TÉCNICAS PARA MEDICION DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Presentado por:

ALBERTO CARLOS MAESTRE

SEBASTIAN RODIGUES

KARINA LEON

JORGE LUIS HERNANDEZ

Ing. YENIS IBEHT PASTRANA PUCHE

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

BERASTEGUI

2005
 1. INTRODUCCIÓN

El crecimiento microbiano se puede considerar como el aumento

ordenado de todos los constituyentes químicos de un organismo, lo
cual, para los organismos unicelulares, conduce a un aumento del
numero de individuos en Ia población.

Se puede considerar el crecirniento de una población a nivel de

individuos dentro de una población (ciclo celular) o el crecimiento de
poblaciones celulares (ciclo de crecimiento).

Para determinar el número total de células de un cultivo, el método de

elección es el recuento microscópico directo. Para células de Levadura;
puede emplearse un hemocitometro. Es necesaria una ampliación de
lOOx a 400x para visualizar la cámara de petroof – hauser y una
ampliación de 1000x a causa del pequeño tamaño de las bacterias. El
recuento microscopico directo tiene la ventaja que permite observar
directamente la morfología de las células estudiadas.

El método mas usado para medir el crecimiento microbiano es secar

volúmenes conocidos de cultivo celular Ientamente hasta obtener un
peso constante. Cuando se trata de células que sedimentan
rápidamente, con las levaduras, esto usualmente Implica
centrifugación de muestras del cultivo en tubos de centrifuga
prepesados.

Para células bacterianas difíciles de concentrar por centrifugación, Ias

muestras de cultivo se filtran a través de membranas hidrofilicas con
un tamaño de poro de 0.2µm.
 2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

 Medir el crecimiento microbiano por los métodos de conteo directo,

densidad óptica y peso seco celular.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Medir el crecimiento microbiano por recuento microscópico directo con

cámara de Neubauer.
 Medir la masa microbiana por diferencia de peso.
 Aplicar el método de densidad óptica las suspensiones preparadas en el
laboratorio.
 3. MARCO CONCEPTUAL

En cualquier sistema biológico el crecimiento puede ser definido como el aumento

ordenado de todos los componentes químicos de un organismo, lo cual, conduce
al aumento del número de individuos en la población.

Para seguir el curso del crecimiento es necesario efectuar mediciones

cuantitativas. El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el
número de células, en la cantidad de algún componente de las mismas (por
ejemplo: proteína) o en el peso total seco de las células. Existen varios de contar
el número de células o de determinar la masa celular, adecuados para diferentes
organismos o diferentes situaciones.

Se puede considerar el crecimiento de una población a nivel de individuos dentro

de una población (ciclo celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de
crecimiento).

Recuento de células totales

El número de células en una población se puede determinar contando una

muestra con el microscopio mediante el método de recuento directo. El recuento
directo se puede hacer de dos formas, en muestras secas sobre porta o en
muestras liquidas. Con muestras liquidas se emplean cámaras de recuento
especiales que, en esencia, son portas excavados modificados, sobre cuya
superficie de vidrio está marcada una rejilla con pequeños cuadrados de área
conocida. (Ver Anexo 1.)
Cada cuadrado de la parrilla puede contener un pequeño volumen conocido, muy
pequeño pero determinado con precisión. En el microscopio se puede contar el
número de células por cada unidad de área de la parrilla, lo que permite conocer el
número de células por el volumen de determinada área.

Medición de la masa celular

Un método muy utilizado para medir el crecimiento microbiano es secar

volúmenes conocidos de un cultivo celular lentamente hasta obtener un peso
constante. Cuando se trata de células que sedimentan rápidamente, esto implica
centrifugación de muestras del cultivo en tubos de centrifuga prepesados. Para las
células bacterianas difíciles de concentrar por centrifugación, las muestras de
cultivo se filtran a través de membranas hidrofílicas con un tamaño de poro de
0.2µm.

La técnica más adecuada para medir la masa celular de los microorganismos

unicelulares es un método óptico llamado “densidad óptica” que consiste en medir
la cantidad de luz difractada por una suspensión de células. Esta técnica se basa
en el hecho de que las partículas pequeñas difractan la luz, dentro de ciertos
límites, de manera proporcional a su concentración. Cuando un haz luminoso pasa
a través de una suspensión bacteriana, la reducción en la cantidad de luz
transmitida a consecuencia de la difracción es pues una medida de la masa
bacteriana presente. Tales mediciones se hacen normalmente con un fotómetro o
espectrofotómetro.

