FISICOS

Inicio Índice A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Z Atrás Página
REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.1. Limpidez y grado de opalescencia de los líquidos
2.2. MÉTODOS FÍSICOS Y FÍSICO-QUÍMICOS
2. Métodos
analíticos
2.2. Métodos físicos y físico-químicos ................ 19 2.2.26. Cromatografía en papel .................. 36
2.2.1. Limpidez y grado de opalescencia 2.2.27. Cromatografía en capa fina ............ 37
de los líquidos ................................ 19 2.2.28. Cromatografía de gases .................. 38
2.2.2. Grado de coloración de los líquidos. 20 2.2.29. Cromatografía de líquidos ............. 40
2.2.3. Determinación potenciométrica del 2.2.30. Cromatografía de exclusión por
pH .................................................. 21 tamaño molecular ........................... 42
2.2.4. Correspondencia entre la reacción 2.2.31. Electroforesis ................................. 43
del medio, el pH aproximado y la
2.2.32. Pérdida de masa por desecación .... 49
coloración de algunos indicadores.. 23
2.2.33. Espectrometría de resonancia mag-
2.2.5. Densidad relativa ........................... 23
nética nuclear ................................. 49
2.2.6. Índice de refracción ....................... 23
2.2.34. Termogravimetría ........................... 50
2.2.7. Rotación óptica .............................. 24
2.2.35. Osmolalidad ................................... 51
2.2.8. Viscosidad ...................................... 24
2.2.36. Determinación potenciométrica de
2.2.9. Método del viscosímetro capilar .... 25 la concentración iónica mediante
2.2.10. Método del viscosímetro rotatorio.. 26 electrodos selectivos ...................... 51
2.2.11. Intervalo de destilación .................. 26 2.2.37. Espectrometría de fluorescencia
2.2.12. Punto de ebullición ........................ 27 por rayos X .................................... 53
2.2.13. Determinación de agua por arrastre.. 27 2.2.38. Conductividad ................................ 53
2.2.14. Punto de fusión - Método del tubo 2.2.39. Distribución de la masa molecular
capilar ............................................ 28 de los dextranos ............................. 54
2.2.15. Punto de fusión - Método del tubo 2.2.40. Espectrofotometría en el infrarrojo
capilar abierto ................................ 28 cercano ........................................... 57
2.2.16. Punto de fusión - Método de la 2.2.41. Dicroísmo circular ......................... 58
fusión instantánea .......................... 28 2.2.42. Densidad de sólidos ....................... 60
2.2.17. Punto de gota ................................. 29 2.2.43. Espectrometría de masas ................ 60
2.2.18. Punto de solidificación ................... 29 2.2.44. Carbono orgánico total en agua
2.2.19. Valoraciones amperométricas ........ 30 destinada a uso farmacéutico ......... 64
2.2.20. Valoraciones potenciométricas ...... 30 2.2.45. Cromatografía de fluidos supercrí-
2.2.21. Fluorimetría ................................... 31 ticos ................................................ 64
2.2.22. Espectrometría de emisión atómica. 31 2.2.46. Técnicas de separación cromato-
gráfica ............................................ 65
2.2.23. Espectrometría de absorción atómica. 32
2.2.47. Electroforesis capilar ..................... 70
2.2.24. Espectrofotometría de absorción en
el infrarrojo .................................... 33 2.2.48. Espectrometría Raman ................... 76
2.2.25. Espectrofotometría de absorción en 2.2.49. Método del viscosímetro de bola. 78
el ultravioleta y en el visible .......... 34 2.2.54. Isoelectroenfoque ........................... 78
2.2. MÉTODOS FÍSICOS los líquidos, en el sentido del eje del tubo, sobre fondo negro
y con luz diurna difusa. La difusión de la luz debe ser tal
Y FÍSICO-QUÍMICOS que permita diferenciar fácilmente la suspensión de referen-
cia I del agua R y la suspensión de referencia II de la sus-
pensión de referencia I.
2.2.1. LIMPIDEZ Y GRADO DE
OPALESCENCIA DE LOS LÍQUIDOS Un líquido se considera límpido si su limpidez es igual que
la del agua R o la del disolvente utilizado, cuando se obser-
va en las condiciones ya señaladas, o bien si su opalescencia
En tubos de ensayo idénticos, de vidrio neutro, incoloro y no es superior a la de la suspensión de referencia I.
transparente, de un diámetro interior de 15 mm a 25 mm
y de fondo plano, comparar el líquido a examinar y la sus- REACTIVOS
pensión de referencia preparada extemporáneamente como
se indica a continuación. La columna de líquido en el inte- Disolución de sulfato de hidrazina. Disolver 1,0 g de sul-
rior del tubo debe tener una altura de 40 mm. Cinco minutos fato de hidrazina R en agua R y completar hasta 100,0 ml
después de preparar la suspensión de referencia, observar con el mismo disolvente. Dejar reposar de 4 h a 6 h.
Las Normas generales (1) son aplicables a todos los textos y monografías 19

2.2.2. Grado de coloración de los líquidos REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
Disolución de hexametilentetramina. En un matraz de 100 REACTIVOS

ml con tapón esmerilado, disolver 2,5 g de hexametilente-
tramina R en 25,0 ml de agua R. Disoluciones primarias
2. Métodos
Suspensión primaria de opalescencia. Introducir 25,0 ml Disolución amarilla. Disolver 46 g de cloruro de

analíticos
de la disolución de sulfato de hidrazina en el envase que hierro(III) R en aproximadamente 900 ml de una mezcla
contiene la disolución de hexametilentetramina y mezclar. formada por 25 ml de ácido clorhídrico R y 975 ml de agua
Dejar reposar durante 24 h. Esta suspensión puede conser- R, a continuación completar hasta 1.000,0 ml con la misma
varse durante dos meses en un envase de vidrio que posea mezcla. Valorar y ajustar la disolución a 45,0 mg de
una superficie interna totalmente lisa. La suspensión no FeCl3,6H2O por mililitro, por adición de la misma mezcla
debe adherirse a las paredes del envase y debe mezclarse ácida. Conservar protegido de la luz.
cuidadosamente antes de su empleo.
Valoración. En un matraz cónico de 250 ml con tapón
Patrón de opalescencia. Tomar 15,0 ml de la suspensión esmerilado, se introducen 10,0 ml de la disolución, 15 ml de
primaria de opalescencia y diluir hasta 1.000,0 ml con agua agua R, 5 ml de ácido clorhídrico R y 4 g de ioduro de pota-
R. Preparar esta suspensión extemporáneamente y conser- sio R. Tapar y dejar reposar en la oscuridad durante 15 min.
varla como máximo 24 h. A continuación, añadir 100 ml de agua R. Se valora el iodo
liberado con tiosulfato de sodio 0,1 M en presencia de 0,5 ml
Suspensiones de referencia. Preparar las suspensiones de de disolución de almidón R añadidos hacia el final de la
referencia según se indica en la tabla 2.2.1.-1. Mezclar y valoración.
agitar antes de su empleo.
1 ml de tiosulfato de sodio 0,1 M equivale a 27,03 mg de
Tabla 2.2.1.-1 FeCl3,6H2O.
I II III IV Disolución roja. Disolver 60 g de cloruro de cobalto R en

aproximadamente 900 ml de una mezcla formada por 25 ml
Patrón de opalescencia 5,0 ml 10,0 ml 30,0 ml 50,0 ml
de ácido clorhídrico R y 975 ml de agua. A continuación
Agua R 95,0 ml 90,0 ml 70,0 ml 50,0 ml completar hasta 1.000,0 ml con la misma mezcla, valorar y
ajustar la disolución a 59,5 mg de CoCl2,6H2O por mililitro,
por adición de la misma mezcla ácida.
Valoración. En un matraz cónico de 250 ml con tapón
2.2.2. GRADO DE COLORACIÓN esmerilado, se introducen 5,0 ml de la disolución, 5 ml de
disolución diluida de peróxido de hidrógeno R y 10 ml de
DE LOS LÍQUIDOS disolución de hidróxido de sodio R de 300 g/l. Mantener a
ebullición suave durante 10 min, dejar enfriar y añadir a
continuación 60 ml de ácido sulfúrico diluido R y 2 g de
Para apreciar el grado de coloración de los líquidos en las ioduro de potasio R. Tapar el matraz cónico y disolver el
tonalidades pardo-amarillo-rojo, se emplea uno de los dos precipitado agitando suavemente. Valorar el iodo liberado
procedimientos descritos a continuación, el que esté señala- con tiosulfato de sodio 0,1 M hasta coloración rosa, en pre-
do en la monografía. sencia de 0,5 ml de disolución de almidón R, añadida hacia
el final de la valoración.
Una disolución se considera incolora si tiene el aspecto del
agua R o del disolvente o bien si no es más coloreada que la 1 ml de tiosulfato de sodio 0,1 M equivale a 23,79 mg de
disolución de referencia P9. CoCl2,6H2O.
MÉTODO I Disolución azul. Disolver 63 g de sulfato de cobre R en

aproximadamente 900 ml de una mezcla formada por 25 ml
En tubos de ensayo idénticos de vidrio neutro, incoloro y de ácido clorhídrico R y 975 ml de agua R, a continuación
transparente, con un diámetro exterior de 12 mm, comparar completar hasta 1.000,0 ml con la misma mezcla. Valorar y
2,0 ml del líquido a examinar con 2,0 ml de agua R, del ajustar la disolución a 62,4 mg de CuSO4,5H2O por milili-
disolvente o de la disolución de referencia señalada en la tro, por adición de la misma mezcla ácida.
monografía (véanse las Tablas de las disoluciones de refe-
rencia). Comparar las distintas tonalidades con luz natural Valoración. En un matraz cónico de 250 ml con tapón
difusa, observando la muestra horizontalmente contra un esmerilado introducir l0,0 ml de la disolución, 50 ml de
fondo blanco. agua R, 12 ml de ácido acético diluido R y 3 g de ioduro de
potasio R. Valorar el iodo liberado con tiosulfato de sodio
0,1 M hasta una débil coloración pardo claro, en presencia
MÉTODO II
de 0,5 ml de disolución de almidón R, añadida hacia el final
En tubos de ensayo idénticos, de vidrio neutro, incoloro y de la valoración.
transparente, con un diámetro interior de 15 mm a 25 mm y
de fondo plano, comparar el líquido a examinar con agua R, 1 ml de tiosulfato de sodio 0,1 M equivale a 24,97 mg de
con el disolvente o con la disolución de referencia señalada CuSO4,5H2O.
en la monografía (véanse las Tablas de las disoluciones de
referencia). La columna de líquido en el interior del tubo Disoluciones patrón
debe tener una altura de 40 mm. Comparar las distintas
tonalidades con luz natural difusa, observando la muestra en A partir de las tres disoluciones primarias, preparar cinco
el sentido del eje del tubo y sobre fondo blanco. disoluciones patrón del modo siguiente (tabla 2.2.2.-1):
20 Véase la nota informativa sobre Monografías generales

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.3. Determinación potenciométrica del pH
Tabla 2.2.2.-1 Tabla 2.2.2.-5.—Disoluciones de referencia AV
Volumen en mililitros Volumen en mililitros
2. Métodos
Disolución Disolución de Disolución Ácido clorhídrico
analíticos
Ácido referencia patrón AV (10 g/l HCl)
patrón Disolución Disolución Disolución clorhídrico
amarilla roja azul 10 g/l HCl)
AV1 25,0 75,0
P (parda) 3,0 3,0 2,4 1,6 AV2 15,0 85,0
PA (pardo AV3 8,5 91,5
amarillenta) 2,4 1,0 0,4 6,2 AV4 5,0 95,0
A (amarilla) 2,4 0,6 0,0 7,0 AV5 3,0 97,0
AV (amarillo AV6 1,5 98,5
verdosa) 9,6 0,2 0,2 0,0 AV7 0,75 99,25
R (roja) 1,0 2,0 0,0 7,0
Tabla 2.2.2.-6.—Disoluciones de referencia R
Volumen en mililitros
Disoluciones de referencia utilizadas en los procedimien-
tos I y II Disolución de Disolución Ácido clorhídrico
referencia patrón R (10 g/l HCl)
A partir de las cinco disoluciones patrón preparar las siguien-
R1 100,0 0,0
tes disoluciones de referencia (tablas 2.2.2.-2 a 2.2.2.-6): R2 75,0 25,0
R3 50,0 50,0
Tabla 2.2.2.-2.—Disoluciones de referencia P R4 37,5 62,5
R5 25,0 75,0
R6 12,5 87,5
Volumen en mililitros R7 5,0 95,0
Disolución de Disolución Ácido clorhídrico
referencia patrón P (10 g/l HCl)
Conservación
P1 75,0 25,0
P2 50,0 50,0 Para el método I, las disoluciones de referencia pueden con-
P3 37,5 62,5 servarse en tubos de ensayo sellados, de vidrio neutro, inco-
P4 25,0 75,0
loro y transparente, con un diámetro exterior de 12 mm y
P5 12,5 87,5
P6 5,0 95,0 protegidas de la luz.
P7 2,5 97,5
P8 1,5 98,5 Para el método II, preparar las disoluciones de referencia
P9 1,0 99,0 inmediatamente antes del uso, a partir de las disoluciones
patrón.
Tabla 2.2.2.-3.—Disoluciones de referencia PA

2.2.3. DETERMINACIÓN
Volumen en mililitros POTENCIOMÉTRICA DEL pH
referencia patrón PA (10 g/l HCl) El pH es un valor que representa convencionalmente la con-
PA1 100,0 0,0 centración de iones hidrógeno de una disolución acuosa. Por
PA2 75,0 25,0 razones prácticas se define de una manera experimental. El
PA3 50,0 50,0 pH de una disolución problema se expresa en relación a una
PA4 25,0 75,0 disolución de referencia (pHS), según la ecuación:
PA5 12,5 87,5
PA6 5,0 95,0 E - Es
PA7 2,5 97,5 pH = pHs - 
k
en la que E es el potencial, expresado en voltios, de la célu-
Tabla 2.2.2.-4.—Disoluciones de referencia A la que contiene la disolución problema y Es es el potencial,
expresado en voltios, de la célula que contiene la disolución
Volumen en mililitros de pH conocido (pHs).
referencia patrón A (10 g/l HCl) Tabla 2.2.3.-1.—Valores de k a distintas temperaturas
A1 100,0 0,0 Temperatura °C k

A2 75,0 25,0
A3 50,0 50,0 15 0,0572
A4 25,0 75,0 20 0,0582
A5 12,5 87,5 25 0,0592
A6 5,0 95,0 30 0,0601
A7 2,5 97,5 35 0,0611

2.2.3. Determinación potenciométrica del pH REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
La determinación potenciométrica del pH se realiza por eventual corrección de la temperatura, se recomienda seguir
medición de la diferencia de potencial entre dos electrodos las instrucciones del fabricante. Calibrar el aparato con la
adecuados, sumergidos en la disolución problema. Uno de disolución tampón de ftalato de hidrógeno y potasio (patrón
ellos es un electrodo sensible a los iones hidrógeno (el más primario) y otra disolución tampón de distinto pH (preferi-
2. Métodos
frecuente es el electrodo de vidrio) y el otro es un electrodo

analíticos
de referencia (por ejemplo, un electrodo de calomelanos blemente una de las que figuran en la tabla 2.2.3.-2). El pH
saturado). de una tercera disolución tampón de un pH intermedio, leído
en la escala, no debe diferir en más de 0,05 unidades de pH
Aparato. El aparato de medida es un voltímetro, graduado del valor correspondiente a dicha disolución. Sumergir los
generalmente en unidades de pH. La resistencia de entrada electrodos en la disolución problema y realizar la lectura en
debe ser al menos 100 veces superior a la de los electrodos las mismas condiciones que para las disoluciones tampón.
empleados y su sensibilidad debe ser como mínimo de 0,05
unidades de pH, es decir un mínimo de 0,003 V. En el caso de utilizar el aparato con frecuencia debe efectuar-
se un control de manera periódica. En caso contrario, es indis-
Procedimiento. Salvo indicación contraria en la monogra- pensable realizar dicho control antes de cada determinación.
fía, realizar todas las mediciones a la misma temperatura
(20 °C a 25 °C). La tabla 2.2.3.-2 indica los valores de pH, Todas las disoluciones a examinar y las disoluciones tam-
en función de la temperatura, de algunas disoluciones tam- pón de referencia deben prepararse con agua exenta de dió-
pón de referencia recomendadas para el calibrado. Para una xido de carbono R.
Tabla 2.2.3.-2.—Variación del pH en las disoluciones tampón en función de la temperatura
Temperatura Tetraoxalato Hidrogeno- Dihidrogeno- Hidrogeno- Hidrogeno- Hidrogeno- Tetraborato Carbonato

en °C de potasio tartrato de citrato ftalato de fosfato de fosfato de de disodio de sodio
0,05 M potasio de potasio potasio dipotasio dipotasio 0,01 M 0,025 M
(sat. 25 °C) 0,05 M 0,05 M 0,025 M 0,0087 M +
+ + hidrogeno-
hidrogeno- hidrogeno- carbonato de
fosfato de fosfato de sodio
sodio sodio 0,025 M
0,025 M 0,0303 M
C4H3KO8, C4H5KO6 C6H7KO7 C8H5KO4 KH2PO4 + KH2PO4 + Na2B4O7, Na2CO3 +
2H2O Na2HPO4 Na2HPO4 10H2O NaHCO3
15 1,67 3,80 4,00 6,90 7,45 9,28 10,12

20 1,68 3,79 4,00 6,88 7,43 9,23 10,06
25 1,68 3,56 3,78 4,01 6,87 7,41 9,18 10,01
30 1,68 3,55 3,77 4,02 6,85 7,40 9,14 9,97
35 1,69 3,55 3,76 4,02 6,84 7,39 9,10 9,93
∆pH(1) + 0,001 - 0,0014 - 0,0022 + 0,0012 - 0,0028 -0,0028 - 0,0082 - 0,0096

∆t
(1) Variación del pH para una variación de 1 °C.
Preparación de las disoluciones tampón de referencia. Hidrogenofosfato de dipotasio 0,025 M + hidrogenofosfato

de disodio 0,025 M. Disolver en agua exenta de dióxido
Tetraoxalato de potasio 0,05 M. Disolver 12,61 g de de carbono R 3,39 g de KH2PO4 y 3,53 g de Na2HPO4, dese-
C4H3KO8,2H2O en agua exenta de dióxido de carbono R y cados previamente a 110-130 °C durante 2 h, completar a
completar hasta 1.000,0 ml con el mismo disolvente. 1.000,0 ml con el mismo disolvente.
Tartrato de hidrógeno y potasio saturado a 25 °C. Agitar Hidrogenofosfato de dipotasio 0,0087 M + hidrogenofosfa-
vigorosamente un exceso de C4H5KO6 en agua exenta de to de disodio 0,0303 M. Disolver en agua exenta de dióxi-
dióxido de carbono R a 25 °C. Filtrar o decantar. Preparar do de carbono R 1,18 g de KH2PO4 y 4,30 g de Na2HPO4,
extemporáneamente. desecados previamente a 110-130 °C durante 2 h, completar
a 1.000,0 ml con el mismo disolvente.
Dihidrogenocitrato de potasio 0,05 M. Disolver 11,41 g
Tetraborato de disodio 0,01 M. Disolver 3,80 g de
de C6H7KO7 en agua exenta de dióxido de carbono R y
Na2B4O7,10H2O en agua exenta de dióxido de carbono R y
completar hasta 1.000,0 ml con el mismo disolvente. Prepa- completar hasta 1.000,0 ml con el mismo disolvente. Con-
rar extemporáneamente. servar protegido del dióxido de carbono del aire.
Ftalato de hidrógeno y potasio 0,05 M. Disolver en agua Carbonato de sodio 0,025 M + hidrogenocarbonato de
exenta de dióxido de carbono R 10,13 g de C8H5KO4, seca- sodio 0,025 M. Disolver 2,64 g de Na2CO3 y 2,09 g de
dos previamente a 110-135 °C y completar a 1.000,0 ml con NaHCO3 en agua exenta de dióxido de carbono R y com-
el mismo disolvente. pletar hasta 1000,0 ml con el mismo disolvente.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.6. Índice de refracción
2.2.4. CORRESPONDENCIA ENTRE 20 con el número de deci-

Determinar la densidad relativa d 20
males indicados en la monografía, con la ayuda de un pic-
LA REACCIÓN DEL MEDIO, nómetro, de una balanza hidrostática o de un areómetro, sin
EL pH APROXIMADO Y LA COLORA- tener en cuenta el efecto del empuje del aire en el momento
2. Métodos
analíticos
de la pesada, lo que puede introducir un error de una unidad
CIÓN DE ALGUNOS INDICADORES en la tercera cifra decimal.
Con frecuencia también se utilizan otras dos definiciones.
Salvo que en la Tabla 2.2.4.-1 se indique lo contrario, añadir La densidad relativa d 420 de una sustancia es la relación entre
0,1 ml de disolución de indicador a 10 ml de la disolución a la masa de un determinado volumen de la sustancia a 20 °C
examinar. y la masa de un volumen igual de agua a 4 °C.
Tabla 2.2.4.-1 La densidad ρ20 de un cuerpo es el cociente de su masa por
Reacción pH Indicador Coloración su volumen a 20 °C. Se expresa en kilogramos por metro
cúbico (1 kg.m-3 = 10-3 g.cm-3).
Alcalina >8 Papel de tornasol, Azul
rojo R Las relaciones numéricas entre la densidad relativa y la den-
Disolución de azul de Gris o azul-violácea sidad expresada en kilogramos por metro cúbico son las
timol R (0,05 ml) siguientes:
Débilmente 8,0 - 10,0 Disolución de Incolora o rosa ρ20 = 998,202 × d 20
20 ó d 20 = 1,00180 × 10-3 × ρ
alcalina fenolftaleína R 20 20
(0,05 ml) ρ20 = 999,972 × d 420 ó d 420 = 1,00003 × 10-3 × ρ20
Disolución de azul de Gris
timol R (0,05 ml) d 420 = 0,998230 × d 20
20
Fuertemente > 10 Papel de fenolfta- Roja

alcalina leína R
Disolución de azul de Azul-violácea 2.2.6. ÍNDICE DE REFRACCIÓN
timol R (0,05 ml)
Neutra 6,0 - 8,0 Disolución de rojo de Amarilla El índice de refracción nλt de un medio en relación al aire es
metilo R igual a la relación entre el seno del ángulo de incidencia de un
Disolución de rojo de rayo luminoso en el aire y el seno del ángulo de refracción
fenol R (0,05 ml) del rayo refractado en el medio considerado.
Neutra al 4,5 - 6,0 Disolución de rojo de Roja anaranjada
rojo de metilo R Salvo que se indique lo contrario, el índice de refracción se
metilo determina a 20 ± 0,5 °C en relación a la longitud de onda de
Neutra < 8,0 Disolución de Incolora, rosa o roja la línea D del sodio (λ = 589,3 nm), en este caso el símbolo
a la fenolftaleína R tras adición de 0,05 es n D20.
fenolfta- (0,05 ml) ml de
leína base 0,1 M Los refractómetros habituales determinan el ángulo límite.
La parte esencial de estos instrumentos es el prisma de índi-
Ácida <6 Disolución de rojo de Anaranjada o roja ce de refracción conocido que se pone en contacto con el
metilo R líquido a examinar.
Disolución de azul de Amarilla
bromotimol R1
Tabla 2.2.6-1
Débilmente 4,0 - 6,0 Disolución de rojo de Anaranjada
ácida metilo R Líquido de referencia ∆n/∆t (coeficiente de temperatura)
Disolución de verde Verde o azul
de bromocresol R
Trimetilpentano SQR –0,00049
Fuertemente <4 Papel de rojo Congo R Verde o azul Tolueno SQR –0,00056
ácida Amarillo de Anaranjada o roja Metilnaftaleno SQR –0,00048
dimetilo
Para calibrar el aparato utilizar los líquidos de referencia

señalados a continuación. El valor del índice de refracción
de cada líquido de referencia se indica en la etiqueta.
2.2.5. DENSIDAD RELATIVA Si se trabaja con luz blanca el refractómetro está provisto de
un sistema de compensación. El aparato da la lectura con
20 de una sustancia es la relación entre
La densidad relativa d 20 una exactitud de al menos la tercera cifra decimal y posee
la masa de un determinado volumen de la sustancia a 20 °C un dispositivo que permite trabajar a la temperatura prescri-
y la masa de un volumen igual de agua a la misma tempe- ta. El termómetro permite una lectura con una aproximación
ratura. de 0,5 °C, o inferior.

2.2.7. Rotación óptica REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
2.2.7. ROTACIÓN ÓPTICA Procedimiento. Determinar el cero del polarímetro y el

ángulo de rotación de la luz polarizada a la longitud de onda
de la línea D del sodio (λ = 589,3 nm) a 20 ± 0,5 oC. No rea-
La rotación óptica es la propiedad que poseen ciertas sus- lizar ninguna lectura a una temperatura distinta de 20 oC, a
2. Métodos
tancias quirales de desviar el plano de polarización de la luz

analíticos
no ser que en la monografía se señalen las correcciones que

polarizada. deben efectuarse en la rotación óptica medida. Determinar
el cero del aparato con el tubo cerrado; vacío en el caso de
La rotación óptica se considera positiva (+) en el caso de las sustancias líquidas y lleno del disolvente prescrito en el caso
sustancias dextrógiras (es decir, las que giran el plano de de sustancias sólidas.
polarización en la dirección de la agujas del reloj) y negati-
va (-) en el caso de las sustancias levógiras. Calcular la rotación óptica específica mediante las siguien-
tes fórmulas.
La rotación óptica específica [αm]tλes la rotación, expresada α
en radianes (rad), medida a la temperatura t y a la longitud Para líquidos no diluidos: [α]D20 = ————
de onda λ producida por una capa de 1 metro de espesor de l · ρ20
un líquido o de una disolución que contiene 1 kg/m3 de sus-
tancia ópticamente activa. Por razones prácticas, la rotación 1000α
óptica específica [αm]tλ se expresa normalmente en milirra- Para sustancias en disolución: [α]D20 = ————
dianes metro cuadrado por kilogramo (mrad · m2 · kg-1). l·c
La Farmacopea adopta las siguientes definiciones conven- donde c es la concentración de la disolución en g/l.
cionales:
Calcular según las fórmulas siguientes la concentración c en
El ángulo de rotación óptica de un líquido no diluido es el g/l o la concentración c’ en tanto por ciento m/m de la sus-
ángulo de rotación α, expresado en grados (o), del plano de tancia disuelta.
polarización a la longitud de onda de la línea D del sodio
(λ = 589,3 nm) medido a 20 oC usando una capa de 1 dm; 1000α 1000α
para una disolución, el método de preparación se describe c = ———— — c’ = ————— —
l · [α]D20 l · [α]D20 · ρ20
en la monografía.
La rotación óptica específica [α]D20 de un líquido es el ángu- α = ángulo de rotación en grados, leído a 20 ± 0,5 oC,
lo de rotación α, expresado en grados (o), del plano de pola- l = longitud en decímetros del tubo del polarímetro,
rización a la longitud de onda de la línea D del sodio (λ =
589,3 nm), medido a 20 oC en la sustancia líquida a exami- ρ20 = densidad a 20 oC en gramos por centímetro cúbico. A
nar, calculado con respecto a una capa de 1 dm y dividido efectos de la Farmacopea, la densidad se reemplaza
por la densidad expresada en gramos por centímetro cúbico. por la densidad relativa (2.2.5),
c = concentración de la sustancia en g/l,
La rotación óptica específica [α]D20 de una sustancia en diso-
lución es el ángulo de rotación α, expresado en grados (o), c’ = concentración de la sustancia en tanto por ciento m/m.
del plano de polarización a la longitud de onda de la línea D
del sodio (λ = 589,3 nm) medido a 20 oC en una disolución
de la sustancia a examinar, calculado con respecto a una
capa de 1 dm que contiene 1 g/ml de la sustancia. La rota- 2.2.8. VISCOSIDAD
ción óptica específica de una sustancia en disolución se
expresa siempre con respecto a un disolvente determinado y
a una concentración dada. La viscosidad dinámica o coeficiente de viscosidad η es la
expresión de la fuerza tangencial por unidad de superficie,
En el sistema convencional adoptado por la Farmacopea, la conocida como tensión de cizallamiento τ y expresada en
rotación óptica específica se expresa por su valor adimensio- pascals, necesaria para desplazar, paralelamente al plano de
nal; se sobreentienden las unidades reales, grados mililitro deslizamiento, una capa de líquido de un metro cuadrado a
por decímetro y por gramo [(º) · ml · dm-1 · g-1]. una velocidad (v) de un metro por segundo, en relación a
una capa paralela situada a la distancia (x) de un metro.
El factor de conversión del Sistema Internacional al de la
Farmacopea es el siguiente: La relación dv/dx es un gradiente de velocidad que indica la
velocidad de cizallamiento D expresada en s-1, de modo que
[αm]tλ = [α]tλ × 0,1745 η = τ / D.
La unidad de viscosidad dinámica es el pascal segundo
En algunos casos especificados en la monografía, el ángulo (Pa.s); el submúltiplo utilizado con más frecuencia es el
de rotación puede medirse a temperaturas distintas de 20 oC milipascal segundo (mPa.s).
y a otras longitudes de onda.
La viscosidad cinemática v, expresada en metros cuadrados
El polarímetro debe permitir una lectura con una aproxima- por segundo, se obtiene dividiendo la viscosidad dinámica η
ción de 0,01o. El control de la escala del aparato se efectúa por la densidad ρ, expresada en kilogramos por metro cúbico
generalmente por medio de láminas de cuarzo certificadas. de líquido, medido a la misma temperatura, es decir v = η/ρ.
La linealidad de la escala puede comprobarse mediante dis- La viscosidad cinemática se expresa más frecuentemente en
tintas disoluciones de sacarosa. milímetros cuadrados por segundo.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.9. Método del viscosímetro capilar
El viscosímetro capilar permite la determinación de la vis- Tabla 2.2.9.-1

cosidad en líquidos newtonianos. El viscosímetro rotatorio
permite la determinación de la viscosidad de líquidos new- Constante Viscosidad Diámetro Volumen Diámetro
Tamaño nominal cinemática interior del interior
tonianos y no newtonianos. Se pueden utilizar otros viscosí- n.º del visco- del envase C del
2. Métodos
analíticos
metros siempre y cuando que su precisión no sea inferior a símetro tubo R tubo N
la obtenida con los aparatos descritos a continuación.
mm2·s-2 mm2·s-1 mm ml mm
(± 2 %) (± 5 %)
1 0,01 3,5 a 10 0,64 5,6 2,8 a 3,2

2.2.9. MÉTODO DEL VISCOSÍMETRO 1A 0,03 6 a 30 0,84 5,6 2,8 a 3,2
2 0,1 20 a 100 1,15 5,6 2,8 a 3,2
CAPILAR 2A 0,3 60 a 300 1,51 5,6 2,8 a 3,2
3 1,0 200 a 1000 2,06 5,6 3,7 a 4,3
3A 3,0 600 a 3000 2,74 5,6 4,6 a 5,4
La determinación de la viscosidad con viscosímetros capila- 4 10 2000 a 10.000 3,70 5,6 4,6 a 5,4
res apropiados se efectúa a una temperatura de 20 ± 0,1 °C, 4A 30 6000 a 30.000 4,07 5,6 5,6 a 6,4
salvo indicación contraria. El tiempo necesario para que el 5 100 20.000 a 100.000 6,76 5,6 6,8 a 7,5
nivel del líquido pase de una marca a otra se mide con un
cronómetro, con aproximación de 1/5 de segundo. ción de 1/5 de segundo, el tiempo necesario para que el nivel
El resultado no es válido si 2 lecturas consecutivas difieren del líquido descienda de la señal (E) a la señal (F).
más de un 1 por ciento. La media de 3 lecturas, como míni-
mo, da el tiempo de vertido del líquido a examinar.
Se calcula la viscosidad dinámica η en milipascals segundo
mediante la siguiente expresión:
η = kρt
Donde:
k = constante del aparato, expresada en milímetros cuadra-
dos por segundo al cuadrado,
ρ = densidad del líquido a examinar expresada en miligra-
mos por milímetro cúbico, que se obtiene multiplicando
por 0,9982,
t = tiempo de vertido, en segundos, del líquido a examinar.
La constante k se determina mediante un líquido apropiado
para el calibrado de viscosímetros.
El cálculo de la viscosidad cinemática (mm2·s-1) se obtiene
por la fórmula v = kt.
La determinación puede efectuarse mediante un aparato
(véase figura 2.2.9.-1) que presente las especificaciones
indicadas en la tabla 2.2.9.-1(1).
El tiempo mínimo de vertido debe ser de 350 s para el tama-
ño n.º 1 y de 200 s para los demás tamaños.
Procedimiento. Llenar el viscosímetro por el tubo (L) con
una cantidad suficiente del líquido a examinar, previamente
llevado a 20 °C (salvo indicación contraria), para llenar el
bulbo (A) pero asegurándose que el nivel del líquido en el
bulbo (B) está por debajo del orificio de ventilación del tubo
(M). Sumergir el viscosímetro en un baño de agua a 20 ±
0,1 °C, salvo indicación contraria. Mantenerlo en posición
vertical y dejar reposar durante 30 min al menos, para estable-
cer el equilibrio térmico. Cerrar el tubo (M) y elevar el nivel Figura 2.2.9.-1.—Viscosímetro de nivel suspendido
del líquido en el tubo (N) hasta que se sitúe a 8 mm aproxima- Dimensiones en milímetros
damente por debajo de la marca (E). Mantener el líquido en
(1)
este nivel, cerrando el tubo (N) y abriendo el tubo (M). Abrir el La Farmacopea Europea describe el sistema propuesto por la Organi-
tubo (N) y medir mediante un cronómetro, con una aproxima- zación Internacional de Normalización (ISO).

2.2.10. Método del viscosímetro rotatorio REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
2.2.10. MÉTODO DEL VISCOSÍMETRO alargadera. Se introduce un termómetro en el cuello del

matraz de manera que el extremo superior del depósito de
ROTATORIO mercurio se encuentre 5 mm por debajo del punto de unión
con la pared inferior del tubo lateral. El termómetro debe
2. Métodos
analíticos
Los viscosímetros rotatorios empleados con más frecuencia estar graduado en 0,2 °C y su escala debe abarcar un inter-
se basan en la medición de las fuerzas de cizallamiento en el valo de 50 °C aproximadamente. Durante la determinación,
seno de un líquido situado entre dos cilindros coaxiales, uno una pantalla apropiada debe proteger al matraz y al cuello
de los cuales se mueve por un motor, mientras que el otro se del mismo de las corrientes de aire.
desliza debido a la rotación del primero. En estas condicio-
Procedimiento. Introducir en el matraz (A) 50,0 ml del
nes, la viscosidad (o viscosidad aparente) viene dada por la
líquido a examinar y algunos trozos de material poroso.
medida M del ángulo de desviación del cilindro que se des-
Recoger el destilado en una probeta de 50 ml graduada en
liza, expresada en newton metros.
1,0 ml. La refrigeración por circulación de agua es indis-
Para un deslizamiento laminar, la viscosidad dinámica η pensable en aquellos líquidos que destilan por debajo de
expresada en pascals segundos obedece a la siguiente ecua- 150 °C. Llevar rápidamente a ebullición y anotar la tempe-
ción: ratura a la cual la primera gota del destilado cae en la probe-
ta. Regular el calentamiento de manera que el líquido desti-
le a una velocidad constante de 2 ml a 3 ml por minuto.
η=1 M · 1 - 1 Anotar la temperatura a la cual la totalidad o la fracción
ω 4 π ·h
(1)
RA2 RB2 prescrita del líquido, medido a 20 °C, ha destilado.
Corregir las lecturas observadas en función de la presión
barométrica utilizando la fórmula siguiente:
en la cual h representa la altura de inmersión, expresada en
metros, del cilindro que se desliza en el medio líquido, RA y t1 = t2 + k (101,3 - b)
RB representan los radios de los cilindros, expresados en
metros, siendo RA menor que RB y ω representa la velocidad t1 = temperatura corregida,
angular expresada en radianes por segundo. La constante k
del aparato(1) se puede determinar a distintas velocidades de t2 = temperatura leída a la presión barométrica b,
rotación, utilizando líquidos adecuados para el calibrado de
viscosímetros. La viscosidad obedece entonces a la siguien- k = factor de corrección (véase la tabla 2.2.11.-1 excepto en
te ecuación: el caso de que el factor ya venga dado),
b = presión barométrica, expresada en kilopascals, en el
momento de la destilación.
η =k M
ω
(1)
Tabla 2.2.11.-1.—Corrección de la temperatura

en función de la presión
Procedimiento. Determinar la viscosidad siguiendo las ins-
trucciones del aparato. La temperatura a la que se mide la Temperatura de destilación Factor de corrección k
viscosidad se señala en la monografía correspondiente. En
Hasta 100 °C 0,30
lo que respecta a las sustancias pseudoplásticas y a otros Por encima de 100 °C y hasta 140 °C 0,34
sistemas no newtonianos, la monografía precisa el tipo de Por encima de 140 °C y hasta 190 °C 0,38
viscosímetro a emplear así como la velocidad angular o la Por encima de 190 °C y hasta 240 °C 0,41
velocidad de cizallamiento a la que debe determinarse Por encima de 240 °C 0,45
la viscosidad. Si resulta imposible alcanzar con exactitud la
velocidad de cizallamiento indicada, utilizar una velocidad
de cizallamiento ligeramente inferior e interpolar.
(1) Los aparatos comerciales están provistos de unas tablas que seña-
lan las constantes del aparato en función de la superficie de los cilin-
dros utilizados y de su velocidad de rotación.
2.2.11. INTERVALO DE DESTILACIÓN
El intervalo de destilación es el intervalo de temperatura,

corregido para una presión de 101,3 kPa, en el cual un líqui-
do o una fracción determinada de un líquido destila en las
condiciones señaladas a continuación.
Aparato. El aparato (véase la figura 2.2.11.-1) está consti-
tuido por un matraz de destilación (A), un refrigerante de
camisa recta (B) que se adapta al tubo lateral del matraz y a
una alargadera acodada (C) fijada al extremo del tubo del
refrigerante. El extremo inferior del tubo del refrigerante Figura 2.2.11.-1.—Aparato para determinar el intervalo de destilación
puede asimismo ser alargado y curvado para reemplazar a la Dimensiones en milímetros

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.13. Determinación de agua por arrastre
2.2.12. PUNTO DE EBULLICIÓN mayor parte del agua, seguidamente aumentar la velocidad
de destilación hasta 4 gotas por segundo. Cuando todo el
agua ha sido arrastrada, enjuagar el interior del tubo refrige-
El punto de ebullición es la temperatura corregida a la cual rante con tolueno R. Continuar la destilación durante 5 min,
2. Métodos
la presión de vapor de un líquido es igual a 101,3 kPa.
analíticos
parar la calefacción y dejar enfriar el tubo colector hasta tem-
peratura ambiente. Hacer caer cualquier gota de agua adheri-
Aparato. El aparato a utilizar es el mismo que el del inter- da todavía a la pared del tubo. Cuando el agua y el tolueno se
valo de destilación (2.2.11), salvo que el termómetro se hayan separado, leer el volumen de agua y calcular el conte-
encuentra situado de manera que la parte inferior del depó- nido presente en la sustancia a examinar en mililitros por
sito de mercurio esté al nivel del borde inferior del cuello kilogramo, a partir de la siguiente relación:
del matraz de destilación, el cual a su vez está situado sobre
una placa de material aislante provista de un orificio de 1000 (n2 - n1)
35 mm de diámetro. 
m
Procedimiento. Introducir en el matraz (A) 20 ml del líqui-
do a examinar y algunos trozos de material poroso. Calentar m = masa en gramos de la muestra a examinar,
de manera que se alcance rápidamente el punto de ebulli-
ción y anotar la temperatura a la cual el líquido empieza a n1= número de mililitros de agua obtenidos en la primera
deslizarse por el tubo lateral del matraz al refrigerante. destilación,
Corregir la temperatura leída en función de la presión baro- n2= número total de mililitros de agua obtenidos en las dos
métrica, utilizando la fórmula siguiente: destilaciones.
t1 = t2 + k (101,3 - b)
t1 = temperatura corregida,
t2 = temperatura leída a la presión barométrica b,
k = factor de corrección (véase la tabla 2.2.11.-1),
b = presión barométrica, expresada en kilopascals, en el
momento de la destilación.
2.2.13. DETERMINACIÓN DE AGUA

