UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE VETERINARIA
Sección Departamental de Tecnología de los Alimentos

TESIS DOCTORAL

Aplicación de técnicas de resonancia magnética nuclear al

estudio de miosistemas

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Andrés García Álvarez

Directores

Mª Isabel Cambero Rodríguez

Mª Encarnación Fernández Valle
David Castejón Ferrer

Madrid
Ed. electrónica 2019

© Andrés García Álvarez, 2018

 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE VETERINARIA

SECCIÓN DEPARTAMENTAL DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE RESONANCIA MAGNÉTICA

NUCLEAR AL ESTUDIO DE MIOSISTEMAS

MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Ana Belén García García

BAJO LA DIRECCIÓN DE LOS DOCTORES

Mª Isabel Cambero Rodríguez
Mª Encarnación Fernández Valle
David Castejón Ferrer

Madrid, 2018
Mª ISABEL CAMBERO RODRÍGUEZ, Profesora Titular de la Sección Departamental de
Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Veterinaria de la Universidad
Complutense de Madrid, Mª ENCARNACIÓN FERNANDEZ VALLE y DAVID CASTEJÓN
FERRER, ambos Técnicos de Grado Superior de la Unidad de Resonancia Magnética
(CAI de Bioimagen Complutense) de la Universidad Complutense de Madrid

CERTIFICAN:
Que la Tesis Doctoral titulada “Aplicación de técnicas de Resonancia Magnética
Nuclear al estudio de miosistemas”, ha sido realizada bajo su dirección por Ana Belén
García García en la Sección Departamental de Tecnología de los Alimentos de la
Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid. Asimismo,
autorizan su presentación para que sea juzgada por la comisión correspondiente para
optar al grado de Doctor.

Madrid, 09 de julio de 2018

Los directores de la Tesis Doctoral

Fdo.: Mª Isabel Cambero Rodríguez Fdo.: Mª Encarnación Fernández Valle

Fdo.: David Castejón Ferrer

El trabajo experimental realizado durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral ha
sido financiado mediante el proyecto de investigación AGL2010-19158: "Ensayos de
tensión y adhesión en productos de origen animal. Aplicación a la mejora del envasado
de productos loncheados" del Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. La
doctoranda disfrutó de una beca predoctoral F.P.I. (Referencia: BES-2011-047485)
otorgada por el mismo organismo. El trabajo realizado se enmarca dentro de las líneas
de investigación desarrolladas por el Grupo UCM-BSCH Nº 920276 Ref. GR3/14.
 AGRADECIMIENTOS

A lo largo de estos años, muchas son las personas que han contribuido a la
realización de esta Tesis Doctoral.

En primer lugar, me gustaría agradecer a mis directores Mª Isabel Cambero, Mª

Encarnación Fernández y David Castejón su apoyo y dedicación durante este periodo.
Gracias Isabel por haber confiado en mí y haberme dado la oportunidad de comenzar
esta Tesis, por tu esfuerzo constante y tu amor al trabajo. Marién y David, gracias por
iniciarme en la RMN, por vuestro apoyo, orientación y buenos consejos.

En segundo lugar, mi agradecimiento a los técnicos que han contribuido a la

realización de la parte experimental, especialmente a Palmira Villa, técnica del CAI de
RMN de la UCM y a los trabajadores del Centro Nacional de Microscopía.

También me gustaría agradecer a mi supervisora en Dinamarca, Hanne Christine

Bertram, el haberme dado la oportunidad de colaborar con su grupo, su buena acogida
y su presencia en la distancia.

Gracias a mis compañeros de laboratorio, Rosa, Lola y Carlos por los buenos
momentos y a mi amiga Karen que vivió conmigo esta experiencia desde el primer día
y con la que he compartido mucho más que trabajo.

Quiero agradecer al personal laboral, en especial a Santiago y Andrés, su cercanía,

amabilidad y disposición para ayudar.

Gracias a mis padres, Carmen y Rafa, por el apoyo y cariño que manifestáis día a día,
por haber dedicado todo vuestro esfuerzo a la educación de vuestros hijos, por haber
confiado en mí y haberme dado siempre libertad para elegir mi camino.

A Rubén, gracias por tu optimismo, por tu labor de coach, por recordarme que sí se
puede y por estar siempre a mi lado.

Gracias a Leo, por llenar mi vida de buenos momentos.

 A mis padres
A Rubén, a Leo
 Índice

Resumen / Abstract ...................................................................................................................... 1

I. Introducción ............................................................................................................................. 15
I.1. Resonancia magnética nuclear (RMN) .................................................................................. 19
I.1.1. Contexto histórico .......................................................................................................... 19
I.1.2. Fundamento de la técnica .............................................................................................. 21
I.1.3. Metodologías de RMN en análisis de alimentos ............................................................ 26
I.1.3.1. Imagen de Resonancia Magnética (IRM) ................................................................ 27
I.1.3.2. Relaxometría ........................................................................................................... 30
I.1.3.3. Espectroscopía de RMN .......................................................................................... 32
I.1.3.3.1. Análisis de muestras mediante 1H RMN........................................................... 36
I.1.3.3.2. Análisis metabolómico ..................................................................................... 40
I.1.3.3.3. Procesado y análisis de los datos espectrales .................................................. 43
I.2. El sector cárnico español ....................................................................................................... 48
I.2.1. Situación actual de la industria cárnica española .......................................................... 48
I.2.2. Importancia económica de la carne de cerdo y sus derivados cárnicos ........................ 50
I.3. El cerdo .................................................................................................................................. 53
I.3.1. Consideraciones generales............................................................................................. 53
I.3.2. Estructura y composición de la carne de cerdo ............................................................. 54
I.3.3. Estructura del tejido muscular ....................................................................................... 55
I.3.4. Composición del músculo porcino ................................................................................. 57
I.3.4.1. Agua......................................................................................................................... 57
I.3.4.1.1. Exudado acuoso cárnico ................................................................................... 61
I.3.4.2. Proteínas ................................................................................................................. 62
I.3.4.3. Lípidos ..................................................................................................................... 63
I.3.4.4. Carbohidratos .......................................................................................................... 64
I.3.5. Aspectos nutricionales de la carne de cerdo ................................................................. 65
I.4. Derivados cárnicos ................................................................................................................ 69
I.4.1. Generalidades ................................................................................................................ 69
I.4.2. Definición de derivados cárnicos ................................................................................... 71
I.4.3. Jamón curado ................................................................................................................. 72
I.4.3.1. Definición ................................................................................................................ 72
I.4.3.2. Tipos de jamones curados en España ..................................................................... 72
I.4.3.3. Proceso de elaboración ........................................................................................... 73
I.4.3.3.1. Selección del pernil .......................................................................................... 74
I.4.3.3.2. Preparación y acondicionamiento de la materia prima ................................... 74
I.4.3.3.3. Salado .............................................................................................................. 74
Índice

I.4.3.3.4. Reposo o post-salado ....................................................................................... 75

I.4.3.3.5. Secado-maduración ......................................................................................... 75
I.4.4. Embutidos cárnicos ........................................................................................................ 76
I.4.4.1. Definición ................................................................................................................ 76
I.4.4.2. Tipos de chorizos y salchichones............................................................................. 76
I.4.4.3. Proceso de elaboración ........................................................................................... 77
I.4.4.3.1. Picado de la carne y la grasa ............................................................................ 78
I.4.4.3.2. Mezclado con el resto de ingredientes y aditivos ............................................ 78
I.4.4.3.2.1. Sal común .................................................................................................. 78
I.4.4.3.2.1.1. Efecto de la sal en la CRA ................................................................... 79
I.4.2.4.3.2.1.2. Difusión ........................................................................................... 80
I.4.4.3.2.2. Nitratos y nitritos ...................................................................................... 80
I.4.4.3.2.3. Azúcares .................................................................................................... 81
I.3.4.3.2.4. Ascorbato .................................................................................................. 82
I.3.4.3.2.5. Especias ..................................................................................................... 82
I.3.4.3.2.6. Cultivos iniciadores ................................................................................... 82
I.4.4.3.3. Embutido .......................................................................................................... 83
I.4.4.3.4. Fermentación ................................................................................................... 84
I.4.4.3.5. Curado .............................................................................................................. 85
I.4.5. Evolución de los productos cárnicos curados durante la etapa de secado-maduración86
I.4.5.1. Parámetros fisicoquímicos ...................................................................................... 86
I.4.5.1.1. Humedad y actividad de agua .......................................................................... 86
I.4.5.1.2. Desarrollo del color .......................................................................................... 87
I.4.5.2. Fracción proteica ..................................................................................................... 89
I.4.5.2.1. Evolución de las fracciones nitrogenadas ........................................................ 89
I.4.5.2.2. Proteólisis ......................................................................................................... 90
I.4.5.3. Fracción lipídica ....................................................................................................... 93
I.4.5.3.1. Lipólisis ............................................................................................................. 93
I.4.5.3.2. Oxidación lipídica ............................................................................................. 94
II. Objetivos ................................................................................................................................. 99
III. Material y métodos .............................................................................................................. 105
III.1. Materiales de laboratorio ................................................................................................. 109
III.1.1. Reactivos y disolventes .............................................................................................. 109
III.1.2. Material instrumental ................................................................................................ 109
III.2. Material cárnico ................................................................................................................ 111
III.2.1. Perniles y jamones en distintas etapas de curado ..................................................... 111
 Índice

III.2.2. Modelos cárnicos y embutidos crudos curados ......................................................... 112

III.2.3. Exudados cárnicos ...................................................................................................... 116
III.3. Metodología ...................................................................................................................... 118
III.4. Determinación de parámetros fisicoquímicos .................................................................. 119
III.4.1. Determinación de la actividad de agua ..................................................................... 119
III.4.2. Determinación del pH ............................................................................................... 119
III.4.3. Determinación del contenido acuoso ....................................................................... 119
III.4.4. Determinación del contenido en cenizas .................................................................. 120
III.4.5. Determinación del contenido en grasa ..................................................................... 120
III.4.6. Determinación del contenido en proteína ................................................................ 121
III.5. Determinación de las propiedades de textura .................................................................. 122
III.5.1. Análisis del perfil de textura....................................................................................... 122
III.5.2. Ensayo de tracción uniaxial destructivo ..................................................................... 124
III.6. Microscopía electrónica de barrido (MEB) ....................................................................... 126
III.7. Ensayo con fluorescamina ................................................................................................. 128
III.8. Electroforesis SDS-page..................................................................................................... 129
III.9. Resonancia Magnética Nuclear (RMN) ............................................................................. 130
III.9.1. Imagen de Resonancia Magnética (IRM) y relaxometría T2 de alto campo ............... 130
III.9.2. Relaxometría de bajo campo (Low-field Nuclear Magnetic Resonance, LF-NMR) .... 132
III.9.3. Espectroscopía de RMN de alta resolución................................................................ 133
IV. Resultados ............................................................................................................................ 135
IV.1. Estudio de la estructura (macro y micro) de distintos productos cárnicos curado ...... 137
IV.1.1. Trabajo 1. Empleo de la IRM como herramienta predictiva para estimar parámetros
fisicoquímicos y reológicos durante el proceso de elaboración de jamón curado .............. 139
IV.1.2. Trabajo 2. Estudio comparado de la microestructura de jamón curado mediante
relaxometría T2 de RMN, microscopía electrónica de barrido (MEB) y ensayos de tracción
uniaxial .................................................................................................................................. 167
IV.1.3. Trabajo 3. Estudio del proceso de proteólisis durante la maduración de modelos
cárnicos elaborados a base de carne picada ......................................................................... 185
IV.1.4. Trabajo 4. Distribución y movilidad de agua durante el proceso de elaboración de
embutidos crudos curados y su relación con características fisicoquímicas y reológicas .... 197
IV.2. Análisis de la composición de derivados cárnicos y exudados cárnicos mediante
espectroscopía de 1H RMN de alta resolución ...................................................................... 213
IV.2.5. Trabajo 5. Monitorización del proceso de elaboración de jamón curado mediante
espectroscopía de RMN de alta resolución........................................................................... 215
IV.2.6. Trabajo 6. Identificación de los principales metabolitos presentes en embutidos
crudos curados y evolución de los mismos durante el proceso de maduración .................. 233
Índice

IV.2.7. Trabajo 7. Valoración de los exudados de cerdo como matriz apta para la
monitorización dela conservación de la carne tratada con electrones acelerados .............. 247
V. Discusión integradora ........................................................................................................... 269
V.1. Análisis de la estructura de derivados cárnicos ................................................................. 273
V.1.1. Aplicación de la IRM al estudio de la macroestructura de jamón curado .................. 273
V.1.2. Aplicación de la relaxometría T2 de RMN al estudio microestructural de distintas
matrices cárnicas ................................................................................................................... 276
V.1.2.1. Modificaciones derivadas del curado de piezas cárnicas enteras versus matrices
cárnicas picadas ................................................................................................................ 279
V.1.2.2. Efecto de la adición de proteasas ........................................................................ 283
V.1.3. RMN y características fisicoquímicas de derivados cárnicos ...................................... 285
V.1.4. RMN y comportamiento reológico de derivados cárnicos ......................................... 287
V.2. Análisis metabolómico de derivados cárnicos y exudados ................................................ 292
V.2.1. Derivados cárnicos ...................................................................................................... 292
V.2.2. Exudados cárnicos ....................................................................................................... 297
VI. Conclusiones / Conclusion ................................................................................................... 305
VII. Bibliografía .......................................................................................................................... 311
VIII. Índice de abreviaturas........................................................................................................ 323
Resumen / Abstract

1
 Resumen

INTRODUCCIÓN
Las técnicas basadas en el principio de la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) son
herramientas de análisis no destructivo que aportan valiosa información sobre las
matrices cárnicas, tanto a nivel estructural como a nivel bioquímico. Por un lado, se ha
estudiado el potencial la Imagen de Resonancia Magnética (IRM) para estudiar la
macroestructura de piezas musculares. Por otro lado, se ha evaluado la aptitud de la
relaxometría de RMN para el estudio y caracterización de la microestructura de
miosistemas cárnicos y, finalmente, se ha comprobado el potencial de la espectroscopía
de alta resolución de RMN para el estudio del perfil metabólico de muestras de músculo
íntegras y muestras de exudado. Estas metodologías permiten el análisis de matrices
complejas de forma rápida, sin apenas preparación de la muestra y su carácter no
invasivo y no destructivo aumenta su ámbito de aplicación.

PLANTEAMIENTO
Se ha empleado la RMN para el estudio de distintos miosistemas cárnicos. Por un
lado, se ha analizado un derivado cárnico elaborado a partir de una pieza entera, el
jamón curado. Por otro lado, se elaboraron distintos productos a partir de carne picada:
modelos cárnicos y embutidos crudos curados, tipo chorizo y tipo salchichón. Se planteó
un estudio longitudinal para monitorizar el proceso de maduración de estos productos,
realizando un seguimiento de los cambios estructurales (mediante IRM y relaxometría
de RMN) y bioquímicos (mediante espectroscopía de RMN) experimentados por la
matriz cárnica durante del tiempo de curado. Además, se empleó la espectroscopía de
RMN para el análisis de matrices líquidas procedentes de miosistemas cárnicos
(exudados) y evaluar su potencial como matriz para monitorizar el proceso de
conservación de la carne de cerdo.

OBJETIVOS
Se han abordado dos objetivos generales:
▪ Evaluar el potencial de las técnicas no destructivas de RMN (IRM y
relaxometría de RMN) para monitorizar el proceso de maduración de distintos
derivados cárnicos (jamón curado, modelos cárnicos y embutidos crudos
curados) a través de los cambios macro y microestructurales experimentados
por los citados miosistemas durante su elaboración.

3
 Resumen

▪ Valorar la aptitud de la espectroscopía de alta resolución de RMN para

monitorizar distintos procesos de la industria alimentaria en base a muestras
musculares íntegras, incluyendo maduración y/o curado y conservación, y
muestras de naturaleza líquida (exudados).

RESULTADOS
Se han desarrollado varias etapas en las que se han afrontado distintos objetivos
parciales, como seguidamente se indica. Los resultados obtenidos han dado lugar a siete
artículos incluidos en esta memoria.

Trabajo 1. Empleo de la IRM como herramienta predictiva para la estimación de

parámetros fisicoquímicos y reológicos durante el proceso de elaboración de jamón
curado.

En este trabajo se describe el uso de la IRM como herramienta predictiva para el

cálculo de características fisicoquímicas y parámetros de textura. Esta técnica permitió
la monitorización del proceso de elaboración del producto, revelando las principales
modificaciones macroestructurales que tienen lugar en la matriz miofibrilar proteica
durante la maduración. Para ello, se analizaron perniles con distinto grado de curado
(fresco, salado, post-salado, secado y bodega) y músculos con distinta localización
anatómica (bíceps femoral, semimembranoso y semitendinoso). Se obtuvieron los
parámetros T1, T2 y CDA para cada etapa y músculo y se observó una progresiva
disminución de los mismos con el tiempo de curado, asociada a las cinéticas de
deshidratación y difusión de sal. Asimismo, se establecieron modelos matemáticos para
el cálculo del contenido en agua y sal y características reológicas a partir de los
parámetros adquiridos mediante IRM.

Trabajo 2. Estudio de la microestructura de jamón curado mediante relaxometría de

RMN.

Con el fin de profundizar en las modificaciones estructurales que conlleva el proceso

de curado de jamón se realizó un estudio mediante relaxometría T2 de RMN. Esta
metodología permitió desgranar los valores medios de los tiempos de relajación T2
mediante la obtención de distribuciones continuas del tiempo de relajación. Así, se
obtuvo información relevante a nivel microestructural. Se identificaron tres

4
 Resumen

componentes T2 en las muestras cárnicas, en función del grado de asociación de los

protones de la muestra con la matriz proteica: T2b, T21, T22. T2b es el componente
minoritario de relajación más rápida y se relaciona con los protones fuertemente
asociados a macromoléculas; T21 es el componente mayoritario en las muestras cárnicas
y representa a los protones del agua retenidos por el entramado miofibrilar proteico;
finalmente, el componente T22 es la población de protones más móviles, de relajación
más lenta. Además, se identificó un cuarto componente (T2´) a partir de la etapa de
secado asociado a los protones de la fase grasa. La obtención de imágenes microscopía
electrónica de barrido (MEB) resultó de gran ayuda para interpretar las modificaciones
estructurales. Su análisis permitió observar la reducción del tamaño intrínseco de poro
de la matriz proteica, debido a los fenómenos de solubilización proteica, absorción de
sal y deshidratación, típicos del curado, así como la visualización de la evolución de la
infiltración grasa en el músculo. Además, se comprobó que el componente T21 está
fuertemente relacionado con la fuerza de rotura calculada mediante la realización de
ensayos de tracción uniaxial destructivos.

Trabajo 3. Estudio del proceso de proteólisis durante la maduración de modelos

cárnicos elaborados a base de carne picada.

En este trabajo se estudió el proceso de proteólisis que tiene lugar durante la

maduración de modelos cárnicos elaborados a partir de carne de cerdo y que es
especialmente relevante para conseguir las características del producto final. Para ello,
se elaboraron dos lotes de modelos cárnicos, con (SMS) y sin proteasas (SMS+P), con el
fin de estudiar mediante relaxometría T2 las diferencias en la microestructura de los dos
tipos de productos generados. Se realizaron, además, análisis electroforéticos para
comparar el perfil de degradación de las fracciones proteicas en ambos lotes. El
comportamiento de degradación fue bastante diferente (mucho más intenso en el lote
con proteasas), así como las distribuciones de los tiempos de relajación T 2 obtenidas
para cada lote. En ambos casos, se identificaron distintas poblaciones de protones (T 2b,
T21, T22) que experimentaron cambios durante la maduración, reduciéndose los tiempos
de relajación a medida que avanzó el proceso. Estructuralmente, los modelos con
proteasas se caracterizaron por matrices más fluidas y mucho menos organizadas, lo
cual se puso de manifiesto a través de las poblaciones T2b y T22.

5
 Resumen

Trabajo 4. Distribución y movilidad de agua durante el proceso de elaboración de

embutidos crudos curados y su relación con características fisicoquímicas y reológicas.

En este trabajo se empleó la relaxometría T2 para estudiar la microestructura de

embutidos crudos curados, recreando las condiciones típicas de un proceso de
elaboración tradicional durante un total de 14 días. Se elaboraron embutidos tipo
chorizo y tipo salchichón con distintos niveles de grasa y se analizaron a distintos
tiempos de maduración. Se obtuvieron distintas poblaciones de protones: T2b, T21, T22.
El avance de la maduración estuvo marcado por la fermentación microbiana de la masa
cárnica, que indujo cambios en la matriz proteica debido al descenso de pH y que se han
relacionado con la aparición de la población T22, y la deshidratación, que marcó la
reducción de los tiempos de relajación durante todo el proceso. El análisis del perfil de
textura (TPA) se realizó también en los tiempos de análisis para evaluar la evolución
estructural de la matriz cárnica mediante un método tradicional. El análisis de clusters
reveló una clara discriminación entre muestras según su tiempo de maduración y el
coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para establecer el grado de dependencia
lineal entre T2-parámetros fisicoquímicos y T2-características de textura. La población
mayoritaria T21 mostró un grado de dependencia más fuerte, especialmente con el
contenido en agua (r=0,93) y la dureza (r=0,87), mientras que las otras poblaciones, T2b
y T22, mostraron un grado de asociación mucho más débil con los parámetros
fisicoquímicos y de textura.

Trabajo 5. Monitorización del proceso de elaboración de jamón curado mediante

espectroscopía de RMN de alta resolución.

En este trabajo se empleó la metodología 1H RMN HRMAS (high resolution magic

angle spinning) para monitorizar los cambios en el perfil metabólico de la carne de cerdo
blanco sometida a un proceso tradicional de curado. El análisis de componentes
principales (PCA) permitió establecer la discriminación entre muestras y agrupar los
espectros obtenidos en función de su etapa de maduración. Fue posible identificar gran
cantidad de metabolitos diferentes. El avance de la maduración en jamón curado se
tradujo en un incremento en las señales de ácidos grasos, favorecida por la
concentración de macromoléculas debido a la deshidratación, y a la actividad enzimática
(lipolisis). Se observó también la degradación de nucleótidos y la reducción de las

6
 Resumen

señales de carbohidratos, debido al consumo de azúcares. Así mismo, se produjo un

aumento en las señales correspondientes a aminoácidos, debido a los fenómenos
proteolíticos implicados en el desarrollo del flavor, especialmente notable en la región
de los aminoácidos aromáticos, fenilalanina, tirosina y triptófano.

Trabajo 6. Identificación de los principales metabolitos presentes en embutidos crudos

curados y evolución de los mismos durante el proceso de maduración.

Con el fin de monitorizar los cambios bioquímicos acontecidos durante la

maduración, y de esta forma, contar con una visión global de los cambios madurativos,
en este trabajo se llevó a cabo el estudio del perfil metabólico de embutidos tipo
salchichón mediante la espectroscopía 1H RMN HRMAS. Se identificaron un gran número
de metabolitos, tanto propios de la carne como de adición, y fue posible estudiar su
variación cuantitativa durante las etapas de fermentación y maduración. El análisis
metabolómico de las muestras analizadas permitió diferenciar los procesos de
fermentación y maduración e hizo posible la clasificación de las muestras en función del
tiempo de maduración a través del Análisis de Componentes Principales (PCA).

Trabajo 7. Valoración de los exudados de cerdo como matriz apta para la

monitorización de la conservación de la carne tratada con electrones acelerados.

En este trabajo se presenta por primera vez el perfil metabólico de los exudados de
cerdo obtenido mediante la metodología 1H RMN HRMAS. Se propone emplear los
exudados de cerdo como matriz de análisis para identificar los procesos y las
trasformaciones habituales que tienen lugar durante el almacenamiento de la carne
sometida a un tratamiento de conservación basado en la aplicación de electrones
acelerados. Se observó que tanto la dosis del tratamiento como el tiempo de
almacenamiento de las muestras tratadas tienen un efecto notable sobre los
metabolitos cárnicos que pueden ser percibidos a partir de los datos espectrales
obtenidos. Además, la aplicación de herramientas quimiométricas al conjunto de datos
espectroscópicos puso de manifiesto cuáles fueron los metabolitos que experimentaron
variaciones significativas durante el almacenamiento de la carne. La clasificación de las
muestras de carne de acuerdo a su tiempo de almacenamiento se realizó a través del

7
 Resumen

Análisis de Componentes Principales (PCA). Con este mismo procedimiento fue posible
la discriminación entre muestras tratadas y no tratadas con electrones acelerados.

CONCLUSIONES
Se concluye, de forma general, que las técnicas de RMN (IRM, relaxometría y
espectroscopía de alta resolución) presentan un gran potencial para monitorizar, desde
un punto de vista tanto estructural como bioquímico, los procesos de elaboración de
derivados cárnicos, como el jamón curado y los embutidos crudos curados, así como
procedimientos habituales en la industria alimentaria, como la conservación de
productos. Se confirma, por tanto, su aptitud para la trazabilidad y el control de calidad
de miosistemas cárnicos.

8
 Abstract

INTRODUCTION
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)-based techniques are non-destructive analytical
tools that provide valuable information about the meat matrices at both structural and
biochemical level. On the one hand, the potential of Magnetic Resonance Imaging (MRI)
to study the macrostructure of muscular pieces was studied. On the other hand, the
aptitude of T2 NMR relaxometry for the study and characterization of the microstructure
of meat myosistems was evaluated and, finally, the potential of the high-resolution NMR
spectroscopy for the study of the metabolic profile of intact samples of muscle and meat
exudates was verified. These techniques allow to analyze complex matrices quickly, with
minimum sample preparation and their non-invasive and non-destructive nature
increases their area of application.

EXPERIMENTAL DESIGN
NMR was used for the study of different meat myosistems. On the one hand, a meat
derivative elaborated from an entire piece, cured ham, was analyzed. On the other hand,
different products were elaborated from minced meat: meat models and raw cured
sausages, chorizo and salchichón type. A linear study to monitor the ripening process of
these products was outlined, in order to track the structural (by means of MRI and T2
NMR relaxometry) and biochemical changes (by means of NMR spectroscopy)
experienced by the meat matrices during processing. In addition, NMR spectroscopy was
used for the analysis of liquid samples coming from meat myosistems (exudates) and to
evaluate its potential as analytical matrix to monitor the conservation process of pork.

OBJECTIVES
Two general aims have been approached:
▪ To evaluate the potential of NMR non-destructive technologies (MRI and T2
NMR relaxometry) to monitor the ripening process of different meat
derivatives (cured ham, meat models and raw cured sausages) through the
macro and microstructural changes experienced by the mentioned
myosistems along their manufacturing process.
▪ To value high-resolution NMR spectroscopy aptitude for monitoring different
industrial processes using intact muscular samples, including ripening and
conservation, and samples of liquid nature (exudates).

9
 Abstract

RESULTS
Different partial aims have been confronted along several stages, as indicated below.
The obtained results have led to seven articles included in this memory.

Paper 1. Use of MRI as a predictive tool for physicochemical and rheological features
during ham manufacturing.

In this work, MRI is described as predictive tool for the estimation of physicochemical
characteristics and textural parameters. This technique allowed the monitoring of the
manufacturing process of the product, revealing the principal macrostructural
modifications that take place in the myofibrilar matrix during ripening. For that purpose,
hams at different ripening times (raw, salted, post-salted, half-cured and cured) and
muscles with different anatomical location (biceps femoris, semimembranosus and
semitendinosus) were analyzed. T1, T2 and ADC parameters were obtained for each stage
and muscle and a progressive decrease was observed during ripening, related to the
dehydration kinetics and salt diffusion. Additionally, mathematical models were
established for the calculation of the water and salt content and rheological features
from the MRI parameters.

Paper 2. Dry cured ham microstructure study by means of T2 NMR relaxometry.

In order to delve into the structural modifications that occur throughout the
manufacturing process of dry cured ham, a T2 NMR relaxometry study was realized. This
technique allowed to separate the average values of T2 in several populations by
obtaining the constant distributions of the relaxation times. Thus, relevant information
was obtained at microstructural level. Three different T2 components were identified in
the meat samples, depending on the degree of association of the protons of the sample
with the protein matrix: T2b, T21, T22. T2b is the minority component with the shortest
relaxation time and it is related to the protons strongly associated with macromolecules;
T21 is the main component in the meat samples and it represents the protons of the
water retained by the myofibrillar proteins; finally, the T22 component is the population
representing the most mobile protons, with long relaxation times. In addition, a fourth
component (T2') was identified during the half-cured stage and it has been related to the
protons of the fat phase. The obtaining of scanning electron microscopy (SEM) images

10
 Abstract

was very helpful to interpret the structural modifications. The SEM images analysis
allowed to observe the reduction of the intrinsic pore size of the meat matrix, due to
protein solubilization, absorption of salt and dehydration, typical transformations along
curing, as well as the visualization of the evolution of fat infiltration inside the muscle.
In addition, it was verified that T21 population is highly correlated to the breaking force
calculated by means of destructive uniaxial tensile test.

Paper 3. Proteolysis process in fermented sausage model systems as studied by NMR

relaxometry.

In this work, the proteolysis process that takes place during the ripening of meat
models elaborated from pork, particularly relevant to obtain the characteristics of the
final product, was studied. For that purpose, two batches of meat models were
elaborated, with (SMS) and without proteases (SMS+P), in order to study the differences
in the microstructure of both types of products by means of T2 NMR relaxometry. In
addition, electrophoretic analyses were conducted to compare the myofibrillar proteins
degradation pattern in both batches. The behavior of degradation was significantly
different (much more intense in the batch with proteases), as well as the distributions
of the T2 relaxation time obtained for each batch. In both cases, different water
populations (T2b, T21, T22) were identified. The mentioned populations experienced
changes during ripening, being reduced the relaxation times as the process progressed.
Structurally, models with proteases were characterized by a more fluid and much less
organized matrix, which was revealed by T2b and T22 populations.

Paper 4. Water mobility and distribution during dry‑fermented sausages “Spanish

type” manufacturing and its relationship with physicochemical and textural
properties: a low‑field NMR study.

T2 NMR relaxometry was used to study the microstructure of raw cured sausages,
recreating the typical conditions of a traditional process of production during a total of
14 days. Chorizo and salchichón type sausages with different levels of fat were analyzed
at several ripening times. Different water populations were obtained: T2b, T21, T22. The
progress of ripening was characterized by the microbial fermentation of the meat mass,
that generate changes in the myofibrillar matrix due to the decrease of pH and that have

11
 Abstract

been related to the appearance of the T22 population, and the dehydration, which
marked the reduction of the relaxation times throughout the entire process. The texture
profile analysis (TPA) was also conducted to evaluate the structural evolution of the
meat matrix by a traditional method. The analysis of clusters revealed a clear
discrimination between samples according to their ripening time and Pearson's
correlation coefficient was used for establishing the degree of linear dependence
between physicochemical features-T2 parameters and T2- textural characteristics. The
main population T21 showed a stronger dependence, especially with water content
(r=0,93) and hardness (r=0,87), whereas other populations, T2b and T22, showed a
weaker association with the physicochemical and textural parameters.

Paper 5. Use of 1H NMR HRMAS methodology for monitoring cured ham

manufacturing.

1H RMN HRMAS (high resolution magic angle spinning) methodology was used to
monitor the changes in the metabolic profile of pork submitted to a traditional
manufacturing process. Principal components analysis (PCA) allowed to establish the
discrimination between samples and to group the obtained spectra depending on the
ripening stage. It was possible to identify a great quantity of metabolites. During cured
ham ripening an increase in the fatty acids signals, favored by the concentration of
macromolecules due to the dehydration, and to the enzymatic activity (lipolysis) was
reported. The degradation of nucleotides and the reduction of the carbohydrates
signals, due to sugars consumption was also observed. Additionally, an increase in the
signals corresponding to amino acids was detected, due to the proteolytic phenomena
involved in the development of the flavor, mainly remarkable in the aromatic amino
acids region, phenylalanine, tyrosine and tryptophan.

Paper 6. 1H NMR-based metabolomics analysis for dry-fermented sausage

characterization.

In order to monitor the biochemical changes happened during ripening and, thus, to
possess a global vision of the madurative changes, in this work the study of the
metabolic profile of salchichón type sausages by 1H RMN HRMAS spectroscopy was
performed. A great number of metabolites were identified, both meat metabolites and

12
 Abstract

metabolites of addition, and it was possible to study their quantitative variation during
the stages of fermentation and ripening. Metabolomics allowed to separate the
processes of fermentation and ripening and the classification of the samples depending
on the ripening time by PCA.

Paper 7. Evaluation of E-beam irradiation and storage time in pork exudates using
NMR metabolomics

In this work, the metabolic profile of pork exudates was obtained by 1H RMN HRMAS
methodology for the first time. It proposes to use of exudates as a suitable matrix to
identify the processes and the habitual transformations that take place during the
storage of the meat treated with E-beam irradiation. It was observed that both the dose
of the treatment and the storage time of the treated samples have a notable effect on
the meat metabolites that can be perceived from the spectral information obtained. In
addition, the application of chemometric tools to the set of spectroscopic information
revealed which were the metabolites that experimented significant variations during the
meat storage. The classification of samples was performed according to the storage time
by PCA. The same procedure was used for the discrimination between samples treated
and not treated with E-beam irradiation.

CONCLUSIONS
NMR techniques (MRI, T2 relaxometry and high-resolution NMR spectroscopy) have
a great potential to monitor, from both a structural and biochemical point of view, the
manufacturing process of meat derivatives, cured ham and raw cured sausages, as well
as habitual procedures in the food processing industry, as the conservation of products.
NMR aptitude for the traceability and the quality control of meat myosistems is,
therefore, verified.

13
I. Introducción

15
 La introducción de esta memoria se ha estructurado en cuatro apartados, en los que
se pretende abordar los distintos aspectos implicados en el desarrollo del trabajo
doctoral realizado. En un primer apartado se describen las particularidades de las
técnicas de Resonancia Magnética Nuclear que se proponen como herramientas de
análisis alternativas para el estudio de matrices alimentarias. En un segundo apartado
se ubica la industria cárnica española, a la que va orientado el estudio realizado, y se
trata la repercusión económica y características de este sector. La tercera parte se centra
en la carne de porcino y sus características. Finalmente, en la cuarta parte se abordan
las particularidades del proceso de elaboración de los productos cárnicos analizados:
embutidos y jamón curado. En conjunto, se pretende establecer el marco de trabajo y el
perfil de los objetivos propuestos.

17
 I.Introducción

I.1. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

Dada la importancia, tanto nutricional como económica, de la carne y sus derivados
se hace necesaria la búsqueda y desarrollo de nuevas herramientas que faciliten su
estudio y análisis. El empleo de la resonancia magnética nuclear como técnica analítica
en alimentos es reciente y, sin embrago, muy fructífero, dadas sus ventajas sobre otras
técnicas similares y su elevado potencial para el análisis de matrices alimentarias sólidas,
líquidas y semisólidas. A continuación, se abordan una serie de generalidades sobre la
técnica, así como su fundamento y sus distintas variantes de aplicación en el análisis de
alimentos.

I.1.1. CONTEXTO HISTÓRICO

La RMN es una técnica espectroscópica que estudia la interacción entre la materia y

la radiación electromagnética basándose en las propiedades magnéticas intrínsecas de
los núcleos atómicos. Hoy en día, la RMN es una técnica analítica ampliamente
consolidada con un gran potencial de aplicación en distintas áreas de conocimiento,
entre las que se encuentran la química, la biología, la medicina, la ciencia de los
materiales o la geología, y a las que se ha sumado recientemente, la ciencia y tecnología
de los alimentos, aportando valiosa información sobre estructura y composición, lo que
le concede un gran potencial para el control de la calidad y seguridad alimentaria
(Emsley & Feeney, 2007).

En su historia se mezclan matemáticos, físicos, químicos, ingenieros y médicos (Figura

I.1) que conjuntamente lograron articular una técnica analítica de resultado
extraordinario que ha supuesto una revolución, tanto en la Imagen para el diagnóstico
como en la determinación estructural mediante técnicas espectroscópicas.

En 1946, el físico suizo Félix Block (Universidad de Stanford) y el ingeniero eléctrico

estadounidense Edward M. Purcell (Universidad de Harvard) desarrollaron, de manera
independiente, nuevos métodos que permitieron medir por primera vez la señal de
resonancia magnética nuclear (Bloch, 1946; Purcell et al., 1946). Ambos científicos
compartieron el Nobel de Física en 1952 por dicho hallazgo.

19
 I.Introducción

En 1973 se produjeron avances fundamentales en la aplicación de la RMN a la

medicina, cuando el químico estadounidense Paul Lauterbur (Universidad Estatal de
New York) codificó espacialmente la señal de RMN mediante la aplicación de gradientes
magnéticos (Lauterbur, 1973) y el físico inglés Peter Mansfield amplió el uso y el
desarrollo de los gradientes y demostró que la señal se puede analizar
matemáticamente, lo que ha hecho que la imagen de RM se haya convertido en una
técnica de imagen útil y de uso clínico (Mansfield & Grannell, 1973). Por estos avances
ambos investigadores fueron galardonados con el Premio Nobel de Medicina en el año
2003.

En 1966, el químico-físico suizo Richard Ernst (ETH de Zúrich) introdujo la codificación

en fase y frecuencia junto con la transformada de Fourier, que constituyen las bases de
la técnica actual. En 1975, Ernst y colaboradores desarrollaron el concepto de RMN
bidimensional e introdujeron sus primeras aplicaciones (Aue et al., 1976). Ernst fue
galardonado con el premio Nobel de Química en 1991 por su contribución al avance de
la espectroscopía de RMN.

Figura I.1. Principales personajes contribuyentes al desarrollo de la RMN.

