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EQUIPO DE TRABAJO #9

Nombres de los integrantes Número de carné

Diana Adelina Damacio Pérez 201841380

Sayra Emperatriz López Gómez 201845118
Dulce María Hernández Lara 201340593
Fernando José Avelar Aguilar 201841357
Mayra Jeannett Peláez Larios 201842418

Resumen del trabajo Análisis proximal contaminantes en los alimentos

Contaminantes en frutas y hortalizas
Determinación de plaguicidas (determinación de agroquímicos)
Este método se puede aplicar a los plaguicidas organoclorados, organofosforados y
organonitrogenados, así como a unos pocos plaguicidas hidrocarbonados. Los residuos de
plaguicidas se extraen con acetona y después de la partición, los plaguicidas organofosforados y
organonitrogenados se determinan directamente utilizando un detector CGL de llama alcalina. Las
interferencias se eliminan utilizando Florisil antes de la determinación de los compuestos
organoclorados mediante la detección de captura de electrones.

Determinación de toxinas
Las toxinas se encuentran en la mayoría de los alimentos que comemos, ya sea porque tienen
tóxicos naturales, químicos agregados para su conservación o porque son genéticamente
modificados o transgénicos.
El exceso de estas grasas causa alteración del sistema inmune, por lo que se es más propenso a
tener infecciones, sentir cansancio, retener líquidos, tener una apariencia de piel acabada y
dificultad para dormir.
Hay alimentos que contienen más toxinas y no mantienen la pureza para asegurar su inocuidad o
que sean inofensivos para la salud.
Cromatografía en capa fina.
Por medio de microgeringas 1.20 con dispensador repetitivo 1.21 y en una línea imaginaria situada
a 4 cm de la base de la cromatoplaca, depositar (sin deteriorar la superficie de la placa) los siguientes
spots a intervalos de 1 cm y cada uno en una franja a aproximadamente 0,5 cm de los lados de la
misma (no utilizar las franjas extremas de la cromatoplaca): a.- Dos spots de 5 microlitros de
extracto solución A (caso la dilución final sea a 0,5 ml) o bien dos spots de 10 microlitros de extracto
solución A (caso la dilución final sea a 1 ml). En uno de los spots correspondiente a 5 microlitros o
10 microlitros, superponer adecuadamente 5 microlitros de la solución patrón o de cada una de las
soluciones patrón de micotoxinas que van a separarse en esa cromatoplaca (patrón interno).
En otro punto aparte de línea imaginaria, depositar 5 microlitros de la solución patrón de micotoxina
o superponer 5 microlitros de cada una de las soluciones patrón de micotoxinas que van a separarse
en esa cromatoplaca (patrón externo).
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Cromatologia de líquidos de alta resolución

El método de análisis se basa en la separación mediante cromatografía de líquidos de alta reso-
lución con detección por fluorescencia. La extracción de la muestra se realiza con cloroformo.
3.- Se filtra el extracto y una parte aliquota de éste se purifica en un cartucho de Florisil y,
continuación, en un cartucho de C18. La separación y determinación finales se realizan mediante
cromatografía de líquidos de alta-resolución (HPLC) utilizando una columna de fase reversa
(inversa) C18, seguida de una reacción de derivatización post-columna con solución acuosa de yodo.
La fase móvil consiste en una mezcla de agua+metanol+acetonitrilo (130+70+40) (v+v+v) que
puede ser necesario ajustar la composición de los solventes de esta fase móvil, de acuerdo con las
características de la columna HPLC utilizada.
5.- La detección se realiza por fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 365 nm y de
emisión de 435 nm. Comparar el cromatograma del patrón de aflatoxina y de la muestra problema
(tiempos de retención y demás). En caso de contaminación con aflatoxina, calcular como
habitualmente en HPLC (medida del área de los picos y demás). La concentración mínima
detectable se sitúa en 1 microgramo/Kg (0,001 mg/Kg).