POR ARRASTRE
Aparato. El aparato (ver figura 2.2.13.-1) está formado por

un matraz de vidrio (A) unido por un tubo de conexión (D) a
un tubo cilíndrico de condensación (B) con un tubo colector
graduado (E). El refrigerante (C) está situado sobre el tubo
cilíndrico (B). El tubo colector (E) está graduado en 0,1 ml.
La fuente de calor que debe utilizarse preferentemente es un
calentador eléctrico regulado por un reostato o un baño de
aceite. La parte superior del matraz y el tubo de conexión
pueden estar aislados.
Procedimiento. Limpiar el tubo colector y el refrigerante
del aparato, enjuagar cuidadosamente con agua y después
secar.
En el matraz seco introducir 200 ml de tolueno R y aproxi-
madamente 2 ml de agua R. Destilar durante 2 h, dejar
enfriar durante 30 min aproximadamente y leer el volumen
de agua con una aproximación de 0,05 ml. A continuación
introducir en el matraz la cantidad de sustancia a examinar,
pesada con una aproximación del 1 por ciento, que pueda
contener de 2 ml a 3 ml de agua aproximadamente. Si se trata
de una sustancia pastosa, pesarla en una navecilla constituida
por una lámina de metal. Calentar suavemente el matraz
durante 15 min en presencia de algunos trozos de material
poroso para asegurar una ebullición regular. Cuando el tolue-
no empieza a hervir, destilar a la velocidad de aproximada- Figura 2.2.13.-1.—Aparato para determinar el agua por arrastre
mente 2 gotas por segundo, hasta que se haya arrastrado la Dimensiones en milímetros

2.2.14. Punto de fusión - Método del tubo capilar REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
2.2.14. PUNTO DE FUSIÓN - MÉTODO En 5 de estos tubos introducir la sustancia problema, tratada
previamente en las condiciones prescritas, en cantidad sufi-
DEL TUBO CAPILAR ciente para formar en el interior de cada tubo una columna
de aproximadamente 10 mm de altura. Conservar los tubos
2. Métodos
analíticos
El punto de fusión determinado por el método del tubo capi- a la temperatura y durante el tiempo prescritos.
lar corresponde a la temperatura a la que funde la última
partícula sólida de una columna compacta de la sustancia a Fijar uno de los tubos a un termómetro graduado en 0,2 °C,
examinar introducida en un tubo. de forma que la sustancia se encuentre próxima al depósito
de mercurio. Introducir el termómetro y el tubo capilar en
Si la monografía lo prescribe, se utilizarán el mismo aparato un vaso cilíndrico ancho, de forma que quede una distancia
y la misma metódica en la determinación de otros factores de 1 cm entre el extremo del depósito y el fondo del envase.
como la formación del menisco o el intervalo de fusión, que Llenar el vaso con agua hasta que el nivel alcance 5 cm res-
caracterizan el comportamiento de fusión de una sustancia. pecto al fondo del vaso. Elevar progresivamente la tempera-
tura del agua a razón de 1 °C por minuto.
El aparato consta de:
La temperatura a la que la sustancia empieza a subir por el
— un envase de vidrio apropiado que contiene el líquido de tubo capilar se considera como la temperatura o el punto de
baño (por ejemplo: agua, parafina líquida o aceite de fusión.
silicona), provisto del dispositivo de calefacción ade-
cuado. Repetir la operación con los otros 4 tubos capilares y calcu-
— un dispositivo apropiado de agitación mecánica que ase- lar el resultado tomando la media de las 5 lecturas.
gure la uniformidad de la temperatura del baño.
— un termómetro graduado en intervalos no superiores a
0,5 °C y provisto de una marca de inmersión. La gama
de temperaturas visible en el termómetro no debe ser 2.2.16. PUNTO DE FUSIÓN - MÉTODO
superior a l00 °C.
DE LA FUSIÓN INSTANTÁNEA
— tubos capilares de vidrio de alta resistencia térmica y
exento de álcali, de diámetro interior de 0,9 mm a 1,1
mm y de 0,10 mm a 0,15 mm de espesor de pared, cerra- El punto de fusión instantáneo viene dado por la relación:
dos por un extremo.
t1 + t2
Procedimiento. Salvo que se indique lo contrario, desecar 
la sustancia finamente pulverizada al vacío sobre gel de síli- 2
ce anhidra R durante 24 h. En un tubo capilar introducir una
cantidad suficiente de sustancia desecada, de modo que se en la que t1 es la primera temperatura anotada y t2 la segun-
forme una columna compacta de 4 mm a 6 mm de altura. da temperatura anotada en las condiciones descritas a conti-
Calentar hasta obtener una temperatura aproximadamen- nuación.
te l0 °C por debajo del punto de fusión previsto. Seguida-
mente regular la velocidad de calefacción a 1 °C por minuto Aparato. El aparato está constituido por un bloque de
aproximadamente. Cuando la temperatura es unos 5 °C infe- metal resistente a la sustancia a examinar y buen conductor
rior al punto de fusión esperado, introducir correctamente el del calor, como por ejemplo latón, y en el que la superficie
tubo capilar dentro del baño. En el aparato descrito anterior- plana superior esté cuidadosamente pulida. El bloque se
mente, sumergir el tubo capilar de modo que su extremo calienta de manera uniforme en toda su masa mediante un
cerrado quede a la mitad de la altura del depósito de mercu- mechero de gas micro-ajustable o de un dispositivo eléctri-
rio del termómetro y que la marca de inmersión de éste co que permita un ajuste muy preciso de la temperatura. El
quede a nivel de la superficie del líquido. Anotar la tempera- bloque posee una cavidad cilíndrica de diámetro suficiente
tura a la que la última partícula pasa al estado líquido. para contener un termómetro, el cual debe mantenerse con
la columna de mercurio en la misma posición durante la
Calibración del aparato. El aparato puede calibrarse utili- calibración del aparato y durante la determinación del punto
zando sustancias de referencia para punto de fusión como de fusión de la sustancia a examinar. La cavidad cilíndrica
las de la Organización Mundial de la Salud u otras sustan- es paralela a la superficie pulida superior del bloque y está
cias apropiadas. situada a una distancia de 3 mm aproximadamente de aqué-
lla. El aparato se calibra mediante sustancias de referencia
adecuadas.
2.2.15. PUNTO DE FUSIÓN - MÉTODO Procedimiento. Calentar el bloque a velocidad bastante

rápida hasta una temperatura de aproximadamente 10 °C
DEL TUBO CAPILAR ABIERTO por debajo del punto de fusión previsto. Seguidamente,
regular la velocidad de calefacción a 1 °C por minuto apro-
La temperatura de licuefacción, comúnmente denominada ximadamente. Dejar caer, a intervalos regulares y en la
punto de fusión, en algunos casos particulares se determina proximidad del depósito del termómetro, algunas partículas
por el método siguiente: de la sustancia pulverizada y, en su caso, desecada según las
indicaciones señaladas en el método del tubo capilar. Lim-
Emplear tubos capilares de vidrio, abiertos por los dos piar la superficie después de cada ensayo. Anotar la tempe-
extremos, de 80 mm aproximadamente de longitud, de 1,4 ratura t1 más baja a la que la sustancia funde instantánea-
mm a 1,5 mm de diámetro exterior y de 1,0 mm a 1,2 mm mente desde el momento en que entra en contacto con el
de diámetro interior. metal. Detener la calefacción y durante el enfriamiento dejar

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.18. Punto desolidificación
caer, a intervalos regulares, algunas partículas de la sustan-

cia, limpiando la superficie después de cada ensayo. Anotar
la temperatura t2 a la que la sustancia deja de fundir instan-
táneamente cuando entra en contacto con el metal.
2. Métodos
analíticos
Calibración del aparato. El aparato se puede calibrar
empleando sustancias de referencia para el punto de fusión,
como las de la Organización Mundial de la Salud, u otras
sustancias apropiadas.
2.2.17. PUNTO DE GOTA
El punto de gota es la temperatura a la que la primera gota

de la sustancia que funde cae desde un depósito, en determi-
nadas condiciones.
Aparato. El aparato (ver la figura 2.2.17.-1) está forma-
do por dos vainas metálicas (A) y (B) enroscadas entre sí.
La vaina (A) está unida a un termómetro de mercurio. Un
depósito metálico (F) está fijado de manera inamovible a
la parte inferior de la vaina (B) mediante dos lengüetas de
sujeción (E). Unos topes de detención (D) de 2 mm de lon-
gitud señalan exactamente la posición del depósito y sir-
ven asimismo para centrar el termómetro. Un orificio (C)
practicado en la pared (B) permite equilibrar la presión. La
superficie de vertido del depósito debe ser plana y los bor-
des del orificio de salida deben estar en ángulo recto. La
parte inferior del termómetro de mercurio debe poseer las
formas y dimensiones indicadas en la figura; el termóme-
tro permite medir temperaturas de 0 °C a 110 °C y en su
graduación, una distancia de 1 mm representa una diferen- Figura 2.2.17.-1.—Aparato para la determinación del punto de gota
cia de 1 °C. El depósito de mercurio del termómetro tiene Dimensiones en milímetros
un diámetro de 3,5 ± 0,2 mm y una altura de 6,0 ± 0,3 mm.
El conjunto del aparato, situado en el eje de un tubo de
ensayo de aproximadamente 200 mm de longitud y de
aproximadamente 40 mm de diámetro exterior, está fijado
a este tubo mediante un tapón con una ranura lateral y atra- 2.2.18. PUNTO DE SOLIDIFICACIÓN
vesado por el termómetro. El orificio del depósito debe
estar situado a 15 mm del fondo del tubo de ensayo El con- El punto de solidificación es la temperatura máxima alcan-
junto está sumergido en un vaso cilíndrico de 1 litro apro- zada en el transcurso de la solidificación de un líquido en
ximadamente, lleno de agua. El fondo del tubo de ensayo condiciones de sobrefusión.
debe estar situado a 25 mm aproximadamente del fondo
del vaso. El nivel del agua debe alcanzar la parte superior Aparato. El aparato (véase la figura 2.2.18.-1) está for-
de la vaina (A). Un agitador asegura la homogeneidad de mado por un tubo de ensayo de aproximadamente 150
la temperatura en todo el baño. mm de longitud y 25 mm de diámetro, situado en el inte-
rior de otro tubo de aproximadamente 160 mm de longi-
Procedimiento. Llenar totalmente el depósito con la sus- tud y 40 mm de diámetro. El tubo interior se cierra con
tancia a examinar sin hacerla fundir, salvo que se indique lo un tapón provisto de un termómetro de aproximadamente
contrario. Eliminar con una espátula el exceso de sustancia 175 mm de longitud, graduado en 0,2 °C y fijado de
en los dos extremos del depósito. Estando acopladas las vai- manera que el depósito se encuentre a 15 mm aproxima-
nas (A) y (B), insertar el depósito en su alojamiento en el damente del fondo del tubo. El tapón posee un orificio
interior de la vaina (B) hasta los topes de detención. Elimi- que permite el movimiento deslizante de un agitador for-
nar con una espátula la sustancia que hubiera sido expulsa- mado por una varilla de vidrio u otro material apropiado,
da por el termómetro al exterior del orificio del depósito. uno de cuyos extremos forma un aro de aproximadamen-
Colocar el aparato en el baño respetando las posiciones te 18 mm de diámetro perpendicular a la varilla del agita-
señaladas anteriormente. Calentar el baño de agua y cuando dor. El tubo interior y su envolvente se mantienen en el
la temperatura es de 10 °C aproximadamente por debajo del centro de un vaso cilíndrico de 1 litro, que contiene un
punto de gota previsto, regular la velocidad de calefacción a líquido refrigerante apropiado que llena el envase hasta
aproximadamente 1 °C por minuto. Anotar la temperatura 20 mm del borde. Se coloca un termómetro en el baño
en el momento de la caída de la primera gota. Efectuar al refrigerante.
menos tres determinaciones operando cada vez con una
nueva toma de muestra. La separación entre las lecturas no Procedimiento. Introducir en el tubo interior una cantidad
debe ser superior a 3 °C. El punto de gota viene dado por la suficiente de la sustancia a examinar, líquida o fundida pre-
media de las tres lecturas. viamente, de manera que recubra enteramente el depósito

2.2.19. Valoraciones amperométricas REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
del termómetro. Determinar el punto de solidificación apro- electrodo indicador (por ejemplo un electrodo de platino, un
ximado mediante un enfriamiento rápido. Seguidamente, electrodo de gotas de mercurio, un electrodo de disco rota-
sumergir el tubo interior en un baño a una temperatura alre- torio o un electrodo de carbono) acoplado a un electrodo de
dedor de 5 °C por encima del punto de solidificación apro- referencia tal como el electrodo de calomelanos o el electro-
2. Métodos
analíticos
ximado y mantenerlo hasta la práctica desaparición de cual- do de plata-cloruro de plata.

quier indicio de cristales. Llenar el vaso cilíndrico con agua
o con una disolución saturada de cloruro de sodio, a una Puede utilizarse también un aparato con 3 electrodos: ade-
temperatura alrededor de 5 °C por debajo del punto de soli- más de electrodo indicador y electrodo de referencia, se
dificación previsto. Introducir el tubo interior en el tubo compone de un electrodo auxiliar polarizado.
exterior, comprobando la presencia de núcleos de cristaliza-
ción, sumergir el aparato en el baño y agitar enérgicamente Método operatorio. Regular el potencial del electrodo de
hasta solidificación. Anotar la temperatura más elevada medida según las indicaciones de la monografía y represen-
observada en el transcurso de la solidificación. tar en una gráfica la intensidad inicial de la corriente y los
valores obtenidos durante la valoración, en función de la
cantidad de reactivo valorante añadido. De este reactivo aña-
dir al menos 3 cantidades sucesivas, que representen un
volumen total de aproximadamente un 80 por ciento del
volumen teórico que correspondería al punto de equivalen-
cia estimado. Los 3 valores obtenidos deben situarse sobre
una recta. Proseguir la adición del reactivo valorante más
allá del supuesto punto de equivalencia, en al menos 3 canti-
dades sucesivas: los 3 valores obtenidos deben situarse tam-
bién sobre una recta. El punto final de la valoración se
corresponde con el punto de intersección de las 2 rectas.
En el caso de una valoración amperométrica con 2 electro-
dos indicadores, es conveniente registrar la totalidad de la
curva de valoración y utilizar ésta para determinar el punto
final de la valoración.
2.2.20. VALORACIONES
POTENCIOMÉTRICAS
En una valoración potenciométrica, el punto final de la valo-

ración queda definido por la variación de potencial medido
entre dos electrodos (un electrodo indicador y un electrodo
de referencia o dos electrodos indicadores) sumergidos en la
disolución problema, en función de la cantidad de reactivo
Figura 2.2.18.-1.—Aparato para la determinación
valorante añadido.
del punto de solidificación
La medida del potencial se realiza habitualmente mante-
Dimensiones en milímetros
niendo la corriente nula o prácticamente nula.
Equipo. El equipo utilizado (potenciómetro simple o
equipo con circuitos electrónicos) se compone de un vol-
2.2.19. VALORACIONES tímetro que permita una aproximación de lectura de 1 mV.
AMPEROMÉTRICAS
La elección del electrodo indicador está en función de la
naturaleza de los compuestos a valorar: electrodo de vidrio
Durante una valoración amperométrica, el punto final de la o electrodo metálico (platino, oro, plata, mercurio, etc.). El
valoración queda definido por la variación de la intensidad electrodo de referencia es generalmente un electrodo de
de corriente medida entre dos electrodos (un electrodo indi- calomelanos o un electrodo de plata-cloruro de plata.
cador y un electrodo de referencia o dos electrodos indica-
dores) sumergidos en la disolución problema y mantenidos En el caso de valoraciones ácido-base y si no se indica lo
a una diferencia de potencial constante, en función de la contrario en la monografía, se utiliza un sistema de electro-
cantidad de reactivo valorante añadido. dos de vidrio/calomelanos o vidrio/plata-cloruro de plata.
El potencial del electrodo de medida debe ser suficiente para Método operatorio. Representar en una gráfica las varia-
asegurar que existe una corriente de difusión de la sustancia
ciones de potencial en función de la cantidad de reactivo
electroactiva.
valorante añadido, continuando la adición de este último
Equipo. El equipo se compone de una fuente de tensión hasta más allá del presumible punto de equivalencia. El
ajustable, así como de un microamperímetro sensible; el sis- punto final de la valoración corresponde a una variación
tema de detección está constituido generalmente por un brusca de potencial.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.22. Espectrometría de emisión atómica
2.2.21. FLUORIMETRÍA Equipo. Consta, esencialmente, de un generador de áto-

mos del elemento que se determina (llama, plasma, arco,
etc.), un monocromador y un detector. Si el generador es
La fluorimetría es una técnica que utiliza la medida de la una llama, el disolvente de elección para la preparación de
2. Métodos
intensidad de luz fluorescente emitida por la sustancia a exa-
analíticos
las disoluciones problema y las de referencia es el agua R.
minar en relación con la emitida por un patrón determinado. No obstante, cabe la posibilidad de utilizar también disol-
ventes orgánicos, si se toman las precauciones necesarias
Procedimiento. Disolver la sustancia en el disolvente o para que el disolvente no afecte a la estabilidad de la llama.
mezcla de disolventes señalados en la monografía, verter la
disolución en la cubeta o en el tubo del fluorímetro e ilumi- Procedimiento. Utilizar un espectrómetro de emisión ató-
nar con un rayo de luz de excitación lo más monocromática mica según las instrucciones que acompañan al aparato y
posible, a la longitud de onda que se señale en la monogra- operando a la longitud de onda prescrita. Introducir una
fía. disolución blanco en el dispositivo de análisis y ajustar a
Medir la intensidad de la luz emitida a un ángulo de 90° en cero. Introducir a continuación la disolución de referencia
relación a la dirección del rayo de iluminación, después de de concentración más elevada y regular la sensibilidad para
hacerla atravesar un filtro que detiene la luz incidente y deja obtener una lectura adecuada.
pasar la radiación fluorescente. Se pueden emplear otros Las medidas se realizan por comparación con disoluciones
tipos de aparatos siempre y cuando se obtengan resultados de referencia de concentración conocida del elemento que
idénticos. se determina, ya sea mediante una calibración directa
Para el análisis cuantitativo, introducir primero en el aparato (Método I) o por el método de adición de patrones
el disolvente o mezcla de disolventes empleados para disol- (Método II).
ver la muestra. Ajustar el instrumento a cero, introducir a
continuación la disolución de referencia y regular la sensibi- Método I - Método de la calibración directa
lidad del aparato de manera que la señal sea superior a 50.
Si el segundo ajuste se realiza modificando la anchura de las Preparar la disolución de la sustancia a examinar (disolu-
rendijas, ajustar de nuevo el aparato a cero y medir nueva- ción problema) tal como se prescriba. Preparar al menos 3
mente la intensidad de fluorescencia de la disolución de disoluciones de referencia, cuyas concentraciones en el ele-
referencia. Finalmente, introducir la disolución de concen- mento que se determina estén por encima y por debajo de la
tración desconocida y leer el valor indicado por el instru- concentración que presumiblemente tendrá la disolución
mento. Calcular la concentración cx de la disolución problema. Deben añadirse a las disoluciones de referencia
mediante la fórmula: todos los reactivos utilizados para la preparación de la diso-
Ix cr lución problema y en la misma concentración.
cx =  Introducir, como mínimo, 3 veces la disolución problema y
Ir las disoluciones de referencia en el dispositivo de análisis
cx = concentración de la disolución problema, y anotar cada vez el valor obtenido después de la estabiliza-
ción. Lavar cada vez el aparato con la disolución blanco y
cr = concentración de la disolución de referencia, comprobar que la lectura vuelva al valor que inicialmente
tenía la disolución blanco.
Ix = intensidad de luz emitida por la disolución problema,
Trazar la curva de calibrado a partir de la media de las lectu-
Ir = intensidad de luz emitida por la disolución de referen- ras obtenidas con las disoluciones de referencia. Determinar
cia. la concentración del elemento en la disolución problema
mediante la curva de calibrado obtenida.
Cuando la intensidad de fluorescencia no es rigurosamente
proporcional a la concentración, la medida puede realizarse
utilizando una curva de calibración. Método II - Método de adición de patrones
En algunas ocasiones se puede efectuar la medición en rela- En como mínimo 3 matraces aforados idénticos introducir
ción a un patrón fijo (por ejemplo un vidrio fluorescente o volúmenes iguales de la disolución de la sustancia a exami-
una disolución de otra sustancia fluorescente). La concen- nar (disolución problema), preparada tal como se prescriba
tración de la sustancia a examinar se determinará en tal caso en la monografía. En todos los matraces, excepto en uno,
sobre una curva de calibración realizada en las mismas con- introducir volúmenes crecientes de una disolución de refe-
diciones. rencia, con una concentración exactamente conocida del
elemento que se determina. De este modo se obtiene una
serie de disoluciones que contienen cantidades crecientes
del elemento que se determina. Estas concentraciones
2.2.22. ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN deben elegirse de forma que den lugar a lecturas situadas
ATÓMICA en la parte lineal de la curva. Enrasar cada matraz con el
disolvente.
La espectrometría de emisión atómica es un método de deter- Introducir en el dispositivo de análisis, como mínimo 3
minación de la concentración de un elemento en una sustan- veces, cada una de las anteriores disoluciones y anotar cada
cia, basado en la medida de la intensidad de una de las líneas vez el valor obtenido después de la estabilización. Lavar el
espectrales emitidas por el vapor atómico del elemento gene- dispositivo cada vez con el disolvente y comprobar que la
rado a partir de la sustancia. La determinación se realiza a la lectura vuelve al valor que inicialmente tenía la disolución
longitud de onda correspondiente a esta línea de emisión. blanco.

2.2.23. Espectrometría de absorción atómica REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
Calcular la ecuación de regresión lineal utilizando el méto- determina, ya sea mediante una calibración directa (Método I)
do de los mínimos cuadrados. Empleando esta ecuación cal- o por el método de adición de patrones (Método II).
cular la concentración del elemento que se determina en la
disolución problema. También se puede conocer esta con- Método I - Método de la calibración directa
2. Métodos
analíticos
centración operando de la manera siguiente:

Preparar la disolución de la sustancia a examinar (disolu-
Representar gráficamente la media de las lecturas frente a la ción problema) de la forma que se prescriba. Preparar, como
cantidad añadida del elemento a determinar en cada disolu- mínimo, 3 disoluciones de referencia cuyas concentraciones
ción. Unir los puntos y extrapolar la recta hasta su intersec- en el elemento que se determina sean las adecuadas para la
ción con el eje de abscisas. La distancia entre este punto y la concentración que del mismo se encontrará previsiblemente
intersección de los ejes (origen) representa la concentración en la disolución problema. Todos los reactivos utilizados
del elemento a determinar en la disolución problema. para la preparación de la disolución problema deben añadir-
se, y a la misma concentración, a las disoluciones de refe-
Cuando se requiera la técnica de muestreo sólido, en la rencia y a la disolución blanco.
monografía se hallan descritos los detalles del procedimien-
to a seguir. Introducir, como mínimo 3 veces, la disolución que se exa-
mina y las disoluciones de referencia en el dispositivo de
análisis y anotar cada vez el valor obtenido después de la
estabilización. Lavar cada vez el dispositivo con la disolu-
2.2.23. ESPECTROMETRÍA ción blanco y comprobar que la lectura vuelve al valor obte-
nido inicialmente con la misma.
DE ABSORCIÓN ATÓMICA
Si se utiliza un horno, éste debe encenderse entre las lectu-
ras para limpiarlo.
La espectrometría de absorción atómica es una técnica de
determinación de la concentración de un elemento en una Trazar la curva de calibrado a partir de la media de las lectu-
sustancia, que se basa en la medida de la absorción de ras obtenidas con las disoluciones de referencia. Determinar
una radiación por parte del vapor atómico del elemento con- la concentración del elemento en la disolución problema
tenido en la sustancia. La medida se realiza a la longitud de empleando la curva de calibrado obtenida.
onda de una de las líneas de absorción del elemento que se
determina. Cuando se requiera la técnica de muestreo sólido, el proce-
dimiento que se debe seguir está descrito detalladamente en
Equipo. Consta, esencialmente, de una fuente de radia- la monografía.
ción, un generador de átomos del elemento que se determi-
na (llama, horno, etc.), un monocromador y un detector. Método II - Método de adición de patrones
El sistema de introducción de la muestra a examinar depen- En como mínimo 3 matraces aforados idénticos introducir
de del tipo de generador de átomos que se utilice. Si se trata volúmenes iguales de la disolución de la sustancia a exami-
de una llama, las muestras son nebulizadas y el agua R es el nar (disolución problema), preparada tal como se prescriba.
disolvente de elección para la preparación de la disolución Añadir a todos los matraces, salvo en uno, volúmenes cre-
problema y de las disoluciones de referencia, aunque es cientes de una disolución de referencia de concentración
posible utilizar también disolventes orgánicos si se toman exactamente conocida en el elemento que se determina. De
las precauciones necesarias para que el disolvente no afecte este modo se obtiene una serie de disoluciones que contie-
nen cantidades crecientes del elemento. Estas concentracio-
a la estabilidad de la llama. Cuando se emplea un horno, las
nes deben elegirse de forma que se obtengan lecturas situa-
muestras pueden introducirse tanto en disolución en agua R
das en la parte lineal de la curva. Enrasar cada matraz con el
o en un disolvente orgánico como en forma sólida.
disolvente.
El vapor atómico puede también generarse en el exterior del
Introducir, como mínimo 3 veces, cada una de las disolucio-
espectrómetro. Este es el método llamado del vapor frío y se
nes en el dispositivo de análisis y anotar cada vez el valor
utiliza, por ejemplo, para el mercurio o los hidruros. En el que se obtenga después de la estabilización. Lavar cada vez
caso del mercurio, los átomos se generan por reducción quí- el dispositivo con el disolvente y comprobar que la lectura
mica y el vapor atómico es arrastrado por una corriente de vuelve al valor obtenido en el ensayo en blanco.
gas inerte hasta la célula de absorción, que está situada en el
trayecto óptico del instrumento. Los hidruros pueden mez- Si se utiliza un horno, éste debe encenderse entre las lectu-
clarse con el gas que alimenta el quemador o bien ser arras- ras para limpiarlo.
trados por un gas inerte hasta una célula calentada, en cuyo
interior se disocian en átomos. Calcular la ecuación de regresión lineal del gráfico utilizan-
do el método de los mínimos cuadrados. Empleando esta
Procedimiento. Utilizar un espectrómetro de absorción ecuación calcular la concentración del elemento que se
atómica de acuerdo con las instrucciones del aparato y tra- determina en la disolución problema. También puede cono-
bajar a la longitud de onda prescrita. Introducir una disolu- cerse esta concentración operando de la siguiente manera:
ción blanco en el dispositivo de análisis y ajustar la lectura
del instrumento de forma que indique la máxima transmi- Representar gráficamente la media de las lecturas obtenidas
sión. Introducir a continuación la disolución de referencia para cada disolución de referencia frente a la cantidad añadi-
de concentración más elevada y regular la sensibilidad para da del elemento que se determina. Unir los puntos sobre el
obtener una lectura de absorbancia adecuada. gráfico y extrapolar la recta hasta su intersección con el eje de
concentraciones (abscisas). La distancia entre este punto y la
Las medidas se realizan por comparación con disoluciones intersección de los ejes (origen) representa la concentración
de referencia de concentración conocida del elemento que se del elemento que se determina en la disolución problema.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.24. Espectrofotometría de absorción en el infrarrojo
Cuando se requiera la técnica de muestreo sólido, el proce- A. Pasta. Triturar una pequeña cantidad de la sustancia a
dimiento que se debe seguir está descrito detalladamente en examinar con la mínima cantidad de parafina líquida R
la monografía. u otro líquido apropiado; generalmente son suficientes
de 5 mg a 10 mg de la sustancia a examinar para prepa-
2. Métodos
analíticos
rar una pasta adecuada. Comprimir la pasta entre 2 pla-
cas transparentes a la radiación infrarroja.
2.2.24. ESPECTROFOTOMETRÍA
B. Pastilla. Salvo que se indique lo contrario, triturar de
DE ABSORCIÓN 1 mg a 2 mg de la sustancia a examinar con 300 mg a
EN EL INFRARROJO 400 mg de bromuro de potasio R o de cloruro de pota-
sio R seco y finamente pulverizado. Estas cantidades
son suficientes, en general, para preparar una pastilla
Los espectrofotómetros de infrarrojo se utilizan para regis- de 13 mm de diámetro y para obtener un espectro con
trar espectros en la región de 4000 cm-1 a 670 cm-1 (2,5 µm una intensidad aceptable. Triturar la mezcla con cui-
a 15 µm) o en algunos casos hasta 200 cm-1 (50 µm). Los dado, repartirla uniformemente en una matriz y some-
espectrofotómetros de infrarrojo con transformada de Fou- terla a vacío a una presión de aproximadamente 800
rier utilizan radiación policromática y calculan el espectro MPa (8 t.cm-2). Diversos factores, tales como una tritu-
en el dominio de frecuencia a partir de los datos originales, ración excesiva o insuficiente, la humedad o presencia
por la transformación de Fourier. También se pueden usar de impurezas en el medio de dispersión y una reducción
espectrofotómetros provistos de un sistema óptico que pro- insuficiente del tamaño de partícula pueden dar lugar a
porcione una radiación monocromática correspondiente a la formación de pastillas defectuosas. Rechazar la pasti-
la zona de la medición. Generalmente el espectro se expresa lla cuando su examen visual revele una transparencia
en función de la transmitancia, es decir la relación entre la poco uniforme o cuando la transmitancia aproximada-
intensidad de la radiación transmitida y la intensidad de mente a 2000 cm-1 (5 µm), sin que haya una banda de
la radiación incidente. absorción específica, sea inferior al 75 por ciento sin
La absorbancia (A) se define como el logaritmo decimal de utilizar blanco, salvo indicación contraria.
la inversa de la transmitancia (T): Gases. Examinar los gases en una cubeta transparente a la
radiación infrarroja y con un recorrido óptico de aproxima-
damente 100 mm. Hacer el vacío en la cubeta y llenarla
( ) ( )
1
A = log10 ————
T
I0
= log10 ————
I
hasta la presión deseada utilizando una válvula de aguja o
una llave de paso y un tubo de transferencia de gases que
conecte adecuadamente el recipiente del gas a examinar y la
cubeta para gases.
T = I/I0,
Si fuera necesario, ajustar la presión de la cubeta a la presión
I0 = intensidad de la radiación incidente, atmosférica utilizando un gas transparente a la radiación
I = intensidad de la radiación transmitida. infrarroja (por ejemplo nitrógeno R o argón R). Para evitar
las interferencias de absorción debidas al agua, al dióxido de
carbono o a otros gases atmosféricos, colocar en el haz de
referencia una cubeta idéntica que permita también el llena-
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA do o vaciado de gas transparente a la radiación infrarroja.
PARA REGISTROS POR ABSORCIÓN

O POR TRANSMISIÓN MEDIDA POR REFLEXIÓN MÚLTIPLE
Preparar la sustancia por uno de los métodos siguientes: Cuando lo prescriba la monografía, preparar la sustancia
empleando uno de los métodos siguientes:
Líquidos. Examinar el líquido en forma de película
situada entre 2 placas (ventanas) transparentes a la radia- Disoluciones. Disolver la sustancia a examinar en el
ción infrarroja o en una cubeta (celda) con un recorrido disolvente adecuado y en las condiciones señaladas en la
óptico adecuado e igualmente transparente a la radiación monografía. Evaporar la disolución sobre una placa de bro-
infrarroja. moioduro de talio o en otra placa apropiada.
Líquidos o sólidos preparados en forma de disolución. Sólidos. Depositar la sustancia a examinar sobre una
Preparar una disolución en un disolvente adecuado, a una placa de bromoioduro de talio o en otra placa adecuada, de
concentración y un recorrido óptico de la cubeta que permi- manera que se asegure un contacto homogéneo entre ambos.
ta obtener un espectro aceptable. Generalmente se obtienen
buenos resultados con concentraciones de 10 g/l a 100 g/l MEDIDA POR REFLECTANCIA TOTAL ATENUADA
para recorridos ópticos de 0,5 mm a 0,1 mm. La absorción
debida al disolvente se compensa colocando en el haz de Depositar la sustancia a examinar en contacto estrecho con
referencia, otra cubeta igual que contenga el disolvente un prisma de reflectancia total atenuada.
empleado.
Sólidos. Examinar los sólidos dispersados en un líquido IDENTIFICACIÓN MEDIANTE SUSTANCIAS
adecuado (pasta) o en un sólido (pastilla de haluro), según DE REFERENCIA
convenga. Cuando lo señale la monografía, hacer una pelí-
cula con la sustancia fundida entre 2 placas transparentes a Preparar la sustancia a examinar y la sustancia de referencia
la radiación infrarroja. por el mismo procedimiento y registrar los espectros entre

2.2.25. Espectrofotometría de absorción en el ultra... REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
4000 cm-1 y 670 cm-1 (2,5 µm a 15 µm) operando en las mis- Tabla 2.2.24.-1.- Mínimos de transmisión (y tolerancias aceptables) de
mas condiciones. Los mínimos de transmisión (máximos de una película de poliestireno
absorción) del espectro obtenido con la sustancia a exami-
nar, corresponden en posición y tamaño relativo a los del 3060,0 (± 1,5) cm-1
2. Métodos
2849,5 (± 1,5) cm-1

analíticos
espectro obtenido con la sustancia de referencia (SQR).

1942,9 (± 1,5) cm-1
Cuando los espectros registrados de la sustancia en estado 1601,2 (± 1,0) cm-1
1583,0 (± 1,0) cm-1
sólido revelan diferencias en las posiciones de los mínimos 1154,5 (± 1,0) cm-1
de transmisión (los máximos de absorción), tratar la sustan- 1028,3 (± 1,0) cm-1
cia a examinar y la sustancia de referencia en las mismas
condiciones, de manera que cristalicen o se presenten bajo
la misma forma, o proceder como se indica en la monogra- Método. Preparar la sustancia a examinar siguiendo las ins-
fía y seguidamente registrar los espectros. trucciones que acompañan a la obtención del espectro de
referencia. Con las mismas condiciones experimentales que
se han utilizado para el control del poder de resolución,
IDENTIFICACIÓN MEDIANTE ESPECTROS registrar el espectro de la sustancia a examinar y superpo-
DE REFERENCIA nerlo a las bandas de poliestireno a 2849,5 cm-1 (3,51 µm), a
Control del poder de resolución. Registrar el espectro de 1601,2 cm-1 (6,25 µm) y a 1028,3 cm-1 (9,72 µm). Comparar
una película de poliestireno de 0,04 mm de espesor. La dife- los 2 espectros y las bandas del poliestireno indicadas ante-
rencia x (ver figura 2.2.24.-1) entre el porcentaje de transmi- riormente. Utilizando las posiciones de las bandas del
tancia en el máximo de transmisión A a 2870 cm-1 (3,48 µm) poliestireno como referencias, las posiciones de las bandas
y en el mínimo de transmisión B a 2849,5 cm-1 (3,51 µm) significativas en el espectro de la sustancia a examinar y en
debe ser superior a 18. La diferencia y entre el porcentaje de el espectro de referencia, deben corresponderse dentro
de un margen del 0,5 por ciento en la escala de número de
transmitancia en el máximo de transmisión C a 1589 cm-1
onda. Los tamaños relativos de las bandas deben ser concor-
(6,29 µm) y en el mínimo de transmisión D a 1583 cm-1 (6,32
dantes en los 2 espectros.
µm) debe ser superior a 12.
IMPUREZAS EN LOS GASES

Para el análisis de las impurezas utilizar una cubeta transpa-
rente a la radiación infrarroja y que permita un recorrido
óptico apropiado (por ejemplo de 1 m a 20 m). Llenar la
cubeta como se indica en «Gases». Para la detección y
determinación cuantitativa de las impurezas proceder como
se indica en la monografía.
2.2.25. ESPECTROFOTOMETRÍA DE
ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA
Y EN EL VISIBLE
Determinación de la absorbancia. La absorbancia (A) de

una disolución es el logaritmo decimal de la inversa de la
transmitancia (T) para una radiación monocromática. Se
expresa según la ecuación:
Número de onda cm-1
Figura 2.2.24.-1.- Espectro característico del poliestireno utilizado

A = log10
( ) 1
T
= log10
( )
I0
I
para controlar el poder de resolución
Comprobación de la escala de números de onda. La T= I/I0.

comprobación de la escala de números de onda puede reali-
zarse mediante una película de poliestireno, que presenta I0 = intensidad de la radiación monocromática incidente,
unos mínimos de transmisión (máximos de absorción) a los
números de onda (expresados en cm-1) indicados en la tabla I= intensidad de la radiación monocromática transmi-
2.2.24.-1. tida.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.25. Espectrofotometría de absorción en el ultra...
En ausencia de otros factores físico-químicos, la absorban- Control de la absorbancia. Controlar la absorbancia

cia medida (A) es proporcional al recorrido óptico (b) de la mediante filtros adecuados o una disolución de dicromato
radiación y a la concentración (c) de la sustancia disuelta, de potasio R a las longitudes de onda señaladas en la tabla
según la ecuación: 2.2.25.-2. Para cada longitud de onda se indica el valor
2. Métodos
analíticos
exacto y los límites permitidos de la absorbancia específica.
Se admite una tolerancia para la absorbancia de ± 0,01.
A = ε·c·b
Para el control de la absorbancia utilizar una disolución de
dicromato de potasio preparada de la siguiente manera.
ε = coeficiente de absorción molar, si b se expresa en centí- Disolver de 57,0 mg a 63,0 mg de dicromato de potasio R,
metros y c en moles por litro. previamente desecado a 130 °C hasta peso constante, en
ácido sulfúrico 0,005 M y diluir hasta 1000,0 ml con el
1 por ciento
mismo ácido.
La expresión A 1 cm que representa la absorbancia
específica de una sustancia disuelta, se refiere a la absorban-
Tabla 2.2.25.-2
cia de una disolución de 10 g/l en una cubeta de 1 cm y a
una longitud de onda determinada, de donde:
Longitud Absorbancia específica Tolerancia
de onda (nm) 1 por ciento máxima
A 1 cm
= 10ε
1 por ciento
A1 cm 235 124,5 122,9 a 126,2
Mr 257 144,5 142,8 a 146,2
313 48,6 47,0 a 50,3
350 107,3 105,6 a 109,0
Salvo que se indique lo contrario, medir la absorbancia a la
longitud de onda prescrita utilizando un recorrido óptico de
1 cm a 20 ± 1 °C y efectuar las medidas con relación al
mismo disolvente o mezcla de disolventes. La absorbancia Límite de luz difusa. La luz difusa se puede detectar a
del disolvente, medida con relación al aire y a la longitud de una longitud de onda dada mediante disoluciones o filtros
onda prescrita, no debe ser en ningún caso mayor que 0,4 y apropiados; por ejemplo, la absorbancia de una disolución
debe ser, preferentemente, menor que 0,2. Representar el de 12 g/l de cloruro de potasio R en una cubeta de 1 cm
espectro de absorción señalando en ordenadas los valores de aumenta bruscamente entre 220 nm y 200 nm y es mayor
absorbancia o cualquier función de ésta y en abscisas la lon- que 2 a una longitud de onda entre 198 nm y 202 nm em-
gitud de onda o cualquier función de ésta. pleando agua como líquido de compensación.
Resolución (para análisis cualitativo). Cuando se prescriba
Cuando la monografía indique un único valor para la posi- en una monografía, medir la resolución de los aparatos del
ción de un máximo de absorción, se admite que el valor modo siguiente: registrar el espectro de una disolución al
obtenido puede diferir como máximo en ± 2 nm. 0,02 por ciento V/V de tolueno R en hexano R. En la mono-
grafía se indica la relación mínima entre la absorbancia
Aparatos. Los espectrofotómetros empleados para el medida en el máximo a 269 nm y la determinada en el míni-
estudio de las regiones ultravioleta y visible del espectro mo a 266 nm.
disponen de un sistema óptico capaz de proporcionar una
Anchura de la rendija espectral (para análisis cuantitati-
radiación monocromática, en la región de 200 nm a 800
vo). Para evitar errores debidos a la anchura de la rendija
nm y de un dispositivo apropiado para la medida de la
absorbancia. espectral, cuando se utiliza un instrumento en el que ésta es
variable a la longitud de onda seleccionada, la anchura de la
rendija tiene que ser pequeña comparada con la mitad del
Control de las longitudes de onda. Verificar la escala de ancho de la banda de absorción, pero debe ser lo mayor
longitudes de onda utilizando los máximos de absorción posible para obtener un valor alto de I0. Por tanto, la anchu-
obtenidos con la disolución de perclorato de holmio R, la ra de la rendija debe ser siempre tal que una reducción pos-
línea de una lámpara de hidrógeno o de deuterio o las líneas terior no implique un cambio en la lectura de absorbancia.
de un arco de vapor de mercurio que se indican en la tabla
2.2.25.-1. Se admite una tolerancia de ± 1 nm para la región Cubetas. Se admite una tolerancia en el recorrido óptico
ultravioleta y de ± 3 nm para la región visible. de las cubetas empleadas de ± 0,005 cm. Si se llenan con el
mismo disolvente, las cubetas destinadas a contener la diso-
lución a examinar y el líquido de compensación, deben pre-
sentar la misma transmitancia. Si no fuera así, se debe reali-
Tabla 2.2.25.-1.- Máximos de absorción para el control zar una corrección adecuada.
de la escala de longitudes de onda
Las cubetas deben limpiarse y manejarse con cuidado.
241,15 nm (Ho) 404,66 nm (Hg)
253,7 nm (Hg) 435,83 nm (Hg)
287,15 nm (Ho) 486,0 nm (Dβ) ESPECTROFOTOMETRÍA DERIVADA
302,25 nm (Hg) 486,1 nm (Hβ)
313,16 nm (Hg) 536,3 nm (Ho) La espectrofotometría derivada implica la transformación
334,15 nm (Hg) 546,07 nm (Hg) de los espectros de absorción (orden cero) en espectros de la
361,5 nm (Ho) 576,96 nm (Hg)
365,48 nm (Hg) 579,07 nm (Hg)
primera derivada, segunda derivada o derivadas de órdenes
superiores.