Un espectrofotómetro está equipado con un prisma o una red de difracción que

permite la iluminación de la muestra con luz de un margen estrecho y ajustable a
longitudes de onda; un fotómetro tiene filtros intercambiables que permiten pasar
un margen relativamente amplio de longitudes de onda. Estos instrumentos miden
en unidades de absorbancia (A); la absorbancia se define como el logaritmo del
cociente entre la intensidad de la luz incidente sobre la suspensión (I0) y la de la
luz transmitida por la suspensión (I)

A = Log
I0

I
Estos instrumentos son adecuados para estimar concentraciones celulares y,
cuando se calibran con suspensiones bacterianas de concentración conocida,
constituyen un método exacto y rápido de determinar el peso seco bacteriano por
unidad de volumen del cultivo. Debe destacarse que tales mediciones tienen
significado solamente cuando se usan conjuntamente con una curva estándar
como la representada en la figura A.

 = 420nm
Absorbancia

 = 650nm

Masa celular bacteriana (mg de peso seco por

ml)
Figura A. Relación existente entre la absorbancia de
una suspensión de bacterias y la masa celular
bacteriana.
 4. PROCEDIMIENTO

4.1. Preparación de las soluciones A.

Pesar 6 tubos de 20 a 25ml

secos

Diluir Solución madre en Agua

destilada (6 diluciones de 10ml)

Datos de las
concentraciones

4.2. Preparación de las soluciones B.

Diluir Soluciones A en Agua

destilada (6 diluciones de
10ml)
Datos ml necesarios
4.3. Medición del crecimiento microbiano por Conteo directo en cámara de
Neubauer.

Soluciones B

Agitar tubos

Tomar volumen 0.2 a 0.5

Micro pipeta

Cámara de 1 gota cerca

Neubauer cubreobjetos

Platina del Colocar cámara

microscopio observar 40x

Enfocar enrejado Observar cuadro

centrado

Enfocar luz Observar enrejado y

células

Bordes externos Contar células 5 cuadros

marcados

Limpiar cámara Agua destilada

Secar cámara Después de

cada lectura

Observar y
Todas las
contar
soluciones B
4.4. Medición del crecimiento microbiano por Densidad óptica.

Soluciones B

Agitar tubos

Realizar lectura de
Espectrofotómetro
absorbancia

4.5. Medición del crecimiento microbiano por Peso seco celular.

Introducir en la Tubos prepesados de

centrifuga Soluciones A

Centrifugar 3600rpm  15min.

Evacuar Pipeta o
sobrenadante Micro pipeta

Evaporación Tubos en estufa

90ºC

Pesar tubos

Evaporación Hasta que alcance

un peso constante
 5. RESULTADOS

5.1. Preparación del cultivo madre (Sacharomyces cerevisiae).

Se preparó una solución madre del cultivo de levadura (Sacharomyces cerevisiae),
compuesta de 3g de levadura y 200ml de agua.
La concentración en partes por millón (ppm) de esta solución es:

ppm = mg Sto / Lt de Sln

[Sln] ppm = 3000mg / 0.2 Lt
[Sln] ppm = 15000mg/Lt
5.2. Preparación de las soluciones A
Se prepararon 6 diluciones a partir de la solución madre, las cuales tenían la
siguiente composición.
Tabla 1. Composición de las soluciones A
Nomenclatura 1ª 2ª 3A 4A 5A 6A
ml de agua 0 2 4 6 8 10
ml de cultivo 10 8 6 4 2 0

Para hallar la concentración de las soluciones en ppm se utiliza la ecuación:

C1 V1 = C2 V2
C2 = C1 V1 / V2
Donde C2 es la concentración de la solución A en ppm.

Solución 1A
V1 = 10ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (10ml×15000ppm)/10ml = 15000ppm
Solución 2A
V1 = 8ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (8ml×15000ppm)/10ml = 12000ppm
Solución 3A
V1 = 6ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (6ml×15000ppm)/10ml = 9000ppm
Solución 4A
V1 = 4ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (4ml×15000ppm)/10ml = 6000ppm
Solución 5A
V1 = 2ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (2ml×15000ppm)/10ml = 3000ppm
Solución 6A
V1 = 0 ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = 0ppm

Los valores hallados matemáticamente para las concentraciones de cada solución

A se encuentran expresados en la tabla 2.
Tabla 1. Concentración de de las soluciones A (ppm)
Nomenclatura 1ª 2ª 3A 4A 5A 6A
Concentración en 15000 12000 9000 6000 3000 0
ppm