Determinación de metales pesados

Los organismos vivos requieren diferentes cantidades de metales pesados. Pequeñas cantidades
de hierro, cobalto, cobre, manganeso, molibdeno, y zinc son requeridas por los humanos.
Excesivas cantidades pueden dañar nuestro organismo. Otros metales pesados
como mercurio, plutonio, y plomo son metales tóxicos que no tienen un efecto vital o beneficioso
para el organismo, y su acumulación en el tiempo y en el cuerpo de los animales puede causar
serias enfermedades, como por ejemplo saturnismo o envenenamiento por mercurio.
Algunos elementos que son normalmente tóxicos, para algunos organismos, bajo algunas
condiciones pueden ser beneficiosos. Por ejemplo, el vanadio, el wolframio, incluso el cadmio.
Método para la determinación de Cadmio, Plomo, Aluminio y Níquel por espectrofotometría
de absorción atómica.
El equipo utilizado fue un espectrofotómetro de absorción atómica de flama (Unicam Thermo
Elemental Solar S4) con límite mínimo de detección de 0.2 ppm para plomo, 0.05 ppm para cadmio,
0.2 ppm para níquel y 1.0 ppm para aluminio. La lámpara utilizada para plomo tendrá una longitud
de onda de 217 nm, 228.8 nm para cadmio, 232 nm para níquel y 309.3 nm para aluminio.
Se ajustó el equipo de acuerdo a las indicaciones del manual de operación del fabricante. Se inició
la configuración operacional del instrumento, así como del sistema de captura de datos,
permitiendo un periodo no menor a 20 minutos para el calentamiento de las lámparas de cátodo
hueco.
Calibración: Se verificó la sensibilidad del instrumento con las soluciones estándares de cada
elemento, preparadas en las concentraciones marcadas en el manual de operación. Es necesario
comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable.
Se Ajustó el instrumento a cero con el blanco de calibración y soluciones estándares de menor a
mayor concentración y se registró al menos tres réplicas de la absorbancia de cada uno.

Contaminantes en cereales
Un contaminante según el Codex alimentarius es “cualquier sustancia no añadida intencionalmente
al alimento, que está presente en dicho alimento como resultado de la producción (incluidas las
operaciones realizadas en agricultura, zootecnia y medicina veterinaria), fabricación, elaboración,
preparación, tratamiento, envasado, empaquetado, transporte o almacenamiento de dicho aliento o
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como resultado de contaminación ambiental. Este término no abarca fragmento de insectos, pelo
de roedores y otras materias extrañas”.
Según el CODEX STAN 193-1995 los contaminantes presentes en harinas y sus derivados pueden
ser micotoxinas, metales y otros. En los contaminantes que son micotoxinas se encuentra la
Deoxynivalenol (DON), Fumonisinas y Ocratoxina A, en contaminantes metales se encuentra el
Arsénico, Cadmio y Plomo, en otros contaminantes se puede encontrar en estos alimentos es el
Ácido cianhídrico.
Micotoxinas
Métodos utilizados para la detección y cuantificación de Micotoxinas
Las micotoxinas se detectan y cuantifican comúnmente en el alimento utilizando ensayos basados
en anticuerpos y técnicas de cromatografía. Están los métodos inmunoquímicos, métodos
asequibles en donde se realiza la cromatografía y espectrometrías.
Los métodos inmunoquímicos: en estos se has desarrollado diferentes tipos de inmunoensayos
entre los que destacan los sistemas:
• ELISA (ensayos inmunológicos de enzimas ligadas)
• RIA (radioinmunoensayos)
• Columnas de inmunoafinidad
La mayoría de estos métodos son muy sensibles, específicos y fáciles de operar. Se encuentran
disponibles varios kits ELISA comerciales para Aflatoxinas, Deoxynivalemol, Fumonisinas,
Ocratoxinas y Zearalenona.
Los métodos asequibles (Cromatografías y Espectrometrías): en el empleo de las técnicas
cromatográficas requiere de una preparación previa de la muestra, empleándose diferentes métodos
de extracción y purificación dependiendo de las micotoxinas a analizar y de la matriz alimentaria.
La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) y la cromatografía de gases/
espectrometría de masas (GC/MS) son dos de los métodos más utilizados para la detección y
cuantificación de micotoxinas.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) esta constituye la técnica de elección para el
análisis de micotoxinas, o para confirmación de resultados positivos por Elisa, ya que son sensibles,
reproducibles, exactos y presentan un mayor grado de automatización.
Cromatografía de gases (GS) se emplea con menos frecuencia debido a que la mayoría de las
micotoxinas no son suficientemente volátiles y, por lo tanto, tienen que ser derivatizadas,
incrementando el tiempo de análisis.
Técnicas espectrometrícas de absorción y emisión, las más empleadas son la detección
ultravioleta (UV) y la fluorescencia (FL), siendo preferibles esta última cuando las micotoxinas
presentan fluorescencia natural.
Espectrometría de masas (MS), es una técnica de análisis que permite determinar la distribución
de las moléculas de una sustancia en función de su masa, HPLC Y GC/MS requieren de un equipo
costoso y soporte técnico, además de que tiene un límite de detección de < 0.05 ppm para muchas
micotoxinas.
Cromatografía liquida acoplada a un detector de espectrometría de masas en Tándem (LC-
MS/MS), permite el desarrollo de métodos altamente sensibles y selectivos, factibles de ser
aplicados en el análisis de metabolitos a concentraciones muy bajas y muestras biológicas
complejas. Este sistema para cubrir todas las micotoxinas de interés y detectarlas con la mayor
sensibilidad, precisión y reproducibilidad. Este análisis es el “estándar de oro” para la evaluación
de micotoxinas y forma más confiable para su cuantificación. (Micotoxinsite.com, 2020)
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Micotoxinas presentes en cereales y sus derivados