2.2.26. Cromatografía en papel REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
El espectro de la primera derivada es una representación Procedimiento. Preparar la disolución de la sustancia a

gráfica del gradiente de la curva de absorción (velocidad de examinar ajustando el instrumento de acuerdo con las ins-
la variación de la absorbancia con la longitud de onda trucciones del fabricante y calcular la cantidad de la sustan-
dA/dλ) con respecto a la longitud de onda. cia a determinar según las indicaciones de la monografía.
2. Métodos
analíticos
El espectro de la segunda derivada es una representación

gráfica de la curvatura del espectro de absorción con respec-
to a la longitud de onda (d2A/dλ2). La segunda derivada de 2.2.26. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
cualquier longitud de onda λ se relaciona con la concentra-
ción mediante las siguientes ecuaciones:
CROMATOGRAFÍA ASCENDENTE
d2A d2A11 cm
por ciento c’b d2Aε cb
= × = × Equipo. Está constituido por una cámara cromatográfica
dλ2 dλ2 10 dλ2 10 de vidrio cuyas dimensiones son adecuadas a las del papel a
emplear. Está provista de una tapa de vidrio que asegura un
cierre hermético y en su parte superior de un dispositivo que
permite mantener suspendido el papel cromatográfico, dis-
c´ = concentración del soluto absorbente en gramos por litro.
positivo que puede bajarse sin abrir la cámara. Al fondo de
Aparatos. Utilizar un espectrofotómetro que cumpla los ésta se encuentra una cubeta para la fase móvil en la que
requisitos anteriormente expuestos y equipado con un puede descender el papel. El papel cromatográfico emplea-
módulo analógico de diferenciación resistivo-capacitivo o do es un papel de filtro adecuado, cortado en tiras de longi-
con un diferenciador digital u otro dispositivo que permita tud suficiente y de anchura de 2,5 cm como mínimo, de
obtener espectros derivados. Algunos dispositivos para manera que la migración de la fase móvil se efectúe en el
obtener el espectro derivado de segundo orden producen un sentido de las fibras del papel.
desplazamiento de la longitud de onda respecto al espectro Procedimiento. Verter en la cubeta una capa de 2,5 cm
de orden cero lo cual hay que tener en cuenta, si es necesa- aproximadamente de la fase móvil indicada en la monogra-
rio. fía y, si ésta lo prescribe, verter la fase estacionaria entre las
Poder de resolución. Cuando se prescriba en una mono- paredes de la cámara y la cubeta. Colocar la tapa, dejar repo-
grafía, registrar el espectro de la segunda derivada de una sar a 20-25 °C durante 24 h y mantener a la misma tempera-
disolución de 0,2 g/l de tolueno R en metanol R, utilizando tura todo el tiempo que requieran las operaciones cromato-
metanol R como líquido de compensación. El espectro gráficas. A 3 cm de uno de los extremos del papel, trazar
muestra un mínimo negativo pequeño situado entre 2 míni- con un lápiz una línea fina y paralela al borde del papel. Con
mos negativos mayores a 261 nm y 268 nm respectivamen- una micropipeta, depositar sobre esta línea el volumen de
te, como muestra la figura 2.2.25.-1. Salvo indicación con- disolución señalado en la monografía. Si la mancha alcanza
traria en la monografía, la relación A/B (ver figura 2.2.25.-1) un diámetro superior a 10 mm, depositar la disolución en
no es menor que 0,2. distintas fracciones dejando evaporar el disolvente en cada
ocasión. Si se emplea la misma tira de papel para más de un
cromatograma, se deben depositar las distintas disoluciones
a lo largo de la línea a una distancia mínima de 3 cm las
unas de las otras. Seguidamente introducir el papel en la
cámara, taparla y dejar reposar durante 1 h 30 min. Poner en
contacto el papel con la fase móvil y retirarlo cuando la fase
móvil ha recorrido la distancia prescrita o cuando ha trans-
currido el tiempo señalado en la monografía. Secar al aire.
Durante el tiempo de desarrollo, mantener el papel protegi-
do de la luz intensa.
CROMATOGRAFÍA DESCENDENTE
Equipo. Está constituido por una cámara cromatográfica
de vidrio de borde esmerilado y cuyas dimensiones están en
relación con las del papel a emplear. Está provista de una
tapa de vidrio que asegura un cierre hermético y posee un
orificio central de 1,5 cm de diámetro, aproximadamente;
dicho orificio está obturado por una placa de vidrio esmeri-
lado o por un tapón. En la parte superior de la cámara y en
el interior de ésta se halla, sobre unos soportes, la cubeta de
la fase móvil provista de un dispositivo que permite fijar la
parte superior del papel cromatográfico. Dos varillas de
vidrio situadas en los 2 lados de la cubeta, paralela y ligera-
mente por encima de sus bordes superiores, actúan como
soporte del papel cromatográfico e impiden que su extremo
libre toque ningún punto de la cámara cromatográfica. El
papel cromatográfico es un papel de filtro adecuado, corta-
do en tiras de longitud suficiente y de anchura comprendida
Figura 2.2.25.-1 entre 2,5 cm y la longitud de la cubeta, de manera que la

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.27. Cromatografía en capa fina
migración de la fase móvil se efectúe en el sentido de las Micropipetas, microjeringas, capilares desechables cali-
fibras del papel. brados o cualquier otro dispositivo que permita una aplica-
ción correcta de las disoluciones.
Procedimiento. Verter en el fondo de la cámara cromato-
2. Métodos
Dispositivo de detección de fluorescencia para la medida
analíticos
gráfica una capa de 2,5 cm aproximadamente de la fase
móvil señalada en la monografía, tapar, dejar reposar a directa de la fluorescencia o de la inhibición de la fluores-
20-25 °C durante 24 h y mantener a la misma temperatura cencia.
todo el tiempo que duren las operaciones cromatográficas.
Reactivos de visualización para detectar las manchas sepa-
Con un lápiz trazar una línea fina paralela a uno de los lados radas mediante pulverización, por exposición a vapores o
del papel. La distancia entre esta línea y uno de los extre- por inmersión.
mos del papel es tal que, cuando dicho extremo esté fijo en
la cubeta y el resto del papel caiga libremente, la línea se PROCEDIMIENTO
halle a algunos centímetros por debajo de la varilla guía y
paralela a ésta. Con una micropipeta depositar sobre la línea Desarrollo vertical. Cubrir las paredes de la cubeta cro-
el volumen de disolución indicado en la monografía. Si la matográfica con papel de filtro. Verter en la cubeta una
mancha alcanza un diámetro superior a 10 mm, depositar la cantidad de fase móvil adecuada al tamaño de la misma y
disolución en distintas fracciones, dejando evaporar el disol- suficiente para obtener, después de la impregnación del
vente en cada ocasión. Si se emplea la misma tira de papel papel de filtro, una capa de altura adecuada, relacionada
para más de un cromatograma, se deben depositar las distin- con las dimensiones de la placa que se utiliza. Para la satu-
ración de la cubeta cromatográfica, taparla y dejar reposar
tas disoluciones a lo largo de la línea a una distancia míni-
de 20 ºC a 25 ºC durante 1 h. A menos que se indique lo
ma de 3 cm las unas de las otras. Seguidamente introducir el
contrario, la separación cromatográfica se realiza en una
papel en la cámara, tapar y dejar reposar durante 1 h 30 min. cubeta saturada.
Verter la fase móvil en cantidad suficiente a través del orifi-
cio de la tapa y cerrar ésta. Retirar el papel cuando la fase Aplicar el volumen prescrito de las disoluciones en fraccio-
móvil ha recorrido la distancia prescrita o cuando ha trans- nes suficientemente pequeñas como para obtener bandas o
currido el tiempo señalado en la monografía. Secar al aire. manchas circulares a una distancia adecuada del borde infe-
Durante el tiempo de desarrollo mantener el papel protegido rior y de los bordes laterales de la placa. Aplicar las disolucio-
de la luz intensa. nes sobre una línea paralela al borde inferior de la placa con
un intervalo de al menos 10 mm entre las manchas.
Cuando el disolvente de las disoluciones aplicadas se haya
2.2.27. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA evaporado, colocar la placa en la cubeta cromatográfica en
una posición lo más vertical posible y asegurándose de que
las manchas o bandas quedan siempre por encima del nivel
Fundamento. La cromatografía en capa fina es una técnica de la fase móvil. Tapar la cubeta, mantenerla de 20 ºC a
de separación en la que la fase estacionaria está constituida 25 ºC protegida de la luz solar. Sacar la placa cuando la fase
por un material adecuado, dispuesto en una capa fina y uni- móvil haya alcanzado la distancia indicada en la monogra-
forme, fijado sobre un soporte (placa) de vidrio, metal o fía, secar la placa y visualizar los cromatogramas de la
plástico. Las disoluciones de analitos se aplican sobre la forma que se prescribe.
placa antes del desarrollo. La separación se basa en proce-
Para cromatografía bidimensional, secar las placas después
sos de adsorción, reparto, intercambio iónico o en la combi-
del primer desarrollo y efectuar un segundo desarrollo en
nación de algunos de estos mecanismos. Se realiza por
dirección perpendicular al primero.
migración (desarrollo) de los solutos (disoluciones de anali-
tos) a través de la capa fina (fase estacionaria) en un disol- Desarrollo horizontal. Aplicar el volumen prescrito de
vente o una mezcla de disolventes (fase móvil). las disoluciones, en fracciones suficientemente pequeñas
como para obtener manchas circulares de 1 mm a 2 mm de
APARATOS diámetro o bandas de 5 mm a 10 mm por 1 mm a 2 mm, a una
distancia adecuada del borde inferior y de los laterales de la
Placas. La cromatografía se realiza con placas pre-recu- placa. Aplicar las disoluciones sobre una línea paralela al
biertas como se describe en Reactivos (4.1.1.). borde inferior de la placa, con un intervalo de al menos 5
Preacondicionamiento de las placas. Puede ser necesario mm entre las manchas. Cuando se haya evaporado el disol-
lavar las placas antes de la separación. Esta operación se vente de las disoluciones aplicadas, introducir la cantidad
suficiente de fase móvil en el surco correspondiente de la
puede realizar mediante migración de un disolvente apro-
cubeta utilizando una jeringa o pipeta, colocar la placa hori-
piado. También se pueden impregnar por procedimientos zontalmente y conectar el dispositivo para dirigir la fase
tales como desarrollo, inmersión o pulverización. En el móvil siguiendo las instrucciones del fabricante. Si se indi-
momento de su empleo, se pueden activar, si fuera necesario, ca en la monografía, desarrollar la placa comenzando simul-
por calentamiento en estufa de 100 ºC a 105 ºC durante 1 h. táneamente por ambos extremos. Tapar la cubeta y mante-
nerla de 20 ºC a 25 °C. Sacar la placa cuando la fase móvil
Cubeta cromatográfica de fondo plano o con dos surcos,
haya alcanzado la distancia indicada en la monografía.
de material transparente, e inerte. Sus dimensiones se adap- Secar la placa y visualizar los cromatogramas de la forma
tan a las de las placas que se vayan a utilizar y está provista que se prescribe.
de una tapa con ajuste hermético. Para el desarrollo hori-
zontal, la cubeta está provista de un surco para la fase móvil Para cromatografía bidimensional, secar las placas después
y de un dispositivo para dirigir la fase móvil hacia la fase del primer desarrollo y efectuar un segundo desarrollo en
estacionaria. dirección perpendicular al primero.

2.2.28. Cromatografía de gases REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
ESTIMACIÓN VISUAL — un registrador y un integrador apropiado o un ordenador;

Identificación. La mancha principal en el cromatograma — para las sustancias que responden a la exposición a la
obtenido con la disolución problema se compara visualmen- radiación UV-Vis: se utilizan para la medida de la reflec-
2. Métodos
te con la mancha correspondiente en el cromatograma obte- tancia o de la transmitancia un fotómetro con fuente de
analíticos
nido con la disolución de referencia, comparando el color, luz, un sistema óptico con capacidad de generar luz
el tamaño y el factor de retención (Rf) de ambas manchas. monocromática y una célula fotoeléctrica de sensibili-
dad adecuada. Cuando se realizan medidas de fluores-
El factor de retención (Rf) se define como la relación entre la cencia además es necesario un filtro monocromático
distancia desde el punto de aplicación al centro de la mancha para la selección de una región espectral específica de la
y la distancia recorrida por el frente del disolvente desde el luz emitida;
punto de aplicación.
— para las sustancias que contienen radionucleidos: un
Verificación del poder de separación con fines de identifica- contador adecuado para la medida de la radiactividad.
ción. Generalmente son suficientes los resultados dados Se debe comprobar la linealidad del contador.
en el ensayo de idoneidad descrito en Reactivos (4.1.1).
Excepcionalmente, se indica en la monografía un criterio Procedimiento. Preparar la disolución de la sustancia a
suplementario de resolución. examinar (disolución problema) como se prescribe en la
monografía y, si fuera necesario, preparar las disoluciones
Ensayo de sustancias relacionadas. Comparar visual- de referencia de la sustancia a examinar, utilizando el
mente la mancha o las manchas secundarias del cromato- mismo disolvente que en la disolución problema. Aplicar en
grama obtenido con la disolución problema con la mancha o la placa el mismo volumen de cada una de las disoluciones
las manchas correspondientes del cromatograma obtenido y desarrollar.
con la disolución de referencia que contenga la impureza o
las impurezas o la mancha del cromatograma obtenido con Sustancias que responden a la exposición a la radiación
UV-Vis. Preparar y aplicar no menos de tres disoluciones de
la disolución de referencia preparada a partir de una dilu-
referencia de la sustancia a examinar cuyas concentraciones
ción de la disolución problema.
abarquen el valor esperado en la disolución problema (aproxi-
Verificación del poder de separación. Las exigencias en madamente el 80, 100 y 120 por ciento). Pulverizar con el reac-
cuanto a la verificación del poder de resolución se indican tivo indicado, si fuera necesario, y registrar la reflectancia,
en las monografías específicas. transmitancia o fluorescencia en los cromatogramas obtenidos
con las disoluciones problema y de referencia. Con ayuda de
Verificación del poder de detección. Se considera satisfac- los resultados obtenidos, calcular la cantidad de sustancia en la
torio cuando la mancha o la banda del cromatograma obte- disolución problema.
nido a partir de la disolución de referencia más diluida sea
claramente visible. Sustancias que contienen radionucleidos: Preparar y apli-
car una disolución problema que contenga aproximadamen-
te 100 por cien del valor esperado. Determinar la radiactivi-
MEDIDAS CUANTITATIVAS dad en función de la distancia recorrida y registrar la
radiactividad en cada pico resultante como un porcentaje de
Las exigencias de separación y resolución se indican en las la cantidad total de radiactividad.
monografías específicas.
Los criterios para determinar la idoneidad del sistema están
Las sustancias separadas por cromatografía en capa fina y descritos en el capítulo Técnicas de separación cromatográ-
que respondan a la exposición de radiación UV-Vis, se pue- fica (2.2.46). En este capítulo se incluyen también los lími-
den determinar directamente sobre la placa, utilizando una tes entre los que pueden variar los diferentes parámetros
instrumentación adecuada. Examinar la placa midiendo la para satisfacer los criterios de idoneidad del sistema.
transmitancia o la reflectancia de la luz incidente por des-
plazamiento de la misma a través del dispositivo de medida
o viceversa. Se puede medir de forma similar la fluorescen-
cia, utilizando un sistema óptico adecuado. Las sustancias 2.2.28. CROMATOGRAFÍA DE GASES
que contienen radionucleidos se pueden cuantificar por tres
métodos: directamente por desplazamiento de la placa a lo La cromatografía de gases (CG) es una técnica de separa-
largo de un contador apropiado o viceversa (ver Preparacio- ción cromatográfica basada en la diferente distribución de
nes Radiofarmacéuticas (0125)), cortando las placas en tiras las especies entre dos fases no miscibles, en la que la fase
y midiendo la radiactividad en cada tira individual mediante móvil es un gas portador que atraviesa la fase estacionaria
un contador apropiado o raspando la fase estacionaria, disol- contenida en una columna. Es aplicable a sustancias o sus
viéndola en una mezcla de centelleo adecuada y midiendo derivados que se volatilizan a las temperaturas empleadas.
la radiactividad mediante un contador de centelleo líquido.
La cromatografía de gases se basa en fenómenos de adsor-
Aparatos. Los equipos para la medida directa de la placa ción, distribución de masas o exclusión por tamaños.
constan de:
— un dispositivo para la colocación exacta y la reproduc- APARATO
ción precisa de la cantidad de sustancias depositadas
sobre la placa; El equipo consiste en una cámara de inyección, una colum-
na cromatográfica contenida en un horno, un detector y un
— un sistema mecánico para desplazar la placa o el dispo- sistema de adquisición de datos (o un integrador o registra-
sitivo de medida a lo largo del eje x o del eje y; dor). El gas portador circula por la columna con un caudal o

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.28. Cromatografía de gases
presión controlado y pasa seguidamente a través del diatomeas lavada con ácido y calcinada. Los materiales
detector. existen en diversos tamaños de partícula, siendo las partículas
más comúnmente utilizadas de 150 µm a 180 µm y de 125 µm
La cromatografía se realiza a temperatura constante o utili- a 150 µm.
2. Métodos
zando un programa de temperaturas dado.
analíticos
Fases móviles
Cámaras de inyección El tiempo de retención y la eficacia del pico dependen del
caudal del gas portador; el tiempo de retención es directa-
Las inyecciones directas de las disoluciones son el modo mente proporcional a la longitud de la columna y la resolu-
usual de inyección, salvo indicación contraria en la mono- ción es proporcional a la raíz cuadrada de la longitud de la
grafía. La inyección puede realizarse directamente en la columna. Para columnas rellenas, el caudal del gas portador
cabeza de la columna utilizando una jeringa o una válvula se expresa generalmente en mililitros por minuto a la pre-
de inyección, o en una cámara de vaporización que puede sión atmosférica y a la temperatura ambiente. El caudal se
estar equipada con un divisor de flujo. mide a la salida del detector, bien con un dispositivo mecá-
nico calibrado o con un tubo de burbujas, mientras la colum-
Las inyecciones de la fase vapor pueden ser efectuadas por na está a la temperatura de funcionamiento. La velocidad
sistemas de inyección estáticos o dinámicos en el espacio en lineal del gas portador a través de una columna rellena es
cabeza. inversamente proporcional a la raíz cuadrada del diámetro
Los sistemas de inyección dinámicos en el espacio en cabe- interno de la columna para un caudal dado. Caudales de 60
za («purge and trap») incluyen un dispositivo de burbujeo ml/min en una columna de 4 mm de diámetro interno y 15
por el que las sustancias volátiles en solución son arrastra- ml/min en una columna de 2 mm de diámetro interno, pro-
das hacia una columna absorbente mantenida a baja tempe- porcionan velocidades lineales idénticas y por tanto tiempos
ratura donde son absorbidas. Las sustancias retenidas son a de retención similares.
continuación desorbidas en la fase móvil por un calenta- Generalmente se emplean helio o nitrógeno como gas porta-
miento rápido de la columna absorbente. dor para columnas rellenas, mientras que generalmente los
Los sistemas de inyección estáticos en el espacio en cabeza gases portadores utilizados para columnas capilares son
incluyen una cámara de calentamiento de las muestras ter- nitrógeno, helio e hidrógeno.
mostáticamente controlada en la cual se colocan viales Detectores
cerrados que contienen muestras sólidas o líquidas durante
un período de tiempo fijado, para permitir que los compo- Los más utilizados son los detectores de ionización en
nentes volátiles de la muestra alcancen el equilibrio entre la llama, pero dependiendo de la finalidad del análisis pueden
fase no gaseosa y la fase vapor. Después de que se establez- utilizarse otros detectores incluyendo: de captura de electro-
ca el equilibrio, se inyecta en el cromatógrafo de gases una nes, de nitrógeno-fósforo, de espectrometría de masas, de
cantidad predeterminada del espacio en cabeza del vial. conductividad térmica, de espectrometría en el infrarrojos
con transformada de Fourier y otros.
Fases estacionarias
PROCEDIMIENTO
Las fases estacionarias están contenidas en columnas que
pueden ser: Equilibrar la columna, la cámara de inyección y el detector
a las temperaturas y caudales de los gases especificados en
— una columna capilar de sílice fundida cuya pared está la monografía hasta que se consiga una línea base estable.
revestida con la fase estacionaria, Preparar la o las disoluciones problema y la o las disolucio-
nes de referencia como se prescribe. Las disoluciones deben
— una columna rellena con partículas inertes impregnadas estar exentas de partículas sólidas.
con la fase estacionaria,
— una columna rellena con la fase estacionaria sólida. descritos en el capítulo Técnicas de separación cromatográ-
fica (2.2.46). En este capítulo se incluyen también los lími-
Las columnas capilares tienen un diámetro interno (∅) de tes entre los que pueden variar los parámetros para satisfa-
0,1 mm a 0,53 mm y una longitud de 5 m a 60 m. La fase cer los criterios de idoneidad del sistema.
líquida o estacionaria, que puede estar químicamente unida
a la superficie interna, es una película de 0,1 µm a 5,0 µm
de espesor. CROMATOGRAFÍA DE GASES EN EL ESPACIO
EN CABEZA
Las columnas rellenas, de vidrio o metálicas, tienen una lon-
gitud generalmente de 1 m a 3 m con un diámetro interno La cromatografía de gases en el espacio en cabeza es una
(∅) de 2 mm a 4 mm. Las fases estacionarias consisten técnica particularmente adecuada para la separación y deter-
generalmente en polímeros porosos o soportes sólidos minación de compuestos volátiles presentes en muestras
impregnados con la fase líquida. sólidas o líquidas. Este método se basa en el análisis de una
Los soportes para análisis de compuestos polares en colum- fase vapor en equilibrio con una fase sólida o líquida.
nas rellenas con una fase estacionaria de baja polaridad y
baja capacidad deben ser inertes para evitar una excesiva APARATO
prolongación de los picos. La reactividad de los materiales
de soporte puede reducirse silanizándolos antes del recubri- El equipo consta de un cromatógrafo de gases al que se
miento con la fase líquida. Generalmente se utiliza tierra de adapta un dispositivo para la introducción de la muestra,

2.2.29. Cromatografía de líquidos REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
que puede estar conectado a un módulo de programación Alternativamente representar las medias de las lecturas
que controle automáticamente la presión y la temperatura. obtenidas frente a la cantidad añadida de la sustancia a
Si fuera necesario, se puede acoplar un dispositivo de elimi- determinar. Unir los puntos y extrapolar la línea hasta la
nación de disolventes. intersección con el eje de concentraciones. La distancia
2. Métodos
analíticos
entre este punto y la intersección de los ejes representa la

La muestra a analizar se introduce en un envase provisto de concentración de la sustancia a determinar en la preparación
un obturador adecuado que lo cierra y de un sistema de vál- a examinar.
vulas que permite la entrada del gas portador. El envase se
coloca en una cámara termostatizada a la temperatura pres-
crita para la muestra que se examina. Agotamientos sucesivos (extracción múltiple en el espa-
cio en cabeza)
La muestra se deja a esta temperatura el tiempo suficiente
para permitir que se establezca el equilibrio entre la fase Cuando se prescriba este método, el procedimiento se halla-
sólida o líquida y la fase gaseosa. rá enteramente descrito en la monografía.
El gas portador se introduce en el envase y, después del

tiempo prescrito, se abre la válvula apropiada, para permitir
el paso del gas que se expande hacia la columna cromato- 2.2.29. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
gráfica, arrastrando los componentes volátiles con él.
En lugar de utilizar un cromatógrafo especialmente adapta- La cromatografía de líquidos (CL) es una técnica de separa-
do para la introducción de las muestras, también pueden uti- ción cromatográfica basada en la diferente distribución de
lizarse jeringas herméticas y un cromatógrafo convencional. las especies entre dos fases no miscibles, en la que la fase
En este caso, el equilibrio entre las dos fases se lleva a cabo móvil es un líquido que atraviesa por percolación una
fase estacionaria contenida en una columna.
en una cámara separada y la fase vapor se transfiere a la
columna, tomando las precauciones necesarias para evitar La cromatografía de líquidos se basa principalmente en
cualquier modificación del equilibrio. mecanismos de adsorción, de distribución de masas, de
intercambio iónico, de exclusión por tamaño molecular o
PROCEDIMIENTO de interacción estereoquímica.
Ajustar las condiciones de trabajo del aparato, a fin de obte- APARATO

ner una respuesta satisfactoria, utilizando las disoluciones
de referencia. Está constituido generalmente por un sistema de bombeo,
un inyector, una columna cromatográfica (puede utilizarse
un controlador de la temperatura de la columna), un detec-
Calibrado directo
tor y un sistema de recogida de datos (o un integrador o
Introducir por separado, y en envases idénticos, la prepara- registrador). La fase móvil suministrada a través de uno
ción a examinar y cada una de las preparaciones de referen- o varios depósitos circula a través de la columna, a un flujo
cia, según las condiciones descritas en la monografía y evi- constante, y a continuación a través del detector.
tando el contacto entre la muestra y el dispositivo de
inyección. Sistemas de bombeo
Cerrar herméticamente los envases y colocarlos en la cáma- En la CL se requieren sistemas de bombeo para suministrar
ra termostatizada a la temperatura y presión prescritas en la la fase móvil a un caudal constante. Conviene que las fluc-
monografía; tras alcanzarse el equilibrio, proceder al análi- tuaciones de presión sean mínimas, por ejemplo haciendo
sis cromatográfico en las condiciones prescritas. pasar el disolvente a presión a través de un dispositivo que
amortigüe las pulsaciones. Los tubos y conexiones deben
ser capaces de resistir las presiones desarrolladas por el sis-
Adiciones de patrones
tema de bombeo. Las bombas para la CL pueden estar pro-
En una serie de envases apropiados idénticos, introducir vistas de un equipo para «purgar» el sistema de las burbujas
volúmenes iguales de la preparación a examinar. Añadir a de aire atrapadas.
todos los envases, excepto a uno, cantidades crecientes de Los sistemas dirigidos por microprocesadores son capaces
una preparación de referencia, de concentración conocida, de suministrar exactamente una fase móvil de composición
de la sustancia a examinar. De este modo se obtienen una constante (elución isocrática) o variable (elución en gra-
serie de preparaciones que contienen cantidades progresiva- diente), de acuerdo con un programa definido. En el caso de
mente crecientes de dicha sustancia. la elución en gradiente, existen sistemas de bombeo que
Cerrar herméticamente los envases y colocarlos en la cáma- suministran el o los disolventes de diversos depósitos,
pudiendo conseguir la mezcla de los disolventes bien aguas
ra termostatizada, según las condiciones de temperatura y
arriba (baja presión) o bien aguas abajo (alta presión) de la
presión descritas en la monografía; tras alcanzarse el equili-
o las bombas.
brio, proceder al análisis cromatográfico en las condiciones
prescritas.
Inyectores
Calcular la ecuación lineal de regresión utilizando el méto-
do de los mínimos cuadrados y a partir de ella obtener la La disolución de la muestra se introduce en la fase móvil
concentración de la sustancia a determinar en la preparación fluente en la cabeza de la columna, o cerca de ella, utilizan-
a examinar. do un sistema de inyección que puede trabajar a alta pre-

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.29. Cromatografía de líquidos
sión. Se utilizan dispositivos de bucle fijo y volumen varia- En ciertos casos es aplicable el análisis que utiliza cromato-
ble que funcionan manualmente o por un inyector de mues- grafía en fase normal con sílice sin modificar, grafito poroso
tras automático. El rellenado parcial de los bucles o sílice polar químicamente modificada, por ejemplo ciano-
de forma manual puede conducir a una menor precisión del propilo o diol, como fase estacionaria con una fase móvil no
2. Métodos
analíticos
volumen de inyección. polar.
En las separaciones analíticas, el tamaño de las partículas
Fases estacionarias de las fases estacionarias más corrientemente utilizadas
varía entre 3 µm y 10 µm. Las partículas pueden ser esfé-
En la CL se utilizan muchos tipos de fases estacionarias, ricas o irregulares, de porosidad y superficie específica
principalmente: variables. Estos parámetros contribuyen al comportamien-
to cromatográfico de una fase estacionaria particular. En
— sílice, alúmina o grafito poroso, utilizado en cromato- el caso de fases inversas, son factores determinantes adi-
grafía en fase normal, en la que la separación se basa en cionales la naturaleza de la fase estacionaria, el grado de
las diferencias de adsorción y de distribución de masas; unión, por ejemplo expresado como la carga de carbono,
— resinas o polímeros con grupos ácidos o básicos, utiliza- y el hecho de que la fase estacionaria esté protegida o no
dos en cromatografía de intercambio iónico, en la que la en los extremos («end-capping», es decir, sililación de los
grupos silanol residuales). Cuando están presentes grupos
separación se basa en la competición entre los iones que
silanol residuales puede producirse una excesiva prolon-
son separados y los que permanecen en la fase móvil;
gación de los picos, particularmente de las sustancias
— sílice o polímeros porosos, utilizados en cromatografía de básicas.
exclusión por tamaños, en la que la separación se basa en Para cromatografía analítica se utilizan columnas, de acero
las diferencias entre los volúmenes de las moléculas, lo inoxidable salvo prescripción contraria en la monografía, de
que corresponde a una exclusión estérica; longitud y diámetro interno (∅) variables. Las columnas
— una variedad de soportes químicamente modificados pre- con diámetros internos menores de 2 mm se denominan con
parados a partir de polímeros, sílice o grafito poroso, uti- frecuencia microcolumnas. La temperatura de la fase móvil
lizada en CL en fase inversa, en la que la separación se y de la columna deben mantenerse constantes durante el
basa principalmente en el reparto de las moléculas entre análisis. La mayor parte de las separaciones se realizan a
temperatura ambiente, pero las columnas pueden calentarse
la fase móvil y la fase estacionaria;
para obtener mayores eficacias. Se recomienda no calentar
— fases estacionarias químicamente modificadas especia- las columnas por encima de 60 ºC debido a la degradación
les, por ejemplo derivados de la celulosa o la amilosa, potencial de la fase estacionaria o a que se produzcan cam-
proteínas o péptidos, ciclodextrinas, etc., para la separa- bios en la composición de la fase móvil.
ción de enantiómeros (cromatografía quiral).
Fases móviles
La mayoría de las separaciones se basan en mecanismos de
reparto que utilizan sílice químicamente modificada como Para la cromatografía en fase normal, se emplean disolventes
fase estacionaria y disolventes polares como fase móvil. La menos polares. La presencia de agua en la fase móvil debe ser
superficie del soporte, por ejemplo los grupos silanol de la estrictamente controlada para obtener resultados reproduci-
sílice, se hacen reaccionar con diversos reactivos de silano bles. En la CL en fase inversa, se emplean fases móviles acuo-
para producir derivados de sililo unidos covalentemente que sas, con o sin modificadores orgánicos.
abarcan un número variable de sitios activos sobre la super-
ficie del soporte. La naturaleza de la fase unida es un pará- Los componentes de la fase móvil se filtran generalmente
metro importante para determinar las propiedades de sepa- para eliminar partículas mayores que 0,45 µm. Las fases
ración del sistema cromatográfico. móviles de múltiples componentes se preparan midiendo los
volúmenes requeridos (a menos que las proporciones se indi-
A continuación se muestran fases unidas generalmente utili- quen en masa) de los componentes individuales, seguido por
zadas: mezclamiento. Alternativamente, los disolventes pueden ser
suministrados por bombas individuales controladas por vál-
octilo = Si-(CH2)7-CH3 C8 vulas dosificadoras efectuándose el mezclamiento de acuer-
do con las proporciones deseadas. Los disolventes se desga-
octadecilo = Si-(CH2)17-CH3 C18 sifican normalmente antes del bombeo por paso de una
fenilo = Si-(CH2)n-(C6H5) C6H5 corriente de helio, tratamiento con ultrasonido o utilización
de módulos de membrana/vacío integrados para evitar la cre-
cianopropilo = Si-(CH2)3-CN CN ación de burbujas de gas en la cubeta del detector.
aminopropilo = Si-(CH2)3-NH2 NH2 Los disolventes utilizados para preparar la fase móvil están
normalmente exentos de estabilizadores y son transparentes
diol = Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH a la longitud de onda de la detección, si se emplea un detec-
tor ultravioleta. Los disolventes y otros componentes emple-
Salvo indicación contraria del fabricante, las columnas en ados deben ser de calidad apropiada. El ajuste del pH, si
fase inversa a base de sílice se consideran estables en fases fuera necesario, debe efectuarse utilizando sólo el compo-
móviles que tengan un pH aparente en el intervalo de 2,0 a nente acuoso de la fase móvil y no la mezcla. Si se utilizan
8,0. Las columnas que contienen grafito poroso o partículas soluciones tampón, el lavado adecuado del sistema se reali-
de materiales polímeros, tales como copolímero de estireno- za con una mezcla de agua y el modificador orgánico de la
divinilbenceno, son estables en un intervalo de pH más fase móvil (5 por ciento V/V) para evitar la cristalización de
amplio. las sales una vez finalizada la cromatografía.

