 g
Preparación
2. Mezclar vigorosamente y calentar en horno microondas.
153
3. Enfriar a 45 ºC.
4. Agregar 20 ml de solución iodada.
5. Mezclar y distribuir 10 ml en tubos estériles.
6. El medio base puede mantenerse a 4 ºC durante varios meses, pero
una vez agregada la solución iodada debe usarse en el mismo día.
Técnica
Sembrar 1 ml del caldo de pre-enriquecimiento en 10 ml
de caldo tetrationato e incubar a 37 °C durante 24 h.
AGAR CETRIMIDE
Agar utilizado para aislamiento selectivo de Pseudomonas
aeruginosa.
Composición
peptona de gelatina 20 g
cloruro de magnesio 1,4 g
sulfato de potasio 10,4 g
agar 13,6 g
cetrimide 0,3 g
glicerina 10 ml
pH final 7,2 ± 0,2
Preparación
1. Disolver 45,3 g del polvo comercial en un litro de agua destilada.
dificar.
Técnica
Interpretación
Microorganismo Crecimiento
Pseudomonas aeruginosa Bueno - excelente
Pseudomonas fluorescens Bueno
Pseudomonas putida Bueno
Pseudomonas stutzeri Inhibido
Escherichia coli Inhibido
Staphylococcus aureus Inhibido
MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES

Se denomina así al medio que por el ataque a un sus-
trato permite distinguir diferentes especies bacterianas con
características morfológicas y tintoriales similares.
154
AGAR CISTINA LACTOSA DEFICIENTE EN
ELECTROLITOS (CLDE)
Este medio de cultivo favorece el desarrollo de los micro-
organismos existentes en orina. Debido a la amplia disponi-
bilidad de sustancias nutritivas que ofrece, a su carencia de
sustancias inhibidoras y a la posibilidad de lograr una cierta
diferenciación de las colonias, resulta también un medio de
cultivo universal que goza de preferencia. Como sustancia
reaccionante contiene lactosa. La degradación a ácido de esta
última origina un viraje de color, hacia el amarillo del azul de
bromotimol. La alcalinización da lugar hacia un color azul in-
tenso. La notable pobreza de electrolitos conlleva la represión
de la proliferación de Proteus spp.
Composición
Peptona de caseína 4 g
Peptona universal 4 g
Extracto de carne 3 g
Cistina 0,128 g
Lactosa 10 g
Azul de bromotimol 0,02 g
Agar 12 g
pH final 6,8 ± 0,2
Preparación
dificar.
Técnica
Interpretación
Microorganismo Colonias
Escherichia coli, Citrobacter spp., Grandes, amarillo-doradas rodeadas de coloración
lactosa positivos amarilla.
Enterobacter spp., Klebsiella spp. Grandes, amarillo-doradas, casi siempre mucosas,
rodeadas de coloración amarilla
Proteus spp., Serratia spp. Grandes, incoloras, rodeadas de coloración azul.
Pseudomonas spp. Grandes, con el centro parduzco, rodeadas de
coloración azul.
Streptococcus spp., Enterococcus Amarillo pálidas, pequeñas, opacas.
spp.
Staphylococcus spp. Amarillo intensas, pequeñas, opacas.
155
MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y

DIFERENCIALES
Son medios de cultivo que contienen elementos que
inhiben el desarrollo de determinadas bacterias y favorece el
desarrollo de otras, permitiendo además diferenciar las colo-
nias de estas últimas mediante su acción sobre determinados
sustratos.
AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (EMB)

EMB es un medio selectivo y diferencial para el aisla-
miento de bacilos gramnegativos de la Familia Enterobacteria-
ceae. Diferencia bacterias fermentadoras, no fermentadoras y
fermentadoras tardías de la lactosa.
Composición
Peptona 10 g
Fosfato dipotásico 2 g
Agar 15 g
Lactosa 10 g
Eosina 0,4 g
Azul de metileno 0,4 g
pH final 6,8 ± 0,2
Preparación
dificar.
Técnica
Interpretación
Los colorantes anilínicos (eosina y azul de metileno) in-
hiben el desarrollo de algunas bacterias grampositivas y a las
bacterias grampositivas exigentes. Se combinan para formar un
precipitado a pH ácido, sirviendo como indicador de ácidez.
Fermentadores fuertes de lactosa como Colonias con color negro verdoso con brillo
Escherichia coli metálico
Fermentadores debiles de lactosa como Colonias de color púrpura en 24-48 h
Klebsiella spp., Enterobacter spp.,
Serratia spp., y Hafnia spp.
No fermentadores de lactosa como Colonias transparentes
Proteus spp., Salmonella spp., y Shigella
156
AGAR MACCONKEY
Se utiliza para el aislamiento de bacilos gramnegativos
de fácil desarrollo, aerobios y facultativos. Es un medio dife-
rencial para bacterias que crecen en el mismo y que utilizan o
no lactosa. Todas las especies de la Familia Enterobacteriaceae
desarrollan en este medio. Las mezclas de sales biliares y el
cristal violeta inhiben parte de la microbiota grampositiva. Las
colonias lactosa positivas son rojas debido a la acidificación
detectada por el indicador rojo neutro, mostrando además un
halo de turbidez por el precipitado de las sales biliares. Las
colonias lactosa negativas son incoloras.
Composición
Peptona 17 g
Pluripeptona 3 g
Lactosa 10 g
Mezcla de sales biliares 1,5 g
Agar 13,5 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,001 g
pH final 7,1 ± 0,2
Preparación
1. Suspender 50 g del polvo comercial por litro de agua destilada.
2. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar lentamente.
3. Calentar suavemente en horno microondas.
5. Dispensar 15-20 ml en placas de Petri estériles y dejar solidificar.
6. Dejar enfriar y conservar a 4 ºC
Técnica
Sembrar en superficie e incubar a 37 ºC durante 18-24 h.
Interpretación
Escherichia coli rojas con halo turbio
Klebsiella spp., Enterobacter spp. rosadas mucosas
Salmonella spp., Shigella spp. incoloras, transparentes
Proteus spp., Enterococcus spp. pequeñas, opacas
AGAR ENTÉRICO HEKTOEN

Medio altamente selectivo y diferencial para el aislamien-
to de Salmonella spp.
157
Composición
Peptona 12 g
Sales biliares 9g
Lactosa 12 g
Sacarosa 12 g
Salicina 2g
Cloruro de sodio 5g
Tiosulfato de sodio 5g
Citrato férrico de amonio 1,5 g
Fucsina ácida 0,1 g
Azul de timol 0,04 g
Agar 14 g
pH final 7,6 ± 0,2
Preparación
3. Alicuotar 15-20 ml en placas de Petri estériles y dejar solidificar.
Técnica
a 37 °C durante 24-48 h.
Interpretación
La alta concentración de sales biliares inhibe el creci-
miento de todas las bacterias grampositivas y retarda el de
muchas especies de coliformes. Pueden producirse acidos a
partir de los carbohidratos, y la fucsina ácida, al reaccionar
con el azul de timol produce un color amarillo cuando baja el
pH. El tiosulfato de sodio es la fuente de sulfuro. Cualquier
bacteria que produce gas sulfuro de hidrógeno se detecta por
un precipitado negro formado con citrato férrico.
Escherichia coli y enterobacterias Inhibidas moderadamente
fermentadoras de lactosa colonias naranja brillante a rosado salmón
Salmonella spp. Colonias azul-verdosas, con centros negros de
ácido sulfhídrico
Shigella spp. Colonias más verde que Salmonella spp. que
palidecen hacia la periferia
Proteus spp. Moderadamente inhibidas, colonias negras
pequenas y transparentes
158
AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD)
to de Salmonella spp. y Shigella spp.
Composición
Xilosa 3,5 g
Lisina 5 g
Lactosa 7,5 g
Sacarosa 7,5 g
Extracto de levadura 3 g
Rojo fenol 0,08 g
Agar 13,5 g
Deoxicolato de sodio 2,5 g
Tiosulfato de sodio 6,8 g
Citrato férrico de amonio 0,8 g
pH final 7,4 ± 0,2
Preparación
3. Alicuotar 15-20 ml en placas de Petri estériles y dejar solidificar.
Técnica
Interpretación
Las sales biliares en concentración relativamente baja
hacen que el medio sea menos selectivo que el agar entérico
hektoen. Tres carbohidratos están disponibles para la pro-
ducción de ácido y el rojo de fenol es el indicador de pH. Los
microorganismos lisina positivos, como algunas especies de
Salmonella spp. producen colonias inicialmente amarillas de-
bido a la utilización de xilosa y colonias rojas retardadas por
la decarboxilación de lisina. El tiosulfato de sodio es la fuente
de sulfuro. Cualquier bacteria que produce ácido sulfhídrico se
detecta por un precipitado negro formado con citrato férrico.
Escherichia coli, Klebsiella spp., Al utilizar uno o más carbohidratos pueden
Enterobacter spp. producir colonias amarillo brillante
Salmonella spp. Colonias rojas, con centro negros de ácido
sulfhídrico
Shigella spp., Providencia spp., No usan ninguno de los carbohidratos y
Proteus spp. producen colonias transparentes
Citrobacter spp. Colonias amarillas con centro negro
159
AGAR Salmonella Shigella (SS)

