UNIVERSIDAD NACIONAL “PEDRO RUIZ GALLO”

Facultad de Ciencias Biológicas

ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Departamento Académico de Biología

Escuela Profesional:
Ciencias Biológicas

Asignatura:
Microbiología Acuática

Integrantes:
- Moreno Tafur Carlos
- Sandoval Flores José
- Diaz Valdera Alex
- Infante Requejo Cesar

Semestre:
2020-I

Tarea:
Colimetría presuntiva y confirmativa de coliformes totales y termotolerantes

Lambayeque – Septiembre 2020

I. Introducción

El grupo de los coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat

primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante,
abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y
multiplicación fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que
este grupo se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; encontrándose
que mientras mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad
de estar frente a una contaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un
tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos microorganismos se
utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias

La detección y enumeración de coliformes como indicadores bacterianos de

contaminación de las aguas garantiza la aplicación de un sistema de vigilancia, teniendo
en cuenta los perjuicios a la salud que pueden provocar el resto de los agentes
patógenos implicados también en la transmisión hídrica, de esta manera aporta
elementos importantes para minimizar futuras contaminaciones del agua.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces

de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C.
Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo, la más prominente es
Escherichia coli.

II. Objetivos

 Determinar el número de coliformes totales y termotolerantes, utilizando el método

del número más probable (NMP).
 Identificar bioquímicamente a Escherichia coli.
III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. MATERIALES
3.1.1. Muestra de agua de grifo
La muestra de agua que utilizo Gamboa, R. (2018) en calidad microbiana
de las fuentes de agua de mayor consumo de la población del cercado de
Lima-Perú, presenta como característica física un color claro, limpio
aparentemente, sin olor característico, pocas partículas en suspensión y
sin sedimento. Está debidamente etiquetada y se ha cumplido con todos
los procesos de transporte en cajas de conservación.

3.1.2. Tubos de 150 mm por 15 mm con tapa de rosca

Tubos diseñados para diversas aplicaciones como contener pequeñas
cantidades de sustancias y realizar pruebas y ensayos de reacción. En
está practica se usaran para determinar el número de coliformes totales y
termotolerantes e identificar bioquímicamente a E. coli.

3.1.2. Campanas de
Durham
La campana Durham es un tubo de laboratorio de vidrio con boca recta y
fondo redondo de medidas 6x35 mm, que sirve para la recuperación de
gas en estudios de microbiología. Estas se colocan boca abajo dentro de
tubos de ensayo más grandes y permite la visualización de las burbujas
de aire atrapadas que han generado los microorganismos.
3.1.3. Medio de cultivo Lauril Sulfato Triptosa
Es un medio selectivo recomendado para la enumeración de coliformes
en agua y productos lácteos, así como para pruebas de confirmación de
fermentación de lactosa con producción de gas por coliformes en
alimentos. Es recomendado para la prueba presuntiva de número más
probable de coliformes en aguas, efluentes o aguas residuales, también
como una prueba confirmatoria de fermentación de lactosa con
producción de gas para muestras de leche y para la detección de
coliformes en alimentos. Este caldo fue elaborado para promover un
crecimiento abundante y una alta producción de gas a partir de pequeños
inóculos de organismos coliformes.

3.1.4. Agar ENDO

El agar ENDO es un medio de cultivo diferencial y ligeramente selectivo
utilizado para la detección de coliformes y otros microorganismos
entéricos. La selectividad del agar ENDO se debe a la combinación de
sulfito de sodio y fucsina básica que inhibe ligeramente el crecimiento de
los microorganismos Gram positivos.
3.1.5. Medio EC
Medio EC fue desarrollado para la identificación selectiva de bacterias
coliformes y Escherichia coli en agua, alimentos y otros. Este medio
mejora los métodos de detección del grupo coliforme, en particular de E.
coli, y se utiliza para investigar el agua potable, los sistemas de
tratamiento de aguas residuales y, en general, para el control de la
calidad del agua. Este medio está compuesto por sales biliares que
actúan como un agente selectivo que inhibe bacterias Gram-positivas,
bacilos y enterococos, pero que permite el desarrollo de E. coli. , sales de
potasio que tienen una alta capacidad de amortiguación, Triptosa la cual
proporciona los nutrientes para el crecimiento, lactosa que es el
carbohidrato fermentable como fuente de carbono y energía y el cloruro
de sodio que mantiene el equilibrio osmótico.

