UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS-ESPE

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
DISEÑO DE PROCESOS

INTEGRANTES: Arias Omar, Ayala Gabriela, Flores David, Panchana Carolina, Paredes Alexandra,
NRC: 633

Producción de proteínas heterólogas utilizando el sistema de expresión Pichia pastoris

La producción de una proteína funcional está íntimamente relacionada con la maquinaria celular del organismo
que produce la proteína. La levadura Pichia pastoris es un sistema útil para la expresión de cantidades de
miligramos a gramos de proteínas tanto para la investigación básica de laboratorio como para la fabricación
industrial. La fermentación puede ampliarse fácilmente para satisfacer mayores demandas, y pueden controlarse
los parámetros que influyen en la productividad y la actividad de las proteínas, como el pH, la aireación y la
tasa de alimentación de la fuente de carbono. En comparación con las células de mamíferos, Pichia no requiere
un medio de crecimiento complejo ni condiciones de cultivo, es genéticamente relativamente fácil de manipular
y tiene una vía de síntesis de proteínas eucariotas. Gracias a esto se ha expresado receptores acoplados a la
proteína G, que no pueden expresarse eficientemente en las bacterias, Saccharomyces cerevisiae o el sistema
célula de insecto/baculovirus. Esta levadura metilotrófica es particularmente adecuada para la expresión de
proteínas extrañas por varias razones, entre ellas la facilidad de manipulación genética, por ejemplo, la selección
de genes, la transformación de ADN de alta frecuencia, la clonación mediante complementación funcional, los
altos niveles de expresión de proteínas a nivel intracelular o extracelular, y la capacidad de realizar mayores
modificaciones de las proteínas eucarióticas, como la glicosilación, la formación de enlaces de disulfuro

El metabolismo del metanol en Pichia

Las levaduras metilotróficas son capaces de utilizar el metanol como única fuente de carbono y energía. Todas
las cepas de este tipo identificadas hasta la fecha pertenecen a sólo cuatro géneros: Hansenula, Pichia, Candida
y Torulopsis. Todas ellas comparten una vía específica de utilización del metanol que implica varias enzimas
únicas. Las reacciones iniciales tienen lugar en microorganismos especializados, los peroxisomas, seguidos de
posteriores pasos metabólicos en el citoplasma. Los peroxisomas desempeñan una función indispensable
durante el crecimiento, ya que albergan las tres enzimas clave para el metabolismo del metanol, a saber, la
oxidasa alcohólica, la catalasa y la dihidroxiacetona sintasa.

Los sistemas de expresión de Pichia

La expresión de cualquier gen extraño en P. pastoris comprende tres pasos principales: a) la inserción del gen
en un vector de expresión; b) la introducción del vector de expresión en el huésped de P. pastoris; y c) el examen
de las posibles cepas para la expresión del gen extraño. Por lo tanto, los promotores AOX han sido los más
utilizados; sin embargo, existen otras opciones de promotores para la producción de proteínas extrañas en
Pichia,

 Promotor de AOX2

El gen AOX2 también produce alcohol oxidasa, aunque este gen produce una actividad de AOX 10-20
veces menor que el gen AOX1. Sin embargo, ha habido algunos informes exitosos de aumento de los niveles
de expresión utilizando el promotor AOX2 o con una versión truncada del promotor. Los niveles de
 producción de una albúmina sérica humana recombinante que utiliza el promotor AOX2 aumentaron con la
adición de una pequeña cantidad de ácido oleico

 El promotor del FLD1

La formaldehído deshidrogenasa (FLD) es una enzima clave involucrada en la vía metabólica del metanol
en Pichia. También participa en la protección de la célula de los efectos tóxicos causados por el
formaldehído durante el metabolismo de la metilamina, que puede ser usada como la única fuente de
nitrógeno para las células.

El gen FLD1 es inducible tanto por el metanol como por la metilamina. La ventaja de esto es que cuando
se utiliza la metilamina para la inducción de la expresión de proteínas extrañas, la glucosa o el glicerol
pueden utilizarse como fuente de carbono en lugar de metanol, o el propio metanol puede utilizarse como
única fuente de carbono

Marcadores seleccionables

Todas las cepas de expresión de P. pastoris se derivan de NRRL-Y11 430 (Northern Regional Research
Laboratories, IL, EE. UU.), la cepa de tipo salvaje. A menudo, uno o más mutantes auxotróficos están presentes
en estas cepas, lo que permite la selección durante la transformación de cepas que contienen el gen marcador
seleccionable apropiado. La manipulación genética de P. pastoris para la producción de diversas proteínas
heterólogas se simplifica mediante el uso de una amplia gama de marcadores y promotores seleccionables.
Puede llegar a requerirse una gran cantidad de optimización a nivel molecular, así como la optimización del
proceso de producción de proteínas.

