Practicas 6 Enzimologia PDF

Prácticas de Enzimología
Ronald Navarro, B. Roxana Mestas
PRACTICA 6
PREPARACION DE COLUMNAS DE GEL FILTRACION

CON SEPHADEX G-75
INTRODUCCION
Uno de los métodos de uso muy frecuente en la purificación de enzimas (proteínas) es
aquel que se basa en el tamaño molecular. El proceso de este tipo es el del tamiz molecular o
cromatografía de permeabilidad en gel. La amplia aplicación de esta técnica se debe a las
muchas ventajas que tiene: (1) las condiciones moderadas de la técnica permiten la separación
de moléculas lábiles; (2) la recuperación del soluto es de casi 100%; (3) alta reproducibilidad;
(4) amplio margen de tamaño de muestra, desde cantidades analíticas hasta cantidades de
planta piloto y (5) tiempos relativamente cortos y equipos adecuados de bajo costo para llevarla
a cabo. A través de esta técnica se pueden separar totalmente moléculas que difieren en 25%
en su tamaño molecular.
La preparación de columnas de gel filtración, constituye una etapa previa en todo

proceso de purificación de enzimas (proteínas), por ello en esta primera parte se expone cada
uno de los pasos a seguir en esta etapa.
MATERIALES:
 Columnas cromatográficas de 5 x 110 cm y accesorios
 Sephadex G-75 (ganancia de agua 75 = 0.5 ml/g de gel seco; tamaño de partícula 40 - 120
u; volumen de lecho por gramo de gel seco 12 - 15 ml.
 Buffer acetato de sodio 0.01 M pH 5.0 que contiene EDTA 0.001 M
 Dos matraces de 2 litros de capacidad
 Un matraz kitasato de 1 litro de capacidad
 Bomba de vacío
PROCEDIMIENTO:
El procedimiento que se describe a continuación es el que se sigue durante la
preparación de una columna de 5 x 110 cm con Sephadex G-75, la cual se utiliza en la
purificación de fosfatasa ácida de bajo peso molecular a partir de hígado de bovino. Sin
embargo, se puede seguir la misma metodología para la preparación de cualquier otra columna
con diferentes dimensiones.
PREPARACION DEL GEL

a) HIDRATACION DEL GEL
 Pesar 180 g de Sephadex g-75. Rociar lentamente el gel sobre la superficie de unos 500 ml
de agua destilada, contenidos en un matraz de 1 litro, al mismo tiempo agitar suavemente
con una varilla de vidrio.
 A la suspensión anterior agregar suficiente agua destilada para llevar el volumen total a 800
ml.
 Dejar en reposo el gel durante 24 horas a temperatura ambiente para su hidratación.
NOTA.- Si desea acortar el tiempo de hidratación, incube la solución de Sephadex G-75 durante
3 horas en un baño María de agua hirviente (100 grados centígrados). Agitar suavemente el
matraz que contiene la solución a intervalos de 15 minutos.
b) ELIMINACION DE LOS FINOS

Los finos, son las pequeñas partículas (polvo) que han escapado a su eliminación
durante el proceso de manufactura o que se han generado durante la hidratación por una
agitación demasiado vigorosa. Estos deben eliminarse, pues de lo contrario su presencia
disminuirá severamente la velocidad de flujo de la columna.
El proceso a seguir es:
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 Suspender suavemente el gel hidratado en 2 a 4 volúmenes de agua destilada (u otra

solución eluyente).
 Dejar en reposo la suspensión hasta que sedimente 90 a 95 % del gel.
 Eliminar rápidamente el gel restante de la solución sobrenadante por succión. Para la
succión, monte adecuadamente un sistema de vacío en un caño de agua corriente.
 Repita los tres pasos anteriores unas cinco veces o hasta obtener una preparación que
sedimenta rápidamente.
c) DEGASEADO DEL GEL