3.2.6. Incubadora
Una Incubadora de laboratorio es un dispositivo utilizado para cultivar y
mantener cultivos microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora
mantiene una temperatura y humedad óptima. Las incubadoras de
laboratorio son esenciales para una gran cantidad de trabajos
experimentales en el campo de la microbiología.
3.2.7. Pipeta
Las pipetas permiten la transferencia de un volumen generalmente no
mayor a 20 ml de un recipiente a otro de forma exacta. Este permite
medir alícuotas de líquido con bastante precisión. Suelen ser de vidrio.
Está formado por un tubo transparente que termina en una de sus puntas
de forma cónica, y tiene una graduación indicando distintos volúmenes.

3.2.8. Asas
Se emplea para transportar, arrastrar o trasvasar inóculos (pequeño
volumen que contiene microorganismos en suspensión) desde la solución
de trabajo también llamada “solución madre” al medio de cultivo (sólido o
líquido) o de un medio a otro (resiembra).

3.2.9. Placas de Petri

Recipiente redondo, hecho de vidrio o de plástico, posee diferentes
diámetros, es de fondo bajo, con una cubierta de la misma forma que la
placa, pero un poco más grande de diámetro, ya que se puede colocar
encima y cerrar el recipiente, como una tapa. Es utilizado para el cultivo
de bacterias y otras especies relacionadas.
 3.2.9. Marcador de vidrio
Se utiliza en el laboratorio para rotular material de vidrio como tubos de
ensayo, placas de Petri, portaobjetos, matraces, etc.

3.2. Procedimiento

3.2.1. Prueba presuntiva-Coliformes totales

Se necesitarán 5 tubos de 15x150 mm para cada dilución, con el medio
de cultivo Lauril Sulfato Triptosa.
Tomar 10 ml de
muestra y agregar a la
primera serie de tubos.
 Tomar 1 ml de
muestra y agregar a
la segunda serie de
tubos. Tomar 0.1 ml de
muestra y agregar a la
tercera serie de tubos.

Incubar a LECTURA: Si se observa turbidez o

35°C por producción de gas el tubo se considera
24h a 48h. positivo y se debe anotar el número de
tubos positivos para posteriormente hacer
el cálculo del NMP.

3.2.2. Prueba confirmativa para coliformes totales

Todos los tubos que

resultaron positivos se
siembran en placas de
Petri con agar ENDO.
 Se incuban las placas a 37°C por 24 horas.
hhoras
LECTURA: Observar colonias y las lactosa positiva
presentaran un brillo metálico

3.2.3. Coliformes termotolerantes

De los tubos positivos obtenidos en la prueba presuntiva de coliformes
totales se toman una o 2 asadas y se siembran en tubos con medio EC.
 Sembramos en tubos con
medio EC.

Tubos positivos

Llevamos a
incubación a
45°C durante RESULTADOS: Se registran
24 horas. los tubos que presenten
turbidez y gas, los cuales
serán los positivos, se
comparan con la tabla NMP
y se registran los
resultados.

3.2.4. Identificación de E. coli

De los tubos gas positivos de la prueba anterior (coliformes
termotolerantes), los sembramos en placas con agar ENDO.
Sembramos en Incubar a
placa con agar 37°C por 24
ENDO. horas.

Evaluar los cultivos, lactosa

positiva presentan brillo
metálico.

Repicar las
Incubar a colonias en
37°C por 24 tubos con agar
horas. tripticasa soya.

