MICROSCOPÍA Y TINCIÓN DE GRAM

CALLUPE AGUILAR, Kassandra Wieny / [email protected]

CHIRITO MAGUIÑA, Jeanpierre Alejandro / [email protected]

JATI QUINTO, Brenda Yazmin / [email protected]

Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental. Facultad de Ingeniería Ambiental. Universidad Nacional

de Ingeniería Ambiental. Av. Túpac Amaru 210 - Rímac. Apartado 1301. Lima-Perú.

06 de junio de 2020

RESUMEN

Desde la creación del microscopio la perspectiva en la biología cambio; debido a que, se

encontraron nuevos grupos de seres vivos o sistemas biológicos. Estos también conocidos
como microorganismos los cuales solo pueden ser vistos a través de un microscopio. Por lo
cual, se crearon diferentes conjuntos de tecnicas y metodos durante el pasar del tiempo.
Esto para lograr una mejor observación y análisis. La tinción de Gram es una de estas
metodologías que fue implementada por el bacteriólogo Christian Gram la cual pudo hacer
una primera diferenciación bacteriológica separando a las bacterias en gram positivas y
negativas. Esta diferencia radica en la morfología celular bacteriana. Finalmente, mediante
experimentos hemos comprobado que si no se siguen los procedimientos adecuados el
resultado no nos permitirá observar a estas bacterias.

Palabras clave: microscopio, microorganismos, tinción de Gram, morfología celular

bacteriana.

INTRODUCCIÓN Las bacterias son microorganismos

unicelulares que conviven con el ser
humano formando parte de nuestra flora
La microscopía es la técnica de producir habitual y la nuestro entorno sin ocasionar
imágenes visibles de estructuras o daños a la salud pero, también hay
detalles demasiado pequeños para ser aquellas que si los provocan. Para
percibidos a simple vista. Fue identificarlas y tratarlas es necesaria su
fundamental para el desarrollo de ciencias clasificación y una técnica sencilla para
como la biología, química y medicina. clasificación es la tinción de Gram.

El uso del microscopio comenzó como un La tinción de Gram es la tinción de las

entretenimiento, convirtiéndose hoy en un bacterias clasificándolas en Gram
instrumento básico de la ciencia y positivas y Gram negativas dependiendo
medicina teniendo como premisa la de la distribución de peptidoglicano en la
amplificación la observación de objetos y pared celular y la abundante existencia de
especímenes empleando diversas lípidos que repele la tinción haciéndola
técnicas, permitiendo así su propia incoloras ante el microscopio.2
evolución y variedad.1
El presente trabajo tiene como objetivos
- Mechero
capacitar al estudiante en el manejo y
- Placa petri - Lugol
aplicación de microscopía a través de
- Asa - Safranina
diversas fuentes virtuales, reconocer las
bacteriológica - Alcohol con
especificaciones apropiadas para la
- Cubreobjeto acetona
visualización de microorganismos,
- Portaobjeto - cristal violeta
reconocer la tinción de Gram y su
- microscopio
metodología, diferenciar las bacterias
gram positivas y las gram negativas.

Procedimiento

PARTE EXPERIMENTAL Preparación de la muestra

1. Microscopia Con la asa bacteriológica esterilizada se

frota una muestra de microorganismos en
el portaobjetos. Asegurándonos de
expandir bien la muestra.
Materiales y equipos Reactivos
Se flamea hasta que el agua en el
- Microscopio - agua portaobjetos se seque, con mucho
- Portaobjeto - bacterias cuidado que la muestra se queme.
- Cubreobjeto - cebolla
Luego se baña, sobre la muestra, el
portaobjetos con cristal violeta y se deja
reposar por 60 segundos lavandola
pasado este tiempo. El mismo
Procedimiento procedimiento se hace con el yodo,
alcohol y safranina en el orden que se
Uso del microscopio
mencionaron dejándolas reposar por 60,
15 y 60 segundo respectivamente.
Se debe prender el microscopio y
calibrarlo para su uso. La muestra debe
Finalmente la muestra pasa al
ser colocada correctamente en la platina
microscopio donde se deben observar las
donde se mueve en dos ejes hasta
bacterias gram positivas y negativas.
acomodarla frente al objetivo. Una vez en
el objetivo se coloca el de menor aumento
3. Diferenciación de bacterias
que viene a ser el 4X y se va aumentando
Gram positivas y negativas en
el rango del objetivo para poder ver más
yogurt
cerca una vez enfocado el
microorganismo.

