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Práctica 2

Carbohidratos

Objetivo: que el estudiante refuerce los conocimientos adquiridos acerca de los


carbohidratos mediante la demostración experimental de algunas de sus
propiedades.

Fundamento
Los carbohidratos son los compuestos orgánicos más abundantes de la
biosfera. La mayoría pueden ser representados con la fórmula general Cx(H2O)y
por lo que son literalmente, hidratos de carbono. Gran parte de sus funciones
biológicas dependen de esta estructura química tan particular y versátil. Ellos son
componentes fundamentales de muchos alimentos y su degradación durante el
proceso de digestión genera la energía necesaria para las funciones vitales del
organismo. Cuando se encuentran combinados con otras biomoléculas, dan origen
a moléculas más complejas cuyas funciones pueden ser estructurales o de soporte
celular y tisular, de comunicación entre células, de reconocimiento o de
señalización. Químicamente se definen como polihidroxialdehídos o
polihidroxiacetonas cíclicas o sustancias que luego de hidrolizarse dan origen a los
mismos. Un carbohidrato que no puede ser hidrolizado en uno más simple es
llamado monosacárido. Los monosacáridos más comunes son la glucosa, la
fructosa, la galactosa y la manosa. Un carbohidrato que puede ser hidrolizado en
dos moléculas de monosacáridos es llamado disacárido. Los más importantes son
la lactosa (presente en la leche), la sacarosa (presente en el azúcar común) y la
maltosa. Por su parte, aquellos carbohidratos que pueden ser hidrolizados en
varias moléculas de monosacáridos son llamados polisacáridos. Los más comunes
son el almidón y la celulosa, éste último es componente estructural de las plantas.
La determinación de glucosa es de importancia médica ya que niveles
sanguíneos alterados pueden ser signo de una enfermedad metabólica común
conocida como diabetes mellitus.

1. Prueba de Benedict

Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes


oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta característica radica en la
presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo
carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo carbonilo libre son
llamados azúcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se
encuentra combinado en unión glicosídica se conocen como azúcares no
reductores. Existen varias reacciones químicas que permiten determinar si se está
en presencia de un azúcar reductor o no. La prueba de Benedict es una de ellas y
se basa precisamente en la reacción o no de un azúcar con el ion Cu2+. El reactivo

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de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato
de sodio. El Na2CO3 confiere a la solución un pH alcalino necesario para que la
reacción pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu2+ en
solución ya que tiene la propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados
con algunos de los metales pesados. Con el cobre produce un complejo de color
azul. Si se le agrega al reactivo una solución de azúcar reductor y se calienta
hasta llevar la mezcla a ebullición, el azúcar en solución alcalina a elevadas
temperaturas se convertirá en D-gluconato y su ene-diol, rompiéndose luego en
dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos,
reaccionarán con el Cu++. Se obtiene entonces un azúcar oxidado y dos iones Cu+.
Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH- presentes en la
solución para formar el hidróxido de cobre:
Cu + + OH - → Cu(OH) (precipitado amarillo)
El hidróxido pierde agua
2Cu(OH) → Cu2O (precipitado rojo ladrillo) + H2O
La aparición de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la
presencia de un azúcar reductor.

Materiales y reactivos

-Reactivo de Benedict: consta de 3 soluciones:


Pesar 100 g de NaCO3 anhidro y disolver en 200 ml de agua destilada hervida.
Pesar 173 g citrato de sodio y disolverlo en 200 ml de agua destilada hervida.
Pesar 17.3 g de CuSO4.5H2O y disolverlo en 300 ml de agua destilada hervida.
Mezclar las tres soluciones cuando estén frías. Aforar a 1 l con agua destilada
hervida.
-Soluciones de carbohidratos 0.1 mol/l. Pesar la cantidad requerida de cada uno
de los carbohidratos a ensayar y disolverlos en 100 ml de agua destilada. La
solución de almidón se prepara al 1%: pesar 1 g de almidón y llevar a 100 ml con
agua destilada caliente.

-1 gradilla con tubos de ensayo


-pipetas de varios volúmenes
-baño maría en ebullición

Procedimiento

Seleccione la pipeta más conveniente y deposite 2.5 ml de reactivo de Benedict


en un tubo de ensayo mediano (los tubos de ensayo grandes se usan en la prueba
de hidrólisis del almidón). Repita este paso en 6 tubos más. Luego, a cada tubo,

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añada 6 gotas de una y solo una de las siguientes soluciones de carbohidratos:
glucosa, galactosa, lactosa, xilosa, fructosa, sacarosa al 0.1M y almidón al 1%.
Coloque los tubos en un baño de agua hirviendo por 5 minutos. Tenga cuidado de
no quemarse

Observe cualquier cambio de color durante el calentamiento. Saque el tubo y


póngalo en una gradilla y después de un corto tiempo observe si se ha formado un
precipitado, el cual puede ser rojo, anaranjado o verdoso.