20
 I.Introducción

A comienzos de la década de los 80, el químico suizo Kurt Wütrich (ETH de Zúrich)
estudió la aplicación de la RMN a la elucidación estructural de proteínas, desarrollando
procedimientos generales para la asignación sistemática de las frecuencias de
resonancia de los diferentes núcleos magnéticos de estas biomoléculas y demostró que
a partir de esta información se podía deducir la estructura tridimensional de
determinadas proteínas (Wüthrich, 1974). Por ello, recibió el Premio Nobel de Química
en el año 2002.

En las últimas décadas, la RMN ha ido ganando protagonismo como técnica para la
elucidación estructural de moléculas aisladas y para el estudio del metabolismo, tanto
in vivo como in vitro. En la primera década del siglo XXI, se propone el término
Metabonómica (Fiehn, 2001) para hacer referencia a la medición cuantitativa de la
respuesta metabólica de naturaleza dinámica y multiparamétrica de los sistemas vivos
ante estímulos patofisiológicos o bien, ante la modificación genética. Desde entonces,
se ha trabajado para conseguir el aumento de la sensibilidad de la técnica gracias a la
utilización de campos magnéticos cada vez más intensos, a la combinación con técnicas
de polarización y al desarrollo de nuevas sondas de radiofrecuencia.

El gran potencial de análisis de las técnicas de RMN y sus ventajas frente a otras
técnicas analíticas han favorecido, en las últimas décadas, su incorporación a la Ciencia
y Tecnología de Alimentos. La RMN es una técnica rápida, no invasiva y no destructiva,
que no requiere preparación de la muestra (IRM) o es mínima (RMN). Es apta para el
análisis de matrices sólidas, semisólidas y líquidas, permitiendo obtener tanto el perfil
metabólico del alimento, como información molecular de forma cuantitativa. Además,
presenta un gran potencial para el estudio estructural de matrices alimentarias. En los
últimos años, la aplicación de esta técnica de alto rendimiento está permitiendo alcanzar
nuevos y ambiciosos objetivos en el análisis de alimentos (Laghi et al., 2014).

I.1.2. FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA

La RMN se basa en un fenómeno físico por el cual los núcleos atómicos con un
número impar de protones (Z) y/o un número impar de neutrones (N) (espín nuclear,
I≠0, no nulo) pueden absorber selectivamente energía generalmente en el rango de la

21
 I.Introducción

radiofrecuencia (RF) al ser sometidos a la acción de un campo magnético (Figura I.2).

Entre los grupos que presentan el fenómeno de la resonancia magnética se encuentran
los principales núcleos presentes en los tejidos biológicos (1H,13C, 15N, 19F y 31P) que
tienen número de espín I=1/2. Una vez los núcleos han absorbido la energía y cesa el
aporte energético externo, estos mismos núcleos devuelven la energía absorbida para
regresar a su situación de equilibrio termodinámico. Esta liberación energética induce
una señal eléctrica en una antena receptora a partir de la cual se puede obtener una
imagen o un espectro.

En base a estos principios, es posible diferenciar varias técnicas de RMN en función

de la información que aportan sobre la matriz analizada. Por una parte, la imagen de
RMN, mediante el empleo de gradientes de campo magnético, permite codificar la señal
de resonancia y adquirir imágenes de los diferentes tejidos presentes, aportando
información sobre su estructura y composición (Herrero et al., 2009); la relaxometría
de RMN es una técnica que se centra en el estudio y medición de los tiempos de
relajación característicos de resonancia aportando información sobre sobre la
naturaleza físico-química de ciertos núcleos en términos de movilidad y
compartimentación (Bertram & Andersen, 2004); por último, la espectroscopía de RMN
permite identificar, cuantificar y monitorizar los metabolitos presentes a través de las
señales espectrales (Castejón et al., 2015).

Figura I.2. Secuencia de un proceso de RMN. A: orientación al azar de espines. B: aplicación de un campo magnético
B0 y orientación de espines. C: aplicación de un pulso de radiofrecuencia B1. D: absorción de energía. E: relajación
nuclear.

La secuencia de la Figura I.2 es común a todos los experimentos de RMN, de manera

que un experimento de RMN consiste en la aplicación de un pulso o n pulsos de
radiofrecuencia que conducen a la obtención de la señal final que será adecuadamente
procesada para su posterior análisis.

22
 I.Introducción

Cuando los núcleos absorben la energía de RF aparece un vector de magnetización

(M) orientado en la dirección del campo magnético cuyo valor depende de la densidad
de núcleos (Figura I.3). M tiene dos componentes: magnetización longitudinal (Mz) y
magnetización transversal (Mxy).

Figura I.3. Representación de la magnetización en el plano x, y, z.

Cuando cesa el pulso de radiofrecuencia, la magnetización vuelve a su orientación

inicial mediante el proceso de relajación nuclear que se verá muy influenciado por la
estructura y el entorno bioquímico en el que se encuentran los núcleos. La recuperación
de la magnetización tiene una componente longitudinal y otra transversal.

Relajación longitudinal: los protones liberan progresivamente su exceso energético.

Cuando el valor de la proyección sobre el eje longitudinal (Mz) sea idéntico al valor inicial
de M, la relajación habrá terminado (Figura I.4). El estudio de la relajación longitudinal,
Mz, informa sobre la rapidez con la que se alcanza de nuevo el estado inicial, aportando
información estructural de la muestra de estudio, así como de la composición de los
tejidos presentes. La relajación longitudinal tiene forma de un exponencial creciente
regulada por una constante de tiempo, denominada constante de relajación longitudinal
T1 (Figura I.4). Cuanto menor es el valor de T1, más rápido se alcanza el estado de
equilibrio, es decir, más rápida es la relajación. El tiempo de relajación T1 representa la
velocidad con la que los protones intercambian energía con el medio ambiente (relación
+H-medio). Se denomina también relajación espín-medio o spin-lattice (Berendsen,
1992).

23
 I.Introducción

Figura I.4. Representación de la relajación longitudinal T1.

Relajación transversal: las variaciones con el tiempo de la componente sobre el plano

transversal x,y de la magnetización durante la relajación o relajación transversal (Mxy)
aportan información relacionada con la estructura bioquímica del medio (Figura I.5). La
variación de la relajación transversal se representa por una exponencial decreciente
regulada por la constante de relajación T2.

Figura I.5. Representación de la relajación transversal T2.

Después del pulso de radiofrecuencia todos los espines están en fase. Al retirar la
energía, con el tiempo, esta coherencia se va perdiendo, desfasándose progresivamente
debido a las diferencias en los campos magnéticos que perciben los núcleos (Figura I.6).
La relajación T2 es el resultado de interacciones entre los espines (relación +H -+H). Se
denomina también relajación spin-spin (Berendsen, 1992).

Figura I.6. Evolución de la proyección de los espines sobre el plano transversal después de un pulso de
radiofrecuencia.

Para poder establecer correlaciones estructurales a partir de la señal transmitida por

los núcleos, es necesario transformar la señal original mediante la aplicación de una

24
 I.Introducción

operación matemática conocida como la Transformada de Fourier (TF), que finalmente

da lugar a una imagen o a un espectro de RMN. La señal es captada originariamente
como una curva sinusoidal amortiguada, denominada FID (Free Induction Decay). Se
trata de una señal dependiente del tiempo f(t), que recoge todas las resonancias
individuales generadas por los núcleos que poseen frecuencias diferentes. La FID se
adquiere durante un intervalo t2 (tiempo de adquisición) y seguidamente se somete a
un proceso de digitalización y almacenamiento. Esta situación se repite tantas veces
como sea necesario hasta alcanzar una FID acumulada con la intensidad o relación
señal/ruido (S/R) suficiente. La FID acumulada es dependiente del tiempo, f(t2). La
transformada de Fourier se utiliza para convertir la FID en una señal dependiente de las
frecuencias que permita extraer la información espectroscópica, f(v2). (Figura I.7).

Figura I.7. Registro de la FID, acumulación y transformada de Fourier.

Durante el proceso de obtención de imágenes de RM, mediante el uso de gradientes

de campo magnético, es decir, la variación del campo magnético principal a lo largo de
una dirección del espacio, se puede obtener información espacial. Cuando los gradientes
se aplican en las tres direcciones del espacio se obtendrá información tridimensional, lo

25
 I.Introducción

que nos permitirá obtener una imagen de resonancia (Figura I.8). En este caso no se
adquiere la FID directamente ya que ésta desaparece muy rápidamente. Mediante el
uso de gradientes y pulsos de RF es posible reenfocar la señal de resonancia. La señal así
reenfocada se denomina eco. El conjunto de ecos se denomina espacio K y es la
representación del contenido en frecuencias espaciales del objeto.

Adquisición n ecos TF 2D

ECO

Espacio-k Imagen

Figura I.8. Formación de las imágenes de RM: adquisición de n ecos, construcción del espacio-k, obtención de la
imagen mediante una transformada de Fourier en 2 dimensiones.

A modo de aclaración, cabe mencionar que la RMN es fundamentalmente de 1H, por

esta razón, a lo largo de esta memoria, se usan indistintamente las palabras espines,
núcleos y protones.

I.1.3. METODOLOGÍAS DE RMN EN ANÁLISIS DE ALIMENTOS

Los alimentos son sistemas complejos tanto a nivel estructural como a nivel
bioquímico. Desde el punto de vista estructural, se pueden establecer distintos niveles
de organización. El modelo más general divide la estructura del alimento en
microscópica (en el rango de 0,1-100 m) y macroscópica (>100 m) (Ramírez et al.,
2009). Desde el punto de vista bioquímico, los alimentos están constituidos por un gran
y variado número de metabolitos. Ambas, la organización estructural y la composición
metabólica repercuten directamente sobre las características del producto final
(apariencia, textura, jugosidad, etc.) percibidas por el consumidor. El creciente interés
por ampliar conocimientos sobre la formación, estabilidad y composición de las
estructuras conlleva el empleo de nuevas técnicas analíticas. En este contexto, la imagen
de resonancia magnética (IRM) y la relaxometría son metodologías que pueden ser
empleadas para obtener información estructural, macro y microscópica,

26
 I.Introducción

respectivamente, sobre las matrices alimentarias, mientras que, la espectroscopía de

RMN, permite la identificación y cuantificación de los diferentes metabolitos presentes.

I.1.3.1. Imagen de Resonancia Magnética (IRM)

Como ya hemos visto, la IRM es una técnica a través de la cual las señales de RMN
son codificadas espacialmente utilizando gradientes de campo magnético y
reconstruidas en un formato de imagen (Liang & Lauterbur, 2000). La imagen de RMN
consiste en una matriz bidimensional de valores de intensidad (píxeles), que son las
señales de pequeños volúmenes dentro de la muestra (vóxeles). Cada píxel representa
la información tridimensional contenida en un vóxel (Figura I.9).

Figura I.9. Imagen de resonancia magnética de la sección interna de jamón. La imagen bidimensional consiste en
una matriz de píxeles; el valor numérico de cada píxel viene dado por la señal del elemento de volumen o vóxel. La
parte muscular y grasa se diferencian claramente (Fantazzini et al., 2009).

En función de los diferentes parámetros seleccionados durante la adquisición

[tiempo de eco (TE) y tiempo de repetición (TR)], podremos potenciar la imagen de
resonancia en cada uno de los parámetros característicos [tiempos de relajación
longitudinal (T1) y transversal (T2) y la densidad protónica (DP)], que dependerán de las
propiedades inherentes de la muestra (Mitchel et al., 2001). Además, como resultado
de la agitación térmica, las moléculas presentan un movimiento de traslación al azar
conocido como movimiento Browniano o de difusión molecular. La IRM es sensible a la
difusión molecular, que a diferencia del T1 y T2, es independiente del valor de la
intensidad del campo magnético y permite la visualización y el cálculo de la difusión
molecular in vivo, directamente a partir de los movimientos moleculares de traslación
del agua libre. Por tanto, de cada vóxel se puede obtener información sobre los

27
 I.Introducción

parámetros ligados a la estructura y movilidad molecular (T1 y T2) y acerca de la

velocidad aparente de difusión del agua [coeficiente de difusión aparente (CDA)].

Dependiendo del parámetro que tenga más peso en el contraste de la imagen,

existen distintos tipos de imágenes de RMN. A estas adquisiciones diferenciadas se las
denomina potenciaciones y se consiguen mediante la aplicación de distintos pulsos de
radiofrecuencia, gradientes de campo magnético y la modificación de los parámetros de
adquisición para incrementar o ponderar un determinado efecto a fin de maximizar el
contraste entre tejidos específicos. Así, se habla de:

▪ Imágenes potencias en DP: cuando el contraste de la imagen resultante es

proporcional a la concentración de núcleos de 1H.

▪ Imágenes potenciadas en T1: son imágenes en las que la contribución del T2 y

la DP son despreciables y el valor del píxel dependerá prácticamente sólo del
T1 del vóxel. La intensidad de la imagen es inversamente proporcional al
tiempo de relajación longitudinal, de modo que, los protones con valores de
T1 más cortos darán lugar a hiperintensidades en la imagen de resonancia
mientras que los que tienen tiempos de relajación longitudinal más largos
aparecerán hipointensos.

▪ Imágenes potenciadas en T2: el contraste, en este tipo de imágenes, es

dependiente del tiempo de relajación transversal, T2. A diferencia de las
imágenes potenciadas en T1, la intensidad de señal en las imágenes
potenciadas en T2 es directamente proporcional al valor de T2 de los protones.
Los píxeles con mayor tiempo de relajación T2 aparecen más brillantes que los
píxeles con menor valor de T2.

▪ Imágenes potenciadas en difusión: el contraste de la imagen es inverso al

valor del coeficiente de difusión aparente.

En función de lo que se desea estudiar, se seleccionarán los parámetros adecuados

para obtener el contraste deseado. Las potenciaciones más comunes se resumen en:

▪ Para obtener imágenes potenciadas en DP se seleccionará un TE corto y un TR

largo.

28
 I.Introducción

▪ Para obtener imágenes potenciadas en T1 se seleccionarán valores de TE y TR

cortos.

▪ Para obtener imágenes potenciadas en T2 se seleccionarán valores de TE y TR

largos.

Para poder calcular los valores de los tiempos de relajación a partir de una serie de
imágenes, generalmente, se define un experimento en el que se fija uno de los
parámetros de adquisición, por ejemplo, TR o TE, y se hace variar otro, por ejemplo, TE
o TR. Así, se pueden obtener los mapas paramétricos. Los mapas son imágenes en los
que el valor de la intensidad del píxel es el valor del parámetro. Dependiendo del
parámetro que se haya calculado hablaremos de mapas del tiempo de relajación T1, T2,
mapas de DP, mapas de CDA, etc. El valor del parámetro se suele extraer como media
de todos los valores en una región de interés seleccionada [(region of interest (ROIs)]. A
diferencia de las imágenes, en los mapas, una intensidad mayor de la imagen
paramétrica siempre significa un valor mayor del parámetro (Tabla I.1).

Tabla I.1. Comparativa de imágenes vs mapas de IRM.

Imagen Mapa
T1  1/T1  T1
T2  T2  T2
CDA  1/CDA  CDA
DP   [1H]

La IRM permite obtener información estructural de la matriz de estudio de manera

no destructiva/no invasiva. Una de sus principales ventajas es que hace posible la
observación del interior del alimento, lo que no solo permite diferenciar entre tejidos,
sino que también posibilita la monitorización de procesos de degradación, maduración,
transformación o conservación sin alteración de la muestra (Damez y Clerjon, 2008). Por
ello, es una técnica con un gran potencial para la clasificación y la determinación de
calidad de los alimentos de forma directa en las propias líneas de producción.
Concretamente en carnes, se ha propuesto como método de clasificación de piezas en
función de su contenido en grasa (Mitchell et al., 2001; Caro et al., 2003), lo cual podría
derivar en su empleo como método de clasificación de canales en matadero. Como se

29
 I.Introducción

verá durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral, y como previamente ha propuesto en

otros estudios (Cernadas et al., 2005), a partir de la imagen, es posible, incluso, predecir
atributos de calidad que se obtienen tradicionalmente mediante técnicas destructivas,
como las características sensoriales.

I.1.3.2. Relaxometría

Mediante esta técnica es posible el estudio y medición de los tiempos de relajación

longitudinal, T1, y transversal, T2.

Una señal de RMN puede caracterizarse, principalmente, por tres propiedades

(Berendsen, 1992):

▪ Su frecuencia de resonancia.

▪ Su relajación longitudinal, T1.

▪ Su relajación transversal, T2.

De ellas, la frecuencia de resonancia es la que menos información proporciona. Sin

embargo, los tiempos de relajación T1 y T2 se han utilizado en un gran número de
estudios con matrices alimentarias a fin de extraer información estructural. Como ya se
ha comentado previamente, el tiempo de relajación T1 representa la facilidad con la que
los protones intercambian energía con el medio y la relajación T2 es el resultado de las
interacciones entre los espines (Berendsen, 1992).

En las distribuciones de los tiempos de relajación, principalmente se visualiza la

contribución de los protones de las moléculas móviles, que en el caso de los alimentos
proceden del agua y de la grasa. El T1 se ha relacionado más frecuentemente con la
determinación de grasa y el T2 con el estudio y caracterización de la distribución y la
movilidad de agua, siendo éste el tiempo de relajación más estudiado en alimentos
(Bertram & Andersen, 2006). De hecho, se ha propuesto que la relajación en alimentos
es multiexponencial, siendo posible diferenciar y caracterizar distintas poblaciones de
agua en función de su propio tiempo de relajación. Los T2 característicos reflejan la
movilidad del agua presente en cada población, de manera que, las moléculas de agua
muy móvil (libre) relajarán muy lentamente y tendrán T2 largos, mientras las moléculas

30
 I.Introducción

menos móviles, con mayor grado de inmovilización o ligazón, tendrán T2 cortos. A modo
de ejemplo, en la Figura I.10 se muestran las curvas de relaxometría que representan
los cambios en las componentes T2a (relajación rápida) y T2b (relajación lenta) en
muestras de queso manchego analizadas a distintos tiempos de maduración (Cruz et al.,
2014).

Figura I.10. Curvas de relaxometría registradas en un equipo de 200 MHz, a partir de muestras obtenidas a
diferentes tiempos de maduración durante el proceso de elaboración de queso manchego (Cruz et al., 2014).

Para obtener los tiempos de relajación T2 se pueden utilizar distintas secuencias de

pulsos de radiofrecuenia, aunque la más empleada es la secuencia Carl-Purcell-
Meiboom-Gill (CPMG) (Carr & Purcell, 1954; Meiboom & Gill, 1958). En la secuencia
CPMG se aplica un pulso inicial de 90o seguido de una serie de pulsos de 180o. Para cada
pulso de 180o se obtiene un eco y la relajación se puede representar como la amplitud
del eco en función del tiempo (Figura I.11).

Figura I.11. Representación de la secuencia CPMG. TE: tiempo de eco. : tiempo transcurrido entre el pulso de 90o y
el de 180o ( = TE/2).

Existe una relación de dependencia entre los tiempos de relajación y el campo

magnético empleado en el estudio, de manera que la intensidad del campo influye sobre
el perfil de las distribuciones obtenidas. Es posible obtener las constantes de relajación,

31
 I.Introducción

T1 y T2, características de un tejido trabajando a bajo campo, entre 0,5 y 1,5 Teslas, [RMN
de bajo campo o low-field NMR (LF-NMR)], o trabajando a campo alto [RMN de alto
campo o high-field NMR (HF-NMR)], con equipos de intensidad de campo magnético
superior a 1,5 Teslas.

La relaxometría es un método rápido, no destructivo y altamente sensible a la

movilidad a nivel molecular, con el que se puede obtener información macro y
micromolecular de una matriz alimentaria a través del estudio de la movilidad y
distribución del agua (Pearce, 2011). Además, a través de las distribuciones de los
tiempos de relajación, es posible investigar cómo procesos de transformación y
conservación, así como la presencia de ciertos componentes o la adición de aditivos,
afectan a la disponibilidad del agua en los alimentos. Es una técnica única para estudiar
la calidad y transformación de la carne, ya que proporciona información directa sobre
las propiedades físicas (distribución, compartimentación) y químicas (movilidad,
interacción entre macromoléculas) del agua (Bertram & Andersen, 2004).

I.1.3.3. Espectroscopía de RMN

A diferencia de la imagen de RMN y la relaxometría, que se centran más en

propiedades estructurales de la muestra, la espectroscopia de RMN se emplea
mayoritariamente para identificar los metabolitos presentes en las muestras. La
espectroscopía de RMN permite diferenciar núcleos en distintos entornos químicos, en
función de su frecuencia de resonancia.

Previamente, se ha descrito el concepto de resonancia de un núcleo aislado dentro

de un campo magnético, pero en realidad los núcleos no se encuentran aislados. La
frecuencia de resonancia exacta de un tipo de núcleo determinado depende en una
forma característica de su entorno. El resultado de este hecho es que el campo
magnético que generalmente llega al núcleo es más débil que el campo externo, por
tanto, se dice que el núcleo está protegido o apantallado. Este apantallamiento es muy
importante desde el punto de vista experimental ya que el campo magnético efectivo
que siente un protón dentro de una molécula es generalmente menor que el campo
externo, y por lo tanto, para que el núcleo entre en resonancia a campo Bo constante, la

32
 I.Introducción

frecuencia disminuirá al aumentar el apantallamiento. El pulso de RF aportará una

banda de frecuencias para que todos los núcleos entren en resonancia.

El resultado es un espectro de diversas frecuencias donde cada conjunto de núcleos

específicos da origen a una señal única de RMN. Así pues, un espectro de RMN es una
representación de la intensidad de señal en función de la frecuencia de la energía
electromagnética que liberan los diversos núcleos de una muestra. Para la
determinación de la posición de la señal en el espectro, se define el desplazamiento
químico (δ) que es una magnitud adimensional, característica del núcleo considerado y
su entorno y es independiente de la frecuencia de medida y de la intensidad de campo
magnético (Figura I.12).

Figura I.12. Rangos de desplazamiento químico (ppm) para diferentes tipos de 1H, según su entorno químico.

En consecuencia, en un espectro 1D es posible observar distintas señales de

resonancia correspondientes a los núcleos presentes en la muestra analizada. El estudio
detallado del espectro aporta valiosa información sobre la naturaleza química de las
moléculas en estudio. Los desplazamientos químicos muestran la posición de los núcleos
en el espectro y proporcionan información sobre el entorno químico de la muestra, loa
que permite identificar los diferentes metabolitos presentes. Adicionalmente, el área
que comprende cada señal (integral) es proporcional a la abundancia relativa de los
núcleos que la producen y, por tanto, aporta información acerca de la concentración.

La información que contiene un espectro de RMN es bastante completa, lo que

permite con frecuencia la elucidación de manera directa de la estructura de

33
 I.Introducción

determinadas moléculas sencillas y/o de tamaño intermedio, como se observa en la

Figura I.13 para el espectro 1H RMN de la molécula de quinina.

Figura I.13. Espectro 1H RMN de la quinina, alcaloide natural que se utiliza con frecuencia como muestra patrón en
RMN.

La información contenida en un espectro 1D es bastante completa y suele permitir la

elucidación directa de la estructura de las moléculas, que generalmente ya se encuentra
tabulada. Pero en muestras complejas, dada la concentración de señales y su
solapamiento, no es tan fácil extraer la información espectral (Figura I.14). En este
contexto, la espectroscopía 2D surge para solucionar la falta de resolución espectral en
los experimentos 1D complejos proporcionando información complementaria que
permitirá llevar a cabo la elucidación estructural.

Figura I.14. Espectro 1H 1D de carne picada de cerdo en el que se representa la localización de los principales grupos
funcionales.

En la RMN 2D, los datos adquiridos dependen de dos variables de tiempo diferentes.
La primera continúa siendo el tiempo t2, que es el tiempo de detección habitual en los
experimentos de RMN 1D. La segunda es una nueva variable temporal, t1, tiempo de
evolución. Los experimentos 2D se basan, por tanto, en la adquisición de experimentos

34
 I.Introducción

1D sucesivos en los que t1 es incrementado de manera secuencial en cada uno de ellos.

La FID obtenida dependerá de dos variables temporales f(t1, t2) que, tras la aplicación de
la transformada de Fourier dará lugar a un espectro bidimensional en función de dos
variables en el dominio de las frecuencias f(v1, v2) (Figura I.15).

Figura I.15. Espectro bidimensional 1H-1H-COSY de exudado de carne de ternera tratada con 8kGy.

En función de la información que se quiera obtener se podrá seleccionar el

experimento 2D necesario. Los experimentos 2D se clasifican en homo y
heteronucleares. Los experimentos 2D homonucleares más empleados son:

▪ 1H,1H-COSY (COrrelated SpectroscopY): Proporcionan valiosa información

sobre los acoplamientos escalares 1H-1H (geminales y vecinales). Establece,
principalmente, las relaciones de vecindad entre los núcleos de hidrógeno de
la molécula (situados a 3 enlaces).

▪ 1H,1H-TOCSY (Total COrrelated SpectroscopY). Reflejan los acoplamientos

entre núcleos de 1H, pertenecientes al mismo sistema de espines, que se
encuentran a una distancia entre 2 y 5 enlaces entre ellos. Se consigue así
disponer de una información bastante completa sobre la vecindad de núcleos
de 1H. Cada una de las correlaciones obtenidas en el espectro 2D

35
 I.Introducción

correlacionan a los núcleos de 1H, que se encuentran acoplados entre sí a

través de los enlaces (correlación escalar).

▪ 1H,1H-NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY). Permite la obtención

de información espacial entre los núcleos de 1H. Las señales de cruce o
correlaciones que aparecen en este experimento bidimensional reflejan la
existencia de interacciones a través del espacio (acoplamientos dipolares)
entre los núcleos de 1H.

Además del 1H, en las muestras es posible obtener información sobre otros núcleos
de interés (heteronúcleos) como el 13C, 15N o 31P que, en combinación con el 1H pueden
aportar nueva información estructural y contribuir a la elucidación estructural de la
muestra. Los experimentos 2D de correlación heteronuclear más habituales son:

▪ 1H,X-HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) o 1H,X-HMQC

(Heteronuclear Multiple Quantum Correlation), que muestran las

correlaciones escalares entre los núcleos de hidrógeno y los heteronúcleos a
los que se encuentran directamente unidos.

▪ 1H,X-HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation), que proporcionan las

correlaciones entre los núcleos de hidrógeno y los heteronúcleos X con los
que se acoplan escalarmente a dos o tres enlaces de distancia.

I.1.3.3.1. Análisis de muestras mediante 1H RMN

Como se ha comentado previamente, por las características del análisis, la
espectroscopía de RMN se ha utilizado ampliamente para el estudio de alimentos
(Ramakrishnan & Luthria, 2017), siendo posible el análisis de distintos tipos de muestras
(Figura I.16):

36
 I.Introducción

MUESTRAS MUESTRAS MUESTRAS

LÍQUIDAS SÓLIDAS SEMISÓLIDAS

Preparación de la muestra

Análisis directo de Extracción de muestras Análisis directo de

líquidos sólidas, semisólidas y muestra intacta
líquidas

RMN DE ALTA RESOLUCIÓN RMN DE ALTA RESOLUCIÓN

ESTADO LÍQUIDO ESTADO SEMISÓLIDO
Sonda HRMAS

Asignación espectral

Datos cuantitativos

Análisis estadístico

Figura I.16. Representación esquemática del análisis de muestras mediante RMN.

▪ Análisis de muestras en disolución: esta es la modalidad de la RMN más

convencional. Se puede aplicar a cualquier tipo de muestra e incluye el
estudio de:

o Muestras líquidas: se incluyen aquí muestras alimentarias líquidas que

se analizan, bien sin ningún pretratamiento (como los zumos de frutas
o los aceites vegetales) o bien con pretratamientos simples, como
liofilización y posterior disolución del liofilizado (vino) o disolución
previa de muestras viscosas (miel).

o Muestras sólidas: en este grupo se incluyen muestras de naturaleza

tisular, cuyo análisis como muestra en disolución, requerirá un paso
previo de extracción de compuestos. El análisis de estas muestras
sólidas generalmente lleva asociado un paso previo de
homogeneización anterior a la extracción.

▪ Muestras sólidas: en estado sólido, la movilidad de los átomos y moléculas se

encuentra muy restringido, por lo que, a diferencia de los espectros que se
registran para moléculas en disolución, los espectros que se obtienen con
muestras sólidas presentan señales ensanchadas que son el resultado de la

37
 I.Introducción

suma de las señales procedentes de todas las posibles orientaciones

espaciales de los espines. A pesar de todo, los espectros de RMN en fase sólida
proporcionan una información única acerca de la estructura y la dinámica de
los materiales objeto de estudio. Las principales interacciones responsables
del ensanchamiento de las señales son la anisotropía del desplazamiento
químico, los acoplamientos dipolares y el acoplamiento cuadrupolar. Se han
desarrollado técnicas que reducen etas interacciones y que permiten obtener
espectros de alta resolución conservando, en lo posible, la información que
aportan estas interacciones: giro con ángulo mágico (que se desarrolará más
adelante), polarización cruzada o secuencias multipulsos específicas para
sólidos.

▪ Muestras semisólidas: en este grupo se incluyen matrices de naturaleza

compleja, ni sólida, ni líquida, normalmente con una organización firme, pero
con cierta capacidad para fluir. La técnica que permite el estudio de muestras
semisólidas por RMN es conocida como HRMAS por sus siglas en inglés, High
Resolution Magic Angle Spinning. El empleo de una sonda con giro con ángulo
mágico (inclinación de 54,7o con respecto al campo externo Bo) (Figura I.17),
combinado con la tecnología de alta resolución de RMN empleada en el
análisis de muestras líquidas, permite obtener espectros de alta resolución de
matrices heterogéneas que no se pueden clasificar como sólidas ni como
líquidas, son sistemas semisólidos. Una de las innovaciones de la técnica viene
dada por la posición del ángulo mágico junto con la alta velocidad de giro de
la muestra (4-6 kHz), lo que permite reducir los efectos de la anchura de línea
típicos de muestras sólidas causados por la heterogeneidad de la muestra y
las interacciones anisotrópicas. La metodología de HRMAS permite analizar
directamente, sin manipulación, una muestra de tejido/alimento intacto. Se
consigue así la identificación simultánea de metabolitos polares y apolares
presentes en la muestra y, por tanto, la caracterización completa de todo su
contenido metabólico, evitando largos tiempos de manipulación y la posible
alteración de la muestra.

38
 I.Introducción

Figura I.17. Esquema de un rotor de HRMAS girando con ángulo mágico.

En la preparación de muestras de RMN hay algunos aspectos que son importantes

para obtener resultados reproducibles y sin variaciones indeseables entre las muestras
analizadas que puedan dificultar la asignación de las señales de RMN y la comparación
entre diferentes espectros. A continuación, se detallan los principales aspectos a
considerar:

▪ La variación de pH entre las muestras acuosas puede causar una significativa

diferencia en los desplazamientos químicos de las señales pertenecientes a
los ácidos orgánicos, aminoácidos y a otros metabolitos con grupos
funcionales ácidos o básicos. Las variaciones en el desplazamiento químico
introducen cambios adicionales que pueden distorsionar los resultados. Para
evitar este problema se pueden aplicar dos estrategias: por un lado, el control
del pH mediante el empleo de disoluciones tampón y, por otro lado, la
realización de un procesado específico de los datos, mediante la aplicación del
bucketing, una opción muy empleada en el análisis multivariante, en la que
los espectros se dividen en regiones espectrales cuidadosamente
seleccionadas.

▪ Disolvente deuterado: la técnica de RMN en estado líquido requiere el

empleo de un disolvente deuterado para corregir la variación en la frecuencia
que se produce debido a la fluctuación del campo magnético. Además, sobre
la señal del disolvente deuterado, se ajusta la homogeneidad del cmapo
magnético y se obtienen así espectros con una alta resolución. Las muestras
líquidas de alimentos pueden analizarse por RMN con la simple adición de una
pequeña fracción de disolvente deuterado para ajustar la señal de RMN. En el
caso de muestras viscosas o sólidas, éstas se disuelven directamente en el

39
 I.Introducción

disolvente deuterado. Los más comunes empleados en el análisis de

alimentos por RMN son D2O, metanol-d4, dimetilsulfóxido-d6 (DMSO-d6),
acetona, acetonitrilo-d3 y cloroformo-d.

▪ Concentración y temperatura: el efecto de la concentración sobre los

desplazamientos químicos es otro aspecto que tiene que ser considerado en
el análisis de los espectros de RMN y, en algunos casos, puede hacer que sea
difícil la utilización de los valores de desplazamiento químico publicados,
pertenecientes a los compuestos estándar de referencia para la identificación
de metabolitos. De igual forma, es importante que todos los experimentos se
lleven a cabo a la misma temperatura para evitar posibles variaciones del
desplazamiento químico.

▪ Estándares internos y agentes quelantes: en muchos casos, hay que recurrir

a la adición de un patrón interno al disolvente deuterado utilizado. Este
producto se utiliza, fundamentalmente, como referencia de desplazamiento
químico, pero su presencia también se puede aprovechar para obtener una
cuantificación absoluta de los metabolitos presentes. En disoluciones acuosas
se suele utilizar como estándar interno el 3-(trimetilsilil)propionato-2,2´-3,3´-
sódico-d4 (TSP) o el ácido 3,3-dimetil-2,2-silapentano-5-sulfónico (DSS),
mientras que en muestras orgánicas el más utilizado es el tetrametilsilano
(TMS). Las señales de RMN de algunos ácidos orgánicos (como el cítrico o el
málico) procedentes de extractos derivados de plantas y productos
alimentarios son generalmente anchas debido a que estos compuestos son
capaces de formar complejos con cationes paramagnéticos (Fe3+ y Mn2+). Este
ensanchamiento se puede evitar mediante la adición a la muestra de ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) para capturar los iones paramagnéticos.

I.1.3.3.2. Análisis metabolómico

La metabolómica es una ciencia de reciente desarrollo que se define como el estudio
sistemático de las huellas químicas únicas que dejan los diferentes procesos biológicos
(Fiehn, 2001). Tiene como objetivo detectar, cuantificar y elucidar la estructura de los
metabolitos, los cuales se caracterizan por una gran diversidad físico-química en sus

40
 I.Introducción

estructuras moleculares. La metabolómica se incluye dentro de las técnicas ómicas, un

conjunto de recientes metodologías analíticas de alto rendimiento empleadas en
diferentes disciplinas que permiten detectar a gran escala en cualquier sistema biológico
los genes, proteínas y metabolitos (Figura I.18) con el fin de obtener una visión lo más
completa posible del sistema en estudio.

Figura I.18. Principales técnicas ómicas.

El estudio de los alimentos y su bioactividad mediante técnicas masivas de análisis

(genómica, proteómica y metabolómica) se ha definido recientemente como foodómica
o alimentómica (García-Cañas et al., 2012). Esta disciplina pretende profundizar en
cómo los alimentos repercuten en la prevención o la evolución de las enfermedades. La
metabolómica permite abordar de forma global estudios acerca de los aspectos
esenciales de los alimentos como su seguridad, calidad y trazabilidad a partir de la
detección de nuevos contaminantes, la determinación de modificaciones en alimentos
transgénicos y la definición de nuevos biomarcadores de la calidad de los alimentos
(Cifuentes, 2013).

La gran diversidad de metabolitos se refleja en una amplia gama de polaridades,

pesos moleculares, grupos funcionales, estabilidad y reactividad química, entre otras
propiedades. Esto requiere el uso de plataformas analíticas que maximicen la cobertura
del metaboloma analizado. Las dos técnicas más empleadas para identificar y cuantificar
metabolitos son: la RMN y la espectroscopía de masas (MS), esta última casi siempre
acoplada a técnicas cromatográficas como la cromatografía líquida (LC-MS), la
cromatografía de gases (GC-MS) o, en menor medida, la electroforesis capilar (CE-MS).
La RMN presenta ciertas ventajas sobre la MS:

▪ No necesita la separación de los analitos, por lo que no requiere

fraccionamiento/alteración de la muestra.

41
 I.Introducción

▪ Es una técnica no destructiva y no invasiva, por lo que es posible recuperar la

muestra tras el análisis.

▪ Es universal, detecta todos los metabolitos a la vez, no es selectiva.

▪ Es una técnica altamente reproducible. Además, generalmente, la

preparación de la muestra es sencilla.

Por otro lado, es menos sensible que la MS, cuyo límite de detección es
sensiblemente menor.

Las principales etapas de un análisis metabolómico se recogen en la Figura I.19.

Figura I.19. Principales etapas en un estudio metabolómico.

En función del conocimiento previo disponible acerca del problema

biológico/bioquímico y de la información que se quiera obtener del estudio, se
seleccionará el tipo de análisis metabolómico más apropiado. En aquellos casos en los
que se conozca el número y tipo de metabolitos de interés, se puede realizar una
aproximación dirigida (Targeted). Por el contrario, en los casos en los que no se tenga
información previa de los metabolitos que puedan estar implicados en el proceso
estudiado, se llevarán a cabo aproximaciones no-dirigidas (Untargeted) (Fiehn, 2002;
Laghi et al., 2014). El primero de ellos es un análisis diana restringido al estudio de un
número limitado de metabolitos seleccionados en función de conocimientos previos a
la realización del estudio metabolómico y constituye una de las aproximaciones
analíticas más empleadas en metabolómica. Por tanto, en este tipo de análisis se puede
particularizar el tratamiento de una muestra y utilizar la técnica de medida más

42
 I.Introducción

conveniente para identificar y cuantificar los compuestos seleccionados en el estudio

(Mannina et al., 2009). En el análisis no dirigido, se pretende determinar
simultáneamente tantos metabolitos como sea posible para obtener una visión global
del problema de interés. Dado que para la aproximación no dirigida no se posee
información de antemano del problema que se plantea, en este caso es particularmente
importante desarrollar un estudio experimental muy detallado para poder detectar el
máximo número posible de metabolitos sin introducir ningún sesgo debido a las
condiciones experimentales o de medida de las muestras (Tautenhahn et al., 2012).