Control de proteólisis

El background genético de una cepa huésped de Pichia puede influir en el nivel de transcripción, la eficiencia
de la traducción, la vía secretora, la calidad de la proteína, la estabilidad del plásmido y el número de copias del
plásmido. Esto se observa mejor con el uso de cepas deficientes en proteasa para mejorar la calidad y el
rendimiento de diversas proteínas heterólogas.

En general, las proteínas recombinantes secretadas pueden potencialmente degradarse proteolíticamente en el

medio de cultivo por proteasas extracelulares, proteasas unidas a células o por proteasas intracelulares de células
lisadas. Sin embargo, las proteasas extracelulares de P. pastoris no están bien documentadas y, según los
informes, esta levadura solo secreta niveles bajos de proteínas endógenas.

Se pueden emplear varias estrategias para controlar la proteólisis en P. pastoris. Como:

Estrategias de nivel de cultivo.

Las técnicas de cultivo pueden influir en la proteólisis de proteínas recombinantes. P. pastoris es capaz de crecer
en un rango de pH relativamente amplio (3.0–7.0).

La estabilidad del producto se mejora aún más mediante la adición de suplementos ricos en aminoácidos al
medio de cultivo, posiblemente actuando como sustratos alternativos y competitivos para una o más proteasas
problemáticas, y estos suplementos también pueden reprimir la inducción de proteasas causada por limitación
de nitrógeno.
La temperatura de cultivo más baja también puede influir en los rendimientos de la proteína recombinante,
posiblemente debido a la pobre estabilidad de la proteína recombinante a temperaturas más altas, la liberación
de más proteasas de las células muertas y los problemas de plegamiento a temperaturas más altas. La tasa de
crecimiento específica también se ha utilizado para reducir la proteólisis, aunque la adición de inhibidores
específicos de proteasa al medio de cultivo también puede ser una opción.

La combinación de una o todas estas estrategias a nivel de cultivo demostraría ser un medio eficaz para obtener
proteínas recombinantes intactas de P. pastoris con mínima degradación proteolítica.

Estrategias a nivel celular

Se ha encontrado que el uso de cepas deficientes en proteasa, como SMD1163 (his4 pep4 prb1), SMD1165
(his4 pep4) y SMD1168 (his4 pep4) aumenta el rendimiento y la calidad de varias proteínas heterólogas. Estas
cepas tienen una alteración en los genes que codifican la proteinasa A (PEP4) y / o la proteinasa B (PRB1). Los
mutantes pep4 eliminan la actividad de la proteinasa A y carboxipeptidasa Y, y reducen parcialmente la
actividad de proteinasa B. Los mutantes prb1 eliminaron la actividad de la proteinasa B, mientras que los
mutantes dobles pep4 prb1 mostraron una reducción o eliminación significativa de estas tres actividades
proteasas.

En los cultivos de fermentadores de P. pastoris, una concentración relativamente alta de estas proteasas
vacuolares está presente en el caldo de cultivo, como resultado de la combinación de altas densidades celulares
y la lisis de un pequeño porcentaje de células.

Estrategias a nivel proteico

Si un conector entre los dominios de una proteína de fusión contiene una secuencia de aminoácidos reconocida
por las proteasas nativas, podría ser particularmente sensible a la degradación. En consecuencia, la secuencia
de aminoácidos se puede eliminar si no es esencial para la función de la proteína.

Dosis de genes

El número de copias de genes ha sido identificado como un paso "limitante de la velocidad" en la producción
de proteínas recombinantes de P. pastoris. Aumentar el número de copias del casete de expresión generalmente
tiene el efecto de aumentar la cantidad de proteína expresada.

Las células de Pichia que expresan el antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg) bajo el control del
promotor constitutivo de GAP se identificaron como sometidas a inserciones espontáneas de genes múltiples en
un solo locus. Se encontró que los clones multicopia que contenían hasta cuatro copias del gen HbsAg tenían
un rendimiento cuatro veces mayor de HbsAg que los que contenían una sola copia del gen. La relación entre
el número de copias y el nivel de producto era muy simple.

Se podría esperar que un mayor número de copias ejerza un efecto negativo en la transcripción y la traducción,
las cuales pueden llegar a limitar la velocidad debido a la falta de recursos, como precursores y energía, como
se informó anteriormente. para la producción de proteínas recombinantes en E. coli. Sin embargo, en Pichia se
ha propuesto que es más probable que cualquier limitación se deba a eventos postraduccionales, como el
plegamiento dentro del retículo endoplásmico (ER), la translocación de membrana y el procesamiento de la
secuencia de señal.