Deoxynivalenol (DON)
También conocido como vomitoxina, puede coexistir con otras toxinas producidas por el mismo
organismo que produce esta toxina. El deoxynivalenol es producido por especies de Fusarium y
afecta principalmente al maíz, trigo, avena y cebada. Dichas especies de Fusarium también son
conocidas por coproducir otras toxinas. (Richard, 2016 )
Entre los métodos confirmatorios la CG se emplea en la determinación simultánea de los
tricotecenos usando detección por Captura Electrónica (CE) o de ionización de llama. Esta es una
de las metodologías oficiales propuestas para su determinación en trigo.
Con relación a la detección CLAR-UV, existe una metodología oficial propuesta por el Comité
Europeo de Normalización para cereales y sus productos, y respecto a CLAR-FL se ha realizado
la derivatización poscolumna con agentes como hidróxido de sodio, metil-aceto-acetato y acetato
de amonio; este método muestra excelentes características del desempeño.
La espectometría de masa (MS) es la que más se emplea en la actualidad, tanto acoplada a CG
como a CLAR, debido a sus innumerables ventajas: mayor selectividad, menores límites de
detección e identificación inequívoca de la sustancia al proveer
información estructural que se caracteriza por la determinación simultánea de numerosas
micotoxinas, e incluso el DON.
Generalmente, en el análisis de la mayoría de los tricotecenos de tipo A y B en cereales por
CLAR/MS/MS las interfases más empleadas son: Ionización Química de Presión Atmosférica y la
Ionización Electrospray; en el caso del DON se reporta el empleo de espectometría de triple
cuádruplo, tiempo de vuelo y Orbitrap. Con el uso de diferentes sistemas de extracción y
purificación se han alcanzado valores de recobrados de esta micotoxina (principalmente en maíz)
que fluctúan entre 66-108 % y detectado a nivel de 10 ngg-1.
El JECFA consideró que la novedad más importante para el análisis del DON la representa el uso
de espectrometría de masas (MS) o espectrometría de masas en tándem (MS/MS) acoplada a
cromatografía de líquidos de alta resolución (LC-MS/MS). (Sosa, 2020)

Fumonisina
Las fumonisinas son un grupo de toxinas, principalmente, FB1, FB2, FB3. No son fluorescentes y
se descubrieron en 1988, en Sudáfrica Gelderblom et al., 1988; Marasas, 2001).
El maíz es el principal producto afectado por este grupo de toxinas, aunque se han informado
algunos casos en el arroz y el sorgo. Se han reportado fumonisinas en la cebada, pero esto espera
confirmación en más muestras. Se desconocen las condiciones exactas de la enfermedad, pero el
estrés por sequía seguido de un clima cálido y húmedo durante la floración parece ser importante.
(Richard J. L.-0.-0., 2020)

Métodos analíticos empleados para la determinación de Fumonisina

Se han elaborado muchos métodos de análisis para la determinación y cuantificación de FB1 y
FB2, que son las fumonisinas más abundantes e importantes desde el punto de vista toxicológico.
Esas fumonisinas pueden separarse y analizarse mediante:
• Cromatografía en capa fina
• Cromatografía líquida de alta resolución
• Cromatografía de gases-espectrometría de masas
• Electroforesis capilar
• También diversos métodos inmunoquímicos.
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Acratoxina A
Detectada por primera vez en muestras de maíz africanas, es considerada un metabolito secundario
tóxico producido por especies de hongos filamentosos superiores de los géneros Penicillium y
Aspergillus, capaces de crecer sobre una amplia gama de sustratos orgánicos.

Los cereales, en humanos, y los piensos, en animales, constituyen las principales fuentes de
exposición alimentaria, aunque también pueden encontrarse niveles notables de contaminación en
otros alimentos como los alimentos infantiles a base de cereales.
Las prácticas agrícolas y las condiciones medioambientales (humedad y temperatura) durante el
almacenamiento y el transporte afectan de forma directa a los niveles de OTA en estos. También
una alta actividad de agua favorece la producción de OTA en los alimentos. (Ravelo Abreu, 2020)