2.2.30. Cromatografía de exclusión por tamaño m... REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
Las fases móviles pueden contener otros componentes, por diámetro interno (∅) variables, rellena con un material capaz
ejemplo un contra-ion para la cromatografía de apareamien- de separar las sustancias en un intervalo adecuado de tamaños
to de iones o un selector quiral para la cromatografía que moleculares y a través del cual se hace circular el eluyente con
utiliza una fase estacionaria aquiral. un caudal constante. La entrada de la columna puede estar
2. Métodos
analíticos
unida a un dispositivo apropiado para la aplicación de la mues-

Detectores tra, como puede ser un adaptador de flujo, una jeringa que
atraviesa un tabique o una válvula de inyección. La columna
Los detectores más comúnmente utilizados son los espec- puede estar también conectada a una bomba adecuada para
trofotómetros en el ultravioleta/visible (UV/Vis), incluyen- controlar con precisión el flujo del eluyente. Alternativamente,
do detectores con diodos. También pueden utilizarse espec- la muestra puede aplicarse directamente sobre la superficie del
trofotómetros de fluorescencia, refractómetros diferen- soporte drenado o, cuando la muestra es más densa que el elu-
ciales, detectores electroquímicos, espectrómetros de yente, puede depositarse debajo del eluyente. La salida de la
masas, detectores de difusión de la luz, detectores de radiac- columna normalmente está conectada a un detector apropiado
tividad u otros detectores especiales. acoplado a un registrador automático para la medida de las
concentraciones relativas de los compuestos separados de la
muestra. El funcionamiento de los detectores generalmente se
PROCEDIMIENTO
basa en fotometría, refractometría o luminiscencia. Si es nece-
Equilibrar la columna con la fase móvil y el caudal prescri- sario, puede conectarse también al sistema un colector auto-
tos, a temperatura ambiente o a la temperatura especificada mático de fracciones.
en la monografía, hasta que se consiga una línea base esta- El soporte puede ser blando, como es el caso de los geles hin-
ble. Preparar la o las disoluciones de la sustancia a examinar chados, o rígido constituido por un material como puede ser
y de la sustancia o sustancias de referencia requeridas. Las vidrio, sílice o un polímero orgánico reticulado compatible
disoluciones deben estar exentas de partículas sólidas. con los disolventes. Los soportes rígidos requieren sistemas
Los criterios para determinar la idoneidad del sistema están presurizados que permitan separaciones más rápidas. La elec-
descritos en el capítulo Técnicas de separación cromatográ- ción de la fase móvil depende de la naturaleza de la muestra,
fica (2.2.46). En este capítulo se incluyen también los lími- del medio de separación y del método de detección. Antes de
tes entre los que pueden variar los diferentes parámetros llevar a cabo la separación, el soporte debe tratarse y la
para satisfacer los criterios de idoneidad del sistema. columna rellenarse según las indicaciones descritas en la
monografía o de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
descritos en el capítulo Técnicas de separación cromatográ-
2.2.30. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN fica (2.2.46). En este capítulo se incluyen también los lími-
POR TAMAÑO MOLECULAR tes entre los que pueden variar los diferentes parámetros
para satisfacer los criterios de idoneidad del sistema.
La cromatografía de exclusión por tamaño molecular es una
técnica cromatográfica para la separación de moléculas en Determinación del contenido relativo de los componen-
disolución en función de su tamaño. En el caso de fases tes de las mezclas
móviles orgánicas, este método de separación se denomina
cromatografía de permeabilidad en gel, y en el caso de fases Proceder a la separación según las indicaciones de la mono-
móviles acuosas, cromatografía de filtración en gel. La grafía. Si es posible, seguir la elución de los componentes
muestra se introduce en una columna que contiene un sopor- mediante un registro continuo y medir la superficie de los
te constituido por un gel o por un material de partículas picos correspondientes. Si la detección de la muestra se rea-
porosas y es eluida por la fase móvil a través de la columna. liza basándose en alguna propiedad fisicoquímica para la
La separación de las moléculas, en función de su tamaño, que todos los componentes muestran respuestas equivalen-
tiene lugar por repetidos intercambios de las moléculas del tes (por ejemplo, si poseen la misma absorbancia específi-
soluto entre el disolvente de la fase móvil y el mismo disol- ca), calcular la cantidad relativa de cada componente divi-
vente inmovilizado en el interior de los poros del soporte diendo la superficie del pico correspondiente por la suma de
(fase estacionaria). El intervalo de tamaños de poro del las superficies de los picos de todos los componentes a exa-
material soporte determina el intervalo de tamaños molecu- minar. Si la respuesta a la propiedad utilizada para la detec-
lares dentro del que puede tener lugar la separación. ción de los componentes que se desean examinar no es equi-
valente para todos ellos, calcular su concentración mediante
Las moléculas cuyo tamaño sea suficientemente pequeño curvas de calibrado obtenidas con los patrones de calibrado
para permitir su penetración en el interior de todos los poros prescritos en la monografía.
del soporte eluyen de la columna en el volumen total de per-
meabilidad (Vt). Por otra parte, las moléculas cuyo tamaño
sea aparentemente superior al tamaño máximo de poro del Determinación de masas moleculares
soporte, migran a lo largo de la columna pasando únicamen-
te a través de los espacios entre las partículas del soporte sin La cromatografía de exclusión por tamaño molecular puede
ser retenidas y eluyen de la columna en el volumen de exclu- utilizarse para la determinación de masas moleculares por
sión (V0, volumen intersticial). La separación según el tama- comparación con patrones de calibrado apropiados, especi-
ño molecular tiene lugar entre el volumen de exclusión y el ficados en la monografía. Los volúmenes de retención de
volumen total de permeabilidad; de hecho, generalmente los patrones de calibrado se pueden representar en función
tiene lugar en los primeros dos tercios de este intervalo. del logaritmo de sus masas moleculares. La representación
gráfica se aproxima normalmente a una línea recta, entre los
Aparato. Está constituido esencialmente por una columna límites de exclusión y volumen total de permeabilidad para
cromatográfica, si es necesario termostatizada, de longitud y el medio de separación utilizado. Las masas moleculares se

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.31. Electroforesis
pueden determinar a partir de esta curva de calibrado. El mixto, introduce numerosos factores adicionales que modi-
calibrado de la masa molecular no es válido más que para fican la movilidad:
un sistema dado de soluto macromolecular y disolvente, uti-
lizado en las condiciones experimentales prescritas. a) debido a las sinuosidades de los canalículos del sopor-
2. Métodos
te, la distancia recorrida aparentemente es menor que la
analíticos
distancia real;
Determinación de la distribución de tamaños molecula-
res de polímeros b) algunos medios soporte no son eléctricamente neutros.
Como el medio es una fase estacionaria, se provoca en
La cromatografía de exclusión por tamaño molecular puede muchas ocasiones un flujo electroendosmótico impor-
aplicarse a la determinación de la distribución del tamaño tante;
molecular de polímeros. Sin embargo, la comparación entre
distintas muestras puede no ser válida más que para resul- c) cualquier efecto de calentamiento debido al efecto joule
tados obtenidos en las mismas condiciones experimentales. puede causar evaporación del líquido desde el medio
La naturaleza del material utilizado para el calibrado y los soporte y por capilaridad, se produce un movimiento de
métodos de determinación de la distribución de los tama- la disolución desde los extremos hacia el centro. La
ños moleculares de los polímeros se indican en la mono- fuerza iónica, por tanto, tiende a incrementarse progre-
grafía. sivamente.
La velocidad de migración depende de cuatro factores prin-
cipales: movilidad de la partícula cargada, flujo electroen-
2.2.31. ELECTROFORESIS dosmótico, flujo de evaporación y campo eléctrico. Por ello
se necesita trabajar en condiciones experimentales clara-
mente definidas y utilizar, siempre que sea posible, sustan-
PRINCIPIOS GENERALES cias de referencia.
Las partículas cargadas, disueltas o dispersadas en una diso- Un equipo de electroforesis consta de:
lución electrolítica emigran hacia el electrodo de polaridad
opuesta, bajo la acción de un campo eléctrico. En la electro- — Un generador de corriente continua, cuyo voltaje se
foresis en gel, el desplazamiento de las partículas se retarda pueda controlar y, si es posible, estabilizar.
por las interacciones con la matriz de gel que constituye el
medio de migración y se comporta como un tamiz molecu- — Una cubeta de electroforesis. Generalmente es rectan-
lar. Las interacciones con las fuerzas eléctricas y la tamiza- gular, de vidrio o de plástico rígido, con dos comparti-
ción molecular dan lugar a una velocidad de migración dife- mentos separados, el anódico y el catódico, que contie-
rencial según el tamaño, la forma y la carga de las nen la disolución de electrolito. En cada compartimento
partículas. Las diferentes macromoléculas presentes en una se introduce un electrodo de platino o de grafito, por
mezcla emigrarán a diferentes velocidades durante el proce- ejemplo. Se conectan por medio de un circuito conve-
so electroforético, debido a sus distintas propiedades fisico- nientemente aislado a los correspondientes terminales
químicas, obteniéndose separadas en fracciones concretas. de la fuente de alimentación para constituir el ánodo y
Las separaciones electroforéticas se pueden realizar sin el cátodo. El nivel de líquido en ambos compartimentos
soporte (por ejemplo la separación por electroforesis capilar se debe mantener igualado para prevenir efectos sifón.
en disolución libre) o en medios estabilizantes como placas
de capa fina, películas y geles. La cámara electroforética se cierra con una tapa herméti-
ca que mantiene un ambiente saturado de humedad
durante el proceso y reduce la evaporación del disolven-
ELECTROFORESIS DE LIBRE MIGRACIÓN te. Se puede utilizar un dispositivo de seguridad que per-
O FRONTAL mita cortar el paso de corriente eléctrica cuando se levan-
Este método se utiliza fundamentalmente para determinar te la tapa. Si la potencia eléctrica que pasa a través del
movilidades electroforéticas y experimentalmente se carac- soporte excede 10 W, es preferible refrigerar el soporte.
teriza por obtenerse medidas directas y reproducibles. Se — Un dispositivo portasoportes:
aplica sobre todo a sustancias de peso molecular alto y poco
difundibles. Las bandas se localizan en principio mediante Electroforesis en tiras. La tira soporte, previamente
un método físico tal como refractometría o conductimetría. humedecida con la misma disolución conductora y con
Después de la aplicación de un campo eléctrico definido los extremos sumergidos en los correspondientes com-
durante un tiempo exactamente medido, se observan las partimentos electródicos, se fija y se tensa sobre un por-
nuevas bandas obtenidas y sus posiciones respectivas. Las tasoporte adecuado diseñado para prevenir la difusión
condiciones del procedimiento operativo utilizado deben ser del electrolito conductor de la corriente eléctrica, tal
tales que permitan obtener tantas bandas como componen- como un bastidor horizontal, un caballete en V inverti-
tes hay en la muestra. da o una superficie uniforme con puntos de contacto a
intervalos adecuados.
ELECTROFORESIS SOBRE UN SOPORTE
O ELECTROFORESIS DE ZONA Electroforesis en gel. El dispositivo consta esencial-
mente de una placa de vidrio (por ejemplo, un portaob-
Este método requiere la utilización de cantidades de mues- jetos de microscopio) sobre la que se deposita, en la
tra reducidas. totalidad de su superficie, una capa firmemente adheri-
da de gel de un espesor uniforme. La conexión entre el
La naturaleza del soporte tales como papel, gel de agar, ace- gel y la disolución conductora se realiza de varios
tato de celulosa, almidón, agarosa, metacrilamida y gel modos, dependiendo del tipo de equipo utilizado. Se

2.2.31. Electroforesis REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
deben tomar precauciones para evitar la condensación ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON
de humedad o el desecado de la capa sólida. DODECILSULFATO DE SODIO (SDS-PAGE)
— Dispositivo de medida o medios de detección. Campo de aplicación. La electroforesis en gel de polia-
2. Métodos
crilamida se utiliza con fines de caracterización cualitativa

analíticos
Método. Introducir la disolución del electrolito en los com- de proteínas en preparaciones biológicas, control de pureza
partimentos electródicos. Colocar el soporte adecuadamente y determinaciones cuantitativas.
impregnado con electrolito en la cubeta según las condiciones
prescritas para el tipo de equipo utilizado. Localizar la zona de Objetivo. La electroforesis en gel analítica es un método
aplicación y depositar la muestra a analizar. Aplicar la corrien- apropiado para identificar y controlar la homogeneidad de
te eléctrica durante el tiempo prescrito. Después de desconectar las proteínas en preparaciones farmacéuticas. El método se
la corriente eléctrica, sacar el soporte de la cubeta electroforéti- utiliza en rutina para estimar los pesos moleculares de sub-
ca, secar y revelar. unidades proteicas y para determinar las subunidades que
componen las proteínas purificadas.
ELECTROFORESIS SOBRE GEL CILÍNDRICO DE Se dispone en el mercado de una amplia variedad de geles y
POLIACRILAMIDA de reactivos que se pueden utilizar de un modo alternativo a
los descritos en este texto, siempre y cuando se obtengan
En la electroforesis sobre un gel cilíndrico de poliacrilami- resultados equivalentes y que sean satisfactorios con las
da, la fase estacionaria está constituida por un gel preparado condiciones de validación descritas más adelante en el apar-
con una mezcla de acrilamida y N,N´-metilenobisacrilami- tado «Validación del ensayo».
da; los geles se preparan en tubos, generalmente de 7,5 cm
de longitud y 0,5 cm de diámetro interno; en cada tubo se
aplica una única muestra. CARACTERÍSTICAS DE LOS GELES
DE POLIACRILAMIDA
Equipo. Consta de dos compartimentos destinados a las
disoluciones tampón, fabricados con un material apropiado tal Las propiedades de tamización de los geles de poliacrilami-
como poli(metacrilato de metilo), dispuestos en posición ver- da se deben a su particular estructura, una red tridimensio-
tical uno encima de otro. Está provisto cada uno de un electro- nal de fibras y de poros obtenida mediante enlaces cruzados
do de platino. Los electrodos se conectan con una fuente de de unidades de bisacrilamida bifuncionales con cadenas
adyacentes de poliacrilamida. La polimerización se cataliza
alimentación que permite trabajar a intensidad constante o a
mediante un producto generador de radicales libres formado
voltaje constante. Para los geles cilíndricos, el compartimento
por persulfato de amonio y tetrametiletilendiamina.
superior se encuentra provisto en su base de varios dispositi-
vos para los tubos situados equidistantes al electrodo. Si se incrementa la concentración de acrilamida del gel, dis-
minuye su tamaño de poro efectivo. El tamaño de poro efec-
Método. De un modo general, se recomienda eliminar los tivo se define, desde el punto de vista operativo, por sus pro-
gases de las disoluciones antes de la polimerización y utilizar piedades de tamización molecular, es decir, la resistencia
el gel inmediatamente después de su preparación. Preparar la con la que se opone a la migración de macromoléculas. Las
mezcla de geles siguiendo las indicaciones de la monografía. concentraciones de acrilamida que se pueden utilizar se
Verter la mezcla de gel en tubos adecuados, tapados en la encuentran dentro de unos límites. A altas concentraciones,
parte inferior, igualar el nivel de gel en cada uno de los tubos los geles se rompen con mayor facilidad y se manejan con
y rellenar hasta 1 cm del borde superior del tubo. Evitar que más dificultad. Cuando el tamaño de poro decrece, la velo-
queden burbujas de aire atrapadas en el interior de los tubos. cidad de migración de la proteína a través del gel decrece.
Cubrir la mezcla de gel con una capa de agua R para impedir La resolución del método para un producto proteico deter-
el contacto con el aire y dejar reposar para que se produzca la minado se puede optimizar ajustando el tamaño del poro del
gelificación. Generalmente la formación de gel requiere alre- gel, modificando la concentración de acrilamida. Por tanto,
dedor de 30 min y se completa cuando se produce una nítida las características físicas de un gel determinado dependen
interfase entre el gel y la capa de agua. Eliminar esta capa de de su contenido de acrilamida y de bisacrilamida.
agua. Rellenar el compartimento inferior con la disolución
tampón prescrita y quitar los tapones de los tubos. Introducir Además de la composición del gel, el estado de la proteína
los tubos en los dispositivos del compartimento superior y constituye un factor importante que afecta a su movilidad
ajustarlos de modo que la parte inferior de los tubos se electroforética. Ésta, en el caso de las proteínas, depende
encuentre inmersa en la disolución tampón del compartimen- del pK de los grupos cargados y del tamaño de la molécu-
to inferior. Rellenar los tubos cuidadosamente con la disolu- la. Está igualmente afectada por la naturaleza, concentra-
ción tampón prescrita. Preparar las disoluciones problemas y ción y pH del tampón, por la temperatura, la intensidad del
de referencia con el colorante marcador indicado y aumentar campo eléctrico, así como por la naturaleza del material
la densidad de estas disoluciones por adición de sacarosa R, del soporte.
por ejemplo. Aplicar las disoluciones en la superficie del gel
utilizando un tubo diferente para cada disolución. Añadir la ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON
misma disolución tampón en el compartimento superior. DESNATURALIZACIÓN
Conectar los electrodos a la fuente de alimentación y desarro-
llar la electroforesis a la temperatura y al voltaje o intensidad El método, descrito aquí como un ejemplo, se utiliza para el
de corriente constantes prescritos en la monografía. Desco- análisis de monómeros polipeptídicos de peso molecular
nectar la fuente de alimentación cuando el colorante marca- comprendido entre 14.000 y 100.000 daltons. Es posible
dor haya emigrado casi hasta el compartimento inferior. aumentar este intervalo por diferentes técnicas (por ejemplo
Separar del equipo inmediatamente cada tubo y extraer el empleo de geles de composición en gradiente o de sistemas
gel. Localizar las bandas en el electroforegrama tal como se tampón específicos), pero estas técnicas no se tratan en este
prescriba en la monografía. capítulo.

La electroforesis en gel de poliacrilamida con desnaturaliza- por lo tanto, no pueden unirse al detergente en una propor-
ción utilizando dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es la ción de masa contante. Esto hace que la determinación del
técnica de electroforesis más utilizada para la evaluación de peso molecular de estas moléculas por SDS-PAGE sea más
la calidad farmacéutica de productos proteicos y por ello se difícil que los análisis de polipéptidos totalmente desnatura-
2. Métodos
analíticos
tratará en el presente texto. De modo general, la electroforesis lizados, ya que es necesario que tanto las proteínas patrón
de proteínas analítica se realiza en geles de poliacrilamida en como las proteínas problemas presenten configuraciones
condiciones en las que se asegure la disociación de las proteí- similares para que se puedan comparar. Sin embargo, la
nas en sus subunidades polipeptídicas individuales y que limi- obtención en el gel de una sola banda coloreada es un crite-
ten los fenómenos de agregación. Se utiliza frecuentemente rio de pureza.
para disociar las proteínas antes de su aplicación en el gel el
dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente aniónico fuerte,
en combinación con calor. Los polipéptidos desnaturalizados CARACTERÍSTICAS DE LA ELECTROFORESIS EN GEL
se unen al SDS, adquieren carga negativa y presentan una CON SISTEMA DE TAMPÓN DISCONTINUO
relación carga/masa constante, cualesquiera que sea el tipo de El método electroforético más difundido para la caracteriza-
proteína considerada. La cantidad de SDS es casi siempre ción de mezclas complejas de proteínas se basa en el empleo
proporcional al peso molecular del polipéptido y es indepen- de un sistema de tampón discontinuo consistente en dos
diente de su secuencia, ya que los complejos SDS-polipépti- geles contiguos pero distintos: un gel inferior, llamado gel de
do emigran a través de los geles de poliacrilamida con movi- separación o de resolución, y otro superior, gel de apilamien-
lidades que dependen del tamaño del polipéptido. to. Estos dos geles presentan porosidad, pH y fuerzas iónicas
Las movilidades electroforéticas de los complejos detergente- diferentes. Además, se utilizan iones con diferentes movili-
polipéptido resultantes presentan siempre la misma relación dades iónicas en el gel y en los tampones electródicos. La
funcional con los pesos moleculares. La migración de los discontinuidad del sistema tampón provoca una concentra-
complejos SDS se efectúa de forma previsible hacia el ánodo, ción de las muestras de mayor tamaño en el gel de apila-
miento y por lo tanto se mejora la resolución. Cuando se apli-
a una velocidad superior para los complejos de peso molecu-
ca la corriente eléctrica, se desarrolla un gradiente de
lar más bajo que para aquellos con peso molecular alto. Así es
potencial negativo a través de la disolución problema que
posible estimar el peso molecular de una proteína a partir de
conduce a las proteínas hacia el gel de apilamiento. Los iones
su movilidad relativa en un método SDS-PAGE calibrado,
glicinato contenidos en el tampón electródico empujan a las
siendo la presencia de una única banda en dicho gel un crite-
proteínas hacia el gel de apilamiento. Se forma rápidamente
rio de pureza.
una zona de frente móvil cuya cabecera está constituida por
Sin embargo, las eventuales modificaciones del esqueleto iones cloruro de alta movilidad, seguidos de iones glicinato,
polipeptídico, por ejemplo una N o una O-glicosilación, tie- más lentos en la cola. Se produce un gradiente de alto voltaje
nen un impacto significativo sobre el peso molecular apa- localizado entre los frentes iónicos de cabeza y de cola, provo-
rente de la proteína, ya que el SDS no se une del mismo cando que los complejos SDS-proteína se concentren en una
modo a los grupos glucídicos que a los grupos polipeptídi- zona muy estrecha (apilamiento) y emigren entre las fases de
cos, por lo que en este caso no se mantiene constante la rela- cloruro y de glicinato. En gran medida, independientemente
ción carga/masa. El peso molecular aparente de las proteí- del volumen de muestra depositado, el conjunto de complejos
nas que han sufrido modificaciones post-translacionales no SDS-proteína se condensan en una región muy estrecha y
es un reflejo real de la masa de la cadena polipeptídica. penetran en el gel de separación en forma de una banda estre-
cha, bien definida y de alta densidad proteica. El gel de apila-
miento, de tamaño de poro grande, no retarda la migración de
Condiciones reductoras la mayoría de las proteínas y actúa principalmente como
medio anticonvectivo. En la interfase de los dos geles, de api-
La asociación de las subunidades polipeptídicas y la estruc- lamiento y de resolución, las proteínas experimentan un incre-
tura tridimensional de las proteínas se mantiene fundamen- mento brusco de retardo electroforético debido al menor tama-
talmente por la existencia de enlaces disulfuro. Uno de los ño de poro del gel de resolución. Una vez que se encuentran
objetivos de la separación SDS-PAGE en condiciones en este gel, las proteínas continúan avanzando lentamente por
reductoras es la ruptura de esta estructura por reducción de el efecto de tamización molecular que ejerce la matriz. Los
los enlaces disulfuro. La desnaturalización y disociación iones glicinato migran por delante de las proteínas, por lo que
completa de las proteínas por tratamiento con 2-mercapto- éstas se mueven en un medio de pH uniforme formado por el
etanol o ditiotreitol (DTT) dará lugar a un desdoblamiento tris(hidroximetil)aminometano y la glicina. La tamización
de la cadena polipeptídica, seguido de la formación de un molecular hace que la separación de los complejos SDS-poli-
complejo con el SDS. En estas condiciones, el peso molecu- péptido se base en sus correspondientes pesos moleculares.
lar de las subunidades polipeptídicas se puede calcular por
regresión lineal en presencia de patrones con pesos molecu-
lares apropiados. PREPARACIÓN DE GELES DE POLIACRILAMIDA SDS
VERTICALES CON TAMPÓN DISCONTINUO
Condiciones no reductoras Conjunto de piezas para moldear el gel
Para algunos análisis, no es aconsejable la disociación com- Limpiar con un detergente suave las dos placas de vidrio (de
pleta de la proteína en subunidades peptídicas. Si no se utili- un tamaño, por ejemplo, de 10 cm × 8 cm), el peine de poli-
zan agentes reductores como el 2-mercaptoetanol o el DDT, tetrafluoroetileno, los dos espaciadores y el tubo de caucho
los enlaces covalentes disulfuro permanecen intactos mante- de silicona (de 0,6 mm × 35 cm de diámetro, por ejemplo) y
niéndose la forma oligomérica de la proteína. Los complejos aclarar con agua abundantemente. Secar todas estas piezas
SDS-proteína oligoméricos emigran más lentamente que sus con un paño u hoja de papel. Lubricar los espaciadores y el
subunidades SDS-polipéptido. Además, las proteínas no tubo con grasa no siliconada. Colocar los espaciadores a 2 mm
reducidas no se pueden saturar completamente con SDS y del borde, a lo largo de los dos lados cortos y de un lado largo

de la placa de vidrio. Este último corresponde al fondo del ración entre las dos placas de vidrio del molde. Dejar espa-
gel. Comenzar a situar el tubo de goma sobre la placa de cio suficiente para el gel de apilamiento (la longitud de un
vidrio, utilizando uno de los espaciadores como guía. Al lle- diente del peine más 1 cm). Utilizando una pipeta de vidrio
gar al borde del espaciador, doblar el tubo con cuidado para de punta larga, recubrir con precaución la disolución con
2. Métodos
analíticos
hacerlo continuar por el lado más largo de la placa de vidrio. isobutanol saturado con agua. Dejar el gel en posición verti-
Manteniendo el tubo en su sitio con la ayuda de un dedo, cal a temperatura ambiente para que se produzca la polime-
doblarlo de nuevo para hacerlo llegar al lado corto de la placa rización.
de vidrio, utilizando el espaciador como guía. Situar la
segunda placa de vidrio perfectamente alineada con la pri- Preparación del gel de apilamiento. Después de la poli-
mera y mantenerlas juntas presionándolas con la mano. merización completa del gel de resolución (alrededor de 30
Colocar dos pinzas en cada uno de los lados cortos del min), retirar la capa superior de isobutanol y lavar varias
molde. Poner, con precaución, cuatro pinzas en el lado largo, veces la parte superior del gel con agua para eliminar la capa
formando el molde del gel. Comprobar que el tubo va siem- de isobutanol y la posible acrilamida no polimerizada.
pre por el borde de las placas y que no se ha desplazado al Suprimir la mayor cantidad posible de líquido de la superfi-
colocar las pinzas. El molde está ya listo para verter el gel. cie del gel eliminando el resto de agua con la ayuda de un
papel de filtro.
Preparación de los geles
En un matraz cónico, preparar el volumen adecuado de diso-
En un gel de poliacrilamida SDS con tampón discontinuo, lución de acrilamida que contenga la concentración requeri-
se recomienda verter el gel de resolución, dejar polimerizar da para el gel de resolución, utilizando los valores dados en
y a continuación, verter el gel de apilamiento, ya que la la Tabla 2.2.31.-2. Mezclar los compuestos en el orden indi-
composición de los dos geles en acrilamida-bisacrilamida cado. Cuando proceda, antes de la adición de la disolución
es tampón y pH diferente. de persulfato de amonio y del tetrametiletilendiamina
(TEMED), filtrar la disolución, si es necesario, a vacío a tra-
Preparación del gel de resolución. En un matraz cónico, vés de una membrana de acetato de celulosa (diámetro de
preparar el volumen adecuado de la disolución de acrilamida poro de 0,45 µm); mantener la disolución bajo vacío por agi-
que contenga la concentración deseada para el gel de resolu- tación del sistema de filtración hasta que no se formen más
ción, utilizando los valores dados en la Tabla 2.2.31.-1. Mez- burbujas en la disolución. Añadir las cantidades apropiadas
clar los componentes en el orden indicado. Cuando proceda, de disolución de persulfato de amonio y de TEMED, indica-
antes de la adición de la disolución de persulfato de amonio das en la Tabla 2.2.31.-2, agitar y verter rápidamente en el
y del tetrametiletilendiamina (TEMED), filtrar la disolu- espacio de separación entre las dos placas de vidrio del
ción, si es necesario, a vacío a través de una membrana de molde, directamente sobre la superficie del gel de resolución
acetato de celulosa (diámetro de poro de 0,45 µm); mante- polimerizado. Insertar inmediatamente un peine limpio de
ner la disolución bajo vacío por rotación de la unidad de fil- politetrafluoroetileno en la disolución del gel de apilamien-
tración hasta que no se formen más burbujas en la disolu- to, con precaución para evitar la formación de burbujas de
ción. Añadir las cantidades apropiadas de disolución de aire. Añadir más disolución de gel de apilamiento hasta relle-
persulfato de amonio y de TEMED, indicadas en la Tabla nar completamente los espacios del peine. Colocar el gel en
2.2.31.-1, agitar y verter rápidamente en el espacio de sepa- posición vertical y dejar polimerizar a temperatura ambiente.
Tabla 2.2.31.-1.- Preparación del gel de resolución
Componentes de la disolución Volumen (ml) de cada componente por volumen de gel moldeado de
5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml
6 por ciento de acrilamida
Agua R 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,5
Disolución de acrilamida (1) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0
Tris pH 8,8 (1,5M) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
SDS 100 g/l (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
PSA 100 g/l (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED (5) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04
Agua R 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2
Tris pH 8,8 (1,5M) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
SDS 100 g/l (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
PSA 100 g/l (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED (5) 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03
Agua R 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8
Tris pH 8,8 (1,5M) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

SDS 100 g/l (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
2. Métodos
analíticos
PSA 100 g/l (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(5)
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Agua R 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5
Tris pH 8,8 (1,5M) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
SDS 100 g/l (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
PSA 100 g/l (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Agua R 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8
Tris pH 8,8 (1,5M) (2) 1,2 2,5 3,6 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
SDS 100 g/l (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
PSA 100 g/l (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Agua R 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5
Tris pH 8,8 (1,5M) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
SDS 100 g/l (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
PSA 100 g/l (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
(1) Disolución de acrilamida: disolución de acrilamida/bisacrilamida (29:1) al 30 por ciento R.

(2) Tris pH 8,8 (1,5 M): disolución tampón tris-clorhídrico pH 8,8 (1,5 M) R.
(3) SDS 100 g/l: disolución de 100 g/l de dodecilsulfato de sodio R.
(4) PSA 100 g/l: disolución de 100 g/l de persulfato de amonio R. El persulfato de amonio forma los radicales libres que inducen la polimerización de la
acrilamida y de la bisacrilamida. La disolución de persulfato de amonio se descompone lentamente y se debe renovar cada semana.
(5) TEMED: tetrametiletilendiamina R.
Tabla 2.2.31.-2.- Preparación del gel de apilamiento

Agua R 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8
Tris pH 6,8 (1,0 M) (2) 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25
SDS 100 g/l (3) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1
PSA 100 g/l (4) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1
TEMED (5) 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01
(1) Disolución de acrilamida: disolución de acrilamida/bisacrilamida (29:1) al 30 por ciento R.

(2) Tris pH 8,8 (1,5 M): disolución tampón tris-clorhídrico pH 8,8 (1,5 M) R.
(3) SDS 100 g/l: disolución de 100 g/l de dodecilsulfato de sodio R.
(4) PSA 100 g/l: disolución de 100 g/l de persulfato de amonio R. El persulfato de amonio forma los radicales libres que inducen la polimerización de la
acrilamida y de la bisacrilamida. La disolución de persulfato de amonio se descompone lentamente y se debe renovar cada semana.
(5) TEMED: tetrametiletilendiamina R.

Montaje del gel en el equipo de electroforesis y separa- acelerar incluyendo en la disolución de decoloración R
ción electroforética varios gramos de resina de intercambio aniónico o una
pequeña esponja.
Una vez completada la polimerización (alrededor de
2. Métodos
30 min), retirar el peine de politetrafluoroetileno con pre- NOTA: Las disoluciones ácido-alcohólicas utilizadas en
analíticos
caución. Lavar los pocillos inmediatamente con agua o con este procedimiento no fijan por completo las proteínas
disolución tampón de desarrollo SDS-PAGE R con el fin de en el gel. Esto puede conducir a la pérdida de algunas pro-
eliminar la posible acrilamida no polimerizada. Si es nece- teínas de bajo peso molecular durante el proceso de tin-
sario, recortar los dientes del gel de apilamiento con una ción y decoloración de geles finos. La fijación permanente
aguja hipodérmica roma fijada a una jeringa. Quitar las pin- se obtiene introduciendo el gel en una mezcla de un volu-
zas de uno de los lados cortos, retirar con precaución el tubo men de ácido tricloroacético R, 4 volúmenes de metanol R
y volver a colocar las pinzas. Proceder de modo similar en y 5 volúmenes de agua R durante 1 h antes de introducirlo
el otro lado corto. Quitar el tubo de la parte inferior del gel. en la disolución colorante de Coomassie R.
Montar el gel en el equipo de electroforesis. Añadir los tam-
pones de electroforesis en los compartimentos inferior y
superior. Eliminar las burbujas que se formen en la parte Tinción con plata
inferior del gel, entre las dos placas de vidrio. Esto es mejor
efectuarlo con una aguja hipodérmica doblada fijada a una Introducir el gel en un exceso de disolución de fijación R
jeringa. Nunca realizar un predesarrollo del gel sin mues- durante 1 h. Eliminar la disolución de fijación R, añadirla de
tras, ya que se destruye la discontinuidad de los sistemas nuevo e incubar otra vez durante al menos 1 h o durante toda la
tampón. Antes de aplicar las muestras, lavar con precaución noche, si es conveniente. Eliminar la disolución de fijación R y
la ranura con tampón de desarrollo SDS-PAGE R. Preparar lavar el gel con abundante agua R durante 1 h. Embeber el gel
las disoluciones problema y de referencia en el tampón de durante 15 min en disolución al 1 por ciento V/V de glutaral-
muestra recomendado y tratar según prescriba la monogra- dehido R. Lavar el gel dos veces durante 15 min en agua R
fía. Aplicar el volumen adecuado de cada disolución en los abundante. Embeber el gel en reactivo de nitrato de plata R
pocillos del gel de apilamiento. Comenzar la electroforesis recién preparado durante 15 min, en oscuridad. Lavar el gel
utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante tres veces durante 5 min en abundante agua R. Sumergir el gel
del equipo. Los fabricantes del equipo de SDS-PAGE pue- durante 1 min aproximadamente en disolución de desarrollo R
den proporcionar geles de diferentes grosores y tamaños. En hasta que se obtenga una tinción satisfactoria. Parar el desarro-
ocasiones se necesita variar el tiempo y la relación intensi- llo por incubación en disolución de bloqueo R durante 15 min.
dad/voltaje del desarrollo electroforético recomendados por Lavar el gel con agua R.
el fabricante del equipo para obtener una separación óptima.
Comprobar que el frente del colorante se desplaza en el gel
de resolución. Cuando el colorante alcance la parte inferior DESECADO DE GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS
del gel, parar la electroforesis. Sacar el montaje de gel del TEÑIDOS
equipo y separar las placas de vidrio. Quitar los espaciado-
Los geles se tratan de modos ligeramente diferentes, depen-
res, cortar y tirar el gel de apilamiento y proceder inmedia-
diendo del método utilizado para teñirlos. Cuando se utiliza
tamente a la tinción.
tinción con Coomassie, después de la etapa de decoloración,
colocar el gel en una disolución de 100 g/l de glicerol R
DETECCIÓN DE PROTEÍNAS EN GELES durante al menos 2 h (es posible una incubación durante
toda la noche). Cuando se utiliza la tinción con plata, añadir
La tinción con Coomassie es el método de tinción de proteí- al final del proceso de lavado una etapa de inmersión duran-
nas más común con un nivel de detección del orden de 1 µg te 5 min en una disolución de 20 g/l de glicerol R.
a 10 µg de proteína por banda. La tinción con plata es el
método más sensible para proteínas teñidas en geles y per- Sumergir dos hojas de celulosa porosa en agua R durante 5 min
mite detectar bandas que contengan de 10 ng a 100 ng de a 10 min. Colocar una de las hojas en el cuadro de secado.
proteína. Levantar el gel cuidadosamente y situarlo sobre la hoja de celu-
losa. Eliminar las burbujas de aire eventualmente retenidas y
Todas las etapas de tinción de geles se realizan a temperatu- verter algunos mililitros de agua R a lo largo de los bordes del
ra ambiente con agitación suave (por ejemplo en una placa gel. Recubrir con la segunda hoja de papel y eliminar de nuevo
de movimiento giratorio) en un recipiente adecuado. Es las posibles burbujas de aire retenidas. Completar el conjunto
necesario utilizar guantes durante la tinción para manejar de cuadro de secado. Colocar en una estufa o dejar secar a tem-
los geles y para evitar que se tiñan también las huellas digi- peratura ambiente.
tales.
DETERMINACIÓN DE PESOS MOLECULARES

Tinción con Coomassie
Sumergir el gel en un exceso de disolución colorante de Los pesos moleculares de las proteínas se determinan por
Coomassie R y dejar en contacto al menos durante 1 h. Eli- comparación de sus movilidades con las correspondientes a
minar la disolución colorante de Coomassie R. varios marcadores con peso molecular conocido. Para la
calibración de los geles se dispone de mezclas de proteínas
Decolorar el gel con un exceso de disolución de decolora- con pesos moleculares conocidos con precisión, que permi-
ción R. Cambiar esta disolución varias veces, hasta que las ten obtener una tinción uniforme. Se obtienen con varios
bandas de proteínas teñidas se distingan netamente sobre un intervalos de pesos moleculares. Las disoluciones madre
fondo claro. Cuanto más a fondo se realice el proceso de concentradas de proteínas con peso molecular conocido se
decoloración, menor será la cantidad de proteína que se diluyen en el tampón de muestra adecuado y se aplican en el
puede detectar por este método. La decoloración se puede mismo gel que la muestra de la proteína a examinar.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.33. Espectrometría de resonancia magnética nuclear
Inmediatamente después del desarrollo electroforético, señalar a la desecación de la sustancia hasta masa constante o bien
la posición del colorante de marcaje, azul de bromofenol, para durante el tiempo prescrito, mediante uno de los proce-
identificar el frente de migración de los iones. Se puede reali- dimientos descritos seguidamente.
zar cortando unas muescas en los bordes del gel o insertando
2. Métodos
a) «en un desecador»: la desecación se realiza en presen-
analíticos
una aguja en el gel, sumergida en tinta china, a nivel del frente
de migración. Después de la tinción, medir las distancias de cia de pentóxido de difósforo R, a presión atmosférica y
migración de cada banda proteica (marcadores y problemas) a temperatura ambiente;
desde la parte superior del gel de resolución. Dividir la distan-
cia de migración de cada proteína por la distancia de migración b) «al vacío»: la desecación se efectúa en presencia de
del colorante. Las distancias de migración normalizadas así pentóxido de difósforo R, a temperatura ambiente y a
obtenidas se denominan movilidades relativas de las proteínas una presión comprendida entre 1,5 kPa y 2,5 kPa;
(relativas al frente del colorante) y convencionalmente se
expresan como Rf. Trazar en papel semilogarítmico un gráfico c) «al vacío con indicación de un intervalo de temperatu-
que represente el logaritmo de los pesos moleculares relativos ra»: la desecación se efectúa en presencia de pentóxido
(Mr) de las proteínas patrón en función de los valores de Rf. de difósforo R, bajo una presión de 1,5 kPa y 2,5 kPa y
Comprobar que los gráficos obtenidos son ligeramente sigmo- en el intervalo de temperatura descrito en la monografía;
ideos. Los pesos moleculares desconocidos se pueden determi- d) «en estufa con indicación de un intervalo de temperatu-
nar por análisis de regresión lineal o por interpolación a partir ra»: la desecación se lleva a cabo en estufa y en el inter-
de las curvas de logaritmo de M frente a Rf, con la condición de
valo de temperatura descrito en la monografía;
que los valores obtenidos para las muestras problemas se sitúen
en la parte lineal del gráfico. e) «al vacío forzado»: la desecación se realiza en presen-
cia de pentóxido de fósforo R, a una presión inferior a
VALIDACIÓN DEL ENSAYO 0,1 kPa y a la temperatura prescrita en la monografía.
El ensayo no es válido a menos que las proteínas utilizadas Cuando se prescriban otras condiciones, el procedimiento a
como marcadores de pesos moleculares se distribuyan a lo utilizar se encuentra descrito completamente en la mono-
largo del 80 por ciento de la longitud del gel y si en el inter- grafía particular.
valo de separación requerido (por ejemplo, el intervalo que
cubre el producto y su dímero o los productos y sus impure-
zas relacionadas), la separación obtenida para las bandas de
proteínas relevantes, muestra una relación lineal entre el 2.2.33. ESPECTROMETRÍA DE RESONANCIA
logaritmo del peso molecular y el Rf.∅. Además se deben MAGNÉTICA NUCLEAR
especificar en las correspondientes monografías los requisi-
tos de validación adicionales referentes a la disolución a
examinar. La espectrometría de resonancia magnética nuclear
(RMN) se basa en la propiedad de núcleos tales como 1H,
13C, 19F, 31P de poseer un momento magnético nuclear per-
CUANTIFICACIÓN DE IMPUREZAS manente. Cuando éstos se sitúan en un campo magnético
Cuando en la monografía concreta se especifica el límite de exterior (campo principal), toman con respecto a él ciertas
impureza, se debe preparar una disolución de referencia orientaciones bien definidas a las que corresponden niveles
correspondiente al nivel de impureza especificado, por dilu- de energía distintos. Para un valor dado del campo, tienen
ción de la disolución problema. Por ejemplo, cuando el lími- lugar transiciones entre niveles de energía contiguos debi-
te de impureza es del 5 por ciento, la disolución de referen- das a la absorción de radiación electromagnética, de longi-
cia será una dilución 1:20 de la disolución problema. En el tud de onda característica, en la región de radiofrecuencias.
electroforegrama obtenido con la disolución problema, nin-
La determinación de estas frecuencias puede realizarse ya
guna impureza (ni ninguna banda, a excepción de la princi-
sea por búsqueda secuencial de las condiciones de resonan-
pal) puede ser más intensa que la banda principal del elec-
troforegrama obtenido con la disolución de referencia. cia (espectrometría de onda continua) o por excitación simul-
tánea de todas las transiciones por irradiación con un pulso
Es posible, cuando se trabaja en las condiciones validadas, multifrecuencia, seguida de un análisis por ordenador de los
cuantificar las impurezas por normalización con relación a interferogramas obtenidos cuando el sistema vuelve al estado
la banda principal, utilizando un densitómetro integrador. inicial (espectrometría de pulsos).
En este caso, se debe comprobar la linealidad de las res-
puestas. Un espectro de resonancia magnética protónica consta de un
conjunto de señales correspondientes a los protones que son
características de su entorno nuclear y electrónico en la molé-
cula. La separación entre una señal dada y la que corresponde
2.2.32. PÉRDIDA DE MASA a un compuesto de referencia se llama desplazamiento quími-
co (δ), se expresa en partes por millón (ppm) y caracteriza al
POR DESECACIÓN tipo de protón en función del entorno nuclear y electrónico.
Con frecuencia las señales se subdividen en grupos de picos
La pérdida de masa por desecación es la pérdida de masa relacionados, llamados dobletes, tripletes..., multipletes. Esta
expresada en porcentaje m/m. multiplicidad se debe a la presencia de campos magnéticos
permanentes procedentes de núcleos adyacentes, en particu-
Procedimiento. Colocar la cantidad prescrita de la sustan- lar de otros protones distantes de 2 a 5 enlaces de valencia. La
cia a examinar en un envase tarado y previamente desecado intensidad de cada señal, medida por el área bajo la señal, es
en las condiciones señaladas para dicha sustancia. Proceder proporcional al número de protones equivalentes.

