Informe Laboratorio Cinética Enzimática

Pontificia Universidad Javeriana
Laboratorio Bioquímica Básica

Laboratorio virtual de cinética enzimática
Presentado por: Andrea Rodríguez, Laura Acosta y María Paula Jiménez Fecha: 16-04-20
1. Indague sobre la función de las enzimas β-glucosidasa, fosfatasa y N-

acetilglucosaminidasa. Elabore una tabla comparativa entre las enzimas, que incluya
la siguiente información: Clase de enzima, función biológica, sustratos y productos.
Enzimas β-glucosidasa Fosfatasa N-acetilglucosaminidasa
Clase de enzima Hidrolasas Hidrolasas Glucosidasa

(EC 3.2.1.21) (EC 3.1.3)
Función biológica Actúa en los enlaces Actúan como Beta-N-

β1->4 que tienen catalizadores en la acetilglucosaminidasa que
como función, unir hidrólisis de ésteres cataliza la hidrólisis de
dos moléculas de fosfóricos liberando residuos 2-acetamido 2-
glucosa o de fosfato inorgánico y desoxi-beta-glucosa
moléculas con en la hidrólisis de terminales no reductores
sustituciones de ácido fosfórico en la quitibiosa y análogos
glucosa. orgánico. Estas mayores así como en las
Ayuda a catalizar la enzimas . glucoproteinas.
hidrólisis de residuos La fosfatasa, de
terminales en beta-D-
acuerdo a su ph se Se ha utilizado
glucósidos,
divide en dos, la ampliamente en estudios
produciendo glucosa.
ácida y la alcalina. estructurales de las
Tienen diversas
La fosfatasa ácida y paredes celulares
aplicaciones; en la
alcalina son enzimas bacterianas y en el estudio
biosíntesis de
que hidrolizan de enfermedades como la
oligosacáridos,
ésteres fosfóricos MUCOLIPIDOSIS y
producción de etanol
alifáticos, diversos trastornos
utilizando residuos
aromáticos o inflamatorios del músculo y
agrícolas y en la
heterocíclicos, a el tejido conjuntivo.
industria de vinos.
diferentes ph, según
su conformación. Son importantes en la
Intervienen en degradación de quitina y
procesos de la pueden
reproducción celular hacer que tanto el carbono
desde el inicio de la como el nitrógeno estén
anafase hasta el disponibles para la
comienzo de la fase adquisición microbia
G1.
Sustratos Es una exocelulasa Ésteres fosfóricos,

con especificidad alifáticos,
para varios sustratos aromáticos o
de β-D-glucósidos. heterocíclicos.
(Normalmente p-
Nitrofenil-fosfato).
Productos Produce glucosa. Fosfato inorgánico Carbono y nitrógeno

(por ejemplo: p-
Nitrofenol).
Monoester fosfórico.
2. Describa clara y brevemente qué es la actividad enzimática y cuál es su

importancia.
La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de
actividad de la misma. En la cual la cantidad de sustrato es transformado en producto, por la
acción catalítica de la enzima por unidad de tiempo,y se da desde que sea termodinámicamente
posible. Su actividad juega un papel crucial en prácticamente todos los procesos biológicos
acelerando reacciones metabólicas en varios órdenes de magnitud y permitiendo que ocurran en
escalas de tiempo biológicamente aceptables. Por lo que midiendo su actividad se pueden hacer
detección de enfermedades.
En ciclos de nutrientes también hay actividad enzimática por medio de enzimas extracelulares
producidas por algunos microorganismos. Medir su actividad permite dar una idea de las tasas de
los procesos a nivel del ecosistema.
3. Indague acerca de las técnicas de fluorometría y colorimetría, las cuales se utilizan

frecuentemente para medir la actividad enzimática. Explique en qué consiste cada una
de ellas.
La fluorometría es un método por el cual se detecta y analiza la fluorescencia de los

compuestos evaluados. Estos compuestos pueden ser células, proteínas o nucleótidos, u
objetos marcados con algún tipo de fluorescencia. Está técnica tiene una muy alta sensibilidad
a comparación de las técnicas colorimétricas normales. Las medidas de fluorescencia se
expresan en unidades de intensidad relativa, se emplea lo que se llama “rendimiento de
fluorescencia relativo”. La señal electrónica variará para la misma concentración de una
sustancia de un instrumento a otro y, por lo tanto, no se podrán comparar. La fluorometría se
realiza en el Fluorómetro, el cual es un instrumento que emplea filtros de vidrio o filtros
interferenciales para seleccionar la longitud de onda de emisión.
La colorimetría es la ciencia que estudia la medida de los colores y que desarrolla métodos
para la cuantificación del color, es decir, la obtención de valores numéricos del color. Las
técnicas colorimétricas se basan en la medida de la absorción de radiación en la zona visible
por sustancias coloreadas. La absorción de luz depende de la intensidad del rayo, ya que en
algunas ocasiones la muestra que deseamos determinar no posee color por sí misma; en tal
caso, es preciso llevar a cabo un desarrollo de color empleando reactivos que den lugar a
sustancias coloreadas con las muestras que interesa estudiar. A mayor sea la intensidad de
la luz incidente, mayor será la intensidad de luz transmitida, si el compuesto así lo permite.
Los constituyentes de una solución son aquellos que absorben la luz emitida, para poder
realizar las mediciones colorimétricas es necesario tomar como punto de comparación la
curva espectral codificada, la cual permite asignar valores numéricos a la respuesta de
estímulos de colores. Para hacer esta técnica se usa el colorímetro, que es un medidor de
color, o un espectrofotómetro.
4. Explique la ventaja de utilizar microplacas para realizar los ensayos descritos en el