Métodos utilizados para la determinación y cuantificación de OTA

Los métodos de determinación y cuantificación han variado a lo largo de los años, así como los
procedimientos de extracción y purificación. El objetivo principal en la elaboración de técnicas es
la obtención de niveles de detección muy bajos, pudiendo ser utilizados tanto en investigación
como en análisis de prospección o control. Entre los métodos más usuales empleados para la
determinación y cuantificación de los niveles de Ocratoxina A, debido a la rapidez y
semicuantificación en el procedimiento de screening119 se incluyen:
• Cromatografía líquida de alta resolución.
• Cromatografía de capa fina.
• Cromatografía de intercambio iónico.
• Técnicas de electroforesis capilar.
• Cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS-MS)121.
• Cromatografía liquida de alta resolución acoplada a un detector de fluorescencia, de gran
sensibilidad y especificidad, que detectan niveles de concentración inferiores a 1 ug/kg122.
• Técnica cualitativa del Test (ELISA), mediante el uso combinado de anticuerpos
monoclonales3,122.
• Empleo de inmunosensores específicos para la detección de OTA.
• Extracción con polímeros de impronta molecular e inmunosensores nanoestructurados
piezoeléctricos y electroquímicos.
• Detección de metabolitos fúngicos con actividad toxica mediante bioensayos sobre Artemia
salina. (Programa Conjunto FAO/OMS Sobre Normas Alimentaris (Noviembre 1998), 2020)

Metales
Los metales no son malos por definición y muchos resultan esenciales en nuestra dieta.
Difícilmente puede evitarse de forma total su ingesta ya que se encuentran presentes de forma
natural o artificial en los alimentos.
Podemos distinguir dos grupos de metales:
• Metales esenciales.
• Metales no esenciales como el plomo, cadmio, arsénico mercurio, entre otros
Análisis de metales no esenciales como el Arsénico, Cadmio y Plomo en cereales.
Se utilizan técnicas espectométricas de emisión atómica, se utilizan técnicas y equipos muy
sofisticados, ya que es necesario llegar a límites de detección muy bajos, del orden de 1 ppm (parte
por millón).
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Para poder hacernos una idea de que supone llegar a estos límites de detección, nos puede servir la
imagen de que sería lo mismo detectar niveles de 1ppm, que encontrar (o detectar) un grano de
arroz en 30Kg, o lo que es equivalente, encontrar un grano de arroz perdido entre 30 paquetes
normales (de 1 Kg.). No obstante, estas técnicas serían capaces de alcanzar niveles 100 veces más
bajos, aunque no resulta necesario para nuestros fines.
Preparación de muestra.
De forma que sea posible utilizarla en el equipo(espectrómetro).
Si la muestra no es homogénea tendremos que conseguir que lo sea, lo que se consigue
normalmente por trituración en un molino.
Posteriormente tenemos que conseguir que la muestra quede en disolución para lo que realizaremos
una digestión con lo que disolveremos sus componentes (mineralización). Esta digestión puede ser
por vía húmeda (mediante la acción de ácidos), o seca (por calcinación).
Medición en el espectrómetro
A partir de aquí es cuando se va a aplicar la técnica de espectrometría. En concreto, en nuestro
caso, de espectrometría de emisión por plasma óptico que se basa en la vaporización, disociación,
ionización y excitación de los diferentes elementos químicos de una muestra en el interior de un
plasma. El plasma está constituido por un gas fuertemente ionizado. En la tierra no existe, pero si
en la corona solar, espacios interestelares. permite alcanzar temperaturas de 5.000 a 10.000 Kelvin.
En el interior del plasma, se producen las emisiones características de cada elemento.
Lectura
En esta fase, a partir de las lecturas de las emisiones que se han producido en el equipo
conseguiremos identificar los metales y saber en qué cantidad se encuentran en la muestra. Para
ello, la selección de la longitud de onda nos permite saber de qué metal se trata, mientras que la
intensidad de la radiación emitida nos proporcionará la información para poder saber en qué
cantidad está en la muestra.

Otros contaminantes presentes en Cereales.

Ácido cianhídrico

Métodos de análisis para determinar la presencia de HCN en la yuca y productos de yuca

Es factible determinar el total de ácido cianhídrico en la yuca mediante la determinación de los
diversos compuestos participantes, no se han documentado métodos que cuantifiquen en forma
fiable los posibles contribuyentes. Por lo tanto, es preferible que el total de ácido cianhídrico se
determine mediante una técnica apropiada que convierta todos los contribuyentes a ácido
cianhídrico (hidrólisis ácida o enzimática).
La detección espectrofotométrica de los productos de una reacción de cianuro (Guignard o König)
o el análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) después de una reacción
precolumna parecen ser los métodos más comunes en uso para determinar el total de ácido
cianhídrico de materiales vegetales cianogénicos.
Es probable que los métodos HPLC sean más específicos y han presentado una buena sensibilidad.
Para los análisis de laboratorio básicos los métodos del papel con picrato o del ácido
isonicotínico/ácido barbitúrico parecen ser adecuados. Actualmente la “norma de oro”
probablemente sean los métodos cromatográficos de detección del cianuro debido a la especificidad
de la técnica de detección.
Hay muy poca información disponible sobre el rendimiento relativo de los diferentes métodos. Se
conocen comparaciones que se han llevado a cabo dentro de un único laboratorio. La falta de
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materiales de referencia y de pruebas de colaboración entre laboratorios obstaculiza la definición