2.2.34. Termogravimetría REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
Equipo. Un espectrómetro de resonancia magnética nucle- ESPECTROMETRÍA DE ONDAS CONTINUAS

ar para espectrometría de onda continua está constituido por:
un imán, un generador de barrido de baja frecuencia, un por- Ajustar el espectrómetro de modo que opere en condiciones
tamuestras, un emisor y receptor de radiofrecuencias, un lo más próximas posibles al modo de absorción pura utili-
2. Métodos
zando una potencia de radiofrecuencia que evite la satura-

analíticos
registrador y un integrador electrónico. Un espectrómetro de

pulsos está, además, equipado con un emisor de pulsos y un ción de las señales. Ajustar los controles del espectrómetro
ordenador para la adquisición, almacenamiento y transforma- de modo que la señal más intensa del espectro de la sustancia
ción matemática de los datos en un espectro convencional. a examinar llegue casi al extremo del papel del registrador y
que la señal del patrón interno corresponda a un desplaza-
Utilizar un espectrómetro de resonancia magnética nuclear miento químico de δ 0,00 ppm. Registrar el espectro en el
de una frecuencia mínima de 60 MHz para 1H. Salvo indica- intervalo espectral prescrito y salvo indicación contraria, a
ción contraria, seguir las instrucciones del fabricante. Antes una velocidad de barrido que no sobrepase 2 Hz por segun-
de registrar el espectro, verificar que: do. Registrar la integral de las señales sobre el mismo inter-
valo del espectro y a una velocidad de barrido adecuada
1. La resolución es inferior o igual a 0,5 Hz, determinada según el aparato utilizado. Cuando se requieran determina-
mediante la expansión de escala apropiada, como la ciones cuantitativas, seguir las instrucciones que se prescri-
anchura del pico a la mitad de la altura de: ben en cada caso.
— la señal a δ 7,33 ppm o a δ 7,51 ppm del multiplete
simétrico de una disolución de diclorobenceno R
ESPECTROMETRÍA DE PULSOS
del 20 por ciento V/V en acetona deuterada R,
— o bien la señal a δ 0,00 ppm de una disolución de Ajustar los mandos del espectrómetro, especialmente el
tetrametilsilano R del 5 por ciento V/V en clorofor- ángulo de pulso, la amplitud de pulso y el intervalo de tiem-
mo deuterado R, po entre pulsos sucesivos, el intervalo espectral y el número
de puntos (resolución) y el tiempo de adquisición de los
2. La relación señal - ruido (S/R), medida en el intervalo datos, según las instrucciones del fabricante y acumular el
de δ 2 ppm a δ 5 ppm en el espectro obtenido con una número necesario de interferogramas. Después de la trans-
disolución de etilbenceno R al 1 por ciento V/V en clo- formación matemática de los datos por el ordenador, ajustar
roformo deuterado R, es al menos 25:1. Esta relación se el control de fase de modo que se obtengan las condiciones
calcula a partir de la media de cinco determinaciones más próximas posibles al espectro de absorción pura, y cali-
sucesivas y mediante la fórmula: brar el espectro con relación a la frecuencia de resonancia
del patrón interno de desplazamiento químico. Visualizar el
espectro almacenado en el ordenador sobre un dispositivo
S/R = 2,5 A adecuado. Para las medidas cuantitativas, procesar la inte-
H gral de acuerdo con las posibilidades del instrumento.
A = amplitud, medida en milímetros, del pico mayor
del cuadruplete del grupo metileno del etilbenceno
centrado a δ 2,65 ppm. La amplitud se mide desde 2.2.34. TERMOGRAVIMETRÍA
una línea base construida desde el centro del ruido
a ambos lados de este cuadruplete y a una distan-
cia de al menos 1 ppm desde su centro, El análisis térmico se refiere a un grupo de técnicas que per-
miten medir la variación de una propiedad física de una sus-
H = amplitud pico a pico desde la línea base del ruido
tancia en función de la temperatura. Las técnicas más utili-
medida en milímetros y obtenida entre δ 4 ppm y
zadas, habitualmente, son las que miden cambios de energía
δ 5 ppm.
o de masa de una muestra de una sustancia.
3. La amplitud de las bandas satélites de rotación no es
superior al 2 por ciento de la altura del pico de la mues- La termogravimetría es una técnica que permite registrar la
tra en un tubo cuya velocidad de rotación es adecuada masa de una muestra de sustancia en función de la tempera-
para el espectrómetro utilizado. tura, según un programa de temperatura controlado.
4. Para medidas cuantitativas, verificar la repetibilidad de Equipo. Los principales constituyentes de una termoba-
las respuestas del integrador, utilizando una disolución lanza son: un dispositivo que permite calentar o enfriar la
de etilbenceno R del 5 por ciento V/V en cloroformo sustancia según un programa de temperatura determinado,
deuterado R. Realizar cinco barridos sucesivos de los un portamuestras bajo atmósfera controlada, una electroba-
protones de los grupos etilo y determinar la media de lanza y un registrador. En ciertos casos, el aparato puede
los valores obtenidos. Ninguno de los valores indivi- estar conectado a un sistema que permita analizar productos
duales debe diferir en más del 2,5 por ciento de la volátiles.
media.
Control de la temperatura. Verificar la escala de tempera-
Procedimiento. Disolver la sustancia a examinar según se turas mediante níquel u otro material apropiado, según las
prescriba y filtrar. La disolución debe ser límpida. Utilizar indicaciones del fabricante.
un patrón interno de desplazamiento químico que, a menos
que se prescriba de otro modo, es una disolución que contie- Calibración de la electrobalanza. Colocar una cantidad
ne del 0,5 por ciento V/V al 1,0 por ciento V/V de tetrametil- apropiada de oxalato de calcio monohidrato SQR en el por-
silano R (TMS) en disolventes orgánicos deuterados o del tamuestras y determinar su masa. Fijar la velocidad de
0,5 por ciento V/V al 1,0 por ciento V/V de tetradeuteriodi- calentamiento según las indicaciones del fabricante. Iniciar
metilsilapentanoato de sodio R (TSP) en óxido de deuterio el calentamiento y registrar la curva termogravimétrica
R. Tomar la cantidad necesaria y registrar el espectro. colocando en abscisas la temperatura, en valores crecientes

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.36. Determinación potenciométrica de la concent...
de izquierda a derecha y en ordenadas la masa, en valores — se incluye normalmente un medio para mezclar las
crecientes hacia arriba. Interrumpir el calentamiento cuando muestras por agitación.
la temperatura alcanza, aproximadamente, los 230 °C.
Medir en la gráfica la distancia entre las mesetas inicial y Tabla 2.2.35.-1.—Disoluciones de referencia para la calibración
2. Métodos
del osmómetro
analíticos
final de la curva masa-temperatura. Esta distancia represen-
ta la pérdida de masa. La pérdida de masa declarada del oxa-
lato de calcio monohidratado SQR está indicada en la eti- Masa en
gramos
queta. de cloruro Osmolalidad Osmolalidad Coeficiente Descenso
de sodio R real ideal osmótico crioscópico
Procedimiento. Utilizar el mismo método con la sustancia por (mosmol/kg) (mosmol/kg) molal (°C)
a examinar, siguiendo las condiciones operatorias prescritas kilogramo
en la monografía. Calcular la pérdida de masa de la sustan- de agua R
cia a examinar a partir de la distancia medida en la gráfica 3,087 100 105,67 0,9463 0,186
obtenida. Expresar la pérdida de masa en porcentaje m/m. 6,260 200 214,20 0,9337 0,372
9,463 300 323,83 0,9264 0,558
En caso de utilización frecuente del aparato, llevar a cabo de 12,684 400 434,07 0,9215 0,744
forma regular el control de la temperatura y el calibrado. En 15,916 500 544,66 0,9180 0,930
caso contrario, deben realizarse antes de cada determina- 19,147 600 655,24 0,9157 1,116
ción. 22,380 700 765,86 0,9140 1,302
Procedimiento. Preparar las disoluciones de referencia

2.2.35. OSMOLALIDAD requeridas como se describe en la tabla 2.2.35.-1. Determi-
nar el cero del equipo utilizando agua R. Calibrar el equipo
utilizando las disoluciones de referencia: introducir de 50 µl
La osmolalidad es un medio práctico de medir de una mane- a 250 µl de muestra en la celda de medida e iniciar el proce-
so de enfriado. Normalmente, el sistema de agitación se pro-
ra global la contribución de los diferentes solutos presentes grama para operar a una temperatura inferior a la del des-
en una disolución a la presión osmótica de esta disolución. censo crioscópico previsto, para evitar el superenfriamiento.
Un dispositivo adecuado indica el logro del equilibrio.
Una aproximación aceptable para la osmolalidad ξm de una Antes de cada medida, enjuagar la celda de medida con la
disolución acuosa viene dada por: disolución problema.
ξm = νmΦ Realizar las mismas operaciones con la muestra problema.
Leer directamente la osmolalidad o calcularla a partir de la
Si el soluto no está ionizado, ν = 1; en caso contrario ν es el medida del descenso del punto de congelación. El ensayo
número total de iones ya presentes o formados por solvolisis no es válido a menos que el valor encontrado esté entre dos
a partir de una molécula de soluto. valores de la escala de calibración.
m = es la molalidad de la disolución, es decir, el número de
moles de soluto por kilogramo de disolvente,
2.2.36. DETERMINACIÓN POTENCIOMÉ-
Φ = es el coeficiente osmótico molal, que tiene en cuenta TRICA DE LA CONCENTRACIÓN
las interacciones entre los iones de carga opuesta en la
disolución. Es dependiente del valor de m. Conforme IÓNICA MEDIANTE ELECTRODOS
aumenta la complejidad de las disoluciones, Φ resulta SELECTIVOS
más difícil de medir.
Idealmente, el potencial E de un electrodo de membrana
La unidad de osmolalidad es osmol por kilogramo selectivo depende linealmente del logaritmo de la actividad
(osmol/kg), pero el submúltiplo utilizado normalmente es ai de un ion dado, como lo expresa la ecuación de Nernst:
miliosmol por kilogramo (mosmol/kg).
RT
A menos que se establezca de otra manera, la osmolalidad E = E0 + 2,303  log ai
se determina por medida del descenso del punto de congela- zi F
ción. En tal caso, la relación entre osmolalidad y descenso
del punto de congelación ∆T es: E0 = parte del potencial constante debida al aparato empleado,
∆T R = constante de los gases perfectos,
ξm =  × 1000 mosmol/kg
1,86 T = temperatura absoluta,
Equipo. El equipo (osmómetro) se compone de: F = número de Faraday,
— un sistema para enfriar el envase utilizado para la medida, zi = número de carga del ion incluyendo su signo.
— un sistema para medir la temperatura, compuesto de una A fuerza iónica constante, se cumple que:
resistencia sensible a la temperatura (termistor), provisto
de sistema apropiado de medida de la corriente o de la k
diferencia de potencial que puede estar graduado en des- E = E0 +  log f Ci
censo de temperatura o directamente en osmolalidad, zi

2.2.36. Determinación potenciométrica de la concent... REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
Ci = concentración molar del ion, valorar encuadre la concentración supuesta de la disolución

problema. Calcular la curva de calibrado o representar gráfi-
f = coeficiente de actividad (ai = f Ci), camente el potencial medio E obtenido frente a la concen-
RT tración del ion a valorar expresada como - log Ci ó pCi.
2. Métodos
k = 
analíticos
F Preparar la disolución problema como se prescribe en la

monografía. Medir su potencial 3 veces y, a partir del poten-
Tabla 2.2.36.-1.—Valores de k a diferentes temperaturas cial medio y de la curva de calibrado, calcular la concentra-
ción del ion a valorar.
Temperatura (°C) k
Método II (método de adición de patrón múltiple)
20 0,0582
25 0,0592 Preparar la disolución problema según las indicaciones de la
30 0,0602 monografía. Medir el potencial en el equilibrio Eτ de un
volumen Vτ de esta disolución de concentración desconoci-
da Cτ en el ion a valorar. Efectuar al menos tres adiciones
k k consecutivas de un volumen VS, negligible en relación a Eτ
Si: E0 +  log f = E’0 y S = 
zi zi (VS < 0,01Vτ), de una disolución de referencia de concentra-
ción CS conocida, que da una respuesta situada en la parte
S = pendiente de la curva de calibración del electrodo con- lineal de la curva de calibrado. Tras cada adición, medir el
siderado, potencial y calcular la variación de potencial ∆E entre el
potencial medido y Eτ. ∆E está relacionado con la concen-
se obtiene: E = E’0 + S log Ci tración del ion a valorar según la ecuación:
y, para - log Ci = pCi : E = E’0 - S pCi

∆E = S log 1 + CS V S
La determinación potenciométrica de la concentración ióni- CT V T
ca se efectúa por medida de la diferencia de potencial entre
2 electrodos apropiados sumergidos en la disolución proble- o bien:
ma: el electrodo indicador es un electrodo selectivo del ion ∆E CSVS
10 S = 1 + ———
a valorar y el otro un electrodo de referencia. CTVT
Aparato. Utilizar como aparato de medida un voltímetro
que permita una aproximación de 0,1 milivoltios y cuya
VT = volumen de la disolución problema,
resistencia de entrada sea al menos 100 veces superior a la
de los electrodos utilizados. CT = concentración del ion a valorar en la disolución pro-
Los electrodos de membrana selectivos pueden ser tanto elec- blema,
trodos primarios de membrana cristalina o no cristalina, o de
matriz rígida (por ejemplo, el electrodo de vidrio), como elec- VS = volumen añadido de la disolución de referencia,
trodos con un transportador móvil cargado positiva o negati-
vamente, o sin carga, o incluso electrodos sensibilizados CS = concentración del ion a valorar en la disolución de
(electrodos de sustrato enzimático, electrodos indicadores de referencia,
gas). El electrodo de referencia suele ser uno de plata-cloruro
de plata o un electrodo de calomelanos, con líquidos de cone- S = pendiente del electrodo determinada experimental-
xión apropiados, que no producen interferencias. mente, a temperatura constante, por medida de la dife-
rencia entre los potenciales obtenidos a partir de 2
Procedimiento. Efectuar cada medida a una temperatura disoluciones de referencia cuya concentración difiere
constante con una aproximación de ± 0,5 °C, teniendo en en un factor 10 y se encuentra en el rango de concen-
cuenta las variaciones de la pendiente del electrodo en fun- traciones donde la respuesta es lineal.
ción de la temperatura (tabla 2.2.36.-1). Ajustar la fuerza
iónica y eventualmente el pH de la disolución problema, por
medio de la disolución tampón prescrita en la monografía. ∆E
Equilibrar el electrodo manteniéndolo sumergido en la diso- Representar gráficamente 10 S (en ordenadas) en fun-
lución problema, bajo agitación lenta y uniforme, hasta que ción de VS (en abscisas).
se obtenga una lectura constante.
Extrapolar la recta obtenida hasta su intersección con el eje de
Si el sistema de electrodos se emplea con frecuencia, verificar abscisas. En la intersección, la concentración Cτ de la disolu-
regularmente la repetibilidad y la estabilidad de las respuestas, ción problema en el ion a valorar viene dada por la ecuación:
así como la linealidad de la curva de calibración o del algorit-
mo de cálculo en el rango de concentraciones de la disolución CS VS
problema. En caso contrario, llevar a cabo este control antes CT = 
de cada serie de medidas. Puede considerarse que la respuesta VT
del electrodo es lineal si la pendiente S de la curva de calibra-
do está próxima al valor de k/zi por unidad de pCi.
Método III (método de la adición de patrón única)
Método I (calibración directa)
Añadir al volumen Vτ de la disolución problema, preparada
Medir al menos 3 veces seguidas el potencial de al menos 3 según las indicaciones de la monografía, un volumen VS de
disoluciones de referencia cuya concentración en el ion a una disolución de referencia que contiene una concentra-

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.38. Conductividad
ción del ion a valorar cuya respuesta se sabe que está dentro Calibrado. A partir de una disolución patrón o de una
de la parte lineal de la curva de calibrado. Efectuar un ensa- serie de disoluciones del elemento a analizar en distintas
yo en blanco en las mismas condiciones. Medir, al menos 3 matrices, determinar la pendiente b0 de la curva de calibra-
veces, el potencial de la disolución problema y el del blando con ayuda de la ecuación siguiente:
2. Métodos
co, antes y después de la adición de la disolución de referen-
analíticos
N
cia. Calcular la concentración Cτ del ion a valorar en la diso- bo 1 = I C
lución problema con ayuda de la ecuación siguiente, µM C
llevando a cabo las correcciones necesarias para la concen-
tración del blanco, calculada de la misma forma:
µM = coeficiente de absorción de la matriz M, calculado o
medido,
Cτ = CS V S
∆E
10 s VT + V S - V T I NC = tasa neta de impulsos,
C = concentración del elemento a valorar en la prepara-
ción patrón.
VT = volumen de la disolución problema o del blanco,
Determinación del coeficiente de absorción másica de la
CT = concentración del ion a valorar en la disolución pro-
matriz de la muestra. Si la fórmula empírica de la muestra
blema,
a analizar es conocida, calcular su coeficiente de absorción
VS = volumen añadido de la disolución de referencia, másica a partir del coeficiente de absorción másica de los
elementos que la componen, que se encuentra tabulado. Si
CS = concentración del ion a valorar en la disolución de la composición elemental de la muestra es desconocida, cal-
referencia, cular su coeficiente de absorción másica midiendo la inten-
sidad I0 de la radiación X difusa (efecto Compton), median-
∆E = diferencia entre los potenciales medios medidos antes te la ecuación siguiente:
y después de la adición de VS,
1
S = pendiente del electrodo determinada experimental-  = a + b IU
mente, a temperatura constante, por medida de la dife- µMP
rencia entre los potenciales obtenidos a partir de 2
disoluciones de referencia cuya concentración difiere
µMP = coeficiente de absorción másica de la muestra,
en un factor 10 y se encuentra en el rango de concen-
traciones donde la respuesta es lineal. IU = radiación X dispersa.
Determinación de la tasa neta de impulsos del elemento a
valorar en la muestra. Calcular la tasa neta de impulsos
2.2.37. ESPECTROMETRÍA DE N
del elemento a valorar I EP a partir de la intensidad medida
FLUORESCENCIA POR RAYOS X(1) de la línea de fluorescencia y de la intensidad de la línea o
las líneas asociadas a la radiación de fondo, teniendo en
cuenta la posible contaminación debida al tubo.
La espectrometría de fluorescencia por dispersión de rayos
X es una técnica que utiliza la medida de la intensidad de la Cálculo de la concentración del elemento a valorar. Si la
radiación fluorescente emitida por un elemento cuya masa concentración C del elemento a valorar en la muestra se
atómica está entre 11 y 92 excitado por una radiación pri- encuentra en la parte lineal de la curva de calibrado, puede
maria continua de rayos X. La intensidad de la fluorescen- calcularse mediante la ecuación siguiente:
cia producida por un elemento dado depende de su concen-
tración en la muestra y también de la absorción por la matriz N
IEP
de las radiaciones incidente y fluorescente. En un rango de C= ×f
concentraciones muy bajas, donde la curva de calibración es bo 1
lineal, la intensidad de la radiación fluorescente emitida por µMP
un elemento dado en una matriz determinada, a una longi-
tud de onda concreta, es directamente proporcional a la con- f = factor de dilución.
centración de dicho elemento e inversamente proporcional
al coeficiente de absorción másica de la matriz a esa longi- (1) G. Andermann & M.W. Kemp, Analytical Chemistry 30 1306
(1958).
tud de onda.
Z.H. Kalman & L. Heller, Analytical Chemistry 34 946 (1962).
Procedimiento. Regular y utilizar el aparato según las ins- R.C. Reynolds, Jr. The American Mineralogist 46 1133 (1963).
trucciones del fabricante. Las muestras líquidas pueden R.O. Müller. Spectrochimica Acta 20 143 (1964).
situarse directamente en el aparato, mientras que las mues- R.O. Müller. Spectrochemische Analyse mit Röntgenfluoreszenz.
tras sólidas deben comprimirse primero en pastillas, mez- R. Oldenburg München-Wien (1967).
clándolas con un agente ligante apropiado si es preciso.
Para determinar la concentración de un elemento en una
muestra, es necesario medir la tasa de impulsos neta produ-
2.2.38. CONDUCTIVIDAD
cida por una o varias muestras patrón que contienen canti-
dades conocidas de dicho elemento en una matriz dada, y La conductividad de una disolución (κ) es, por definición, la
calcular o medir el coeficiente de absorción másica de la inversa de su resistividad (ρ). Ésta se define como el cocien-
matriz en la que se encuentra el elemento a valorar. te entre el campo eléctrico y la densidad de corriente. La

2.2.39. Distribución de la masa molecular de los dextranos REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
resistencia R (Ω) de un conductor de sección S (cm2) y de CT = C20 [1 + 0,021 ( T - 20 )]

longitud L (cm) viene dada por la expresión:
T= temperatura prescrita por la monografía,
L
R=ρ
2. Métodos
analíticos
S CT = conductividad de la disolución a T °C,
1 L 1 L C20 = conductividad de la disolución a 20 °C.

de donde: R =  ·  o bien κ =  · 
κ S R S
La unidad de conductividad en el sistema internacional es el Procedimiento
siemens por metro (S·m-1). En la práctica, la conductividad
eléctrica de una disolución se expresa en siemens por centí- Determinación de la constante de la célula de medición
metro (S·cm-1) o en microsiemens por centímetro (µS·cm-1).
La unidad de resistividad en el sistema internacional es el Escoger una célula de medición adaptada a la conductividad
ohm·metro (Ω·m). La resistividad de una disolución suele de la disolución problema. La constante de la célula debe
expresarse en ohms·centímetro (Ω·cm). Salvo indicación ser tanto más elevada cuanto mayor sea la conductividad
contraria, la temperatura de referencia para la expresión de esperada (ρ pequeña), de forma que el valor R medido sea
la conductividad o de la resistividad es de 20 °C. lo más grande posible, teniendo en cuenta el aparato emple-
ado. A título orientativo, las células de medición que se uti-
Aparato. El aparato utilizado (conductímetro o resistiví- lizan corrientemente tienen constantes de célula del orden
metro) permite determinar el valor de la resistencia de la de 0,1 cm-1, 1 cm-1 y 10 cm-1. Utilizar una disolución patrón
columna de líquido comprendida entre los electrodos del de cloruro de potasio R apropiada a la medida a realizar.
dispositivo de medida sumergido (célula de medición). El Enjuagar la célula de medición varias veces con agua exen-
aparato se alimenta con corriente alterna para evitar los ta de dióxido de carbono R preparada a partir de agua desti-
efectos de polarización de los electrodos. Está provisto de lada R, luego al menos 2 veces con la disolución de cloruro
un dispositivo de compensación de la temperatura o de un de potasio que se utiliza para la determinación de la cons-
termómetro de precisión. tante de la célula. Medir la resistencia de la célula de medi-
La célula de medición está formada por 2 electrodos de pla- ción en presencia de la disolución de cloruro de potasio lle-
tino recubiertos de negro de platino, cada uno con una vada a 20 ± 0,1 °C o a la temperatura prescrita por la
superficie S, mantenidos paralelos a una distancia L uno del monografía. La constante C de la célula de medición en cm-1
otro. Generalmente los electrodos están protegidos con una viene dada por la expresión:
vaina de vidrio que permite un intercambio eficaz entre la
disolución y los electrodos. C = RKCl · κKCl
La constante C de la célula de medida, en cm-1, viene dada RKCl = resistencia medida, expresada en megaohms,
por la expresión:
L κKCl = conductividad de la disolución patrón de cloruro de
C=α potasio R utilizada, expresada en µS.cm-1.
S
La constante C de la célula de conductividad no debe des-
α= coeficiente numérico adimensional, característico de viarse más del 5 por ciento del valor indicado.
la geometría de la célula.
Reactivos. Preparar 3 disoluciones de referencia de cloru- Determinación de la conductividad de la disolución
ro de potasio R que contengan respectivamente: 0,7455 g, problema
0,0746 g y 0,0149 g de cloruro de potasio R por 1.000,0 g
de disolución, empleando agua exenta de dióxido de carbo- Tras calibrado del aparato con una de las disoluciones
no R preparada a partir de agua destilada R, cuya conducti- patrón, enjuagar la célula de medición varias veces con agua
vidad no rebase los 2 µS·cm-1. exenta de dióxido de carbono R preparada a partir de agua
destilada R, y luego 2 veces con la disolución acuosa a estu-
La conductividad y la resistividad de estas 3 disoluciones a diar a 20 ± 0,1 °C o a la temperatura prescrita en la mono-
20 °C son las siguientes: grafía. Efectuar seguidamente las medidas sucesivas que se
indiquen en la monografía.
Tabla 2.2.38.-1.—Conductividad y resistividad de las disoluciones de
cloruro de potasio
Concentración en g
por 1000,0 g Conductividad Resistividad 2.2.39. DISTRIBUCIÓN DE LA MASA
de disolución µS·cm-1 Ω·cm MOLECULAR DE LOS DEXTRANOS
0,7455 133,0 752
0,0746 1330 7519
0,0149 26,6 37.594 Operar mediante cromatografía de exclusión (2.2.30).
Disolución problema. Disolver 0,200 g de la sustancia a
En caso de que la temperatura de 20 °C no pueda obtenerse, examinar en la fase móvil y completar hasta 10 ml con la
aplicar la siguiente ecuación para corregir la conductividad fase móvil.
de las disoluciones de cloruro de potasio indicadas en la
tabla. Esta ecuación no se aplica más que al intervalo de Disolución de marcaje. Disolver 5 mg de glucosa R
temperaturas 20 ± 5 °C: y 2 mg de dextrano V0 SQR en 1 ml de fase móvil.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.39. Distribución de la masa molecular de los dextranos
Disoluciones de calibrado. Disolver por separado, en 1 ml Vt = volumen total de la columna, determinado a partir del
de fase móvil, 15 mg de dextrano 4 para calibrado SQR, 15 pico correspondiente a la glucosa en el cromatograma
mg de dextrano 10 para calibrado SQR, 20 mg de dextrano obtenido con la disolución de marcaje,
40 para calibrado SQR, 20 mg de dextrano 70 para calibra-
2. Métodos
Vi = volumen de elución de la banda i del cromatograma
analíticos
do SQR y 20 mg de dextrano 250 para calibrado SQR.
obtenido con cada una de las disoluciones de calibrado.
Disolución para la validación del sistema. Disolver 20
mg de dextrano 40 para validación SQR (para el análisis del Efectuar el calibrado del sistema cromatográfico por uno de
dextrano 40) ó 20 mg de dextrano 60/70 para validación los dos métodos siguientes.
SQR (para el análisis del dextrano 60 y del dextrano 70), en
Calibrado por representación de la curva. Para cada uno
1 ml de fase móvil.
de los dextranos para calibrado, calcular, mediante la ecua-
La cromatografía puede efectuarse utilizando: ción (1), el coeficiente de distribución Kmax correspondiente
al punto más alto del trazo cromatográfico. Llevar a un grá-
— una columna de una longitud de 0,3 m y de un diámetro fico semilogarítmico los valores de Kmax (en abscisas) en
interior de 10 mm, rellena de agarosa reticulada para función de la masa molecular declarada de cada uno de los
cromatografía R, o una serie de columnas, de una longi- dextranos para calibrado y de la glucosa. Trazar una primera
tud de 0,3 m y de un diámetro interior de 10 mm, relle- curva de calibrado a través de los puntos obtenidos, extrapo-
nas de gel poliéter hidroxilado para cromatografía R, lándola entre el punto Kmax obtenido con el dextrano 250
para calibrado SQR y el valor más bajo de K obtenido con
— como fase móvil, a un flujo entre 0,5 ml y 1 ml por este mismo dextrano (ver figura 2.2.39.-1). Con ayuda de
minuto, mantenido constante a ± 1 por ciento por hora, esta primera curva de calibrado, transformar, para cada cro-
una disolución que contiene 7 g de sulfato de sodio matograma, todos los valores del coeficiente de distribución
anhidro R y 1 g de clorobutanol R por litro de agua R, Ki en masa molecular Mi y luego calcular la masa molecular
media Mw de cada dextrano para calibrado, empleando la
— como detector, un refractómetro diferencial, ecuación (3) siguiente. Si los valores de Mw no difieren en
más del 5 por ciento de los declarados para cada uno de los
— un inyector de bucle de 100 µl a 200 µl. 5 dextranos para calibrado y si la diferencia media es de ± 3
manteniendo el sistema a temperatura constante (± 0,1 °C). por ciento, la curva de calibrado es correcta. Si no es así,
desplazar la curva de calibrado a lo largo del eje de ordena-
das y repetir el cálculo hasta que los valores calculados y
Calibrado del sistema cromatográfico declarados no difieran en más de un 5 por ciento.
Inyectar varias veces el volumen escogido de la disolución Calibrado por cálculo de la curva. Calcular, con ayuda de
de marcaje. El cromatograma obtenido presenta 2 picos suce- las ecuaciones (2) y (3) siguientes, empleando un método
sivos correspondientes respectivamente al dextrano V0 SQR apropiado(1), los valores de b1, b2, b3, b4 y b5 que dan valores
y a la glucosa R. Calcular el volumen intersticial V0 a partir de Mw que no difieren en más de un 5 por ciento del valor
del volumen de elución correspondiente al dextrano V0 y declarado para cada uno de los dextranos para calibrado, y
el volumen total Vt a partir del pico correspondiente a la glu- de 180 ± 2 para la glucosa:
cosa.
(b4 + b1 Ki + b2 K2i+ b3 K 3i)
Mi = b5 + e (2)
Inyectar el volumen escogido de cada una de las disolucio-
nes de calibrado. Trazar cuidadosamente la línea de base de
cada uno de los cromatogramas obtenidos. Dividir cada cro-
matograma en p (al menos 60) bandas verticales iguales p
(correspondientes a volúmenes de elución iguales). En cada
banda i, correspondiente a un volumen de elución Vi, medir —
Σ(y
i=1
i Mi)
la altura yi que separa la línea de base del trazo del cromato- Mw = (3)
p
grama y calcular el coeficiente de distribución Ki mediante
la expresión: Σy
i=1
i
(V - V0)
——i——— (1) p= número de bandas en que se ha dividido el cromato-
(Vt - V0) grama,
V0 = volumen intersticial de la columna, determinado a yi = altura que separa la línea de base del trazado del cro-
partir del pico correspondiente al dextrano V0 SQR en matograma en la banda i,
el cromatograma obtenido con la disolución de
marcaje, Mi = masa molecular en la banda i.

2.2.39. Distribución de la masa molecular de los dextranos REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
— i=1
Σ(y M ) i i
Mw = ————— (4)
2. Métodos
Σy
analíticos
i
i=1
estando n definido por las expresiones (5) y (6) siguientes:
Σ
n
i=1
(yi ≤ 0.1
(Σ )
P
i=1
yi (5)
Σ(y > 0.1

n +1
i=1
i (Σ )
P
i=l
yi (6)
p = número de bandas en que se ha dividido el cromato-

grama,
yi = altura que separa la línea de base del trazado del cro-
matograma en la banda i,
Mi = masa molecular en la banda i.
El ensayo sólo es válido si el valor de Mw obtenido para la
fracción superior de dextrano (10 por ciento) es de:
— 110.000 a 130.000 para el dextrano 40 para validación
SQR,
— 190.000 a 230.000 para el dextrano 60/70 para valida-
ción SQR.
Masas molecular media de la fracción inferior de dextrano
(10 por ciento)
Figura 2.2.39.-1.—Ejemplo de una curva de calibrado. Calcular Mw para la fracción inferior de dextrano (10 por
ciento) que eluye en la banda m, y después de ella con ayuda
El trazo punteado representa la parte de la curva que debe de la ecuación:
extrapolarse. Los trazos horizontales en la parte inferior de
la figura representan la anchura y la posición del trazo cro-
matográfico obtenido con cada dextrano para calibrado.
Validación del sistema cromatográfico. Inyectar el volu-
p
men escogido de la disolución de validación del sistema
apropiada al dextrano a analizar. Σ(y M )
i=m
i i
Masa molecular media total del dextrano para validación Mw = ————— (7)
p
SQR
Calcular Mw como se indica en el epígrafe “Calibrado del
Σy
i =m
i
sistema cromatográfico”, empleando sea la curva de calibra-

do, sea los valores obtenidos para b1, b2, b3, b4 y b5.
estando m definido por las expresiones (8) y (9) siguientes:
El ensayo sólo es válido si el valor de Mw es de:
(Σ )
p
Σ
P
— 41.000 a 47.000 para el dextrano 40 para validación yi ≤ 0.1 yi
(8)
SQR, i=m i=1
— 67.000 a 75.000 para el dextrano 60/70 para validación
(Σ )
p
Σ
SQR. P
yi > 0.1 yi
(9)
Masa molecular media de la fracción superior de dextrano i = m -1 i=l
(10 por ciento)
Calcular Mw para la fracción superior de dextrano (10 por p = número de bandas en que se ha dividido el cromato-
ciento) que eluye en la banda n, con ayuda de la ecuación: grama,

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.40. Espectrofotometría en el infrarrojo cercano
yi = altura que separa la línea de base del trazado del cro- Examinar las muestras en una cubeta transparente a la radia-
matograma en la banda i, ción del infrarrojo cercano, de un camino óptico adecuado
(generalmente 0,5 mm a 4 mm), o por inmersión de una
Mi = masa molecular en la banda i. sonda de fibra óptica de configuración adecuada, que permi-
2. Métodos
analíticos
te obtener un espectro situado en una región de transmitan-
El ensayo sólo es válido si el valor de Mw obtenido para la cia compatible con las especificaciones del espectrofotóme-
fracción inferior de dextrano (10 por ciento) es de: tro utilizado y apropiada para el uso propuesto.
— 6.000 a 8.500 para el dextrano 40 para validación SQR, Durante la medida del espectro de una muestra líquida, el
— 7.000 a 11.000 para el dextrano 60/70 para validación analista tendrá en cuenta el riesgo de modificaciones debi-
SQR. das a la temperatura o cualquier otro riesgo de perturbacio-
nes del espectro.
Distribución de la masa molecular del dextrano proble-
ma. Inyectar el volumen escogido de la disolución proble- En todos los casos, las interferencias deben compensarse en
ma. Calcular los valores de Mw que corresponden respectiva- función de la configuración óptica del aparato, por ejemplo
mente a la distribución de la masa molecular total, a la fracción substrayendo del espectro de la muestra un barrido blanco
superior de dextrano (10 por ciento) y a la fracción inferior de del aire (para los líquidos) o del disolvente (para las disolu-
dextrano (10 por ciento) siguiendo las indicaciones dadas en ciones).
el epígrafe “Validación del sistema cromatográfico”. Medida por reflexión difusa. Este método suele aplicarse
(1) El método Gauss-Newton, modificado por Hartley, se ha considera- a los sólidos.
do adecuado (ver O. Hartley, Tecnometrics, 3 (1961) y G. Nilsson y K
Nilsson, J. Chromat., 101, 137 (1974). Puede utilizarse un programa de Examinar las muestras en un dispositivo adecuado. En caso
ajuste de curvas para microordenador, capaz de efectuar regresiones no de utilizar una sonda de fibra óptica introducida en la mues-
lineales. tra, cuidar de que la sonda esté inmóvil durante el registro
del espectro y de que las condiciones de medida sean lo más
reproducibles posible entre una y otra muestra.
2.2.40. ESPECTROFOTOMETRÍA EN EL En todos los casos, deben compensarse las interferencias en
función de la configuración óptica del aparato, por ejemplo
INFRARROJO CERCANO por calibrado mediante un patrón de reflexión interna o
externa.
La espectrofotometría en el infrarrojo cercano es un método
particularmente útil para la identificación de las sustancias La granulometría y el grado de hidratación o de solvatación
orgánicas. A pesar de que los espectros se limitan a las reso- de la muestra también deben tenerse en cuenta.
nancias C-H, N-H, O-H y S-H, por regla general presentan
un contenido rico en información. No obstante, los espec- Medida por transflexión. Este método se aplica general-
tros dependen de un cierto número de características de la mente a los líquidos, diluidos o no, y a los sólidos en disolu-
sustancia tales como el tamaño de las partículas, el polimor- ción o en suspensión.
fismo, los disolventes residuales, la humedad, etc., que no Examinar la muestra en una cubeta provista de un reflector
siempre pueden controlarse. Por este motivo, suele ser difusor apropiado, que puede ser metálico o constituido por
imposible llevar a cabo una comparación directa del espec- una sustancia inerte (por ejemplo óxido de titanio), que no
tro obtenido con la sustancia a examinar con el espectro de presenta espectro en la región del infrarrojo cercano y que
referencia, lo que hace indispensable el tratamiento adecua- se introduce en la muestra a analizar en cantidad suficiente.
do de los datos, debidamente validado. Las muestras se examinan como se indica en “Medida por
transmisión” o en “Medida por reflexión difusa”, según el
APARATO caso.
Los espectrofotómetros adaptados al registro de espectros
en la región del infrarrojo cercano están constituidos por: CONTROL DEL FUNCIONAMIENTO DEL APARATO
— un dispositivo de filtros, redes o un interferómetro capa- Utilizar el aparato de acuerdo con las instrucciones del
ces de suministrar un conjunto de radiaciones electro- fabricante y efectuar las verificaciones prescritas a interva-
magnéticas en la región comprendida entre aproximada- los regulares, en función del grado de uso del aparato y de
mente 780 nm y 2500 nm (12.821 cm-1 a 4000 cm-1), las sustancias examinadas.
— un dispositivo que permite recoger y medir la intensidad Verificación de la escala de longitud de onda (excepto
de las radiaciones transmitidas (transmisión) o refleja- aparatos de filtro). Verificar la escala de longitud de onda
das (reflexión), tal como una esfera de integración, una empleada, generalmente situada entre 780 y 2.500 nm,
fibra óptica, etc., acoplado a un detector apropiado, mediante uno o varios patrones de longitud de onda apro-
piados, que presenten máximos característicos para las lon-
— un dispositivo de tratamiento matemático de los datos gitudes de onda en la región investigada, tales como el
espectrales obtenidos. poliestireno o los óxidos de tierras raras.
Verificación de la repetibilidad de longitud de onda
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA (excepto aparatos de filtro). Verificar la repetibilidad de
la longitud de onda con ayuda de uno o varios patrones ade-
Medida por transmisión. Este método se aplica general- cuados, tales como el poliestireno o los óxidos de tierras
mente a los líquidos, diluidos o no, y a los sólidos en disolu- raras. La desviación estándar de las longitudes de onda cum-
ción. ple con la especificación del espectrofotómetro.