5.3. Preparación de las soluciones B

Se prepararon 6 diluciones a partir de las soluciones A a las cuales deben ser de
la concentración expresada en la tabla 3.
Tabla 3. Composición de las soluciones B
Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Concentración en 1000 800 600 400 200 0
ppm
A partir de 1ª 2ª 3A 4A 5A 6A

Para hallar el volumen necesario de las soluciones A para llegar a la

concentración pedida se necesita la siguiente ecuación:
 C1 V1 = C2 V2
V1 = C 2 V2 / C 1
Donde V1 es el volumen en ml de la solución A.
Solución 1B a partir de 1A
C2 = 1000ppm V2 = 10ml
C1 = 15000ppm  V1 = (10ml×1000ppm)/15000ppm  0.67ml
Solución 2B a partir de 2A
C2 = 800ppm V2 = 10ml
C1 = 12000ppm  V1 = (10ml×800ppm)/12000ppm  0.67ml
Solución 3B a partir de 3A
C2 = 600ppm V2 = 10ml
C1 = 9000ppm  V1 = (10ml×600ppm)/9000ppm  0.67ml
Solución 4B a partir de 4A
C2 = 400ppm V2 = 10ml
C1 = 6000ppm  V1 = (10ml×400ppm)/6000ppm  0.67ml
Solución 1B a partir de 6A
C2 = 200ppm V2 = 10ml
C1 = 3000ppm  V1 = (10ml×200ppm)/3000ppm  0.67ml
Solución 1B a partir de 6A
C2 = 0ppm V2 = 10ml
C1 = 0ppm  V1 = 0ml

Los valores hallados matemáticamente para los mililitros de las soluciones A

necesarios para preparar las soluciones B se encuentran expresados en la tabla
4.
Tabla 4. Composición de las soluciones B
Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Volumen de A en ml 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0
5.4. Medición del crecimiento microbiano por conteo directo en cámara de
Neubauer

Para la medición del crecimiento microbiano por conteo directo se tomaron las
soluciones B, depositando la muestra en una cámara de Neubauer y observando
en el microscopio con un objetivo de 40x.

La cámara de Neubauer posee una especie de rejilla, que en su cuadro central

(ver Anexo C) posee 25 cuadros, los que a su vez poseen 16 cuadritos, se deben
contar las células que se encuentren dentro de los 5 cuadros marcados (los de las
cuatro esquinas y el del centro).

El área del cuadro central marcado con un círculo es de 0.01 mm 2 y una

profundidad de 0.1mm. Entonces el área de cada uno de los 25 cuadros es de:

Ac= A / 25
Ac = 0.01 mm2 / 25 = 0.0004 mm2

El volumen de los cuadros que se cuentan es igual a la suma de sus áreas

multiplicado por su profundidad.

V = 5Ac  Prof.
V = 5 (0.0004 mm2)  0.1mm = 0.0002 mm3
Con este volumen y el número de células contadas en los 5 cuadros, se puede
hallar la concentración de células en células/ml.

El número de células contadas en el experimento para cada una de las soluciones

B se expresa en la tabla 5.

Tabla 5. Numero de células contadas en el experimento para las soluciones B

Nomencl.
Cuadro 1B 2B 3B 4B 5B 6B
1 156 90 88 32 29 0
2 121 106 94 49 31 0
 3 90 67 69 33 41 0
4 85 107 73 36 26 0
5 102 85 109 35 30 0
Total 554 455 433 185 157 0

Para hallar la concentración de células se divide el total de células de cada

solución B entre el volumen de los 5 cuadros.

[Células] = # células / 0.0002 ml.

 [1B] = 554 cel / 0.0002ml = 2770000 cel/ml

 [2B] = 455 cel / 0.0002ml = 2275000 cel/ml

 [3B] = 433 cel / 0.0002ml = 2165000 cel/ml

 [4B] = 185 cel / 0.0002ml = 925000 cel/ml

 [5B] = 157 cel / 0.0002ml = 785000 cel/ml

 [6B] = 0 cel / 0.0002ml = 0 cel/ml

Las concentraciones de las soluciones B obtenidas se encuentran en las siguiente

tabla.