La modificación post-traducción de las proteínas secretadas

P. pastoris, a diferencia de los sistemas de expresión bacteriana, tiene la capacidad de realizar muchas de las
modificaciones post-traducción que se realizan normalmente en los eucariotas superiores, por ejemplo, el
plegado correcto, la formación de enlaces de disulfuro, O -glicosilación y el procesamiento de secuencias de
señales vinculadas al N. El plegamiento y la formación de enlaces de disulfuro se han identificado en algunos
casos como el paso "limitante de la velocidad" en la producción de proteínas extrañas de Pichia, es decir, la
capacidad del organismo para procesar, plegar y secretar los productos recombinantes determina la
productividad del sistema de expresión de Pichia. Por lo tanto, es difícil optimizar la producción de proteínas
recombinantes a menos que se puedan identificar estos factores limitantes de la tasa.

Señales de secreción y formación de enlaces de disulfuro

P. pastoris puede producir proteínas extrañas expresadas tanto intracelular como extracelularmente. La
producción extracelular de proteínas extrañas es más deseable para evitar los habituales primeros pasos de
purificación, por ejemplo, lisis celular para liberar el contenido celular, seguido de una clarificación para
eliminar los restos celulares. La pichia también segrega niveles muy bajos de proteínas nativas, lo que facilita
la recuperación de la proteína extraña segregada del líquido de fermentación mediante la simple eliminación de
células enteras por filtración o centrifugación. Además, las señales de secreción pueden adherirse a la proteína
de interés, haciendo que sea exportada fuera de la célula. Los genes extraños pueden ser clonados en vectores
de P. pastoris para alinearlos en el marco de lectura correcto con la señal de secreción nativa de la proteína de
interés, el péptido de factor de S. cerevisiae α, oLa señal de la fosfatasa ácida de P. pastoris (PHO1). La señal
α-factor de S. cerevisiae es la señal de secreción más utilizada y exitosa, siendo en algunos casos mejor que la
secuencia líder de la proteína heteróloga nativa. Sin embargo, la variabilidad en el número de aminoácidos N-
terminal se informa comúnmente con las proteínas heterólogas secretadas utilizando la señal preprolongadora
del factor α.

La glicosilación ligada al O y al N

La glicosilación es una de las modificaciones post-traducción más comunes realizadas por P. pastoris. También
es una de las más complejas [34]. Se cree que como muchas proteínas nativas de los mamíferos son glicosiladas,
debe ser necesario tener los patrones de glicosilación correctos en las proteínas recombinantes para asegurar su
actividad biológica. Además, los productos génicos glicosilados tienen generalmente cadenas de glicosil mucho
más cortas que las que se expresan en S. cerevisiae, lo que hace que P. pastoris sea un huésped mucho más
atractivo para la expresión de las proteínas recombinantes.

Pichia, como otras levaduras y hongos, añade O -oligosacáridos a los grupos hidroxilo de la serina y treonina
de las proteínas secretadas. Estos están compuestos sólo por residuos de manosa, mientras que los eucariotas
superiores, como los mamíferos, tienen una composición de azúcar más variada en estos oligosacáridos. Es
posible que Pichia glicosile proteínas heterólogas, incluso cuando esas proteínas no son normalmente
glicosiladas por el huésped nativo; e incluso cuando la proteína es glicosilada en el huésped nativo, Pichia puede
no glicosilarla en los mismos residuos de serina y treonina.

El alcance de la glicosilación de O por P. pastoris se ha estudiado en un dominio catalítico de glucoamilasa de

Aspergillus awamori [44]. El peso molecular de la proteína secretada era 20 kDa más pesado que la proteína
nativa. Alrededor de 10 kDa de este peso podría atribuirse a la N -glicosilación, lo que significa que el resto
podría atribuirse a los glucósidos ligados al O, que probablemente consisten en 20 - 30 residuos de manosa. De
este estudio se concluyó que el grado de glicosilación de las proteínas por P. pastoris era sustancialmente menor
que el de S. cerevisiae, pero que el grado de glicosilación de las diferentes proteínas secretadas por P. pastoris
difirió mucho.
Producción de proteínas heterólogas en P. pastoris

Desde 2002 ha habido un gran aumento en la producción de proteínas extrañas en Pichia. El crecimiento celular
es importante para la producción de proteínas secretadas en biorreactores, ya que la concentración del producto
en el medio extracelular es aproximadamente proporcional a la concentración de células en el cultivo debido a
la eficiencia del promotor AOX1. Los biorreactores son preferibles, ya que todos estos parámetros pueden ser
monitoreados y controlados simultáneamente, permitiendo una producción más eficiente de la proteína
heteróloga deseada.