Finalmente se hace uso del mando de Materiales y equipos Reactivos

enfoque, primero el macro con el cual
hallaremos el microorganismo y por último - Mechero
el micro para enfocar a este. - Placa petri - Yogurt
- Asa - Lugol
Se repite el procedimiento con cada bacteriologica - Safranina
microorganismo que se quiere observar. - Cubreobjeto - Alcohol con
- Portaobjeto acetona
2. Tinción de Gram - microscopio - cristal violeta
- Encendedor - Solución
- Marcador salina
- Tubo de tamponada
Materiales y equipos Reactivos ensayo con fosfato
 - Pipeta

Al comenzar la actividad se debe

desinfectar el lugar de trabajo con etanol
al 70% para evitar la contaminación de la
muestra.

Se dibuja un circulo en el centro del

portaobjetos con un marcador y el nombre
de la muestra al costado para no
confundirla con otras muestras.

Para diluir una muestra de yogurt se hace Imagen 1. Microscopio manipulado en el simulador
uso de la solución salina tamponada con UD Virtual Compound Microscope
fosfato, que nos ayudará a poder observar
mejor las bacterias al separarlas. En este simulador se usó un aumento de
400X para la punta de raíz de cebolla y el
Se coloca 1 ml de PBS en un tubo de frotis de mejilla; y se usó un aumento de
ensayo con una pipeta y se hace uso de 1000X para la cápsula bacteriana y se
la asa bacteriológica para obtener una obtuvieron los siguiente resultados:
pequeña muestra del yogurt y diluirla en el
tubo de ensayo. El mechero debe ser Muestra Resultado
esterilizado primero.
Punta de
Para una mejor obtención de muestra se raíz de
debe hundir el asa hasta la parte más
cebolla
baja del envase donde se encuentra el
yogurt

Una vez mezclado el yogurt con el PBS

se agita el tubo de ensayo por 10 o 15
segundos para que se mezclen
Cápsula
Finalmente, se usa el asa para sacar una bacteriana
muestra de esta mezcla y colocarla sobre
el portaobjetos la cual seguirá el proceso
de tinción de Gram para hallar las
bacterias Gram positivas y negativas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Simulador: UD Virtual Compound Frotis de la

Microscope mejilla
Como se observa en la imagen 1, se
manipuló el microscopio virtual con el fin
de reconocer las condiciones necesarias
para la visualización de los
microorganismos.
Simulador Explore with the Virtual
Scanning Electron Microscope
Simulator

En este simulador se trabajó dos grupos

de microbios obtenidos de una esponja de
cocina, se calcularon las calibraciones
necesarias para la visualización como se
puede observar en la imagen 2.

Imagen 3. Simulación utilizada en el simulador

Gram Stain

Se realizó la tinción de una muestra

predeterminada por el simulador
obteniéndose múltiples resultados
dependiendo únicamente de la
Imagen 2. Sistema utilizado en el simulador manipulación que le dé cada usuario.
Explore with the Virtual Scanning Electron Nuestro resultado con un aumento de
Microscope Simulator
1000X es el siguiente:
Se obtuvieron los siguientes resultados: Resultado

Muestra Resultado

Grupo 1

Grupo 2
Simulador Virtual Labs: Gram Staining

En este simulador nos piden identificar

usando la tinción de Gram a una bacteria
en el yogurt.

Simulador Gram Stain

Este simulador nos mostró paso a paso el

procedimiento de la tinción de Gram
 la presencia de las bacterias gram
positivas y gram negativas.

-En el análisis del yogurt pudimos

determinar que, en efecto, no se
encontraba contaminado debido a la
presencia de bacterias gram positivas y
ninguna gram negativa.

CONCLUSIONES

El primer microscopio no permitió ver la el

interior de la bacteria debido a la cápsula
bacteriana que envuelve a su pared
Imagen 4. Sistema utilizado en el simulador Virtual
Labs: Gram Staining celular.

Siguiendo los procedimientos correctos se En el Simulador Gram Stain no se obtuvo

determina que el yogurt presentaba solo la tinción esperada posiblemente debido
tipo deseable de bacterias gram positivas. la alta exposición al mechero o el tiempo
en exceso al aplicar el alcohol con
acetona.
Resultado
Para futuros laboratorios debemos ser
más precavidos en la distancia mínima
con la flama para que no elimine ciertos
microorganismos.