La etapa final de la preparación del gel de Sephadex G-75 (y de cualquier otro gel de
permeabilización) es eliminar las burbujas de aire que pueden estar presentes. Esta eliminación
es necesaria, pues las burbujas que se desplazan durante la cromatografía aumentan la
superficie de la columna, mezclando el gel y sus contenidos. Para esto, proceder de la siguiente
manera:
 Elimine el líquido sobrenadante del gel hidratado y deje una capa de 2 cm.
 Colocar el gel hidratado y sin finos en un kitasato (recipiente de vacío) de 1 litro de
capacidad.
 Colocar un tapón de goma de tamaño adecuado en la boca del kitasato.
 Conectar el tubo lateral del kitasato a la manguera de una bomba de vacío.
 Poner en marcha la bomba de vacío durante 40 minutos.
NOTA.- En lugar de la bomba de vacío puede utilizarse un aspirador de agua que trabaje
adecuadamente. El proceso de degaseado puede acelerarse agitando suavemente el gel que
está dentro del recipiente de vacío. Puesto que las burbujas de aire, especialmente de bióxido
de carbono, se acumulan fácilmente en el interior del gel, es aconsejable eliminar el gas justo
antes de verterlo en la columna.
PREPARACION DE LA COLUMNA
Un empacado correcto de la columna es de suma importancia para conseguir una buena
cromatografía de gel filtración. Las características de una columna adecuada incluyen: (1) un
pequeño espacio muerto (espacio entre el soporte del medio y la salida de la columna; (2)
facilidad para empalmar el tubo capilar que conducirá el eluyente; (3) un soporte del lecho del
gel que no se obstruya fácilmente (se usan cribas de nylon); (4) algún medio de protección de la
superficie del lecho y ; (5) un volumen y proporción diámetro/longitud adecuados, según el tipo
de gel y uso que se dará a la columna. Las columnas que se emplean para separar una
macromolécula de otra deben tener un volumen de 25 a 100 veces mayor que el volumen de
muestra a estudiar y una relación diámetro / altura de 20:1 a 100:1.
NOTA.- El volumen de muestra que ha de colocarse en una columna cromatográfica de gel

filtración debe ser igual al 5% del volumen total de la columna.
EMPACADO DE LA COLUMNA
Proceda del siguiente modo:
 Fije la columna de 5 x 110 cm en un soporte fuerte que se halla dentro de una cámara
refrigerada.
 Comprobar que la columna esté en posición perfectamente vertical, colocando para ello un
pequeño nivel contra la columna en tres o cuatro puntos diferentes alrededor de ella. Luego
de ajustar fuertemente las pinzas, en la posición adecuada al soporte, estas ya no se deben
mover.
 Sacar la columna de la cámara refrigerada. Manteniendo cerrado el extremo de salida del
eluyente con una pinza, vierta unos 500 ml de agua destilada (o tampón acetato pH 5.0).
Luego deje drenar 450 ml antes de cerrar la salida.
 Agite, suavemente, el gel degaseado.
 Apoye el extremo inferior de la columna sobre la punta de su zapato izquierdo y con la mano
izquierda sostenga la columna en forma inclinada (unos 45 grados) y con la otra mano vierta
suavemente por las paredes, pero de manera continua, el gel hasta llenar totalmente la
columna.
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 Lleve la columna a la cámara refrigerada y coloque en la posición correcta en el soporte ya

elegido.
 Abrir la salida del eluyente y dejar que el relleno del lecho sedimente hasta una altura de 100
cm.
 Si el relleno baja por debajo de esta altura, agite suavemente con una varilla de vidrio la
capa superior y agregue mas relleno. Repita esta operación hasta que el relleno se
mantenga en el nivel indicado.
 Cualquier exceso del gel se elimina por succión.
EQUILIBRADO DE LA COLUMNA
 El volumen restante de la columna se llena con tampón acetato de sodio pH 5.0 (una capa
de 5cm de altura).
 Colocar un tapón hermético en la parte superior de la columna y conectar a la entrada el
tubo de goma que viene del frasco que contiene 2 litros de tampón (Frasco de Mariotte).
 Se deja que fluyan unos 2 litros de tampón por la columna para estabilizarla (equilibrarla).
NOTA.- El equilibrado se hace con 2 volúmenes de tampón, es decir, se dejan pasar 2