I.1.3.3.3. Procesado y análisis de los datos espectrales

La señal obtenida mediante RMN (FID) no es directamente utilizable por las
herramientas bioinformáticas necesarias para realizar el análisis de datos, por tanto, es
necesario realizar una serie de operaciones básicas, denominadas habitualmente pre-
procesado de datos. Las etapas habituales que comprende el pre-procesado se
muestran en la Figura I.20.

Figura I.20. Etapas del pre-procesado de datos de RMN y principales métodos quimiométricos de análisis.

43
 I.Introducción

El procesado de los datos espectrales suele requerir además de una metodología

estadística característica. En un análisis metabolómico habitualmente se maneja un
volumen muy grande de muestras y variables y, normalmente, se requiere un proceso
de reducción de su dimensionalidad. Se utiliza para ello la quimiometría, conjunto de
herramientas matemáticas y estadísticas que permiten extraer la información relevante
de los datos producidos en experimentos químicos (Lavine & Workman, 2004). Los
métodos de análisis se pueden clasificar como univariantes, que utilizan información de
cada variable o metabolito, o multivariantes, que emplean de forma conjunta la
información de las múltiples variables presentes (Figura I.20). Los métodos de análisis
multivariante pueden ser además no supervisados, que permiten evaluar la variabilidad
de los datos sin tener en cuenta su clasificación dentro de ningún grupo, o supervisados,
que utilizan la información sobre la clasificación de las muestras para maximizar la
separación entre grupos.

Análisis univariante: una vez que se conoce la distribución y la homogeneidad de las

variables en los grupos de muestras, se puede seleccionar el método de análisis de la
varianza más adecuado. El análisis de la varianza es una prueba estadística univariante
que tiene como objetivo principal la detección de metabolitos significativamente
diferentes entre los grupos considerando, en general, un valor de p<0,05 como
estadísticamente significativo. El análisis univariante puede servir para la
selección/reducción de variables antes del análisis multivariante o, también, una vez
identificadas las señales más relevantes que permiten la discriminación entre los grupos
estudiados mediante el análisis multivariante.

Análisis multivariantes no supervisados de exploración: como se mencionó

previamente, los métodos no supervisados no tienen en cuenta la información de la
pertenencia de las muestras a los grupos de clasificación. Estos métodos son de gran
utilidad para la identificación de patrones y/o tendencias dentro de las muestras
estudiadas. En muchos casos, los resultados obtenidos en esta etapa son suficientes
para distinguir las variaciones entre los grupos en función de sus diferencias
metabólicas. Además, permiten la identificación de muestras atípicas que se desvían
significativamente del perfil global que muestran los grupos analizados. La eliminación

44
 I.Introducción

de dichas muestras es el punto de partida de todo análisis estadístico y, por tanto, es un

paso fundamental y previo a la aplicación de un análisis supervisado.

Una de las metodologías más utilizada en el análisis metabolómico es el análisis

multivariante mediante PCA (Principal Component Analysis) ya que permite representar
los datos espectrales en un espacio de baja dimensionalidad. Como resultado de este
análisis, los datos extraídos de una matriz (X) con k dimensiones, donde k corresponde
al número de variables, son reducidos a un espacio definido por unos pocos
componentes principales (PCs), capaces de explicar la mayor variabilidad entre las
muestras. El primer componente principal (PC1) consistirá en una combinación lineal de
todas las variables espaciales ponderadas para explicar el máximo de la varianza total
del espacio original; el segundo componente principal (PC2) será ortogonal al primero y
explicará el máximo de la varianza residual, y así con el resto hasta que la varianza total
quede explicada. Como los PCs son ortogonales entre sí, la representación gráfica de los
datos en el espacio bidimensional definido por dos PCs (p. ej., PC1 versus PC2),
proporciona una proyección que se conoce como gráfico de puntuaciones de las
muestras o score plot, donde cada uno de los puntos representa el espectro de una
muestra. En el gráfico de puntuaciones, se pueden apreciar las principales agrupaciones
y tendencias entre las muestras analizadas. De manera análoga, el gráfico de
puntuaciones de las variables o loading plot, define las relaciones entre las k variables
que integran la matriz de datos original (X), lo que permite identificar, de forma gráfica,
cuáles son las variables (buckets) responsables de las tendencias o agrupaciones
observadas.

La Figura I.21 muestra los gráficos de score plot y loading plot de un análisis de PCA
de los espectros de 1H RMN de muestras de exudado de merluza almacenada en hielo
entre 1 y 12 días. El análisis por PCA permite agrupar las muestras en función del tiempo
de almacenamiento e indicar los buckets más significativos en dicha agrupación
(Castejón et al., 2015).

45
 I.Introducción

Figura I.21. Diagramas de scores y de loadings de un análisis de PCA (Castejón et al., 2015).

Análisis multivariantes supervisados: el objetivo de estas técnicas es obtener

funciones de clasificación a partir de la información proporcionada por las variables
analizadas en las muestras pertenecientes a los diferentes grupos que forman el llamado
conjunto de entrenamiento o training data set. Este conjunto de muestras se puede
utilizar para confirmar que existe diferencia entre los grupos de clasificación y también
para redecir la clasificación de muestras ciegas o test data set. En espectroscopía, donde
el número de variables suele ser más grande que el número de muestras es común
recurrir al empleo de la regresión lineal.

La regresión de mínimos cuadrados o Partial least squares regression (PLS regression)

es un método estadístico que estudia la relación entre dos matrices de datos, X e Y, en
donde la matriz X contiene los datos extraídos de los espectros de RMN para cada
muestra, mientras que la matriz Y contiene información adicional sobre los tipos de
muestra analizada (clase, género, tratamiento de la muestra, etc.). estos métodos
utilizan el conocimiento previo de las muestras para construir modelos estadísticos
robustos que permitan, posteriormente, predecir la clase a la pertenece una muestra
determinada sin necesidad de estar previamente clasificada. La representación gráfica
de estos modelos, de manera similar al PCA, revela el grado de discriminación entre los
grupos. Las técnicas quimiométricas supervisadas se han utilizado ampliamente en
muestras alimentarias para hacer frente a problemas relacionados con la autenticación
de origen o variedad y así poder clasificar y/o discriminar entre diferentes tipos de
muestras (Schievano et al., 2008; Capitani et al., 2010).

46
 I.Introducción

La Figura I.22 muestra un ejemplo donde se describe el estudio de muestras de suero

procedentes de vacas sanas y enfermas (Zhang et al., 2015). Existe una agrupación
mediante los dos métodos de análisis multivariante empleados (no supervisado, PCA, y
supervisado, PLS), aunque el método supervisado, como era de esperar, amplifica las
diferencias y permite obtener una mejor clasificación de las muestras.

Figura I.22. Análisis de PCA y PLS de mustras de suero procedentes de vacas sanas (rojo) y vacas enfermas (verde)
(Zhang et al., 2015)

47
 I.Introducción

I.2. EL SECTOR CÁRNICO ESPAÑOL

Basta una rápida radiografía del sector cárnico español para dar una idea de su
relevancia económica, social, industrial y comercial, como motor de la cadena de valor
de la carne, singularmente de la de porcino. De aquí la importancia de que este sector
industrial cuente con el respaldo y el apoyo científico-técnico de los centros de
investigación y universitarios, facilitando la puesta en el mercado productos cada vez
más seguros, saludables y apreciados y, en definitiva, incrementando su competitividad
y cuota de mercado.

I.2.1. SITUACIÓN ACTUAL DE LA INDUSTRIA CÁRNICA ESPAÑOLA

La industria cárnica es el cuarto sector productivo de nuestro país, sólo por detrás de
parcelas tan relevantes como la industria automovilística, la del petróleo y combustibles
y la de producción y distribución energética. El sector cárnico, formado por mataderos,
salas de despiece e industrias de elaborados, presenta en nuestro país un tejido
industrial constituido por unas 3.000 empresas, la mayoría en la categoría de pequeñas
y medianas, repartidas por toda la geografía nacional (ANICE, 2015). El 75% de las
industrias cárnicas españolas tienen menos de 20 empleados, según el Instituto Nacional
de Empleo (INE). Aunque su estructura está muy diseminada, la industria cárnica ocupa
con diferencia el primer lugar de toda la industria española de alimentos y bebidas,
representando una cifra de negocio de 22.000 millones de euros, más del 21% de todo
el sector alimentario, según datos publicados por el Ministerio de Agricultura, Pesca,
Alimentación y Medio Ambiente (MAPAMA, 2016a). Esta cifra de negocio supone
aproximadamente el 2 % del PIB total español, y en concreto el 14% del PIB de la rama
industrial. El empleo sectorial directo de las empresas cárnicas supera los 80.900
trabajadores, equivalente a más del 20% de la ocupación total de la industria alimentaria
española.

Por otra parte, la industria cárnica contribuye a paliar el déficit comercial de nuestro
país. Se trata del primer subsector exportador de la parcela agroalimentaria. En los
últimos años, se exportaron en torno a 1,7 millones de toneladas de productos frescos
y alrededor de 148.552 Tm de elaborados cárnicos, con un valor de más de 4.467

48
 I.Introducción

millones de euros a distintos países del mundo, con una balanza comercial muy positiva
y en constante progresión, que ha pasado de una tasa de cobertura del 229% en 2010
al 375% en 2015. La industria cárnica es, por tanto, un sector estratégico que es
necesario proteger para conservar su posicionamiento internacional y su carácter
competitivo.

Como es sabido, España es uno de los países con mayor tradición en la elaboración y
consumo de una amplia gama de productos cárnicos, que engloba una extensa variedad
de embutidos y jamones, que forman parte del acervo cultural y gastronómico de cada
una de sus comunidades o regiones. Las extraordinarias características organolépticas
de estos productos cárnicos son la base de su gran aceptación tanto a nivel nacional
como internacional. El mercado actual, se caracteriza por la comercialización de
productos tradicionales de calidad, bien caracterizados y diferenciados, que conviven
con nuevos derivados cárnicos con los que se intenta cubrir las demandas del
consumidor actual y los requerimientos de su forma de vida. En el amplio elenco de
derivados cárnicos, sin duda, el producto más emblemático es el jamón curado, seguido
de otros productos entre los que cabe citar, lomo embuchado y embutidos curados
como chorizo, salchichón, fuet y salami además de fiambres y jamón cocido, galantinas,
bacon, morcillas, salchichas y elaborados para untar, como patés y sobrasadas. En los
últimos años, se ha modificado la forma de comercializar estos derivados cárnicos.
Mientras se ha reducido la venta de piezas enteras o troceadas en porciones, más o
menos grandes, se ha incrementado la oferta de productos loncheados listos para su
consumo o envasados en porciones pequeñas adaptadas al consumo individual o en
unidades familiares. Por otra parte, la industria cárnica está elaborando productos con
menor aporte calórico y con perfiles más saludables, adaptándose a los nuevos criterios
nutricionales.

Otros cambios experimentados en el sector cárnico hacen referencia a la distribución

de los productos. En los últimos años, se ha experimentado un claro retroceso de las
ventas en charcuterías y otros establecimientos especializados, frente al avance de la
distribución en el libre servicio. La gran distribución organizada, como en el resto de
segmentos de consumo, ha ido captando cuota de mercado en todos los productos

49
 I.Introducción

cárnicos, sobre todo por conveniencia de precio y comodidad. No obstante, las

características especiales de la carne fresca y de sus derivados hacen que haya una
porción importante del mercado dedicada a un comercio especializado cada vez más
modernizado y profesional.

I.2.2. IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LA CARNE DE CERDO Y SUS DERIVADOS CÁRNICOS

El sector porcino español tiene una importancia clave en la economía de nuestro país
ya que supone el 12,7% de la Producción Final Agraria. Dentro de las producciones
ganaderas, que representan en torno al 38% de la Producción Final Agraria, el sector
porcino ocupa el primer lugar en cuanto a su importancia económica alcanzando el
36,4% del total.

A nivel mundial, la UE-28 es el segundo productor de carne de porcino, después de

China. Individualmente, España es la cuarta potencia productora (después de China,
EEUU, y Alemania), mientras que, a nivel europeo, ocupa la segunda posición, aportando
el 17,5% de las toneladas producidas (MAPAMA, 2016a), por detrás de Alemania, y es el
primer país de la UE en censo, con más del 19% (Figura I.23) del ganado porcino
comunitario).

Figura I.23. Censo de animales porcinos en la Unión Europea (MAPAMA, 2016a).

Tras varios años de evolución irregular del censo de porcino, como consecuencia de
las nuevas exigencias en materia de bienestar animal y de los vaivenes en los costes de

50
 I.Introducción

alimentación, desde noviembre de 2013 se ha consolidado en España una tendencia

ascendente en relación con los efectivos porcinos. Los datos de noviembre de 2014
apuntaban a un aumento del censo total (+ 4,1%) y de las reproductoras (+ 4,7%) en
particular, con respecto a las cifras de noviembre del año anterior. En 2015, se alcanzó
un censo de 28,3 millones de individuos, lo que sitúa a España por primera vez como el
país con mayor censo de la UE (Figura I.24) por delante de Alemania (27,5 millones). El
número de animales sacrificados en 2015 se sitúa en 46,38 millones de cabezas, lo que
supone una producción de 3.895.800 toneladas (MAPAMA, 2016a). En este año
continúa la tendencia ascendente detectada los dos años precedentes, alcanzando cifras
récord (Figura I.24).

Figura I.24. Evolución del número de animales sacrificados 2000-2015 (MAPAMA, 2016a).

Este aumento de la producción ha incrementado la ya elevada tasa de

autoabastecimiento, lo que convierte a la exportación en un elemento esencial para el
equilibrio del mercado. Con una balanza comercial muy positiva, España se ha
consolidado como segundo mayor exportador de porcino de la UE, sólo por detrás de
Alemania. Cabe destacar en los últimos años el fuerte aumento de las exportaciones a
terceros países, especialmente a China, que se ha convertido en el primer destino de la
carne de porcino español. En el contexto internacional, la UE representa la principal
potencia exportadora.

51
 I.Introducción

Por otro lado, España es uno de los países con mayor tradición en la elaboración y
consumo de derivados cárnicos. Lo diverso de la producción chacinera forma parte de
nuestro acervo cultural y gastronómico y es apreciada dentro y fuera de nuestras
fronteras.

En cuanto a la producción de derivados cárnicos, España, con 1,3 millones de

toneladas anuales, se sitúa en cuarto lugar en la UE, por detrás de Alemania, Italia y
Francia. Por productos, destacan en volumen los fiambres cocidos, con un 28,6% de la
cuota, y en valor, los jamones y paletas curados (blancos e ibéricos), con un 38,0% de
participación (MAPAMA, 2016b) (Figura I.25).

Figura I.25. Importancia de los tipos de carne procesada sobre el total de carne procesada (MAPAMA, 2016b).

En España, el consumo per cápita de carne procesada durante el año 2015 fue de
8,25 kilos por persona y año. El 28,6% corresponde a fiambres siendo la ingesta media
aproximada de 2,36 kilos/persona/año. Le sigue el jamón curado y la paleta con un
consumo per cápita de 2,06 kilos/persona/año (MAPAMA, 2016b).

La importancia que tiene en España el consumo de derivados cárnicos ejerce una gran
influencia en todo el sector productivo y condiciona la mayor parte de las decisiones
técnicas y económicas. La producción de derivados cárnicos exige una materia prima
con atributos de alta calidad y características diferentes a las que requiere la
comercialización de la carne fresca, de ahí la necesidad de introducir mejoras en los
métodos de control y aseguramiento de la calidad, así como en los métodos y líneas de
producción.

52
 I.Introducción

I.3. EL CERDO
La carne de cerdo proveniente de una buena crianza constituye un alimento nutritivo,
saludable, sabroso, muy equilibrado en su composición y por su relación calidad-precio
constituye uno de los productos cárnicos más consumidos por la población.
Estructuralmente, se considera un miosistema, por la importancia que tienen las
proteínas miofibrilares en la formación y consolidación de esta matriz cárnica. En este
apartado se abordan consideraciones generales de la carne y se detallan aspectos
relevantes relacionados con la estructura y composición de la misma.

I.3.1. CONSIDERACIONES GENERALES

El cerdo (Sus scrofa domestica) es un mamífero artiodáctilo (orden Artiodactyla) de

la familia Suidae. Es un animal doméstico usado en la alimentación humana por algunas
culturas, en especial las occidentales. El ancestro étnico de la mayoría de las razas de
cerdos domésticos es el jabalí eurasiano, que fue domesticado de manera
independiente en varios lugares distanciados, tanto geográfica como temporalmente
(Larson et al., 2005). Al ser animales adaptados a climas templados y semitropicales se
pueden encontrar en muchas zonas del globo, hasta el punto de que a comienzos del
presente siglo su población mundial se calculaba en más de 900 millones de ejemplares.

Los esfuerzos encaminados a fijar las características deseadas de razas mejoradas han
conducido al reconocimiento de alrededor de 90 razas, con más de 200 variedades que
se han agrupado en tres tipos principales de cerdos: el céltico, el ibérico y el asiático.
Entre estos, la agrupación racial “tronco ibérico” con varias estirpes es la variedad
genuina de España (Suárez et al., 2002).

La tendencia actual presentada por la producción porcina en nuestro país viene

marcada por las exigencias de la industria cárnica de transformación, particularmente
las interesadas en la elaboración de productos de calidad, como el jamón o los
embutidos curados. Bajo este planteamiento muchas de las razas porcinas locales o
rústicas, anteriormente comercializadas, se encuentran en regresión debido
fundamentalmente a su baja tasa de producción, a que ofrecen canales de tamaño
reducido y bastante engrasadas, y/o por no responder a las demandas actuales del

53
 I.Introducción

mercado. En consecuencia, la producción y comercialización del ganado porcino ha

experimentado un cambio profundo en nuestro país por la preferencia hacia otras razas
foráneas mejoradas, como se indica en el Catálogo Oficial de Razas de Ganado de
España, recogido en el Anexo I del Real Decreto 2129/2008, de 26 de diciembre, por el
que se establece el Programa Nacional de conservación, mejora y fomento de las razas
ganaderas, donde figuran como razas porcinas integradas en España: Blanco belga,
Duroc, Hampshire, Landrace, Large White y Pietrain. Sin embargo, existen ejemplos de
algunas razas porcinas históricas que han permanecido en el mercado nacional, al
resultar altamente valoradas por la calidad aportada a sus productos derivados,
particularmente los curados. Este es el caso del Cerdo ibérico.

I.3.2. ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DE LA CARNE DE CERDO

La carne es fundamentalmente tejido muscular acompañado de cantidades variables

de tejido conectivo, grasa, ocasionalmente, tejido epitelial, hueso y cartílagos. Contiene
también fibras nerviosas y vasos sanguíneos que, en vida del animal, proporcionan un
sistema de inervación y un lecho vascular para el aporte de nutrientes y eliminación de
desechos.

En el animal vivo se distinguen, tanto por su estructura como por su función, tres
tipos de tejido muscular: el estriado esquelético, el músculo cardíaco y el músculo liso.
En la carne, la musculatura lisa sólo representa una pequeña proporción formando parte
fundamentalmente de los vasos sanguíneos, mientras que el músculo cardiaco se limita
al corazón. En consecuencia, esta memoria se referirá únicamente al músculo estriado
esquelético, que es el más importante cuantitativamente en la carne.

El documento CAC/RCP 58/2005 del Codex Alimentarius define el término carne

como “todas las partes de un animal que han sido dictaminadas como inocuas y aptas
para el consumo humano o se destinan para este fin”. Incluye la parte comestible de los
músculos de los bóvidos, óvidos, suidos, cápridos, équidos y camélidos sanos,
sacrificados en condiciones higiénicas. Por extensión, se aplica también a la de los
animales de corral, caza y mamíferos marinos. La carne ha de estar limpia, sana y
debidamente preparada. El término carne incluye los músculos del esqueleto, los de la

54
 I.Introducción

lengua y los del diafragma y esófago, con o sin grasa, así como porciones de hueso, piel,
tendones, aponeurosis, nervios y vasos sanguíneos que normalmente acompañan al
tejido muscular y que no se separan de éste en las operaciones de preparación de la
carne.

I.3.3. ESTRUCTURA DEL TEJIDO MUSCULAR

Como se mencionó anteriormente, la carne procede mayoritariamente del músculo

estriado esquelético, que supone alrededor del 40% del peso corporal total. Se compone
de múltiples células o fibras individuales que se agrupan formando haces o fascículos
cuyo tamaño varía dependiendo del número de fibras asociadas. A su vez, varios haces
se agrupan entre sí, rodeados de tejido conjuntivo y con infiltraciones de grasa, para
conformar el músculo.

En el corte transversal de un músculo diseccionado, al que se ha separado del tejido

adiposo subcutáneo (Figura I.26), se pueden distinguir, de fuera hacia adentro, las
siguientes estructuras:

▪ Epimisio: gruesa capa de tejido conectivo que rodea al músculo. Se prolonga

hasta los extremos de los músculos y se une a otras estructuras conjuntivas
para formar las aponeurosis y los tendones, por donde el músculo se ancla al
tejido óseo.

▪ Perimisio: vaina de tejido conjuntivo que envuelve a cada fascículo muscular.

▪ Endomisio: capa de colágeno, elastina y reticulina que rodea a cada fibra

muscular de forma individual.

Figura I.26. Corte transversal de músculo esquelético.

55
 I.Introducción

Las fibras musculares, también llamadas miocitos, se encuentran distribuidas de

forma paralela y están rodeadas de una membrana que se denomina sarcolema,
conteniendo el sarcoplasma, un material semifluido que presenta proteínas solubles y
pequeñas partículas de glucógeno, inclusiones de grasa y mitocondrias. El interior de la
fibra contiene las miofibrillas (1 y 2 μm de diámetro) ordenadas longitudinalmente, y
constituidas por miofilamentos. Estas estructuras conforman el aparato contráctil y son
responsables del aspecto estriado del músculo. Las miofibrillas presentan una estructura
formada por moléculas de cadena larga y pequeño diámetro, enlazadas lateralmente a
través de puentes de hidrógeno e interacciones electrostáticas, dando lugar a una red
tridimensional en la que el agua permanece inmovilizada en mayor o menor grado.

La contracción del músculo consiste en el deslizamiento de los miofilamentos de

actina (filamentos finos) sobre los miofilamentos de miosina (filamentos gruesos). Como
se muestra en la Figura I.27, a nivel microscópico, el sarcómero, unidad anatómica y
funcional del músculo, exhibe bandas oscuras (bandas A) y bandas claras (bandas I). Las
bandas I son intersectadas por la línea Z. A su vez, las bandas A son intersectadas por la
línea M. Separando la banda A de la línea M se encuentra un espacio claro llamado zona
H. La disposición de todas estas bandas y líneas constituye la organización de la
maquinaria contráctil de la fibra muscular que se extiende de una línea Z a la siguiente.
La banda I del sarcómero está constituida por los filamentos finos de actina. La banda A
contiene las fibras de miosina. Ambas fibras se superponen en el espacio de la banda A.
Durante la contracción muscular, las bandas A mantienen su espesor, mientras que las
bandas I se estrechan.

Figura I.27. Esquema de la contracción muscular.

56
 I.Introducción

Según la relación entre las miofibrillas y el sarcoplasma se diferencian dos tipos de

fibras: rojas y blancas. Las fibras rojas presentan un número reducido de miofibrillas,
que se agrupan en determinadas zonas, denominadas campos de Cohnheim. El
sarcoplasma es muy abundante y contiene una elevada cantidad de mioglobina (Mb),
de mitocondrias y de gotas lipídicas. Son fibras de contracción lenta, sostenida y
agotamiento pausado siempre que dispongan de oxígeno (Belitz et al., 2012). Presentan
una baja actividad metabólica oxidativa, lipásica, hexoquinasa y de síntesis de glucógeno
(Aberle et al., 2012). Las blancas, de contracción intensa, rápida y fugaz agotamiento, se
caracterizan por la abundancia de miofibrillas que ocupan casi la totalidad del
sarcoplasma. Este último es, por tanto, muy escaso y también su contenido en Mb y
mitocondrias. Estas fibras tienen mayor diámetro que las rojas, mayor contenido de
glucógeno, creatín-fosfato, ATP y fructosa 1,6-difosfato y mayor actividad fosforilasa,
ATPásica y glucolítica. También existen fibras de tipo intermedio que comparten las
características de las anteriores (Aberle et al., 2012).

La fibra muscular suele ser polinucleada. En la mayoría de las especies animales las
fibras rojas y blancas están más o menos mezcladas al azar en los haces musculares. Sin
embargo, en el cerdo, en la mayoría de los músculos, las fibras rojas se localizan en
forma de pequeños grupos cerca del centro de los fascículos y están rodeadas de fibras
blancas que forman la periferia de los haces (Aberle et al., 2012).

Los músculos se clasifican como rojos o blancos basándose fundamentalmente en la

intensidad de su color, que a su vez depende de la proporción de fibras rojas y blancas
que contengan y éstas, en definitiva, del contenido en Mb.

I.3.4. COMPOSICIÓN DEL MÚSCULO PORCINO

I.3.4.1. Agua

El contenido en agua de la carne de cerdo es, aproximadamente, del 75%, siendo muy
similar al de otras especies de abasto como pollo y vacuno (Primo, 1997; Fennema et al.,
2010). El agua de la canal se encuentra principalmente en el tejido muscular magro; el
tejido adiposo contiene poca agua. En conjunto se estima que en el tejido conectivo se

57
 I.Introducción

encuentra aproximadamente el 10 % del agua de la carne, mientras que las proteínas

sarcoplásmicas se asocian con un 20% del contenido acuoso. El mayor porcentaje de
agua (alrededor del 70%) se encuentra asociada a la estructura de las miofibrillas.
Muchas de las propiedades físicas de la carne, como el color, la textura y la firmeza,
dependen en parte de su capacidad de retención de agua (CRA) de la carne (Kim et al.,
2013), que está muy relacionada con el pH final de la misma. La CRA es un parámetro
fisicoquímico que se podría definir como la aptitud de la carne para retener el agua que
ella misma contiene durante la aplicación de fuerzas externas tales como cortes,
calentamiento, trituración y prensado, lo que tiene especial interés durante su
conservación, fileteado, cocinado y transformación.

El agua del tejido muscular puede encontrarse en distintas localizaciones (Pearce et

al., 2011):

▪ Enlazada de una manera directa a los grupos hidrófilos de las proteínas

musculares. Este contenido acuoso se encuentra fuertemente ligado a las
estructuras celulares y apenas se ve afectada por los cambios ocurridos
durante los procesos postmortem. Por otra parte, contribuye a la estabilidad
de las formas moleculares proteicas durante el procesado de la carne (como
la desecación, la congelación, etc.).

▪ En los espacios intermiofibrilares, localizada entre los miofilamentos de las

proteínas musculares (agua intramiofibrilar). La amplitud de estos espacios
puede variar en función de varios factores: pH, longitud del sarcómero, fuerza
iónica o presión osmótica.

▪ En el espacio extramiofibrilar, entre las miofibrillas, se encuentra agua en

estado más libre, menos ligada. Su porcentaje se incrementa a expensas del
agua intramiofibrilar durante determinados procesos de transformación, al
quedar reducidas las zonas de posibles enlaces.

En consecuencia, se puede hablar de la existencia de distintos tipos de agua en el

tejido muscular (Bello, 2008):

58
 I.Introducción

▪ Agua de constitución o de estructura o agua fuertemente ligada: Este

contenido de agua estabiliza la estructura de las proteínas. Su contenido oscila
entre 0,04 y 0,01 g/g de proteína, representando entre el 4 y el 5 % de los
componentes del músculo. Forma una capa monomolecular en torno a las
moléculas proteicas y se halla enlazada directamente a los grupos cargados y
polares (NH3+ y COO-). Este tipo de agua no es móvil y no puede extraerse a
no ser que se provoquen modificaciones considerables de la conformación y
propiedades funcionales de las proteínas. Requiere una energía de desorción
elevada, entre 12 y 25 kJ/mol variaciones de volumen del orden de 0,05 ml/g
de proteína. No está disponible ni como disolvente ni como reactivo y no es
congelable.

▪ Agua de interfase: Representado por el pequeño porcentaje de moléculas

enlazadas a la superficie de las proteínas mediante una energía de unión
superior a la propia del agua normal, que le permite formar capas acuosas en
torno a las moléculas proteicas. Primeramente, se constituye una segunda
capa de moléculas de agua (agua de hidratación o agua ligada) ordenada en
torno a los grupos hidrofílicos de las proteínas (alrededor de 0,2 g/g de
proteína) y luego, capas sucesivas de moléculas con menor fijación a medida
que aumenta la distancia al grupo reactivo de la proteína (entre 0,3 y 0,5 g/g
de proteína). Todas estas capas de moléculas de agua organizadas en torno a
las proteínas se encuentran relacionadas entre sí a través de enlaces de
hidrógeno e interacciones dipolo-dipolo. Esta agua no es congelable, pero
está disponible como disolvente y como reactivo. Tanto el agua de
constitución como el agua de interfase, según la clasificación anterior, por su
movilidad, se considera agua fuertemente ligada a las proteínas musculares.

▪ Agua de movilidad reducida: La movilidad del resto del contenido acuoso,

(no incluido en el agua de constitución ni de interfase) está limitada por
distintos mecanismos. Incluye el agua extracelular, la correspondiente al
espacio sarcoplásmico y el agua retenida en los espacios capilares y
microcapilares. El agua extracelular representa menos de un 10% del agua

59
 I.Introducción

total del músculo vivo, aunque en la carne, debido a los cambios postmortem,
puede ascender a más de un 15%. Se trata del agua que se encuentra fuera
de las células, en espacios macrocapilares y, por su movilidad, se considera
agua extramiofibrilar. La liberación del agua del espacio sarcoplásmico se
encuentra frenada por el comportamiento y la integridad del sarcolema. La
mayor cantidad de agua se encuentra en el interior de las miofibrillas,
atrapado en el retículo tridimensional constituido por los miofilamentos,
especialmente de actina y miosina. Éste es el agua embebida, agua de los
microcapilares o agua fijada a los miofilamentos (hasta 10 g de agua/g de
proteína). Según su movilidad, este tipo de agua se corresponde con el agua
intramiofibrilar.

▪ Agua libre: corresponde a las moléculas de agua que se mantienen en el

músculo retenidas solamente por fuerzas superficiales. El contenido acuoso
más libre es el que se encuentra en los espacios macrocapilares
extracelulares, el cual puede migrar lentamente a la superficie de la carne
donde se evapora o se desprende en forma de goteo.

2%
5%
13%
10%
agua de constitución
agua de interfase
agua extramiofibrilar
agua intramiofibrilar
agua libre
70%

Figura I.28. Representación de los distintos compartimentos de agua en la carne.

Como se muestra en la Figura I.28, alrededor del 95% del contenido acuoso de la
carne se encuentra como agua libre o agua de movilidad reducida. El agua de estas
fracciones es congelable, puede disolver solutos e intervenir en diversas reacciones. Su
liberación de la masa cárnica exige una energía variable, que puede valorarse
sometiendo al sistema a distintas fuerzas; de esta forma, puede determinarse su

60
 I.Introducción

capacidad para retener o absorber este elemento. Los cambios en la capacidad de

retención de agua (CRA) afectan al agua denominada "inmovilizada" y no tienen ninguna
relación con el "agua ligada". El término "agua ligada" incluye tanto el agua de
constitución como el agua de interfase y el resto de las fracciones se consideran "agua
inmovilizada” (Pearce et al., 2011). La CRA está fundamentalmente asociada a las
proteínas miofibrilares, dado que la mayor cantidad de este elemento se encuentra
embebida en el retículo que constituyen las miofibrillas. La cantidad de agua que esta
estructura es capaz de inmovilizar depende del espacio disponible; en consecuencia,
todos aquellos factores que disminuyan la cohesión entre las moléculas adyacentes (por
ejemplo, el incremento de la repulsión electrostática entre las cadenas proteicas)
ampliarán los espacios de la red tridimensional, aumentando la capacidad de imbibición.
Por el contrario, todo agente que incremente la atracción entre las cadenas proteicas
(por ejemplo, aumentando las fuerzas electrostáticas en la estructura proteica)
provocará la retracción de la red tridimensional y disminuirá la cantidad de agua que
ésta es capaz de albergar, forzándose la expulsión del exceso (sinéresis).

I.3.4.1.1. Exudado acuoso cárnico

Dada la relación con el contenido acuoso, y la relevancia para el desarrollo de la
presente tesis doctoral, se realiza aquí una breve referencia al agua liberada por la carne
denominado exudado cárnico. Una manifestación de la CRA de la carne son las pérdidas
por goteo y la aparición de exudados en torno a las porciones cárnicas, especialmente
apreciables en los cortes de las porciones cárnicas (superficies de contacto en envases y
contenedores). Esta liberación se traduce en pérdidas de peso, cambios en la
palatabilidad e incluso modificaciones en el valor nutritivo al arrastrar todo tipo de
componentes hidrosolubles, como ciertas vitaminas, minerales, proteínas (tanto
sarcoplásmicas como miofibrilares), nucleótidos, aminoácidos, péptidos y enzimas
solubles (Savage et al., 1990). En general, los exudados cárnicos suelen representar
entre 1-3% en cortes frescos (Melody et al., 2004). Las pérdidas por goteo se aceleran
por procedimientos de corte, prensado y, particularmente, congelación-descongelación.
De hecho, se han observado pérdidas de hasta el 18% durante la congelación-
descongelación de carne de cerdo (Xia et al., 2009).

61
 I.Introducción

La exudación acuosa de la carne depende de la cantidad de fluido que se ha podido

separar de la estructura muscular, especialmente de la retenida en los espacios capilares
y microcapilares del entramado de los miofilamentos de actina y miosina (Huff-Lonergan
& Lonergan, 2005). Este hecho, está potenciado por el mencionado descenso del pH y
el consiguiente acercamiento al punto isoeléctrico de las proteínas miofibrilares y la
instauración de la interacción actina-miosina (Joo & Kim, 2011); todo ello reduce el
espacio disponible para la retención de agua. El fluido acuoso separado de los
filamentos pasa al sarcoplasma, diluyéndolo y rebajando la presión osmótica del mismo,
con el consiguiente incremento del espacio extracelular. Los músculos ricos en grasa
presentan una mayor CRA, aunque se desconoce la razón de dicho efecto que
posiblemente se debe a que la grasa intramuscular relaja la microestructura del músculo
y permite la entrada de mayor cantidad de agua (Bello, 2008).

I.3.4.2. Proteínas

Las proteínas representan el componente más abundante de la materia seca del

músculo. Además de las proteínas, en la carne se pueden encontrar otros compuestos
nitrogenados como aminas, compuestos guanidínicos, compuestos de amonio
cuaternario, aminoácidos libres y péptidos, pero son las proteínas las que van a
desempeñar un papel fundamental en las propiedades de la carne, tanto para su
consumo en fresco como para su industrialización (Larrea, 2003). Atendiendo a su
solubilidad, las proteínas se pueden clasificar en tres grupos (Pospiech et al., 2003):

▪ Proteínas solubles (proteínas sarcoplásmicas): extraíbles con agua o en

soluciones diluidas de sal (<50mM). Este grupo supone un 30-35% de las
proteínas del músculo esquelético. Constituyen un grupo heterogéneo
formado por más de 100 proteínas diferentes, entre las que se encuentran
pigmentos como la mioglobina y la mayor parte de enzimas involucrados en
el metabolismo muscular.

▪ Proteínas del aparato contráctil (proteínas miofibrilares): son solubles en

soluciones con alta fuerza iónica, especialmente a 0,6 M de KCl. Constituyen
las ya mencionadas miofibrillas o unidades estructurales responsables de la

62
 I.Introducción

contracción muscular. Representan entre el 50-55% de las proteínas totales

del músculo. Entre las más importantes se encuentran las proteínas
contráctiles: actina y miosina, así como las proteínas reguladoras de la
contracción, troponina, tropomiosina, proteínas M y C. Además, cabe citar la
α-actinina y diversas proteínas, que se presentan en pequeñas cantidades y
conforman el citoesqueleto muscular. Dentro de este grupo, las más
importantes son la titina, nebulina, desmina y vinculina. Las proteínas
miofibrilares son las principales responsables de las propiedades funcionales
de la carne. Destaca su papel en la CRA, factor tecnológico que incide en la
idoneidad del comportamiento de la carne en diversos procesos. La mayor o
menor CRA será determinante de la cuantía en las pérdidas de peso por goteo,
así como en lo que atañe a la calidad del producto final, ambas de gran
trascendencia económica.

▪ Proteínas insolubles o del estroma: representadas por las fibras

extracelulares de colágeno, elastina y reticulina. Forman parte del tejido
conjuntivo que recubre las fibras y haces musculares. El colágeno es la
proteína más abundante en los animales de abasto, pudiendo alcanzar el 30
% del total de proteínas corporales en los individuos adultos, con especial
abundancia en piel, tendones, cartílagos y huesos. En la carne, las proteínas
insolubles suponen entre un 2 y un 6% del total de las proteínas musculares.

I.3.4.3. Lípidos

Los lípidos desempeñan un papel fundamental en el desarrollo de las características

cualitativas de la carne y los productos cárnicos transformados, tanto en cuanto a su
valor nutritivo como a sus propiedades sensoriales, al ser precursores de compuestos
responsables del flavor.