Consideraciones de nutrientes

La de proteínas recombinantes de P. pastoris utilizan medios complejos para el crecimiento, que proporcionen
el ambiente químico correcto requerido para el crecimiento celular. Uno de las limitaciones comunes son la
concentración inicial de sustratos (glucosa o glicerol) utilizados. Es importante mantener el sustrato inicial a
bajas concentraciones no inhibitorias. Para producir grandes cantidades de la proteína heteróloga, se requiere el
uso de un medio definido y manipular el entorno fisicoquímico para maximizar el crecimiento y producción de
proteínas.

Se encontraron que la suplementación de un medio basal con siete vitaminas y dos oligoelementos aumentó la
producción de una hormona recombinante estimulante del folículo porcino de 93 mg / l (basal) a 187 mg / l
suplementado, tienen un efecto importante sobre el crecimiento celular y la producción de proteínas
recombinantes en P. pastoris. La fuente de nitrógeno generalmente se obtiene mediante la adición de hidróxido
de amonio, que también tiene el efecto de controlar el pH al nivel deseado. Adición de iones de amonio
adecuados a la el medio de crecimiento fue responsable de aumentar el rendimiento de una angiostatina
recombinante en aproximadamente 2.8 veces.

La fuente de carbono utilizada también puede afectar la cantidad de proteína recombinante retenida dentro de
las células. Las fuentes de carbono que no reprimen la expresión, como alanina, sorbitol y manitol, también han
con las cepas Mut− P. pastoris. Se demostró que cada una de estas fuentes de carbono aumentar la producción
de una β-galactosidasa recombinante en comparación con las células cultivadas con glicerol o glucosa, así como
reducir la cantidad de metanol requerida para la inducción de la expresión de proteínas.

Control de procesos

La ampliación del matraz de agitación al biorreactor requiere mucha más reoptimización que la ampliación de
biorreactores pequeños a grandes. Los componentes del medio utilizados en los procesos de P. pastoris (glicerol,
metanol, biotina, sales, oligoelementos) son económicos y están bien definidos y, como tales, son casi ideales
para gran escala producción de proteínas heterólogas en biorreactores.

Monitorear el metanol en un proceso de Pichia es extremadamente importante, ya que altos niveles de metanol
puede ser tóxico para las células y los niveles bajos de metanol pueden no ser suficientes para iniciar. Su control
puede hacerse usando un analizador de bioquímica para determinar las concentraciones de metanol, por medio
de reacciones enzimáticas de alcohol oxidasa. Otros factores como el pH que se sugiere un valor de 6.

La temperatura del proceso también resultó ser factor importante en el rendimiento y la actividad de esta
proteína. Alrededor de cuatro veces la cantidad de galactosa oxidasa producido cuando la temperatura del
proceso se redujo de 30 ° C a 25 ° C. Es necesario controlar el metanol, así como la producción de glicerol y
proteínas heterólogas para obtener la máxima cantidad de producto posible. Esto se logró utilizando la
transformada de Fourier en el infrarrojo medio espectroscopía que información sobre todos los componentes
del medio, incluida la biomasa, pueden detectar bajas concentraciones de proteína heteróloga, típicamente
menos.

Aspectos Futuros

El sistema de expresión de Pichia se ha utilizado ampliamente para la producción de proteínas solubles, el

verdadero desafío es la producción y recuperación de las proteínas de membrana hidrofóbicas. Muchas proteínas
de membrana tienen requerimientos específicos de lípidos y esteroles, y estos lípidos pueden estar involucrados
en el plegamiento y la estabilidad de la proteína, así como en su función.

A pesar de los resultados variables logrados se anticipa que la ampliación de estos procesos al fermentador los
recipientes mejorarán significativamente los niveles de producción y, por lo tanto, harán que su uso para
investigación y aplicaciones farmacéuticas sea más viable financieramente.

Conclusiones

El uso de P. pastoris para la producción de proteínas heterólogas es altamente efectivo. Ha permitido la

producción de incluso proteínas de membrana complejas. Sin embargo, aunque los sistemas de expresión de
Pichia disponibles son eficientes y fáciles de usar con protocolos de proceso bien definidos, se requiere cierto
grado de optimización del proceso para lograr la producción máxima de la proteína heteróloga, así como la
actividad máxima de la proteína.

P. pastoris para las proteínas solubles y secretables es el sistema de expresión más fácil y confiable con el
potencial de producir gramos de la proteína deseada. Para las proteínas de membrana insolubles, es difícil llegar
a una conclusión cuando hay tan poca información disponible.