2.2.41. Dicroísmo circular REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
Verificación de la repetibilidad de la respuesta. Verificar 2.2.41. DICROÍSMO CIRCULAR

la repetibilidad de la respuesta con ayuda de uno o varios
patrones apropiados, tales como las resinas termoplásticas
reflectantes adicionadas de negro de carbón. La desviación El dicroísmo circular se define como la diferencia en la
2. Métodos
absorbancia de las sustancias ópticamente activas dentro de

analíticos
estándar de la respuesta máxima cumple con la especifica-

ción del espectrofotómetro. una banda de absorción para la luz circularmente polarizada
hacia la derecha y hacia la izquierda.
Verificación del ruido fotométrico. Determinar el ruido
fotométrico con ayuda de un patrón de reflexión apropiado, La medida directa da un valor con significado algebraico:
tal como azulejos de cerámica blanca reflectante o resinas
termoplásticas reflectantes. Realizar un barrido del patrón ∆Α = AL - AR
de reflexión de acuerdo con las instrucciones del fabricante
del espectrofotómetro y calcular el ruido fotométrico, sea de ∆A = absorbancia de dicroísmo circular.
pico a pico, o bien para una longitud de onda dada. En este
AL = absorbancia de la luz circularmente polarizada hacia
último caso, el ruido viene representado por la desviación
estándar de las respuestas. El ruido fotométrico cumple con la izquierda.
la especificación del espectrofotómetro. AR = absorbancia de la luz circularmente polarizada hacia
la derecha.
ESTABLECIMIENTO DE UNA BIBLIOTECA
DE REFERENCIAS ESPECTRALES El dicroísmo circular se calcula a partir de la ecuación:
Registrar el espectro de un número apropiado de lotes de la ∆Α

sustancia a examinar, los cuales se habrán analizado com- ∆ε = εL - εR = ———
c×l
pletamente siguiendo los métodos prescritos por la mono-
grafía, y que presentan las variaciones típicas para la sustan- ∆ε = coeficiente de absorción molar por dicroísmo circu-
cia en cuestión (por ejemplo, proveedor, tamaño de las lar o coeficiente de absorción molar diferencial de
partículas, etc.). La serie de espectros obtenidos representa dicroísmo circular, expresada en litro·mol-1·cm-1.
la cantidad de información que debe figurar en el modelo
matemático que define los límites de semejanza para la sus- εL = coeficiente de absorción molar (2.2.25) de la luz cir-
tancia y representa la entrada de esta sustancia en la base de cularmente polarizada hacia la izquierda.
datos espectrales utilizada para la identificación. El número
de sustancias presentes en la base de datos depende del uso εR = coeficiente de absorción molar de la luz circular-
propuesto para la misma. mente polarizada hacia la derecha.
La colección de espectros presentes en la base de datos c = concentración de la disolución problema en
puede representarse de varias formas, según la técnica mate- mol·litro-1.
mática utilizada para la identificación. Puede tratarse:
l = paso óptico de la cubeta en centímetros.
— de espectros individuales que representan la sustancia,
Las siguientes unidades pueden utilizarse para caracterizar
— del espectro promedio de la sustancia, acompañado de el dicroísmo circular:
una descripción de la variabilidad.
Factor de disimetría:
La selectividad de la base de datos, es decir su aptitud para
identificar positivamente una sustancia y distinguirla de g = ∆ε/ε
otras sustancias también presentes en la base de datos, debe
demostrarse durante la validación. La selectividad debe vol- ε = coeficiente de absorción molar (2.2.25).
verse a comprobar regularmente de modo que se garantice
la validez de la base de datos a lo largo del tiempo. Esta ope-
ración debe efectuarse siempre que se produzca un cambio Elipticidad molar:
importante que pueda afectar a la sustancia, por ejemplo un
Algunos instrumentos calculan directamente el valor de la
cambio de proveedor o una modificación del proceso de
elipticidad θ, expresada en grados. Cuando se utilizan
fabricación.
dichos instrumentos, la elipticidad molar [θ] se puede cal-
A partir de su validación, la base de datos sólo será utiliza- cular utilizando la siguiente ecuación:
ble con el equipo inicial o con un equipo semejante, a con-
dición de que se demuestre que el banco de datos transferi- θ×M
do al nuevo aparato sigue siendo válido. [θ] = ——————
c × l × 10
Procedimiento. Preparar la muestra de la misma manera
que durante la creación de la base de datos. Para facilitar la [θ] = elipticidad molar, expresada en grado·cm2·decimol-1,
comparación de los espectros, puede emplearse una trans-
formación matemática adecuada del log (1/T) o del θ = valor de la elipticidad dada por el instrumento,
log (1/R), por ejemplo una derivada segunda o una correc-
ción de dispersión multiplicativa. M = masa molecular de la sustancia a examinar,
La comparación de las transformaciones del espectro de la c = concentración de la disolución problema en g/ml,
muestra y de la biblioteca de referencias espectrales requiere el
uso de una técnica de clasificación quimiométrica apropiada. l = paso óptico de la cubeta en centímetros.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.41. Dicroísmo circular
La elipticidad molar está además relacionada con el dicroís- tado a un circuito amplificador que produce dos señales
mo circular molar por la siguiente ecuación: eléctricas: una es una corriente continua Vc y otra es una
corriente alterna modulada con una frecuencia característica
4500 Vac de la muestra a examinar. La fase de la corriente alterna
2. Métodos
[θ] = 2,303 ∆ε ———— ≈ 3300 ∆ε
analíticos
proporciona el signo del dicroísmo circular. La relación
π Vac/Vc es proporcional a la diferencia de absorción ∆A que
crea la señal. La región de longitudes de onda normalmente
La elipticidad molar se utiliza habitualmente en el análisis cubierta por el dicrógrafo es de 170 nm a 800 nm.
de proteínas y ácidos nucleicos. En este caso, la concentra-
ción molar se expresa respecto al residuo monomérico, cal- Calibrado del aparato
culado utilizando la expresión:
Exactitud de la escala de absorbancia. Disolver 10,0 mg
masa molecular
—————————————— de isoandrosterona R en dioxano R y diluir hasta 10,0 ml
número de aminoácidos con el mismo disolvente. Registrar el espectro del dicroís-
mo circular de la disolución entre 280 nm y 360 nm. Medi-
La masa molecular media del residuo monomérico está da en el máximo a 304 nm, ∆ε es + 3,3.
comprendida entre 100 y 120 (en general 115) para las pro-
teínas y aproximadamente de 300 para los ácidos nucleicos La disolución del ácido (1S)-(+)-10-canforsulfónico R se
(como sales de sodio). puede utilizar también.
Instrumento. La fuente de radiación (S) es una lámpara de Linealidad de la modulación. Disolver 10,0 mg del ácido
xenon; la luz pasa a través de un monocromador doble (M) (1S)-(+)-10-canfo-sulfónico R en agua R y diluir hasta 10,0
equipado con primas de cuarzo (P1, P2). ml con el mismo disolvente. Determinar la concentración
exacta del ácido canforsulfónico en la disolución por espec-
El haz de luz procedente del primer monocromador se divi- trofotometría de absorción en el ultravioleta (2.2.25), toman-
de en dos componentes polarizados en planos perpendicula- do como valor de absorbancia específica 1,49 a 285 nm.
res en el segundo monocromador. La rendija de salida del
monocromador elimina el rayo extraordinario. Registrar el espectro de dicroísmo circular entre 185 nm y
340 nm. Medida en el máximo a 290,5 nm, ∆ε está com-
La luz polarizada y monocromática pasa a través de un prendido entre +2,2 y +2,5. Medida en el máximo a 192,5
modulador birrefringente (Cr): el resultado es una luz pola- nm, ∆ε está comprendido entre -4,3 y -5.
rizada circularmente de carácter alterno.
El (1S)-(+)-10-canforsulfonato de amonio R o su opuesto el
El haz de luz pasa a través de la muestra a examinar (C) y (1R)-(-)-10-canforsulfonato de amonio R se pueden utilizar
alcanza el fotomultiplicador (PM) que se encuentra conec- también.
Figura 2.2.41.-1.—Esquema óptico de un dicrógrafo.

2.2.42. Densidad de sólidos REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
2.2.42. DENSIDAD DE SÓLIDOS cual es equivalente al volumen de gas desplazado por

el polvo y utilizando un picnómetro de desplazamiento
de gas (2.9.23). En las medidas de densidad por picno-
Se denomina densidad de un sólido a su masa media por uni- metría, el volumen determinado incluye el volumen
2. Métodos
dad de volumen y generalmente se expresa en gramos por

analíticos
ocupado por los poros abiertos; sin embargo excluye el

centímetro cúbico (g/cm3) aunque la unidad internacional es volumen ocupado por los poros cerrados o inaccesibles
el kilogramo por metro cúbico (1g/cm3 = 1000 Kg /m3). al gas. Debido a la alta difusividad del helio, que es el
gas de elección, la mayoría de los poros abiertos son
A diferencia de los líquidos y los gases cuya densidad accesibles al gas. Por tanto, la densidad por picnome-
depende únicamente de la temperatura y de la presión, la tría de un polvo perfectamente homogeneizado no
densidad de una partícula sólida también depende del con- difiere mucho de la densidad del cristal.
junto molecular y por tanto varía con la estructura del cristal
y el grado de cristalinidad. B. La densidad por porosimetría con mercurio, también
llamada densidad granular. El volumen determinado
Cuando una partícula sólida es amorfa o parcialmente amor- por este método también excluye las contribuciones de
fa, su densidad puede depender además, de las condiciones los poros cerrados; e incluye solamente el volumen de
de su preparación y de tratamientos posteriores. los poros abiertos superiores a un tamaño límite. Este
tamaño de poro límite o diámetro mínimo de acceso,
En consecuencia a diferencia de los fluidos, las densidades de depende de la presión máxima de intrusión del mercu-
dos sólidos similares químicamente pueden ser diferentes y rio aplicada durante la medida. En condiciones norma-
esta diferencia refleja una diferencia en la estructura del esta- les de presión, el mercurio no penetra en los poros más
do sólido. La densidad de las partículas constituyentes es una pequeños pero accesibles al helio. Se pueden obtener
característica física importante de los polvos farmacéuticos. distintas densidades granulares para una misma mues-
La densidad de una partícula sólida puede tomar diferentes tra, ya que, para cada presión de intrusión de mercurio
valores dependiendo del método utilizado para la medida aplicada, se puede determinar una densidad que corres-
del volumen de la partícula. Se pueden distinguir tres for- ponde al tamaño de poro límite para esa presión.
mas de expresar la densidad:
III. Densidad del producto a granel y asentado
— densidad del cristal sólo incluye la fracción sólida del
material; la densidad del cristal también se denomina La densidad el producto a granel de un polvo incluye la con-
densidad verdadera; tribución del volumen vacío interparticular. Por tanto depen-
de de ambos, de la densidad de las partículas de polvo y de
— densidad de la partícula que también incluye el volumen la configuración espacial de las partículas en el lecho del
correspondiente a los poros intraparticulares; polvo.
— densidad del producto a granel que además incluye el La densidad del producto a granel generalmente es muy difí-
volumen vacío interparticular existente en el conjunto cil de medir puesto que una variación en el lecho del polvo
del polvo; también se denomina densidad aparente. puede dar lugar a una variación en la densidad. Por tanto,
cuando se expresa la densidad del producto a granel, es esen-
I. Densidad del cristal cial especificar como se ha realizado la determinación.
La densidad del cristal de una sustancia es la masa media A. La densidad del producto a granel se determina midien-
por unidad de volumen, excluyendo todo volumen vacío que do el volumen de una masa de polvo conocida que ha
no forme parte del entramado molecular. Es una propiedad pasado a través de un tamiz, dentro de un cilindro gra-
intrínseca de la sustancia y por tanto debe ser independiente duado (2.9.15).
del método de determinación. La densidad del cristal se B. La densidad del producto asentado se determina
puede determinar mediante cálculos o mediante medidas. midiendo una muestra de polvo golpeada mecánicamen-
A. La densidad del cristal calculada se obtiene mediante te en una probeta. Después de observar el volumen ini-
datos cristalográficos (tamaño y composición de la celdilla cial, la probeta se golpea mecánicamente y la lectura se
unidad) de un cristal perfecto, por ejemplo con datos de realiza cuando los cambios de volumen observados sean
difracción de rayos X y el peso molecular de la sustancia. inapreciables (2.9.15).
B. La densidad del cristal medida es la relación masa/volu-

men obtenida después de medir la masa y el volumen
del monocristal. 2.2.43. ESPECTROMETRÍA DE MASAS
II. Densidad de la partícula La espectrometría de masas se basa en la medida directa de

la relación de la masa con el número de cargas elementales
La densidad de la partícula considera la densidad del cristal positivas o negativas de los iones (m/z) en la fase gaseosa
y la porosidad intraparticular (poros abiertos y/o cerrados). obtenida de la sustancia a analizar. Esta relación se expre-
Por tanto, depende del valor del volumen determinado que a sa en unidades de masa atómica (u), (1 u = la doceava
su vez depende del método de medida. La densidad de la parte de la masa de un átomo de carbono 12) o en daltons
partícula se puede determinar por uno de los dos métodos (1 Da = a la masa del átomo de hidrógeno).
siguientes:
Los iones producidos en la fuente de iones del instrumento,
A. La densidad por picnometría se determina midiendo el son acelerados y posteriormente separados por el analiza-
volumen ocupado por una masa conocida de polvo la dor antes de llegar al detector. Todas estas operaciones tie-

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.43. Espectrometría de masas
nen lugar en una cámara en la que un sistema de bombeo Otros tipos de acoplamientos (electronebulización, termo-
mantiene un vacío de 10-3 Pa a 10-6 Pa. nebulización, ionización química a presión atmosférica), se
consideran por derecho propio técnicas de ionización y
El espectro resultante muestra la abundancia relativa de las se describen en la sección de formas de ionización.
2. Métodos
distintas especies iónicas presentes, en función de m/z. La
analíticos
señal correspondiente a un ion aparece en forma de varios Cromatografía de fluidos supercríticos/espectrometría de
picos que corresponden a la distribución estadística de los masas. La fase móvil, que consiste generalmente en dióxi-
distintos isótopos del ion. A esta representación se le llama do de carbono supercrítico, se convierte en estado gaseoso
perfil isotópico y (por lo menos en moléculas pequeñas) al después de atravesar un restrictor calentado entre la colum-
pico que representa la mayor abundancia de isótopos para na y la fuente de iones.
cada átomo se le denomina pico monoisotópico.
La información obtenida por espectrometría de masas es Electroforesis capilar/espectrometría de masas. Se intro-
esencialmente cualitativa (determinación de masa molecu- duce el eluyente en la fuente de ionización, en ciertos casos
lar, información sobre la estructura a partir de los fragmen- después de añadirle otro disolvente para conseguir alcanzar
tos obtenidos) o cuantitativa (utilizando patrones internos o caudales del orden de varios microlitros por minuto. Esta
externos), con límites de detección desde picomoles a fem- técnica está limitada por las pequeñas cantidades de mues-
tomoles. tra introducidas y por la necesidad de utilizar tampones
volátiles.
Introducción de la muestra
El primer paso de un análisis es la introducción de la mues- Formas de ionización
tra en el instrumento sin modificar el vacío. En un método
usual, llamado introducción directa de líquidos, la muestra Impacto de electrones. La muestra, en estado gaseoso, se
se coloca al final de una varilla cilíndrica (en un crisol de ioniza mediante un haz de electrones cuya energía (general-
cuarzo, sobre un filamento o sobre una superficie metálica). mente 70 eV) es mayor que la energía de ionización de la
Esta varilla se introduce en el espectrómetro después de muestra. Además del ion molecular M+, se observan frag-
atravesar una cámara de vacío, en la que se mantiene un mentos característicos de la estructura molecular. Esta téc-
vacío primario intermedio entre la presión atmosférica y el nica está limitada principalmente por la necesidad de vapo-
vacío secundario del instrumento. rizar la muestra. Esto la hace poco recomendable para
compuestos polares, termolábiles o de alto peso molecular.
Otros sistemas de introducción, permiten analizar los com- El impacto de electrones es compatible con el acoplamiento
ponentes de una mezcla, según van siendo separados por un de la cromatografía de gases a la espectrometría de masas y
equipo apropiado, conectado al espectrómetro de masas. a veces con la utilización de cromatografía de líquidos.
Cromatografía de gases/espectrometría de masas. La utili-
zación de columnas adecuadas (capilares o semicapilares) Ionización química. Este tipo de ionización implica el
permite que el final de la columna pueda introducirse directa- empleo de un gas reactivo como metano, amoníaco, óxido
mente en la fuente del instrumento sin utilizar un separador. de nitrógeno, dióxido de nitrógeno u oxígeno. El espectro se
caracteriza por los iones del tipo (M + H)+ o (M - H)-, o por
Cromatografía de líquidos/espectrometría de masas. Esta aductos iónicos formados a partir del analito y del gas utili-
combinación es especialmente valiosa para el análisis de zado. Se producen menos fragmentos que con el impacto
compuestos polares, que no sean suficientemente volátiles o electrónico. Cuando la muestra es termolábil se utiliza una
que sean termolábiles para ser analizados por cromatografía variante de este método: la muestra, aplicada a un filamento
de gases acoplada con espectrometría de masas. Es un méto- se vaporiza rápidamente por efecto Joule - Thomson (ioni-
do complicado por la dificultad de obtener iones en fase zación por desorción química).
gaseosa a partir de una fase líquida, para lo cual se requie-
ren interfases muy específicas como: Bombardeo con átomos acelerados (FAB) o ionización por
bombardeo con iones acelerados (espectrometría de masas
— introducción directa de líquido: la fase móvil se nebuli- de iones secundarios líquidos LSIMS). La muestra, disuel-
za y se evapora el disolvente delante de la fuente de ta en una matriz viscosa como el glicerol, se aplica sobre
iones del instrumento, una superficie metálica y se ioniza con un haz de átomos
— interfase de haz de partículas: la fase móvil, que puede neutros, tales como argón o xenón o iones cesio de alta ener-
fluir a una velocidad mayor de 0,6 ml/min, se nebuliza gía cinética. Se forman iones del tipo (M + H)+ o (M - H)- o
en una cámara de desolvatación, de tal forma que sólo aductos iónicos formados a partir de la matriz o de la mues-
los analitos en estado neutro llegan a la fuente de iones tra. Este tipo de ionización es válida para compuestos pola-
del instrumento; esta técnica se utiliza para compuestos res y termolábiles, permitiendo determinar pesos molecula-
de polaridad relativamente baja y peso molecular menor res superiores a 10.000 Da. Esta técnica se puede combinar
de 1000 Da, con la cromatografía de líquidos añadiendo entre un 1 por
ciento y un 2 por ciento de glicerol a la fase móvil, sin
— interfase de cinta transportadora: la fase móvil, que embargo, el caudal debe ser muy bajo (unos pocos microli-
puede fluir a una velocidad mayor de 1 ml/min, se depo- tros por minuto). Estas técnicas de ionización permiten tam-
sita sobre la superficie de una cinta transportadora y tras bién analizar placas de cromatografía de capa fina, aplican-
la evaporación del disolvente, los componentes a deter- do una fina capa de matriz a la superficie de las placas.
minar son transportados de forma sucesiva hasta la fuen-
te de iones del instrumento donde se ionizan; esta técni- Desorción por campo e ionización por campo. La muestra
ca no es recomendable para compuestos muy polares o se vaporiza cerca de un filamento de wolframio cubierto con
termolábiles. microagujas (ionización por campo) o aplicada en el fila-

2.2.43. Espectrometría de masas REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
mento (desorción por campo). Se aplica un voltaje de unos solapada respecto a la altura del pico (definición de
10 kV, entre el filamento y el contraelectrodo, que ioniza la valle); por ejemplo un poder de resolución (M/∆M) de
muestra. Estas dos técnicas producen principalmente iones 1.000 con un 10 por ciento de definición de valle, permi-
M+ e iones (M + H)+ y se emplean para compuestos de baja te la separación de relaciones m/z entre 1.000 y 1.001
2. Métodos
analíticos
polaridad y/o compuestos termolábiles. cuando la intensidad vuelve a estar por encima del 10
por ciento de la línea base. Sin embargo, el poder de
Ionización por desorción laser favorecida por una matriz resolución en algunos casos (analizadores de tiempo de
(MALDI). La muestra, dentro de una matriz adecuada y vuelo, cuadrupolares y analizadores de trampa de iones)
depositada sobre un soporte metálico, se ioniza por un haz se puede definir como la relación entre la masa molecu-
de laser pulsante cuya longitud de onda puede estar com- lar y el ancho del pico a media altura (50 por ciento de la
prendida desde el UV al IR (la duración de los impulsos será definición de valle).
desde un picosegundo a unos pocos nanosegundos). Esta
forma de ionización tiene un papel importante en el análisis Analizadores magnéticos y electrostáticos. Los iones pro-
de compuestos de elevado peso molecular (más de 100.000 ducidos en la fuente de iones se aceleran mediante un volta-
Da), pero está limitada a los analizadores de tiempo de je V y se enfocan hacia un analizador magnético (campo
vuelo (ver más adelante). magnético B) o un analizador electrostático (campo eléctri-
co E), dependiendo de la configuración del instrumento.
Electronebulización. Esta forma de ionización se realiza a Siguen una trayectoria de radio r de acuerdo con la ley de
presión atmosférica. Las muestras, en disolución, se intro- Laplace:
ducen en la fuente a través de un tubo capilar, al final del
cual se establece un potencial del orden de 5 kV. Se puede 2 2
utilizar un gas para facilitar la nebulización. La desolvata- m/z = B r

2V
ción de las microgotas resultantes produce iones de carga
única o múltiple en la fase gaseosa. El caudal varía de unos
microlitros por minuto a 1 mililitro por minuto. Esta técnica Se pueden usar dos tipos de barridos para recoger y medir
es válida para compuestos polares y para la investigación de los distintos iones producidos por la fuente de iones: un
biomoléculas con pesos moleculares superiores a 100.000 barrido de B manteniendo V fijo o un barrido de V con B
Da. Puede acoplarse a la cromatografía de líquidos o a la constante. Generalmente al analizador magnético le sigue
electroforesis capilar. un sector eléctrico que actúa como un filtro de la energía
cinética y permite que se incremente apreciablemente el
Ionización química a presión atmosférica (APCI). La poder de resolución del instrumento. El poder de resolución
ionización se lleva a cabo a presión atmosférica por la máximo de este instrumento (de doble sector) varía desde
acción de un electrodo que se mantiene a un potencial de 10.000 a 150.000 y en la mayoría de los casos se puede cal-
varios kilovoltios y colocado en la trayectoria de la fase cular el valor de las relaciones m/z con exactitud suficiente
móvil, la cual se nebuliza por los efectos térmicos y por el para determinar la composición elemental de los correspon-
uso de una corriente de nitrógeno. Los iones resultantes lle- dientes iones. Para iones monovalentes el intervalo de peso
van una única carga y son del tipo (M + H)+ si son positivos varía desde 2.000 Da a 15.000 Da. Algunos iones pueden
y (M - H)- si son negativos. La posibilidad de utilizar cauda- descomponerse espontáneamente (transiciones metaesta-
les altos (mayores de 2 ml/min) con este tipo de ionización, bles) o por colisiones con un gas (disociación activada por
la convierte en la técnica ideal para acoplarla con la croma- colisiones [CAD]) en las zonas de campo nulo entre la fuen-
tografía de líquidos. te de ionización y el detector. El examen de estas descom-
posiciones es muy útil para la elucidación de la estructura,
Termonebulización. La muestra, en una fase móvil consis- así como para la caracterización de un compuesto específi-
tente en agua y modificadores orgánicos y que contiene un co dentro de una mezcla, e implica el uso de espectrómetros
electrolito volátil (generalmente acetato de amonio) se intro- de masas acoplados. Hay muchas de estas técnicas depen-
duce nebulizada después de haber pasado a través de un diendo de la zona en la que transcurre esta descomposición:
capilar metálico a temperatura controlada. Son caudales
aceptables los del orden de 1 ml/min a 2 ml/min. Los iones — método de los iones hijos (determinación de los iones de
del electrolito ionizan a los compuestos que se van a anali- descomposición a partir de un ion progenitor dado):
zar. Este proceso de ionización se puede reemplazar o B/E = constante, MIKES (Espectrometría de Iones con
potenciar por una descarga eléctrica de aproximadamente Energía Cinética analizados por Masas),
800 voltios, principalmente cuando los disolventes son
totalmente orgánicos. Esta técnica es compatible con el uso — método del ion progenitor (determinación de todos los
de cromatografía de líquidos acoplada con espectrometría iones que por descomposición dan un ion con una rela-
de masas. ción m/z específica): B2/E = constante,
— método de pérdida de parte neutra (detección de todos
Analizadores los iones que pierden el mismo fragmento): B/E(1-
E/Eo) 1/2 = constante, donde Eo es el voltaje básico del
Las diferencias en las prestaciones de los analizadores sector eléctrico.
dependen principalmente de dos parámetros:
Cuadrupolos. El analizador consta de cuatro varillas
— el intervalo en el que se pueden medir las relaciones m/z, metálicas paralelas de sección transversal cilíndrica o hiper-
por ejemplo, el intervalo de masas, bólica. Están dispuestas simétricamente respecto a la tra-
yectoria de los iones; se conecta eléctricamente cada par
— su poder de resolución, caracterizado por la capacidad diagonalmente opuesto, respecto al eje de simetría. Los
de separar dos iones de la misma intensidad con relacio- potenciales de los dos pares de varillas son opuestos y son
nes m/z que difieran en ∆M y cuyo solapamiento se la resultante de una componente constante y una compo-
expresa en forma de porcentaje de la altura de la porción nente alternante. Los iones producidos en la fuente de ioni-

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.43. Espectrometría de masas
zación se transportan y se separan variando los voltajes apli- tar considerablemente utilizando un espejo electrostático
cados a las varillas, de tal forma que la relación entre volta- (reflectrón).
je continuo y voltaje alterno permanezca constante. Los
cuadrupolos determinan normalmente un intervalo de
2. Métodos
Obtención de señales
analíticos
masas de 1 u hasta 2.000 u, pero a veces se puede extender
el intervalo por encima de 4.000 u. Como tienen menor Esencialmente hay tres métodos.
poder de resolución que los analizadores de sector magnéti-
co, no permiten obtener el perfil monoisotópico de los iones Método del espectro completo. Se registra toda la señal
monocargados en un intervalo completo de masas. Es posi- obtenida en un intervalo de masas seleccionado. El espectro
ble obtener espectros utilizando tres cuadrupolos conecta- representa la intensidad relativa de las diferentes especies
dos en serie, Q1, Q2, Q3 (Q2 sirve de celda de colisión y no iónicas presentes, en función de m/z. Los resultados son
es realmente un analizador; el gas de colisión que se utiliza principalmente cualitativos. Para una identificación rápida
generalmente es el argón). se pueden utilizar colecciones de espectros de referencia.
Las formas más comunes de realizar el barrido son las Método fragmentométrico (Monitorización del ion selec-
siguientes: cionado). La señal obtenida es únicamente de uno o
varios iones característicos de la sustancia a analizar (moni-
— en el método de los iones hijos: Q1 selecciona un ión m/z torización de un único ion (SIM) y monitorización de múl-
cuyos fragmentos obtenidos por colisión en Q2 son ana- tiples iones (MIM)). En este método se consiguen límites
lizados por Q3, de detección considerablemente más bajos. En los análisis
— en el método del ion progenitor: Q3 filtra sólo una rela- cuantitativos o semicuantitativos se pueden utilizar patrones
ción m/z específica, mientras Q1 hace un barrido en un externos o internos (por ejemplo, patrones deuterados).
Estos análisis no pueden realizarse con un analizador de
intervalo de masa dado. Sólo se detectan en Q3 los iones
tiempo de vuelo.
que se descomponen a partir del ion seleccionado,
Espectrometría de masas por el método fragmentométrico
— en el método de pérdida de parte neutra: Q1 y Q3 hacen
doble (monitorización de reacción múltiple (MRM)). Se
un barrido en un determinado intervalo de masa pero
va investigando específicamente la descomposición unimo-
con una diferencia correspondiente a la pérdida de un
lecular o bimolecular de un determinado ion precursor,
fragmento característico de un producto o de una familia
característico de la sustancia a examinar. Debido a la selec-
de compuestos.
tividad y a la naturaleza tan específica de esta forma de
También es posible obtener espectros combinando los ana- obtención de señales, se consiguen excelentes niveles
lizadores cuadrupolares con instrumentos de sector elec- de sensibilidad y hacen de él, el sistema más apropiado para
trostático o magnético, a estos instrumentos se les denomi- estudios cuantitativos utilizando patrones internos adecua-
na espectrómetros de masa híbridos. dos (por ejemplo, patrones deuterados). Este tipo de análisis
sólo se puede realizar en aparatos con tres cuadrupolos en
Analizadores de trampa de iones. El fundamento es el serie, analizadores de trampa de iones o analizadores de
mismo que el del cuadrupolar, pero en este caso con los resonancia - ciclotrón.
campos eléctricos en tres dimensiones. Con estos analiza-
dores se pueden obtener espectros de los iones formados
Calibrado
durante varias generaciones (MS n).
El calibrado permite atribuir a una señal obtenida el valor
Analizadores de resonancia iónica ciclotrónica. Los iones
correspondiente de m/z. Por regla general se realiza con
producidos en una celda y sometidos a un campo magnético
una sustancia de referencia. Esta calibración puede ser
intenso y uniforme, se mueven en órbitas circulares a unas
externa (obtención de un registro independiente del análi-
frecuencias que se pueden correlacionar directamente con su
sis) o interna (la sustancia de referencia se mezcla con la
relación m/z aplicando el algoritmo de la transformada de
sustancia a examinar y aparece sobre el mismo registro). El
Fourier. Este fenómeno se llama resonancia de iónica ciclo- número de iones o puntos necesarios para una calibración
trónica. Estos analizadores constan de unos magnetos super- fiable depende del tipo de analizador y de la exactitud
conductores y proporcionan un poder de resolución muy ele- deseada en las medidas, por ejemplo, en el caso de un ana-
vado (por encima de 1.000.000 o más) así como espectros lizador magnético, en el que la relación m/z varía exponen-
MS n. Sin embargo se requieren presiones muy bajas (del cialmente con el valor del campo magnético, debe de haber
orden de 10-7 Pa). tantos puntos como sea posible.
Analizadores de tiempo de vuelo. Los iones producidos en
la fuente de iones son acelerados a un voltaje V entre 10 kV Detección de señales y procesamiento de datos
y 20 kV. Pasan a través del analizador, que consiste en un
tubo de campo nulo de 25 cm a 1,5 m de longitud, general- Los iones separados por un analizador se transforman en
mente llamado tubo de vuelo. El tiempo (t) para que un ion señales eléctricas mediante un sistema de detección tal
llegue hasta el detector es proporcional a la raíz cuadrada de como un fotomultiplicador o un multiplicador de electro-
la relación m/z. Teóricamente se podría analizar un interva- nes. Estas señales se amplifican antes de ser reconvertidas
lo de masas infinito. En la práctica está limitado por el en señales digitales, para el procesamiento de los datos, per-
método de ionización o desorción. Los analizadores de mitiendo varias opciones como calibración; reconstrucción
tiempo de vuelo se utilizan principalmente para compuestos de espectros; cuantificación automática; archivado y crea-
de elevado peso molecular (del orden de cientos de miles de ción o consulta de colecciones de espectros de masas.
daltons). Esta técnica es muy sensible (son suficientes algu- Mediante un ordenador se controlan los distintos paráme-
nos picomoles de producto). La exactitud de las medidas y tros físicos, para que el instrumento funcione como un
el poder de resolución del instrumento se pueden incremen- todo.

2.2.44. Carbono orgánico total en agua destinada... REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
2.2.44. CARBONO ORGÁNICO TOTAL para obtener una disolución que contenga 1,19 mg de saca-
rosa por litro (0,50 mg de carbono por litro).
EN AGUA DESTINADA A USO
FARMACÉUTICO Disolución problema. Utilizando las debidas precauciones
2. Métodos
para evitar la contaminación, recoger la muestra de agua a

analíticos
examinar en un envase hermético dejando el mínimo espa-

La determinación del carbono orgánico total (COT) es una cio en la parte superior. Examinar el agua con la mínima
medida indirecta de las sustancias orgánicas presentes en el demora con el fin de reducir la contaminación procedente
agua destinada a uso farmacéutico. Se puede utilizar tam- del envase y de los cierres.
bién para controlar la eficacia de diversas operaciones en la
preparación de medicamentos. Disolución para determinar la idoneidad del sistema. Disol-
ver 1,4-benzoquinona R en agua para determinación de
Se dispone de varios métodos adecuados para la determi- COT para obtener una disolución que tenga una concentra-
nación del COT. En lugar de la descripción de un método ción de 0,75 mg de 1,4-benzoquinona por litro (0,50 mg de
dado a utilizar, el presente capítulo general describe los carbono por litro).
procedimientos utilizados para cualificar el método selec-
cionado y para interpretar los resultados en los ensayos Agua control para determinación de COT. Utilizar agua
límite. Se analiza una disolución de referencia, en interva- para determinación de COT obtenida al mismo tiempo que
los adecuados, dependiendo de la frecuencia de las medi- la utilizada para la preparación de la disolución de referen-
das; la disolución se prepara con una sustancia fácilmente cia y la disolución para determinar la idoneidad del sistema.
oxidable (por ejemplo, sacarosa) a una concentración ajus- Disoluciones control. Además del agua control para deter-
tada para obtener una respuesta instrumental correspon- minación de COT, preparar las disoluciones blanco adecua-
diente al límite de COT a medir. La idoneidad del sistema das u otras disoluciones necesarias para establecer la línea
se determina por análisis de una disolución preparada con base o para los ajustes de la calibración siguiendo las ins-
una sustancia que se oxida con dificultad (por ejemplo, la trucciones del fabricante; procesar los blancos adecuados
1,4-benzoquinona). para ajustar a cero del instrumento.
Los diversos tipos de aparatos utilizados para la medida del Idoneidad del sistema. Procesar las siguientes disoluciones
COT en agua destinada a uso farmacéutico tienen en común y registrar las respuestas: agua para determinación de COT
el objetivo de la oxidación completa de las moléculas orgá- (rw); disolución de referencia (rs); disolución para determi-
nicas presentes en la muestra de agua para producir dióxido nar la idoneidad del sistema (rss). Calcular la eficacia por-
de carbono y la posterior medida del mismo. El resultado se centual de respuesta utilizando la expresión:
utiliza para calcular la concentración de carbono en el agua.
El aparato utilizado debe discriminar entre carbono orgáni- rss - rw × 100
co y carbono inorgánico, estando éste último presente como rs - rw
carbonato. La discriminación se puede efectuar bien por
medida del carbono inorgánico y sustracción del carbono El sistema es idóneo si la eficacia de la respuesta no es
total o bien por supresión del carbono inorgánico en la menos del 85 por ciento y no más del 115 por ciento de la
muestra antes de la oxidación. La supresión puede también respuesta teórica.
afectar a las moléculas orgánicas, pero el carbono orgánico
que se puede suprimir se encuentra presente en cantidades Procedimiento. Procesar la disolución problema y registrar
insignificantes en el agua destinada a uso farmacéutico. la respuesta (ru). La disolución problema satisface el ensayo
si ru no es superior a rs – rw.
Aparato. Utilizar un instrumento calibrado instalado bien
en línea o fuera de línea. Comprobar la idoneidad del siste- El método se puede también acoplar a una instrumentación
ma en intervalos de tiempo adecuados, como se describe en línea que se haya calibrado adecuadamente y que se
más adelante. El aparato debe tener un límite de detección demuestre que presenta una adecuación al sistema acepta-
especificado por el fabricante de 0,05 mg o menos de carbo- ble. Se debe elegir la localización de la instrumentación con
no por litro. el fin de asegurar que las respuestas son representativas del
agua utilizada.
Agua para determinación de COT. Utilizar agua de alta
pureza que cumpla las siguientes especificaciones:
— conductividad: no superior a 1,0 µS·cm-1 a 25 ºC, 2.2.45. CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
— carbono orgánico total: no superior a 0,1 mg/l. SUPERCRÍTICOS
Dependiendo del tipo de aparato utilizado, el contenido de
metales pesados y de cobre puede ser crítico. Se deben La cromatografía de fluidos supercríticos (CFS) es una téc-
seguir las instrucciones del fabricante. nica de separación cromatográfica en la que la fase móvil es
un fluido en un estado supercrítico o subcrítico. La fase
Preparación del material de vidrio. Utilizar material de estacionaria, contenida en una columna, puede estar consti-
vidrio sometido a un escrupuloso método de limpieza que tuida por partículas sólidas finamente divididas, tales como
elimine la materia orgánica. Utilizar agua para determina- sílice o grafito poroso; dicha fase estacionaria puede estar
ción de COT para el aclarado final del material de vidrio. químicamente modificada, como la que se utiliza en la cro-
matografía de líquidos o, para columnas capilares, puede
Disolución de referencia. Disolver sacarosa R, desecada a estar constituida por una película líquida reticulada unifor-
105 ºC durante 3 h, en agua para determinación de COT memente extendida sobre las paredes de la columna.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.46. Técnicas de separación cromatográfica
La CFS se basa en mecanismos de adsorción o distribución Los criterios para determinar la idoneidad del sistema están
de masas. descritos en el capítulo Técnicas de separación cromatográ-
fica (2.2.46). En este capítulo se incluyen también los límites
entre los que pueden variar los parámetros para satisfacer los
2. Métodos
APARATO
analíticos
criterios de idoneidad del sistema.
Consiste generalmente en un sistema de bombeo refrigerado,
un inyector, una columna cromatográfica, colocada en una
estufa, un detector, un regulador de la presión y un dispositi-
vo de recogida de datos (o un integrador o un registrador). 2.2.46. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
Sistema de bombeo
CROMATOGRÁFICA
Se requieren sistemas de bombeo para suministrar la fase Las técnicas de separación cromatográfica son métodos de
móvil a un caudal constante. Conviene que las fluctuaciones separación en múltiples etapas que se basan en la distribu-
de la presión sean mínimas, por ejemplo haciendo pasar el ción de los componentes de una muestra entre 2 fases, una
disolvente a presión a través de un dispositivo que amorti- estacionaria y otra móvil. La fase estacionaria puede ser un
güe las pulsaciones. Los tubos y conexiones deben ser capa- sólido, un líquido sobre un soporte sólido o un gel. La fase
ces de resistir las presiones desarrolladas por el sistema de estacionaria puede estar como relleno en una columna,
bombeo. extendida como una capa, distribuida en forma de película,
Los sistemas controlados por microprocesadores son capa- etc. La fase móvil puede ser gaseosa, líquida o estar en
ces de suministrar exactamente una fase móvil en condicio- forma de fluido supercrítico. La separación puede basarse
nes constantes o variables, de acuerdo con un programa en técnicas de adsorción, distribución másica (reparto),
definido. En el caso de una elución en gradiente, existen sis- intercambio de iones, etc., o puede basarse en diferencias en
temas de bombeo que suministran el o los disolventes desde las propiedades fisico-químicas de las moléculas, tales
diversos depósitos, pudiendo efectuarse la mezcla de los como tamaño, masa, volumen, etc.
disolventes bien aguas arriba (baja presión) o aguas abajo Este capítulo contiene definiciones y cálculos de los pará-
(alta presión) de la bomba. metros comunes a estas técnicas y requisitos aplicables en
general a la idoneidad del sistema. Los principios de separa-
Inyectores ción, aparatos y métodos se dan en los métodos generales
La inyección puede realizarse directamente en la cabeza de siguientes:
la columna utilizando una válvula.
Cromatografía en papel (2.2.26)
Fases estacionarias Cromatografía en capa fina (2.2.27)
Las fases estacionarias están contenidas en columnas que Cromatografía de gases (2.2.28)
han sido descritas en los capítulos Cromatografía de líquidos
(2.2.29) (columnas rellenas) y Cromatografía de gases Cromatografía de líquidos (2.2.29)
(2.2.28) (columnas capilares). Una columna capilar tiene un
diámetro interno máximo (∅) de 100 µm. Cromatografía de exclusión por tamaño molecular (2.2.30)
Fases móviles Cromatografía de fluidos supercríticos (2.2.45)
Generalmente la fase móvil es dióxido de carbono que

puede contener un modificador polar, tal como metanol, 2- DEFINICIONES
propanol o acetonitrilo. La composición, presión (densi-
Para calcular los límites en las monografías se han utiliza-
dad), temperatura y caudal de la fase móvil prescrita pueden
do las siguientes definiciones.
ser constantes durante todo el procedimiento cromatográfi-
co (elución isocrática, isobara, isotérmica) o pueden variar En algunos aparatos, ciertos parámetros, tales como la
de acuerdo con un programa definido (elución en gradiente relación señal-ruido, pueden calcularse utilizando progra-
del modificador, presión [densidad], temperatura o caudal). mas de ordenador proporcionados por el fabricante. Es
responsabilidad del usuario comprobar que los métodos
Detectores de cálculo utilizados en el programa de ordenador son
Los detectores más frecuentemente utilizados son espectrofo- compatibles con los requisitos de la Real Farmacopea
tómetros en el ultravioleta/visible (UV/Vis) y los detectores Española. Si no es así, deben realizarse las correcciones
de ionización en llama. Pueden utilizarse detectores de difu- necesarias.
sión de la luz, espectrofotómetros de absorción en el infrarro-
jo, detectores de conductividad térmica u otros detectores Cromatograma
especiales.
Un cromatograma es una representación gráfica o de otra
índole de la respuesta del detector, la concentración del
PROCEDIMIENTO efluente u otra magnitud utilizada como medida de la con-
centración del efluente, en función del tiempo, volumen o
Preparar la o las disoluciones problemas y la o las disolucio- distancia. Los cromatogramas ideales se representan
nes de referencia como se prescribe. Las disoluciones deben como una secuencia de picos gaussianos sobre una línea
estar exentas de partículas sólidas. base.