BIBLIOGRAFÍA

1. Soluciones amortiguadoras. Disponible

en:
http://www.facmed.unam.mx/deptos/salud/
censenanza/spivst/spiv/104-03.pdf.

2. Alcoholes. Disponible en:

Discusión: http://www.quimicaorganica.org/alcoholes.
html
-Al analizar la muestra de la raíz de
cebolla pudimos observar la pared celular, 3. Stearn y Stearn. 1923. Teoría de la
Tinción Gram. (en línea). Disponible en
de sus células y el núcleo propia de las www.microbelibrary.org/ASMOnly/details.
plantas. Mientras que en la cápsula asp?id=1095&Lang=Spanish
bacteriana no podemos visualizar el
interior de la célula, sólo observamos la 4. Backdive. Disponible en : Ideonella
cobertura de esta. sakaiensis 201-F6 | Type strain | NBRC
110686, TISTR 2288 | BacDiveID:140803
-Podemos observar que en los resultados
5. Métodos Tinciones
del Simulador Gram Stain muestran una
tinción muy tenue y hace poco apreciable 6. TINCIÓN DE GRAM NICOLLE
7. El género Rhodococcus. Una revisión presenta los grupos metilos en su
didáctica molécula la de mayor intensidad. Con
respecto al de contraste podemos variar
8. Biorremediación de organofosforados la safranina por la fucsina básica fenicada
por hongos y bacterias en suelos para revelar determinados
agrícolas: revisión sistemática microorganismos Gram negativos pero lo
hace muy tenuemente.
9.https://www.salud.mapfre.es/pruebas-
diagnosticas/otras-pruebas- 4. ¿Cuál es la influencia del PH en la
diagnosticas/tincion-de-gram/#:~:text=La reacción de Gram?
%20tinci%C3%B3n%20de%20Gram
%20es%20un%20tipo%20de%20tinci Stearn y Stearn comprobaron que la
%C3%B3n%20que,t%C3%A9cnica%20se reacción de tinción de las bacterias
%20denominan%20Gram%20negativas. obedece en gran parte a su contenido
proteínico; estos microorganismos se
10. Importancia del Microscopio para la conducen como cuerpos anfóteros, al
Ciencia y Humanidad combinarse con colorantes ácidos en
soluciones ácidas y con los básicos en
medio alcalino
CUESTIONARIO
Según Stearn y Stearn, los gérmenes
1. ¿Cuáles son las fuentes de error más Gram positivos tienen una escala
comunes en la tinción Gram? isoeléctrica de pH inferior a la de los
- Impurezas en los reactivos de tinción. gérmenes Gram negativos; y, a base de
- Concentración inadecuada de los sus datos experimentales, deducen las
reactivos de tinción. siguientes conclusiones: Los
- pH inadecuado. microorganismos Gram positivos pueden
- El colorante se fija a la célula por hacerse Gram negativos al aumentar la
mecanismos físico - químicos, que se acidez. Los microorganismos Gram
alteran si el pH no es el apropiado. negativos pueden hacerse Gram positivos
- Los colorantes pueden ser ácidos, al aumentar la alcalinidad. Los microbios
básicos o neutros. de reacción positiva a los colorantes
- Tiempo de tinción incorrecto. ácidos pueden hacerse Gram negativos
- Temperatura suficiente. por aumentar la alcalinidad. Los microbios
de reacción positiva a los colorantes
2. ¿Qué efecto traería reemplazar el lugol básicos pueden hacerse Gram negativos
con otro agente oxidante? por aumentar la acidez.
Ninguna ya que cumpliría la misma
función de incrementar la afinidad del 5. Liste 5 ejemplos de bacterias Gram-
colorante primario con la célula, formando positivas y 5 Gram-negativas y su
complejos insolubles con este. El importancia.
complejo cristal violeta - yodo sirve para
intensificar el color del teñido, así que no Gram-positivas
se produciría un efecto si el lugol es
reemplazado por otro agente oxidante 1. Bacillus pumilus C2A1
Género: Bacillus
3.¿Podría usted variar el colorante Especie: B. pumilus
primario y el contrastante obteniendo los Esta bacteria tiene la capacidad de
mismos resultados? degradar altas concentraciones de
Sí, podemos variar el colorante primario clorpirifós, que se hidroliza en (tcp), uno de
entre los de p-rosanilina ( que son los que los insecticidas organofosforados clorados
brindan mejores resultados) entre las que más utilizados en la industria agrícola, que
tenemos violeta de metilo y violeta cristal puede penetrar fácilmente las membranas
o de genciana. Sin embargo, la intensidad celulares.
de tinción es distinta siendo la que
 en un periodo de diez años reduciendo la
masa inicial de 100 gramos a uno.

