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    Informe 4

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    JUAN LUIS TUNAROSA
    Este documento describe el proceso de amplificación de ADN genómico mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se amplificó una pequeña sección de ADN extraída previamente y se duplicó usando PCR. La creación de una nueva cadena de ADN se logró basándose en la secuencia original gracias a la PCR.

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    JUAN LUIS TUNAROSA
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    Este documento describe el proceso de amplificación de ADN genómico mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se amplificó una pequeña sección de ADN extraída previamente y se duplicó usando PCR. La creación de una nueva cadena de ADN se logró basándose en la secuencia original gracias a la PCR.

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    INFORME 4

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    Tunarosa, J

    AMPLIACION DEL ADN GENOMICO MEDIANTE


    LA REACCION EN CADENA DE LA
    POLIMERASA (PCR)
    Tunarosa Delgado Juan Luis
    Estudiante De Medicina
    Cod: 19181025
    [email protected]
    Universidad de Santander (UDES)

    Abstract En la siguiente practica se amplificará una pequeña sección


    de ADN extraída anteriormente y se amplificará por medio de
    la reacción de la polimerasa (PCR).
    It is vitally important for forensic sciences to be able to
    duplicate small sections of DNA coding areas to help solve
    cases that is why in this laboratory a small section of DNA 2. OBJETIVOS
    that had been extracted through salting out was duplicated.
    The creation of a new DNA chain was achieved based on  Describir los puntos importantes de control de la
    what we already had thanks to (PCR). (PCR) para obtener una secuencia especifica de un
    gen.

    Resumen  Amplificar la secuencia especifica de ADN


    mediante la técnica de (PCR)

    Es de vital importancia para las ciencias forenses el poder


    duplicar pequeñas secciones de áreas codificantes de ADN 3. METODOLOGIFERA
    para ayudar a resolver casos por eso en este laboratorio se EXPERIMENTAL
    duplico una pequeña sección de ADN que se había extraído
    por medio de salting out.
    AMPLIFICACION DE ADN USANDO LA TECNICA
    Se logro la creación de una nueva cadena de ADN con base a
    (PCR).
    la que ya teníamos gracias a la (PCR).

    I. Se tomo 1 rubos de eppendorf de 200 ml.


    Palabras Clave
    II. Al tubo se le agregaron los siguientes reactivos: 15
    μL de solución buffer, 15 μL de H2O, 30 μL de
    Buffer, Polimerasa, Eppendorf, ADN, Baño serologico DNTP´S, 15 μL de Primer F, 15 μL de Primer R, 15
    μL de MgCl2 y 15 μL de TAQ.
    III. Luego se coloco en voretex por 10 segundos
    1. INTRODUCCIÓN
    IV. Posterior a esto se toma un tubo de eppendorf de
    2ml y en el se colocan 15 μL de la solución que se
    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para encuentra en el tubo de eppendorf grande.
    amplificar una secuencia de ADN desconocidas. Gracias a V. Se retira el ADN de baño serológico y se agregaron
    esta técnica se han podido realizar estudios genéticos en 15 μL de ADN.
    cualquier campo de la ciencia. Por ejemplo, se utiliza
    diariamente para la identificación de cadáveres o en el VI. Se coloco la muestra en el termociclador durante 4
    estudio de escenas del crimen para buscar rastros del horas para el resultado.
    culpable. También se emplea en la biología, para identificar
    cadenas genéticas de plantas, animales o, sobre todo,
    microorganismos. En la medicina se reúne la experiencia de 4. RESULTADOS
    todos esos campos y se usa principalmente para identificar
    gérmenes agresores que se encuentran en nuestro organismo. Para concluir la practica los tubos de eppendorf fueron
    llevados al termociclador para realizar la reacción de la
    Esta técnica permite amplificar pequeñas regiones específicas (PCR).
    del ADN en laboratorio. Es decir, consigue que un pequeño
    segmento de ADN que pasaría desapercibido en un análisis
    cualquiera se multiplique millones de veces y así sea fácil de 5. DISCUSION
    detectar.
    TIPOS DE (PCR)
    Tunarosa, J original, o para identificar con una muy alta probabilidad,
    muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de
    PCR Anidada: Técnica muy sensible de PCR en la que el fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting
    producto de una amplificación es utilizado como molde para temperature).
    realizar una segunda amplificación con cebadores que se Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no
    ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas.
    cuando tenemos el primer, como su amplificación se pueden
    unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve
    dentro de la ampliación inicial. Este tipo de PCR tiene multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al
    la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo
    especificidad aumenta porque como es amplificación de una fluorescencia que es medida por el termociclador apto para
    ampliación obtenido previamente, los cebadores sólo van a PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia
    hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será por reacción, pero tiene la ventaja de utilizar cebadores
    una única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones normales para su realización. Es mucho más económica que
    inespecíficas de los cebadores. La desventaja de esta técnica la que usa sondas específicas.
    es que no nos permite cuantificar la muestra.
    En este laboratorio se usó la técnica conocida como PCR
    PCR de extensión solapada (Mutagénesis): Se anidad ya que esta brinda una mayor especificidad que brinda
    introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos y es la mejor opción teniendo en cuenta que ya teníamos una
    (clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primers) fracción de ADN totalmente aislada.
    mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un
    fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutación. Se
    usan los productos en otra reacción para producir el ADN 6. INVITACION AL ESTUDIANTE
    mutado de longitud completa.

    PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reacción de PCR  Plantee tres factores que afecten la actividad
    en secciones histológicas o células, donde los productos de las enzimas de restricción
    generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es
    realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la
    técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación RTA: Existen varios factores que son críticos al
    de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in trabajar con enzimas de restricción y que pueden afectar la
    situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera actividad de estas enzimas como:
    pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta
    tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar 1.      Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy
    específicamente una población de secuencias de menor dependiente de la pureza, contaminantes como
    representación. proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS,
    altas concentraciones de sal, etc. inhiben la
    endonucleasa.
    PCR múltiple: PCR en la cual se amplifica 2.      Temperatura y pH – las enzimas son muy
    simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su
    combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, estabilidad y actividad.
    junto con el resto de los reactivos de la reacción en 3.      DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en
    cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente presencia de Mg++.
    varios segmentos de ADN. Ventajas: información sobre
    varios locus en una sola reacción, menor cantidad de molde
    para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida 7. Conclusiones
    construcción de bases de datos. Desventajas: para llevarla a
    cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una
    cuidadosa optimización del proceso.  La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un
    método por el cual se puede duplicar un pequeño
    fragmento de ADN.
    PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): Es una variante de
     Es de vital importancia contar con las respectivas
    la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de
    medidas de seguridad tanto para los estudiantes
    ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para
    como para la muestra para así evitar la degradación
    realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN
    del ADN por medio de las ADN asas.
    (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR
    sería:  Es importante saber que tipo de PCR usar en los
    diferentes casos que se necesiten y en las
    condiciones en las que se encuentre el ADN para de
     1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
    esta manera lograr una correcta amplificación y de
     2.º paso: amplificación a partir de la primera hebra
    que se obtenga en resultado deseado.
    de ADNc.
     3.er paso: PCR estándar.
    Referencias
    PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR):
    Reacción de PCR cuya principal característica es que permite Este informe está basado en las fuentes bibliográficas que se
    cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra citan a continuación, así como en la propia experiencia de
    Tunarosa, J en el laboratorio del curso de biociencias II
    los participantes
    grupo A2 (UDES).

    I. Tipos de PCR. (2019). Retrieved 20 September


    2019, from
    http://apuntesbiologiamol.blogspot.com/2014/05/tip
    os-de-pcr.html
    II. LEON, F., MATEUS SANCHEZ, J. and
    GONZALES SEDANO, G. (2019). Manual De
    Laboratorio Biociencias 2 Medicina. 1st ed.
    Bucaramanga.

    III. Acidosis y Alcalosis | Lab Tests Online-ES. (2019).


    Retrieved 6 September 2019, from
    https://labtestsonline.es/conditions/acidosis-y-
    alcalosis

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