Tabla 6. Concentraciones de las soluciones B en cel/ml

Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Concentración 2770000 2275000 2165000 925000 785000 0
cel/ml

5.5. Medición del crecimiento microbiano por densidad óptica

Se realizó una lectura de absorbancia a 540 nm en el espectrofotómetro y arrojó

los siguientes resultados:
 Tabla 7. Concentraciones de las soluciones B en absorbancia
Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B (Blanco)
Concentración (A) 0.925 0.900 0.636 0.468 0.222 0

5.6. Medición del crecimiento microbiano por peso seco celular

Se tomó el peso de los tubos de ensayo vacíos, se centrifugó un volumen

determinado de las soluciones A. Luego se separó el sobrenadante y se evaporó a
90ºC para eliminar el agua restante, los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Tabla 8. Datos para las soluciones A en la determinación del peso seco celular
Nomenclatura 1A 2ª 3A 4A 5A 6A
Volumen de A 9.33 9.33 9.33 9.33 9.33 —
(1) Peso de tubos (vacíos) 17.1 16.4 16.7 17.0 17.0 —
(2) Peso de tubos + células 16.6 16.8 17.1 17.2 17.1 —
Peso de seco celular (2 – 1) 0.5 0.4 0.4 0.2 0.1 —

Para hallar la concentración en g de células por mililitro se divide el peso seco

celular obtenido y se divide por los mililitros iniciales de la solución antes de
extraer el líquido.

[Células] = Peso seco celular / ml de Sln.

 [1A] = 0.5g / 9.33ml = 0.054g/ml

 [2A] = 0.4g / 9.33ml = 0.043g/ml
 [3A] = 0.4g / 9.33ml = 0.043g/ml
 [4A] = 0.2g/ 9.33 ml = 0.021g/ml
 [5A] = 0.1g / 9.33ml = 0.010g/ml

Las concentraciones de las soluciones A obtenidas se encuentran en las siguiente

tabla.

Tabla 9. Concentraciones de las soluciones A en g cel/ml

Nomenclatura 1ª 2ª 3A 4A 5A 6A
Concentración g 0.054 0.043 0.043 0.021 0.010 0
cel/ml
 6. ANALISIS DE RESULTADOS

6.1. Preparación del cultivo madre (Sacharomyces cerevisiae).

Cultivo de levadura comercial (Sacharomyces cerevisiae) diluido en agua en una
concentración de 15000 ppm de color amarillento (ver Anexo C).

6.2. Preparación de las soluciones A

Se realizaron a partir de la solución madre de levadura de diferentes
concentraciones para un posterior estudio en la determinación del peso seco
celular, a medida que disminuía la concentración en ppm se tornaba más
transparente.

6.3. Preparación de las soluciones B

Las soluciones B fueron diluciones de las soluciones A en agua, estas soluciones
brindan la oportunidad de estudiar las células en el microscopio por la facilidad de
conteo y por tener una menor densidad óptica. Por esto fueron utilizadas para
realizar el procedimiento de recuento directo y de densidad óptica.

6.4. Medición del crecimiento microbiano por conteo directo en cámara de

Neubauer
Para este método se utilizaron las soluciones B, ya que, por ser diluciones, tenían
una menor concentración, por lo tanto un menor número de células y así poder
contarse más fácilmente.

Se utilizó la cámara de Neubauer la cual nos proporcionaba una información

exacta sobre la cantidad de células que se encontraban en un volumen conocido.
Luego de montar la cámara, y ubicarse en el cuadro central se observaron células
de color amarillo brillante en forma esférica. Solo se contaron las células que se
podían diferenciar ya que algunas se encontraban muy juntas y no se podía
determinar el numero exacto de células.

6.5. Medición del crecimiento microbiano por densidad óptica

Para la medición de la densidad óptica se utilizó el espectrofotómetro arrojando
resultados que permitieron afirmar que la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración en ppm de las células en solución.

6.6. Medición del crecimiento microbiano por peso seco celular

En la medición del peso seco celular se observó que a medida que la solución
tenía una menor concentración, menor era el peso, lo que da a entender que el
peso seco celular de una solución de células es directamente a su concentración.
 7. CUESTIONARIO

1. Calcule y reporte la concentración de cada una de las soluciones problemas en

células/ml, absorbancia y g de células/Lt.

Nomenclatura 1A 2ª 3A 4A 5A 6A
Concentración g 0.054 0.043 0.043 0.021 0.010 0
cel/ml
Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Concentración cel/ml 277000 227500 216500 925000 785000 0
0 0 0
Concentración (A) 0.925 0.900 0.636 0.468 0.222 0

2. Elabore un grafico de células/ml vs. absorbancia.

Celulas/ml vs. Absorbancia

3000000
2500000
C e l/m l.