del rendimiento del método analítico.
Contaminantes en cárnicos
El análisis de contaminantes orgánicos en alimentos es una tarea ardua que engloba muchas
disciplinas incluidas la química, bioquímica y la microbiología. No es una tarea fácil, ya que estos
contaminantes, de los que se pueden enumerar miles, están presentes a unas concentraciones
extremadamente bajas, en mezclas complejas de compuestos de los alimentos naturales. Sin
embargo, cualquier técnica que se utilice en el análisis de alimentos debe alcanzar o ser capaz de
separar los compuestos de la matriz y la identificación de los contaminantes a niveles traza. Ver
tabla No.2 sobre Aplicaciones de la EC para la determinación de contaminantes orgánicos en
alimentos
Métodos para determinar contaminantes
Contaminantes físicos
Detección y control de mercurio en carnes y vísceras
Métodos analíticos basados en Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado
Inductivamente (ICP-MS) para la detección de mercurio en carnes y vísceras. La técnica de
análisis consiste en la determinación de la relación masa/carga de los iones de la muestra que han
sido originados por un plasma de acoplamiento inductivo.
Límites máximos de residuos de compuestos de mercurio en determinados productos, según la
normativa actual, el mercurio forma parte del grupo B3c dentro del Plan PNIR (MAPAMA, 2017)
y se encuentra legislado en el Reglamento (CE) 396/2005, límites máximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal
Carne: a 0,01 mg/kg, excepto en la carne de animales de caza silvestres, en los que era a 0,015
mg/kg, y carne de pato (de cría y silvestre), en los que era a 0,04 mg/kg
Grasa de origen animal: a 0,01 mg/kg; en despojos comestibles a 0,02 mg/kg, excepto en los
despojos de animales de caza silvestres, en los que era a 0,025 mg/kg, y en los despojos de jabalí,
en los que era a 0,10 mg/kg
Determinacion de las concentracion de metales toxicos (al, pb y cd) en carnes.
Mediante un espectrómetro de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente (ICP-OES)
para la obtención de los valores numéricos de las concentraciones de los distintos metales.
Materiales y equipo
Cápsulas de porcelana
Varillas de vidrio
Frascos de polipropileno de 100 mL.
Matraces aforados de 25 mLy 1L.
Probetas de 100 mL.
Vasos de precitipado de 100 mL.
Pipetas Pasteur
Embudo de cristal
Balanza analítica de la marca Mettler Toledo classic plus, modelo PB153-S/FACT
Placa calefactora de temperatura regulable
Estufa marca J.P
Horno mufla marca Nabertherm, modelo L9/ 11/ C6
Espectrofotómetro de absorción atómica, IPC óptico.
Material general de laboratorio (papel de filtro)
Análisis de contaminantes químicos
Determinación de avermectinas en músculo e hígado
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Método analítico empleando cromatografía de líquidos (HPLC) en fase reserva, utilizando

un detector de Espectrometría de Masas (HPLC/MS-MS).
La ionización se produce en la interface electrospray y el detector es un triple cuádruplo con modo
de adquisición “Múltiple Reaction Monitoring” (MRM). Ver tabla No. 1 sobre LMRs de
avermectinas en higados de bovinos y porcinos