to de Salmonella spp. y Shigella spp.
Composición
pluripeptona 5 g
extracto de carne 5 g
lactosa 10 g
sales biliares 8,5 g
citrato de sodio 8,5 g
tiosulfato de sodio 8,5 g
citrato férrico 1 g
agar 13,5 g
verde brillante 0,00033 g
rojo neutro 0,025 g
pH final 7 ± 0,2
Preparación
3. Alicuotar 15-20 ml en placas de Petri estériles.
Técnica
Interpretación
Las altas concentraciones de sales biliares y citrato de
sodio inhiben a todas las bacterias grampositivas y a muchos
microorganismos gramnegativos. La lactosa es el único carbo-
hidrato y el rojo neutro es el indicador de pH para la detección
de ácido. El tiosulfato de sodio es la fuente de sulfuro. Cual-
quier bacteria que produce ácido sulfhídrico se detecta por un
precipitado negro formado con citrato férrico.
Bacterias fermentadoras de lactosa Colonias de color rojo
Escherichia coli
Salmonella spp. Colonias transparentes con centro negro
debido a la producción de ácido sulfhídrico
Shigella spp. Colonias transparentes sin centro negro
160
AGAR MANITOL SALADO
Agar utilizado para el aislamiento selectivo y diferencial
de Staphylococcus spp.
Composición
Pluripeptona 10 g
D-manitol 10 g
Agar 15 g
Rojo de fenol 0,025 g
pH final 7,4 ± 0,2
Preparación
2. Reposar 5 min y mezclar calentando en horno microondas.
dificar.
Técnica
Interpretación
Las colonias que desarrollen luego de 24 h serán resis-
tentes al cloruro de sodio y aquellas colonias manitol positivo
se observarán de color amarillo.
MEDIO DE EDWARDS
Medio elaborado para el aislamiento de Streptococcus
spp. productores de mastitis pero se extendió su uso para es-
pecies que causan otras patologías con óptimos resultados.
Composición
Peptona 10 g
Esculina 1 g
Cristal violeta 0,0013 g
Sulfato de talio 0,033 g
Agar 15 g
pH final 7,4 ± 0,2
Preparación
4. Enfriar a 50 ºC y agregar 5 a 7% de sangre estéril bovina u ovina,
homogenizar.
161
dificar.
Técnica
Interpretación
Las colonias de color negro o marrón, o aquellas que
presentan un halo de precipitación son esculina positiva, las
colonias de color blanco sin precipitación alrededor son con-
sideradas como esculina negativa.
162
ANEXO III –PRUEBAS BIOQUIMICAS
PRUEBAS BIOQUIMICAS SIMPLES
PRODUCCION DE CATALASA
El principio de esta prueba es determinar la capacidad
del aislamiento bacteriano en estudio de producir la enzima ca-
talasa. Se la utiliza para diferenciar los siguientes Géneros:
1. Streptococcus (-) del Micrococcus (+) y Staphylococcus (+).
2. Bacillus (+) del Clostridium (-).
3. Listeria (+) Enterococcus (-)
La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de las
bacterias que contienen citocromo, excepto Streptococcus;
generalmente las bacterias que carecen de citocromo también
carecen de catalasa, lo que les impide descomponer el peróxido
de hidrógeno (agua oxigenada); en lo que a anaerobios se re-
fiere (por ejemplo, especies de Clostridium), en vez de catalasa
estos poseen otra enzima denominada peroxidasa. No debe
partirse de colonias que provengan con medios que contengan
sangre, ya que naturalmente los hematíes poseen catalasas que
provocarían un resultado positivo falso. El reactivo utilizado
es el peróxido de hidrógeno al 3% (agua oxigenada).
Técnica
A temperatura ambiente (25 ºC). Método del portaobje-
tos con ansa recta se toma el centro de una colonia pura sin
arrastrar medio de cultivo (se puede hacer desde agar chocolate
pero con mucho cuidado de no arrastrar medio), colocarla en
un portaobjetos y añadir una gota de H2O2 al 3%. No invertir el
orden del método porque pueden producirse resultados falsos
positivos. No mezclar con la aguja o el asa de inoculación. No es
necesaria la mezcla del cultivo y el H2O2. Observar la inmediata
formación de burbujas (liberación de gas) y registrar resultado.
Desechar el portaobjetos poniéndolo en un desinfectante.
Interpretación
Prueba positiva: producción de burbujas (por liberación
de oxígeno)
Prueba negativa: no se producen burbujas.
PRODUCCION DE CITOCROMO-OXIDASA
del aislamiento bacteriano en estudio de producir la enzima
163
citocromo-oxidasa. Las bacterias producen una enzima de-

nominada citocromo-oxidasa, que cataliza la oxidación de
las sustancias por el oxígeno. Todas las bacterias aeróbicas
obtienen su energía por la respiración, proceso en que se
oxidan diversos sustratos por acción del O2 y del sistema de
transporte de electrones. Como el oxígeno es el aceptor final
del H2, según la especie bacteriana y su sistema enzimático se
producen agua o peróxido de H2. Se la utiliza para diferenciar
los siguientes Géneros:
a. originariamente para identificar todas las especies
de Neisseria, pero más adelante se la usó para diferenciar
las Pseudomonadaceae de los miembros citocromo-oxidasa
negativos de las Familia Enterobacteriaceae.
b. La mayoría de las bacterias grampositivas son cito-
cromo-oxidasa negativas.
c. Muchos de los bacilos gramnegativos, aparte de las
Enterobacteriaceae, tienen una actividad citocromo-oxidasa
negativa que las diferencia de otros bacilos gramnegativos
como Pasteurella, Bordetella y Brucella, entre otros.
Reactivos. Existen varias opciones:
• Kovacs (Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina
al 1 %)
• Gordon y McLeod (diclorhidrato de dimetil-p-fenilen-
diamina)
• Nadi (a.a. de a-naftol al 1%, alcohol etílico de 95° y
aminodimetilanilina al 1%
• Discos impregnados con p-fenilendiamina (los de
uso más frecuente). Son de suma utilidad para diferenciar
Pseudomonas (positivo) de otros bacilos gramnegativos como
las enterobacterias (citocromo-oxidasa negativas). Los discos
comerciales tienen un período de vencimiento muy corto, por
lo cual se recomienda comprar muy poca cantidad.
Técnica
Los colorantes p-fenilendiaminas son aminas aromáticas
primarias, diaminoderivados del benceno. La citocromo-oxi
dasa, en presencia del oxígeno atmosférico, oxida el reactivo
p-fenilendiamina para formar un compuesto coloreado, el
indofenol.
Interpretación de la prueba en disco
Prueba positiva: producción de color negro o violeta.
Prueba negativa: no se produce cambio de color.
164
ROJO DE METILO
El principio de esta prueba es comprobar la capacidad de
un organismo de producir y mantener estables los productos
ácidos terminales de la fermentación de glucosa, superando la
capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba cualita-
tiva de la producción de ácido (determinación del pH). Algunos
organismos producen más ácidos que otros. La prueba del
rojo de metilo (RM), se basa en el empleo de un indicador de
pH, rojo de metilo, para determinar la concentración de iones
hidrógeno (pH), presente cuando un organismo fermenta glu-
cosa. Todos los miembros de la Familia Enterobacteriaceae,
utiliza glucosa por vía fermentativa. En el caldo RM/VP des-
pués de 18-24 h de incubación, la fermentación resultante da
productos secundarios ácidos, por lo tanto inicialmente todas
las enterobacterias darán una reacción positiva con el rojo de
metilo. Después de 48 h de incubación, los organismos RM
positivos continúan produciendo ácidos, venciendo el sistema
amortiguador de fosfato, dando un pH final menor o igual a
4,2. Los organismos RM negativos, continúan metabolizando
los productos iniciales de la fermentación por decarboxilación,
produciendo acetilmetil carbinol (acetoína) neutro, dando un
pH final mayor o igual a 6. A continuación se describen los
medios y reactivos utilizados.
Composición del caldo RM/VP
Polipeptona 7g
Glucosa 5g
pH final 6,9 ± 0,2
Composición del indicador de pH

Rojo de metilo 0,1 g en 300 ml de etanol al 95%
Intervalo de pH entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo)
Preparación
2. Mezclar vigorosamente y calentar en horno microondas.
3. Alicuotar 3 ml en tubos de hemólisis.
4. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos.
Técnica
1. Inocular el caldo RM/VP con el cultivo a investigar.
2. Incubar a 37 ºC durante 48 h.
3. Añadir 3 gotas del indicador rojo de metilo a una alí-
165
cuota de ese cultivo.