La cantidad de grasa de un animal y, por tanto, de la canal, varía con la raza, el sexo,
la edad, la dieta, o el peso, entre otros factores (Marusic et al., 2013). El contenido en
lípidos de un determinado músculo es variable; su concentración está relacionada
inversamente con el contenido en agua. La mayoría de los lípidos se localizan en los

63
 I.Introducción

depósitos de tejido adiposo y en el caso de los músculos (Bello, 2008), asociados a los
septos del tejido conectivo laxo que se encuentran entre los haces musculares (grasa
intramuscular), formando lo que se conoce como veteado o marmorización. Estos
lípidos dan jugosidad a la carne y, además, se comportan como un aislante, que permite
que la carne infiltrada pueda ser sometida a mayores tratamientos térmicos con mínima
pérdida de calidad.

La mayor parte de los ácidos grasos del material lipídico corresponde a los
triglicéridos, aunque hay pequeñas cantidades de mono y diglicéridos (Prändl et al.,
1994). La composición en ácidos grasos, además de ser importante para la consistencia,
influye en la calidad sensorial. Los porcentajes de grasa en carne de cerdo oscilan entre
un 17% y un 36%, correspondiendo el porcentaje de ácidos grasos más elevado a los
monoinsaturados (51%) seguido de los saturados (35%) y los poliinsaturados (13%). Por
ácidos grasos individuales los porcentajes más elevados corresponden al ácido oleico
(C18:1) (aproximadamente 48%), seguido del ácido palmítico (C16:11) (23%) y del ácido
esteárico (C18:0) (10.6%) (Piñeiro et al., 2001). Los fosfolípidos son componentes
esenciales de las membranas celulares, participan en la regulación del metabolismo
celular y su contenido es relativamente constante (0,8-1,0%) en los tejidos magros
(Bello, 2008). Estos lípidos estructurales contienen una proporción considerable de
ácidos grasos poliinsaturados, lo que resulta clave en la alteración química de la carne
por ser en estos ácidos grasos donde se inicia con mayor facilidad el enranciamiento
autooxidativo de los lípidos, originando cambios en el aroma, el color y el flavor de la
carne (Skiba et al., 2012).

I.3.4.4. Carbohidratos

Suelen constituir el 1-2% de los componentes del músculo en el animal vivo,

representados principalmente por el polisacárido de reserva glucógeno. No obstante,
en los procesos postmortem, el músculo experimenta cambios muy significativos, que
caracterizan la trasformación del músculo en carne. Inmediatamente después de la
muerte, el tejido muscular acude a las reservas de glucógeno como fuente energética y
lo degrada mediante glucolisis anaerobia. En consecuencia, el músculo se acidifica y el
pH muscular alcanza un valor final que dependerá del porcentaje de glucógeno

64
 I.Introducción

degradado, de la raza del animal o del tipo de músculo. En definitiva, la carne contiene
cierto porcentaje de ácido láctico, junto con cantidades vestigiales de algunos
metabolitos con estructura de azúcares, como glucosa, glucosa-6-fosfato y otros
azúcares-fosfatos (Bello, 2008).

I.3.5. ASPECTOS NUTRICIONALES DE LA CARNE DE CERDO

Como hemos visto, la carne es un alimento eminentemente proteico. No obstante,

desde el punto de vista nutricional, la composición de la carne puede variar debido a
diversas causas, entre las que cabe destacar la especie animal, la porción anatómica
considerada y su procesado. Además, dentro de cada especie hay variaciones
dependiendo de la raza, edad o alimentación entre otros factores. La edad influye en la
proporción de grasa y proteínas, de manera que los animales viejos tienen más grasa
intramuscular que los jóvenes ya que al avanzar la edad mayor es la grasa acumulada y
menor el contenido en colágeno, sin embargo, presentan una dureza mayor debido a la
mayor abundancia de entrecruzamientos entre las fibras de colágeno (Toldrá et al.,
1996). Los machos, en general, contienen menos grasa intramuscular que las hembras,
mientras que los cerdos castrados presentan más grasa que los machos y las hembras
(Toldrá et al., 1996). Entre los factores extrínsecos, al ser el cerdo un animal
monogástrico, el más importante es la alimentación, influyendo en las cualidades de la
carne obtenida, pues si se aumenta en la dieta el contenido de hidratos de carbono o de
grasa, aumenta el engrasamiento de las canales (Ordóñez et al., 1998). Además, la
composición en ácidos grasos depende poderosamente de los presentes en la dieta.

En la fracción comestible de la carne fresca de cerdo, el 65-80% de su peso es agua,

y en ella se encuentran disueltos o suspendidos numerosos componentes químicos,
ciertas proteínas (16-22%), lípidos (3-13%), minerales (1-1,5%) y otros componentes
minoritarios como sustancias nitrogenadas no proteicas (aminoácidos libres, péptidos,
nucleótidos, creatina), carbohidratos (trazas), ácido láctico, y algunas vitaminas. En la
Tabla I.2 se detalla la composición nutricional de la carne de cerdo (Moreiras et al., 2013)

65
 I.Introducción

Tabla I.2. Composición nutricional de la carne de cerdo.

Fuente: Tablas de composición de alimentos (Moreiras et al., 2013).
AGS:ácidos grasos saturados; AGM: ácidos grasos monoinsaturados; AGP: ácidos grasos poliinsaturados.

Los minerales tienen un papel significativo en la conversión del músculo en carne. El

magnesio y el calcio contribuyen al estado de contracción post mortem, influyendo
indirectamente, por tanto, en la dureza de la carne. Están relacionados también con la
CRA, por su implicación en los efectos estéricos (Price & Schweigert, 1994). En la carne
fresca el contenido en minerales es del 1%. Desde el punto de vista nutricional, el hierro
es el que alcanza mayor relevancia, por su elevado contenido en relación con otros
alimentos y por su gran disponibilidad, lo que se debe a que se encuentra en forma
hemo, presentando una excelente absorción. Además, esta estructura, potencia la
absorción del hierro procedente de otras fuentes (Godber, 1994). La carne también es
una importante fuente de zinc; sin embargo, es bastante pobre en calcio (Moreiras et
al., 2013). Otros oligoelementos presentes son el flúor, el bromo, el yodo, el silicio, el
manganeso y el cobre (Prändl et al., 1994).

Las vitaminas más abundantes en las carnes son las hidrosolubles,

fundamentalmente del grupo B, destacando la B1 (tiamina), B2 (riboflavina), B6
(piridoxina), B12 (cianocobalamina) y niacina, las cuales proporcionan un 25-50% de las

66
 I.Introducción

necesidades diarias (Windham et al., 1990). Las vitaminas liposolubles se encuentran en

muy pequeñas cantidades y se localizan en las fracciones lipídicas.

Los procedimientos de transformación necesarios para la obtención de derivados

cárnicos implican modificaciones más o menos profundas de la estructura de la carne
fresca de origen y la incorporación de otras materias primas que repercuten en la
valoración nutricional del producto final, sobre todo en lo que respecta a la cantidad de
grasa y contenido en sal. La Tabla I.3 muestra los principales aspectos nutricionales de
los embutidos crudos curados y del jamón curado a través del empleo del “semáforo
nutricional”, un sistema ideado en Gran Bretaña para conocer el valor nutritivo de los
alimentos de forma sencilla, rápida y cómoda para el consumidor (Farrán et al., 2003).

Tabla I.3. Semáforo nutricional de distintos embutidos crudo-curados y de jamón curado según una ración de
consumo que va desde los 35 a los 60 gramos, en función del producto considerado.
Fuente: Tablas de composición de alimentos del CESNID (Farrán et al., 2003)

Indica la proporción aportada respecto de la cantidad Diaria Orientativa (CDO) que una persona adulta necesita
ingerir de cada nutriente: 2.000 kcal, 90 g de grasa, 70 g de saturadas, 20 g de azúcares, 6 g de sal y 24 g de fibra. El
semáforo nutricional se basa en un sistema de colores: verde-baja cantidad (la aportación es del 7,5% de la CDO),
amarillo-cantidad media (entre el 7,5% y el 20%) y naranja-cantidad alta (más del 20%). La fibra no tiene color
porque escasea en la dieta.

A este respecto, en octubre de 2015, el Centro Internacional de Investigaciones sobre

el Cáncer (CIIC), perteneciente a la Organización Mundial de la Salud (OMS), emitió un
informe evaluador de la carcinogenidad del consumo de carne roja y carne procesada
(OMS, 2015). Dados los productos incluidos en la presente Tesis Doctoral y la
repercusión de dicho informe en los medios de comunicación, la opinión pública y las
reacciones suscitadas en el seno de la industria cárnica a nivel mundial, el resultado de
dicho informe merece ser mencionado. Como resultado del estudio, la carne roja (parte
muscular de los mamíferos, incluyendo carne de res, ternera, cerdo, cordero, caballo y

67
 I.Introducción

cabra) ha sido clasificada como Grupo 2A, probablemente cancerígena para los seres
humanos. Dicha clasificación se basa en una evidencia limitada procedente de estudios
epidemiológicos que muestran una asociación positiva entre el consumo de carne roja
y el desarrollo de cáncer colorrectal. La carne procesada (carne que ha sido
transformada a través de la salazón, el curado, la fermentación, el ahumado, u otros
procesos para mejorar su sabor o su conservación) fue clasificada como Grupo 1,
cancerígeno para los seres humanos. Esta categoría se utiliza cuando hay suficiente
evidencia de carcinogenicidad en humanos. Los expertos afirman que el consumo de 50
gramos de productos cárnicos al día supone incrementar el riesgo de cáncer colorrectal
en un 18%, sin haber especificado qué tipo de productos ni el método de elaboración
utilizado. Esta evaluación del CIIC refuerza la recomendación de 2002 de la OMS acerca
de moderar el consumo de carne para reducir el riesgo de cáncer colorrectal. Algunas
otras directrices sobre la dieta también recomiendan limitar el consumo de carne roja o
carne procesada, pero éstas se centran principalmente en la reducción de la ingesta de
grasa y sodio, que son factores de riesgo para las enfermedades cardiovasculares y la
obesidad.

68
 I.Introducción

I.4. DERIVADOS CÁRNICOS

Además del consumo en fresco, la carne de cerdo es susceptible de ser sometida a
múltiples procesos de transformación que conducen a la elaboración de distintos tipos
de derivados cárnicos, lo que permite la diversificación de la materia prima y la obtención
de productos de gran calidad y con amplia vida útil. La mayoría de estos productos son
altamente apreciados por el consumidor y, económicamente, aportan grandes
beneficios a la industria cárnica, de ahí la necesidad de conocer a fondo los procesos
tecnológicos y las transformaciones bioquímicas implicadas. A continuación, se abordan
los detalles de elaboración de los productos estudiados en esta Tesis Doctoral: jamón
curado y embutidos crudos curados.

I.4.1. GENERALIDADES

La búsqueda de soluciones para la conservación de alimentos ha estado siempre

ligada a la evolución humana y aún hoy es un reto para la sociedad. Entre los primeros
métodos utilizados para este fin destacan el secado y la fermentación.

La fermentación representa, probablemente, uno de los procesos biotecnológicos

más antiguos. Esta técnica, que se ha empleado desde la Prehistoria para la
conservación de alimentos durante periodos prolongados de tiempo, consume poca
energía y da lugar a un producto de elevada calidad (Molly et al., 1997). Aunque empírica
en sus orígenes, hoy sabemos que la microbiota presente en el producto tiene una
participación decisiva en los procesos fermentativos ya que los microorganismos
fermentadores participan tanto en garantizar la estabilidad microbiológica del alimento
fermentado como en la consecución de sus características sensoriales (Ordoñez et al.,
1999).

Igualmente, el curado es otra técnica ancestral de conservación que también surgió

como un medio de evitar o retrasar la alteración del producto fresco. En esencia, la
estabilización del producto se consigue mediante la adición de sal y deshidratación. El
tiempo de curado y las condiciones de temperatura y humedad son claves para el
desarrollo de los atributos sensoriales peculiares que caracterizan al producto y que

69
 I.Introducción

surgen de complejas reacciones microbiológicas, químicas y bioquímicas y las

interacciones entre ellas (Toldrá, 2006).

Actualmente la fermentación y el secado de la carne han dejado de ser métodos cuyo

objetivo primero era la conservación para convertirse en una forma de diversificación
de productos. La pérdida de la estacionalidad en la disponibilidad de la carne, el
desarrollo de la refrigeración y de la congelación y el de otros procesos tecnológicos han
transformado la fabricación de los derivados cárnicos. En la actualidad, la industria
cárnica está encaminada a la obtención de productos muy variados, de alta calidad y con
características muy distintas a las de las materias primas de partida. A esto se une el
hecho de que muchos derivados cárnicos presentan una extensa vida útil, sin necesidad
de otras medidas adicionales de conservación, y el escaso riesgo sanitario que su
consumo conlleva, lo que ha ocasionado que la producción de derivados cárnicos se
haya hecho un hueco importante dentro del sector alimentario.

Con el fin de obtener productos de calidad, un aspecto fundamental en la elaboración

de los productos cárnicos es la selección de la materia prima. En este sentido, cabe
destacar la necesidad de evitar el empleo de carnes con defectos asociados al manejo y
al sacrificio del animal. La energía requerida para la actividad muscular en un animal vivo
se obtiene de los azúcares (glucógeno) presentes en el músculo. En un animal sano y
descansado, el nivel de glucógeno de sus músculos se encuentra en torno al 1%. Una vez
sacrificado el animal se van a producir una serie de cambios que conducen a la ya
mencionada transformación del músculo en carne, proceso en el cual está implicada,
por una parte, la formación de ácido láctico a partir de la reserva de glucógeno,
siguiendo un ciclo de glucólisis en condiciones anaerobias. El consiguiente acumulo de
ácido láctico es el principal responsable de la bajada de pH de la carne postmortem. Por
una parte, la aparición de enlaces cruzados permanentes entre los filamentos de actina
y de miosina, debido al agotamiento del ATP requerido para la relajación, conduce a la
manifestación de una rigidez generalizada de los músculos (rigor mortis). La instauración
de esta situación de contracción irreversible del músculo se resuelve por una
degradación física de la estructura muscular por la acción enzimática endógena, dando
lugar a la carne. El perfil o velocidad del descenso del pH, y en menor medida el nivel de

70
 I.Introducción

degradación proteica y la acción enzimática, están íntimamente relacionados con la

incidencia de carnes pálidas, blandas y exudativas (PSE, del inglés ‘pale, soft and
exudative’) así como de carnes oscuras, firmes y secas (DFD, del inglés ‘dark, firm and
dry’). Una rápida acidificación causada por un metabolismo muscular acelerado en
cerdos susceptibles a estrés daría lugar a carnes PSE, mientras que un reducido
contenido de glucógeno antemortem mantendría el pH cercano a la neutralidad, dando
lugar a carnes DFD (Batlle et al., 2000; Scheffler & Gerrard, 2007). Los defectos de
calidad de estos tipos de carnes están íntimamente relacionados con su CRA, disminuida
en el caso de las carnes PSE (pérdidas de exudado de hasta un 10% del peso) e
incrementada en el caso de la DFD. En ambos casos, su destino industrial está
condicionado, tanto por su aptitud tecnológica como por su conservación. Así, por
ejemplo, la carne PSE no resulta apropiada, por su escasa capacidad de retención de
agua, para la elaboración de jamón cocido ni para elaborar jamón curado (Arnau et al.,
1995). En cambio, la carne DFD es apropiada para productos del tipo emulsión cárnica
(mortadelas y salchichas) y jamones cocidos, pero tampoco es aconsejable para fabricar
jamón curado (especialmente peligroso en el caso de jamones con hueso) debido a su
poca difusión de sal y su fácil alteración microbiana (Arnau et al., 1998).

I.4.2. DEFINICIÓN DE DERIVADOS CÁRNICOS

El Real Decreto (R.D.) 474/2014, de 13 de junio, por el que se aprueba la norma de

calidad de derivados cárnicos, los define como “los productos alimenticios preparados
total o parcialmente con carnes o menudencias de las especies domésticas bovina,
porcina, ovina, caprina, aves de corral, lagomorfos y especies de caza silvestre”. Este R.D.
establece su clasificación en función del tratamiento al que han sido sometidos, y
describe sus características de composición, calidad y etiquetado. Esta normativa
clasifica a los derivados cárnicos según se obtengan de piezas cárnicas enteras (jamón
curado) o carnes picadas (embutidos crudos curados).

Según el citado R.D., los productos objeto de la presente Tesis Doctoral (jamón,
chorizo y salchichón curados) se incluyen en el grupo de derivados cárnicos no tratados
por calor, curado-madurados. Integran este grupo los productos sometidos a procesos
tecnológicos no térmicos, de salazón y de curado-maduración, suficiente para

71
 I.Introducción

conferirles las características organolépticas propias y de estabilidad a temperatura

ambiente, pudiendo someterse opcionalmente a fermentación y ahumado.

I.4.3. JAMÓN CURADO

I.4.3.1. Definición

Es el producto elaborado con la extremidad posterior del cerdo que se ha sometido,

con carácter general, a un proceso de salazón, acompañado eventualmente de adición
de especias, condimentos y aditivos, lavado, reposo o postsalado, maduración y secado
durante el tiempo suficiente para conferirle las características organolépticas propias
(R.D. 474/2014).

El pernil es la pieza anatómica que se obtiene de la canal porcina después de

seccionar la sínfisis isquiopubiana (Figura I.29).

Figura I.29. Representación de las principales partes de un pernil de cerdo.

Anatómicamente, se compone de los huesos coxal, fémur, tibia, peroné, tarso,

metatarso y falanges; las masas musculares correspondientes a los músculos bíceps
femoral, semitendinoso, tensor de la fascia lata, glúteo superficial, glúteo medio, glúteo
profundo, obturador interno, gemelos, aductor, gracilis, pectíneo, iliopsoas, cuádriceps
femoral, sartorio, poplíteo, gastronemio y sóleo; la grasa de cobertura y la piel (Olmos,
2006).

I.4.3.2. Tipos de jamones curados en España

La mayoría de jamones curados que se elaboran en España proceden de cerdos

blancos alimentados con piensos concentrados comerciales y criados en explotaciones

72
 I.Introducción

intensivas. Estos animales están vinculados a los genotipos más empleados

industrialmente, como Large White, Pietrain, Landrace o de sus cruces. En general, los
cerdos se sacrifican a los 5-6 meses de edad, cuando han alcanzado 100-120 Kg de peso.
Por el contrario, los cerdos ibéricos se crían mediante un sistema tradicional en
explotaciones extensivas; los animales se sacrifican con 18-24 meses de edad debido a
su lento crecimiento. Este proceder influye notablemente en la calidad de la carne y en
el grado de engrasamiento, que se manifiesta fundamentalmente durante los últimos
cuatro meses del período de cebo.

No todos los jamones curados de cerdo blanco producidos en España son iguales, ya
que sus características dependen de diversos factores relativos al animal, tipo de
crianza, alimentación, edad de sacrificio y proceso de elaboración. Estos factores
proporcionan al producto final unas características físicas y sensoriales peculiares y
diferenciales.

La Unión Europea despliega una política que favorece la producción de calidad

garantizada que refrenda mediante el etiquetado de los productos con Denominación
de Origen Protegida (D.O.P.), Indicación Geográfica Protegida (I.G.P.) y Especialidad
Tradicional Garantizada (E.T.G.). En este contexto cabe mencionar:

▪ Jamón serrano (E.T.G.)

▪ Dehesa de Extremadura, Guijuelo, Jamón de Huelva y Jamón de Teruel

(D.O.P.)

I.4.3.3. Proceso de elaboración

La producción de jamón curado comprende una serie de etapas que se detallan a

continuación (Ventanas, 2001) (Figura I.30).

73
 I.Introducción

Figura I.30. Principales etapas en la elaboración de jamón curado.

I.4.3.3.1. Selección del pernil

Se basa en factores extrínsecos (genética del animal, edad y peso al sacrificio, sexo,
alimentación y sistemas de explotación) e intrínsecos (fundamentalmente CRA,
contenido de grasa y evolución del pH después del sacrificio). Como se mencionó en el
apartado I.3.1., el seguimiento de la evolución del pH durante el proceso postmortem
de la canal (en este caso, en especial del pernil) es de especial relevancia, con el fin de
evitar el uso tanto de carnes DFD como PSE. En el primer caso, su gran CRA serían un
obstáculo para una correcta hidratación y penetración de la sal (Toldrá, 2006). En el caso
de las carnes PSE, hay riesgo de producirse elevadas pérdidas por secado, mayor
absorción de sal, color pálido y escaso aroma (Arnau et al., 1995).

I.4.3.3.2. Preparación y acondicionamiento de la materia prima

En primer lugar, se realiza el perfilado del pernil, que consiste en la eliminación de
porciones de músculo, grasa y piel, para conferir a las piezas las proporciones y
características típicas de la conformación de los diferentes tipos de jamones.
Posteriormente, se lleva a cabo el sangrado, en el que se procura la evacuación
mediante presión manual o mecánica, de restos de sangre remanentes en la
musculatura, con el fin de minimizar la posible alteración microbiológica.

I.4.3.3.3. Salado
Esta etapa consiste en la incorporación de las denominadas sales del curado,
compuestas por cloruro sódico, sales nitrificantes (nitratos y nitritos) y coadyuvantes del
curado (azúcares y ascorbatos). La finalidad de esta operación es potenciar el sabor,
crear condiciones desfavorables para la multiplicación de la microbiota alterante y

74
 I.Introducción

patógena y regular las actividades bioquímicas que acaecen durante la maduración. El

empleo de dichas sales del curado es común en el proceso de elaboración de distintos
productos madurados, como los embutidos curados, que se abordan a continuación. Los
detalles sobre la funcionalidad de estas sales se contemplan en el apartado I.4.4.3.2. de
esta memoria.

Los perniles están en contacto directo con las sales durante un tiempo que varía en
función de su tamaño. En la actualidad, la relación suele ser de 0,7 día/kg de peso. La
temperatura durante el salado puede considerarse como un factor regulador de la
duración del mismo. En las instalaciones actuales, se mantiene siempre por encima de
1 oC, para que no cristalice el agua, y por debajo de 3 oC, para impedir el crecimiento de
Clostridium botulinun. La humedad relativa de las cámaras de salado se mantiene en
torno a 90%, o incluso superior, para impedir en la medida de lo posible, la evaporación
del agua que, por ósmosis, afloraría desde el interior de los perniles.

I.4.3.3.4. Reposo o post-salado

Después del salado, debe eliminarse el exceso de sal e impurezas que se encuentran
en la superficie. Para ello, las piezas se lavan con agua fría, se cepillan y se colocan en
cámaras para escurrirlas donde seguidamente se someten a un masaje mediante
presión de las masas musculares laterales para desplazarlas hacia el centro y darles la
forma adecuada. Posteriormente, se trasladan a una cámara de post-salado refrigeradas
(24 °C), haciendo descender la humedad relativa desde el 85 hasta el 75%. En estas
cámaras permanecen entre 1 y 3 meses, produciéndose una merma en peso del 10-12%,
que conlleva un descenso de la actividad del agua (aw) hasta valores inferiores a 0,96-
0,92. En esta fase, se alcanza lo que se conoce como asentamiento de las piezas, que
corresponde a una distribución homogénea de las sales del curado en todo el pernil.

I.4.3.3.5. Secado-maduración
Esta fase es la más larga del proceso, aunque su duración es variable, desde meses
en los cerdos de raza blanca hasta más de un año en los cerdos ibéricos, y es crucial para
el desarrollo del sabor y aroma merced a reacciones de degradación (proteólisis,
lipólisis, y oxidaciones) y síntesis (generación de moléculas sápidas de bajo peso
molecular y volátiles). Además, en esta etapa se estabiliza el color y se produce una

75
 I.Introducción

deshidratación adicional que asegura la estabilización del jamón. El secado se lleva a

cabo en secaderos industriales y/o bodegas y se caracteriza por desarrollarse a una
temperatura más elevada y una humedad relativa más baja que las fases anteriores. Las
variaciones de temperatura y humedad se producen de forma suave y paulatina,
considerando que la temperatura oscila desde los 7‐9 °C hasta los 28‐30 °C y la humedad
relativa se reduce hasta un 85%. Al tener una temperatura más elevada, la grasa se
funde e impregna las fibras musculares e incluso puede llegar a enmascarar la identidad
del miosistema, lo que se conoce como sudado del jamón. El periodo en el que se alcanza
la temperatura máxima se denomina estufaje. Transcurrido este periodo, el jamón se
somete a un proceso de afinado en bodega para favorecer las reacciones que dan lugar
a los compuestos responsables de las características organolépticas del producto
acabado.

I.4.4. EMBUTIDOS CÁRNICOS

I.4.4.1. Definición

Los embutidos son derivados cárnicos, generalmente constituidos por carne picada,
contenidos en una tripa o envoltura artificial (R.D. 474/2014).

Dentro de este grupo, los chorizos y salchichones son derivados cárnicos constituidos
por trozos de carne y grasa no identificables anatómicamente que, con carácter general
y no limitativo, se han sometido a un proceso de picado más o menos intenso, mezclados
con especias, ingredientes, condimentos y aditivos, embutidos en tripas naturales o
envolturas artificiales, y sometidos a un proceso de salazón seguido de curado-
maduración, acompañado de fermentación, suficiente para conferirles las
características organolépticas propias y su estabilidad a temperatura ambiente. Se les
añade pimentón, a los chorizos, y pimienta, a los salchichones, como ingrediente
caracterizante (R.D. 474/2014).

I.4.4.2. Tipos de chorizos y salchichones

Los chorizos y los salchichones tienen un origen primitivo ya que están

estrechamente ligados a la matanza del cerdo, una de las tradiciones gastronómicas,

76
 I.Introducción

festivas, culturales y hasta religiosas con más tradición en las sociedades rurales,
mediante la cual, las familias se abastecían de una reserva de carne para todo el año.
Por ello, son derivados cárnicos cuya producción está muy extendida por el territorio
nacional y casi todas las Comunidades Autónomas tienen sus embutidos característicos.

Hay múltiples tipos de chorizos y salchichones dependiendo de la carne utilizada en

su elaboración, de las especias añadidas, de la zona de curación, de su forma de atado,
de su medida o peso, etc. Según la carne de cerdo utilizada, los chorizos y salchichones
se clasifican en:

▪ Ibérico de Bellota: elaborado a partir de carne de cerdo ibérico de Bellota.

▪ Ibérico: elaborado con carne de cerdo ibérico.

▪ Casero tradicional: elaborado con carne de cerdo blanco.

Como ocurre con el jamón curado, distintos chorizos y salchichones son productos
con marca de calidad garantizada, destacando las I.G.P.:

▪ Chorizo de Cantimpalo

▪ Chorizo Riojano

▪ Salchichón de Vic

I.4.4.3. Proceso de elaboración

La elaboración de un embutido fermentado de calidad requiere un proceso

fermentativo en el que se produce un descenso del pH y una etapa de maduración en la
que se desarrollan el aroma y textura típicos como consecuencia de los numerosos
procesos químicos y enzimáticos que tienen lugar. También es imprescindible la
subsiguiente fase de desecación, ya que en ella se produce una reducción de la aw que,
en combinación con la disminución del pH, hace que el embutido adquiera su capacidad
de conservación, además de la consistencia adecuada (Ordóñez et al., 1999).

A continuación, se detallan las principales etapas que comprende la elaboración de

embutidos crudos curados (Órdoñez & de la Hoz, 2001) (Figura I.31).

77
 I.Introducción

I.4.4.3.1. Picado de la carne y la grasa

La carne que se utiliza normalmente para la elaboración de estos productos es de
cerdo, ternera y/o pollo. Debe estar libre de coágulos de sangre y con un valor de pH
entre 5,6-6,2, no siendo aconsejable utilizar carnes DFD ni PSE, como se mencionó en el
apartad I.3.1. Generalmente suele utilizarse grasa animal y preferentemente de cerdo.
Es conveniente seleccionar grasa con alto grado de saturación para prevenir los defectos
de enranciamiento, por lo que es recomendable emplear grasas de depósito dorsal o de
panceta. El picado puede realizarse en una picadora o en una cutter (si se desea un
picado más fino) y para evitar fenómenos de embarrado es aconsejable que se lleve a
cabo a una temperatura de 0 oC o incluso menor.

Figura I.31. Principales etapas en la elaboración de embutidos curados.

I.4.4.3.2. Mezclado con el resto de ingredientes y aditivos

Además de la carne y la grasa, los embutidos curados contienen una serie de aditivos
que cumplen diversas funciones durante el proceso de elaboración y que contribuyen a
las características del producto final. Como se abordó en el apartado I.4.3.3.3. de esta
memoria, los aditivos contemplados en este punto se emplean también en la
elaboración de jamón curado, por lo que se tratan aquí como ingredientes comunes,
haciendo hincapié en las particularidades y diferencias de cada proceso de elaboración.

I.4.4.3.2.1. Sal común

Además de mejorar el sabor, su importancia tecnológica radica en su influencia sobre
múltiples reacciones de los procesos de maduración y desecación. Además, contribuye
a la reducción de la aw y restringen las condiciones de desarrollo de algunos
microorganismos patógenos o alterantes. La sal ejerce un papel primordial en la CRA y

78
 I.Introducción

la ligazón de la masa, ya que interviene en la solubilización de las proteínas cárnicas, que

permitirá la formación de un gel estable y consistente (Lucke, 1998).

I.4.4.3.2.1.1. Efecto de la sal en la CRA

La CRA se define como la capacidad que tiene la carne para retener el agua libre
durante la aplicación de fuerzas externas, tales como el corte, la trituración y el
prensado. Muchas de las propiedades físicas de la carne como el color, la textura y la
firmeza de la carne cruda, así como la jugosidad y la suavidad de la carne procesada,
dependen en parte de la CRA. Esta propiedad es particularmente importante en
productos picados o molidos, en los cuales se ha perdido la integridad de la fibra
muscular y, por tanto, no existe una retención física del agua libre por la estructura
celular.

Figura I.32. Efecto de la adición de sal sobre la CRA (Albarracín et al., 2011). PI: punto isoeléctrico.

El aumento de la CRA de las proteínas cárnicas por efecto de la adición de sal se

atribuye a la unión preferencial del anión Cl- por las moléculas proteicas. Como se
observa en la Figura I.32, por encima del punto isoeléctrico de las proteínas miofibrilares
(pH>PI), esta unión incrementa la carga neta negativa y aparecen fuerzas de repulsión
que permiten una absorción de agua adicional por parte de la red proteica. En contraste,
a pH inferiores al punto isoeléctrico (pH<PI), la carga positiva de las proteínas es

79
 I.Introducción

neutraliza por los aniones Cl-, cerrando los espacios interproteicos y, por tanto,
reduciendo la CRA (Albarracín et al., 2011) (Figura I.32).

I.4.2.4.3.2.1.2. Difusión
Este proceso es especialmente importante en derivados cárnicos elaborados a partir
de piezas musculares enteras, como el jamón curado, en cuya elaboración la etapa de
salado es fundamental para el desarrollo de las características del producto final. En
estos casos, la mayoría de estudios realizados muestran que el movimiento de la sal en
el interior de las piezas cárnicas se produce mediante fenómenos de difusión (Gou &
Comaposada, 2000), influenciados por la diferencia de concentraciones entre el exterior
y la superficie, y por el área de carne que permanece en contacto con la sal (Carrasco,
2001).

En las piezas cárnicas, el proceso de difusión será diferente según las características
de la zona de la carne por la que la sal penetra. El cloruro sódico difunde a través de la
fase acuosa líquida del músculo (Gou & Comaposada, 2000), pero en alimentos
sometidos a procesos de secado esta fase no permanece inmóvil, sino que se mueve
hacia el exterior y va arrastrando la sal en sentido opuesto al del agua. Otro factor
implicado en la penetración de la sal al interior del producto es el contenido en materia
seca del músculo y su composición, que van a determinar tanto la cantidad, como el
recorrido de la sal, e incluso va a actuar directamente sobre ella, fijándola a la estructura
de la proteína.

En el caso de la elaboración de productos embutidos, los fenómenos anteriores no

proceden. En la carne picada, la estructura miofibrilar esta interrumpida y presenta un
elevado desarrollo superficial que facilita la mezcla con la sal, que será incorporada en
un reducido porcentaje (3-4%, dependiendo de la formulación). En el trabajo de mezcla,
la sal se incorpora de forma homogénea con los componentes de la carne.

I.4.4.3.2.2. Nitratos y nitritos

El compuesto activo de las sales de curación es el nitrito, añadido directamente o
proveniente de la reducción de nitrato. El principal objetivo de la adición de nitratos y
nitritos a los productos curados es la inhibición de microorganismos indeseables como

80
 I.Introducción

Clostridium botulinum. Además, contribuye a la formación del color característico del

curado (por formación del complejo nitrosomioglobina) al desarrollo del aroma, por
reacción de varios componentes de la carne con el nitrito o el óxido nítrico, y a previene
la oxidación de los componentes lipídicos. A pesar de todos sus efectos positivos en el
proceso tecnológico, hay que considerar que el uso de estos aditivos conlleva un riesgo
de formación de N-nitrosaminas, compuestos que pueden resultar altamente tóxicas.
Estas sustancias se forman como resultado de la reacción del nitrito con aminas
secundarias. Debido a su toxicidad, los niveles permitidos de nitratos y nitritos han sido
reducidos en los últimos años. Las cantidades legalmente permitidas en España son 150
ppm para los nitritos y 300 ppm para los nitratos. Además, las cantidades residuales de
nitritos y nitratos en el producto final no deben superar las 50 y 250 ppm,
respectivamente (R. D. 142/2002).

I.4.4.3.2.3. Azúcares
Los azúcares fermentables (glucosa o sacarosa), se adicionan como sustrato
energético de los microorganismos que intervienen en el proceso de acidificación. El
descenso de pH puede ser más o menos pronunciado según el tipo y la cantidad de
azúcar adicionado. La glucosa es asimilada rápidamente por casi todos los
microorganismos, pero también se utilizan lactosa, sacarosa u otros azúcares menos
asimilables como el almidón o dextrinas para regular la velocidad de la acidificación
(Lücke, 1998). El descenso de pH tiene varios efectos beneficiosos, entre los que cabe
mencionar:

▪ reduce la CRA, favoreciendo la deshidratación del producto,

▪ inhibe el desarrollo de microorganismos patógenos y proteolíticos que

pueden entorpecer el proceso de maduración,

▪ interviene en el proceso de enrojecimiento, favoreciendo la reducción del

nitrito a óxido nítrico,

▪ facilita la gelificación de las proteínas cárnicas, garantizando la correcta

ligazón y consistencia del producto.

81
 I.Introducción

I.3.4.3.2.4. Ascorbato
Es una sustancia antioxidante y coadyuvante del proceso de curado que ayuda a
disminuir la cantidad de nitrito residual puesto que favorece su transformación a óxido
nítrico con lo que, además, mejora la formación y estabilización del color. La legislación
española, R. D. 142/2002, permite la adición de ácido L-ascórbico o ascorbato sódico en
dosis quantum satis, habitualmente 0,5 g/Kg.

I.3.4.3.2.5. Especias
Son ingredientes vegetales con carácter aromático que se utilizan habitualmente en
pequeñas cantidades para conferir determinados sabores, aromas y colores a los
productos cárnicos. Además de sus propiedades aromáticas, muchas especias son
antioxidantes y antimicrobianas. Su empleo varía según el tipo de producto, pero, en
general, las más utilizadas son: pimentón, ajo, clavo, nuez moscada, cilantro, cebolla,
orégano, pimienta y tomillo.

I.3.4.3.2.6. Cultivos iniciadores

Los microorganismos desempeñan un papel decisivo en la fabricación de embutidos
fermentados, ya que están directamente implicados en la reducción de nitratos a
nitritos, el descenso del pH, la formación del aroma, la estabilidad del color y la
capacidad de conservación del producto. Si la materia prima es de buena calidad
higiénica y se mantienen las condiciones adecuadas se pueden fabricar embutidos
tradicionales de excelente calidad. Sin embargo, no todos los microorganismos
presentes en las materias primas contribuyen a la maduración prevista, y algunos de
ellos pueden derivarla hacia una dirección indeseable. Para corregir posibles defectos
en la maduración del producto se suele optar por utilizar cultivos de microorganismos
seleccionados (cultivo iniciador o starters). De esta forma la industria cárnica pretende
asegurar una producción homogénea, estabilizada y segura.

Como microbiota natural de la carne fresca o como cultivo iniciador, es

especialmente importante la presencia de bacterias ácido-lácticas (BAL, como
Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus) que crece rápidamente durante la
fermentación (108-109 u.f.c./g) y se mantiene prácticamente estables hasta el final del
secado. Esta microbiota juega un papel esencial en la calidad de los productos

82
 I.Introducción

fermentados. A través de la acidificación del medio contribuye a la estabilización del

color y mejora de la textura (Ordóñez et al., 1999). Además, inhibe el desarrollo de la
microbiota acompañante que normalmente llega a la masa del embutido procedente de
la materia prima o en el transcurso de la fabricación (Fernández et al., 2000). La
presencia o la adición de cultivos iniciadores que contengan además bacterias
pertenecientes a la familia Micrococcaceae (Kocuria varians, Staphylococcus carnosus y
xylosus) es muy importante por su actividad nitrato reductasa que es la responsable de
la reducción del nitrato a nitrito, contribuye a la reducción del nitrito residual y poseen
actividad catalasa para la protección del color y prevención de la rancidez. Los mohos
(Penicillium) que se añaden sobre la superficie de la tripa de los embutidos metabolizan
los ácidos orgánicos y ejercen desaminación oxidativa de los aminoácidos produciendo
amonio que eleva el pH de los embutidos y potencia el aroma y sabor típicos (Ordóñez
et al., 1999).