2000000
1500000
1000000
500000
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Absorbancia

3. Elabore un grafico de g de células/ml vs. absorbancia.

g de Celulas/ml vs. Absorbancia

0,6
g de cel/ml.

0,4

0,2

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Absorbancia
4. Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición del crecimiento
microbiano.

Recuento de células viables

En el recuento microscópico directo se cuentan tanto células vivas como muertas.

En muchos casos interesa contar solo las células vivas, y con este fin se han
desarrollado métodos de recuento de células viables. Una célula viable se define
como aquella que es capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia; y el
método usual para realizar una determinación de células viables se basa en contar
el número de células de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un
medio sólido adecuado. Por esta razón el recuento de células viables también se
llama recuento en placa o recuento de colonias. En este procedimiento se
supone que cada célula viable puede formar una colonia.

Hay dos maneras de realizar un recuento en placa para viables: El método de

extensión en placa y el método de vertido en placa (ver Anexo D).

 Método de extensión en placa: En este método, un cierto volumen de

cultivo diluido, que no suele ser superior a 0.1ml, se extiende sobre la
superficie de una placa con medio sólido utilizando un asa estéril de
extensión. La placa se incuba después hasta que aparecen las colonias y
se cuenta su número. Es importante que la superficie del medio esté seca
de modo que el líquido de la muestra se absorba. No se suelen usar
volúmenes mayores a 0.1ml porque el exceso de líquido no se absorbe, y
origina problemas en el recuento al favorecer la extensión y mezcla de las
colonias.
  Método de vertido en placa: En este método se pipetea un volumen
conocido (normalmente 0.1 a 1ml) de cultivo en una caja de Petri estéril
sobre la que se añade el medio con agar fundido y se mezcla todo bien con
suaves movimientos de la placa sobre la superficie de la mesa antes de
dejar que se solidifique. Como la muestra se mezcla con el medio fundido,
se pueden usar volúmenes de inoculo mayores que en el método de
recuento por extensión; sin embargo, con este método el organismo que se
cuenta debe ser capaz de resistir la temperatura del agar fundido a 45ºC.

Recomendaciones para estos métodos

En los dos métodos señalados anteriormente es importante que el numero de

colonias que aparezcan en las placas no sea demasiado grande, pues algunas
colonias se podrían fusionar dando estimaciones erróneos. También es importante
que el numero de colonias no sea demasiado bajo para que el calculo sea
estadísticamente significativo.

Para obtener el número apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra.

Lo más frecuente es realizar diluciones decimales de la muestra (ver Anexo E). En
la mayor parte de los casos se realizan dichas diluciones seriadas para alcanzar la
dilución final deseada.

Recuento electrónico de partículas

El contador electrónico se basa en el principio de que las células son malos
conductores eléctricos en comparación con una solución electrolítica. Una
suspensión de células diluidas en un electrolito salino o cualquier otro electrolito
conveniente, se hace discurrir por una minúscula abertura por la que circula una
corriente eléctrica entre dos electrodos. La elevación del voltaje resultante es
proporcional al volumen de la partícula que pasa a través del orificio. Los impulsos
son amplificados y registrados en la pantalla de osciloscopio al tiempo que son
cortados. El contador electrónico dispone de mandos de puesta a cero que
permiten contar únicamente los impulsos de cierta magnitud. Cuando se modifica
el nivel cero, las partículas de tamaños diferentes son contadas selectivamente.

Medición de un constituyente celular

A veces, por causa del tipo de crecimiento (las células pueden formar filamentos o
grupos difícilmente dispersables), o de la complejidad del medio, resulta muy poco
practico medir la masa o el numero de células. En estos casos, el crecimiento
puede medirse calculando la cantidad de un constituyente celular determinado
(por ejemplo, proteínas, peptidoglicano, DNA, RNA ó ATP) en el medio. Con
frecuencia, tales mediciones son también el método más práctico de calcular la
masa y el crecimiento microbiano en un ambiente natural.

5. Consulte las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas utilizadas en el

experimento.