Interpretación
Prueba positiva: desarrollo de color rojo estable (pH 4,4
rojo)
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo (pH 6
amarillo)
VOGES PROSKAUER
de algunos organismos de generar un producto final neutro, el
acetil metil carbinol (acetoína), a partir de la fermentación de
la glucosa. En presencia de oxígeno atmosférico y de hidróxi-
do de potasio al 40%, la acetoína se convierte en diacetilo, el
alfa naftol actúa como catalizador para revelar un complejo
de color rojo, formado por diacetilo y creatina proveniente del
catabolismo de las peptonas. Se la utiliza para diferenciar los
siguientes Géneros:
Klebsiella pneumoniae (+) y Enterobacter (generalmente
+) de E. coli (-).
La reacción de VP para la acetoína se usa sobre todo
para separar E. coli de los grupos Klebsiella-Enterobacter, aun
cuando otros Géneros de la Familia Enterobacteriaceae son
capaces de producir una reacción de VP positiva.
Reactivos
Composición
1) Alfa naftol (5%) 5g
Alcohol etílico absoluto 100 ml
2) KOH (40%) 40 g
AD 100 ml
Preparación del caldo RM/VP
De igual manera que en rojo de metilo
Técnica
1. Añadir 0,6 ml de alfa naftol 5% y 0,2 ml de KOH 40% a
otra alícuota de 2,5 ml del cultivo en caldo RM/VP. Es esencial
adicionar los reactivos en este orden.
2. Añadir 0,2 ml de KOH (40%). Agitar cuidadosamente
para exponer el medio al oxígeno, dejar reposar y efectuar la
lectura a los 15 minutos.
Interpretación
Prueba positiva: desarrollo de color rojo en anillo a los
15 minutos.
Prueba negativa: no hay modificación de color.
166
CRECIMIENTO EN AGAR CITRATO
El principio de esta prueba es identificar los aislamientos
bacterianos que son capaces de tomar el citrato como única
fuente de carbono para producir energía. Esta prueba se utiliza
para diferenciar los siguientes Géneros:
a.- Edwarsiella (-) de Salmonella (por lo general +)
b.- grupos Klebsiella-Enterobacter (por lo general +) de
E. coli (-)
Normalmente, el metabolismo del citrato comprende una
condensación de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para
entrar en el ciclo de Krebs. Un microorganismo que es capaz de
utilizar citrato como única fuente de carbono utiliza también
las sales de amonio como única fuente de nitrógeno. Las sales
de amonio se desdoblan en amoníaco (NH3) con la consiguien
te alcalinidad. La utilización de ácidos orgánicos y sus sales
como fuente de carbono produce carbonatos y bicarbonatos
alcalinos en la nueva degradación. El indicador de pH usado
es el azul de bromotimol, el cual en medio alcalino toma un
color azul intenso, indicando una prueba positiva. El medio
no inoculado tiene color verde.
Composición
Fosfato diácido de amonio 1 g
Sulfato de magnesio 0,2 g
Agar 15 g
Citrato de sodio 5 g
pH final 6,8 ± 0,2
Preparación
1. Resuspender 24,2 g del polvo comercial en un litro de agua desti-
lada.
2. Calentar a ebullición hasta disolución completa.
3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos de hemólisis.
5. Solidificar en forma de pico de flauta permitiendo la formación de
una base profunda
Técnica
La siembra en el medio con citrato debe realizarse en
estría, sobre un medio en pico de flauta, con aguja pues se
debe evitar el arrastre de material nutritivo del cultivo anterior;
incubar a 37 ºC por 24 a 48 h (hasta 4 días) y leer.
Interpretación
Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso
167
en el pico de flauta.
Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio
de color (verde).
TARTRATO
bacterianos que son capaces de utilizar el tartrato como única
fuente de carbono para producir energía.
Composición
Peptona 10 g
Azul de bromotimol (0,2%) 12 ml
L-tartrato 10 g
pH final 7,4 ± 0,2
Preparación
1. Pesar los componentes del medio y disolverlos en un litro de agua
destilada.
3. Fraccionar 3 ml del medio en tubos de hemólisis.
Técnica
Sembrar una ansada del cultivo en estudio e incubar a 37 ºC
por 18 a 24 h. Se debe utilizar un tubo control sin inoculo. En
ambos tubos (sembrado y sin sembrar) se debe agregar 0,5 ml
de una solución neutra de acetato de plomo al 50%. La utili-
zación de este compuesto se observa por la disminución del
precipitado formado en comparación con el tubo control.
Interpretación
Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso.
Prueba negativa: se observa crecimiento sin cambio de
color (verde)
MALONATO
El principio de esta prueba es identificar los aislamien-
tos bacterianos que son capaces de utilizar el malonato como
única fuente de carbono para producir energía.
Composición
Sulfato de amonio 2 g
Fosfato dipotásico 0,6 g
Fosfato monopotásico 0,4 g
Malonato de sodio 3 g
Glucosa 0,25 g
168
Azul de bromotimol (1/500) 12,5 ml
pH final 6,6 ± 0,1
Preparación
Técnica
Sembrar una ansada del cultivo en estudio e incubar a
37 ºC por 24 a 48 h (hasta 4 días).
Interpretación
Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso.
Prueba negativa: se observa crecimiento sin cambio de
color (verde).
MUCATO
bacterianos que son capaces de utilizar el ácido múcico.
Composición
Bacto peptona 1g
Acido múcico 1g
Hidróxido de sodio 4N 1,2 ml
Azul de bromotimol (1/500) 1,8 ml
pH final 7,4 ± 0,1
Preparación
1. Pesar el ácido múcico y disolver en 80 ml de agua destilada.
2. Colocar el recipiente sobre un agitador magnético y agregar 1,2 ml
de hidróxido de sodio 4N hasta virar el color amarillo de la solución al azul
verdoso.
3. Agregar 1 g de bacto peptona, 1,8 ml de azul de bromotimol y 15
ml de agua destilada.
4. Esterilizar por filtración.
Técnica
Sembrar una ansada del cultivo en estudio e incubar a
37 ºC por 48 h.
Interpretación
Prueba positiva: viraje del color al amarillo o amarillo
verdoso.
Prueba negativa: no hay cambio de color, el medio per-
manece azul verdoso.
169
Medio de Fermentación del piruvato

Composición
Triptona: 10 g
piruvato de sodio 5g
azul de bromotimol
(solución etanólica 4 mg/ml) 10 ml
K2HPO4 5g
agar 10 g
Preparación
Disolver los ingredientes sólidos por calor, enfriar y
adherir la solución indicadora. Mezclar y ajustar el pH a 7,2-
7,4. Dispensar en tubos de ensayo. Esterilizar a 115 grados
por 20 minutos. Colocar los tubos inclinados para producir
pico de flauta.
Interpretación:
Positivo: color amarillo el pico de flauta. Negativo: verde.
PRODUCCIÓN DE INDOL
de un organismo de desdoblar el indol de la molécula de tripto-
fano. El triptofano es un aminoácido que por oxidación puede
originar tres metabolitos indólicos principales: indol (desami
nación del ácido indol-pirúvico), ácido indolacético y escatol
(decarboxilación del ácido indolacético); estos metabolitos se
producen por acción de enzimas intracelulares denominadas
triptofanasas, lo que indica un sistema completo de enzimas
vinculadas con la producción del indol. El principal interme-
diario en la degradación del triptofano es el ácido indolpirúvico,
del cual puede formarse indol por desaminación y escatol por
decarboxilación del ácido indolacético. Esta prueba es utilizada
para diferenciar los siguientes Géneros y especies:
a.- Edwarsiella (+) de Salmonella (-)
b.- E. coli (+) de Klebsiella-Enterobacter (-)
c.- Proteus mirabilis (-) de otras especies de Proteus (+).
Como medio base se utiliza un caldo peptonado con trip-
tofano en concentración del 1 %. Para la detección del indol no
debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa.
Para determinar la producción de indol se utilizan los reactivos
de Kovacs (alcohol amílico o isoamílico, p-dimetilamino-benzal-
dehído, ácido clorhídrico concentrado) o Ehrlich (alcohol etílico,
p-dimetilamino-benzaldehído, ácido clorhídrico concentrado).
170
Técnica
Sembrar el caldo triptofanado con la cepa problema,
incubar durante 24 a 48 h a 37 ºC, añadir 5 gotas del reactivo
de Kovacs y leer.
Si se emplea reactivo de Ehrlich, antes de agregarlo aña-
dir al cultivo 1 ml de éter, esperar que ascienda a la superficie
con el indol y recién entonces agregar 0,5 ml de reactivo por
las paredes del tubo. Si el reactivo que se utiliza es el de Ko-
vacs, se le agregarán 5 gotas directamente al medio inoculado,
agitando suavemente el tubo. Cualquiera que sea el reactivo
empleado, si se hace la prueba de producción de indol en un
tubo incubado 24 h, se recomienda retirar asépticamente para
la prueba una porción de 2 ml.
a. La reacción positiva después de 24 h indica una prue-
ba completa.
b. Si el cultivo de 24 h es negativo, deberá incubarse
otras 24 h y repetir la prueba.
Cuando existe indol, éste se combina con el aldehído que