Técnicas cromatográficas para la determinación de contaminantes

Electroforesis capilar (ec)
Es una técnica analítica que se ha aplicado para el análisis de alimentos, forense, farmacéutico,
ambiental, muestras biológicas, etc. Es una técnica muy estudiada para aquellos compuestos que
no se pueden separar ni por cromatografía gaseosa (CG) ni por cromatografía líquida (CL). Son
muchas las características inherentes a la EC, como: la velocidad del análisis, eficacia elevada,
separación selectiva, capacidad de analizar tamaños de partícula pequeña y bajo consumo de
reactivos.
Extracción en fase sólida (efs)
La EFS se realiza forzando el paso de los analitos disueltos en una matriz líquida a través de un
soporte sólido de naturaleza extractante, donde los analitos quedan retenidos para posteriormente
ser diluidos con una mínima cantidad de disolvente orgánico. En este proceso se ven implicados
mecanismos de absorción, reparto y desorción.
Microextracción en fase sólida (mefs)
La MEFS es una técnica de preparación de la muestra alternativa a la EFS, basada en la adsorción
y/o reparto de los analitos sobre una microfibra, recubierta con una fase estacionaria (sílice
fundida). Los analitos difunden hacia la fibra hasta que transcurrido un tiempo, se alcanza el
equilibrio para cada compuesto entre el agua y la fibra. Posteriormente los analitos se desorben en
el inyector de un cromatógrafo de gases o de líquidos con ayuda de una jeringa.
Solamente en dos trabajos se aplica la MEFS en cambinación con EC para la determinación de
plaguicidas en alimentos. Rodríguez y col; determinaron cinco plaguicidas ácidos, o-fenilfenol,
ioxonil, haloxifop, acifluorfen y picloram en frutas y obtuvieron recuperaciones muy similares a
las que se obtiene con EFS.
Extracción sobre barras magnéticas (esbm)
La ESBM consiste en introducir una barra magnética recubierta de polidimetilsiloxano (PDMS) en
una solución acuosa, a la cual se adsorben los analitos. Se basa en los mismos principios de la
MEFS, sin embargo, la principal diferencia con la MEFS es que la cantidad de fase extractiva en
las barras magnéticas es mayor que en las fibras, y por lo tanto la sensibilidad es también mayor.
Presenta algunas limitaciones como es el recubrimiento de las barras, para las que sólo existen de
PDMS, en cambio para las fibras de la MEFS se comercializan distintos tipos de recubrimientos.
Extracción presurizada con disolventes (epd o ple o ase)
La EPD permite la extracción de una gran variedad de compuestos tanto de muestras sólidas como
semisólidas. Se utilizan disolventes a alta presión y temperatura sin alcanzar su punto crítico; estos
dos parámetros determinaran la eficiencia de la extracción. La extracción sigue tres etapas; el
analito difunde del corazón de la matriz a la superficie, después se transfiere al solvente de
extracción y por último el analito es eluído de la celda de extracción.
El coeficiente de difusión viene determinado por la estructura del analito, la temperatura de
extracción y el disolvente utilizado, lo que permite utilizar una gran variedad de disolventes. La
muestra se introduce dentro de una celda de extracción de acero inoxidable se cierra y se llena de
disolvente. Bajo y límites de cuantificación (LDC o LOQs) aceptables.
Contaminantes en productos lácteos
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La leche es el alimento más completo que entrega la naturaleza y tiene grandes posibilidades
industriales para obtener diversos productos para la alimentación humana, industria farmacéutica
y otros. Es considerada como un alimento completo puesto que contiene elementos nutritivos en
cantidades adecuadas para el funcionamiento correcto de los procesos bioquímicos que se producen
en el organismo (Mardones, 1994).
Este producto que llega a los acopios y a las procesadoras en muchos casos contiene recuentos de
bacterias elevados. De una vaca sana, recién ordeñada en condiciones higiénicas, se obtiene una
leche con un número pequeño de microorganismos. Algunas de las cuales son muy perjudiciales
desde el punto de vista sanitario y tecnológico.
Estos métodos universalmente conocidos tienen limitantes como son el excesivo tiempo de
realización, amplia laboriosidad y utilización de gran cantidad de medios de cultivo, placas y otros
insumos (Tejedor, 1998).
Métodos rápidos de diagnóstico microbiológico en leche.
El desarrollo de métodos rápidos y/o automatizados en el diagnóstico de la calidad higiénico
sanitaria de la leche y sus productos constituye en los últimos años una necesidad enfocada en lo
fundamental en la obtención de la respuesta en el menor tiempo posible para tomar las medidas
correctivas sobre las posibles brechas en la higiene de algunas de las fases de la cadena productiva
antes de que el producto sea liberado en el mercado. (Bishop, 1998).
Métodos directos
Los métodos directos se basan en la enumeración directa de las células bacterianas donde
encontramos el Conteo Directo al Microscopio (CDM) y la Epifluorescencia Directa (DEFT),
mientras que el Dispensor de placa (Plate Loop), el Sistema de Conteo en Espiral y Petrifilm
detectan colonias bacterianas.
El CDM
Del número de bacterias en muestras de leche cruda se basa en la técnica desarrollada por Breed
(1911). Una pequeña cantidad de leche se expone uniformemente sobre un área prescrita de un
portaobjeto la cual después de secada se tiñe y las células individuales o agregados de bacterias
son contadas en varios campos usando un microscopio compuesto con una iluminación
convencional. A partir del número de células o agregados contados y del número de campos
examinados, se calcula un conteo por mililitro de la muestra de leche original.
ECDM
Es un método rápido para estimar el grado de contaminación bacteriano de la leche pero que no
está diseñado para el conteo rutinario de la leche cruda ya que el conteo en placa es más preciso,
más práctico y más barato que un conteo directo ejecutado adecuadamente. Si el método se
contemplara como un método para estimar la calidad de la leche con propósito de pago, su uso
seria limitado para pequeño número de muestras con alto conteo bacteriano (2.3 x 106 ufc/mL)
debido a la insensibilidad del método.
La Técnica de la Epifluorescencia Directa sobre Filtro (DEFT)
Se basa en el filtrado de la muestra a través de una membrana que retiene mohos, bacterias y
levaduras y en teñir estos microorganismos con el colorante fluorescente para su conteo mediante
microscopio de epifluorescencia. La fluorescencia es una reacción de luminiscencia en la que la
energía de una luz incidente es absorbida por los átomos de moléculas o por iones de sustancias
fluorescentes capaces de emitir una luz de longitud de onda superior a las que la ha excitado
previamente.