video.
En este tipo de estudios cuando se usan las micropipetas es más fácil analizar un gran
número de muestras que se tienen en un corto marco de tiempo, ya que son pruebas
pequeñas que no demandan mucho espacio (estas micropipetas cuentan con 96 bloques de
microplacas con pozos profundos). Un estudio, con un nivel tan alto de procedimientos
demandan mucho tiempo y diferentes instrumentos, por esto las micropipetas ayudan a tener
un mejor rendimiento, además de no solo facilitar las comparaciones entre sitios o
ecosistemas separados espacialmente, sino que pueden ayudar a los investigadores a
disminuir los costos de las investigaciones, ya que estos ensayos no demandan volúmenes
de reactivos grandes, si no que se utilizan solamente los necesarios por cada muestra.
5. En la descripción metodológica de los ensayos realizados en el video se mencionan

las réplicas. Describa clara y brevemente qué es una réplica técnica y una biológica y
explique la importancia de cada una de ellas.
Las réplicas son múltiples corridas experimentales con la misma configuración de factores
(niveles). Las réplicas están sujetas a las mismas fuentes de variabilidad, de forma
independiente unas de otras.
Réplica técnica: Aseguran la precisión de la técnica y permiten comprobar diferencias entre

los grupos de tratamiento. Determinando que tan reproducible es la técnica.
Réplica biológica: muestras diferentes en donde se observa la respuesta de la muestra,

donde permite observar si el método es estadísticamente significativo.
6. Los reportes de la actividad enzimática se dieron en peso seco. Explique la

importancia de este aspecto.
Los reportes de esta investigación se dieron en peso seco ya que esta se hizo para la
determinación de la actividad de una variedad de enzimas microbianas extracelulares que se
encontraban en suelos y sedimentos, para poder encontrar información que ayudará a saber
las tasas de nutrientes, la mineralización y el procesamiento de dicha materia orgánica. Ahora
bien, los investigadores resaltan que los suelos pueden variar sus niveles de humedad, por
lo que es importante para ellos estandarizar la actividad del suelo en peso seco con el cual,
tendrían una información más exacta de la actividad enzimática, sin tener en cuenta el tipo
de humedad y el grado de esta que cada suelo y sedimento tenía.
A pesar de que este paso sea un poco extenuante y requiera un poco más de tiempo, ya que
se necesita un secado y los datos de las muestras se demoran más que las investigaciones
hechas en agua, los datos obtenidos son más específicos y precisos para la investigación.
Hay que tener en cuenta que en algunos casos se necesita expresar la actividad por gramo
de materia orgánica o masa seca sin cenizas, lo que requiere que los investigadores hagan
un paso más de incineración, aparte del secado. Lo complicado de hacer este tipo de
procedimientos con peso seco, es quitar el sobrenadante del bloque de pozo profundo
después de la centrifugación, ya que, como se va a realizar el análisis de la absorbancia,
cualquier presencia de unas pocas partículas de tierra sueltas en la microplaca final puede
dañar los resultados de la investigación.
7. Analice la figura 3 presentada en los resultados. Explique las diferencias

encontradas en los resultados con los tres tipos de enzimas analizadas.
Con respecto a las moles de sustrato consumidas, se puede reconocer como la actividad
enzimática extracelular en los diferentes ambientes aquí estudiados, son de grandes niveles
apreciable al tener crecimiento en la superficie de biofilms. Las diferencias en los resultados
según la enzima, muestra cada uno de los patrones que tienen cada una según la actividad
que cambia con respecto al tamaño de las partículas; en este caso de cada una de las
enzimas que se analizan, donde se debe recordar
como ya antes se habían determinado frente a las
comunidades de microorganismos liberadas, según su
estructura molecular que se separan inicialmente en
grupos distintos de partículas:
- 0,063 mm
- 0,125, 0,25 y 0,5 mm de partículas
- 1 mm partículas
Por lo que:
Al utilizar la técnica del sustrato NP-ligado p, en el patrón de la fosfatasa tiene similitud en