Recuento de células totales

Este método da resultados con mayor rapidez que cualquier otro, gracias al hecho
de que no se requiere periodo de incubación para que las células se metabolicen y
multipliquen. Sus ventajas son:
 Manipulaciones sencillas
 Facilidad de ensayo
 Aparte del microscopio, el instrumental se reduce al mínimo
 Las placas obtenidas pueden conservarse y constituir un fichero de datos
permanentes
  Permite hacerse una idea del tipo de microorganismo presente (cocos,
bacilo, etc.)
 Los recuentos se refieren a los microorganismos del producto original
 Se pueden añadir conservantes a la muestra antes de su análisis
 Se requiere solamente una mínima cantidad de muestra.

El recuento directo por microscopía es un método rápido para conocer el número

de células. Sin embargo, presenta ciertas limitaciones:
 No distingue las células vivas de las muertas.
 Las células pequeñas son difíciles de ver con el microscopio y algunas
posiblemente se pierden en el recuento.
 En ocasiones la precisión es difícil.
 Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando las muestras no
se tiñen.
 El método no suele ser adecuado para suspensiones con baja densidad.

Medición de la masa celular

La única manera de medir la masa celular es determinar el peso seco del material
celular en un volumen fijo de cultivo. Para ello hay que separar las células del
medio, secarlas y pesarlas. Tal determinación requiere mucho tiempo y es
relativamente poco sensible. Con un equipo ordinario es difícil pesar con exactitud
menos de 1mg, y sin embargo este peso seco puede suponer el equivalente de
unos 5000 millones de bacterias.

6. Qué son los colorantes supravitales y para que se usan.

Los colorantes supravitales son aquellos que permiten diferenciar las células
viables de las no viables. Estos colorantes permiten que se tiña una parte de la
pared celular de las células no viables; mientras que las células viables son
refringentes.

Entre estos encontramos el azul de metileno, azul de tripan, lugol. Colorantes

como el Wright o el Giemsa permiten colorear los restos de DNA de células
muertas.
8. CONCLUSIONES
 BIBLIOGRAFIA

 MOSSEL, David. Microbiología de los alimentos. Ed ACRIBIA, S.A. 2 da

edición. Zaragoza (España). 2003.

 MADIGAN, Michael. Brock. Biología de los microorganismos. Ed Pearson

Prentice Hall. 10a edición. New Jersey (E.U.A).2003.

 STANIER, Roger. Microbiología. Ed Reverté, S.A. 2da edición. Barcelona

(España). 1996.
 ANEXO A.
PROCEDIMIENTO DE RECUENTO MICROSCOPICO UTILIZANDO UNA
CAMARA DE TIPO PETROFF – HAUSSER.

Bordes que sostienen el cubreobjetos

Para calcular el número por mililitro de

muestra:

(# de células) × (# de cuadrados grandes)

(ml de muestra)

La muestra se añade aquí con cuidado para que Se cuentan las células de
no se rebose; el espacio entre el portaobjetos y un cuadrado grande. En
el cubre objetos es de 0.02 mm. La rejilla tiene la práctica se cuentan
25 cuadrados grandes un área total de 1 mm2 y varios cuadrados y se
un volumen total de 0.02 mm3. halla media)
 ANEXO B.
REJILLA DE UNA CÁMARA DE NEUBAUER
 ANEXO C.
PROCESO DE DILUCION PARA EL EXPERIMENTO

3g en 200 ml

1A 2A 3A 4A 5A 6A

1B 2B 3B 4B 5B 6B
 ANEXO D.
MÉTODOS DE REALIZAR UNA DETERMINACION DE CÉLULAS VIABLES

Siembra por expansión

Colonias en superficie

Incubación

La muestra se pipetea La muestra se extiende

sobre la superficie de uniformemente sobre la
la placa con agar superficie del agar usando Resultado típico de la
un asa de vidrio estéril siembra por extensión

Siembra por vertido en placa

Colonias incluidas en
medio
Colonias en superficie

Incubación

La muestra se pipetea Se añade el medio estéril

sobre la superficie de y se mezcla bien el Resultado típico del
la placa estéril inoculo vertido en placa
 ANEXO E.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE VIABLES USANDO
DILUCIONES SERIADAS DE LA MUESTRA Y EL MÉTODO DEL VERTIDO EN
PLACA

1ml

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

1/10 1/100 1/103 1/104 1/105 1/106

(10-1) (10-2) (10-3) (10-4) (10-5) (10-6)
Pasar a placa muestras de 1ml

159 17 2 0
Colonias Colonias Colonias Colonias
Demasiadas colonias
para contar

159 x 103 = 1.59 x 105

Recuento Factor de Células (unidades
de la placa dilución formadoras de
colonias) por
mililitro de muestra
original