Realizar la identificación Bioquímica: IMViC, Urea

INDOL Voges-proskauer
Rojo UREA
Citrato
de metilo
IV. Resultados e interpretación

4.1. Resultados

4.1.1. Coliforme totales

4.1.1.1. Prueba presuntiva

Tabla 01:

Resultados de la prueba presuntiva de coliformes totales

Número de tubos Número INDICE

más DE
Datos
Probable NMP/100
(NMP) ml

Dilució 1 2 3 4 5
n
10 ml Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 5
1 ml Positivo Negativo Positivo Positivo positivo 4 130
0,1 ml Negativ Negativo Negativ Negativ negativo 0
o o o

obtenidos por: Palomino, C. (2017) en calidad microbiológica y fisicoquímica de las aguas de consumo
humano y de riego del distrito de Luricocha de la provincia de Huanta – Ayacucho 2016 – 2017

4.1.1.2. Prueba confirmativa

Tabla 02:

Resultados de la prueba confirmativa de coliformes totales

Dilución Coliformes totales INDICE DE NMP /100 ml

(Positivos)
10 ml 3
1 ml 2 14
0,1 ml 0

Datos obtenidos por: Palomino, C. (2017) en calidad microbiológica y fisicoquímica de las aguas
de consumo humano y de riego del distrito de Luricocha de la provincia de Huanta – Ayacucho
2016 – 2017
 4.1.2. Coliformes termotolerantes

4.1.2.1. Prueba presuntiva

Tabla 03

Resultados de la prueba presuntiva de coliformes termotolerantes

Datos
Dilución Coliformes Termotolerantes INDICE DE NMP /100
(Positivos) ml
10 ml 2
1 ml 0 4
0,1 ml 0

obtenidos por: Palomino, C. (2017) en calidad microbiológica y fisicoquímica de las aguas de consumo
humano y de riego del distrito de Luricocha de la provincia de Huanta – Ayacucho 2016 – 2017

4.1.3. Identificación de E. coli

Tabla 04

Resultados de las pruebas bioquímica de Eschirichia coli

Bacteria/Prueb Indol Rojo de Voges - Citrato Ureasa

a INViC Metilo Proskauer
Anillo rojo Color rojo Color Crecimiento Color
Escherichia coli oscuro magenta Marrón no visible amarillo
(+) (+) (-) (-) (-)

Datos obtenidos por: Baldeón, J. (2013) en calidad bacteriológica del agua de cultivo de
oncorhynchus mykiss del centro piscícola “el ingenio”, huancayo - junín

4.2. Interpretación
El limite establecido en el Reglamento de la Calidad del Agua para Consumo
Humano - DS N° 031-2010-SA - Dirección General de Salud Ambiental -
Ministerio de Salud, en el artículo 60°, el cual es <1,8 NMP/100ml.
  Coliformes totales. Código NMP: 5-4-0, Contiene 130 NMP/100ml.

 Coliformes termotolerantes. Código NMP: 2-0-0, Contiene 4 NMP/100ml.

 Prueba confirmativa. Código NMP: 3-2-0, Contiene 14 NMP/100ml.

V. Conclusiones
 Se demostró que determinar el número de coliformes totales y termotolerantes,
utilizando el método del número más probable (NMP), es útil para evaluar muestras
de agua de consumo humano.
 Los niveles de coliformes totales y termotolerantes en el agua de grifo sobrepasan
los valores permisibles del DS N° 031-2010-SA del reglamento de la calidad del
agua para consumo humano con valores 130 y 4 NMP/100ml respectivamente,
siendo no apto para el consumo humano.
 La carga microbiologica que presentaron la muestras, reflejan que el agua de grifo
supera los Limites maximos permisibles (LMP) que señala el reglamento de la
calidad del agua para consumo humano, siendo un peligro para la salud pública.

VI. Recomendaciones

 Se recomienda que a las autoridades correspondientes realicen un monitoreo

constante de la cantidad de coliformes presentes en el agua y contar un tratamiento
especial de la fuente de agua para prevenir enfermedades.

 Se recomienda hervir el agua antes de su consumo, para prevenir enfermedades.