sus partículas de 0,125, 0,25 y 0,5 mm, y en 0,063 y 1mm, al haber incubado y presentado la
lectura de estas concentraciones; Es así como se pueden determinan los moles consumidos
con este sustrato, obteniendo la actividad en el suelo luego de un producto de cuantificación
por colorimetría, al consumir el sustrato artificial que se hidroliza con las diferentes enzimas
indicado su crecimiento y actividad en las superficies de cada una de las partículas, siendo
mayor su absorción de luz que se expresa en micromoles de p NP en cada reacción, en la
fosfatasa con una actividad más alta en 1nm. A diferencia de las otras dos enzimas leídas (β-
glucosidasa y N-acetilglucosaminidasa), se puede ver picos similares en la unión con el
sustrato, pero como vemos en las partículas con concentración 1nm no se desarrollan en
elevación, pero si se ve como entre estas dos enzimas su comportamiento enzimático difieren
en los moles consumidos con respecto al tamaño de sus moléculas, tomando al final su
actividad potencial al ver cada uno de los picos más altos de actividad con respecto a sus
distribuciones en el ambiente.
8. Analice la figura 4 presentada en los resultados. Explique las diferencias

encontradas en los resultados con los tres tipos de enzimas analizadas.
Desde la medición fluorimétrica se determina la actividad por

medio del sustrato MUB que al tomar tres profundidades
diferentes, se puede ver como se asemeja la liberación 4-
metilumbeliferona con respecto a su unión con las enzimas
después de incubar a una temperatura para medir cual es la
actividad máxima de la enzima potencial en la muestra. Se
entiende que el agua tiende a tener menor actividad enzimática
extracelular por ml de suelos, por lo que aquí podemos ver en la
gráfica como este sustrato actúa en las tres enzimas, representado
por la actividad en las diferentes profundidades: 0, 50 y 100cm.
Como vemos la mayor actividad está en la producción de la
fosfatasa, al ser pobres en el nutriente y así adquieren el fosfato
en compuestos orgánicos y en general al encontrarse en
cualquiera de las tres profundidades. Pero vemos cómo en 0 y 50
cm de profundidad, su actividad es similar y menor en las enzimas
β-glucosidasa y N-acetilglucosaminidasa se informa además en
nmoles de sustrato consumidos h -1 ml de agua -1
9. Explique la importancia en el contexto biológico de los

resultados reportados en las figura 3 y 4.
Las dos figuras representan en función de las comunidades microbianas con funcionalidades
fisiológicas microbianos, estos procesos tienen una influencia directa sobre las
transformaciones a nivel de ecosistemas de carbono y nutrientes, una con respecto a
muestras ambientales determinando que tan instantáneo es la tasa de descomposición in
situ, y la otra según muestras de aguas. Estas actividades enzimáticas extracelular, son el
indicador en las dos figuras en donde se destaca el comportamiento de la fosfatasa, pues
desde los inicios de esta actividad se proporciona la tasa de limitación en nutrientes y como
es el procesamiento de la materia orgánica durante el desarrollo del suelo.
10. Elabore un diagrama o esquema general que describa el protocolo metodológico
utilizado en los ensayos presentados en el video. Este debe incluir solamente la
información relevante que permita entender el proceso realizado.
Referencias:
- https://es.slideshare.net/Marlenpmtz/colorimetria-61067922
- Jackson, C. R., Tyler, H. L., Millar, J. J. Determination of Microbial
Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High
Throughput Microplate Assays. J. Vis. Exp. (80), e50399, doi:10.3791/50399
(2013).

Informe Laboratorio Cinética Enzimática

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Informe Laboratorio Cinética Enzimática

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Informe Laboratorio Cinética Enzimática

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Pontificia Universidad Javeriana

Laboratorio Bioquímica Básica

1. Indague sobre la función de las enzimas β-glucosidasa, fosfatasa y N-

Enzimas β-glucosidasa Fosfatasa N-acetilglucosaminidasa

Clase de enzima Hidrolasas Hidrolasas Glucosidasa

Función biológica Actúa en los enlaces Actúan como Beta-N-

Sustratos Es una exocelulasa Ésteres fosfóricos,

Productos Produce glucosa. Fosfato inorgánico Carbono y nitrógeno

2. Describa clara y brevemente qué es la actividad enzimática y cuál es su

3. Indague acerca de las técnicas de fluorometría y colorimetría, las cuales se utilizan

La fluorometría es un método por el cual se detecta y analiza la fluorescencia de los

4. Explique la ventaja de utilizar microplacas para realizar los ensayos descritos en el

5. En la descripción metodológica de los ensayos realizados en el video se mencionan

Réplica técnica: Aseguran la precisión de la técnica y permiten comprobar diferencias entre

Réplica biológica: muestras diferentes en donde se observa la respuesta de la muestra,

6. Los reportes de la actividad enzimática se dieron en peso seco. Explique la

7. Analice la figura 3 presentada en los resultados. Explique las diferencias

- 0,125, 0,25 y 0,5 mm de partículas

Al utilizar la técnica del sustrato NP-ligado p, en el patrón de la fosfatasa tiene similitud en

8. Analice la figura 4 presentada en los resultados. Explique las diferencias

Desde la medición fluorimétrica se determina la actividad por

9. Explique la importancia en el contexto biológico de los

También podría gustarte