En el proceso de elaboración de embutidos, las especias, los aditivos, el azúcar y la

sal suelen agregarse a la masa básica de carne y grasa picadas y la mezcla obtenida se
homogeneiza para distribuir adecuadamente estos componentes. En caso de que se
utilicen cultivos iniciadores, se añaden al final del proceso, cuando el resto de
ingredientes forman ya una masa uniforme. Tras su adición se continúa con el amasado
para que la distribución de los microorganismos sea homogénea en toda la mezcla. La
masa cárnica ya elaborada se deja reposar en refrigeración durante 18-24 horas,
después de lo cual se embute.

I.4.4.3.3. Embutido
Tras mezclar todos los ingredientes, se procede a embutir o introducir la masa en las
tripas para constituir las piezas del producto cárnico. Las tripas pueden ser naturales o
artificiales. Las tripas naturales se han utilizado tradicionalmente empleando tracto
intestinal de ovino, porcino y vacuno. Sin embargo, el proceso de obtención y
preparación de la tripa es muy laborioso por lo que son más costosas que las artificiales
y generalmente sólo se utilizan para productos de mayor calidad como el lomo
embutido. Las tripas artificiales de celulosa o colágeno son las más empleadas.

83
 I.Introducción

Para llevar a cabo esta operación, la industria suele utilizar embutidoras continuas a
vacío que evitan la presencia de aire en la masa, reduciendo considerablemente la
posibilidad de que aparezcan defectos de aspecto y consistencia en el producto. Durante
la operación de embutido es recomendable que la temperatura de la masa cárnica no
sea superior a 1 o 2 oC para evitar fenómenos de embarrado, es decir, un
desprendimiento excesivo de grasa por rotura de adipocitos, lo cual confiere a la pasta
un aspecto pálido y grasiento.

I.4.4.3.4. Fermentación
Los embutidos se cuelgan a continuación en cámaras expuestos al aire con o sin
sistemas de control de la temperatura y humedad relativa (HR). En este proceso, la
temperatura puede variar entre 12 y 25 oC, y la HR se mantiene en el intervalo 90-95%
durante un periodo de tiempo que puede oscilar entre 24 y 72 horas.

La microbiota inicial, sin considerar la adición de cultivos iniciadores, suele ser muy
variada y similar a la presente en la carne fresca, incluyendo lactobacilos, micrococos,
enterobacterias, Pseudomonas spp, Achromobacter spp., Flavobacterium spp, Bacillus
spp., etc., hongos y levaduras (Ordoñez et al., 1999). Sin embargo, la conjunción de
diversos factores como la adición de las sales del curado, la reducción de la aw, los
efectos inhibitorios de nitratos y la baja tensión de oxígeno, favorece el establecimiento
de las condiciones óptimas para la inhibición del crecimiento de microorganismos
alterantes (psedomonas principalmente) y favorece el desarrollo de los deseables, de
manera que en los embutidos elaborados de forma tradicional, sin adición de cultivos
iniciadores, la microbiota típica está constituida por BAL y Micrococcaceae (Ordoñez et
al., 1999).

Como se ha introducido en el apartado I.4.4.3.2.6., las BAL, especialmente el género

Lactobacillus, son responsables de la producción de ácido láctico como producto de la
fermentación de carbohidratos (Caplice & Fitzgerald, 1999). Se produce así un descenso
del pH hasta valores próximos a 5,0, es decir, alrededor del punto isoeléctrico de las
proteínas miofibrilares (Totosaus et al., 2002), con la consiguiente reducción de la CRA
de la masa y facilitándose el secado posterior. Además, se promueve la coagulación de
las proteínas cárnicas que aportará firmeza al producto final (Ordóñez et al., 1999).

84
 I.Introducción

Junto con la fermentación de azúcares, las proteínas miofibrilares, actina y miosina,

empiezan a ser degradadas a péptidos, lo que se traduce en un aumento del nitrógeno
no proteico. Las principales responsables de esta degradación son las proteasas
musculares, fundamentalmente la catepsina D (Toldrá et al., 1996). Al mismo tiempo, se
inicia la hidrólisis lipídica o lipólisis, fenómeno que se debe tanto a la presencia de lipasas
microbianas, como de lipasas endógenas de la carne (Ordoñez et al., 1999).

I.4.4.3.5. Curado
Una vez finalizada la etapa de fermentación, los embutidos pasan por una etapa de
curado, donde empieza el proceso de maduración y, simultáneamente, el secado del
producto. Esta etapa implica el mantenimiento de los embutidos durante periodos de
tiempo variables en condiciones de Hr y temperatura controladas (Chang et al., 1996).
Los procedimientos más habituales suelen consistir en 5-10 días a 18-22 oC y HR entre
el 80-90% y, posteriormente, se mantienen a 12-15 oC y una HR del 65-80% (Ordóñez &
de la Hoz, 2001). La duración de este último periodo del curado es variable, en función
de la clase de producto y su diámetro, pero suele oscilar entre unos 15 (curado rápido)
y 90 (proceso tradicional) días (Flores, 1997).

La deshidratación es un requisito esencial para conseguir la firmeza final de la masa

del embutido. Tras la fermentación, la masa coagulada es todavía inestable y está
debilitada por una capa intermedia de moléculas de agua. Para lograr la firmeza final de
la masa, las moléculas de agua inmovilizadas en los espacios entre los agregados de
proteínas deben liberarse (Chang et al., 1996). Esto se consigue procurando la
deshidratación progresiva del producto mediante el ajuste y control de las condiciones
de secado de la cámara de maduración.

Paralelamente a la deshidratación se producen fenómenos asociados a la maduración

del producto. La proteólisis, iniciada durante la fermentación, continúa ahora con la
actuación de las exopeptidasas, tanto endógenas como de origen microbiano, que
liberan pequeños péptidos y aminoácidos libres (Molly et al., 1997). Además, la fracción
de nitrógeno no proteico se enriquece con el amonio procedente del metabolismo
microbiano de los aminoácidos (Ordóñez et al., 1999), provocando un ligero aumento
del pH. Este incremento en el nitrógeno no proteico y, en particular, en los aminoácidos

85
 I.Introducción

libres, contribuye, tanto al sabor y al aroma del producto final, como a su desecación,
pues acelera la pérdida de agua (DeMasi et al., 1990).

Por otra parte, la lipólisis también continúa en la fase de maduración. Los ácidos
grasos libres generados sufren diversas actividades oxidativas que conducen a la
aparición de sustancias volátiles y no volátiles que contribuyen al sabor y aroma del
embutido. Por último, cabe destacar que, durante esta fase, tiene lugar la completa
reducción del nitrito residual (Incze, 1992).

La producción de la amplia variedad de embutidos crudos curados fermentados que

existe en el mercado es posible por la aplicación de una tecnología de fabricación flexible
que permite modificaciones siempre que se mantengan las reducciones adecuadas de
pH y aw. Las diferencias se basan fundamentalmente en la realización de una
fermentación más o menos rápida, en función de la adición o no de azúcares, el uso de
cultivos iniciadores y algunos otros aditivos (Ordóñez et al., 1999).

I.4.5. EVOLUCIÓN DE LOS PRODUCTOS CÁRNICOS CURADOS DURANTE LA ETAPA DE

SECADO-MADURACIÓN

Con independencia del producto cárnico considerado, durante la etapa de secado-

maduración tiene lugar la estabilización de las piezas cárnicas. Tanto la oxidación lipídica
como las reacciones proteolíticas y lipolíticas, entre otras, constituyen el conjunto de
fenómenos madurativos que modifican la composición y determinan la calidad final del
producto, dando como resultado las características sensoriales típicas y altamente
apreciadas de los productos curados, como el jamón y los embutidos. Seguidamente se
analizan brevemente los principales cambios que se producen durante la etapa de
secado-maduración.

I.4.5.1. Parámetros fisicoquímicos

I.4.5.1.1. Humedad y actividad de agua

Como se ha mencionado, durante el proceso de elaboración de los productos curados
se produce una progresiva disminución de su contenido acuoso y consecuentemente un
descenso paralelo de la aw, este último potenciado además por la absorción de las sales.

86
 I.Introducción

La pérdida de humedad se produce mediante un fenómeno de difusión del agua

desde el interior del producto a la superficie y posterior evaporación superficial. Suele
ser más notable en las etapas previas a la maduración, ya que las condiciones
termohigrométricas van a ser más suaves a medida que avanza el proceso de
elaboración. A ello se suma una superficie más seca del producto, lo que va a ocasionar
que la pérdida de humedad sea menor durante las últimas etapas del procesado. Por
otra parte, la pérdida de agua durante el secado tiene lugar a través de la superficie del
producto de forma que el tiempo de secado estará directamente relacionado con la
superficie que esté en contacto con el aire. En la velocidad de secado también
intervienen otros factores como la humedad del aire exterior, la humedad del producto
y la transmisión de calor, que será fundamental para que tenga lugar la evaporación del
agua.

En cualquier caso, la velocidad de deshidratación debe adecuarse a las características

del producto en las distintas etapas del proceso de elaboración (Prieto & Carballo, 1997)
para evitar la aparición de defectos. Cuando es muy lenta, se incrementa el riesgo de
proliferación microbiana en la superficie del producto, con la consiguiente aparición de
limosidad y desarrollo de signos de putrefacción. Por el contrario, si la velocidad es muy
rápida, se potencia la formación de una corteza superficial e impermeable al agua, que
impedirá la salida de humedad desde el interior del producto, dando lugar a procesos
de putrefacción profunda. Este fenómeno es conocido como encostramiento (Prieto &
Carballo, 1997).

I.4.5.1.2. Desarrollo del color

El color de la carne depende de varios factores como son la concentración y la forma
química de los pigmentos musculares, así como de la tasa de caída del pH y su valor final.
En el caso de productos cárnicos curados, otro factor que influye en el desarrollo del
color es la adición de sales nitrificantes durante el procesado.

Uno de los efectos más importantes que tiene el nitrito en los productos cárnicos
crudos curados es la formación del color típico. Este proceso tiene lugar a través de una
secuencia compleja de reacciones que conducen a la formación de nitrosomioglobina,
que imparte el característico color rojo violáceo a estos productos (Figura I.33).

87
 I.Introducción

Figura I.33. Grupo hemo de la mioglobina (izquierda) y esquema de las reacciones del curado para la formación del
color (derecha). MbFe2+, mioglobina nativa; MbFe2+O2, oximioglobina; MMbFe3+, metamioglobina; MbFe2+NO,
nitrosomioglobina; AR, agentes reductores. Adaptado de: Skibsted, 1992.

La molécula de mioglobina está constituida por una proteína, la globina, y un grupo

hemo formado por cuatro anillos de pirrol y un núcleo de hierro central, cuya función es
la de contener el oxígeno. Este hierro se une, por cuatro enlaces, a los átomos de
nitrógeno de los anillos pirrólicos; la posición quinta está unida al átomo de nitrógeno
del grupo imidazol de la globina y, la sexta posición de coordinación queda lista para
unirse a cualquier molécula (O2, CO, NO, etc.) que presente la configuración electrónica
adecuada. La naturaleza de este sexto ligando y el estado de oxidación del hierro van a
ser los que determinen el color de la carne.

Si la sexta posición de coordinación está vacía y el hierro aparece en forma reducida,

el color de la carne será rojo púrpura (mioglobina); si está ocupada por oxígeno, la
mioglobina estará oxigenada (oximioglobina) presentando un color rojo anaranjado, y si
en la sexta posición se aloja el agua y el hierro se encuentra en estado férrico, la
mioglobina está oxidada (metamioglobina), adquiriendo la carne un color pardo. La
oximioglobina es el pigmento dominante en la superficie de la carne fresca, dada su
exposición al oxígeno. Las sales de curado comerciales contienen, además de cloruro
sódico, una mezcla de nitrito sódico y nitrato potásico que, tras la acción de
microorganismos, se reducen dando lugar al compuesto activo, el óxido nítrico. Este
compuesto se va a unir al grupo hemo de la mioglobina, dando lugar al pigmento
responsable de la coloración típica de productos curados, la nitrosomioglobina (Honikel,
2008; Skibsted, 2011).

88
 I.Introducción

En general, la adición de tan solo 40-50 mg/kg de nitrito permite el correcto

desarrollo del color en los productos curados (Froehlich et al., 1983). Si no se adicionan
nitratos y nitritos durante la elaboración de los productos cárnicos no tiene lugar la
formación del pigmento característico (Pichner et al., 2006).

I.4.5.2. Fracción proteica

Además de las modificaciones post-mortem que se producen en las proteínas de la

carne, durante la etapa de maduración de productos cárnicos curados, las proteínas y
los compuestos nitrogenados van a verse afectados por una serie de transformaciones,
que van a tener como resultado un aumento progresivo de la fracción nitrogenada no
proteica (NNP). Por ello, al inicio de la etapa de maduración, predominarán los péptidos,
mientras que, los aminoácidos libres serán más abundantes al final del proceso. Este
fenómeno, junto con la lipólisis, va a determinar las características de textura, sabor y
aroma del derivado cárnico.

I.4.5.2.1. Evolución de las fracciones nitrogenadas

Tanto las proteínas sarcoplásmicas como las miofibrilares experimentan, durante la
maduración de los productos cárnicos curados, un proceso de desnaturalización e
hidrólisis, que se manifiesta en un descenso de la cantidad de proteína y un aumento de
la concentración de nitrógeno no proteico (péptidos de diferentes tamaños,
aminoácidos y otros compuestos de degradación) (Toldrá et al., 1993; Córdoba et al.,
1994). En jamón Ibérico al final de la maduración, se han descrito tasas de
transformación de nitrógeno proteico en nitrógeno no proteico del orden del 25 al 27%
(Ventanas, 2001). La medida de este parámetro puede ser útil para determinar el grado
de proteólisis del proceso.

La evolución del contenido y composición del NNP va a estar condicionada tanto por
la variación de temperatura, como por el grado de secado del producto. El incremento
de la concentración se verá favorecido en las fases en las que la temperatura sea mayor.
Sin embargo, a la vez que el aumento de temperatura favorece la proteólisis, también
va a favorecer la desecación del producto, circunstancia en la que se verá disminuida la
actividad enzimática (Sánchez-Molinero & Arnau, 2010).

89
 I.Introducción

En la etapa inicial de maduración, el nitrógeno peptídico (NP) representará la mayor

parte del NNP. Al aumentar la temperatura en la fase de secado, el contenido en NP
aumentará más lentamente pues, en estas condiciones, se va a ver más favorecida la
hidrólisis de péptidos hacia aminoácidos libres, que la propia generación de péptidos
(Ordóñez et al., 1999). Lo mismo ocurrirá en las últimas etapas, en las que la cantidad
de NP puede llegar a disminuir al quedar inhibida la actividad de determinadas proteasas
y, por lo tanto, los aminoácidos libres al final de la fase de maduración pueden llegar a
sustituir a los péptidos como principal fracción del NNP (Toldrá, 2006). En esta etapa
final, los aminoácidos libres lisina, alanina y ácido glutámico han sido descritos como
aminoácidos mayoritarios de la fracción amininoacídica (NA) de productos cárnicos
curados, como el jamón, al final del proceso de maduración (Jurado et al., 2007).

I.4.5.2.2. Proteólisis
La proteólisis es un fenómeno de naturaleza enzimática, que consiste en la actuación
sucesiva de distintas enzimas proteolíticas sobre las proteínas cárnicas (Figura I.34).

Figura I.34. Esquema general de la proteólisis en productos cárnicos curados (Toldrá, 2006).

Las principales enzimas musculares que se asocian con la hidrólisis de las proteínas
son endoproteasas y exopeptidasas (Toldrá & Aristoy, 2010). A la acción hidrolítica de
las enzimas musculares hay que sumar la actividad proteolítica de los microorganismos
presentes en los productos curados, especialmente de las BAL. Aunque se desconoce el
papel que las enzimas proteolíticas juegan en el desarrollo del flavor de los productos
madurados, sí está claro que contribuyen a los cambios proteolíticos que suceden

90
 I.Introducción

durante la maduración, sobre todo durante los primeros días, cuando dichas bacterias
hidrolizan proteínas a péptidos y aminoácidos para su utilización (Ordóñez et al., 1999).

La primera etapa de la proteólisis consiste en la hidrólisis de las proteínas

miofibrilares y sarcoplásmicas por la acción de las endoproteasas musculares (calpaínas
I y II, catepsinas B, B+L y H principalmente y, en menor medida, proteosoma o complejo
endopeptidasa multicatalítico).

Las calpaínas son cisteína endopeptidasas de origen muscular. Están formadas por la
calpaína I, la calpaína II y la calpastatina, proteína que inhibe de modo específico la
actividad de las anteriores (Koomaraie, 1994). Estas enzimas sólo actúan en la carne
cruda y en el primer estadio del periodo de maduración de productos cárnicos curados
(Ordóñez & De la Hoz, 2001). Estas enzimas son muy inestables, perdiendo su actividad
a los 10-14 días de procesado. Las calpaínas son capaces de hidrozilar proteínas como la
titina, la nebulina, las troponinas T e I, la tropomiosina y la desmina (Koohmaraie, 1994).

Las catepsinas, pertenecientes también al grupo de las endoproteasas musculares,

son proteinasas ácidas lisosomales. Este grupo de enzimas son especialmente activas a
pH ácido, provocando la liberación de fragmentos proteicos de tamaño intermedio
procedentes, en gran medida, de la degradación de proteínas miofibrilares
(fundamentalmente miosina y troponina). Las catepsinas van a ser las principales
responsables de los cambios que van a tener lugar durante la maduración ya que, al
contrario que las calpaínas, este grupo de enzimas son bastante estables a lo largo del
proceso de curado. De hecho, se ha llegado a encontrar una actividad residual del 5%-
10% de las catepsinas B, H y L, incluso después de 15 meses de procesado de jamones
(Toldrá, 1998). Por otro lado, la actividad de la catepsina D tiende a desaparecer a partir
del sexto mes de procesado. El resultado de la actividad de estas enzimas se traduce en
una disminución de la capacidad de retención de agua, así como una serie de cambios
en las características texturales y en el valor nutricional.

Las exopeptidasas (dipeptidilpeptidasa I, II, III y IV y tripeptidilpeptidasas I y II,

carboxipeptidasas y alanil-, arginil-, metionil-leucil-, y piroglutamil- aminopeptidasas)
actúan sobre los fragmentos proteicos, pequeños polipéptidos y péptidos obtenidos tras
la acción de las endopeptidasas (especialmente catepsinas) sobre las proteínas

91
 I.Introducción

miofibrilares y sarcoplásmicas (Toldrá, 1998). Las exopeptidasas hidrolizan estas

cadenas peptídicas a partir de sus extremos terminales (Toldrá, 1998; Toldrá, 2006).
Estas enzimas son las responsables de la generación de di y tripéptidos, mientras que las
aminopeptidasas y carboxipeptidasas liberan aminoácidos libres. Por lo tanto, la mayor
parte de los aminoácidos libres que se generan durante el procesado del jamón curado
son resultado de la acción de las aminopeptidasas (Toldrá, 1998). Se ha observado que
la actividad de las aminopeptidasas musculares, incluyendo la alanil, arginil, leucil, tirosil
y piroglutamil aminopeptidasas, es estable durante los 8 primeros meses de curado,
disminuyendo al final del proceso, debido al efecto inhibidor de la sal, la desecación y la
propia actividad proteolítica (Toldrá et al., 1996). Las principales aminopeptidasas son
la alanil aminopeptidasa (responsable de más del 80% de la actividad total de
aminopeptidasas) y la metionil amnipeptidasa, que presentan amplia especifidad por los
sustratos, y la arginil aminopeptidasa que hidroliza principalmente aminoácidos básicos
(Flores et al., 1996).

Estos aminoácidos liberados son la base para el desarrollo de distintas vías de

reacciones químicas (reacción de Maillard y/o degradación de Strecker), con gran
relevancia para la generación de las características sensoriales del producto, tanto a
nivel del aroma (como compuestos precursores) como del sabor. Los principales
aminoácidos relacionados con las características sensoriales de productos sometidos a
largos tiempos de curado, como el jamón, son ácido glutámico, alanina, leucina, lisina
valina y ácido aspártico (Toldrá, 1998). Según qué aminoácidos predominen, el sabor
será más dulce, amargo o salado.

Todo este proceso de hidrólisis proteica y liberación de aminoácidos va a estar

regulado por parámetros extrínsecos como el grado de secado, la temperatura, la
cantidad de sal del músculo y el pH (Toldrá, 1998). No obstante, la temperatura es el
factor que más influye en la regulación de la proteólisis. Así, el aumento de temperatura
a lo largo del proceso de elaboración producirá un incremento de la proteólisis, al
aumentar la actividad de las enzimas proteolíticas (Ordóñez & de la Hoz, 2001). Respecto
a la cantidad de sal, cuando la concentración es baja, las enzimas pueden actuar, y la
proteólisis estará favorecida mientras que, en etapas posteriores de curado, debido a

92
 I.Introducción

un aumento en su concentración tras la incorporación de sales, la actividad proteolítica

disminuirá (Antequera & Martín, 2001).

I.4.5.3. Fracción lipídica

De forma general, se puede afirmar que los lípidos de los productos crudos-curados
son precursores de muchas sustancias aromáticas, que se forman como resultado de
fenómenos lipolíticos y oxidativos, durante el proceso de maduración, que van a tener
un importante papel en el desarrollo de las características sensoriales finales (Ordóñez
et al., 1999).

I.4.5.3.1. Lipólisis
La lipólisis consiste en la hidrólisis enzimática de los lípidos musculares o del tejido
adiposo y tiene como resultado la generación de ácidos grasos libres. Las enzimas
lipolíticas, tales como lipasas, esterasas, fosfolipasas y lisofosfolipasas, están
involucrados en los procesos de esta naturaleza que tienen lugar durante la maduración
de la carne y de los productos cárnicos (Ordóñez et al., 1999).

Pueden distinguirse dos tipos de lipólisis, según los lípidos afectados estén localizados
en el interior del músculo o en el tejido adiposo. La grasa muscular se compone
esencialmente de triglicéridos y fosfolípidos. En la lipólisis muscular, estos compuestos
son los sustratos de las lipasas (ácida lisosomal, neutra y básica) y las fosfolipasas (tipo
A1, A2, C y D), que reaccionan de forma hidrolítica (Figura I.35) liberando ácidos grasos
de estas moléculas (Motilva et al., 1993).

Figura I.35. Mecanismo de acción de las lipasas (izquierda) y las fosfolipasas (derecha) musculares (Mora, 2010).

El resultado final de la acción de ambos grupos de enzimas es la generación de

numerosos ácidos grasos libres que, en productos como el jamón, aumentan el

93
 I.Introducción

contenido de ácidos grasos libres desde un 2% del contenido lipídico total en el estado
inicial, a un 8%-20%, al final de su maduración (Gandemer, 2002). La actividad de las
lipasas neutra y básica es más importante durante los primeros 3-4 meses del proceso
de elaboración. Posteriormente, su actividad disminuye de forma progresiva, aunque la
lipasa ácida ejerce una baja actividad a lo largo de todo el procesado (Gandemer, 2002).

En el caso del tejido adiposo, la grasa está compuesta en un 99% de triglicéridos,

sobre los que actúa la lipasa sensible a hormonas. Esta enzima es la principal enzima
responsable de la liberación de ácidos grasos a partir de los lípidos presentes en este
tejido. Su actividad se va a desarrollar principalmente durante los primeros 8-10 meses
de curado (Mora, 2010).

Figura I.36. Principales pasos en la lipolisis y oxidación lipídica (Toldrá, 1998).

I.4.5.3.2. Oxidación lipídica

Puede afirmarse que, la oxidación de lípidos tiene su inicio en la hidrólisis enzimática,
descrita en el apartado anterior (Figura I.36).

Los ácidos grasos que se liberan durante la fase de maduración de los productos
curados van a ser muy susceptibles de ser oxidados (Estévez et al., 2009), dando lugar a
diversos compuestos derivados de la oxidación (hidroperóxidos, epóxidos, furanos,
etc.), que actúan como precursores de un gran número de compuestos volátiles (Toldrá,

94
 I.Introducción

1998). Estos compuestos determinarán, en gran medida, el aroma de los productos

cárnicos elaborados (Toldrá & Aristoy, 2010).

La susceptibilidad a la oxidación de los ácidos grasos incrementa con el número de

dobles enlaces, siendo el conjunto de ácidos grasos poliinsaturados los más propensos
a sufrir reacciones de oxidación (Nawar, 1996). Esto se ha visto reflejado en diversos
estudios como el firmado por Martín et al. (1999) en jamón Ibérico, donde se describe
un aumento de ácidos grasos saturados libres, y un descenso del contenido en ácidos
grasos monoinsaturados y poliinsaturados durante el procesado. Sin embargo, en otros
trabajos (Andrés et al., 2005; Flores et al., 2009), la degradación de los ácidos grasos
poliinsaturados no fue tan evidente, y sólo se describe un aumento de estos compuestos
insaturados al final de la maduración. Estas diferencias pueden ser explicadas por las
numerosas variables que influyen en los procesos de oxidación lipídica, favoreciéndola
o inhibiéndola. Por un lado, la presencia de antioxidantes naturales, procedentes de la
alimentación del animal (vitamina E y tocoferoles), o los incorporados durante el
proceso de elaboración (nitrito), inhibirán, en cierta medida, la reacción de oxidación de
ácidos grasos. Por otra parte, también hay que considerar el efecto de diversos factores
como el cloruro sódico, la luz o la presencia de determinados metales, que por el
contrario la favorecen (Morrissey et al., 1998).

El conjunto de compuestos que más interés presenta en la degradación lipídica,

desde el punto de vista del desarrollo de componentes aromáticos, son los aldehídos,
debido a su repercusión sobre el flavor del producto final (Ordóñez & de la Hoz, 2001).
Se han identificado más de 100 compuestos volátiles en productos curados de cerdo
procedentes tanto de lípidos como de proteínas. (Gandemer, 2002). La Tabla I.4 recoge
los principales aldehídos lineales formados a partir de la oxidación de los ácidos grasos
insaturados oleico (C18:1), linoleico (C18:3) y linolénico (C18:3).

95
 I.Introducción

Tabla I.4. Productos específicos de la degradación de los ácidos oleico, linoleico y linolénico (Ordóñez y de la Hoz,
2001)

Ácido graso Grupo metileno Hidroperóxidos isómeros Aldehídos formados por

atacado (a) descomposición de
hidroperóxidos
11-hidroperoxi-9-eno Octanal
11
9-hidroperoxi-10-eno 2-Decenal
Oleico
8-hidroperoxi-9-eno 2-Undecenal
8
10-hidroperoxi-8-eno Nonanal
13-hidroperoxi-9,11-dieno Hexanal
Linoleico 11 11-hidroperoxi-9,11-dieno 2-Octenal
9-hidroperoxi-10,12-dieno 2,4-Decadienal
16-hidroperoxi-9,12,14-trieno Propanal
14 14-hidroperoxi-9,12,15-trieno 2-Pentenal
12-hidroperoxi-9,12,15-trieno 2,4-Heptadienal
Linolénico
13-hidroperoxi-9,11,15-trieno 3-Hexenal
11 11-hidroperoxi-9,11,15-trieno 2,5-Octadienal
9-hidroperoxi-10,12,15-trieno 2,4,7-Decatrienal
(a)Sólo se consideran los grupos metileno más activos

96
 I.Introducción

Como hemos visto a lo largo de los apartados anteriores, la producción de derivados

cárnicos crudos curados implica la combinación de una gran variedad de procesos y
transformaciones de cuyo desarrollo exitoso dependerá la calidad del producto final. En
la industria actual, la fiabilidad y la exactitud son aspectos cruciales para recortar costes
y aumentar la productividad y calidad. El empleo de nuevas técnicas analíticas, como la
resonancia magnética, brinda una importante herramienta de monitorización y control
de los procesos de producción y trabajo en planta. Así, durante el desarrollo de esta
Tesis Doctoral se ha utilizado esta técnica para:

i. monitorizar procesos de elaboración tradicionales, tanto de jamón curado como

de embutidos crudos curados, evaluando, entre otros aspectos, la dinámica de
secado y deshidratación y la transformación estructural de la matriz proteica de
este tipo de miosistemas, pasando por el estudio de la movilidad y distribución
de agua y grasa en el músculo y por la degradación proteica;
ii. observar cambios en los metabolitos más significativos de los citados productos
durante las etapas más destacadas de su elaboración a través del estudio del
perfil metabólico característico de cada fase, identificando, entre otros,
fenómenos de proteólisis, lipólisis y glucólisis, enfocado al control de procesos y
a garantizar la calidad del producto final, y
iii. evaluar la aptitud de los exudados cárnicos como nueva matriz no destructiva de
estudio, así como estimar la conservación de derivados cárnicos mediante la
aplicación de tratamientos de irradiación, a través del análisis del perfil
metabólico de exudados de cerdo.

Por todo ello, los resultados aquí obtenidos constituyen interesantes aportaciones a
la Tecnología Alimentaria, ahondan en el potencial de las técnicas basadas en la
resonancia magnética para el análisis de alimentos, y afianzan la importancia de estas
herramientas en el ámbito industrial.

97
II. Objetivos

99
 II. Objetivos

España es uno de los países con una tradición más rica en la elaboración y consumo
de los más variados embutidos y jamones. Lo diverso de la producción, que se extiende
a todos los rincones de nuestro país, forma parte de nuestro acervo cultural y
gastronómico, y es apreciada dentro y fuera de nuestras fronteras.

En la presente Tesis Doctoral se abordan dos líneas de trabajo. Por una parte, se ha
estudiado el proceso de maduración de distintos productos derivados del cerdo blanco,
elaborados a partir de pieza entera (jamón curado) y elaborados a partir de carne picada
(modelos cárnicos y embutidos crudos curados) desde un punto de vista estructural.
Para ello se ha empleado la Imagen de Resonancia Magnética (IRM), con el fin de
estudiar los cambios en la macroestructura asociados al proceso, y la relaxometría T2 de
RMN, para estudiar la microestructura de los derivados cárnicos. Por otra parte, el
proceso de maduración de los mencionados derivados se ha estudiado también desde
un punto de vista bioquímico mediante la espectroscopía de 1H de alta resolución, que
permite la identificación y cuantificación de metabolitos representativos. Además, esta
técnica se ha empleado también para valorar la aptitud de los exudados liberados a
partir de la carne de cerdo como nueva matriz de análisis para estudiar los procesos y
los cambios metabólicos que tienen lugar durante la aplicación de un tratamiento de
electrones acelerados de la carne fresca de cerdo. Para afrontar las dos líneas de trabajo,
se plantean dos objetivos principales:

El objetivo principal del estudio estructural fue evaluar el potencial de las técnicas
no destructivas de RMN para monitorizar el proceso de maduración de distintos
productos cárnicos curados a través de los cambios macro y microestructurales
experimentados por los citados miosistemas durante su elaboración.

Para abordar este objetivo general de esta parte de la Tesis Doctoral se han
considerado los siguientes objetivos parciales:

▪ Estudiar los cambios en la macroestructura de jamón curado durante la

maduración mediante la Imagen de Resonancia Magnética (IRM), así como
determinar su potencial como herramienta predictiva para la estimación de
parámetros fisicoquímicos y características de textura.

101
 II. Objetivos

▪ Estudiar los cambios en la microestructura de jamón curado durante la

maduración a partir de las distribuciones continuas del tiempo de relajación
transversal T2 calculados mediante relaxometría de RMN.
▪ Determinar el potencial de la relaxometría T2 de RMN para evaluar el efecto de
la adición de proteasas sobre la microestructura de modelos cárnicos
madurados.
▪ Monitorizar mediante la relaxometría T2 de RMN el proceso de maduración de
embutidos crudos curados (chorizo y salchichón) y evaluar su potencial como
herramienta predictiva para la estimación de parámetros fisicoquímicos y
características de textura.

El objetivo principal del análisis bioquímico fue valorar la aptitud de la

espectroscopía de 1H de RMN de alta resolución para monitorizar, desde un punto de
vista bioquímico, los procesos de maduración de los derivados cárnicos y evaluar el
potencial de esta técnica para el análisis de una matriz líquida procedente de la carne,
el exudado cárnico.

Para abordar este objetivo general de esta parte de la Tesis Doctoral se han
considerado los siguientes objetivos parciales:

▪ Determinar el potencial de la espectroscopía 1H RMN HRMAS para el análisis y

seguimiento del proceso de maduración de jamón curado y embutidos crudos
curados, tipo salchichón, y realizar un estudio metabonómico para la
discriminación de muestras en función del tiempo de maduración.
▪ Determinar el perfil metabólico de los exudados de cerdo y compararlo con el
perfil obtenido para el músculo cárnico, con el fin de asegurar la aptitud de los
exudados como matriz de estudio.
▪ Determinar el potencial de la espectroscopía 1H RMN HRMAS para el análisis y
seguimiento del proceso de conservación de la carne de cerdo tratada con
electrones acelerados, mediante el análisis del exudado cárnico liberado.
▪ Estimar el potencial de las técnicas quimiométricas basadas en la RMN para la
clasificación de exudado de carne de cerdo en función de la dosis de irradiación
y del tiempo de almacenamiento.

102
 II. Objetivos

En conjunto, se estima que se han abordado objetivos de interés científico y

tecnológico, especialmente mediante la optimización de técnicas de RMN para el
estudio de productos madurados y la estimación de su potencial de aplicación, como
técnicas no destructivas, a nivel industrial.

103
III. Material y métodos

105
 III. Material y métodos

En este apartado se aporta una visión resumida y general de las características de

los materiales empleados y de las técnicas metodológicas utilizadas en el conjunto de
las actividades llevadas a cabo para concluir la presente Tesis Doctoral. No obstante,
en cada artículo incluido (ver Sección IV. Resultados) se concretan y se aportan detalles
específicos de la forma de proceder en las distintas experiencias desarrolladas.

107
 III. Material y métodos

III.1. MATERIALES DE LABORATORIO

III.1.1. REACTIVOS Y DISOLVENTES

Todos los productos químicos utilizados en las experiencias integradas en la

presente Tesis Doctoral fueron de la calidad de análisis apropiada en cada caso,
suministrados por las marcas Merck, Panreac, Fluka y Sigma-Aldrich.

III.1.2. MATERIAL INSTRUMENTAL

 El material de vidrio utilizado en el trabajo experimental escrito en esta

memoria fue de la marca Pyrex® (vasos de precipitados, pipetas de vidrio,
probetas, matraces Erlenmeyer, tubos de centrífuga, tubos Kjeldahl, etc).

 El instrumental empleado (cucharas, espátulas, tijeras bisturí) fue de acero

inoxidable.

 Las pipetas automáticas empleadas fueron de la marca Discovery Comfort

autoclavable HTTP con capacidad de 20‐200 μL, 100‐1000 μL y 1‐5 mL.

 El calibre utilizado para medir las dimensiones de las probetas de ensayo

para los ensayos reológicos fue un pie de rey digital Tesa (modelo Shop‐Cal)
con accesorios Brown and Sharpe Centerline.

 Los desecadores para la conservación de muestras, con gel de sílice activado,

fueron de la marca Pyrex®.

 Los procedimientos de filtración se realizaron utilizando filtros Whatman

125 y Millipore FH 0,5 μm.

 Las muestras cárnicas, así como las disoluciones y preparados sensibles a la

temperatura, se conservaron en arcones de congelación Liebher y en
frigoríficos Sanyo, Medicool, Philco, Fagor, Electrolux y Kelvinator.

 Las disoluciones se prepararon en placas de agitación magnética Selecta

(modelo Agimatic N), Bunsen (modelo MC‐8) y Thermolyne (modelo Nuova
II), dotadas con regulador de temperatura.

109
III. Material y métodos

 Las pesadas ordinarias se realizaron en balanzas monoplato AND (modelo

FX‐320) y KERN (modelo 440‐33 y modelo 449‐35N) y las de precisión en
balanza analítica AND (modelo HR‐120).

 La homogeneización de las muestras, para la realización de las

correspondientes determinaciones químicas, se efectuó en
homogeneizadores Polytron (modelo PT 10‐35) y Ultra Turrax (modelo T25
basic).

 La concentración de volúmenes de disolventes orgánicos se realizó en un

rotavapor Büchi (modelo EL), acoplado a un baño calefactor y a una bomba
de vacío Eyela (modelo A‐3S). Los volúmenes pequeños se evaporaron
mediante corriente de nitrógeno (suministrado por Carburos Metálicos,
Grupo Air Products).

 La centrifugación de extractos se realizó en centrífugas Sorvall (modelo RC‐

5B) equipadas con rotores modelo GSA, GS3 y S600, y Orto‐Alresa (modelo
Digicen 20).

 El agua destilada se obtuvo en un aparato Millipore Elix 3, por ósmosis

inversa. Fue agua purificada de tipo II, de calidad constante y fiable, con una
resistividad del orden de 15 MΩ.

110
 III. Material y métodos

III.2. MATERIAL CÁRNICO

III.2.1. PERNILES Y JAMONES EN DISTINTAS ETAPAS DE CURADO

Los perniles frescos (10-11 kg), así como las piezas de jamón en distintas etapas del
proceso de curado, analizados en este estudio fueron suministrados por la empresa
cárnica Incarlopsa (Tarancón, Cuenca). Todas las piezas procedían de hembras de
cerdos blancos grasos (Landrace × Large White) habitualmente utilizados para la
elaboración de jamón curado en la mencionada industria. El procedimiento seguido,
así como los momentos de toma de muestra (pernil fresco, salado, postsalado, secado
y bodega), y las determinaciones físicoquímicas realizadas se resumen en la Figura III.1.