se encuentra en cualquiera de los dos reactivos, para dar un
color rojo en la capa de alcohol. Esta reacción se produce por
un proceso de condensación formado por un desdoblamiento
ácido de la proteína. La capa alcohólica extrae y concentra el
complejo de color rojo. Este complejo es soluble en éter etílico,
alcohol etílico, alcohol isoamílico o alcohol butílico.
Interpretación
a) Positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en
la capa alcohólica.
b) Negativa: no se produce color en la capa alcohólica;
toma el color del reactivo.
c) Variable: un color anaranjado en la superficie del me-
dio debido a desarrollo de escatol, un compuesto metilado que
puede ser un precursor de la formación de indol.
Esta prueba puede realizarse con pruebas bioquímicas
combinadas como SIM y MIO.
PRODUCCIÓN DE COAGULASA
Algunas especies del Género Staphylococcus (S. aureus
y S. intermedius, entre otras) producen la enzima coagulasa,
resistente al calor (60 ºC por 30 min) y de fácil inactivación
por medio de enzimas proteolíticas, in vivo actúa sobre compo
nentes séricos para producir coágulo, pero in vitro produce
171
coágulo a partir de plasma citratado u oxalatado y la velocidad

de coagulación del plasma aumenta de forma directamente
proporcional a la concentración enzimática. Se utiliza plasma
de conejo citratado, fresco y estéril.
Técnica
Varía según la coagulasa investigada.
· Coagulasa ligada (en portaobjetos): en una gota de
solución fisiológica emulsionar una suspensión de Staphylo-
coccus y agregarle una ansada de plasma citratado mezclando
suavemente; leer. Esta prueba no se recomienda ya que solo
puede detectar la coagulasa ligada a la pared.
· Coagulasa ligada y libre (en tubo): colocar volúmenes
iguales de plasma citratado de conejo (0,5 ml) y de cultivo en
caldo cerebro corazón (0,5 ml) de Staphylococcus (o con ansa,
una buena cantidad de colonia pura), mezclar suavemente e
incubar durante 4 h a 37 ºC controlando cada 30 min si se
produce la coagulación, ya que hay cepas de Staphylococcus
que producen la enzima estafiloquinasa que es capaz de licuar
el plasma y si no observamos esta reacción podríamos dar una
prueba como negativa.
Resultados de coagulasa en portaobjetos
Positivo: aglutinación entre 20 y 30 seg
Negativo: suspensión homogénea
Resultados de coagulasa libre

Positivo: producción de un coágulo entre el plasma y el
caldo de cultivo.
Negativo: el plasma y el caldo de cultivo se mantienen
líquidos.
FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS
Existen distintas clases de fermentación producidas por
las bacterias y cada una depende de los productos finales ca-
racterísticos formados. Los grupos más importantes de bacte
rias muestran uno de los cinco tipos principales de formas de
fermentación.
Fermentación alcohólica
Fermentación del ácido láctico
Fermentadoras heterolácticas
Fermentación del ácido propiónico
Fermentación del grupo coliforme
Los microorganismos pueden ser también ácidos mixtos.
172
Medios empleados
Caldo base rojo de fenol (pH 7,4). Los componentes de
este medio son: peptona, cloruro de sodio, extracto de carne
(opcional), rojo de fenol y agua destilada. Los carbohidratos
utilizados en la prueba generalmente son: glucosa, lactosa,
sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, inositol, sorbi-
tol, arabinosa, rafinosa, ramnosa, xilosa, trehalosa, celobiosa,
galactosa, inulina, fructosa, melobiosa; es importante señalar
que estos carbohidratos deben quedar en el medio con una
concentración final del 1%, excepto cuando utilizamos salicina,
que debe tener una concentración final del 0,5%.
El caldo rojo de fenol se utiliza como base para determi-
nar la capacidad de los microorganismos de utilizar diferentes
carbohidratos. La batería de carbohidratos es de fundamental
importancia para la identificación de la mayoría de las bacte-
rias patógenas.
Técnica
1. Resuspender 15 g del polvo comercial en 1000 ml de
agua destilada
2. Distribuir en alícuotas
3. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 min
4. Conservar a 4 °C
Solución de carbohidratos (10% p/v)

1. Disolver 1 g del carbohidrato en 10 ml de agua des-
tilada estéril.
2. Esterilizar con unidad filtrante de 0,22 mm. Debemos
considerar que algunos carbohidratos pueden ser esterilizados
en autoclave, como por ejemplo adonitol, dextrosa, dulcitol,
inositol, manitol y salicina.
3. Una alternativa para obtener carbohidratos estériles
es mezclar la solución de carbohidrato al 10% (inmedianta-
mente de prepararla), en igual cantidad de cloroformo, homo-
geneizar muy bien durante 2 min y dejar separar las fases de
carbohidrato y cloroformo durante 24 h. La fase superficial
corresponde al carbohidrato, por lo tanto se debe tomar la
solución de la superficie para preparar la concentración final
de carbohidrato al 1%.
Solución al 1% del carbohidrato en el medio base con
indicador de rojo de fenol
1. Fraccionar 9 ml del medio base rojo de fenol en tubos
con tapa bacteriológica.
173
2. Agregar 1 ml del carbohidrato al 10%.

3. Fraccionar 2 ml por tubo de hemólisis.
4. Conservar los tubos a 4 ºC.
Siembra
Se transfiere una colonia del aislamiento bacteriano en
estudio, se homogeiniza y se incuba a 37 ºC durante 24-48 h.
Sin embargo, en algunos casos se recomienda una incubación
de 3 a 7 días para interpretar correctamente los resultados.
Interpretación
La evaluación de la prueba radica en la determinación
del viraje del indicador; esto señalará que el carbohidrato
utilizado fue metabolizado por el aislamiento bacteriano en
estudio. Es importante señalar, que para evitar errores de
interpretación, la peptona incluida en el medio se encuentra
en mínima proporción para evitar los productos finales alca-
linos de su metabolismo. Por lo mismo, el ácido producido
por un metabolismo de un carbohidrato, se observa por el
cambio de pH originada ante el exceso del ácido con respecto
a las sustancias alcalinas del metabolismo de la peptona. El
medio sin inocular es de color rojo y en caso que se utilice un
carbohidrato se acidifica y vira al color amarillo.
Resultado positivo: el caldo vira a color amarillo debido
a la acidez producida por la utilización del carbohidrato.
Resultado negativo: el caldo permanece de color rojo o
vira a rojo intenso debido a la alcalinización producida por la
utilización de la fuente proteica.
Las pruebas de los carbohidratos suelen ser funda-
mentales para tipificaciones finales de los microorganismos,
sin embargo las más usuales son glucosa, lactosa y sacarosa
presentes en el medio TSI.
FENILALANINA DESAMINASA
El aminoácido fenilalanina por desaminación oxidativa
catalizada por una flavoproteína, produce amoníaco y ácido
fenilpirúvico. La presencia de este último se detecta por el
cloruro férrico en medio ácido, con el cual se forma un quelato
de color verdoso.
Composición
D-L-Fenilalanina 2g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato de disodico 1g
Agar 12 g
174
pH final 7,3 ± 0,2
Preparación
4. Alicuotar en tubos dejando un pico de flauta alargado y dejar so-
lidificar.
Técnica
1. Sembrar en superficie con el cultivo a investigar.
2. Incubar a 37 ºC.
3. Al cabo de 24-48 h de incubación agregar unas gotas del
reactivo revelador (solución acuosa de cloruro férrico al 10%).
Interpretación
Prueba positiva: coloración verde en la superficie del
medio.
Prueba negativa: no hay modificación del color en la
superficie del medio.
PRODUCCIÓN DE UREASA
El principio de esta prueba es identificar las bacterias que
hidrolizan la urea, y particularmente para diferenciar algunos
miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Aquellas bacterias
que poseen la enzima ureasa, desdoblan la urea, liberando
amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos metabólicos
alcalinizan el medio haciendo virar el indicador rojo fenol del
amarillo al rojo. Este medio, formulado por Rustigian y Stuart,
tiene extracto de levadura como única fuente de carbono y
nitrógeno. Si el microorganismo lo utiliza antes de lograr un
buen desarrollo, no se apreciará su capacidad de hidrolizar la
urea. Por lo tanto, este medio se recomienda para diferenciar
Proteus de otros Géneros de la Familia Enterobacteriaceae.
Para organismos que hidrolizan la urea lentamente, es reco-
mendable usar el medio de Christensen.
Composición
Urea 20 g
Extracto de levadura 0,1 g
Rojo fenol 0,01 g
pH final 6,8 ± 0,2
175
Preparación
1. Suspender 3,87 g del medio deshidatado por cada 100 ml de agua
destilada.
2. Disolver sin calentar y esterilizar por filtración.
3. Distribuir entre 0,5 y 2 ml en tubos de hemólisis.
Técnica
1. Sembrar un inóculo denso a partir de un cultivo puro
de 24 h. Incubar a 35 ºC.
2. Observar las reacciones después de 8, 12, 24 y 48 h.
Para aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea,
incubar por más tiempo.
Interpretación
Reacción positiva: rojo rosado
Reacción negativa: amarillo
PRUEBA DE LA BILIS-ESCULINA
El principio de esta prueba es determinar la hidrólisis
de esculina en un medio que contiene bilis. Los glucósidos
se producen por la unión de un elemento no hidrocarbonado
(acetal) con un carbohidrato y son rápidamente hidrolizados
por los ácidos; la esculina es un glucósido y cuando es hidro
lizada produce esculetina liberando la molécula de glucosa en
presencia de bilis (10 a 40%). Se utiliza el agar esculina con bilis
(pH 7,0), el cual posee en su constitución citrato de hierro como
indicador de la hidrólisis de la esculina y formación de escule
tina; ésta reaccionará con la sal de hierro produciéndose un
complejo castaño oscuro o negro. La bilis tiene como finalidad
inhibir el desarrollo de los organismos que no corresponden a
los Streptococcus del grupo D y Enterocococcus spp.
Composición
Bilis de buey 40 g
Esculina 1 g
Citrato férrico 0,05 g
Agar 15 g
Agua destilada csp. 1000 ml
pH 6,6 ± 0,2
Preparación
Suspender 64,5 g del polvo por litro de agua destilada.
Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 min hasta disolver.
Distribuir y esterilizar a 121 ºC durante 15 min.
Técnica
La cepa a investigar debe ser cultivada en caldo por 24h;
176
de allí se toman dos gotas que se agregan a la superficie del
medio de esculina con bilis (con pipeta o con ansa), incubán-
dose 48 h a 35 ºC.
Interpretación
Reacción positiva: castaño oscuro o negro en la mitad o
más de la superficie del medio de cultivo.
Reacción negativa: no hay ennegrecimiento o se produce
en menos de la mitad después de incubar 72 h (reacción +/-).
DETECCION DE b-GALACTOSIDASA (ONPG)