Resultados
1) Elabore un cuadro con los carbohidratos que utilizó en esta prueba, si se
formó un precipitado y de qué color es el mismo.

2) Concuerdan sus resultados con lo esperado teóricamente sobre


carbohidratos reductores? Explique.

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3) Qué otro reactivo se puede usar para análisis de azúcares reductores?

4) Por qué es necesario el citrato de sodio en el reactivo de Benedict?

2. Prueba cualitativa de glucosa oxidasa

Este método es utilizado hoy en día para la determinación y cuantificación de


glucosa en sangre y orina y vino a reemplazar a otros como la prueba de Benedict,
debido a su mayor especificidad y sensibilidad. La prueba se basa el uso de una
enzima llamada glucosa oxidasa que reconoce específicamente a una de las
formas anoméricas de la D-glucosa, la forma beta glucopiranosa. Esta enzima, en
presencia de glucosa, oxígeno y un amortiguador de pH, genera gluconolactona y
peróxido de hidrógeno.

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El peróxido de hidrógeno es a su vez sustrato de otra enzima, la peroxidasa, la
cual en presencia de fenol y una amina aromática (en nuestro caso, la amino-4-
antipirina) genera un compuesto de color rosado y agua. Por lo tanto, cuando el
reactivo vira de incoloro a rosado, se demuestra la presencia de glucosa en la
muestra.

Materiales y reactivos

-1 placa de aglutinación
-Solución de glucosa oxidasa/ peroxidasa: Contiene glucosa oxidasa, peroxidasa,
amortiguador y amino 4 antipirina.
-Soluciones de carbohidratos 0.1M utilizados en la práctica de la prueba de
Benedict y almidón al 1%.

Procedimiento
Coloque 3 gotas de solución de glucosa oxidasa/peroxidasa en siete
depresiones de la placa de ensayos. Añada una gota de glucosa a una depresión,
una gota de fructosa a otra, etc. Observe las depresiones inmediatamente y anote
los resultados. Vuelva a observar las depresiones y revise si existe algún cambio.

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Resultados
1) Qué coloración es una prueba positiva para la glucosa oxidasa?

2) Porqué la prueba es específica para la determinación de glucosa?

3) Observó algún cambio luego de incubar por más tiempo las diferentes
reacciones? Si es así, a qué cree usted que se debe este cambio? Qué
implicaciones podría tener este resultado?

3. Prueba de yodo para Almidón


El polisacárido almidón está constituido de dos polímeros, amilosa y
amilopeptina. La amilosa está constituida de largas cadenas lineales de glucosa
unidas en enlace glicosídico alfa 1,4 (Figura 1). Estas cadenas no poseen un
tamaño determinado sino que pueden variar desde unos miles de unidades de

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glucosa hasta un millón. Por otro lado, la amilopeptina posee, al igual que la
amilosa, cadenas lineales de glucosa unidas en enlace alfa 1,4 pero además
posee una gran cantidad de ramificaciones, las cuales se presentan cada 24 a 30
residuos de glucosa y en enlace glicosídico alfa 1,6.

El almidón es la molécula de reserva energética en las plantas por excelencia.


Debido a que muchos organismos superiores poseen las enzimas necesarias para
su degradación, este polímero puede ser convertido durante el proceso de
digestión en diferentes intermediarios metabólicos que generan energía. El
glucógeno a su vez es la contraparte del almidón en el reino animal, con la
diferencia de que esta molécula posee una mayor cantidad de ramificaciones que
el almidón y es más compacta. La conformación de los enlaces alfa 1,4 presentes
en estas moléculas causa que estos polímeros asuman una estructura helicoidal
muy estrecha. La prueba del almidón es una prueba muy sencilla pero que todavía
se utiliza para determinar la presencia de almidón en algunos alimentos. La prueba
se basa en una reacción física y no química, en la cual el almidón reacciona con el
yodo para formar un complejo de color azul intenso. Bajo las mismas condiciones,
el glucógeno da una coloración café.

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Materiales y reactivos

-1 gradilla con tubos de ensayo medianos


-pipetas de varios volúmenes
-Solución de almidón 1 % que se utiliza también para la prueba de Benedict
-Solución de yodo: Disolver un gramo de yodo en una solución de Kl 2%.

Procedimiento

En tres tubos medianos y utilizando la pipeta que más se ajuste, distribuya los
reactivos indicados según el siguiente cuadro:

Reactivo
Tubo Agua Almidón 1% Solución
número (ml) (gotas) de yodo
(gotas)
1 5 5 1
2 5 1 1
3 5 0 1

Agite muy bien los tubos y note la diferencia de color que se atribuye a la
formación de un complejo entre el almidón y el yodo. Anote el resultado.
Posteriormente coloque los tres tubos en un baño de agua caliente (70o C) con
cuidado por 10 minutos y observe cualquier cambio de color. Anote el resultado.
Enfríe los tubos y observe nuevamente. Anote el resultado.