Pernil fresco Recepción de perniles Tº del pernil: 2-5 oC

3 días después del sacrificio

Acondicionamiento de la materia prima

Perfilado Sangrado

NaCl
NO2
Pernil salado Salado
NO3
después de la adición de sal Tº: 1-3 oC azúcares
Humedad: 90% ascorbatos

0,7 días / Kg peso

Lavado y cepillado sal superficial

Tº: 4 oC
Pernil post-salado Post-salado
Humedad: 75-80%
tras la retirada de sal

Pernil secado Tº: 13-15 oC

Secado Humedad: 75-85%
6 meses en secadero

Pernil estufaje Tº: 22-26 oC

Estufaje Humedad: 65-75%
8 meses en secadero

Jamón curado
12 meses de bodega Tº: 12-17 oC
Maduración Humedad: 60-80%

Jamón curado
20 meses de bodega

Análisis TPA MEB Imagen Relaxometría Espectroscopía

1 H-RMN 1 H- HR-MAS RMN
1 H-RMN
físico-químicos
(E.S., aw, pH, grasa, proteína)

Figura III.1. Principales etapas de la elaboración de jamón curado y análisis realizados. TPA: Análisis del Perfil de
Textura, ES: Extracto seco, MEB: Microscopía Electrónica de Barrido.

111
III. Material y métodos

Tras la recepción de las piezas en los tiempos establecidos, se procedió, en la planta

piloto de la Facultad de Veterinaria de la UCM, a su disección anatómica para el
aislamiento y extracción manual de los tres músculos objeto de estudio: bíceps
femoral, semimembranoso y semitendinoso (Figura III.2). Las muestras se mantuvieron
en refrigeración (4 ± 1 ºC) hasta su análisis.

Figura III.2. Localización anatómica de los músculos estudiados y procedimiento seguido para la toma de muestras.
SM:semimembranoso. BF: bíceps femoral; ST: semitendinoso.

III.2.2. MODELOS CÁRNICOS Y EMBUTIDOS CRUDOS CURADOS

Para las experiencias realizadas en esta Tesis Doctoral se elaboraron modelos

cárnicos en la planta piloto de la Facultad de Veterinaria. Además, siguiendo
formulaciones de productos comerciales, se elaboraron embutidos crudos curados.

Utilizando como base carne magra (Longissimus lumborum) molida en una picadora
dotada de una placa de control de granulometría con orificios de 5 mm, se
confeccionaron dos tipos de modelos cárnicos:

i. SMS (sistema modelo sin enzimas adicionadas) elaborado mezclando (%, p/p)
con la mencionada carne picada, grasa (19%), sales de curado [NaCl (2,5%),
KNO3 (0,02%), NaNO2 (0,01%)], dextrosa (0,8%), lactosa (1%) y dextrina (1,6%).
ii. SMS+P (sistema modelo adicionado con proteasas), elaborado como el modelo
anterior pero caracterizado por la adición de un combinado de proteasas. Se
utilizó pronasa E de Streptomyces griseus y aspartil proteinasa de Aspergillus
oryzae (300 y 100 U / Kg de carne, respectivamente). Las mencionadas
proteasas fueron suministradas por Sygma-Aldrich. Los detalles de la
elaboración de los dos modelos cárnicos se recogen en la Figura III.3.

Como embutidos crudos curados, se elaboró salchichón (S) y chorizo (CH) siguiendo
un procedimiento tradicional, sin utilizar cultivos iniciadores (Ordóñez et al. 1999;

112
 III. Material y métodos

Toldrá et al., 2015). Para la fabricación de dichos productos se utilizaron dos niveles de
grasa: 20% (1) y 40% (2), de manera que se fabricaron cuatro lotes de productos: S1,
S2, CH1 y CH2. El esquema de elaboración de estos productos se recoge en la Figura
III.4.

113
III. Material y métodos

Figura III.3. Diagrama de elaboración de modelos cárnicos, toma de muestras y análisis.

114
 III. Material y métodos

Figura III.4. Diagrama de elaboración de embutidos curados, toma de muestras y análisis.

115
III. Material y métodos

III.2.3. EXUDADOS CÁRNICOS

En dos establecimientos comerciales se adquirieron porciones de lomo (Longissimus

dorsis) de cerdo, procedentes de un total de seis animales. Las piezas cárnicas se
transportaron (menos de 1 hora) a los laboratorios de la Sección Departamental de
Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Veterinaria (UCM), en contenedores
aislados térmicamente, donde se cortaron en porciones aproximadamente de 20 g.
Para emular las condiciones de envasado comerciales, cada porción se envasó al vacío
(20 kPa) en bolsas (10 × 10 cm) de plástico laminado (90 μm de poliamida / polietileno)
de baja permeabilidad a los gases (velocidades de transmisión de 35 cm 3 24h-1 m- 2 bar-
1
y 150 cm3 24h-1 m-2 bar-1 para O2 y CO2, respectivamente). Las muestras se
mantuvieron en refrigeración (4 ± 1 oC) hasta su tratamiento con electrones acelerados
(radiación ) en la planta Ionisos Ibérica S.A. situada en Tarancón (Cuenca), dotada de
un acelerador de electrones (Rhodotron TT200 (IBA Industrial, Lovain-Neuve, Belgium)
que opera a 10 MeV, con una potencia máxima de 80kW. El transporte de las muestras
hasta estas instalaciones (alrededor de una hora) se realizó en recipientes isotermos
de polipropileno expandido. Las muestras se sometieron a dosis de 1, 2 y 6 kGy,
considerando los resultados obtenidos en trabajos anteriores en los que se estimó el
tratamiento requerido para incrementar la vida útil de la carne de porcino con el
mínimo impacto en la calidad sensorial de la carne (García-Márquez et al., 2012). La
dosis exacta absorbida por las muestras se comprobó determinando la absorbancia de
dosímetros de triacetato de celulosa (CTA-125, Fuji, Japan) irradiados
simultáneamente (ASTM, 2000). Las muestras no tratadas se usaron como control (0
kGy). Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (20-24 oC) por
triplicado. El aumento de temperatura durante el tratamiento fue inferior a 2 oC.
Después del tratamiento de ionización, las muestras se transportaron hasta el
laboratorio, en los recipientes isotermos citados anteriormente, y se almacenaron a 4
o
C hasta su análisis. Después de 1, 6 y 12 días de almacenamiento, el exudado liberado
por la carne envasada al vacío (veinticuatro muestras por tiempo de almacenamiento),
se extrajo con ayuda de una pipeta y se congeló a -80 oC. Seguidamente se procedió a
su liofilización (Virtris FM12XL, Milán, Italia) a temperatura ambiente. Los exudados
liofilizados se almacenaron a -80 oC hasta el análisis por RMN.

116
 III. Material y métodos

En la Figura III.5 se resume el procedimiento conjunto descrito de extracción y

manipulación de los exudados cárnicos.

Figura III.5. Procedimiento de extracción y manipulación de exudados procedentes de carne de cerdo.

117
 III. Material y métodos

III.3. METODOLOGÍA
En la Figura II.6 se detalla gráficamente el planteamiento conjunto del trabajo
integrado en la presente Tesis Doctoral, así como las experiencias que constituyen
cada uno de los artículos o unidades publicables en los que se estructura.

ANÁLISIS DE MACRO Y
MICROESTRUCTURA
DE PRODUCTOS
ANÁLISIS DEL PERFIL
CÁRNICOS
METABÓLICO DE
DISTINTAS MATRICES
CÁRNICAS

Figura III.6. Metodología y planteamiento del trabajo realizado.

118
 III. Material y métodos

III.4. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS

III.4.1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE AGUA

La actividad de agua (aw) se determinó utilizando un higrómetro de punto de rocío

modelo Decagon CX‐1 a una temperatura de 20 oC. Para cada medida, en el equipo se
introdujeron alrededor de 2 g de muestra en la cápsula suministrada por el fabricante.
El equipo se calibró previamente (Labuza et al., 1976) con una disolución saturada de
cloruro sódico (aw = 0,775) y agua destilada (aw = 1,000). El higrómetro proporcionó
directamente los valores de la aw (con una precisión de ± 0,003 unidades) y la
temperatura a la que se realizó la medida.

III.4.2. DETERMINACIÓN DEL PH

El pH se determinó por inmersión del electrodo en una solución homogeneizada de

la muestra en agua destilada (1/10) (p/v), utilizando un pH-metro de la marca Crison
Digital 501, modelo 2001. La calibración del pH-metro se realizó con las soluciones
tampón de referencia, pH 4 y 7, suministradas por el fabricante. El electrodo se
mantuvo sumergido en una solución de KCl 3M y AgCl para su correcta conservación.

III.4.3. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO ACUOSO

La determinación del contenido de agua se realizó según el procedimiento de la

AOAC (2006), mediante secado de la muestra hasta peso constante. Se utilizó para ello
una estufa marca Heraeus, modelo T6200, y el secado se realizó a una temperatura de
110 oC. La uniformidad de peso se alcanzó a las 48-72 horas. Las cápsulas de porcelana
Pobel empleadas para contener la muestra se deshidrataron previamente a 110 °C
durante 3 horas y se dejaron enfriar en un desecador de vidrio a vacío, cargado con gel
de sílice activado. En las cápsulas se depositaron 4 g de muestra, aproximadamente,
para cada determinación. El contenido de agua se determinó por diferencia entre el
peso de la muestra fresca y el de la muestra desecada, una vez alcanzado el peso
constante. El extracto seco (ES) se calculó restando el contenido de agua del peso de la
muestra cárnica.

119
III. Material y métodos

III.4.4. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN CENIZAS

La cuantificación de cenizas, o contenido mineral total, se realizó siguiendo el

procedimiento descrito por la AOAC (2006), introduciendo las cápsulas de porcelana
con la muestra deshidratada en una mufla Heraus, modelo MR 170, a 550 oC hasta su
completa incineración (48 horas, aproximadamente). La cantidad de cenizas se
determinó por diferencia de pesada con respecto a la cápsula vacía, previamente
tarada.

III.4.5. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN GRASA

La determinación del contenido en grasa se realizó utilizando el método de Bligh &

Dyer (1959), mediante una extracción en frío con cloroformo y metanol en presencia
del antioxidante butilhidroxitolueno (BHT) para, posteriormente, cuantificar de forma
gravimétrica, según el procedimiento descrito por Hanson & Olley (1963).

Se homogeneizaron 20 g de muestra con una mezcla de metanol/cloroformo

(40/20) (v/v), y una punta de espátula de BHT al 98% para evitar la oxidación durante
el proceso. A continuación, se añadió cloroformo y suero fisiológico (20/20) (v/v) y se
homogeneizó de nuevo. La mezcla resultante se centrifugó a 3000 rpm durante 5
minutos a 21 oC y se separó en tres fases: la superior, fundamentalmente acuosa, la
intermedia, proteica, y la inferior, la fase orgánica. Se extrajeron 20 mL de la fase
orgánica con ayuda de una pipeta Pasteur y se filtraron a través de un algodón
impregnado con cloroformo/metanol (2:1) y una punta de espátula de sulfato sódico
anhidro para retener pequeños restos de agua que se pudieran haber arrastrado
durante el proceso. Por último, para obtener la grasa, se evaporó el disolvente en un
rotavapor.

El porcentaje de grasa de las muestras se estimó por diferencia de pesada:

% grasa = 100 × 2 × (Pg - Pv)/ M

donde: M = peso de la muestra (g); Pg = peso del matraz después de evaporar el

disolvente (g) y Pv = peso del matraz vacío (g).

120
 III. Material y métodos

III.4.6. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN PROTEÍNA

La cuantificación de la proteína se realizó mediante la determinación de nitrógeno

total por el método de Kjeldahl (AOAC, 2006). Las muestras se trataron en un digestor
Büchi Digestion, Unit K‐435, acoplado a una bomba de vacío Büchi, encargada de
recoger los gases producidos durante el proceso de digestión. La neutralización y
destilación de las muestras digeridas se efectuó en un destilador automático, Büchi
Distillation, Unit B‐324. 1,5 g de muestra se introdujeron en un tubo Kjeldahl junto a
una pastilla de 5 g de catalizador (99,9% de K2SO4 y 0,1% de Se), 3‐4 perlas de vidrio y
20 mL de ácido sulfúrico al 96%. Se cargó el digestor con los tubos Kjeldahl, se cerró el
circuito y se calentaron a 350-400 ºC durante 4-5 horas, hasta que el contenido de los
tubos adquirió un color amarillo claro y transparente. La destilación se realizó una vez
los tubos se habían enfriado. Para ello se añadieron 45 mL de hidróxido de sódico
(NaOH al 40% p/v). Cada destilado resultante se recogió en un matraz de Erlenmeyer
con 25 mL de ácido bórico (H3BO3 al 4% p/v). La cuantificación del nitrógeno amoniacal
se realizó por medio de una volumetría ácido-base del ion borato formado, empleando
ácido clorhídrico (HCl 0,5 N) y como indicador una mezcla de rojo de metilo (0,2%) y
azul de metileno (0,1%) en etanol. Los equivalentes de ácido consumidos
corresponden a los equivalentes de amoniaco destilados.

Para calcular el % de nitrógeno total se empleó la fórmula:

% Nitrógeno total = VHCl × NHCl × Pm N2/mg muestra × 100

donde: VHCl = volumen de mL de HCl gastados para neutralizar la muestra – volumen de

mL de HCl empleados para neutralizar el blanco y NHCl = normalidad de la disolución de
HCl; Pm N2 = peso molecular del nitrógeno (14,007 g mol‐1).

El cálculo de la cantidad de proteína a partir del nitrógeno total se obtuvo aplicando

el factor de conversión 6,25, utilizado para la carne y derivados, asumiendo que las
proteínas de los productos cárnicos tienen un 16% de nitrógeno:

% proteína = % N2 total × 6,25

Todas las determinaciones fisicoquímicas se realizaron por triplicado.

121
III. Material y métodos

III.5. DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE TEXTURA

III.5.1. ANÁLISIS DEL PERFIL DE TEXTURA

El análisis de perfil de textura (Texture Profile Analysis, TPA) se realizó con un

texturómetro TA.XT2i Stable Micro System Texture Analyzer (Stable Microsystems Ltd.,
Surrey, Inglaterra) suministrado por Aname S.L. y controlado desde un ordenador
Pentium II mediante el programa Texture Exponent 32, versión 5.0.6.0. En los ensayos
se utilizó una célula de carga de 5 kg. La calibración se realizó con una pesa de 2 kg.
Para llevar a cabo el TPA se procedió de acuerdo a trabajos previos (Herrero et al.,
2007, 2009). Todos los ensayos se ejecutaron a temperatura ambiente, 22±2 oC.

Se prepararon muestras con forma cilíndrica, con una altura de 1 cm y un diámetro

de 25 mm, obtenidas mediante un sacabocados. El ensayo consistió en una prueba de
doble compresión y para ello se empleó una sonda de presión con base plana de forma
cilíndrica de aluminio de 25 mm de diámetro, modelo P/25, asociada a una plataforma
de aluminio, modelo HDP/90, donde fueron colocadas las muestras para el análisis. El
ensayo se efectuó a una velocidad de 2 mm s‐1. El tiempo de recuperación,
transcurrido entre ambas compresiones, fue de 5 segundos, ascendiendo la sonda a su
posición inicial a una velocidad de 10 mm s‐1. Se realizaron diez réplicas de cada
muestra.

Una vez concluido el ensayo, se obtuvieron las gráficas o curvas de deformación

fuerza-tiempo (Figura III.6). En ellas se representa la fuerza aplicada (ordenadas) frente
al tiempo de ensayo (abscisas). Es posible obtener los siguientes parámetros a partir de
las curvas:

 Dureza: definida como la altura máxima obtenida en el primer ciclo de

compresión. Representa la fuerza máxima para producir una cierta
deformación. Se expresa en unidades de fuerza (N).

 Adhesividad: corresponde al área de fuerza bajo el eje de abscisas que

resulta tras la primera compresión. Se define como el trabajo necesario para
retirar la sonda de la muestra después de realizar la primera compresión.

122
 III. Material y métodos

Presenta siempre un valor negativo. Se expresa en unidades de fuerza ×

tiempo (N s).

 Elasticidad: se define como la capacidad de la muestra para recuperar su

forma original, una vez que cesa (deja de aplicarse) la fuerza deformante.
Corresponde a la diferencia entre las alturas registradas en la muestra tras la
primera compresión (Distancia1) y al iniciar la segunda (Distancia 2). Se
expresa en unidades de longitud (m).

 Cohesividad: se define como el grado en que una muestra puede deformarse

sin llegar a romperse. Corresponde a la relación que existe entre las áreas
positivas de la segunda y la primera compresión (Área2/Área1). Es
adimensional.

A partir de ellos fue posible calcular estos parámetros secundarios:

 Gomosidad: fuerza para desintegrar una muestra semisólida para tragar

(dureza × cohesión). Se expresa en N.

 Masticabilidad: se define como el producto de la gomosidad y la elasticidad,

es decir, el producto de dureza × cohesividad × elasticidad. Representa el
trabajo necesario para desintegrar una muestra hasta dejarla lista para la
deglución. Se expresa en unidades de fuerza × longitud (N m).

Figura III.6. Representación gráfica (fuerza-tiempo) de un análisis de perfil de textura (TPA). A: área; D: distancia.

123
III. Material y métodos

III.5.2. ENSAYO DE TRACCIÓN UNIAXIAL DESTRUCTIVO

Para la realización de este ensayo, se emplearon unas pinzas A/MTG (Figura II.7)
fijadas, por una parte, a la base del texturómetro y, por otra, al brazo móvil del equipo,
conectado con la célula de carga. Se ensayaron probetas con una longitud de 7 cm y
una anchura entre 0,2 y 0,5 cm. Éstas se colocaron entre los dos extremos de las
pinzas, de forma que quedasen lo más estiradas posibles, y se inició la tracción a una
velocidad de 1 mm s-1 hasta la rotura. Se empleó una célula de carga de 5 Kg y las
medidas se realizaron a temperatura ambiente. Se realizaron unos 10 ensayos por tipo
de muestra.

Figura III.7. Pinzas A/MTG.

Una vez concluido el ensayo, se obtuvieron las curvas fuerza-distancia o fuerza

tiempo (Figura III.8). La fuerza máxima (N) obtenida en dichas curvas fue considerada
como la fuerza de ruptura. La resistencia a la ruptura (N cm-2) fue calculada como el
cociente entre la fuerza máxima y el área de sección (anchura x espesor). Para calcular
este parámetro sólo se consideraron válidos los ensayos en los que la ruptura se
produjo en la parte central de las probetas.

124
 III. Material y métodos

Figura III.8. Representación gráfica fuerza-tiempo de un ensayo de tracción uniaxial destructivo.

125
III. Material y métodos

III.6. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

La determinación de la microestructura de las muestras mediante microscopía
electrónica de barrido (MEB) requirió una preparación previa de las mismas, la cual
implicó corte, deshidratación, evaporación y metalización de las mismas. El corte de las
muestras se realizó en forma de cubos con un tamaño de 5x5x5 mm.

Posteriormente, fueron sumergidas en una solución de glutaraldehído al 2,5 % en

suero fisiológico (concentración salina al 0,9 %) durante 4 horas para su fijación.
Durante este período las muestras se mantuvieron en refrigeración a 4 °C.
Seguidamente las muestras se lavaron con solución salina 3 veces para retirar los
restos de fijador. Para la deshidratación de las muestras, una vez fijadas, el agente
empleado fue el etanol. Se prepararon diferentes soluciones con concentraciones
crecientes de etanol, desde el 30 % hasta el 100 % (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 y 100).
Las muestras se introdujeron dos veces en la misma concentración, haciendo un
trasvase a otro recipiente con solución nueva cada 30 minutos. De esta forma, la
muestra permaneció una hora en cada concentración de etanol.

A continuación, se realizó el secado de las muestras mediante punto crítico (CPD,

critical point drying) que consiste en desplazar el etanol de las muestras con CO2
líquido en condiciones estándar (temperatura = 31°C, presión = 7,38 x 106 Pa), para
posteriormente cambiar el CO2 líquido a CO2 en estado gaseoso y finalizar el proceso
de secado liberando presión hasta alcanzar la presión atmosférica. El secado de punto
crítico es un método para secar tejidos sin que estos colapsen o deformen su
estructura original, minimizando las tensiones superficiales del tejido. Se utiliza con
frecuencia en MEB cuando se pretende visualizar muestras biológicas. Para llevar a
cabo la deshidratación de las muestras se utilizó un secadero por punto crítico Balzers
CDP‐030.

El siguiente paso fue la evaporación (a vacío), que consiste en recubrir las muestras
con grafito. Para este procedimiento, se utilizó un evaporador Balzers SCD‐004 Sputter
Coater y el recubrimiento con grafito se realizó en un equipo Mini deposition System
MED 010 Balzers.

126
 III. Material y métodos

Por último, se procedió a la metalización de las muestras con oro (Emitech K550x
Sputter Coater, 25 mA, 4 minutos), para su correcta visualización en el microscopio
electrónico de barrido (JEOL mod. JSM 6400, Japón). Las muestras utilizadas no son
buenas conductoras, por lo que es necesario hacer conductora la superficie, eliminar la
electricidad estática, minimizar el daño por radiación y aumentar la reflectividad
electrónica.

El proceso completo, desde el secado de las muestras mediante el punto crítico

hasta la visualización en el microscopio electrónico de barrido, fue realizado en el
Centro Nacional de Microscopía Electrónica (ICTS) de la UCM.

127
III. Material y métodos

III.7. ENSAYO CON FLUORESCAMINA

El grado de proteólisis se estimó mediante la medida de grupos amino-terminales
libres usando un ensayo con fluorescamina (Jansson et al., 2014). Para ello, se
solubilizaron 100 mg de muestra en 1 mL de solución salina [tampón fosfato (0,05 M),
NaCl (0,14 M), pH 6,7]. A 500 μL de una solución de ácido tricloroacético (1,67 M) en
agua se añadió un volumen igual de muestra solubilizada, y la mezcla se mantuvo en
hielo durante 20 minutos para permitir la precipitación de proteínas. Posteriormente,
la mezcla fue centrifugada (17000g ,20 minuto) y luego filtrada. Una alícuota de 12,5
μL de este filtrado se mezcló con 1 mL (100 mM) de buffer borato y 500 μL (719 μM)
fluorescamina en acetona. 250 μL de esta disolución fueron transferidos a cada pocillo
de una microplaca de microtítulo. Se midió la fluorescencia de las muestras 18 minutos
después de la adición de la fluorescamine, a una longitud de onda de 390 nm.

128
 III. Material y métodos

III.8. ELECTROFORESIS SDS-PAGE

La fracción de proteínas miofibrilares se analizó mediante electroforesis SDS-PAGE
(sodium dodecyl sulfate-poly- acrylamide gel). Para ello, las proteínas miofibrilares se
extrajeron por homogeneización de 1 g de muestra en 5 mL de una solución
constituida por urea (7 M), tiourea (2 M) y Tris base (400 mM). El homogeneizado se
centrifugó a 10.000 g durante 20 min a 4° C, y se separó el sobrenadante con las
proteínas miofibrilares. La concentración de proteína de los extractos se determinó
mediante el método de Bradford. La concentración de proteína se ajustó con agua
para obtener una concentración final de 2 mg/mL y se diluyó (1:1) con tampón SDS-
PAGE [SDS 2%, 20% de glicerol, 20 mM Tris-Cl, pH 6,8, ácido etilendiaminotetracético
(EDTA, 2 mM), 160 mM Ditiotreitol (DTT) y 0.1 mg/mL azul bromofenol] para obtener
una concentración final de 1 mg/mL. Las muestras fueron calentadas a 100° C durante
5 minutos antes de la electroforesis. Se realizó SDS-PAGE bajo condiciones reductoras
en geles prefabricados. La cantidad de solución de proteína inyectada en los geles de
electroforesis fue de 20 μL en cada carril. Después de la electroforesis, los geles fueron
cubiertos con solución fijadora (40% de metanol y ácido acético al 10%) y luego se
tiñeron usando azul brillante de Coomassie. Los pesos moleculares de los productos de
la proteólisis se estimaron por referencia a la movilidad relativa de proteínas estándar.

129
III. Material y métodos

III.9. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

III.9.1. IMAGEN DE RESONANCIA MAGNÉTICA (IRM) Y RELAXOMETRÍA T2 DE ALTO CAMPO

Los experimentos de imagen y relaxometría T2 de alto campo se realizaron en un

espectrómetro Bruker BIOSPEC 47/40 (BrukerGmBH, Ettlingen, Alemania) horizontal
que opera a 4,7 Teslas (200 MHz), equipado con un sistema de gradientes apantallado
de 6 cm de diámetro que permite un gradiente de 450 mT m-1 (Figura III.9).

Figura III.9. Espectrómetro Bruker BIOSPEC 47/40 utilizado en el análisis de IRM y de relaxometría T2 de alto campo.

Para ambos tipos de experimentos, las muestras fueron cortadas en pequeñas

piezas (3 cm largo, 2 cm ancho, 1,5 cm espesor) y se colocaron sobre una sonda de
volumen de 3,5 cm de diámetro. De esta forma, la muestra se situó en la bobina de
radiofrecuencia que se emplea para la transmisión y recepción de la señal.

En los experimentos de IRM, para las medidas del tiempo de relajación espín-espín
o transversal (T2), se obtuvieron 60 imágenes a diferentes tiempos de eco (TE = 5-300
ms). El resto de parámetros permanecieron constantes (NA = 1; TR = 3046,1 ms; MTX =
256 x 128, FOV = 5 x 2,5 cm; grosor del corte= 1 mm; número de corte = 1).

Los datos así obtenidos se ajustaron a una exponencial de acuerdo con la ecuación:

S(TE)= S0 exp (-TE/T2)

donde S(TE) es la señal de la imagen a cada tiempo de eco (TE) y S0 es la señal cuando
TE es igual a cero.

Para las medidas del tiempo de relajación espín-red o longitudinal (T1) se

adquirieron experimentos utilizando diferentes valores en el tiempo de repetición (TR
= 52,5-6002.5 ms) hasta obtener un total de 13 imágenes. El resto de parámetros de

130
 III. Material y métodos

adquisición que permanecieron constantes entre los diferentes experimentos fueron:

NA = 1; TE = 5 ms; MTX = 256 x 128; FOV = 5 x 2,5 cm; grosor del corte = 1 mm; número
de cortes = 1.

Los datos así obtenidos se ajustaron a una exponencial de acuerdo con la ecuación:

S(TR) = S0 [1-exp (-TR/T1)]

donde S(TR) es la señal de la imagen a cada tiempo de recuperación (TR) y S0 es la

señal cuando el TR es igual a infinito.

Para las medidas del Coeficiente de Difusión Aparente (CDA) las imágenes se
adquirieron con seis valores de ponderación de la difusión (valor b = 48,4-54969,9 s
mm-2). El resto de parámetros de adquisición que permanecieron constantes entre los
diferentes experimentos fueron: (NA = 1; TR = 2000 ms; TE = 45 ms; Δ = 25ms; δ = 10
ms; MTX = 256 x 128; FOV = 5 x 2,5 cm; grosor del corte = 1 mm; número de cortes =
1).

Los datos así obtenidos se ajustaron a una exponencial de acuerdo con la ecuación:

S(b)= S0 exp (-CDA * b)

donde S(b) es la señal potenciada en difusión y S0 es la señal de la imagen cuando el

valor de la potenciación en difusión (b) es igual a cero.

Para el procesado de las imágenes se utilizó el programa Image J.

En los experimentos de relaxometría, los tiempos de relajación T2 fueron obtenidos

sin emplear gradientes, es decir, a partir de la muestra completa, utilizando la
secuencia Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG). Se obtuvieron un total de 256 ecos con
un tiempo de eco (TE) de 2 ms. Sin embargo, solamente los ecos pares fueron
registrados y empleados para el cálculo de las distribuciones T2, por tanto, el auténtico
tiempo de eco fue de 4 ms. Las distribuciones fueron obtenidas utilizando el programa
UpenWin 1.01 (Università di Bologna, Bologna, Italia).

Los experimentos de IRM y relaxometría T2 de alto campo se realizaron en la Unidad

de RMN del CAI de Bioimagen Complutense (sede del Instituto Pluridisciplinar).

131
III. Material y métodos

III.9.2. RELAXOMETRÍA DE BAJO CAMPO (LOW-FIELD NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE,

LF-NMR)

Los experimentos espín-eco de relaxometría de RMN bajo campo se realizaron en

un equipo Maran Benchtop Pulsed NMR Analyzer (Resonance Instruments, Witney,
UK), con una frecuencia de resonancia de 23,2 MHz y equipado con una sonda de
temperatura variable de 18 mm (Figura III.10).

Figura III.10. Maran Benchtop Pulsed NMR Analyer.

El tiempo de relajación transversal, T2, se midió utilizando la secuencia de pulsos de

Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) (Carr & Purcell, 1954; Meiboon & Gill, 1958):

[90xo--180yo-) n-adquisiciones]

con un valor (tiempo entre el pulso de 90o y el pulso de 180o) de 150 s. Los datos
adquiridos resultaron de la suma de 16 scans. El tiempo de repetición entre dos
adquisiciones sucesivas fue 2 s. Las muestras cárnicas (4 cm de longitud, 1 cm de
diámetro y aproximadamente 5 g de peso) se depositaron en un tubo cilíndrico de
vidrio (5 cm de longitud, 14 mm de diámetro) que se introdujo directamente en el
equipo. Antes del ensayo, las muestras se atemperaron a 25 oC en un baño de agua
durante unos 15-20 minutos. Los datos de T2 obtenidos se analizaron con el programa
MatLab, versión 6,5, utilizando scripts internos, según el algoritmo de regularización
propuesto por Butler et al., (1981). Las distribuciones de ajuste exponencial se
muestran en una gráfica que refleja la intensidad de la relajación vs tiempo de
relajación. Se realizaron seis medidas de cada producto y tiempo de maduración.

Los experimentos de relaxometría T2 de bajo campo se realizaron en el Food

Science Department (Food, Metabolomics and Sensory Group), Aarhus University,
Dinamarca.

132
 III. Material y métodos

III.9.3. ESPECTROSCOPÍA DE RMN DE ALTA RESOLUCIÓN.

Se utilizaron dos equipos distintos para llevar a cabo los experimentos de RMN de
alta resolución, 1H RMN HRMAS (high resolution magic angle spinning).

Los experimentos realizados en la Unidad de RMN del CAI de Bioimagen

Complutense (sede del Instituto Pluridisciplinar) se llevaron a cabo en un
espectrómetro Bruker AMX500 (BrukerGmBH, Ettlingen, Alemania) que opera a 11,7
Teslas (frecuencia de resonancia 500,13 MHz) equipado con una sonda de HRMAS
(Figura III.11). Se utilizaron aproximadamente 8 - 10 mg de muestra a los que se les
agregó una solución de 20 l D2O con sal de sodio del ácido 3-Trimetilsilil Propionico
(TSP, 0,1 mM). Las muestras se colocaron dentro de un rotor cilíndrico de óxido de
zirconio de 50 l. La velocidad de giro fue de 4 MHz y los ensayos se realizaron a una
o
temperatura de 4 C. La secuencia de pulsos empleada fue 1D NOESY con
presaturación de la señal del agua con un tiempo para la relajación / presaturación de
2 s, un tiempo de mezcla de 150 ms y un t1 fijo de 3 μs. Los espectros fueron
adquiridos a 16k puntos de datos, como suma de 256 adquisiciones con un tiempo
total del experimento de 14 min y una anchura espectral de 8333 Hz.

Todos los espectros fueron procesados utilizando el software Topspin, versión 2.1.
A continuación, se ajustó la fase y la línea base de los espectros y se referenciaron al
TSP δ = 0 ppm.

Figura III.11. Espectrómetro Bruker AMX 500 MHz equipado con una sonda HRMAS (high resolution magic angle
spinnig) para el análisis de muestras semi-sólidas.

Los experimentos de 1H RMN HRMAS realizados en el Food Science Department,

Dinamarca, se llevaron a cabo en un espectrómetro Bruker Advance 600 MHz
(BrukerGmBH, Ettlingen, Alemania) que opera a una frecuencia de resonancia de

133
III. Material y métodos

600,13 MHz, equipado con una sonda de HRMAS (Figura III.12). Una solución de D2O
(15μL) junto con TSP (0,1 mM) se añadió a una cápsula HRMAS desechable Kel-F con
capacidad de 30 μL (Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany) junto con la muestra
cárnica (10 ± 2 mg). La cápsula se introdujo en un rotor de zirconio de 4 mm. Los
espectros 1H RMN fueron adquiridos a 4 oC y una velocidad de giro de 5 MHz. Para ello,
se utilizó la secuencia espín-eco Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) con un tiempo de
eco de 300 ms con el fin de eliminar las señales más intensas correspondientes a
lípidos y macromoléculas. Los espectros fueron adquiridos a 32k puntos de datos, con
un tiempo de repetición de 5 s. Se corrigió su fase, su línea base y finalmente se
referenciaron a TSP utilizando el software Topspin, versión 2.1.

Figura III.12. Espectrómetro Bruker Avance 600 MHz equipado con una sonda HRMAS (high resolution magic angle
spinnig) para el análisis de muestras semi-sólidas.

134
IV. Resultados

135
 IV.1. ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA (MACRO Y
MICRO) DE DISTINTOS PRODUCTOS CÁRNICOS CURADOS

La primera parte de esta Tesis Doctoral compila los

trabajos del 1 al 4, en los que se describen los resultados obtenidos
tras la consecución del primer objetivo.

137
 IV. Resultados

Trabajo 1
Empleo de la IRM como herramienta predictiva para la estimación de parámetros
fisicoquímicos y reológicos durante el proceso de elaboración de jamón curado

Enviado a Meat Science

139
 IV. Resultados

Durante los últimos años, se ha puesto de manifiesto la importancia de desarrollar

nuevos métodos rápidos de análisis con el fin de controlar el proceso de elaboración
de productos cárnicos de forma segura y eficiente. El desarrollo de nuevas
metodologías contribuye a obtener resultados con mayor rapidez, suponiendo ahorro
de tiempo y material. En este contexto, la RMN es una de las técnicas analíticas que
mayor auge ha experimentado en el ámbito alimentario, dadas sus numerosas
ventajas frente a otras metodologías.
Dado el potencial de la IRM para estudiar el interior de los alimentos de forma no
destructiva y no invasiva, en el Trabajo 1 se describe el uso de la IRM como
herramienta predictiva para el cálculo de características reológicas y parámetros de
textura durante la maduración de jamón curado. La IRM permitió la monitorización del
proceso de elaboración del producto, revelando las principales modificaciones
macroestructurales que tienen lugar en la matriz miofibrilar proteica durante la
maduración. Para ello, se analizaron perniles con distinto grado de curado (fresco,
salado, post-salado, secado y bodega) y músculos con distinta localización anatómica
en cada caso (bíceps femoral, semimembranoso y semitendinoso) para observar
posibles diferencias en el proceso de maduración dado su grado de exposición al aire.
Se obtuvieron los parámetros de IRM (T1, T2 y CDA) para cada etapa y músculo y se
observó una progresiva disminución de los mismos con el tiempo de curado, asociada
a las cinéticas de deshidratación y difusión de sal. A partir de los parámetros de IRM
fue posible establecer modelos matemáticos aptos para calcular contenido en agua y
sal, así como características de textura, determinadas normalmente mediante
métodos destructivos, de manera que a partir de un solo análisis sería posible obtener
gran cantidad de información en un tiempo muy corto. El uso de esta metodología
para el control de calidad en las líneas industriales supondría un gran avance,
reduciendo los tiempos de análisis, así como las pérdidas de producto.

141
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

Use of MRI as a Predictive Tool for Physicochemical and

Rheologycal Features During Cured Ham Manufacturing

A.B. García-Garcíaa, M.E. Fernández-Valleb, D. Castejónb, R. Escuderoa, M.I. Camberoa*

a) Sección Departamental de Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad

Complutense de Madrid. 28040 Madrid. Spain.

b) Centro de Asistencia a la Investigación de Resonancia Magnética Nuclear y de Espín

Electrónico. Universidad Complutense de Madrid. 28040. Madrid. Spain.

*Corresponding author. Tel: +34 913943745; Fax: +34 913943743; E-mail: [email protected]

Abstract: Magnetic resonance imaging (MRI) was used to study the structural changes during
dry-cured ham manufacturing. T1, T2 and apparent diffusion coefficient (ADC) were determined.
Dry cured hams were analysed at different steps of the manufacturing process (raw, salted, post
salted, half-cured and cured). Structural changes have been linked with the rheological
behaviour, estimated by texture profile analysis (TPA) performed in three different muscles of
hams (semimembranosus, semitendinosus and biceps femoris). A decrease for T1, T2 and ADC
parameters was observed, connected to the dehydration kinetics and salt diffusion. Curing
process increased hardness and chewiness and reduced elasticity and cohesiveness.
Mathematical models were defined to obtain useful equations to monitor ripening. Multiple and
simple linear regression models were performed to predict water and salt content and rheological
features evolution through MRI parameters. Best settings were achieved with water and salt
content for the three studied muscles (R2 around 0.90). T1, T2 and ADC showed a negative
correlation with hardness and a positive relation with springiness and cohesiveness.

Keywords: cured ham, magnetic resonance imaging (MRI), texture profile analysis (TPA),
predictive models.