Mediante esta prueba se demuestra la presencia o au-
sencia de la enzima b-galactosidasa utilizando el compuesto
orgánico orto nitro fenil b-galactopiranósido (ONPG).
ONPG tiene una estructura similar a la de la lactosa
excepto que el ortonitrofenil sustituyó a la glucosa, como se
muestra en la siguiente reacción:

H2O
ONPG Galactosa + Ortonitrofenol
b-galactosidasa
La b-galactosidasa hidroliza ONPG en galactosa y orto-

nitrofenol.
ONPG es un compuesto incoloro y el ortonitrofenol es
amarillo.
Las bacterias que fermentan lactosa poseen dos enzimas:
lactosa permeasa y b-galactosidasa, ambas necesarias para la
fermentación de lactosa.
La permeasa permite que la molécula de lactosa penetre
en la célula bacteriana mientras que la b-galactosidasa hidro-
liza el galactósido en glucosa y galactosa.
Las bacterias que no fermentan lactosa carecen de ambas
enzimas y son incapaces de producir ácido de lactosa.
Algunas especies bacterianas parecen ser no fermenta-
doras de lactosa porque carecen de permeasa, pero si poseen
b-galactosidasa, hidrolizan el ONPG.
Aquellas que fermentan tardíamente la lactosa poseen
una lenta actividad de su permeasa pero serán ONPG posi-
tivas.
177
Técnica
Se suspende un cultivo bacteriano proveniente de un
medio que contenga lactosa, por ejemplo TSI (no usar EMB
Levine) en 0,2 ml de solución fisiológica hasta alcanzar una
alta densidad.
Adicionar un disco de ONPG e incubar a 37 ºC durante
20 min.
Observar y si es necesario continuar incubación hasta
4 h.
Interpretación
Reacción positiva: color amarillo
Reacción negativa: incolora
PRUEBA CAMP
Prueba destinada a la identificación presuntiva de
Streptococcus spp. betahemolíticos del grupo B. La actividad
hemolítica de la beta-hemolisina producida por la mayoría de
las cepas de Staphylococcus aureus es intensificada por una
proteina extracelular producida por Streptococcus spp. betahe-
molíticos del grupo B denominada factor CAMP. La interacción
de la beta-hemolisina con este factor produce «hemólisis sinér-
gica», que puede observarse fácilmente en un aplaca de agar
sangre. Este fenómeno se observa tanto con los aislamientos
hemolíticos como con los no hemolíticos de los Streptococcus
spp. no hemolíticos.
Materiales
1. Cepa de Staphylococcus aureus productora de beta-
hemolisina.
2. Placa de agar sangre de carnero.
3. Controles de calidad: positivo Streptococcus del grupo
B y negativo Streptococcus del grupo A.
Procedimiento
1. Hacer una estria única en línea recta que divida la
placa de agar sangre con S. aureus beta-hemolítico.
2. Sin tocar la estría del S. aureus, realizar una estría
perpendicular a esta, de 3-4 cm de longitud, con los aislamien-
tos a estudiar y con cada uno de los controles. Estas estrías
deben estar realizar de tal manera que luego de la incubación
no se junten con la estría de S. aureus.
3. Incubar la placa a 37 ºC durante 24 h.
Interpretación
Se observa una zona de mayor hemólisis cuando la beta-
178
hemolisina producida por S. aureus y el factor CAMP producido
por el Streptococcus spp. del grpo B se intersectan.
PRODUCCIóN DE ARGININA DEHIDROLASA, Y

LISINA Y ORNITINA DECARBOXILASAS
Las decarboxilasas son un grupo de enzimas con sus-
trato especifico capaces de reaccionar con el residuo carboxilo
(COOH) de los aminoácidos, para formar aminas de reacción
alcalina. Esta reacción conocida como decarboxilación, forma
dióxido de carbono como producto secundario. Cada enzima
decarboxilasa es específica para un aminoácido. Los tres ami-
noácidos probados habitualmente para la identificación de las
especies de la Familia Enterobacteriaceae son lisina, ornitina y
arginina. Los productos aminados específicos son cadaverina,
putrescina y citrulina, respectivamente.
La conversión de arginina a citrulina es una reacción
dehidrolasa y no decarboxilasa; en ella un grupo amino es
eliminado de la arginina como primer paso y posteriormente
la citrulina es convertida en ornitina, que se decarboxila para
formar putrescina.
El medio para decarboxilasas de Moeller es la base
utilizada para determinar las propiedades decarboxilasas. El
aminoácido a probar se agrega a la base antes de la siembra
con el microorganismo en estudio. Se recomienda sembrar en
paralelo un tubo control, que contiene la base sin el aminoá-
cido. Ambos tubos se incuban en anaerobiosis y se los cubre
con una capa de vaselina líquida. Al principio de la incubación
ambos tubos viran al amarillo, debido a la fermentación de
la pequeña cantidad de glucosa que contiene el medio. Si el
aminoácido es decarboxilado, se forman aminas alcalinas y el
medio vira nuevamente a su color púrpura original.
Composición del caldo base de Moeller

Peptona 5 g
Prpura de bromocresol 0,01 g
Rojo cresol 0,005 g
Glucosa 0,5 g
Piridoxal 0,005 g
pH final 6 ± 0,2
Preparación
1. Resuspender 10,5 g del polvo comercial en 1000 ml de agua destilada
179
2. Agregar 10 g (concentración final = 1%) del aminoácido (lisina,