2.2.46. Técnicas de separación cromatográfica REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
DATOS DE RETENCIÓN to = tiempo (o volumen) de retención o distancia medida

sobre la línea base entre el punto de inyección y la per-
Tiempo de retención y volumen de retención pendicular trazada desde el máximo del pico corres-
pondiente a un componente no retenido,
2. Métodos
Las magnitudes de retención en la cromatografía de elución

analíticos
pueden expresarse como el tiempo de retención (tR) defini- tt = tiempo (o volumen) de retención o distancia medida
do directamente por la posición del máximo del pico en el sobre la línea base entre el punto de inyección y la per-
cromatograma. A partir del tiempo de retención, puede cal- pendicular trazada desde el máximo del pico corres-
cularse el volumen de retención (VR). pondiente a un componente que tiene acceso a todos
los poros de la fase estacionaria.
VR = tRv
Factor de retraso
tR = tiempo de retención o distancia medida sobre la línea
base entre el punto de inyección y la perpendicular tra- El factor de retraso (RF) (también conocido como factor de
zada desde el máximo del pico correspondiente al retención Rf), utilizado en la cromatografía planar, es la rela-
componente, ción entre la distancia desde el punto de aplicación hasta el
centro de la mancha y la distancia recorrida por el frente del
v = caudal de la fase móvil.
disolvente desde el punto de aplicación.
Coeficiente de distribución másica
b
El coeficiente de distribución másica (Dm) (también conoci- RF = ————
do como factor de capacidad k’) se define como: a
cantidad de soluto en la fase estacionaria VS

Dm = ————————————————————————— = KC —— — b = distancia de migración del analito,
cantidad de soluto en la fase móvil VM
a = distancia de migración del frente del disolvente.
KC = coeficiente de distribución en el equilibrio (también DATOS CROMATOGRÁFICOS
conocido como constante de distribución),
Un pico puede ser definido por el área del pico (A) o la altu-
VS = volumen de la fase estacionaria, ra del pico (h) y la anchura del pico a la mitad de la altura
(wh) o la altura del pico (h) y la anchura del pico entre los
VM = volumen de la fase móvil. puntos de inflexión (wi). En los picos gaussianos (Figura
2.2.46.-1) se da la relación:
El coeficiente de distribución másica de un componente
puede determinarse a partir del cromatograma utilizando la wh = 1,18wi
expresión:
tR - tM
Dm = —— ——
tM
tR = tiempo (o volumen) de retención o distancia medida

pendicular trazada desde el máximo del pico corres-
pondiente al componente,
tM = tiempo (o volumen) de retención o distancia medida
pendicular trazada desde el máximo del pico corres-
pondiente a un componente no retenido.
Coeficiente de distribución Figura 2.2.46.-1.
Las características de elución de un componente en una Factor de simetría

columna particular, en la cromatografía de exclusión por
tamaño molecular, pueden definirse por el coeficiente de El factor de simetría (As) (o factor de cola) de un pico (Figu-
distribución (Ko) que se calcula a partir de la expresión: ra 2.2.46.-2) se calcula por la expresión:
w0,05
tR - to As = ———
Ko = —— —— 2d
tt - to
w0,05 = anchura del pico en el veinteavo de su altura,

tR = tiempo (o volumen) de retención o distancia medida
sobre la línea base entre el punto de inyección y la per- d = distancia entre la perpendicular trazada desde el
pendicular trazada desde el máximo del pico corres- máximo del pico y el borde de entrada del pico a
pondiente al componente, la veinteava parte de su altura.

Un valor de 1,0 significa la simetría completa (ideal). Una resolución mayor que 1,5 corresponde a la separación
de la línea base.
La expresión dada anteriormente puede no ser aplicable si
2. Métodos
los picos tienen alturas muy diferentes.
analíticos
En cromatografía planar cuantitativa, se utilizan las distan-
cias de migración en lugar de los tiempos de retención y la
resolución puede calcularse utilizando la expresión:
1,18 a R F2 - R F1
Rs =
wh1 + wh2
RF1 y RF2 = relaciones entre las distancias desde el punto

de aplicación hasta los centros de las man-
chas y la distancia recorrida por el frente del
disolvente desde su punto de aplicación (fac-
tor de retraso),
wh1 y wh2 = anchuras de los picos a la mitad de su altura,
Figura 2.2.46.-2.
a = distancia de migración del frente del disol-
Eficacia de la columna y número aparente de platos vente.
teóricos
La eficacia de una columna (eficacia aparente) puede calcu- Relación pico a valle
larse a partir de los datos obtenidos en condiciones isotér-
micas, isocráticas o isobaras, dependiendo de la técnica, La relación pico a valle (p/v) puede emplearse como requi-
como el número aparente de platos teóricos (N) a partir de sito de idoneidad del sistema en un ensayo de sustancias
la siguiente fórmula, en la que los valores de tR y wh se relacionadas cuando es incompleta la separación de una
deben expresar en las mismas unidades (tiempo, volumen o impureza del analito (Figura 2.2.46-3).
distancia).
Hp
p/v = ———
Hv
2
N = 5,54 tR Hp = altura sobre la línea base extrapolada del pico
wh
correspondiente a la impureza,
Hv = altura sobre la línea base extrapolada del punto
tR = tiempo (o volumen) de retención o distancia medida más bajo de la curva que separa los picos corres-
sobre la línea base desde el punto de inyección hasta pondientes a la impureza y al analito.
la perpendicular trazada desde el máximo del pico
correspondiente al componente,
wh = anchura del pico a la mitad de su altura.
El número aparente de platos teóricos varía con el compo-
nente así como con la columna y el tiempo de retención.
DATOS DE SEPARACIÓN
Resolución
La resolución (RS) entre picos de altura similar de dos com-
ponentes puede calcularse a partir de la expresión:
1,18 t R2 - t R1
Rs =
wh1 + wh2
tR2 > tR1
tR1 y tR2 = tiempos de retención o distancias medidas

Figura 2.2.46.-3.
sobre la línea base entre el punto de inyección
y las perpendiculares trazadas desde los máxi- Retención relativa
mos de dos picos adyacentes,
La retención relativa (r) se calcula como un valor estimado
wh1 y wh2 = anchuras de los picos a la mitad de su altura. por la expresión:

2.2.46. Técnicas de separación cromatográfica REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
nes de una disolución de referencia y se calcula mediante la

r = tR2 - tM expresión:
tR1 - tM
Σ yi - y 2
2. Métodos
analíticos
DTR % = 100
tR2 = tiempo de retención del pico de interés, y n-1
tR1 = tiempo de retención del pico de referencia (general- yi = valores individuales expresados como área del pico,
mente el pico correspondiente a la sustancia a exa- altura del pico, o relación entre las áreas por el méto-
minar), do de normalización interna,
–y = media de los valores individuales,
tM = tiempo de retención o distancia medida sobre la
línea base entre el punto de inyección y la perpendi- n = número de valores individuales.
cular trazada desde el máximo del pico correspon-
diente a un componente no retenido. La desviación típica relativa máxima permitida (DTRmax) se
calcula a partir de una serie de inyecciones de la disolución
En cromatografía planar, se utilizan los factores de retraso de referencia para límites definidos utilizando la siguiente
RF2 y RF1 en lugar de tR2 y tR1. expresión:
PRECISIÓN DE LA CUANTIFICACIÓN DTR max = KB n

Relación señal-ruido t90% , n -1
La relación señal-ruido (S/N) influye sobre la precisión de K = constante (0,349), obtenida por la expresión
la cuantificación y se calcula por la ecuación:
0,6 t 90%,5 0,6

K= × en la que
S/N = 2H 2 6 2
h
H = altura del pico (Figura 2.2.46.-4) correspondiente al representa la DTR requerida después de 6 inyecciones para
componente considerado, en el cromatograma obteni- B = 1,0,
do con la disolución de referencia prescrita, medida
desde el máximo del pico hasta la línea base extrapo- B = límite superior dado en la definición de la mono-
lada de la señal observada a una distancia igual a 20 grafía individual menos el 100 por ciento, supo-
veces la anchura a la mitad de su altura, niendo que el límite superior se fija de acuerdo con
la reproducibilidad del método,
h = intervalo del ruido de fondo en un cromatograma obte-
nido después de la inyección o aplicación de un blan- n = número de inyecciones repetidas de la disolución
co, observado a una distancia igual a 20 veces la de referencia (3 ≤ n ≤6),
anchura a la mitad de su altura en el cromatograma
obtenido con la disolución de referencia prescrita y, si t90%, n-1 = variable t de Student a un nivel de probabilidad del
es posible, situado igualmente en la zona próxima al 90 por ciento (bilateral) con n-1 grados de libertad.
lugar donde se espera la aparición del pico.
IDONEIDAD DEL SISTEMA
Los ensayos de idoneidad del sistema representan una parte
integrante del método y se utilizan para confirmar la efica-
cia adecuada del sistema cromatográfico. La eficacia apa-
rente, el coeficiente de distribución másica, la resolución, la
retención relativa y el factor de simetría son los parámetros
que generalmente se emplean para evaluar la eficacia de la
columna. Los factores que pueden afectar el comportamien-
to cromatográfico incluyen la composición, la fuerza iónica,
la temperatura y el pH aparente de la fase móvil, el caudal,
la longitud de la columna, la temperatura y presión y las
características de la fase estacionaria incluyendo el tamaño
de poro, el tamaño de partícula, el tipo de partículas, la
superficie específica y, en el caso de soportes para fase
inversa, el grado de modificación química (expresado por
Figura 2.2.46.-4. “con recubrimiento”, “con carga de carbono”, etc.).
Los diversos componentes del equipo empleado deben ser
Repetibilidad aptos y capaces de conseguir la precisión requerida para rea-
lizar el ensayo o valoración.
La repetibilidad de la respuesta se expresa como una desvia-
ción típica relativa (DTR%) en porcentaje estimada de una En la monografía, salvo indicación contraria, deben cum-
serie consecutiva de medidas de las inyecciones o aplicacio- plirse los siguientes requisitos.

— El factor de simetría del pico principal ha de encontrarse mayor. No se alteran otros componentes en más del 10 por
entre 0,8 y 1,5. Este requisito tiene aplicación general a ciento absoluto.
ensayos o valoraciones descritos en las monografías.
pH del componente acuoso de la fase móvil: ± 0,2 pH, salvo
2. Métodos
— La desviación típica relativa máxima permitida para las indicación contraria en la monografía, o ± 1,0 pH cuando se
analíticos
inyecciones repetidas de la disolución de referencia examinan sustancias neutras.
prescrita no debe exceder los valores dados en la Tabla
2.2.46.-1. Este requisito es aplicable sólo a las valora- Concentración de las sales en el componente tampón de una
ciones de contenido y no al ensayo de sustancias rela- fase móvil: ± 10 por ciento.
cionadas.
Volumen de aplicación: disminución hasta el 20 por ciento
— El límite de detección del pico (correspondiente a una del volumen prescrito si se utilizan placas de granulometría
relación señal-ruido de 3) es inferior al límite de exclu- fina (2-10 µm).
sión (“reporting threshold”) del ensayo de las sustancias
relacionadas. La distancia de migración del frente del disolvente no es
menor que 50 mm.
— El límite de cuantificación del pico (correspondiente a
una relación señal-ruido de 10) es igual o menor que el Cromatografía de líquidos
límite de exclusión (“reporting threshold”) del ensayo
de las sustancias relacionadas. Composición de la fase móvil: la cantidad del disolvente
minoritario puede ajustarse en ± 30 por ciento en términos
Tabla 2.2.46.-1.—Requisitos de repetibilidad relativos o ± 2 por ciento en términos absolutos, el que sea
mayor. No se alteran otros componentes en más del 10 por
Número de inyecciones individuales ciento absoluto.
3 4 5 6 pH del componente acuoso de la fase móvil: ± 0,2 pH, salvo
B (por indicación contraria en la monografía, o ± 1,0 pH cuando se
Desviación típica relativa máxima permitida
ciento) examinan sustancias neutras.
2,0 0,41 0,59 0,73 0,85 Concentración de las sales en el componente tampón de una
2,5 0,52 0,74 0,92 1,06 fase móvil: ± 10 por ciento.
3,0 0,62 0,89 1,10 1,27
Longitud de onda del detector: no se permiten ajustes.
Fase estacionaria:
AJUSTE DE LAS CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
— longitud de la columna: ± 70 por ciento,
A continuación se indican, como información, los límites
entre los que pueden ajustarse los diversos parámetros de un — diámetro interno de la columna: ± 25 por ciento,
ensayo cromatográfico para satisfacer los criterios de ido- — tamaño de partícula: reducción máxima del 50 por cien-
neidad del sistema, sin modificar fundamentalmente los to, no se permiten aumentos.
métodos. Las condiciones cromatográficas descritas son
validadas durante la elaboración de la monografía. Se inclu- Caudal: ± 50 por ciento.
yen los ensayos de idoneidad del sistema para confirmar la
separación requerida para la realización satisfactoria del Temperatura: ± 10 por ciento, hasta un máximo de 60 ºC.
ensayo o valoración. No obstante, puesto que las fases esta-
cionarias se describen en general y en el comercio existe Volumen de inyección: puede disminuirse, siempre que sean
gran diversidad con diferentes comportamientos cromato- satisfactorias la detección y la repetibilidad del o de los
gráficos, para conseguir los requisitos prescritos de idonei- picos que se han de determinar.
dad del sistema pueden ser necesarios algunos ajustes de las
Elución en gradiente: la configuración del equipo empleado
condiciones cromatográficas. En particular, con métodos
puede alterar significativamente la resolución, el tiempo de
cromatográficos de líquidos en fase inversa, el ajuste de los
retención y las retenciones relativas descritas en el método.
diversos parámetros no dará siempre como resultado una
Si esto ocurre, puede ser debido a un volumen muerto exce-
cromatografía satisfactoria. En tal caso, puede ser necesario
sivo (“dwell volume”) que es el volumen entre la parte supe-
cambiar la columna por otra del mismo tipo (por ejemplo
rior de la columna y el punto en el que se encuentran los dos
gel de sílice octadecilsililado) que presente la eficacia cro-
eluyentes.
matográfica deseada, pero de un fabricante diferente.
Para parámetros críticos, se definen claramente en la mono- Cromatografía de gases
grafía los ajustes que aseguren la idoneidad del sistema.
Fase estacionaria:
Deben evitarse ajustes múltiples que puedan tener un efecto
acumulativo en el comportamiento del sistema. — longitud de la columna: ± 70 por ciento,
— diámetro interno de la columna: ± 50 por ciento,
Cromatografía en capa fina y cromatografía en papel
— tamaño de partícula: reducción máxima del 50 por cien-
Composición de la fase móvil: la cantidad del disolvente to, no se permiten aumentos.
minoritario puede ajustarse en ± 30 por ciento en términos
relativos o ± 2 por ciento en términos absolutos, el que sea — espesor de la película: -50 por ciento a +100 por ciento.

2.2.47. Electroforesis capilar REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
Caudal: ± 50 por ciento. Para valoraciones y para determinación cuantitativa de los

componentes, pueden describirse en la monografía el méto-
Temperatura: ± 10 por ciento. do de patrón externo, el método del patrón interno o el pro-
cedimiento de calibrado, y no se aplica normalmente el
2. Métodos
Volumen de inyección: puede disminuirse, siempre que sean

analíticos
procedimiento de normalización. En ensayos de sustancias

satisfactorias la detección y la repetibilidad. relacionadas, se aplica generalmente bien el método del
patrón externo con una única disolución de referencia o bien
Cromatografía de fluidos supercríticos el procedimiento de normalización. Sin embargo, tanto con
el procedimiento de normalización como con el método del
Composición de la fase móvil: para columnas rellenas, la patrón externo, cuando se utiliza para comparación una dilu-
cantidad del disolvente minoritario puede ajustarse en ± 30 ción de la disolución problema, las respuestas de las sustan-
por ciento en términos relativos o ± 2 por ciento en términos cias relacionadas son similares a la de la sustancia propia-
absolutos, el que sea mayor. No se permiten ajustes en el mente dicha (factor de respuesta de 0,8 a 1,2), a no ser que
sistema de columnas capilares. se incluyan en el texto otros factores de corrección (valores
inversos a los factores de respuesta).
Longitud de onda del detector: no se permiten ajustes.
Fase estacionaria: El factor de respuesta es una magnitud relativa, definida
como la relación de la respuesta de una sustancia a la de otra
— longitud de la columna: ± 70 por ciento,
sustancia, de igual masa y en las condiciones de trabajo
— diámetro interno de la columna: prescritas en el ensayo.
± 25 por ciento (columnas rellenas),
Cuando el ensayo de sustancias relacionadas prescribe la suma
± 50 por ciento (columnas capilares), de impurezas o existe una determinación cuantitativa de una
impureza, es importante elegir un umbral apropiado y condi-
— tamaño de partícula: reducción máxima del 50 por cien-
ciones adecuadas para la integración de las áreas de los picos.
to, no se permiten aumentos (columnas rellenas).
En dichos ensayos el límite de exclusión, es decir el área por
Caudal: ± 50 por ciento. debajo de la cual no se tienen en cuenta los picos, es general-
mente 0,05 por ciento. Así, el valor umbral del sistema de
Temperatura: ± 10 por ciento. recogida de datos corresponde a al menos la mitad del límite
Volumen de inyección: puede disminuirse, siempre que sean de exclusión. La integración de las áreas de los picos de las
satisfactorias la detección y la repetibilidad. impurezas, que no se separan completamente del pico princi-
pal, se realiza preferiblemente por extrapolación valle a valle
CUANTIFICACIÓN (enrase tangencial). Se ignoran también los picos debidos al
disolvente o disolventes utilizados para disolver la muestra.
— Método del patrón externo. La concentración del o de
los componentes que han de analizarse se determina
comparando la respuesta o respuestas (pico o picos)
obtenidas con la disolución problema con la respuesta o
respuestas (pico o picos) obtenidas con una disolución 2.2.47. ELECTROFORESIS CAPILAR
de referencia.
— Método del patrón interno. En la disolución problema y PRINCIPIOS GENERALES
una disolución de referencia se introducen cantidades La electroforesis capilar es un método de análisis físico
iguales de un componente separado de la sustancia a basado en la migración, en el interior de un capilar, de anali-
examinar y que no reaccione con ella (patrón interno). tos cargados disueltos en una disolución electrolítica, bajo
La concentración de la sustancia a examinar se determi- la influencia de un campo eléctrico de corriente continua.
na comparando la relación entre las superficies o alturas
de los picos de la sustancia a examinar y del patrón inter- La velocidad de migración de un analito bajo un campo
no en la disolución problema con la relación de las áreas eléctrico de intensidad E, viene determinada por la movili-
o alturas de los picos correspondientes a la sustancia a dad electroforética del analito y la movilidad electro-osmó-
examinar y al patrón interno en la disolución de referen- tica del tampón en el interior del capilar. La movilidad elec-
cia. troforética de un soluto (µep) depende de las características
— Procedimiento de normalización. El contenido en por- del soluto (carga eléctrica, tamaño y forma molecular) y las
centaje de uno o más componentes de la sustancia a exa- del tampón en el que tiene lugar la migración (tipo y fuerza
minar se calcula determinando el área del pico o picos iónica del electrólito, pH, viscosidad y aditivos). La veloci-
como porcentaje del área total de los picos, excluyendo dad electroforética (vep) de un soluto, suponiendo que tiene
los correspondientes a los disolventes y a cualquiera de una forma esférica, viene dada por la ecuación:
los reactivos añadidos y los que estén por debajo del
límite de exclusión.
q V
v ep = µep E =
— Procedimiento de calibrado. Se determina la relación 6πηr L
entre la señal medida o evaluada (y) y la cantidad (con-
centración, masa, etc.) de la sustancia (x) y se calcula la
función de calibrado. Los resultados analíticos se calcu- q = carga eficaz del soluto,
lan a partir de la señal medida o evaluada del analito por
medio de la función inversa. η = viscosidad de la disolución electrolítica,

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.47. Electroforesis capilar
r = radio de Stoke del soluto,

µep ± µeo × V × l
N=
V = voltaje aplicado, 2×D×L
2. Métodos
L = longitud total del capilar. D = coeficiente de difusión molecular del soluto en el tampón.
analíticos
Cuando se aplica un campo eléctrico a un capilar relleno En la práctica, pueden también contribuir significativamen-
con un tampón, se genera un flujo de disolvente en el inte- te a la dispersión de las bandas otros fenómenos tales como
rior del capilar, denominado flujo electro-osmótico. La la disipación del calor, la adsorción de la muestra por la
velocidad del flujo electro-osmótico depende de la movili- pared del capilar, las diferencias de conductividad entre la
dad electro-osmótica (µeo) que depende a su vez de la densi- muestra y el tampón, la longitud del capilar ocupado por
dad de carga sobre la pared interna del capilar y de las carac- la muestra inyectada, el tamaño de la cubeta de detección y
terísticas del tampón. La velocidad electro-osmótica (veo) una diferencia de nivel entre los depósitos para tampón no
viene dada por la ecuación: nivelados.
v eo = µeo E = εξ
La separación entre dos bandas (expresada como la resolu-
V
η ción, Rs) puede obtenerse modificando la movilidad electro-
L forética de los analitos, la movilidad electro-osmótica indu-
cida en el capilar y aumentando la eficacia de la banda de
ε = constante dieléctrica del tampón, cada analito, de acuerdo con la ecuación:
ζ = potencial zeta de la superficie del capilar.
N µepb - µepa
Las movilidades electroforéticas y electro-osmóticas del Rs =
analito pueden actuar en la misma dirección o en direccio- 4 µep ± µeo
nes opuestas, dependiendo de la carga (positiva o negativa)
del soluto, de modo que la velocidad del soluto (v) viene µepa y µepb = movilidades electroforéticas de los dos
expresada por: analitos separados,
v = vep ± veo µ–ep = movilidad electroforética media de los dos
analitos µ– = 1 (µ + µ ).
ep 2 epb epa
Se utiliza la suma o la diferencia entre los dos términos
dependiendo de si las movilidades actúan en la misma direc-
ción o en direcciones opuestas. Cuando la velocidad elec-
tro-osmótica es elevada con relación a la velocidad electro- APARATO
forética de los solutos, pueden separarse en una sola Un aparato para electroforesis capilar está compuesto por:
operación tanto los analitos cargados negativamente como
positivamente. — un generador regulable de corriente continua de alto vol-
taje;
El tiempo (t) empleado por el soluto para migrar la distancia
(l) desde el extremo de inyección del capilar hasta el punto — dos cubetas para tampón, mantenidas al mismo nivel,
de detección (longitud eficaz del capilar) viene dada por la que contienen las disoluciones anódica y catódica pres-
expresión: critas;
l×L — dos electrodos (cátodo y ánodo), sumergidos en las

t= l = cubetas para tampón y conectados al generador;
v ep ± v eo µep ± µeo V
— un capilar de separación (generalmente de sílice fundi-
La mayoría de los capilares de sílice fundida utilizados en da) que, cuando se utiliza con algunos tipos de detecto-
electroforesis llevan cargas negativas en su pared interna, res específicos, tiene una ventana óptica alineada con el
produciendo un flujo electro-osmótico hacia el cátodo. El detector. Los extremos del capilar están introducidos en
flujo electro-osmótico debe permanecer constante de un las cubetas para tampón. El capilar está relleno de la
análisis a otro si se quiere obtener una buena reproducibili- solución prescrita en la monografía;
dad en la velocidad de migración de los solutos. Para algu-
nas aplicaciones, puede ser necesario reducir o suprimir el — un sistema de inyección adecuado;
flujo electro-osmótico modificando la pared interna del
— un detector capaz de determinar en un momento dado
capilar o cambiando el pH de la disolución tampón. la cantidad de sustancias de interés que pasan a través
Después de la introducción de la muestra en el capilar, cada de un segmento del capilar de separación. Generalmen-
ion analito de la muestra migra en el seno del electrólito te se basa en espectrofotometría de absorción (UV y
como una zona independiente, de acuerdo con su movilidad visible) o fluorimetría, pero para aplicaciones específi-
cas pueden ser útiles detecciones por conductimetría,
electroforética. La dispersión de las zonas, es decir, la exten-
amperometría o espectrometría de masas. La detección
sión de cada banda de soluto, da como resultado diferentes indirecta es un método alternativo utilizado para detec-
fenómenos. En condiciones ideales la única contribución a tar compuestos que no absorben UV y no son fluores-
la extensión de la zona de soluto es la difusión molecular centes;
del soluto a lo largo del capilar (difusión longitudinal). En
este caso ideal la eficacia de la zona, expresada en número — se recomienda un sistema termostático con el fin de
de platos teóricos (N), viene dada por: mantener una temperatura constante en el interior del

capilar para obtener una buena reproducibilidad de la Temperatura. El efecto principal de la temperatura se
separación; observa sobre la viscosidad del tampón y la conductividad
eléctrica, y por consiguiente, sobre la velocidad de migra-
— un registrador y un integrador apropiado o un ordenador. ción. En algunos casos, un aumento de la temperatura en el
2. Métodos
analíticos
capilar puede provocar un cambio conformacional en las

El proceso de inyección y su automatización son críticos proteínas, modificando su tiempo de migración y la efica-
para un análisis cuantitativo preciso. Los modos de inyec- cia de su separación.
ción incluyen la inyección por gravedad, presión o vacío y
la inyección electrocinética. Si se utiliza este modo de Capilar. Las dimensiones del capilar (longitud y diámetro
inyección se puede llegar a una posible discriminación, interno) influyen sobre el tiempo del análisis, la eficacia de
puesto que la cantidad de cada componente de muestra las separaciones y la capacidad de carga. El aumento tanto
introducida electrocinéticamente depende de su movilidad de la longitud eficaz como de la longitud total puede dismi-
electroforética. nuir los campos eléctricos (trabajando a voltaje constante) y
en consecuencia aumentar el tiempo de migración. Para un
Utilizar el capilar, las disoluciones tampón, el método de pre- tampón y un campo eléctrico dados, la disipación del calor
acondicionamiento, la disolución de la muestra y las condi- y, por consiguiente, el ensanchamiento de la banda de la
ciones de migración prescritas en la monografía de la sustan- muestra, dependen del diámetro interno del capilar. Este
cia considerada. La disolución electrolítica empleada se filtra también afecta al límite de detección, que depende del volu-
para eliminar partículas y se desgasifica para evitar la forma- men inyectado de la muestra y del sistema de detección
ción de burbujas que puedan interferir con el sistema de empleado.
detección o interrumpan el contacto eléctrico en el capilar
durante la operación de separación. Para cada método analíti- Puesto que la adsorción de los componentes de la muestra
co debe ponerse a punto un procedimiento de lavado riguroso por la pared del capilar limita la eficacia, en el desarrollo de
con el fin de conseguir tiempos de migración reproducibles un método de separación, deben aplicarse métodos para evi-
de los solutos. tar estas interacciones. En el caso específico de proteínas, se
han ideado diversas estrategias para evitar este efecto. Algu-
nas de estas estrategias (el uso de pH extremo y la adsorción
ELECTROFORESIS CAPILAR EN DISOLUCIÓN LIBRE
por el tampón de aditivos cargados positivamente) sólo
Principio requieren la modificación de la composición del tampón
para evitar la adsorción de la proteína. Otras estrategias con-
En la electroforesis capilar en disolución libre, los analitos sisten en recubrir la pared interna del capilar con un políme-
se separan en un capilar que sólo contiene tampón sin medio ro, unido covalentemente a la sílice, que evite la interacción
anticonvectivo. En esta técnica, la separación se basa en que entre las proteínas y la superficie de la sílice cargada negati-
los diferentes componentes de la muestra migran como ban- vamente. Para este fin, se disponen de capilares listos para
das individuales a diferentes velocidades. La velocidad de su uso con recubrimientos que consisten en polímeros neu-
cada banda depende de la movilidad electroforética del tro-hidrófilos, catiónicos y aniónicos.
soluto y el flujo electro-osmótico en el capilar (ver Princi-
pios generales). Pueden utilizarse capilares recubiertos para — Parámetros de la disolución electrolítica
mejorar la capacidad de separación de las sustancias que Tipo y concentración del tampón. Los tampones adecua-
presentan tendencia a la adsorción sobre superficies de síli- dos para la electroforesis capilar tienen una capacidad de
ce fundida. tampón apropiada en el intervalo de pH elegido y una baja
Utilizando este modo de electroforesis capilar, puede reali- movilidad para minimizar la generación de corriente.
zarse el análisis tanto de moléculas pequeñas (Mr < 2000) Es importante igualar en lo posible la movilidad de los iones
como grandes (2000 < Mr < 100.000). Debido a la alta efi- del tampón a la movilidad del soluto, para minimizar la dis-
cacia conseguida en la electroforesis capilar en disolución torsión de las bandas. Igualmente es importante el tipo de
libre, puede efectuarse la separación de moléculas que sólo disolvente utilizado en la muestra para conseguir el enfoque
tienen diferencias mínimas en su relación carga a masa. Per- de la muestra en la columna, lo que aumenta la eficacia de
mite también la separación de compuestos quirales por adi- separación y mejora la detección.
ción al tampón de separación de selectores quirales.
Un aumento de la concentración del tampón (a un pH dado)
Optimización disminuye el flujo electro-osmótico y la velocidad del soluto.
La optimización de la separación es un proceso complejo en pH del tampón. El pH del tampón puede afectar a la sepa-
el que intervienen diversos parámetros de separación. Los ración modificando la carga del analito o de los aditivos, y
factores principales que han de tenerse en cuenta en el desa- cambiando el flujo electro-osmótico. En la separación de
rrollo de las separaciones son los parámetros instrumentales proteínas y péptidos, la disminución del pH del tampón hasta
y los de la disolución electrolítica. un valor inferior al punto isoeléctrico (pI) cambia la carga
neta del soluto de negativa a positiva. Un aumento en el pH
— Parámetros instrumentales del tampón aumenta generalmente el flujo electro-osmótico.
Voltaje. El tiempo de separación es inversamente propor- Disolventes orgánicos. Pueden añadirse al tampón acuoso
cional al voltaje aplicado. Sin embargo, un aumento en el modificadores orgánicos (metanol, acetonitrilo, etc.) para
voltaje utilizado puede provocar una producción excesiva aumentar la solubilidad del soluto u otros aditivos y
de calor, dando lugar a gradientes de temperatura y, como para actuar sobre el grado de ionización de los componentes
resultado, de viscosidad en el tampón contenido en el capi- de la muestra. La adición al tampón de estos modificadores
lar. Este efecto causa un ensanchamiento de la banda y una orgánicos provoca generalmente una disminución en el flujo
disminución de la resolución. electro-osmótico.

Aditivos para separaciones quirales. Para la separación prepararse en un vial e introducirse por presión en un capi-
de isómeros ópticos, al tampón de separación se añade un lar de paredes revestidas (sin flujo electro-osmótico). La
selector quiral. Los selectores quirales más comúnmente sustitución del gel antes de cada inyección mejora general-
utilizados son ciclodextrinas, pero pueden también añadirse mente la reproducibilidad de la separación. La porosidad de
2. Métodos
analíticos
éteres coronas, polisacáridos y proteínas. Puesto que el los geles puede aumentarse utilizando polímeros de mayor
reconocimiento quiral se basa en las diferentes interaccio- masa molecular (a una concentración de polímero dada) o
nes entre el selector quiral y cada uno de los enantiómeros, disminuyendo la concentración del polímero (a masa mole-
la resolución conseguida para los compuestos quirales cular de polímero dada). Para el mismo tampón una reduc-
dependerá del tipo de selector quiral utilizado. A este res- ción de la porosidad del gel conduce a una disminución de
pecto, para el desarrollo de una separación dada puede ser la movilidad del soluto. Puesto que la disolución de estos
útil probar ciclodextrinas que tengan diferente tamaño de polímeros en el tampón proporciona disoluciones de baja
cavidad (α-, β- o γ-ciclodextrina) o ciclodextrinas modifica- viscosidad, pueden utilizarse técnicas de inyección tanto
das con grupos neutros (metilo, etilo, hidroxialquilo, etc.) o hidrodinámicas como electrocinéticas.
ionizables (aminometilo, carboximetilo, éter sulfobutílico,
etc.). Cuando se utilizan ciclodextrinas modificadas, deben
tenerse en cuenta las variaciones en el grado de sustitución ISOELECTROENFOQUE CAPILAR
de las ciclodextrinas entre los diferentes lotes, puesto que
esto influirá sobre la selectividad. Otros factores que con- Principio
trolan la resolución en las separaciones quirales son la con- En el isoelectroenfoque, las moléculas migran bajo la
centración del selector quiral, la composición y pH del tam- influencia de un campo eléctrico, siempre que estén carga-
pón y la temperatura. El uso de aditivos orgánicos, tales das, en un gradiente de pH generado por anfolitos que tie-
como metanol o urea, puede también modificar la resolu- nen valores de pI en un amplio intervalo (ácidos poli-ami-
ción conseguida.
nocarboxílicos), disueltos en el tampón de separación.
ELECTROFORESIS CAPILAR EN GEL Las tres etapas básicas del isoelectroenfoque son carga,
enfoque y movilización.
Principio
Etapa de carga. Pueden emplearse dos métodos:
En la electroforesis capilar en gel, la separación tiene lugar
en el interior de un capilar relleno con un gel que actúa — carga en una etapa: la muestra se mezcla con los anfoli-
como tamiz molecular. De este modo, a una relación dada tos y se introducen en el capilar por presión o vacío;
de carga a masa, los componentes más pequeños se mueven
— carga secuencial: se introducen en el capilar un tampón
en el capilar más rápidamente que los mayores. La electro-
foresis capilar en gel puede utilizarse para separación de inicial, a continuación los anfolitos, la muestra mezcla-
macromoléculas biológicas (proteínas y fragmentos de da con los anfolitos, de nuevo los anfolitos solos y por
ADN) de acuerdo con su masa molecular. último el tampón final. El volumen de la muestra debe
ser lo suficientemente pequeño como para no modificar
el gradiente de pH.
Características de los geles
Etapa de enfoque. Cuando se aplica el voltaje, los anfoli-
En la electroforesis capilar se utilizan dos tipos de geles: tos migran hacia el cátodo o el ánodo, de acuerdo con su
geles químicos y geles físicos. Los geles químicos, tales carga neta, creando así un gradiente de pH desde el ánodo
como poliacrilamida reticulada, se preparan en el interior (pH inferior) hasta el cátodo (pH superior). Durante esta
del capilar por polimerización de los monómeros. General- etapa los componentes que han de separarse migran hasta
mente se unen a la pared de la sílice fundida y no pueden que alcanzan un pH correspondiente a su punto isoeléctrico
separarse sin destruir el capilar. Si los geles se utilizan para (pI) y la corriente cae hasta valores muy bajos.
análisis de proteínas, el tampón de separación contiene
generalmente dodecilsulfato de sodio y las muestras son Etapa de movilización. Las bandas de los componentes
desnaturalizadas por calentamiento en una mezcla de dode- separados son forzadas a pasar por el detector, por uno de
cilsulfato de sodio y 2-mercaptoetanol o ditiotreitol antes de estos tres métodos:
su inyección. La separación en geles reticulados puede opti-
mizarse modificando el tampón de separación (como se — en el primer método, se realiza la movilización durante
indica en la sección Electroforesis capilar en disolución la etapa de enfoque bajo el efecto del flujo electro-
libre) y controlando la porosidad del gel durante su prepara- osmótico; el flujo electro-osmótico debe ser lo suficien-
ción. Para los geles de poliacrilamida reticulada, la porosi- temente pequeño como para permitir el enfoque de los
dad puede modificarse cambiando la concentración de acri- componentes;
lamida y la proporción del agente de reticulación. Como
regla general, la disminución de la porosidad del gel conduce — en el segundo método, se realiza la movilización apli-
a la disminución de la movilidad de los solutos. Debido a la cando presión positiva después de la etapa de enfoque;
rigidez de estos geles, sólo puede utilizarse inyección elec-
trocinética. — en el tercer método, se consigue la movilización des-
pués de la etapa de enfoque añadiendo sales al depósito
Los geles físicos son polímeros hidrófilos, tales como polia- del cátodo o al depósito del ánodo (dependiendo de la
crilamida lineal, derivados de celulosa, dextrano, etc., que dirección elegida para la movilización) con el fin de
pueden disolverse en tampones de separación acuosos alterar el pH en el capilar cuando se aplique el voltaje. A
dando lugar a un medio de separación que actúa también medida que cambia el pH, se movilizan las proteínas y
como tamiz molecular. Estos medios de separación son más anfolitos en la dirección del depósito que contiene las
fáciles de preparar que los polímeros reticulados. Pueden sales añadidas y pasan por el detector.