143
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

1.Introduction
Dry-curing has evolved from a mere meat preservation process to an improved procedure, in
order to obtain a flavourful and attractive meat product with particular and characteristic sensory
traits (Toldrá & Flores, 1998). Cured ham, in particular, is one of the most valuable meat
products, both inside and outside Spain, with a first-rate consumer acceptance. It is a non-
homogeneous product that undergoes a salting stage and then is subjected to a long
dehydration/ripening process (taking between 12 to 24 months) during which the dynamics of the
migration of the water and salts is balanced (Arnau et al., 1995) and flavour is developed. Given
the technological and economic importance of this product, the development of suitable analytical
tools is essential to know the quality of ham at its best.
A non-invasive and non-destructive way of measuring moisture profiles is through the
application of nuclear magnetic resonance (NMR) techniques. Proton NMR is performed by
applying a radio frequency pulse to a sample within a magnetic field and assessing the relaxation
properties of the hydrogen nuclei of the sample (Charlton, 2009). Magnetic resonance imaging
(MRI) permits the quantification of water content and distribution, ant its interaction with the food
matrix by magnetic resonance parameters such as transverse relaxation time (T2), longitudinal
relaxation time (T1) and the apparent diffusion coefficient (ADC). (Fantazzini et al., 2009; Marcone
et al., 2013). These magnetic resonance parameters are potentially sensitive to variations of
water mobility and enviroment (T1 and T2) and facility of diffusion of the water in all directions
(ADC) resulting from the modification of water macromolecule interactions and changes in tissue
structure (Boulby & Rugg-Gunn, 2003; Gowland & Stevenson, 2003; Wheeler- Kingshott et al.,
2003). Due to the extensive information gained through this technique, it has been used in meat
science to study carcass composition, adipose tissue distribution, connective tissue and muscle
fibre type. These parameters have also been correlated with meat properties, including pH,
water-holding capacity, moisture, texture and sensory attributes. (Tingle et al. 1995; Bonny et al.,
2000, Cernadas et al., 2005, Laurent, Bonny & Renou, 2000, Guiheneuf et al. 1997; Guiheneuf et
al 1996; Herrero et al., 2007, Herrero et al. 2009; Mitchell et al., 2001, Renou, Foucat & Bonny
2003, Ruiz-Cabrera et al., 2004 and Shaarani, Nott & Hall, 2006). However, few studies have
been performed on dry-cured ham (Manzocco, L., 2013; Fantazziniet al., 2009) and even this
technique has not been used so far to carry out a detailed study of the changes that take place
during Spanish dry cured ham manufacturing.
Moreover, texture is one of the key quality attributes used in the food industry to assess
product quality and acceptability. Meat products obtained by processing operations, such as
curing, show a non-isotropic behaviour, influenced by the internal structure, including different
tissues and different chemical composition. The evaluation of the rheological behaviour
contributes to understand the effect of processing on products, probes the system structure and
reveals critical aspects of food texture (Foegeding, 2003). Nowadays, the most commonly used
instrumental method is probably, the texture profile analysis (TPA) test, which is based on the
imitation of chewing process and is performed with double-compression cycles. TPA has been

144
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.1.1., 1-23

employed for many authors as a usual way to evaluate sensorial properties of cured ham (Tabilo
et al., 1999; Morales et al., 2007a, 2007b; Aliño et al., 2010; Benedini et al., 2012).
The aim of this study was to apply MRI technique to pork in different stages of the curing
process to determine relaxation times T1 and T2, and ADC, relating these results to those
obtained from compression textural analysis (TPA) and physicochemical characteristics in order
to obtain useful equations to monitor the ripening process. Linear regression statistics could be
used to predict physicochemical and rheological behaviour using the imaging parameters as
predictor variables.
This study constitutes the first attempt to relate MRI parameters, which provide structural
information, with textural attributes of meat products. The establishment of suitable mathematical
models would allow using MRI to estimate the rheological behaviour of meat products without
realizing complex instrumental analyses, such as the TPA, which requires a laborious procedure.
Finally, this work is focused on increasing the existing knowledge on the potential application of
the MRI for the estimation of food quality and process control.

2. Materials and methods

2.1. Meat sampling

A total of 35 fresh hams (10-11 kg) obtained from white-breed pigs, (Landrace x Large White
female animals slaughtered at 100-120 kg live weight), were purchased from a local
manufacturing plant. The legs were randomly chosen. The process of salting and ripening was
the one usually followed by a standard production plant of Spanish dry-cured hams (Santos et al.,
2008). Sampling was carried out at the most relevant stages of the process (Figure 1):
▪ Raw hams (R). The pieces were taken at 3 days after slaughter.
▪ Salted hams (S). Raw hams were covered with a mixture of salts (NaCl amount
equivalent to 2% of the weight of the ham, 200 ppm of KNO 3 and 100 ppm of NaNO2).
Samples were taken one hour, approximately, after salt addition.
▪ Post-salted hams (PS). Hams covered with salts were staked for a period of 0.75 day
per kg of fresh ham. The samples were taken after removing salt left on the surface of
the hams.
▪ Hams in drying period for 6 months (Half-cured hams, 6M). Post-salted hams were
washed with cold water and hung for 30 days at 4 ± 1 oC. Then the pieces were
maintained at 13–15 oC and RH 75–85% for three months, and at 22–26 oC, RH 60–
75% for two months.
▪ Hams analysed at 8 months corresponding to the end of the drying process (Half-
cured hams, 8M). Pieces processed as previously mentioned but taken after three
months at 13–15 oC and RH 75–85%, and four months at 22–26 oC, RH 60–75%.

145
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

▪ Hams at ripening process with a total ageing of 12 months (Ageing, 12 M). After a
drying process of 8 months, the cured hams were left for four months at 12-17 oC and
RH 60-80%

Figure 1. Sample collection and sampling procedure, showing the Anatomical localization of muscles under analysis
(Bíceps femoris [BF], Semimembranosus [SM] and Semitendinosus [ST]) in the pork leg.

146
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1, 1-23

▪ Hams ripened up to 20 months (Ageing, 20 M): dry-cured hams with a total ripening
period of 20 months.
5 pieces were analyzed at each stage. All the hams used corresponded to the right side of the
animal. Once the bones, skin and fat had been removed, muscles corresponding to different
anatomical locations [biceps femoris (BF) and semitendinosus (ST), internal-type muscles, and
semimembranosus (SM), an external-type one] were taken from the leg, as displayed in Figure 1.
The visible fat and connective tissue were totally removed from the separated muscles pieces.

2.2. Physicochemical analyses

Water activity (aw), pH, dry matter (DM), salt content and fat content were determined in
triplicate samples of each of the considered muscles. aw was measured using a Decagon CX1
hygrometer (Decagon Devices Inc., Pullman,WA, USA) at 25 oC. The pH was determined in a
homogenate of the sample with distilled water (1:10) (w/v), using a Crison Digit-501 pH meter
(Crison Instruments LTD, Barcelona, Spain). DM was determined by drying the sample at 110 oC
to constant weight and the results were expressed as a percentage (AOAC, 2006). The salt
content was measured by AOAC method 935.47 (AOAC, 1995). Fat content was determined
using the method of Bligh and Dyer, described by Hanson and Olley (1963).

2.3. Magnetic Resonance Imaging (MRI)

MRI experiments were performed using a Bruker BIOSPEC 47/40 spectrometer (Bruker
GmBH, Ettlingen, Germany) operating at 4.7 T (200 MHz). Magnetic field gradients for imaging in
the three orthogonal directions were generated by a 6 cm actively shielded gradient set capable
of reaching 450 mTm-1. Each of the samples for imaging, coming from the inner part of each of
the three muscles studied (BF, ST, SM), was cut approximately 4 cm long, 2 cm wide and 1.5 cm
thick. Individual specimens were placed in a radio frequency birdcage coil with an inner diameter
of 3.5 cm. The temperature inside the magnet was maintained at 18 °C using a water circulator.
For the MRI experiments a first global shimming was performed and then three scout spin-echo
experiments in axial, sagittal and coronal directions were acquired.
For measurements of T2, 60 separate images were acquired at different echo times (TE = 5-
300 ms). All other imaging parameters remained constant between images (NA = 1; TR = 3046.1
ms; MTX = 256 x 128, FOV = 5 x 2.5 cm; slice thickness = 1 mm; slice number = 1).
T1 relaxation time measurements were conducted on the same slice using a spin-echo
sequence. 13 separate images were acquired at different recovery times. TR varied from 52.5 to
6002.5 ms. All other imaging parameters remained constant between images (NA = 1; TE = 5 ms;
MTX = 256 x 128; FOV = 5 x 2.5 cm; slice thickness = 1 mm; slice number = 1).
To measure the apparent diffusion coefficient (ADC), separate images were acquired at six
diffusion weightings (b value varied from 48.4 to 54969.881 s mm-2). All other imaging parameters

147
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

remained constant between images (NA = 1; TR = 2000 ms; TE = 45 ms; Δ = 25ms; δ = 10 ms;
MTX = 256 x 128; FOV = 5 x 2.5 cm; slice thickness = 1 mm; slice number = 1).
From these sequences, T1, T2 and ADC maps were calculated using Image J 1.44p (Rasband,
W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA). The mean values at
ten different Region of Interest (ROIs) in each map were measured to obtain the T1, T2 and ADC
values.

2.4. Texture Profile Analysis (TPA)

Texture profile analysis (TPA) was performed using a TA.XT2i SMS Stable micro Systems
Texture Analyser (Stable Microsystems Ltd., Surrey, England) with the Texture Exponent 32,
6.0.7.0. version. Eight sample cores (diameter = 2.5 cm, height = 1.0 cm) were obtained from the
inner part of each of the studied muscles. A double compression cycle test was performed of up
to 50% compression of the original height with an aluminium cylinder probe P/25. Force–time
deformation curves were obtained with a 5 kg load cell applied at a cross-head speed of 1.0
mm/s. Hardness (N); springiness (cm); adhesiveness (N s); cohesiveness (dimensionless);
gumminess (N), (hardness × cohesiveness) and chewiness (J) (hardness × cohesiveness ×
springiness) were quantified according to Segura et al., 2015. The compression force was
performed in longitudinal direction to muscle fibres. Measurements of samples were carried out at
room temperature.

2.5. Statistical analysis

Statistical analyses were perfomed using Statgraphics Centurion XVI for Windows (Statistical
Graphics Corporation, Rockville, MD, USA). Data were presented as mean values and standard
deviation (SD). Chemical and TPA analyses were carried out in triplicate. To check the normal
distribution (90% confidence) of samples, the Shapiro–Wilks test was applied. When samples
fitted the normal distribution, the one-way ANOVA analysis was performed. When samples did
not fit the normal distribution, the Kruskal–Wallis test was used to test the null hypothesis that the
medians of variable within each of the levels in the samples were the same. Both Duncan´s test
for multiple mean comparisons and the Pearson product moment correlation (R), using the
Durbin–Watson statistic tests at 95%, of confidence level, were performed to determine the
relationships between data from TPA, physicochemical analysis and MRI parameters.
The multiple linear regressions were performed to determine the relationships between data
obtained by water and salt analysis, TPA and NMR parameters. To describe the relation between
textural and MRI parameters, surface models were obtained by regressions analysis to estimate
the response function as shown below:

Y = o + ∑i Xi +∑ iiXi2 +∑ ij XiXj

148
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.

where Y is the predicted response (estimated textural parameters values), o,  i, ii, and ij, are
the estimated coefficients from regression. They represent the linear, quadratic and cross-product
relation among MRI parameters [T1 (X1), T2 (X2) and ADC (X3)] and textural features on the
response. ANOVA was applied to test the statistical significance of each factor introduced in the
model and non-significant factors, with a confidence level of 95% (p > 0.05), were gradually
eliminated. In order to check the goodness of fit of the calculated models, Root Mean Square
Error (RMSE) was also obtained according to the following equation:

RMSE 
  Xpred  Xobs  2

n
where, Xpred is the estimated data, Xobs is the result obtained in the experimental analyses and
n the number of samples.

3. Results and discussion

3.1. Physicochemical analyses

The mean values and their corresponding deviation of the physicochemical characteristics
obtained for each of the main stages of the curing process are shown in Table 1. aw dropped after
12 months of ripening in the three considered muscles. This decrease in a w is the main
mechanism to ensure the microbiological product safety since pH underwent little variation during
the process and remained at values ranging from 5.57 to 6.30. Dry matter (DM) content of the
muscles selected increased significantly throughout the curing process (p < 0.05). Lower moisture
content and aw are related to salting due to the osmotic effect of salt added to the surface of ham
and dehydration during resting and maturation. Significant differences (p < 0.05) were found
among muscles. As expected, the moisture content decreased quicker in the external muscle
(SM) not covered by skin and/or fat than in the inner ones (BF and ST) (Arnau, Casademont &
Gou, 1995) so SM presented the highest DM values and the lower a w during the hole process.
Although ST is located in a deeper layer of the pieces, BF is surrounded by a thick layer of fat,
which reduces its water loss (DM around 44.0 g/100 g product in BF and around 49.9 g/100 g
product in ST at the end of processing time). An increase on NaCl content was observed during
the studied stages, related to the penetration of the salt added to the raw pieces. At the end of the
ripening time, the highest NaCl content (p < 0.05) was observed in BF muscle (5.7±0.7) followed
by SM and ST, with values of 5.1±0.5 and 4.7±0.2, respectively. These results are in agreement
with the findings obtained by several authors (Arnau, Casademont & Gou, 1995; Fantazzini et al.,
2009). Raw ST presented the highest fat content (5.46±0.2 g/100 g product), followed by BF and
SM (2.40±0.1 and 2.13±0.1 g/100 g product, respectively). With the progressive loss of water
occurred the ensuing increase in the percentage of fat from pieces. According to previous studies
(Kim et al, 2008), at the end of the process, ST presented the higher value (13.94±1.3 g/100 g
product) followed by BF (12.91±1.2 g/100g product) and SM (11.11±1.2 g/100 g product). In

149
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, V.1.1., 1-23

Table 1. Physicochemical properties and chemical composition of muscles in different stages of the curing process of ham

Muscle type Sample aw pH DM Salt content Fat content

(g DM/100 g product) (g salt/100 g product) (g fat/100 g product)
Raw 0.960±0.013 a, α 5.77±0.15 d,  26.62±1.32 f,  2.40±0.16 c, 
Salted 0.967±0.002 a, α 6.02±0.15 a,  28.21±1.31 e,  7.27±0.92 b,
Postsalted 0.959± 0.005 b, α 6.03± 0.01 a,  31.04±0.80 d,  0.88±0.99 b, β 8.50±1.10 b, 
BF
Half-cured (6 months) 0.911±0.011 c, α 5.89±0.16 c,  38.92±0.81 c,  4.32±0.91 a, α 11.19±1.34 a, 
Half-cured (8 months) 0.911±0.007 c, α 6.00± 0.01 ab,  40.52±1.23 b,  4.62±0.98 a, α 11.01±0.85 a, 
Ageing (12 months) 0.893±0.003 d, α 5.98±0.05 b,  41.52±0.73 b,  5.7±0.73 a, α 12.91±1.24 a, 
Ageing (20 months) 0.890±0.004 d, α 5.94±0.03 b,  44.04±0.75 a,  6.01±0.81 a, α 12.54±0.71 a, 
Raw 0.959±0.013 a, α 5.65±0.08 d,  25.90±1.66 f,  2.13±0.14 d, 
Salted 0.957±0.005 a, β 6.08±0.10 a,  29.72±1.91 e,  5.44±0.44 c, c
Postsalted 0.936± 0.014 b, β 6.18± 0.12 a,  41.52±0.80 d,  5.35±0.88 a, α 5.10±0.63 c, c
SM Half-cured (6 months) 0.902±0.010 c, α 5.87±0.17 c,  48.21±2.91 c,  5.05±0.44 a, α 8.94±0.56 b, 
Half-cured (8 months) 0.897± 0.003 c, β 5.95± 0.01 b,  56.42±1.45 b,  5.55±0.46 a, α 10.35±0.90 a, 
Ageing (12 months) 0.876±0.003 d, β 5.98±0.05 ab,  60.35±0.48 a,  5.18±0.59 a, α 11.11±1.24 a, 
Ageing (20 months) 0.868±0.013 d,  5.89±0.02 c,  61.23±0.72 a,  5.79±0.77 a, α 11.24±0.54 a, 
Raw 0.962± 0.004 a, α 5.97± 0.22 ab,  28.2±0.52 d,  5.46±0.22 c, 
Salted 0.960± 0.003 a, β 6.14± 0.10 a,  28.4±0.99 d, 11.78±0.83 ab, 
Postsalted 0.955± 0.004 b, α 6.01± 0.01 b,  39.5±1.12 c,  0.69±0.18 c,  12.21±1.27 a,
ST Half-cured (6 months) 0.906± 0.009 c, α 5.91± 0.15 b,  41.8±1.32 c,  4.32±0.31 b, α 12.52±0.88 a, 
Half-cured (8 months) 0.909± 0.004 c, α 5.93± 0.02 b,  44.1±0.88 b,  4.81±0.71 b, α 12.71±1.14 a, 
Ageing (12 months) 0.886± 0.008 d, α 5.96± 0.04 b,  47.8±1.36 a,  4.79±0.28 a, β 13.94±1.32 a, 
Ageing (20 months) 0.881± 0.002 d, β 5.91± 0.01 c,  49.9±1.84 a, 5.01±0.88 a, β 13.27±0.62 a, 

a, b: values in the same column for a same muscle with different lyrics differ significantly (P<0.05) (differences in a same muscle throughout the process)

: values in the same column for the same curing stage of different muscles with different lyrics differ significantly (P<0.05) (differences between muscles throughout
the process)

150
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.

general, the estimated parameters are within the range of values for different hams cured
Spanish type (Arnau, Casdemont & Gou, 1995; Fernández et al, 2007; Santos et al, 2008).

3.1. Magnetic Resonance Imaging (MRI)

3.2.1. Longitudinal or spin-lattice relaxation time

Figure 2.A shows MRI T1 maps of ham at different relevant ripening times. The intensity of the
signal acquired is determined by the interactions between the protons and other nuclei in the
environment. Free water presents high T1 values because of its mobility; when water is bound to
macromolecules there is a loss of mobility with easier energy release and a decrease in the T1
values. (Gowland & Stevenson, 2003).

BF SM ST BF SM ST BF SM ST
Raw

Salted
1600.0 ms 100.0 ms 1.0 · 10-3 mm 2/s

Post-salted

Half-cured (6 months)

Half-cured (8 months)

Ageing (12 months)

Ageing (20 months)

0.0 ms 0.0 ms 0.0 mm 2/s

A. T1 maps B. T2 maps C. ADC maps

Figure 2. T1, T2 and ADC maps obtained using MRI tool. A: T1 maps, B: T2 maps; C: ADC maps.

T1 maps were characterised by areas with different intensity level. Fat appeared dark than
lean tissue due to the ease in the relaxation of protons in the lipid molecules compared to those
present in muscle.
Table 2 shows the median value of MRI parameters calculated for different Regions of Interest
(ROIs) of BF, SM and ST. A progressive reduction of average T1 was observed throughout
ripening time in each of the concerned muscles. In BF, T1 value decreased from 1409.0±78.2 ms
in raw product to 707.5±13.4 ms in finished ham. The same trend was observed in the SM and
ST muscles in which this parameter went from 1388.3±73.9 to 483.6±29.8 ms and from
1403.4±47.5 to 698.0 ± 9.3 ms, respectively.
The observed T1 reduction is due to the salt diffusion and water evaporation that takes place
during the dry-curing progress. From the salting stage, sets a gradient of moisture from the inside
to the surface of the meat pieces and from the surface to the environment. These facts, respond
to the flow of water out by evaporation, osmotic dehydration and dissemination, all favoured by
environmental conditions in which develops the process and salt addition (Arnau & Gou, 2001).

151
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

Table 2. IRM parameters from Bíceps femoris (BF), Semimembranosus (SM) and Semitendinosus (ST) muscles in different stages of the process.

BF SM ST
T1 T2 ADC T1 T2 ADC T1 T2 ADC
(ms) (ms) (10-3 mm2/s) (ms) (ms) (10-3 mm2/s) (ms) (ms) (10-3 mm2/s)
Raw 1286.2±58.2 a, 45.6±1.7 a, 0.26±0.02 b, 1509.0±136.7 a, 47.1±1.1 a, 0.27±0.04 b, 1465.8±100.5 a, 46.9±1.2 a, 0.15±0.01 d,
Salted 1232.7±32.5 a, 42.5±1.1 b, 0.24±0.01 b, 1255.3±63.7 b, 41.2±2.2 b, 0.70±0.04 a, 1189.0±70.0 b, 46.2±1.0 a, 0.89±0.11 a,
Postsalted 1136.5±75.3 b, 40.9±2.4 b, 0.89±0.07 a, 1026.5±34.2 c, 35.7±2.6 c, 0.77±0.07 a, 1121.3±94.3 b, 39.8±1.5 b, 0.76±0.04 b,
Half-cured (6 months) 965.3±33.5 c, 28.3±6.0 c, 0.08±0.03 c, 778.8±30.6 d, 27.7±2.6 d, 0.16±0.03 c, 806.8±35.2 c, 30.9±2.0 c, 0.18±0.03 c,
Half-cured (8 months) 737.7±27.9 d, 26.9±2.2 c, 0.06±0.01 c, 694.1±48.0 e, 19.7±3.2 e, 0.02±0.00 e, 800.7±47.4 c, 26.1±1.7 d, 0.05±0.00 e,
Ageing (12 months) 707.6±29.9 d, 24.7±3.6 c, 0.08±0.03 c, 592.7±20.2 f, 19.2±2.2 e, 0.06±0.03 d, 693.0±33.5 d, 24.8±1.9 d, 0.20±0.03 c,
Ageing (20 months) 704.7±19.0 d, 15.4±1.1 d, 0.04±0.01 d, 478.5±28.7 g, 9.7±1.2 f, 0.01±0.00 e, 695.9±26.5 d, 12.8±0.9 e, 0.02±0.00 f,

a, b: values in the same column for a same muscle with different lyrics differ significantly (P<0.05) (differences in a same muscle throughout the process)

: values in the same column for the same curing stage of different muscles with different lyrics differ significantly (P<0.05) (differences between muscles throughout the
process)

10

152
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.

T1 values are also associated with muscle location within the ham. BF and ST are inner muscles
of ham cushion; moisture decrease and salt uptake occur slowly, whereas SM is an outer muscle
of the thigh, undergoing a direct exposure to air dehydration from salting to maturing. It is
characterized by a marked moisture decrease that results in the lowest T1 among assayed
muscles at the same processing time. Moisture content in BF exceeds the values found in SM
and also in ST during the whole process, so that T1 gets the highest value for this muscle.
Moreover, fat protons have lower relaxation time T1 than muscle protons. This phenomenon is
related to lower average T1 of marbled muscles like ST.

3.2.2. Transverse or spin-spin relaxation time

MRI T2 maps are shown in Figure 2.B. Transverse relaxation time (T2) is mainly correlated
with water mobility and is particularly sensitive to the porosity of the sample matrix. Longer T2
times correspond to free water and to large pores or spaces in the sample matrix (Simpson et al.,
2003). Therefore, any treatment or procedures, which reduce the porosity or free water, or
increase the degree of water binding with the structures of the environment produces a drop in T2
value (Boulby & Rugg-Gunn, 2003).
T2 maps showed different areas: lean tissue gave a signal of low intensity due to its high
structuration (mid-grey areas), while the signal caused by the fat was more intense (brighter
zones). A high signal is related to greater coherence in relaxation, less influence among nuclei
and, therefore, more tissue desestructuration.
Muscular average T2 showed similar evolution to T1, decreasing gradually with the progress of
the drying process (Table 2). T2 values measured in raw ham experiments were: 46.1 ± 1.1 ms
for BF, 46.7 ± 0.8 ms for SM and 46.9 ± 1.5 ms for ST. At the end of the process, relaxation times
of 14.5±0.5 ms, 9.0±0.5 ms and 12.6±0.7 ms, respectively, were obtained.
In addition to dehydration and muscle salt absorption, already mentioned, during curing
process another phenomenon with a strong influence on T2 takes place: the solubilisation of
myofibrillar proteins results in a reduction of the gap between filaments and prevents the
molecular mobility, which leads to increase the compaction of muscle and to reduce T2 signal
(Fantazzini et al. 2009; Manzocco et al. 2013).
Regarding the three muscles studied the decline in T2 is especially remarkable in SM
according to the intense dehydration suffered throughout the process. ST and BF are very similar
(Figure 2; Table 2).

3.2.2. Apparent diffusion coefficient

The apparent diffusion coefficient (ADC) is a measure of the average translational motion of
water molecules. ADC maps are shown in Figure 2.C. Water in a free environment can easily
spread in all directions. In biological tissues, the moisture content is compartmentalized by cell
walls and protein structures that condition its mobility. In this way, the destruction of these
biological barriers is reflected by an increase in the ADC values (Wheeler-Kingshott et al., 2003).

11

153
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV1.1.,1-23

Throughout ripening a decrease in ADC was observed in almost every of the considered times,
except during the salting and post salting stages, in which an increase of ADC occurred due to
salt-induced osmotic effect and protein solubilization. The higher ADC value for SM (0.89*10-3 ±
0.05 mm2 s-1) was reached during the salting stage due to its direct contact with the added salt at
this time. The inner location of muscles BF and ST make the salt uptake slower and is not even
reached the resting phase when a higher diffusion of water is observed (0.77*10-3 ± 0.07 mm2s-1
in BF and 0.76*10-3 ± 0.04 mm2s-1 in ST).
As the process progresses, the restricted diffusive motion of water (low ADC) is observed. The
water that remains after dehydration is strongly linked by myofibrillar structures. This retention is
favoured by the presence of salt in the middle, since salt absorption is related to higher water
holding capacity and protein solubilisation. Both phenomena, dehydration and salt uptake, result
in a gradually descent of ADC that reaches the minimum value at the end of the manufacturing
process (0.03*10-3 ± 0.01 mm2s-1 in BF; 0.008*10-3 ± 0.002 mm2s-1 in SM and 0.02*10-3 ± 0.002
mm2s-1 in ST). As expected, ADC temporal changes were more pronounced in SM due to its
external location, whereas the values in BF and ST were very close, not finding significant
differences (p > 0.05) between both muscles for the same processing time. Although ST is a
muscle with higher fat content, fat had not led a barrier to water diffusion.
Drying and salting, however, did not affect significantly to the T2 relaxation time values
because the contribution of the myofibrillar water on this parameter is much larger than the input
of another more mobile water populations, that would be the more involved in the above-
mentioned ADC increase. In the post-salting stage, when dehydration was stronger, both
parameters, T2 and ADC, decreased, suggesting a remarkable loss of water in the whole product.

3.3. Evolution of rheological behavior

Values of rheological parameters obtained from the texture profile analysis (TPA) are shown in
Table 3. Significant differences (p < 0.05) were found between different stages of the process and
between the three studied muscles. In dry-cured ham, texture is a characteristic directly related to
the muscle structure, especially related to the degradation of myofibrillar protein and collagen as
well as to the intramuscular fat content and drying rate (Toldrá, 1998).
In accordance with previous studies, Monin et al., 1997, Serra et al. 2005, hardness increased
during ripening. When lower water activity and water content values were reached, hardness
increased significantly. Similarly, it also varies the chewiness since it is a secondary textural
characteristic (product of hardness x cohesiveness x elasticity). Salt could also increase the
stability and rigidity of the myofibrillar muscle structure since stiffness is increased by
mineralization. In the three muscles considered, a progressive trend was observed and the
maximum value of hardness and chewiness was reached at the end of the ripening. The muscle
that kept the highest hardness and chewiness values throughout the process was SM, followed
by BF and finally ST, the softest and the weakest of the three muscles studied. ST showed higher
fat content, lower mineralization level due to its intern location and medium moisture level that
12

154
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

Table 3. Texture parameters of Biceps femoris (BF), Semimembranosus (SM) and Semitendinosus (ST) muscles in different stages of the dry-cured ham manufacturing process

Muscle Hardness Springiness Gumminess Chewiness Adhesiveness

Sample Cohesiveness
type (N) (10-3 m) (N) (10-2 J) (N s)
Raw 6.98±1.79 d, 1.22±0.60 b, 0.51±0.06 ab, 3.72±0.87d, 0.45±0.12 c, -0.83±0.20 ab,
Salted 14.62±2.18 cd, 1.41±0.30 ab, 0.54±0.03 a, 8.33±1.07 bc, 1.17±0.26 b, -0.35±0.19 a,
Postsalted 10.76±0.74 c, 1.77±0.44 ab, 0.52±0.03 ab, 5.52±0.68cd, 0.98±0.25 b, -0.42±0.15 a,
BF Half-cured (6 months) 13.29±0.22 c, 2.04±0.55 ab, 0.56±0.12 ab, 7.34±1.19 bcd, 1.54±0.65 b, -2.09±0.63 c,
Half-cured (8 months) 19.46±1.74 b, 1.80±0.21 ab, 0.50±0.01 ab, 10.17±1.71b, 1.83±0.25 b, -1.32±0.03 b,
Ageing (12 months) 19.74±1.23 b, 2.32±0.45 a, 0.49±0.04 ab, 9.07±0.76 bc, 2.11±0.48 b, -1.41±0.48 b,
Ageing (20 months) 39.40±4.44 a, 2.29±0.81 a, 0.58±0.14 a, 21.57±4.98 a, 5.21±1.71 a, -0.43±0.17 a,
Raw 6.55±0.20 d, 0.14±0.09 c, 0.59±0.07 ab, 3.78±0.47 c, 0.06±0.02 e, -1.43±0.41 c,
Salted 6.71±0.97 d, 0.17±0.04 c, 0.60±0.06 ab, 3.97±0.54 c, 0.07±0.02 e, -1.37±0.35 c,
Postsalted 10.67±1.32 d, 1.74±0.48 b, 0.46±0.003 bc, 5.28±0.99 c, 0.95±0.10 d, -0.77±0.34ab,
SM Half-cured (6 months) 26.20±0.61 c, 2.71±0.91 a, 0.56±0.04 bc, 12.00±3.30 c, 3.64±1.93 c, -0.94±0.35bc
Half-cured (8 months) 16.56±1.75 cd, 3.27±0.37 a, 0.38±0.02 d, 6.42±1.09 c, 2.12±0.59 c, -0.63±0.20d
Ageing (12 months) 54.52±4.91b, 1.94±0.15 b, 0.49±0.02 cd, 25.90±3.93 b, 5.06±1.05 b, -0.75±0.22ab
Ageing (20 months) 99.30±21.31 a, 1.57±0.22 b, 0.63±0.03 a, 62.07±16.68 a, 10.08±4.01 a, -0.33±0.16 a
Raw 4.69±0.19 e, 0.42±0.10 b, 0.49±0.03 bc, 2.56±0.27 d, 0.11±0.04 d, -0.30±0.51 a,
Salted 7.34±1.36 d, 0.38±0.19 b, 0.54±0.02 ab, 4.22±1.57 cd, 0.18±0.08 d, -0.43±0.15 a,
Postsalted 9.72±1.80 c, 0.51±0.33 b, 0.58±0.06 ab, 5.92±1.29 c, 0.33±0.21 d, -1.15±0.06b
ST Half-cured (6 months) 10.23±0.75 c, 2.16±0.80a, 0.48±0.04 bc, 4.93±0.62 c, 1.01±0.46 c, -1.38±0.30b
Half-cured (8 months) 10.84±0.72 c, 2.33±0.51 a, 0.48±0.03 bc, 5.31±0.86 c, 1.26±0.41 bc, -1.44±0.19b,
Ageing (12 months) 19.04±0.70 b, 2.10±0.40 a, 0.54±0.04 a, 10.36±1.33 b, 2.19±0.56 b, -1.02±0.50b
Ageing (20 months) 32.67±2.08 a, 2.15±0.53a, 0.57±0.03 a, 18.41±1.36 a, 4.01±1.23 a, -0.27±0.09a

a, b: values in the same column for a same muscle with different lyrics differ significantly (P<0.05) (differences in a same muscle throughout the process)
: values in the same column for the same curing stage of different muscles with different lyrics differ significantly (P<0.05) (differences between muscles throughout the
process)

13

155
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

cause a lower mechanical resistance in that muscle compared with BF and, especially with SM,
characterized for an intense dehydration.
According to Serra et al., 2005, cohesiveness and springiness showed a positive linear
relationship with aw and moisture content. With increasing dehydration, cohesiveness (extent to
which a material can be deformed before it ruptures) and springiness (rate at which a deformed
material goes back to its initial form after the deforming force is removed) were reduced. SM
presented also the higher values for cohesiveness and springiness during the process. The
adhesiveness (degree to which the surface of the ham muscles adheres to the palate during
chewing process) not experienced regular changes during ripening. In each of the three muscles
studied, a decrease in adhesiveness since raw ham to cured ham was observed, although there
was not a progressive reduction. BF resulted to be the one presenting the lower value of
adhesiveness at the end of the process.

3.3. Relationship between MRI parameters and physicochemical characteristics

3.4.1. MRI parameters versus water and salt contents

For all the considered muscles, multiple linear regressions were performed using the water
and salt contents, as dependent variables, and MRI parameters (T1, T2 and ADC) as independent
variables (Table 4).
A highly significant multiple linear regression was found between water content (R2=0.973 for
BF; R2=0.980 for SM and R2=0.975 for ST; p < 0.05) and MRI parameters. Salt content is also
highly correlated with MRI parameters (R2=0.994 for BF; R2=0.959 for SM and R2=0.990 for ST; p
< 0.05).
These relations correspond to salt kinetics, drain and reverse flow of moisture that takes place
from the outside of the ham (represented by SM) and the interior (related through BF and ST).
The possibility of MRI non-destructively monitoring water content and NaCl concentrations in
cured ham was previously addressed by other authors. Guiheneuf et al., 1996 achieved
quantitative maps of cured pork samples based on MRI parameters such as T1, T2 and proton
density, showing a decrease for these parameters in pork samples cured with increasing NaCl
amounts. Linear relationships (p < 0.0001) were found between muscle water and salt content
and MRI T1 and T2 parameters in Longissimus dorsi muscle salted with different NaCl
percentages. (Fantazzini, 2005). Multiple regression analysis was also used to compute a model
fitting salt content in ST and BF of Parma ham. T1, T2, their ratio T1/T2 and proton density S0 were
used to establish this model. Salt content resulted to be highly correlated with MRI parameters
(R2=0.90, p < 0.001) (Fantazzinni, 2009).
Results of the multivariate analysis confirm that MRI parameters (T1, T2 and ADC) were
relevant for constructing multiple regression models to predict water and salt content for cured
ham.

14

156
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

Table 4. Multiple linear regression analysis of physicochemical characteristics (water content and salt content) versus MRI parameters (T1, T2 and ADC) of ham

Dependent variable Muscle type R2 SE Independent variable Regression coefficient t- values

Water content BF 0.973 0.987 Constant 44.350 64.532
T1 0.005 3.188
T2 0.431 8.226
ADC 3.060 3.613
SM 0.980 1.989 Constant 18.691 16.705
T1 0.016 2.842
T2 0.688 4.377
ADC 5.291 4.110
ST 0.975 1.326 Constant 31.818 28.314
T1 0.007 2.236
T2 0.612 5.528
ADC 4.773 3.596
Salt content BF 0.994 0.205 Constant 8.021 11.460
T1 -0.003 -5.887
T2 -0.005 -0.217
ADC -4.968 -6.236
SM 0.959 0.245 Constant 16.236 13.764
T1 0.0004 2.867
T2 -0.096 -2.845
ADC 10.819 4.756
ST 0.990 0.212 Constant 8.815 10.510
T1 -0.004 -4.073
T2 -0.022 -0.979
ADC -3.302 -3.712
R2 = coefficient of determination (adjusted for degrees of freedom); SE = standard error; P<0.0

15

157
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

MRI parameters are related to water and salt content and distribution, so the results obtained
by regression analysis are in accordance with those obtained by other authors throughout the
curing process (Monin et al.1997, Serra et al. 2005).

3.4.2. Relationship between MRI parameters and rheological characteristics

In order to allow a closer examination of how textural response of muscle is related to their
structural organization, the relation among textural features and MRI parameters (T1 and T2
relaxation times and ADC) was studied. To this end, response surface model was calculated
because it is more flexible and it can take a large variety of functional forms.
The surface models were obtained to estimate the response function for the parameters procured
directly from TPA (hardness, springiness, adhesiveness, and cohesiveness). Secondary
attributes (gumminess and chewiness) were not considered. The regression model with
significant (P < 0.05) regression coefficients are showed in Table 5. An example of the estimated
response surfaces obtained for each muscle (BF, ST and SM), considering an ADC value of
0.5.10-3 (mm2/s) are plotted in Figure S1.
Overall, high regression coefficients for all TPA parameters of the three studied muscles were
obtained (Table 5), definitely due to the relationship between MRI parameters and muscle
structure, which determines its rheological behaviour (Romero de Ávila et al., 2014). Differences
in the regression models reflect different degree of muscle affectation by the dry-curing
manufacturing process, mainly due to the anatomical morphology characteristics and the
chemical composition (mostly the amount of collagen and intramuscular fat). ST is located in a
deeper layer of the ham and although BF is more external, it is surrounded on the outside by a
thick layer of fat, which reduces its water loss. SM occupies more external positions and would
therefore be subject to the greatest degrees of dehydration (Romero de Ávila et al., 2014). BF, in
comparison to SM and ST, presents the highest collagen content.
To determine sample standard deviation between predicted values and observed values, the
RMSE was calculated for each TPA parameter of the three muscles (Table 5). The results
confirmed acceptable goodness of fit of the model for TPA parameters of each muscles of ham.

16

158
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV1.1., 1-23.

Table 5. Estimated response surface model relating textural properties to magnetic resonance image (MRI) parameters of different muscle [biceps femoris (BF), semitendinosus (ST), and
semimembranosus (SM)] in different stages of the dry-cured ham manufacturing process.