ornitina o arginina).
3. Distribuir en alícuotas de 3 ml en tubos de hemólisis.
4. Preparar la misma cantidad de caldo base sin adicionar el aminoá-
cido para utilizar como control.
5. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
6. Conservar a 4 °C.
Técnica
1. Sembrar dos tubos de medio decarboxilasa de Mo-
eller, uno con el aminoácido a probar y el otro sin aminoácido
(control), a partir de una colonia aislada del microorganismo
en estudio.
2. Cubrir ambos tubos con vaselina líquida estéril, hasta
aproximadamente 1 cm por encima de la superficie, e incubar
Interpretación
El viraje del tubo a color amarillo indica que el microor-
ganismo es viable y que el pH del medio descendió lo suficiente
como para activar las enzimas decarboxilasas. La reversión
del tubo que contiene el aminoácido a un color azul-púrpura
indica una prueba positiva, debido a la formación de aminas
a partir de la reacción de decarboxilación.
Para evidenciar la actividad decarboxilasa también
existen medios comerciales (MIO, LIA) que se describen en la
página correspondiente.
REDUCCIÓN DE NITRATO
La capacidad de un microorganismo para reducir los
nitratos a nitritos es una carcaterística importante, que se
utiliza para identificar y diferenciar especies de muchos gru-
pos. La mayoría de los Géneros de la Familia Enterobacteria-
ceae reducen nitratos. Los microorganismos que reducen los
nitratos tienen la capacidad de extraer oxígeno de aquellos
para formar nitritos. La presencia de nitritos en el medio de
prueba se detecta por el agregado de alfa-naftilamina y ácido
sulfanílico, con formación de un colorante rojo de diazonio, el
p-sulfobendenoato-alfa-naftilamina.
Medios y reactivos
A. CALDO O AGAR PARA NITRATOS
Extracto de carne 3g
Peptona 5g
180
Nitrato de potasio 1g
Agar (libre de nitritos) 12 g
B. REACTIVO A
Alfa-naftilamina 5g
Acido acético 1000 ml
C. REACTIVO B
Acido sulfanílico 8g
Acido acético 1000 ml
Preparación
3. Distribuir en alícuotas 5 ml en tubos de hemólisis.
Técnica
1. Inocular el medio con una ansada del aislamiento en
estudio e incubar a 37 °C durante 24 h.
2. Finalizada la incubación, agregar 1 ml de cada uno
de los reactivos A y B, en ese orden.
Interpretación
Prueba positiva: desarrollo de color rojo dentro de los 30
seg después de agregar los reactivos
Prueba negativa: no se observa color luego de agregar
los reactivos.
PRUEBA DE OXIDACIóN-FERMENTACIóN
Los microorganismos sacarolíticos degradan la glucosa
por vía fermentativa u oxidativa. Los productos finales de la
fermentación son ácidos mixtos, relativamente fuertes, que
pueden ser detectados por las pruebas convencionales de
fermentación. Sin embargo, los ácidos formados en la degra-
dación oxidativa de la glucosa son en extremo débiles, y para
detectarlos es necesario el medio más sensible de oxidación-
fermentación Hugh y Leifson (medio OF). Este medio pre-
senta una baja relación proteína/carbohidrato que reduce
la formación de aminas alcalinas que puede neutralizar las
pequeñas cantidades de ácidos débiles que pueden formarse
a partir del metabolismo oxidativo. Las cantidades elevadas de
carbohidratos sirven para aumentar la cantidad de ácido que
puede formarse. La consistencia semisólida del agar permite
181
que los ácidos que se forman en su superficie se difundan a

través del medio; esto facilita la visualización del cambio de
pH del indicador. En este cambio también puede observarse
la motilidad del microorganismo en estudio.
Composición del medio OF

Peptona 2 g
Glucosa 10 g
Agar 3 g
pH final 7,1 ± 0,2
Preparación
1. Disolver 9,8 g del polvo comercial en 1000 ml de agua destilada.
3. Agregar la solución de glucosa filtrada previamente como se explicó
en 173.
4. Distribuir en tubos de 15 a 20 mm de diámetro interno para au-
mentar la superficie, preparar en pico de flauta.
5. Conservar a 4°C.
Técnica
1. Para la prueba de OF se necesitan 2 tubos, ambos
sembrados con el microorganismo en estudio mediante un
ansa en punta.
2. Sembrar en profundidad 3 o 4 veces.
3. Un tubo de cada par se cubre con una capa de vaselina
líquida esteril y el otro se deja expuesto al aire.
4. Incubar ambos tubos a 37 °C.
5. Observar a diario durante varios días.
Interpretación
La producción de ácido se detecta por la aparición de
un color amarillo. En el caso de microorganismos oxidativos,
la producción de color se puede notar en primer lugar cerca
de la superficie del medio. Los patrones de reacción son los
siguientes:
Tubo abierto Tubo cubierto Metabolismo
Acido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo
Acido (amarillo) Acido (amarillo) Fermentativo
Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacarolítico
182
PRODUCCION DE DNASA
Prueba utilizada para determinar la actividad de deoxirri-
bonucleasa de los microorganismos. Las bacterias formadoras
de DNAsa hidrolizan el ADN presente en el medio de cultivo.
Composición
Bacto triptosa 20 g
Acido deoxirribonucleico 2g
Cloruro de sodio 5g
Bacto agar 15 g
pH final 7,3 ± 0,2
Preparación
1. Disolver 42 g del polvo comercial en 1000 ml de agua destilada.
dificar.
Técnica
Inocular sobre la placa en forma de mancha, por ello se
pueden sembrar varios cultivos en una sola placa. Incubar 37 ºC
durante 18-24 h. Posteriormente, cubrir la placa con ácido clorhí-
drico 1N.
Interpretación
Positivo: se observa una zona clara alrededor de la man-
cha que contrasta con la turbidez del medio
Negativo: ausencia de dicha zona clara.
PYR
Prueba diseñada para la identificación presuntiva de
Streptococcus spp. beta-hemolíticos de los grupos A y D, y de
Enterococcus spp. El fundamento de esta prueba consiste en
la capacidad de ciertas bacterias de hidrolizar la pirrolidonil-
beta-naftilamida en menos de 30 min, liberándose el grupo
pirrolido que se determina con el reactivo revelador (N-N di-
metilamino cinamaldehído).
Preparación
Se comercializan discos impregnados en el sustrato
(pirrolidonil-beta-naftilamida)
Técnica
1. Tomar una colonia aislada y efectuar un repique para
aumentar el inóculo.
2. Suspender en 500 µl de solución fisiológica.
183
3. Agregar un disco de PYR e incubar a 37 ºC durante

30 min.
4. Retirar de la estufa y agregar una gota del revelador
(N-N dimetilamino cinamaldehído)
5. Esperar 5 min antes de interpretar.
Interpretación
Positivo: disco color rosado a rojo
Negativo: disco y solución color amarillo a incoloro.
PRODUCCIÓN DE PIOCIANINA (KING A)

Prueba utilizada para detectar y diferenciar Pseudomonas
aeruginosa de otras Pseudomonas basado en la producción
de piocianina. El medio utilizado se denomina Pseudomonas
agar P.
Composición
Peptona de gelatina 20 g
Sulfato de potasio 10 g
Cloruro de magnesio 1,4 g
Agar 15 g
pH final 7 ± 0,2
Preparación
2. Agregar 10 ml de glicerina.
dificar.
Técnica
Interpretación
Microorganismos Crecimiento Producción de pigmento
Pseudomonas aeruginosa Bueno Azul
Pseudomonas cepacia Bueno No pigmenta
PRODUCCION DE FLUORESCEINA (KING B)

Prueba utilizada para detectar y diferenciar Pseudomonas
aeruginosa de otras Pseudomonas basado en la producción de
fluoresceína. El medio utilizado se denomina Pseudomonas
agar F.
184
Composición
Tripteína 10 g
Sulfato de magnesio 1,5 g
Agar 15 g
pH final 7,2 ± 0,2
Preparación
2. Agregar 10 ml de glicerina.
dificar.
Técnica
Interpretación
Microorganismos Crecimiento Producción de pigmento
Pseudomonas aeruginosa Bueno Verde amarillento
Pseudomonas cepacia Bueno No pigmenta
HIDRÓLISIS DE GELATINA
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de
un microorganismo de producir enzimas de tipo proteolítico
(gelatinasas) que licúan la gelatina.
Composición
Extracto de carne 3g
Peptona 5g
Gelatina 120 g
pH final 7,2 ± 0,2
Preparación
3. Alicuotar 4-5 ml del medio en tubos de hemólisis.
Técnica
Sembrar el aislamiento en estudio en un tubo por pun-
ción e incubar a 37°C durante 24 h. Luego de las 24 h de
185
incubación colocar el tubo en una heladera durante 2 h para

determinar si se produjo o no la digestión de la gelatina.
Interpretación
Positivo: crecimiento, turbidez y licuefacción.
Negativo: crecimiento, turbidez sin licuefacción.
HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Fórmula
Almidón 10 g
agua destilada 50 ml
agar nutritivo 1000 ml
Preparación
Triturar el almidón con el agua destilada hasta hacer una
crema y adherir el agar nutritivo disuelto. Mezclar y esterilizar
a 115 ºC por 10 min. Distribuir en placas de Petri.
Técnica
Agregar 2 ó 3 gotas de iodo de Gram a un medio de
cultivo.
Interpretación
Observar inmediatamente. No color: hidrólisis (+), color
azul-negruzco (-, presencia de almidón). El color debe desapa-
recer dentro de pocos segundos de agregado el reactivo.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS COMBINADAS