El grado de separación obtenido, expresado en ∆pI, depende tos tanto neutros como cargados, manteniendo la eficacia,
del gradiente de pH, (dpH/dx) el número de anfolitos que velocidad e idoneidad instrumental de la electroforesis capi-
tienen diferentes valores de pI, el coeficiente de difusión lar. Uno de los tensioactivos más ampliamente utilizados en
molecular (D), la intensidad del campo eléctrico (E) y la la CECM es el tensioactivo aniónico dodecilsulfato de sodio,
2. Métodos
analíticos
variación de la movilidad electroforética del analito con aunque también pueden utilizarse otros tensioactivos, por
el pH ejemplo tensioactivos catiónicos tales como sales de cetil-
trimetil-amonio.
— (dµ/dpH):
El mecanismo de separación es el siguiente: a pH neutro y
alcalino, se genera un fuerte flujo electro-osmótico que arras-
tra los iones de tampón de separación en la dirección del cáto-
∆pI = 3 × D (dpH/dx) do. Si se emplea como tensioactivo dodecilsulfato de sodio, la
E (–dµ/dpH) migración electroforética de la micela aniónica va en direc-
ción opuesta, hacia el ánodo. Como resultado, la velocidad
total de migración de las micelas se ralentiza con relación al
Optimización flujo a granel de la disolución electrolítica. En el caso de solu-
tos neutros, puesto que el analito puede repartirse entre la
Los parámetros principales que deben ser tenidos en cuenta micela y el tampón acuoso, y no tiene movilidad electroforéti-
en el desarrollo de las separaciones son: ca, la velocidad de migración del analito dependerá sólo del
coeficiente de reparto entre la micela y el tampón acuoso. En
Voltaje. El isoelectroenfoque capilar utiliza campos eléc- el electroforetograma, los picos correspondientes a cada solu-
tricos muy altos, 300 V/cm a 1000 V/cm en la etapa de enfo- to no cargado se encuentran siempre entre el del marcador del
que. flujo electro-osmótico y el de la micela (el tiempo transcurrido
entre estos dos picos se denomina ventana de separación). Para
Capilar. El flujo electro-osmótico debe reducirse o supri- solutos cargados eléctricamente, la velocidad de migración
mirse dependiendo de la estrategia de la movilización (ver depende tanto del coeficiente de reparto del soluto entre la
anteriormente). Los capilares recubiertos tienden a producir micela y el tampón acuoso, como de la movilidad electroforé-
el flujo electro-osmótico. tica del soluto en ausencia de micelas.
Disoluciones. El depósito anódico está lleno de una diso- Puesto que el mecanismo de separación en la CECM de
lución con un pH inferior al pI del anfolito más ácido y el solutos neutros y débilmente ionizados es esencialmente
depósito catódico está relleno con una disolución con un pH cromatográfica, la migración del soluto y la resolución pue-
superior al pI del anfolito más básico. Frecuentemente se den definirse en términos de factor de capacidad del soluto
utiliza ácido fosfórico para el ánodo e hidróxido de sodio (k’), denominado también coeficiente de distribución mási-
para el cátodo. ca (Dm), que es la relación entre el número de moles de solu-
to contenidos en la micela y los que se encuentran en la fase
móvil. Para un compuesto neutro, k’ viene definida por:
La adición de un polímero, tal como metilcelulosa, en la
disolución del anfolito tiende a suprimir las fuerzas con-
tR – to
vectivas (si las hay) y el flujo electro-osmótico aumentan- k' = = K Vs
do la viscosidad. En el comercio existen anfolitos que to 1 – tR VM
cubren intervalos de pH muy diversos y si es necesario tm
pueden mezclarse para ampliar el intervalo de pH. Se usan
amplios intervalos de pH para estimar el punto isoeléctrico tR = tiempo de migración del soluto,
mientras que se emplean intervalos más estrechos para
mejorar la precisión. El calibrado puede realizarse relacio- t0 = tiempo de análisis de un soluto no retenido (deter-
nando el tiempo de migración con el punto isoeléctrico minado inyectando un marcador de flujo electro-
para una serie de marcadores proteicos. osmótico que no entra en la micela, por ejemplo
metanol),
Durante la etapa de enfoque puede evitarse la precipitación tm = tiempo de migración de las micelas (medido inyec-
de proteínas en su punto isoeléctrico, si es necesario, aña- tando un marcador micelar, tal como Sudan III, que
diendo al tampón sustancias tales como glicerol, tensioacti- migra siempre en forma absorbida en las micelas),
vos, urea o tampones anfóteros. Sin embargo, a ciertas con-
centraciones, la urea desnaturaliza las proteínas. K = coeficiente de reparto del soluto,
Vs = volumen de la fase micelar,
CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR (CECM) VM = volumen de la fase móvil.
Igualmente, la resolución entre dos solutos que tienen tiem-
Principio pos de migración próximos (Rs) viene definida por:
En la cromatografía electrocinética micelar, la separación
tiene lugar en una disolución de electrólitos que contiene un 1 – to
α –1
tensioactivo a una concentración superior a la concentración Rs = N × × k'b × tm
micelar crítica (cmc). Las moléculas de soluto se distribuyen 4 α k'b + 1 t o
1+ k'a
entre el tampón acuoso y la fase pseudo-estacionaria com- tm
puesta de micelas, en función del coeficiente de reparto del
soluto. La técnica puede, por consiguiente, ser considerada N = número de platos teóricos para uno de los solutos,
como un híbrido de la electroforesis y la cromatografía. Es
una técnica que puede utilizarse para la separación de solu- α = selectividad,

k’a y k’b = factores de capacidad de ambos solutos, respecti- modificadores disminuye generalmente el tiempo de
vamente. migración y la selectividad de la separación. Puesto que
la adición de los modificadores orgánicos afecta la con-
Ecuaciones similares, pero no idénticas, proporcionan valo- centración micelar crítica, debe mantenerse un cierto
2. Métodos
res de k’ y Rs para solutos cargados eléctricamente.
analíticos
equilibrio entre el porcentaje de modificador orgánico y
el agente tensioactivo para no inhibir la micelización,
Optimización dando como resultado la ausencia de micelas y por consi-
guiente la ausencia de reparto. La disociación de micelas
Los parámetros principales que deben ser tenidos en cuenta en presencia de un alto contenido de disolvente orgánico
en el desarrollo de las separaciones por CECM son los pará- no siempre significa que ya no sea posible la separación;
metros instrumentales y de la disolución electrolítica. en algunos casos, la interacción hidrófoba entre el monó-
mero tensioactivo iónico y los solutos neutros da lugar a
— Parámetros instrumentales la formación de complejos solvófobos que pueden sepa-
rarse electroforéticamente.
Voltaje. El tiempo de separación es inversamente propor-
cional al voltaje aplicado. Sin embargo, un aumento en el Aditivos para separaciones quirales. Para la separación
voltaje puede provocar una producción excesiva de calor, de enantiómeros utilizando CECM, se incluye en el sistema
dando lugar a gradientes de temperatura y de viscosidad en micelar un selector quiral, bien unido covalentemente al ten-
el tampón en la sección transversal del capilar. Este efecto sioactivo o añadido al electrólito de separación micelar. Las
puede ser significativo con tampones de alta conductividad, micelas que tienen grupos con propiedades de discrimina-
tales como los que contienen las micelas. La mala disipa- ción quiral son las sales de N-dodecanoil-L-aminoácidos,
ción del calor se traduce en un ensanchamiento de las ban- sales biliares, etc. La resolución quiral puede conseguirse
das y disminución de la resolución. igualmente utilizando discriminadores quirales, tales como
ciclodextrinas, añadidos a las disoluciones electrolíticas que
Temperatura. Las variaciones en la temperatura del capi- contienen tensioactivos aquirales micelizados.
lar afectan el coeficiente de reparto del soluto entre el tam-
pón y las micelas, la concentración crítica micelar y la vis- Otros aditivos. Para modificar la selectividad pueden apli-
cosidad del tampón. Estos parámetros influyen sobre el carse diversas estrategias, por adición de compuestos quími-
tiempo de migración de los solutos. El uso de un buen siste- cos al tampón. El empleo de varios tipos de ciclodextrinas
ma de refrigeración mejora la reproducibilidad del tiempo puede también reducir la interacción de solutos hidrófobos
de migración de los solutos. con las micelas, aumentando así la selectividad para este
tipo de compuestos.
Capilar. Como en la electroforesis capilar en disolución
libre, las dimensiones del capilar (longitud y diámetro inter- La adición de sustancias capaces de modificar las interac-
no) influyen sobre el tiempo del análisis y la eficacia de las ciones soluto-micelas por adsorción en éstas, se utiliza
separaciones. Al aumentar tanto la longitud eficaz como la para mejorar la selectividad de las separaciones por
longitud total puede disminuir la intensidad del campo eléc- CECM. Estos aditivos pueden ser un segundo tensioactivo
trico (trabajando a voltaje constante), y por consiguiente (iónico o no iónico) que da lugar a micelas mixtas o catio-
aumentar el tiempo de migración y mejorar la eficacia de las nes metálicos que se disuelven en la micela y forman
separaciones. El diámetro interno controla la disipación de complejos de coordinación con los solutos.
calor (para un tampón y un campo eléctrico dados) y en con-
secuencia el ensanchamiento de las bandas de la muestra.
CUANTIFICACIÓN
— Parámetros de la disolución electrolítica
Conviene dividir las áreas de los picos por el tiempo de
Tipo y concentración del tensioactivo. El tipo de tensio- migración correspondiente para obtener el área corregida
activo, del mismo modo que la fase estacionaria en la con el fin de:
cromatografía, afecta la resolución puesto que modifica
la selectividad de la separación. También, el log k’ de un — compensar la desviación del tiempo de migración de un
compuesto neutro aumenta linealmente con la concen- análisis a otro, reduciendo así la variabilidad de la res-
tración del tensioactivo en la fase móvil. Puesto que la puesta;
resolución en la CECM alcanza un máximo cuando k’ se
— compensar las diferentes respuestas de los constituyen-
tm /to tes de la muestra con diferentes tiempos de migración.
aproxima al valor , cualquier modificación de la
concentración del tensioactivo en la fase móvil influye sobre Cuando se utiliza un patrón interno, debe verificarse que
la resolución obtenida. ningún pico de la sustancia a examinar está enmascarado
pH del tampón. Aunque el pH no modifica el coeficiente por el del patrón interno.
de reparto de los solutos no ionizados, puede modificar el
flujo electro-osmótico en los capilares no recubiertos. Una Cálculos
disminución del pH del tampón conlleva una disminución
del flujo electro-osmótico y por consiguiente un aumento de A partir de los valores obtenidos, calcular el contenido del
la resolución de los solutos neutros en la CECM, dando componente o componentes a examinar. Cuando la mono-
como resultado un mayor tiempo de análisis. grafía lo prescriba, el contenido en porcentaje de uno o
más componentes de la muestra a examinar se calcula
Disolventes orgánicos. Para mejorar la separación por determinando el área o las áreas corregidas del pico o de
CECM de los compuestos hidrófobos, pueden añadirse a los picos como porcentaje del total de las áreas corregidas
la disolución electrolítica modificadores orgánicos (meta- de todos los picos, excluyendo los debidos a los disolven-
nol, propanol, acetonitrilo, etc.). La adición de estos tes o a cualquiera de los reactivos añadidos (procedimiento

2.2.48. Espectrometría Raman REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
de normalización). Se recomienda el uso de un sistema de w0,05 = anchura del pico a la veinteava parte de su altura,
integración automático (integrador o sistema de adquisi-
ción y tratamiento de datos). d= distancia entre la perpendicular trazada desde el
máximo del pico y el borde de entrada del pico a
2. Métodos
la veinteava parte de su altura.

analíticos
IDONEIDAD DEL SISTEMA

Como parámetros de idoneidad se introducen ensayos de
Para comprobar el comportamiento del sistema de electro- repetibilidad del área (desviación típica de las áreas o de la
foresis capilar, se utilizan los parámetros de idoneidad del relación área/tiempo de migración) y de la repetibilidad del
sistema. La elección de estos parámetros depende del tipo tiempo de migración (desviación típica del tiempo de migra-
de electroforesis capilar utilizado. Dichos parámetros son: ción). La repetibilidad del tiempo de migración proporciona
factor de capacidad (k’) (sólo para cromatografía electro- un ensayo de idoneidad de los procedimientos de lavado de
cinética micelar), número aparente de platos teóricos (N), los capilares. Una práctica alternativa para evitar la falta de
factor de simetría (As) y resolución (Rs). En las secciones repetibilidad del tiempo de migración es utilizar un tiempo de
anteriores ya han sido descritas las expresiones teóricas de migración respecto a un patrón interno.
N y Rs, pero a continuación se dan otras ecuaciones prácti-
cas que permiten calcular estos parámetros a partir de los Puede también ser útil para la determinación de sustancias
electroforetogramas. relacionadas un ensayo de la verificación de la relación
señal-ruido para una preparación patrón (o la determinación
Número aparente de platos teóricos del límite de cuantificación).
El número aparente de platos teóricos (N) puede calcularse Relación señal-ruido

utilizando la expresión:
El límite de detección y el límite de cuantificación corres-
2 ponden a una relación señal-ruido de 3 y 10, respectivamen-
N = 5,54 wtR te. La relación señal-ruido (S/N) se calcula utilizando la
h expresión:
tR = tiempo o distancia de migración medido sobre la línea
base entre el punto de inyección y la perpendicular tra- S/N = 2H
zada desde el máximo del pico correspondiente al h
componente, H = altura del pico correspondiente al componente consi-
derado, en el electroforetograma obtenido con la diso-
wh = anchura del pico a la mitad de la altura. lución de referencia prescrita, medida desde el máxi-
mo del pico hasta la línea base extrapolada de la señal
Resolución observada sobre una distancia igual a veinte veces la
anchura a la mitad de su altura,
La resolución (Rs) entre picos de altura similar de los dos
componentes puede calcularse utilizando la expresión: h = intervalo del ruido de fondo en un electroforetograma
obtenido después de la inyección de un blanco, obser-
Rs =
( 1,18 (tR2 - tR1)
wh1 + wh2 ) vado a una distancia igual a veinte veces la anchura a la
mitad de su altura en el electroforetograma obtenido
con la disolución de referencia prescrita y, si es posible,
situado igualmente en la zona próxima al lugar donde
se espera la aparición del pico.
tR2 > tR1
tR1 y tR2 = tiempos o distancias de migración medidos sobre
la línea base entre el punto de inyección y las 2.2.48. ESPECTROMETRÍA RAMAN
perpendiculares trazadas desde los máximos de
dos picos adyacentes,
La espectrometría Raman (difusión no elástica de la luz) es
wh1 y wh2 = anchuras de los picos a la mitad de la altura. un proceso de difusión de la luz en el que la muestra que se
examina se irradia con luz monocromática intensa (general-
Cuando proceda, la resolución puede calcularse midiendo la mente luz de láser) y se analiza la luz difundida por la mues-
altura del valle (hv) entre dos picos parcialmente resueltos en tra para determinar las desviaciones de frecuencia.
una preparación patrón y la altura del pico menor (hp) y cal-
culando la relación pico a valle La espectrometría Raman es complementaria de la espec-
trometría infrarroja en el sentido que las dos técnicas
Hp demuestran las vibraciones moleculares de un material. Sin
p/v =
Hv embargo, la espectrometría Raman y la infrarroja tienen
diferentes sensibilidades relativas para diferentes grupos
Factor de simetría funcionales. La espectrometría Raman es particularmente
sensible a los enlaces no polares (por ejemplo, enlaces C-C
El factor de simetría (As) de un pico puede calcularse utili-
sencillos o múltiples) y menos sensible a los enlaces pola-
zando la expresión:
res. Por consiguiente, el agua, que tiene un fuerte espectro
de absorción en el infrarrojo, es un débil difusor en la espec-
w 0,05
As = trometría Raman y por consiguiente adecuada como disol-
2d vente para dicha espectrometría.

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.48. Espectrometría Raman
Aparatos: los espectrómetros para registrar los espectros Aunque la ley de Beer-Lambert no es válida para la espec-
Raman están constituidos generalmente por los siguientes trometría Raman, la intensidad Raman es directamente pro-
componentes: porcional a la concentración de las especies difusoras.
Como para otras técnicas espectroscópicas, puede realizarse
2. Métodos
— una fuente de luz monocromática, generalmente un
analíticos
la cuantificación utilizando cantidades o concentraciones
láser, con una longitud de onda en la región ultravioleta, conocidas de sustancias de referencia. Debido a la pequeña
visible o del infrarrojo cercano, resolución espacial de la técnica, deben tomarse medidas
— dispositivos ópticos apropiados (lentes, espejos, equipo para que sean representativas las muestras de las sustancias
de fibra óptica) que dirigen la luz irradiante a la muestra patrones y de las sustancias desconocidas, por ejemplo con-
y recogen la luz difundida por ella, firmando que están en el mismo estado físico o utilizando
un patrón interno para las muestras líquidas.
— un dispositivo óptico (monocromador o filtro) que trans-
mite la difusión Raman de diferentes frecuencias y evita
que la intensa frecuencia incidente (esparcimiento Ray- IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN UTILIZANDO
leigh) alcance el detector, COLECCIONES DE ESPECTROS Y MÉTODOS
ESTADÍSTICOS PARA CLASIFICACIÓN
— un dispositivo dispersor (monocromador de red o prisma) Y CALIBRADO
combinado con ranuras selectoras de la longitud de onda y
un detector (generalmente un tubo fotomultiplicador), Control de la validación de los instrumentos. Utilizar el apa-
rato de acuerdo con las instrucciones del fabricante y realizar a
o: intervalos regulares los calibrados y los ensayos de validación
— un dispositivo dispersor (de red o prisma) combinado del sistema prescritos, dependiendo del uso del aparato y de
con un detector de múltiples canales (generalmente un las sustancias a examinar. Cuando se utiliza la espectrometría
dispositivo de acoplamiento con carga [DAC]), Raman para determinaciones cuantitativas, o cuando se recu-
rre a colecciones de espectros de referencia para clasificación
o:
(quimiométrica) o calibración, debe comprobarse en particu-
— un interferómetro con un detector que registra la intensi- lar que se realizan las correcciones necesarias o que se toman
dad de la luz difundida con relación al tiempo, y un medidas para controlar la variación del número de ondas y la
equipo de tratamiento de datos que convierte los datos intensidad de respuesta de los instrumentos.
en frecuencia o en número de ondas por cálculo median-
te una transformada de Fourier. Verificación de la escala del número de ondas. Verificar la
escala del número de ondas del desplazamiento Raman
(expresado normalmente en centímetros recíprocos) utili-
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
zando un patrón apropiado que tenga máximos característi-
Los espectros Raman pueden obtenerse de sólidos, líquidos y cos en los números de onda en investigación, por ejemplo,
gases bien directamente, o en recipientes o tubos de vidrio, una sustancia orgánica, una lámpara de Ne o líneas de plas-
ma de Ar+ procedentes de un láser de ion argón.
generalmente sin preparación ni dilución previa de la muestra.
El calibrado debe adaptarse al tipo de muestra, es decir,
Una de las principales limitaciones de la espectrometría
debe utilizarse una muestra sólida de calibración para mues-
Raman es que las impurezas pueden causar fluorescencia
tras sólidas y una muestra líquida de calibración para mues-
que interfiere con la detección de la señal Raman mucho más
tras líquidas. Elegir una sustancia apropiada (por ejemplo
débil. La fluorescencia puede evitarse eligiendo como fuente indeno, ciclohexano o nafteno) para la que se hayan estable-
un láser con una longitud de onda más larga, por ejemplo del cido las diferencias exactas de los números de ondas. La
infrarrojo cercano, que la línea excitatriz. La intensidad de muestra de indeno puede ser colocada preferiblemente en
ciertas líneas Raman puede aumentarse de varios modos, por un tubo para RMN, al que se hace el vacío y se cierra bajo
ejemplo en Raman con Resonancia (RR) y por Espectrome- gas inerte, y se almacena en frío en la oscuridad para evitar
tría Raman sensibilizada en superficie (SERS). la degradación de la muestra.
Debido al estrecho foco del haz irradiante del láser, general- Tabla 2.2.48.-1.–Desplazamientos de los números de ondas
mente el espectro se obtiene a partir de sólo unos microli- (y tolerancias aceptables) de ciclohexano, indeno y naftaleno.
tros de muestra. Por consiguiente, debe tenerse en cuenta
las heterogeneidades de la muestra, a menos que se aumente ciclohexanoA indenoB naftalenoA
su volumen, por ejemplo, por rotación.
3056,4 (+ 1,5)
2938,3 (± 1,5)
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN UTILIZANDO 2923,8 (+ 1,5)
SUSTANCIAS DE REFERENCIA 2852,9 (+ 1,5)
1609,7 (+ 1,0) 1576,6 (+ 1,0)
Preparar la sustancia a examinar y la sustancia de referencia 1444,4 (+ 1,0) 1552,6 (+ 1,0) 1464,5 (+ 1,0)
por el mismo procedimiento y registrar los espectros en las 1266,4 (+ 1,0) 1205,2 (+ 1,0) 1382,2 (+ 1,0)
mismas condiciones. Los máximos en el espectro obtenido 1157,6 (+ 1,0) 1147,2 (+ 1,0)
1028,3 (+ 1,0) 1018,6 (+ 1,0) 1021,6 (+ 1,0)
con la sustancia a examinar corresponden en posición e 801,3 (+ 1,0) 730,5 (+ 1,0) 763,8 (+ 1,0)
intensidad relativa a los espectros obtenidos con la sustancia 533,9 (+ 1,0) 513,8 (+ 1,0)
de referencia (SQR).
Cuando los espectros registrados en el estado sólido presen- A Standard guide for Raman shift standards for spectrome-
tan diferencias en las posiciones de los máximos, tratar la ter calibration (American Society for Testing and Materials
sustancia a examinar y la sustancia de referencia del mismo ASTM E 1840).
modo para que cristalicen o se produzcan de la misma
BD. A. Carter, W. R. Thompson, C. E. Taylor y J. E. Pem-
forma, o proceder como se describe en la monografía, y a
continuación registrar los espectros. berton, Applied Spectroscopy, 1995, 49 (11), 1561-1576.

2.2.49. Método del viscosímetro de bola REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
Verificación de la escala respuesta-intensidad. Las inten- 2.2.49. MÉTODO DEL VISCOSÍMETRO

sidades absoluta y relativa de las bandas Raman se ven afec-
tadas por varios factores que incluyen: DE BOLA
2. Métodos
— el estado de polarización de la luz irradiante,

analíticos
La determinación de la viscosidad dinámica de los líquidos

— el estado de polarización de los aparatos ópticos recopi- newtonianos utilizando un viscosímetro apropiado basado
ladores de datos, en la medida de la velocidad de caída de una bola se realiza
a 20 ± 0,1 ºC, salvo indicación contraria en la monografía.
— la intensidad de la luz irradiante, Se determina el tiempo requerido para que una bola introdu-
cida en el líquido a examinar recorra la distancia entre dos
— las diferencias de respuesta de los instrumentos, marcas circulares. Si no se define un límite menor para el
equipo utilizado, el resultado es válido sólo si dos medidas
— las diferencias de enfoque y geometría de la muestra, consecutivas no difieren más del 1,5 por ciento.
— las diferencias de densidad de compactación de las Aparato. El viscosímetro basado en la medida de la velo-
muestras sólidas. cidad de caída de una bola consiste en: un tubo de vidrio
encerrado en una camisa, que permite el control exacto de la
Los criterios de aceptación apropiados variarán con la apli- temperatura; seis bolas de vidrio, níquel-hierro o acero con
cación, pero en la mayoría de los casos se alcanza una varia- diferentes densidades y diámetros. El tubo se fija de tal
ción diaria de ± 10 por ciento en las intensidades relativas modo que el eje esté inclinado 10 ± 1º respecto a la vertical.
de las bandas. El tubo tiene 2 marcas circulares que definen la distancia
que ha de recorrer la bola. Junto con los aparatos comercia-
Establecimiento de una colección de espectros de referen- les se suministran tablas que indican las constantes, la den-
cia. Registrar los espectros de un número apropiado de sidad de las bolas y la idoneidad de las diferentes bolas para
materiales que hayan sido ensayados a fondo (por ejemplo el intervalo de viscosidad esperado.
como se prescribe en una monografía) y que presenten la
variación (fabricante, lote, modificación cristalina, tamaño Procedimiento. Rellenar el tubo seco y limpio del viscosí-
de partículas, etc.) típica del material que se va a analizar. metro, previamente calentado a 20 ± 0,1 ºC, con el líquido a
La serie de espectros representa la información que define examinar, evitando la formación de burbujas. Añadir la bola
adecuada para el intervalo de viscosidad del líquido de
el margen de similitud, o los límites cuantitativos, que pue-
modo que se obtenga un tiempo de caída no menor de 30 s.
den utilizarse, por ejemplo para identificar la sustancia o Cerrar el tubo y mantener la disolución a 20 ± 0,1 ºC duran-
controlar la cantidad formada en un proceso de fabricación. te al menos 15 min. Dejar caer la bola en el líquido entre las
El número de sustancias en la base de datos depende de su 2 marcas circulares una vez sin efectuar ninguna medición.
aplicación específica. La recogida de espectros en la base de Volver a realizar de nuevo la operación y medir con un cro-
datos puede representarse de diferentes modos definidos por nómetro, con una aproximación de un quinto de segundo, el
la técnica matemática utilizada para su clasificación o cuan- tiempo requerido para que la bola caiga desde la marca cir-
tificación. cular superior a la inferior. Repetir el ensayo al menos
3 veces.
Durante el procedimiento de validación ha de establecerse
la selectividad de la base de datos que hace posible identifi- Calcular la viscosidad dinámica η en milipascales segundos
car positivamente un material dado y distinguirlo adecuada- utilizando la fórmula:
mente de otros materiales de dicha base. Esta selectividad
debe ser comprobada regularmente para confirmar la vali- η = k (ρ1 - ρ2) × t
dez inicial de la base de datos; esto es necesario especial-
mente después de un cambio importante de una sustancia
(por ejemplo cambio del suministrador o del proceso de k = constante, expresada en milímetros cuadrados por
fabricación del material) o en el ajuste de los instrumentos segundo al cuadrado,
Raman (por ejemplo verificación del número de ondas y
repetibilidad de la respuesta del espectrómetro). ρ1 = densidad de la bola utilizada, expresada en gramos por
centímetro cúbico,
Esta base de datos se valida a continuación para utilizar sólo ρ2 = densidad del líquido a examinar, expresada en gramos
con el instrumento original, o con un instrumento similar, por centímetro cúbico, obtenida multiplicando su den-
siempre que la base de datos transferida haya demostrado 20 por 0,9982,
sidad relativa d 20
que sigue siendo válida.
t = tiempo de caída de la bola, en segundos.
Método. Preparar y examinar la muestra de la misma
manera que para la formación de la base de datos. Puede
calcularse una transformación matemática apropiada del
espectro Raman para facilitar la comparación o la predic- 2.2.54. ISOELECTROENFOQUE
ción cuantitativa de los espectros.
PRINCIPIOS GENERALES
La comparación de los espectros o de las transformadas de
los espectros o la predicción cuantitativa de las propiedades El isoelectroenfoque (IEF) es un método de electroforesis
o cantidades en el material en cuestión puede implicar el que se utiliza para separar las proteínas basándose en su
uso de una técnica adecuada de clasificación quimiométrica punto isoeléctrico. La separación se realiza en una placa de
o estadística o de calibrado. gel de poliacrilamida o de agarosa que contiene una mezcla

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.54. Isoelectroenfoque
de electrólitos anfóteros (anfolitos). Cuando se someten a 30 W obteniéndose generalmente una separación completa
un campo eléctrico, los anfolitos migran en el gel creando en 1,5 h a 3,0 h.
un gradiente de pH. En algunos casos se utilizan geles con
un gradiente de pH inmovilizado, obtenidos incorporando El tiempo requerido para realizar el enfoque en geles de
2. Métodos
analíticos
ácidos y bases débiles a regiones específicas del gel durante poliacrilamida en capa delgada se determina depositando
su preparación. Cuando las proteínas aplicadas alcanzan la una proteína coloreada (por ejemplo hemoglobina) en dife-
fracción de gel que tiene un pH igual a su punto isoeléctrico rentes puntos del gel y aplicando un campo eléctrico: el
(pI), su carga se neutraliza y cesa su migración. Según la equilibrio se alcanza cuando son idénticos todos los perfiles
mezcla de anfolitos elegida, los gradientes pueden preparar- de electroforesis de los diferentes depósitos. En algunos
se en diversas regiones de pH. protocolos, el punto final del enfoque está indicado por el
tiempo transcurrido desde la aplicación de la muestra.
ASPECTOS TEÓRICOS La resolución entre las bandas de proteínas en un gel de IEF
preparado con anfolitos transportadores puede ser bastante
Cuando una proteína se encuentra en la posición de su punto buena. La mejor resolución puede conseguirse utilizando
isoeléctrico, su carga neta es nula y cesa su desplazamiento gradientes de pH inmovilizados en los que las especies tam-
en la matriz de gel por efecto del campo eléctrico. Sin pón, análogas a los anfolitos transportadores, están copoli-
embargo puede desplazarse desde dicha posición por difu- merizadas en la matriz del gel. Las proteínas cuyos pI difie-
sión. El gradiente de pH hace que la proteína permanezca en ren sólo en 0,02 unidades de pH pueden resolverse
la posición de su punto isoeléctrico, donde se concentra; utilizando un gel preparado con anfolitos transportadores,
este efecto de concentración se denomina “enfoque”. mientras que los gradientes de pH inmovilizados pueden
Aumentando el voltaje aplicado o reduciendo la carga de la resolver proteínas que se diferencian en aproximadamente
muestra se obtiene una mejor separación de las bandas. Sin 0,001 unidades de pH.
embargo, el voltaje aplicado está limitado por el calor gene-
rado, que debe ser disipado. La utilización de geles delga- El gel de IEF puede utilizarse como ensayo de identidad
dos y un sistema eficaz de enfriamiento de la placa, contro- cuando la migración en el gel se compara con la de una pre-
lado por una bomba de circulación termoestática, evita la paración patrón y con la de proteínas de calibrado de IEF; el
combustión del gel permitiendo un enfoque fino. La separa- gel de IEF puede utilizarse como ensayo límite cuando la
ción se estima determinando la diferencia mínima de pI densidad de una banda en IEF se compara subjetivamente
(∆pI) que es necesaria para separar 2 bandas próximas: con la densidad de las bandas que aparecen en una prepara-
ción patrón; o puede utilizarse como ensayo semicuantitati-
dpH
vo cuando la densidad se mide utilizando un densitómetro o
D instrumentación similar para determinar la concentración
∆pI = 3 × dx
relativa de proteínas en las bandas.
dµ
E - dpH
APARATO
D = coeficiente de difusión de la proteína, Un aparato para IEF consiste en:
dpH
dx
= gradiente de pH, — un generador de corriente continua regulable y de poten-
cia estabilizada,
E = intensidad del campo eléctrico, en voltios por
centímetro, — una cubeta para IEF de plástico rígido que contiene,
dµ como soporte del gel, una placa refrigerada de material
- dpH = variación de la movilidad del soluto con el pH adecuado,
en la región próxima al pI.
— una tapa de plástico con electrodos de platino conecta-
dos al gel por medio de mechas de papel, de anchura,
dµ longitud y espesor adecuados, impregnadas con disolu-
Puesto que D y - dpH para una proteína dada son invaria- ciones de electrólitos anódicos y catódicos.
bles, la separación puede mejorarse utilizando un intervalo
más estrecho de pH y aumentando la intensidad del campo
eléctrico. ISOELECTROENFOQUE EN GELES DE POLIACRILAMIDA:
PROCEDIMIENTO DETALLADO
ASPECTOS PRÁCTICOS El siguiente método es una descripción detallada de un pro-

cedimiento de IEF en placas gruesas de geles de poliacrila-
Debe prestarse especial atención a las características y/o mida, que es el utilizado salvo indicación contraria en la
preparación de la muestra. Puede ser problemática la pre- monografía.
sencia de sal en la muestra y es mejor prepararla, si es posi-
ble, en agua desionizada o en una disolución de anfolitos al PREPARACIÓN DE LOS GELES
2 por ciento utilizando, si es necesario, diálisis o filtración
en gel. Molde. El molde (ver Figura 2.2.54.-1) está compuesto de
una placa de vidrio (A) sobre la que se coloca una película
En general se trabaja con diferencias de potencial de 2500 V de poliéster (B) para facilitar la manipulación del gel, uno o
que se consideran óptimas en ciertas condiciones de funcio- más espaciadores (C), una segunda placa de vidrio (D) y
namiento. Puede aplicarse una potencia constante de hasta pinzas para sujetar la estructura.

2.2.54. Isoelectroenfoque REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición
Escurrir la disolución y añadir 200 ml de disolución de

decoloración R e incubar con agitación durante 1 h. Escurrir
el gel, añadir disolución de tinción de Coomassie R. Incubar
durante 30 min. Decolorar el gel por difusión pasiva con
2. Métodos
analíticos
disolución de decoloración R hasta que las bandas se obser-

van claramente contra un fondo transparente. Localizar la
posición e intensidad de las bandas en el electroforetograma
como se prescribe en la monografía.
VARIACIONES AL PROCEDIMIENTO DETALLADO

(SUSCEPTIBLES DE VALIDACIÓN)
Cuando se hace referencia al método general de isoelectro-
enfoque, pueden realizarse variaciones en la metodología o
en el procedimiento, susceptibles de validación. Estas
incluyen:
Figura 2.2.54.-1–Molde
— el uso de geles pre-moldeados comercialmente disponi-
Gel de poliacrilamida al 7,5 por ciento. Disolver 29,1 g bles,
de acrilamida R y 0,9 g de metilénbisacrilamida R en 100
— el uso de gradientes de pH inmovilizados,
ml de agua R. A 2,5 volúmenes de esta disolución, añadir la
mezcla de anfolitos especificada en la monografía y diluir — el uso de geles cilíndricos,
hasta 10 volúmenes con agua R. Mezclar minuciosamente y
desgasificar la disolución. — el uso de geles en placas de diferentes dimensiones,
incluyendo geles ultrafinos (0,2 mm),
Preparación del molde. Extender la película de poliéster
sobre la placa de vidrio inferior, colocar el espaciador, y — variaciones en el procedimiento de aplicación de la
luego la segunda placa de vidrio y fijar todo con las pinzas. muestra, incluyendo diferentes volúmenes de la muestra
Antes de su utilización, colocar la disolución en un agitador o el empleo de máscaras o mechas de aplicación de un
magnético y añadir 0,25 volúmenes de una disolución de material distinto al papel,
100 g/l de persulfato de amonio R y 0,25 volúmenes de
tetrametiletilendiamina R. Rellenar inmediatamente con la — el uso de condiciones de migración alternativas, inclu-
disolución el espacio entre las placas de vidrio del molde. yendo variaciones en el campo eléctrico dependiendo de
las dimensiones del gel y del equipo, y el uso de tiempos
de migración fijos en vez de la interpretación subjetiva
PROCEDIMIENTO de la estabilidad de las bandas,
Desmontar el molde y, utilizando la película de poliéster, — la inclusión de una etapa de pre-enfoque,
transferir el gel al soporte enfriado, humedecido con algu-
nos mililitros de un líquido adecuado, procurando evitar la — el uso de instrumentación automatizada,
formación de burbujas de aire. Preparar las disoluciones
problemas y las disoluciones de referencia como se especi- — el uso de geles de agarosa.
fique en la monografía. Colocar sobre el gel tiras de papel,
de aproximadamente 10 mm × 5 mm, para la aplicación de VALIDACIÓN DE LOS PROCEDIMIENTOS
las muestras e impregnar cada una con la cantidad prescrita DE ISOELECTROENFOQUE
de las disoluciones problemas y de referencia. Si la concen-
tración de proteínas de la disolución es demasiado baja, pue- Cuando se emplean métodos alternativos al procedimien-
den superponerse varias tiras (hasta 4). Aplicar también la to detallado, deben validarse utilizando los siguientes cri-
cantidad prescrita de una disolución de proteínas con puntos terios:
isoeléctricos conocidos como marcadores de pH para cali-
brar el gel. En algunos protocolos el gel tiene ranuras pre- — formación de un gradiente estable de pH de característi-
moldeadas en las que se aplica una disolución de la muestra cas deseadas, determinado por ejemplo utilizando mar-
en lugar de utilizar tiras de papel impregnadas. Cortar 2 tiras cadores de pH coloreados de puntos isoeléctricos cono-
de papel con la longitud del gel e impregnarlas con las diso- cidos,
luciones de los electrólitos: disolución ácida para el ánodo y
alcalina para el cátodo. Las composiciones de las disolucio- — comparación con el electroforetograma proporcionado
nes anódica y catódica se dan en la monografía. Aplicar con la sustancia química de referencia para la prepara-
estas mechas de papel a cada lado del gel a varios milíme- ción a examinar,
tros del borde. Colocar la tapa de modo que los electrodos
estén en contacto con las mechas (respetando los polos anó- — cualquier otro criterio de validación prescrito en la
dico y catódico). Proseguir con el isoelectroenfoque apli- monografía.
cando los parámetros eléctricos descritos en la monografía.
Conectar la corriente cuando se haya estabilizado la migra- VARIACIONES ESPECÍFICAS AL PROCEDIMIENTO
ción de la mezcla de las proteínas patrón. Utilizando pinzas, GENERAL
retirar las tiras de aplicación de la muestra y las 2 mechas de
electrodos. Sumergir el gel en disolución de fijación para Las variaciones al procedimiento general requeridas para el
isoelectroenfoque en gel de poliacrilamida R. Incubar con análisis de sustancias específicas pueden describirse con
agitación suave a temperatura ambiente durante 30 min. detalle en las monografías. Estas variaciones incluyen:

REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.54. Isoelectroenfoque
— la adición de urea al gel de migración (una concentra- tes de pH extremo, las muestras no deben aplicarse cerca de
ción 3 M es con frecuencia suficiente para mantener la cada uno de los electrodos. Durante la realización del proce-
proteína en solución pero pueden utilizarse concentra- dimiento, el analista puede intentar aplicar la proteína en 3
ciones de hasta 8 M); para algunas proteínas que pre- posiciones del gel (es decir en el centro y en ambos extre-
2. Métodos
analíticos
cipitan en su punto isoeléctrico, se incluye urea en la mos); el comportamiento de una proteína aplicada en los
formulación del gel para mantener la proteína en solu- extremos opuestos del gel puede no ser idéntico.
ción. Si se usa urea, sólo deben utilizarse disoluciones
recién preparadas para evitar la carbamilación de la Puede surgir un fenómeno conocido como deriva catódica,
proteína, en la que el gradiente de pH disminuye con el tiempo, si el
enfoque del gel es demasiado largo. Aunque dicho fenóme-
— el uso de métodos de coloración alternativos, no no se comprenda muy bien, la electroendósmosis y la
absorción de dióxido de carbono pueden ser los factores res-
— el uso de aditivos del gel, tales como detergentes no
ponsables de la deriva catódica. La deriva catódica se obser-
iónicos (por ejemplo, octilglicósidos) o detergentes de
va cuando la proteína enfocada migra hacia el extremo del
ion híbrido para evitar la agregación o precipitación de
cátodo del gel. Para resolver este problema pueden utilizar-
las proteínas.
se gradientes de pH inmovilizados.
PUNTOS A CONSIDERAR Es importante un enfriamiento eficaz (aproximadamente

4 ºC) del lecho que soporta el gel durante el enfoque. Cam-
Las muestras pueden aplicarse a cualquier zona del gel, pero pos eléctricos elevados utilizados durante el isoelectroenfo-
en general deben aplicarse a las zonas en las que se va a rea- que pueden conducir a un sobrecalentamiento y afectar la
lizar el enfoque. Para proteger las proteínas de los ambien- calidad del gel enfocado.

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2.2. MÉTODOS FÍSICOS Y FÍSICO-QUÍMICOS

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Disolución de hexametilentetramina. En un matraz de 100 REACTIVOS

Suspensión primaria de opalescencia. Introducir 25,0 ml Disolución amarilla. Disolver 46 g de cloruro de

I II III IV Disolución roja. Disolver 60 g de cloruro de cobalto R en

MÉTODO I Disolución azul. Disolver 63 g de sulfato de cobre R en

20 Véase la nota informativa sobre Monografías generales

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Tabla 2.2.2.-1 Tabla 2.2.2.-5.—Disoluciones de referencia AV

Volumen en mililitros Volumen en mililitros

Tabla 2.2.2.-3.—Disoluciones de referencia PA

A1 100,0 0,0 Temperatura °C k

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frecuente es el electrodo de vidrio) y el otro es un electrodo

Tabla 2.2.3.-2.—Variación del pH en las disoluciones tampón en función de la temperatura

Temperatura Tetraoxalato Hidrogeno- Dihidrogeno- Hidrogeno- Hidrogeno- Hidrogeno- Tetraborato Carbonato

15 1,67 3,80 4,00 6,90 7,45 9,28 10,12

Preparación de las disoluciones tampón de referencia. Hidrogenofosfato de dipotasio 0,025 M + hidrogenofosfato

22 Véase la nota informativa sobre Monografías generales

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2.2.4. CORRESPONDENCIA ENTRE 20 con el número de deci-

Fuertemente > 10 Papel de fenolfta- Roja

Para calibrar el aparato utilizar los líquidos de referencia

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2.2.7. ROTACIÓN ÓPTICA Procedimiento. Determinar el cero del polarímetro y el

tancias quirales de desviar el plano de polarización de la luz

no ser que en la monografía se señalen las correcciones que

24 Véase la nota informativa sobre Monografías generales

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El viscosímetro capilar permite la determinación de la vis- Tabla 2.2.9.-1

1 0,01 3,5 a 10 0,64 5,6 2,8 a 3,2

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2.2.10. MÉTODO DEL VISCOSÍMETRO alargadera. Se introduce un termómetro en el cuello del

Tabla 2.2.11.-1.—Corrección de la temperatura

2.2.11. INTERVALO DE DESTILACIÓN

El intervalo de destilación es el intervalo de temperatura,

26 Véase la nota informativa sobre Monografías generales

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2.2.13. DETERMINACIÓN DE AGUA

Aparato. El aparato (ver figura 2.2.13.-1) está formado por

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2.2.15. PUNTO DE FUSIÓN - MÉTODO Procedimiento. Calentar el bloque a velocidad bastante

28 Véase la nota informativa sobre Monografías generales

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caer, a intervalos regulares, algunas partículas de la sustan-

2.2.17. PUNTO DE GOTA

El punto de gota es la temperatura a la que la primera gota

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ximado y mantenerlo hasta la práctica desaparición de cual- do de plata-cloruro de plata.

En una valoración potenciométrica, el punto final de la valo-

30 Véase la nota informativa sobre Monografías generales

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2.2.21. FLUORIMETRÍA Equipo. Consta, esencialmente, de un generador de áto-

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centración operando de la manera siguiente:

32 Véase la nota informativa sobre Monografías generales

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PARA REGISTROS POR ABSORCIÓN

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