Resultados
1) Describa el resultado obtenido en los diferentes tubos luego de incubar a
temperatura ambiente.

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2) Describa el resultado obtenido en los diferentes tubos luego de incubar a alta
temperatura.

3) Qué sucede cuando los tubos se enfrían de nuevo?

4) Tomando en cuenta la estructura helicoidal del almidón, explique qué tipo de


reacción se lleva a cabo cuando se mezcla el yodo con el almidón?

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5) Cómo explica los fenómenos descritos en las respuestas a las preguntas 1 y 2?

6) Cómo cree usted que daría el resultado de esta prueba si se utiliza celulosa?

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4. Hidrólisis del almidón
Esta práctica tiene como objetivo demostrar que efectivamente los polisacáridos
como el almidón están compuestos de monosacáridos unidos por enlaces
glicosídicos. Como se mencionó anteriormente, el almidón está constituido de un
solo monosacárido, la glucosa. Las propiedades del almidón son diferentes a las
de la glucosa como se evidenciará mediante la hidrólisis del almidón para generar
glucosa. Todos los polisacáridos son hidrolizados en sus constituyentes
monosacáridos, por la acción de ácidos diluidos. Esta es una reacción gradual que
puede observarse durante el tiempo de la sesión de laboratorio. Es por tanto
recomendable que usted inicie el proceso de hidrólisis al comenzar la sesión de
laboratorio y luego proceda con el resto de las pruebas. La hidrólisis del almidón
se puede evidenciar con dos pruebas:
a. Desaparición del color azul característico de la prueba del yodo.
b. Aparición de glucosa, un azúcar reductor. La aparición de glucosa se
evidenciará mediante la prueba de Benedict.

Materiales y reactivos
-1 gradilla con 4 tubos de ensayo grandes (10ml)
-baño María en ebullición
-Pipetas de varios volúmenes
-Solución de almidón 1 %: pesar 1 g de almidón y llevar a 100 ml con agua
destilada caliente. Preparar fresco.
-HCl concentrado: será manipulado únicamente por los instructores. Tenga
cuidado a la hora de manipular y agitar sus tubos que contengan este ácido.
-Solución de yodo: Disolver un gramo de yodo en una solución de Kl 2%.
-Reactivo de Benedict
-NaOH 0.4 mol/l: Pesar 16.0 g de NaOH y llevar a 1000 ml con agua destilada.

Procedimiento
Coloque 10 ml de una solución de almidón al 1% en un tubo de ensayo grande.
Pida a su instructor que le añada 1 ml de HCI concentrado al tubo. Agite bien y
luego coloque el tubo en un baño de agua hirviendo con cuidado de no quemarse.
Mientras el almidón se está hidrolizando (tarda de 1:30 h a 2 h aproximadamente),
efectúe la prueba de coloración del yodo. Para ello, añada en otro tubo 5 ml de
agua, una gota de la solución de yodo y 0.5 ml de la solución de almidón que tiene
hidrolizando en el baño maría a ebullición. Anote el resultado de la prueba del
yodo.
Después de que la hidrólisis del almidón se haya llevado a cabo por 15 minutos,
saque 0.5 ml del almidón que se está hidrolizando en el baño maría y repita la
prueba del yodo. Continúe la hidrólisis hasta obtener una prueba de yodo negativa.

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Posteriormente y para confirmar la presencia de glucosa, efectúe la prueba de
Benedict. Para ello, añada en un tubo 0.5 ml del almidón hidrolizado, 1 ml de
NaOH 0.4 mol/l (para neutralizar el ácido) y 2.5 ml de reactivo de Benedict. Incubar
por 8 minutos en agua hirviendo. Anote y analice los resultados. Utilice sus
resultados del punto 1 (Prueba de Benedict) y del punto 2 (Prueba de yodo para
almidón) para interpretar sus resultados.

Resultados
1) Haga un cuadro con los resultados de la prueba del yodo a diferentes
tiempos y anote el tiempo que tardó la prueba de Benedict en dar positiva
para la presencia de glucosa.

2) Según los resultados del cuadro 1, cuánto tiempo tardó la solución de


almidón en hidrolizarse?

3) Qué tipo de enlaces es capaz de romper el HCI? Porqué?

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Bibliografía

-Angulo Ugalde, Y. Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa


Rica. 1999
-ELITECH Diagnostics. Instrucciones de uso del reactivo Glucosa PAP, versión
12/2006
- Nelson D.L y Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman
and Company, NY. Quinta edición, 2008.

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