Hasta aquí se describieron los fundamentos y las téc-
nicas básicas que comprende el estudio de la mayoría de las
bacterias que contemplan la bacteriología clínica. Para facilitar
la identificación bacteriana se usan de rutina pruebas bioquí-
micas combinadas tales como:
AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI)

de un microorganismo de fermentar los carbohidratos presen-
tes en el medio de crecimiento básico con producción o no de
gas. También permite visualizar la producción o no de ácido
sulfhídrico (SH2).
Composición
Peptona 20 g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1 g
Sulfato amónico ferroso 0,2 g
186
Rojo de fenol 0,025 g
Agar 13 g
pH final 7,3 ± 0,2
Preparación
3. Fraccionar en tubos de hemólisis (4 o 5 ml por tubo).
5. Solidificar en pico de flauta para obtener 2 cámaras de reacción:
fondo o profundidad (anaerobiosis); pico (aerobiosis).
Técnica
1. Inocular la superficie de la pico de flauta y el fondo
por punción.
3. Efectuar la lectura luego de 18-24 h de incubación.
Interpretación
La fermentación de carbohidratos provoca acidificación
del medio con viraje del indicador (rojo de fenol) al amarillo.
Las reacciones que pueden observarse son:
a) Pico alcalino (rojo) / fondo alcalino (rojo) No hay fer-
mentación de carbohidratos.
b) Pico alcalino (rojo) / fondo ácido (amarillo) Glucosa
fermentada. Lactosa y sacarosa no fermentadas.
c) Pico ácido (amarillo) / Fondo ácido (amarillo) Glucosa
fermentada. Lactosa y/o sacarosa fermentadas.
La producción de gas durante la fermentación de los
carbohidratos se evidencia por la aparición de burbujas o
fragmentación del medio.
La formación de ácido sulfhídrico se detecta por enne-
grecimiento debido a la producción de sulfuro ferroso.
MEDIO SULFURO, INDOL, MOVILIDAD (SIM)

de un microorganismo de producir indol. También permite vi-
sualizar la producción o no de ácido sulfhídrico, y determinar
la movilidad del mismo.
Composición
Tripteína 20 g
Peptona 6,1 g
Sulfato de hierro y amonio 0,2 g
Tiosulfato sódico 0,2 g
Agar 3,5 g
Ph final pH 7,3 ± 0,2
187
Preparación
5. Solidificar en posición vertical.
Técnica
Inocular el medio por punción e incubar a 37 ºC durante
24-48 h.
Interpretación
1. Respecto a la movilidad, el principio de esta prueba es
que las bacterias pueden desplazarse de un punto a otro gra-
cias a la presencia de flagelos. Las bacterias móviles producen
turbidez en el medio por migración en la línea de siembra. Las
bacterias negativas se mantienen en la línea de siembra y el
medio se mantiene transparente.
2. La formación de ácido sulfhídrico se detecta por en-
negrecimiento (producción de sulfuro ferroso).
3. Indol positivo: al adicionar reactivo de indol a la su-
perficie del medio se observa color rojo.
Indol negativo: al adicionar el reactivo de indol a la su-
perficie del medio no se observa color.
AGAR LISINA HIERRO (LIA)

LIA es un medio que se utiliza para detectar la producción
de lisina-decarboxilasa y ácido sulfhídrico simultáneamente.
La lisina puede ser decarboxilada por los microorganismos
que poseen la enzima, transformándose en cadaverina. Esto
produce el viraje del indicador púrpura de bromocresol al color
violeta. Como la decarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido
(pH inferior a 6), es necesario que se produzca previamente la
acidificación del medio de cultivo, por fermentación de la glu-
cosa. Por este motivo este medio de cultivo sólo debe utilizarse
para la diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa.
Los microorganismos que no producen lisina-decarboxilasa
pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje
del medio al amarillo. La incubación de 24 h ocasiona una
alcalinización en la superficie del medio de cultivo y conse-
cuentemente un viraje del pico al color violeta. La producción
de ácido sulfhídrico se visualiza por el ennegrecimiento del
medio, debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas
188
de Proteus y Providencia, con excepción de algunas cepas de
Morganella morganii, desaminan la lisina y producen ácido
alfa-ceto-carbónico. Este último, con la sal de hierro y por la
influencia de oxígeno forma combinaciones pardo-rojizas en
la región superficial del medio de cultivo.
Composición
Peptona 5 g
Glucosa 1 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
L-lisina 10 g
Citrato férrico amónico 0,5 g
Agar 15 g
pH final 6,7 ± 0,2
Preparación
2. Calentar en horno microondas hasta disolución completa
3. Fraccionar en tubos de hemólisis (4 ó 5 ml por tubo).
5. Solidificar en pico de flauta para obtener 2 cámaras de reacción:
fondo o profundidad (anaerobiosis); pico (aerobiosis).
Técnica
1. Inocular el fondo por punción y el pico de flauta en
superficie.
3. Efectuar la lectura luego de 24-48 h de incubación.
Interpretación
a) Pico violeta / fondo violeta: decarboxilación de lisina (+)
b) Pico violeta / fondo amarillo: no se produce decar-
boxilación de lisina (-)
c) Pico pardo rojizo / fondo amarillo: desaminación de
la lisina
La formación de ácido sulfhídrico se detecta por enne-
grecimiento (producción de sulfuro ferroso).
MEDIO MOVILIDAD INDOL ORNITINA (MIO)

Composición
Peptona 10 g
Triptona 10 g
Hidrocloruro de L-ornitina 5 g
Dextrosa 1 g
Agar 2 g
189
Púrpura de bromocresol 0,02 g

pH final 6,5 ± 0,2
Preparación
5. Solidificar en posición vertical.
Técnica
Inocular el medio por punción e incubar a 37 ºC durante
24-48 h.
Interpretación
1. Respecto a la movilidad, el principio de esta prueba es
que las bacterias pueden desplazarse de un punto a otro gracias a
la presencia de flagelos. Las bacterias móviles producen turbidez
en el medio por migración en la línea de siembra. Las bacterias
negativas se mantienen en la línea de siembra y el medio se
mantiene transparente.
2. Ornitina decarboxilasa positivo: fondo del tubo violeta.
Ornitina decarboxilasa negativo: fondo del tubo amarillo.
3. Indol positivo: al adicionar reactivo de indol a la superficie
del medio se observa color rojo.
Indol negativo: al adicionar el reactivo de indol a la super-
ficie del medio no se observa color.
190
ANEXO IV – SOLUCIONES
AGUA PEPTONADA
Composición
Peptona 1g
Preparación
1. Disolver la peptona en un litro de agua destilada.
2. Dispensar la solución de acuerdo al uso.
3. Esterilizar en autoclave a 121 ºC, durante 15 min.
AGUA PEPTONADA BUFFERADA

Composición
pH final 7,2 ± 0,2
Preparación
2. Alicuotar en frascos según el uso que se pretende.
Técnica
SOLUCIÓN FISIOLOGICA
Composición
Cloruro de sodio 8,5 g
pH final a 25 ºC 7 ± 0,2
Preparación
1. Disolver el cloruro de sodio en un litro de agua destilada.
2. Dispensar la solución de acuerdo al uso.
3. Esterilizar en autoclave a 121 ºC, durante 15 minutos.
SOLUCION FISIOLÓGICA FORMOLADA 1% V/V

Se utiliza para inactivar cultivos de bacterias
Composición
Solución fisiológica estéril 97,5 ml
Formol 40% V/V 2,5 ml
Preparación
1. Mezclar 2,5 ml de formol 40% V/V con 97,5 ml de Solución fisio-
191
lógica estéril.
2. Conservar a temperatura ambiente.
SoluciÓn salina buferada estEril (PBS)

Composición
Solución concentrada 10X
Cloruro de potasio 2 g
Fosfato ácido disódico anhidro 11,5 g
Fosfato diácido monopotásico 2 g
pH final 7,3 ± 0,2
Solución de trabajo 1X
Se realiza una dilución 1:10 de la solución concentrada 10X.
Preparación
1. Disolver los componentes de la solución concentrada 10X en 1000
ml de agua destilada.
2. Esterilizar la solución 10X, en autoclave a 121 ºC, durante 15
min.
3. Realizar una dilución 1:10 de la solución 10X.
4. Esterilizar la solución 1X, en autoclave a 121 ºC, durante 15 min.
192
ANEXO VIII - Determinación de
b-lactamasas
Propósito
Una rápida determinación de b-lactamasas brinda infor-
mación clínica relevante. Es la única confiable para la detección
de Enterococcus spp. productores de estas enzimas.
Una determinación positiva predice resistencia a penici-
lina, amino, carboxi y ureidopenicilinas para Staphylococcus
spp. y Enterococcus spp.
Una determinación negativa de b-lactamasa no descarta
resistencia debido a otros mecanismos. No corresponde rea-
lizar la determinación en Enterobacteriaceae, Pseudomonas
spp., y otros bacilos gramnegativos aerobios, dado que estos
resultados no pueden predecir la sensibilidad a los diferentes
antibióticos b-lactámicos.
Métodos de detección de b-lactamasas