El Método de Dispersión en Placa

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Fue adaptado ampliamente para la estimación de la calidad de la leche y se emplea un asa calibrada
para transferir una porción definida de una muestra de leche en una placa de petri en una sola
operación. El equipo ensamblado consiste en un asa de platino calibrado que se inserta al final de
una aguja hipodérmica (Lver-lok) en un ángulo de 30o. La aguja esta acoplada a un dispositivo que
pipetea de forma continua un diluyente estéril administrado con la pipeta. El resto de la prueba
incluye el vaciado de las placas, incubación y conteo de colonias que se lleva a cabo de la misma
forma que el método convencional de conteo en placa o CSP.
El Sistema de Conteo en Espiral
Dispone de un dispensador que deposita de forma continua un volumen decreciente de líquido en
la superficie de una placa de agar que gira a una velocidad adecuada mientras el dispensador se
mueve desde el centro hasta el extremo, dando lugar a una espiral de Arquimides. El sistema diluye
y siembra de forma que se puede determinar un intervalo amplio de conteo de colonias en una sola
placa. Se le señalan como limitaciones el costo y algunas dificultades para el conteo de mohos
(Fung, 1994).
El Sistema Petrifilm
Consiste en dos piezas fílmicas que contactan con el nutriente de medio en su estado sólido. La
muestra diluida es aplicada sobre el film y después de incubada, las colonias son contadas mediante
el revelado (Reybrodeck, 1996). La técnica se ha empleado en la estimación de psicrófilos con
resultados aproximados de 48 horas incluyendo el período de preincubación. Los valores de
correlación son posibles entre 75 y 80 y se plantea como ventaja la ausencia de costo inicial
significativo y el bajo costo por muestra.
Métodos indirectos.
Este procedimiento requiere un periodo de incubación en el cual se producen cambios físicos o
bioquímicos en el medio. Mientras que el segundo grupo esta relacionado con las mediciones de
las concentraciones de constituyentes específicos de las células como ATP, el cual está presente en
las células activas, así como la lipopolisacaridasa, el tercer grupo se fundamenta en la
determinación de compuestos metabólicos que aparecen en la muestra como consecuencia de la
transformación de los componentes del sustrato durante el almacenamiento. Estos dos últimos
grupos no requieren períodos largos de incubación, (Grappin, 1989).
En los métodos rápidos se elige la detección de una señal físico-química resultante de la actividad
específica de los M.O contaminantes a detectar.

Actividad metabólica
Tensión de oxigeno
El O2 es el primer aceptor de electrones para muchos M.O en el proceso de respiración y
metabolismo, excepto en l de los anaerobios obligados, la reacción o volumen de consumo de O2
es proporcional a la actividad metabólica y número de M.O. Partiendo de estos elementos, la
utilización del O2 tiene varias aplicaciones en biología, ello es usualmente válido si se utilizan
manómetros o electrodos de O2 haciéndose más sensitiva y rápida la prueba. La técnica puede ser
aplicada para detectar y conocer la actividad de la población microbiana total en muestras de leche.
L disminución del contenido de O2 de la leche durante el almacenaje e incubación se debe al
contenido de bacterias (Lück et al.1970). Un trabajo realizado por Gaida et al. (1990) con un
microrespirómetro basado en la medición del consumo de O2 a una presión y volumen variable
para estimar la carga bacteriana de la leche cruda resultó satisfactorio.