2. Rhodococcus sp.
Género: Rhodococcus
Las especies de este
microorganismos se les relaciona con una
gran variedad de procesos de
biodegradación de suelos contaminados 5. Bacillus atrophaeus
con hidrocarburos, debido a que son Género: Bacilo
capaces de degradar ciclohexanol, Especie: B. atrophaeus
dibenzotiofeno (DBT), metil-terbutil-éter, Las cepas de B. atrophaeus se
acetileno, entre otros. han usado ampliamente en biomedicina
como cepas indicadoras de regímenes de
descontaminación basados en calor y
químicos.

3. Kocuria rosea PKS1409

Género: Kocuria
Especie: K. rosea
Esta bacteria posee un metabolismo
con la capacidad de degradar
hidrocarburos. Una elevada concentración
indica un importante potencial de 6. Bacillus megaterium
biodegradación por parte de esta bacteria.
Género: Bacilo
Especie: B. Megaterio
B. megaterium ha sido reconocido
como endófito y es un agente potencial para
el biocontrol de enfermedades de las
plantas. La fijación de nitrógeno se ha
demostrado en algunas cepas de B.
megaterium .

4. Microbacterium oxydans
Género: Microbacterium
Especie: M. oxydans
Se probó que un grupo de
bacterias, donde está incluida esta
bacteria, tiene la capacidad de
descomponer el caucho de las cubiertas
Gram-negativas
4.
1. Pseudomonas pseudoalcaligenes
MHF ENV
Género: Pseudomonas
Especie: P. pseudoalcaligenes
Esta bacteria se encarga de degradar el
Tributil fosfato utilizándolo como única
fuente de carbono a diferentes
concentraciones. El TBP es un compuesto
organofosforado usado como agente
Aliivibrio fischeri
complejante, herbicida y fungicida, etc, que
Género: Aliivibrio
causa afecciones en los riñones, vejiga
Especie: A. fischeri
urinaria; irritación de la piel, entre otros.
Esta bacteria degrada la aflatoxina sin la
producción de productos intermedios y
subproductos nocivos, de manera rápida y
rentable. Controlando los efectos citotóxicos
y genotóxicos de la aflatoxina.

5.

2. Hyphomicrobium sp. MAP-1

Género: Hyphomicrobium
Especie: H. vulgare
Tiene la capacidad de degradar altas
concentraciones de metamidofos (4.000 Ideonella sakaiensis (201-F6)
mg/L) con metanol como suplemento para
la degradación. El metamidofo es un Género: Idonella
compuesto altamente tóxico usado como Especie: Idonella Sakaiensis
insecticida y acaricida en cultivos de arroz,
algodón y maíz,puede contaminar La bacteria fue hallada en el
fácilmente el agua superficial y subterránea. interior de una planta de reciclaje de
botellas de plástico y es capaz de
descomponer el tereftalato de polietileno
(PET) en sus componentes ácido
tereftálico y etilenglicol.
Debido a que el PET solo hace 70 años
que existe significa que la bacteria ha
3. evolucionado en este sentido en tan sólo
70 años. Este hallazgo supone un enorme
avance para el mundo del reciclaje y la
reutilización.
Rhodobacter capsulatus B10
Género: Rhodobacter
Especie: R. capsulatus
Esta bacteria degrada diversos
polinitrofenoles en condiciones folotróficas a
aminonitrofenoles, lo que permite a la
bacteria el crecimiento diazotrófico ya que
los polinitrofenoles son desacoplantes que
inhiben el proceso de fijación de nitrógeno,
que requiere una gran cantidad de energía.
 6. Pseudomonas aeruginosa

Genero: Pseudomonas
Especie: P. aeruginosa
P. aeruginosa es capaz de crecer
en combustibles como queroseno o
gasóleo, ya que es un microorganismo
capaz de nutrirse a partir de
hidrocarburos, causando estragos de
corrosión microbiana, y creando una
gelatina oscura que a veces se identifica
inadecuadamente con un alga.