VII. Referencias bibliográficas

Agar ENDO. (s.f)
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Aga
rEndo.pdf

Campana de Durham.(s.f) https://www.labcomercial.com/es/tubos-y-accesorios/2455-

campana-durham-6x35mm.html

Condalab. (s.f). Caldo Lauril Sulfato (Caldo Lauril Triptosa - Ltb [Archivo PDF].
https://www.condalab.com/int/es/index.php?
controller=attachment&id_attachment=8664
Dirección General de Salud Ambiental del Ministerio de Salud. Reglamento de la
Calidad del Agua para Consumo Humano: D.S. N° 031-2010-SA /. Febrero 2011.
 http://www.digesa.minsa.gob.pe/publicaciones/descargas/Reglamento_Calidad_
Agua.pdf

Gamboa Ruiz, R. (2018). Calidad microbiana de las fuentes de agua de mayor consumo
humano de la población del Cercado de Lima-Perú [tesis de pregrado]
Repositorio institucional Universidad Nacional del Callao.
http://209.45.55.171/bitstream/handle/UNAC/3658/Gamboa
%20Ruiz_POSGRADO_MAESTRIA_2018.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Kitlab. (s.f). Caja de Petri. http://kitlab.exa.unicen.edu.ar/caja_de_petri.html

Instrumentos de laboratorio. (25 de septiembre de 2013). Tubo de Ensayo.

https://instrumentosdelaboratorio.org/tubo-de-ensayo

Materiales de laboratorio. (s.f) Pipetas.

https://materialesdelaboratoriohoy.us/vidrio/pipetas

Palomino Simbrón, C. (2017). Calidad microbiológica y fisicoquímica de las aguas de

consumo humano y de riego del distrito de Luricocha de la provincia de Huanta–
Ayacucho 2016–2017 [tesis de pregrado] Repositorio institucional Universidad
Nacional san Cristobal de Huamanga
http://repositorio.unsch.edu.pe/bitstream/handle/UNSCH/1660/TESIS
%20B798_Pal.pdf?sequence=1

Quistian, H. (4 de octubre de 2014). Asas microbiológicas y su uso.

http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/asas-microbiologicas-y-su-
uso.html
Tp Laboratorio. (s.f). Incubadora de Laboratorio.
https://www.tplaboratorioquimico.com/laboratorio-quimico/materiales-e-
instrumentos-de-un-laboratorio-quimico/incubadora-de-
laboratorio.html#:~:text=Una%20Incubadora%20de%20laboratorio
%20es,oxigeno%20presente%20en%20la%20incubadora.
VIII. Anexos
Cuadro N° 2 NMP y límites de confianza de 95% cuando se usan diversas combinaciones de
resultados positivos de series de 10, 1 y 0.1 ml. en series de 5 tubos
IX.
NÚMERO DE TUBOS CON REACCIÓN POSITIVA INDICE DE LIMITE DE CONFIANZA DE 95%
NMP/100 ml
10 ml 1 ml 0.1 ml. Inferior Superior
0 0 0 <2 --- ---
0 0 1 2 1 10
0 1 0 2 1 10
0 2 0 4 1 13
0 2 1
1 0 11
1 4 1
1 0 0 4 1 15
1 1 1 6 2 15
1 1 0 6 2 18
1 2 0 4 1 18
2 0 1 7 2 17
2 0 0 7 2 20
2 1 1 9 3 21
2 1 0 9 3 24
0 12 5
2 2 25
0 8 3
2 3 29
1 11 4
3 0 0 11 4 24
3 0 1 14 6 29
3 1 0 14 6 25
3 1 1 17 7 35
3 2 0 13 5 35
3 2 1 17 7 40
4 0 0 17 7 38
4 0 1 21 9 45
2 26 12
4 1 46
0 22 9
4 1 55
1 26 12
4 1 0 27 12 63
4 2 1 33 15 56
4 2 0 34 16 65
4 3 0 23 9 67
4 3 1 30 10 77
4 4 2 40 20 80
5 0 0 30 10 86
5 0 1 50 20 110
2 60 30
5 0 140
0 50 20
5 1 1 70 30
120
5 1 2 90 40 150
5 1 0 80 30 180
5 2 1 110 40 170
5 2 2 140 60 210
5 2 3 170 80 250
5 3 0 130 50 250
5 3 1 170 70 300
5 3 2 220 100 360
5 3 3 280 120 410
0 350 160
5 4 390
0 240 100
5 4 1 300 100 480
5 4 2 500 200 580
5 4 3 900 300 690
5 4 4 1600 600 820
5 5 5 > 1600 --- 940
5 5 1300
5 5 2000
5 5 2900
5 5 5300
5 5 ---