Catalasa
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Se escriben dos métodos para esta determinación, uno es el método de la columna de gas con pipeta
de Pasteur y el segundo sistema es el que se conoce comercialmente como CATALASAMETER
(equipo automatizado), usando el método del disco de flotación. El principio esta dado por el
tiempo de flotación del disco de papel que contiene catalasa en el tubo con H2O2, la presencia de
altos niveles de catalasa indican, niveles altos de M.O catalasa positivos, el tiempo de flotación
sería muy largo o nulo. El problema con dicha prueba es la interfase a partir de bacterias catalasa
negativos y la catalasa proveniente de los tejidos, por lo que se necesita más investigaciones sobre
esta prueba, justificado ello por la rapidez de la misma (Fung, 1994).
Reductasa
Los tests de reducción de colorantes se han utilizado durante muchos años como indicadores de la
calidad microbiológica de la leche y otros productos alimenticios. Están basados en la medición de
la actividad metabólica de las bacterias, ya que muchas de ellas poseen las enzimas
deshidrogenasas, las cuales transfieren hidrógeno de un sustrato a un aceptor biológico
reduciéndolo. Tal es el uso de la Prueba de Reducción del Azul de Metileno, de la Resazurina y
del Trifenilfetrazolium. Teniendo en cuenta que los métodos de reducción no funcionan
eficazmente en leches refrigeradas, se ha sugerido la sustitución de estas por otras técnicas rápidas
(Ponce, 1989).
La prueba de reductasa es una prueba destinada a establecer el grado de conservación de la leche,
más que una forma precisa de estimar el número total de microorganismos. Estas pruebas son
métodos indirectos basados en la reducción de colorantes.
Prueba de filtrado
En el transcurso del ordeño, la leche es susceptible de cargarse de partículas e impurezas
procedentes del polvo, excremento, etc. Por eso examinar los sedimentos macroscópicos en el
filtro, después de colar la leche, permitirá la separación de suciedades y prevención temprana de la
calidad de la leche, como también, distinguir a los productores descuidados y sucios. Esta prueba
es muy sencilla y consiste en examinar el filtro o la manta, después de haber colado la leche. El
procedimiento se realiza a cada recipiente y por cada productor.
Prueba de mastitis
La prueba más utilizada para detección rápida de mastitis es la Prueba Mastitis California (PMC).
Esta prueba se fundamenta en la reacción que tiene lugar entre determinados detergentes y las
células somáticas presentes en la leche. El reactivo PMC lleva incorporado además un indicador
de pH. Dependiendo de la cantidad de las células somá- ticas presentes, la mezcla de leche con
reactivo PMC puede permanecer homogénea (si el número de células somáticas es bajo) o formar
una masa viscosa gelificada (en el caso contrario).
Bioluminiscencia
La Bioluminiscencia es otra técnica muy interesante. Se basa en una serie de reacciones
enzimáticas (generalmente a cargo de oxidasas) que cursan con una emisión de luz y tiene lugar en
determinados seres vivos. Para su procedimiento se obtiene la enzima luciferasa de un coleóptero
de la familia Lampyres, el Photinus pyralis, la cual en presencia de sus dos sustratos, luciferina y
ATP microbiano, produce una reacción bioluminiscente que se puede medir con un
espectrofotómetro. El tiempo requerido para el análisis es muy corto (aproximadamente 1 minuto),
pero partiendo de la preparación de la muestra, el tiempo tomado usualmente es de 5-15 minutos.
La sensibilidad de la prueba se ha movido desde 104 hasta 1 x 107 ufc/mL, con el empleo de
equipos semi-automatizados como el LUMAC RAW MILK MICROBIAL o más automatizado
como el BACTOFOSS.
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Limulus TEST
Las bacterias Gram negativas se caracterizan por la producción de endotoxinas a partir de la
membrana celular, la cual está compuesta por una capa lipopolisacárida (LSP) y las mismas pueden
ser detectadas por la formación de un gel o mediante ensayos colorimétricos usando un LAL
(limulus amacbocyte lysale) como reactivo. Este es preparado a partir de sangre del cangrejo de
herradura Limulus poliphemus. Una versión turbidimétrica de la prueba de limulus se utiliza para
evaluar la flora Gram negativa en leche cruda. Esta técnica ha sido evaluada por Moody et al.
(1996) quien indicó que el procedimiento de microplaca (LAL) puede usarse exitosamente en lugar
del procedimiento en tubos. El procedimiento (LAL) entrega buenos valores de correlación (¡Ý
0.85) cuando el suministro de reactivo es disponible. Las endotoxinas ¨Backgrounds¨ de la
cristalería, agua, etc, pueden afectar los resultados con estos procedimientos, por lo tanto, deben
tomarse extremo cuidado respecto a esto.
Piruvato
Se sugiere la medición del piruvato como un indicador de la calidad higiénica de la leche
inmediatamente después del ordeño. El nivel de piruvato normal en leche es de 0.5 – 1.5 mg/l, el
cual no es relativo al conteo inicial de la leche, pues proviene de otras fuentes como los leucocitos,
además el nivel de piruvato presente en la leche limita la utilidad de esta prueba para bajos niveles
de M.O donde el piruvato varia de acuerdo a las condiciones de almacenamiento del producto. Por
esta razón la medición del piruvato no es un método factible para determinar la calidad higiénica
de la leche con bajos niveles microbianos, siendo solo útil para detectar leches con altos conteos
bacterianos (1x108ufc/mL). La prueba tiene como ventajas su rapidez y facilidad de
automatización (Suhren et al, 1991).