volúmenes de, respecto al volumen de la columna. Por ejemplo, si la columna tiene un volumen
de 400 ml, se hace pasar 800 ml de tampón.
APLICACIÓN DE LA MUESTRA
 Se quita el tapón de la entrada de la columna y se deja que la columna drene hasta que el
tampón alcance justamente la superficie del lecho. Luego se cierra la salida.
 Con una pipeta Pasteur (u otra similar) se coloca 25 ml de muestra. Este proceso se realiza
dejando deslizar suavemente la muestra por las paredes de la columna. Evite que se forme
una suspención del gel.
 Conecte la salida de la columna a un colector de fracciones.
 Llene el frasco de Mariotte con 2 litros de tampón acetato pH 5.0
 Abrir la salida permitiendo que la muestra se introduzca en el gel.
 Cuando la superficie de la muestra alcance la superficie del lecho,, se añade
cuidadosamente: primero unos 5 ml de tampón acetato de sodio pH 5.0 para lavar las
paredes de la columna y se espera a que se introduzca en el gel; luego 50 ml de tampón
acetato de sodio pH 5.0, por las paredes de la columna, tratando de lavar la proteína pegada
a ella.
 Se repite una vez mas la segunda parte del paso anterior.
 Cuando este tampón alcance la superficie del gel, se llena muy suavemente la columna con
el mismo tampón acetato; se coloca de nuevo el tapón de la columna y se conecta el frasco
de Mariotte a la columna. Bajo estas condiciones la columna tendrá una velocidad de flujo de
aproximadamente 2 ml / min. Cuando la muestra haya avanzado unos 60 cm, se notarán
casi completamente separadas tres bandas pigmentadas: la primera verdusca, luego una
rojiza y, finalmente, una verde limón. La fracción que nos interesa es una sin pigmento que
se halla entre la banda rojiza y la de color verde limón.
 La muestra empieza a salir después que han pasado 280 ml de tampón. Por tanto, si se deja
fluir primero este volumen en un beaker de 500 ml, sólo es necesario colectar 80 fracciones
de 10 ml cada una para obtener el perfil completo.
 Se determina la absorbancia, a 280 nm, de cada fracción, en un espectrofotómetro Gilford
240 ( u otro modelo), y con las lecturas se realiza el perfil de proteína.
 El perfil de actividad se realiza tomando 200 microlitros de cada fracción y probando la
actividad frente a pNitrofenilfosfato. La lectura de estas mezclas de reacción se realiza a 400
nm en el espectrofotómetro.
BIBLIOGRAFIA
1. Alemany, M. y Font, S. (1983). Prácticas de Bioquímica. Alhambra.

2. Cooper, T.G. (1984). Instrumentos y Técnicas de Bioquímica Experimental. Reverté.
3. Harris, D.C. (1992). Análisis Químico Cuantitativo. Grupo Editorial Iberoamérica.
4. Pharmacia Fine Chemicals (1970) Sephadex: Gel Filtration in Theory and Practice.
UPPSALA. Sweden.
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5. Plummer, D.T. (1981). Introducción a la Bioquímica Práctica.

6. Williams, B.L. y Wilson, K. (1981). Principios y Técnicas de Bioquímica Experimental.
Omega.
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La preparación de columnas de gel filtración, constituye una etapa previa en todo

PREPARACION DEL GEL

b) ELIMINACION DE LOS FINOS

El proceso a seguir es:

 Suspender suavemente el gel hidratado en 2 a 4 volúmenes de agua destilada (u otra

c) DEGASEADO DEL GEL

NOTA.- El volumen de muestra que ha de colocarse en una columna cromatográfica de gel

 Lleve la columna a la cámara refrigerada y coloque en la posición correcta en el soporte ya

NOTA.- El equilibrado se hace con 2 volúmenes de tampón, es decir, se dejan pasar 2

1. Alemany, M. y Font, S. (1983). Prácticas de Bioquímica. Alhambra.

5. Plummer, D.T. (1981). Introducción a la Bioquímica Práctica.

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