Por el método iodométrico se obtuvieron resultados satis-
factorios para las cepas de Staphylococcus spp. y Enterococcus
spp. En Staphylococcus spp. la detección de b-lactamasas
mejora realizando la determinación con la población que
desarrolla en el borde de la zona de inhibición del disco de
oxacilina.
Método iodométrico
Todos los métodos de detección de estas enzimas se
basan en los cambios químicos producidos en la molécula
de Penicilinas y Cefalosporinas al ser hidrolizado, por estas
enzimas, el anillo b-lactámico. El método iodométrico se basa
en la capacidad de reducir el iodo que tiene el ácido peniciloico
y no la penicilina.
Adaptación en gel de agar de Labia y Barthelemy

La reacción se realiza en un aplaca de Petri que contie-
ne en gel-agar-sustrato, el clásico sistema iodo-almidón, que
inicialmente da un color azul. Al ser hidrolizado el antibiótico
ß-lactámico por el crudo enzimático o el inóculo bacteriano,
el gel es localmente decolorado.
193
Materiales y Métodos
Buffer fosfato pH 7.0 100 ml
Almidón soluble 0,5 g
Agar 1,5 g
Reactivo de iodo 1,6 ml
Sustrato:
Penicilinas 0,1 mg/ml
Cefalosporinas 1,0 mg/ml
Buffer fosfato (0,1M; pH: 7,0)

Disolver 13,4 g de Na2HPO4.7H2O en 500 ml de agua
destilada y 6,85 g de KH2PO4 en 500 ml de agua destilada.
Mezclar 80 ml de la solución de Na2HPO4 con 45 ml de
la solución KH2PO4.
Ajustar a pH con la solución de fosfato apropiada.
Estable varias semanas a temperatura ambiente.
Reactivo de Iodo (0,08M en 3,2M de KI)

Pesar 2,0 g de I2 y 53,29 g de KI en 100 ml de agua
destilada.
Conservar a temperatura ambiente en envase de vidrio
color caramelo. Estable por varios meses (debe prepararse
nuevo cuando se observa un precipitado).
Colocar en un erlenmeyer el agar y el almidón y calen-

tar hasta disolver. Enfriar a 50 ºC y agregar el sustrato y el
reactivo de iodo.
Mezclar rápidamente y distribuir en placas de Petri de
10 a 15 ml.
Una vez solidificado el agar, se practican orificios con
una pipeta Pasteur.
Las placas se guardan a 4 ºC al abrigo de la luz. La de-
coloración indica el envejecimiento (1 semana).
Procedimiento
Se prepara una suspensión densa del MO a ensayar en
buffer fosfato o solución fisiológica
Se inocula en los orificios practicados
Se guarda a 4 ºC al abrigo de la luz durante no menos
de 4 h.
Si la reacción es positiva se observa un halo decolorado
alrededor de los orificios sembrados.
194
ANTIMICROBIANOS A PROBAR SEGÚN ESPECIES
ANIMAL Y BACTERIANA
Enterobacterias

µg S I R
Ampicilina/Amoxicilina 10 ≥ 17 14-16 ≤ 13
Amoxicilina-Clavulámico 20/10 ≥ 18 14-17 ≤ 13
Gentamicina 10 ≥ 15 13-14 ≤ 12
Tetraciclina 30 ≥ 19 15-18 ≤ 14
Cefalotina 30 ≥ 18 15-17 ≤ 14
Cefalosporias 3 gen (CTX) 30 ≥ 14 15-22 ≤ 23
Ceftiofur 30 ≥ 21 18-20 ≤ 17
Enrofloxacina 5 ≥ 23 17-22 ≤ 16
≥ 21 Bovinos
Ciprofloxacina* 5 ≥ 15 16-20 ≤ 21
Nitrofuranos (IU) * 300 ≥ 14 15-16 ≤ 17
* Valores de humanos. Pueden usarse en pequeños animales
Staphylococcus spp.
µg S I R
Penicilina 10 U ≥ 29 - ≤ 28
Eritromicina 15 ≥ 23 14-22 ≤ 13
Oxacilina ** 1 ≥ 13 11-12 ≤ 10
Gentamicina 10 ≥ 15 13-14 ≤ 12
Tetraciclina 30 ≥ 19 15-18 ≤ 14
Enrofloxacina 5 ≥ 23 17-22 ≤ 16
Ciprofloxacina* 5 ≥ 15 16-20 ≤ 21
Amoxicilina-Clavulámico 20/10 ≥ 20 - ≤ 19
Ampicilina/Amoxicilina 10 ≥ 29 - ≤ 28
Vancomicina 30 ≥ 12 10-11 ≤9
Nitrofuranos (IU) * 300 ≥ 14 15-16 ≤ 17

** Sensible a Oxa significa Sensible a todos los betalactámicos
195
PREDICCION DEL GEN mecA

µg Oxacilina Oxacilina
Sensible Resistente
Cefoxitina 30 S, aureus ≥ 19 ≥ 20
S. lugdunensis
S. C. N. ≥ 24 ≥ 25
Enterococcus spp.
µg S I R
Ampicilina 10 ≥ 17 - ≤ 16
Vancomina 30 ≥ 14 15-16 ≤ 17
Tetraciclina 30 ≥ 19 15-18 ≤ 14
Gentamicina alta carga 120 ≥ 6 7-9 ≤ 10
Nitrofurandos (IU) * 5 ≥ 15 16-20 ≤ 21
Streptococcus spp.
µg S I R
Penicilina 10 U ≥ 28 20-27 ≤ 19
Eritromicina 15 ≥ 21 16-20 ≤ 15
Tetraciclina 30 ≥ 23 19-22 ≤ 18
Pseudomonas spp.*
µg S I R
Piperacilina 100 ≥ 17 - ≤ 18
Ceftacidima 30 ≥ 14 15-17 ≤ 18
Cefotaxima 30 ≥ 14 15-22 ≤ 23
Gentamicina 10 ≥ 12 13-14 ≤ 15
Tetraciclina 30 ≥ 14 15-18 ≤ 19
Cicprofloxacina 5 ≥ 15 16-20 ≤ 21
196
CONTROL DE CALIDAD PARA TEST DE
DIFUSION EN AGAR
µg Escherichia Staphylococcus Pseudomonas
coli aureus aeruginosa
ATCC 25922 ATCC 25923 ATCC 27853
Amoxicilina- 20/10 15-24 28-36 -
Clavulámico
Ampicilina 10 16-22 27-35
Cefotaxima 30 29-35 25-31 18-22
Cefoxitina 30 23-29 23-29 -
Ceftacidima 30 25-32 16-20 22-29
Cefalotina 30 15-21 29-37 -
Cloramfenicol 30 21-27 19-26 -
Ciprofloxacina 5 30-40 22-30 25-33
Eritromicina 5 - 22-30 -
Gentamicina 10 19-26 19-27 16-21
Nitrofurantoina 300 20-25 18-22 -
Oxacilina 1 - 18-24 -
Penicilina 10 U - 26-37 -
Piperacilina 100 24-30 - 25-33
Tetaciclina 30 18-25 24-30 -
Vancomicina 30 - 17-21 -
Gentamicina 120 µg Enterococcus faecalis ATCC 29212 16 a 23 mm

Pseudomonas spp.*
* Valores de humanos. Pueden usarse en pequeños animales.
197
198
ANEXO VI – MODELO DE PLANILLA
PARA LA RECOLECCION DE DATOS
PLANILLA PARA REGISTRO DE
AISLAMIENTOS BACTERIANOS
Fecha de recepción:
Remitente:
Establecimiento de origen:
Localidad: Provincia:
Especie animal:
Raza: Edad: Sexo:
Peso corporal:
Sintomatología:
Lesiones macroscópicas:
Diagnóstico presuntivo:
Tratamiento:
Plan de vacunación:
Vacuna: Lote:
Aislamiento bacteriano nº:
Identificación:
Género: Especie: Subespecie:
Biotipo: Serotipo:
Antibiograma:
Otros:
199
ANEXO VII - ESCALA NEFELOMETRICA

DE McFARLAND
Ordenar en una gradilla 11 tubos del mismo tamaño de
aquellos usados en la dilución del material a comparar (vacu-
nas, suspensiones bacterianas, etc.)
Rotular desde 0,5 a 10.
Agregar a cada tubo una dilución de sulfato de bario an-
hidro al 1% y solución fría de ácido sulfúrico 1% químicamente
puro (v/v), de acuerdo a lo indicado en la tabla.
Sellar los tubos y guardar en refrigerador.
Cada tubo posee diferente densidad, la cual corres-
ponde en forma aproximada a las suspensiones bacterianas
señaladas.
Para usar, agitar bien el tubo requerido hasta suspen-
sión homogénea.
CONTENIDO (ml) Suspensión Bacteriana /

TUBO Nº ml
BaCl2 (1%) SO 4H2 (1%)
Correspondiente (108)
0.5 0.05 9.95 1.5

1 0.1 9.9 3
2 0.2 9.8 6
3 0.3 9.7 9
4 0.4 9.6 12
5 0.5 9.5 15
6 0.6 9.4 18
7 0.7 9.3 21
8 0.8 9.2 24
9 0.9 9.1 27
10 1.0 9.0 30
200
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203
204

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Bacteriología

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