R2adjusted
Muscle R2
Regression models for d.f. P RMSE
type (percent)
(percent)
Hardness = 38.58 + 0.13*T1 - 5.07*T2 + 254.63*ADC + 0.34*T22 - 0,01*T1*T2 + 2.05*T1*ADC – 63.23*T2 0.0000
97.44 96.06
*ADC
Cohesiveness = 1.02 – 0.09* T2 + 19.67*ADC + 0.000002* T12 + 0.006* T22 + 7.76*ADC2 -
91.01 83.65 0.0000
0.0002* T1* T2 + 0.02* T1*ADC – 1.43* T2*ADC +0.0003* T1* T2*ADC
BF
Springiness= -4.48+ 0.01* T1 – 0.34* T2+ 245.19*ADC + 0.03* T22+ 36.40*ADC2 – 0.0009* T1 * T2 – 12.05*
87.06 78.43 0.001
T2*ADC + 0.004* T1 * T2*ADC
Adhesiveness= 3.32 – 0.38* T2 + 31.26*ADC + 0.00001* T12+ 0.04* T22- 0.002* T1 * T2 + 0.21* T1 *ADC –
94.66 91.78 0.0000
6.49* T2*ADC
Hardness= 305.08 – 0.57*T1 + 0.0002*T12 + 0.08**T22 +0.02*T1*ADC 92.34 90.29 0.0000
Cohesiveness = 1.21 – 0.001* T1 - 2.93*ADC + 0.000004* T12
+ 0.004* T22
– 0.0002* T1 * T2 + 0.005* T1
83.31 74.32 0.001
SM *ADC -0.00006* T1* T2 *ADC
Springiness= -5.43+ 0.61*T2 – 14.31*ADC + 0.00007*T12+ 0.05* T22 + 13.27*ADC2 – 0.004* T1* T2 95.55 93.64 0.001
2 2 2
Adhesiveness= -0.36 – 0.007* T1 + 0.21* T2 +0.00003* T1 + 0.03* T2 + 9.82*ADC – 0.002* T1*T2 - 0.42*
86.94 78.23 0.005
T2*ADC + 0.0002* T1* T2*ADC
Hardness = -92.43 + 0.26*T1 – 1.47*T2 + 609.53*ADC +0.06*T22 – 90.69*ADC2 – 0.00579*T1*T2 – 99.70
99.44 0.0000
0.55*T1*ADC – 13.49*T2*ADC + 0.01*T1*T2*ADC
Cohesiveness = 0.04 +0.0008* T1 +3.12*ADC - 0.0003* T22 - 0.003* T1 *ADC - 0.05* T2 *ADC + 0.00006*T1*
92.20 88.59 0.005
T2*ADC
ST
Springiness= -28.62 + 0.05*T1 + 0.50*T2 + 89.03*ADC -18.40*ADC2 – 0.001* T1*T2 – 0.10*T1*ADC – 1.93*
93.27 88.78 0.0001
T2*ADC+ 0.002* T1 * T2*ADC
Adhesiveness=- 12.88 + 0.02* T1 + 53.66*ADC – 10.70*ADC2- 0.0003* T1 * T2 – 0.06* T1 *ADC – 0.81*
92.90 89.08 0.0001
T2*ADC +0.001* T1 * T2*ADC
R2= coefficient of determination. P-value for R2 was determined using F-test. RMSE: Root Mean Square Error

17

159
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

4. Conclusions

MRI has proven to be a suitable tool in order to study structural changes during ham
manufacturing process, since T1, T2 and ADC parameters allow getting complete information of
the studied tissues. The multivariate analysis confirms that MRI parameters could be used to
construct regression models to predict water and salt content and TPA parameters. Therefore,
with only non-destructive MRI analyses it could be possible to obtain structural, physicochemical
and textural information. This type of predictive models was accurate enough to consider MRI as
a useful tool for monitoring and optimizing dry cured ham manufacturing process.

Acknowledgements

The authors are grateful for the financial support of UCM-BSCH Group 920176GR35/10A, project
AGL2010‐19158 funded by the Spanish Secretary of State of Research, Development and
Innovation within the Ministry of Economy and Competitiveness. A.B.G.G. was awarded a grant
(BES-2011-047485) from the same institution.

18

160
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

References

Aliño, M., Grau, R., Toldrá, F., Barat, J.M. (2010). Physicochemical changes in dry-cured hams salted with
potassium, calcium and magnesium chloride as a partial replacement for sodium chloride. Meat Science
86, 331-336.

Arnau, J. & Gou, P. (2001). Effect of air relative humidity on ham rind and subcutaneous
salted fat during the resting period. Meat Science, 58, 65-68.

Arnau, J., Guerrero, L., Casademont, G. & Gou, P. (1995). Physical and chemical changes in different zones
of normal and PSE dry-cured ham during processing. Food Chemistry, 52, 63-69.

Benedini, R., Parolari, G., Toscani, T., Virgili, R. (2012). Sensory and texture properties of Italian typical dry-
cured hams as related to maturation time and salt content. Meat Science, 90, 431-437.

Bonny, J. M., Laurent, W., Labas, R., Taylor, R., Berge, P., Renou, J. P. (2000). Magnetic resonance
imaging of connective tissue: A non-destructive method for characterizing muscle structure. Journal of
the Science of Food and Agriculture, 81, 337–341.

Boulby, P. A. & Rugg-Gunn, F. (2003). T2: The transverse relaxation time. In: P. Toofts (Ed.), Quantitative
MRI of the brain. Measuring changes caused by disease (pp. 143-173). West Sussex, England: John
Wiley & Sons.

Cernadas, E., Carrion, P., Rodriguez, P. G., Muriel, E., Antequera, T. (2005). Analyzing magnetic resonance
images of Iberian pork loin to predict its sensorial characteristics. Computer Vision and Image
Understanding, 98, 344–360.

Charlton, J. A. (2009). High resolution NMR analysis of complex mixtures. In: M. Gudjónsdóttir, P. S. Belton,
& G. A. Webb (Eds.), Magnetic resonance in food science: challenges in a changing world (pp. 3–12).
Cambridge: Royal Society of Chemistry.

Fantazzini, P., Bortolotti, V., Garavaglia, C., Gombia, M., Riccardi, S., Schembri, P. (2005). Magnetic
resonance imaging and relaxation analysis to predict noninvasively and non-destructively salt-to-
moisture ratios in dry-cured ham. Magnetic Resonance Imaging, 23, 359-361.

Fantazzini, P., Gombia, M., Schembri, P., Simoncini, N., Virgili, R. (2009). Use of magnetic resonance
imaging for monitoring Parma dry-cured ham processing. Meat Science, 82, 219-27.

Fernández, M., Ordóñez, J.A., Cambero, I., Santos, C., Pin, C., de la Hoz, L. (2007). Fatty acid composition
of selected varieties of Spanish dry ham related to their nutritional implications. Food Chemistry, 101,
107-112.

Foegeding, E. A., Brown, J., Drake, M. A., Daubert, C. R. (2003). Review. Sensory and mechanical aspects
of cheese texture. International Dairy Journal, 13, 585-591.

Gowland, P.A.; Stevenson, V.L. (2003). T1: The longitudinal relaxation time. In: Quantitative MRI of the
brain. Measuring changes caused by disease. (pp. 111–143). Ed. John Wiley & Sons, West Sussex,
England.

Guiheneuf, T. M., Tessier, J. J., Herrod, N. J., Hall, L. D. (1996). Magnetic resonance imaging of meat
products: Automated quantitation of the NMR relaxation parameters of cured pork, by both bulk NMR
and MRI methods. Journal of the Science of Food and Agriculture, 71, 163–173.

Guiheneuf, T. M., Parker, A. D., Tessier, J. J., Hall, L. D. (1997). Authentication of the effect of
freezing/thawing of pork by quantitative magnetic resonance imaging. Magnetic Resonance in
Chemistry, 35, 112-118.

Hanson, S.W.F. & Olley J. (1963). Application of the Bligh and Dyer method of lipid extraction to tissue
homogenates. Biochemical Journal, 89, 101-102.

Herrero, A. M., Cambero, M. I., Ordonez, J. A., Castejon, D., Romero de Avila, M. D., de la Hoz, L. (2007).
Magnetic resonance imaging, rheological properties, and physicochemical characteristics of meat
systems with fibrinogen and thrombin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 9357-9364.

19

161
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

Herrero, A.M., de la Hoz, L., Ordóñez, J.A., Castejón, D., Romero de Ávila, M.D., Cambero, M.I. (2009).
Magnetic resonance imaging studies of the cold-set gelation on plasma powder and meat systems. Food
Research International, 42, 1362-1372.

Kim, J. H., Seong, P. N., Cho, S. H., Park, B. Y., Hah, K. H., Yu, L. H., Lim, D. G., Hwang, I. H., Kim, D. H.,
Lee, J. L., Ahn, C. N. (2008). Characterization of nutritional value for twenty‐one pork muscles. Asian-
Australasian Journal Animal Science, 21, 138-144.

Laurent, W., Bonny, J. M. & Renou, J. P. (2000). Muscle characterization by NMR imaging and
spectroscopic techniques. Food Chemistry, 69, 419–426.

Marcone, M.F., Wuang, S., Albabish, W., Nie, S., Somnarain, D., Hill, A. (2013). Diverse food-based
applications of nuclear magnetic resonance (NMR) technology. Food Research International, 51, 729-
747.

Mitchell, A. D., Scholz, A. M., Wang, P. C., Song, H. (2001). Body composition analysis of the pig by
magnetic resonance imaging. Journal of Animal Science, 79, 1800-1813.

Monin, G., Marinova, P., Talmant, A., Martin, J.F., Cornet, M., Lanore, D., Grasso, F. (1997). Chemical and
structural changes in dry-cured hams (bayonne hams) during processing and effects of the dehairing
technique. Meat Science, 47, 29-47.

Manzocco, L., Anese, M., Marzona, S., Innocente, N., Lagazio, C., Nicoli, M.C. (2013). Monitoring dry-curing
of S. Daniele ham by magnetic resonance imaging. Food Chemistry, 141, 2246-2252.

Morales, R., Serra, X., Guerrero, L., Gou, P. (2007a). Instrumental evaluation of defective texture in dry-
cured hams. Meat Science, 76, 536-542.

Morales, R., Serra, X., Guerrero, L., Gou, P. (2007b). Softness in dry-cured porcine biceps femoris muscles
in relation to meat quality characteristics and processing conditions. Meat Science 77, 662-669.

Renou, J. P., Foucat, L., & Bonny, J. M. (2003). Magnetic resonance imaging studies of water interactions in
meat. Food Chemistry, 82, 35-39.

Romero de Ávila, M.D., Escudero, R., Ordóñez, J.A., Cambero, M.I. (2014). Weibull analysis characterizes
the breaking properties of dry-cured ham slices. Meat Science, 97, 451-458.

Ruiz-Cabrera, M.A., Gou, P., Foucat, L., Renou, J.P., Daudin, J.D. (2004). Water transfer analysis in pork
meat supported by NMR imaging. Meat Science, 67, 169-78.

Santos, C., Hoz, L., Cambero, I., Cabeza, C., Ordóñez, J.A. (2008). Enrichment of dry cured ham with α-
linolenic acid and α-tocopherol by the use of linseed oil and α-tocopheryl acetate in pig diets. Meat
Science, 80, 668-674.

Segura, J., Escudero, R., Romero de Ávila, M.D., Cambero, M.I., López-Bote, C.J. (2015). Effect of fatty
acid composition and positional distribution within the triglyceride on selected physical properties of dry-
cured ham subcutaneous fat. Meat Science, 103, 90-95.

Serra, X., Ruiz-Ramirez, J., Arnau, J., Gou, P. (2005). Texture parameters of dry-cured ham, muscle biceps
femoris samples, dried at different levels as a function of water activity and water content. Meat Science,
69, 249-54.

Shaarani, S. M., Nott, K. P., & Hall, L. D. (2006). Combination of NMR and MRI quantitation of structure and
structure changes for convection cooking of fresh chicken meat. Meat Science, 72, 398-403.

Simpson, N.E., Grant, S.C., Blackband, S.J., Constantinidis, I. (2003). NMR properties
of alginate microbeads. Biomaterials, 24, 4941-4948.

Tabilo, G., Flores, M., Fiszman, S.M., Toldrá, F. (1999). Postmortem meat quality and sex affect textural
properties and protein breakdown of dry-cured ham. Meat Science, 51, 255-260.

Tingle, J. M., Pope, J. M., Baumgartner, P. A., Sarafis, V. (1995). Magnetic resonance imaging of fat and
muscle distribution in meat. International Journal of Food Science and Technology, 30, 437–446.

Toldrá, F. & Flores, M. (1998). The role of muscle proteases and lipases in flavour development during the
processing of dry-cured ham. Critical Review of Food Science and Nutrition, 38, 331-52.
20

162
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1, 1-23

Toldrá, F. (1998). Desarrollo da las características de textura y flavor: contribución enzimática. In:
International Congress of Meat Science and Technology, 44,42-54. Barcelona. Simposio Especial.

Wheeler-Kingshott, A. M., Barker, G. J., Steens, S. C. A., Van Buchem, M. (2003). ADC: The diffusion of
water. In P. Toofts (Ed.), Quantitative MRI of the brain. Measuring changes caused by disease (pp. 203–
210). West Sussex, England: John Wile

21

163
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

SUPPLEMENTARY MATERIAL
(2 pages)

Manuscript entitled: Use of MRI as a Predictive Tool for Physicochemical

and Rheological Features During Cured Ham Manufacturing.

A.B. García-García, M. E. Fernández-Valle, D. Castejón, R. Escudero, M. I.

Cambero.

Table of contents

1). Figure S1. Relation among textural features and transverse relaxation time (T2, ms) and
longitudinal relaxation time (T1, ms) obtained by Magnetic resonance image (MRI) of different
muscle [biceps femoris (BF), semitendinosus (ST), and semimembranosus (SM)] in different
stages of the dry-cured ham manufacturing process (considering an apparent diffusion
coefficient value of 0.5* 10-3 mm2/s)……………………………………………………………………………………. p.28

22

165
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Meat Science, IV.1.1., 1-23

1) Figure S1. Relation among textural features and transverse relaxation time (T2, ms) and longitudinal relaxation
time (T1, ms) obtained by Magnetic resonance image (MRI) of different muscle [biceps femoris (BF),
semitendinosus (ST), and semimembranosus (SM)] in different stages of the dry-cured ham manufacturing process
(considering an apparent diffusion coefficient value of 0.5* 10-3 mm2/s)

variable buckets and its

23

166
 IV. Resultados

Trabajo 2
Estudio comparado de la microestructura de jamón curado mediante relaxometría T2 de
RMN, microscopía electrónica de barrido (MEB) y ensayos de tracción uniaxial.

Enviado a Food Structure

167
 IV. Resultados

En el Trabajo 2 se plantea un estudio preliminar de la microestructura de jamón

curado. Para ello, se obtuvo información a partir de diversas técnicas de análisis para
conseguir un enfoque multidisciplinar. Varias unidades de jamón curado fueron
analizadas a distintos tiempos de maduración mediante relaxometría de RMN para
evaluar la variación de la relajación transversal T2 en respuesta a la adición de sal y a la
deshidratación en los dos músculos más representativos (bíceps femoral y
semimembranoso). A lo largo de la maduración se observaron cambios en la movilidad
y la distribución de agua y en la infiltración grasa. Se identificaron distintas poblaciones
T2: T2b, T21, T22 y T2'. El cambio de la población principal, T21, hacia tiempos de relajación
más cortos indica mayor grado de inmovilización del agua y se relaciona con el
aumento de la consistencia de la matriz cárnica. Los resultados de RMN obtenidos,
apoyados por las imágenes de MEB, sugieren que la maduración favorece la
consolidación y compactación de la estructura de jamón y conduce al desarrollo de
una matriz miofibrilar altamente organizada en la cual el agua queda atrapada en el
interior del entramado tridimensional proteico. La infiltración grasa se hizo visible por
medio de la aparición de la población T2' durante la etapa de secado, cuya presencia se
relacionó con los protones asociados con la fase grasa. Los valores de la fuerza de
rotura y el límite elástico, calculados mediante la realización de ensayos destructivos
de tracción uniaxial, se vieron afectados por la maduración y cambiaron en función del
grado de curación de las muestras analizadas, siendo mayores cuanto más avanzado
estaba el proceso. La población principal, T21, mostró una relación lineal positiva con el
contenido de agua y negativo con la fuerza de rotura.
Por consiguiente, el estudio demostró que la relaxometría de RMN es una técnica
prometedora para establecer asociaciones entre el estado biofísico del agua intrínseca
y la progresión en el procesado de jamón curado.

169
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Structure, V.1.2, 1-14

Dry Cured-ham Microestructure: a T2 NMR Relaxometry,

SEM and Uniaxial Tensile Test Combined Study.

A.B. García-Garcíaa, M.I. Camberoa*, D. Castejón, R. Escuderoa, M.E. Fernández-Valleb

a) Sección Departamental de Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad

Complutense de Madrid. 28040 Madrid. Spain.

b) Centro de Asistencia a la Investigación de Resonancia Magnética Nuclear y de Espín

Electrónico. Universidad Complutense de Madrid. 28040. Madrid. Spain.

*Corresponding author. Tel: +34 913943745; Fax: +34 913943743; E-mail: [email protected]

Abstract: NMR relaxation analyses were performed on dry-cured hams at different processing
times to evaluate the ranges of variation of 1H transverse relaxation time (T2) in representative
ham muscle tissues, due to dehydration and salt uptake. Changes in the mobility and distribution
of water and fat marbling were detected throughout ripening. Three to four different 1H populations
were identified: T2b, T21, T22 and T2´. The shift of the main population, T21, toward faster relaxation
times indicates a higher degree of immobilization of water, and the change is related to the
increase in the consistency of the meat matrix. NMR results, supported by SEM images, suggest
that ripening favors the compaction of ham structure and leads to a high organized myofibrilar
matrix in which the remaining water is trapped within the protein tridimensional network. Fat
marbling became visible through the emergence of T2´ population during the maturing stage,
whose presence is linked to protons related to the fat phase. Breaking strength and elastic stress
limit values for BF and SM muscles changed according with the extent to which they are affected
by the curing process. The main water population, T 21 showed a positive linear relationship with
water content and it was negative related with the breaking strength. Consequently, the study
demonstrated that NMR T2 relaxometry is a promising technique to elucidate associations
between the biophysical state of intrinsic water and progression in processing of dry-cured ham.

Key words: dry-cured ham, microstructure, T2 relaxometry, uniaxial tensile test

171
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Structure, IV.1.2, 1-14

1. Introduction
Foods are complex, dynamical and heterogeneous mixtures of macromolecules, solutes and
solvent (including water). This complex structure gives rise to three states of water; ‘structural’ or
‘bound’ water, water which is hydrogen-bonded inside the grooves and cavities of proteins and
polysaccharides; ‘surface’ water, water at the biopolymer surface having a dynamic state agitated
by the presence of the surface; and the third state is bulk water (Fullerton & Cameron, 1988; Hills,
Manning & Ridge, 1996). Thus, the distribution of water in the different states is highly dependent
on the microstructure of the food, which can be altered by changing formulation, processing and
storage conditions. However, the water availability for chemical and biochemical reactions
depends on the type of interaction it might have with the food constituents. This close relationship
between microstructure and water also influences the textural and other quality attributes; among
others, by the plasticising effect of water influencing the physical states of foods, such as
solubilisation, softening due to melting, glassy-to-rubbery transition and staling (Cornejo &
Chinachoti, 2003; Hermansson, 1983; Mathlouthi, 2001; Ruan & Chen, 1998). Because of this
intimate relationship between water, food quality and food safety, a more complete understanding
of water and its properties, behavior and influence, alone and in foods, is of prime importance.
In this regard, dry-cured ham is a whole muscle product whose processing involves
dehydration and salting of the raw pieces and the final attributes of the product depends on the
proper development of the techniques and procedures (Toldrá, 2006). A profound knowledge
about water mobility and distribution during ripening is essential to improve industrial ham
manufacturing.
Nuclear magnetic resonance (NMR) relaxometry is a widely used method in food science with
the ability to provide information about the mobility and compartmentalization of water and about
molecular interactions between water and myofibrilar components (Bertram, Dønstrup, Karlsson,
& Andersen, 2001; Bertram & Andersen, 2004). Thus, NMR relaxometry is able to provide detailed
information about the water in meat and thereby give a measure of the water availability, which is
decisive for food stability and safety (Bertram et al., 2001; Bertram, Purslow, & Andersen, 2002).
In the other hand, the rheological behavior of the product is highly related to textural properties
and, therefore, it determines technological usages and consumers´ acceptance. Among the
essential methods that can be used to study the rheological behavior, the tensile test is the best
suited for structural investigations (Purslow, 1985). The performance of this test allows obtaining
a load deformation curve to complete rupture, in which the fracture strength corresponds to the
maximum force supported by the material (Romero de Ávila, Escudero, Ordóñez & Cambero,
2014). The data obtained by tensile test offer complementary valuable information about muscles
behavior by applying a tensile stress force and how this external force affect meat structure.
The aim of this work was to investigate the potential use of NMR transverse relaxation time
(T2) as a technique capable of monitoring local changes occurring in dry-cured ham during
processing and affecting the quality of the final product, mainly related to salt and moisture content
and marbling fat amount and distribution. A detailed study of the microstructure of the product

172
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.1.2, 1-14

was completed by the acquisition of SEM images, together with the characterization of the
breaking strength and elastic stress limit for each of the muscles and stages considered.

2. Materials and methods

2.1. Sample collection during ham processing

Samples of a total of 35 hams were taken at different steps of the manufacturing process: raw
(3 days after slaughter), during salting (after salt addition, in the first 2-3 days of processing), post-
salting (hams taken during the resting period after salt removal), maturing (half-cured hams taken
after 8 months of processing) and ageing (fully maturated hams after 20 months of processing).
Salting and post-salting were managed at low temperature (0-4 oC); two different processing
conditions were established during maturing: a cold period (13-15 oC, RH: 75-85%) and a warm
period (22-26 oC, RH: 60-75%) and ageing was performed at room temperature (12-17 oC, RH:
60-80), in conformity with Santos et al., 2008. Two different muscle types, corresponding to
different anatomical locations [bíceps femoris (BF) and semimembranosus (SM)] were
considered for analysis. The hams from white-breed pigs, (Landrace x Large White female
animals slaughtered at 100-120 kg live weight), were purchased from a local manufacturing plant.
Manufacturing process and sample collection was carried out according to García-García et al
(2018).
The water content was determined by drying the sample at 110 oC to constant weight and the
results were expressed as a percentage (AOAC, 2006).

2.2. Scanning Electron Microscopy (SEM)

Cubic samples (5 x 5 x 5 mm 3) were obtained by cutting lengthwise to the muscle fibres from
the interior of the meat piece with a stainless-steel cutter. The samples obtained were fixed in a
solution of 2.5% glutaraldehyde in saline solution (diluted in 0.9% saline solution) for 4 h at 4 oC.
The fixed samples were washed 3 times with saline solution and then dehydrated in incremental
concentrations of ethanol (30%, 50%, 70%, 90%, 95% and 100%) (ethanol/water, v/v) for 30
min/step and ultradehydrated by critical point with CO 2. Then, they were covered with graphite,
gold-coated and observed in a JEOL JSM 6400 Scanning Electron microscope (Jeol, Tokio,
Japan) at 15 kV and working distance of 25 mm.

2.3. NMR measurements: T2 relaxometry

Transverse relaxation (T2) measurements were obtained using a Biospec BMT 47/40
spectrometer (Bruker, Ettlingen, Germany), operating a 4.7 T and equipped with a 6 cm gradient
system. Samples (approximately 3 cm long, 2 cm wide and 1.5 cm thick) were placed in a 3.5 cm
Bruker-designed volume radio frequency coil, used for transmission and reception.
T2 data were measured, without gradients, that is, from the whole sample, using a Carr-
Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) sequence. A total of 256 echoes with an echo time (TE) of 2 ms
were generated. However, only the even echoes were registered and used for the T2 distributions

173
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Structure, IV.1.2, 1-14

calculation, thus, the effective echo time was 4 ms. The distributions were obtained using
UpenWin 1.01 (Università di Bologna, Bologna, Italy).
A preliminary T2 relaxometry study was performed in ham pieces, so one single analysis for
each ripening stage and muscle type was completed.

2.4. Uniaxial tensile tests

3-6 slices were obtained from each one of the studied muscles using a TYPE ES 300 Model
DOM (Beckers, Italia) instrument. Slices with surface imperfections that could be a starting point
of rupture were discarded. At least, three pieces were cut from each slice. To standardize
sampling and in accordance with previous works (Herrero et al. 2007; Herrero et al., 2008;
Romero de Ávila, Escudero, Ordóñez & Cambero, 2014) these pieces were cut in a dumbbell
shape, approximately 4.0 x 1.0 cm 2 in the narrowest zone and 0.2 cm thickness per sample. All
samples were cut parallel to the fibre direction. For analysis, one tensile grip (A/MGT) was fixed
to the base of the textural analyser, while the other one was attached to the load cell. Initial grip
separation was 15.0 mm and crosshead speed was 1.0 mm/s until rupture. A load cell of 5 kg
was used to perform all the analysis. Each sample was placed between both tensile grips on the
textural analyzer. Rupture force was taken as the maximum force peak height (N) required to
break the sample. Breaking strength (N/cm 2) was calculated by dividing the rupture force by the
crosssectional area (thickness*width) of the portions (Honikel, 1998; Romero de Ávila et al.,
2014). Measurements were carried out at room temperature. Tensile tests were performed using
a TA.XT2i SMS Stable micro Systems Texture Analyser (Stable Microsystems Ltd., Surrey,
England) with the Texture Exponent 32, 6.0.7.0. version.

2.5. Statistical analysis

Data are presented as the means and standard deviations (SD). Differences among means
were established by ANOVA and Duncan’s multiple comparison procedure using Statgraphic
Centurion XVI para Windows (Statistical Graphics Corporation, Rockville, MD, EE.UU.). Simple
regression analyses, using a Durbin–Watson statistic tests, at 95% of confidence level, were per-
formed to determine the relationships between data.

3. Results

3.1. SEM images

SEM images (Figure 1) showed changes in the myofibrillar matrix during dry-cured ham
processing according to the two mechanisms mainly involved in ripening: salting and dehydration.
Raw ham showed the characteristic structure of skeletal muscle. The muscle fibers remain intact,
with clearly distinguishable and well-defined muscle packages. Most of the water from the meat
is trapped by the myofibrils, between fine strands of actin and thick myosin (Huff-Lonergan &
Lonergan, 2005). Similar comments can be made in both muscles, but SM showed less presence
of perimysium. The progress of ripening produced the degradation of muscle structure, especially
by alteration of the sarcolemma, dehydration of the sarcoplasm and structural modification of
miofibrilar packages. These results are in agreement with other authors (Larrea et al., 2007a) in

174
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.1.2, 1-14

salted meat. The post-salted hams were analyzed immediately after brushing the surface salt,
therefore these images show the effect of salt on the structure of the meat.

Figure 1. SEM images (300x) obtained for the two considered muscles [bíceps femoris (BF) and semimembranosus
(SM)] at different processing stages. Micrographs corresponding to raw, salted, post-salted, half-cured and cured hams
are shown)

Muscle packages experienced a slight swelling during this stage due to the property of salt to
increase the CRA, due to the shift of the isoelectric point of myofibrillar protein towards lower
values (Albarracín, Sánchez, Grau & Barat, 2011). The separation between bundles of muscle
fibers is not as clear and the fibers are not as sharp due to the degradation of cell membranes
and the solubilization of myofibrillar proteins by the effect of salt, especially in SM. Maturing and
ageing images mainly show the dehydration effect favored by the conditions of humidity and
temperature of the ripening rooms. The bundles of muscle fibers are much less distinguishable
and its diameter decreased due to water loss. Towards the end of ripening, the boundaries
between bundles of muscle fibers are hardly visible, favored by the lipolytic and proteolytic
phenomena that occur during these phases. The products generated are deposited in the inter-
muscular spaces (Larrea et al., 2007b) creating a sort of amorphous matrix between bundles of
muscle fibers. Especially notable is this effect in SM. BF is maintained to a greater extent fibrillar
structure, being possible to appreciate the packages of muscle fibers surrounded by connective
tissue (perimysium) dehydrated. The result is a characteristic structure of porous appearance.

3.2. T2 measurements
T2 distributed data (Figure 2) revealed the existence of four different T2 populations in dry-
cured samples, depending on the degree of association of the protons of the sample with the
protein matrix. T2b population, with a fast relaxation time, between 1-10 ms, is related to protons
strongly linked to macromolecules, with a high degree of association to the matrix. The main
population, T21, with a relaxation time around 50 ms in fresh meat, is related to protons located
within highly organized structures and corresponds to the water retained by the three-dimensional
network of myofibrillar proteins. T22 population, with slower relaxation time, more than 300 ms, is
related to the most mobile protons located in extramiofibrilar spaces. These three components
have been previously described in the fresh meat (Bertram, Dønstrup, Karlsson & Andersen,

175
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Structure, IV.1.2, 1-14

2001; Bertram et al., 2001; Bertram & Andersen, 2004; Andersen, Andersen, & Bertram, 2006)
and also in dry-cured ham (Fantazzini et al., 2009).

Figure 2. NMR T2 distributed data obtained for bíceps femoris (BF) and semimembranosus (SM) muscles at different
processing times. A: raw ham. B: salted ham. C: post-salted ham. D: Half-cured ham. E: Cured ham.

176
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.1.2, 1-14

Moreover, it should be noted the emergence of a new signal during maturing, T2´ population,
with a relaxation time of 80 ms approximately, not covered so far in the literature. To the authors´
knowledge, this is the first time that this signal has been associated with the protons of the fat
phase given that, at this point in the process, the infiltration degree of fat in the muscle matrix has
reach an important progress. The progress of ripening is reflected in the distributions obtained,
enabling the monitoring of the process. On the one hand, the dehydration of the protein matrix
manifested itself through changes in the protons distribution and mobility, so that a shift towards
T2 shorter relaxation times was observed, especially notable in the main component T21, and
related to the extinction of T22 population. This shift is related to a greater degree of binding of the
protons with the matrix, which suggests a higher degree of matrix compaction as the process
progresses. On the other hand, it was possible to observe changes in the distribution of fat, due
to the emergence of the T2´ signal, whose presence can be used as a marker for later stages of
processing. SEM images were of great help to interpret structural modifications. Their analysis
allowed to observe the reduction of the intrinsic size of pore of the protein matrix, due to the
phenomena of protein solubility, absorption of salt and dehydration, typical of curing, as well as
the display of the evolution of fat marbling in the muscle. In addition, differences in behavior
between muscles, were detected since the effect of ripening was more evident in SM muscle.
The T21 component distributions obtained for this muscle from the post-salting stage presented
faster relaxation times in comparison with the BF, suggesting that the ripening phenomena
affected faster to SM muscle, since it is an outer muscle, with direct contact with the air, which
determine the accelerated effects of the dynamics of diffusion of water and salt in this muscle.
Based on a previous work (García-García et al., 2018), the obtained values of moisture were used
in the present study to establish correlations between physicochemical parameters and T2 NMR
measurements. A linear correlation model between the main water population (T21) and the water
content for BF and SM muscles was calculated. A strong linear positive dependence was found
between both variables, suggesting that T21 population is a highly valuable parameter to monitor
the undergoing of the ripening process. The linear correlation models obtained were:

water content BF (g H2O/100 g of product) = 0.64 (T21) + 42.69 (R2= 0.71)

water content SM (g H2O/100 g of product) = 1.12 (T21) + 25.31 (R2= 0.98)

3.3. Tensile tests

Breaking strength (mean values and standard deviations) obtained by tensile testing of BF
and SM muscle are given in Table 1. In general, SM showed higher values (ranging from 2.169 ±
0.235 to 39.499 ± 1.454) than BF (from 4.327 ± 1.025 to 21.243 ± 0.719), which is in accordance
to those detected by other authors (Herrero et al., 2007; Herrero et al., 2008; Hoz et al., 2008;
Romero de Ávila, Escudero, Ordóñez & Cambero, 2014).

177
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Structure, IV.1.2, 1-14

Table 1. Parameters obtained from tensile tests for bíceps femoris (BF) and semimembranosus (SM) in different stages
of the curing process

Muscle Curing Breaking strenght Elastic stress limit

type stage (Ncm-2) (Ncm-2)

Raw 4.327 ± 1.025 d,  3.365 ± 0.392 d, 

Salted 10.946 ± 1.048 c,  8.087 ± 0.989 c, 
BF Postsalted 5.577 ± 0.394 d,  3.766 ± 0.294 d, 
Half-cured (8 months) 20.582 ± 1.992 a,  14.743 ± 1.292 a, 
Ageing (20 months) 11.420 ± 1.173 c,  4.107 ± 0.587 d, 
Raw 2.169 ± 0.235 e,  1.831 ± 0.216 e, 
Salted 5.731 ± 0.771 d,  4.534 ± 0.530 c, 
SM Postsalted 8.140 ± 0.657 c,  5.123 ± 0.935 c, 
Half-cured (8 months) 28.850 ± 2.499 b,  20.233 ± 1.687 b, 
Ageing (20 months) 39.499 ± 1.454 a,  26.542 ± 1.415 a, 
a, b: values in the same column for a same muscle with different lyrics differ significantly (P<0.05) (differences in a same muscle
throughout the process)

: values in the same column for the same curing stage of different muscles with different lyrics differ significantly (P<0.05)
(differences between muscles throughout the process)

The breaking strength of the two studied muscles (Ncm -2) increased significantly (P>0.05)
throughout the curing process. SM muscle was the most resistant, presenting the higher breaking
strength. This behavior suggests that rupture of the muscle would take place along several lines
of weakness in the bundles of muscle fibers, by successive microfractures in the muscle fibers
and in the destructuration of intramuscular connective tissue (Romero de Ávila, Escudero,
Ordóñez & Cambero, 2014). The enlargement in resistance in BF was much smaller than the one
showed by SM (the first tripled the value while in the second one was 20 times higher in cured
than in fresh meat). In both cases, this growing is associated with an increase in the elastic limit,
point above tissue deformation is irreversible. These results relate the increase of toughness with
the moisture loss and would be associated with data provided by other authors in different tissues
(Zeugolis, Paul, & Attenburrow, 2008; Jager & Fratzl, 2000; Landis, Librizzi, Dunn, & Silver, 1995).
Similarly, it has been reported that salt could increase the stability and rigidity of the myofibrillar
muscle structure (Andrés et al., 2004; Ruiz-Ramírez, Arnau, Serra, & Gou, 2005).
When a tensile test was applied, the resultant internal strains were absorbed causing a
characteristic deformation in each muscle tissue and strength-distance curves with different
shapes were obtained (Figure 3). Their analysis reveals a different mechanical behavior for BF
and SM. The form of the curves for each muscle can be related to several factors such as
morphology characteristics (Maltin, Balcerzak, Tilley, & Delday, 2003), sarcomere length (Serra,
Ruiz-Ramírez, Arnau, & Gou, 2005), intramuscular fat and connective contents (Serra, Ruiz-
Ramírez, Arnau, & Gou, 2005) and proteolytic activity (Parolari, Virgili, & Schivazappa, 1994).

178
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Structure, IV.1.2, 1-14

Figure 3. Evolution of strength-distance curves obtained by means of uniaxial tensile test for bíceps femoris (BF) and
semimembranosus (SM) at different ripening stages.

Depending on the position of the muscle on the leg, the processing stage can also determine
the form of the obtained curves. BF experienced an increase of the breaking strength during
salting and drying and a slight decline during ageing. Samples reach the breaking point after an
elastic period, without a phase of plastic behavior. The shape of the curves changed during
ripening and a change in the slope was observed. SM curves are characterized by a period of
elastic deformation, which concludes with the break of the stressed sample. Modification of the
slope in this case is less remarkable than in BF, although the breaking strength increase is
progressive and most notably, reaching its maximum towards the end of the ripening. As it is
known, meat myofibrillar proteins have great influence on the structural and rheological properties
of food. BF myofibrillar degradation which takes place during ripening is slower than the
degradation experienced by SM due to its internal localization (slower loss of moisture and late
diffusion of salt), so properties as elasticity or the water holding capacity make stress behavior
different for the SM and BF muscles. At the end of the process, inside the product is still a three-
dimensional protein structure, while in the surface moisture loss has been more pronounced and
muscular structure is compact, the spaces between myofibrils are reduced and there is no
retained water. As a result, by applying tension forces, SM muscle, more compact structurally,
suffers less deformation than BF.
This finding agrees with a previous work, Romero de Ávila, Escudero, Ordóñez & Cambero,
2014, where stress-strain curves were obtained for different tissues of dry-cured ham in order to
provide a complete characterization of the mechanical behavior of this product.
SEM images resulted very helpful to understand what happens at the microstructural level by
applying tension forces. Figure 4 shows the behavior of BF muscle fibers with a representative
strength-distance curve obtained in a stress test. In the first part of the curve (area between A
and B) the applied force is proportional to the deformation suffered by the sample, stablishing the
region of linear deformation or elastic region. From point B, the deformation ceases to be linear
and the elastic limit is reached. From then on, the increase of tensile stress also increases the

179
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Structure, IV.1.2, 1-14

deformation but not proportionally, reaching the peak of maximum force (C), from which the stress
begins to descend while the deformation continues the breaking point is reached.

Figure 4. Evolution of bíceps femoris (BF) muscular fibers behavior during an uniaxial tensile test.

SEM was also used to study the changes suffered by fresh and cured muscles when they
were subjected to the action of an external force of tensile stress. The stretching of SM muscle
fibers during the elastic period followed by their fully breaking is shown in Figure 5. The stretching
is most evident in fresh muscle, while in the cured one, due to the degradation of the myofibrillar
structure stretching effect is less noticeable. Especially striking is the structural difference which
can be seen when looking at the inner surface of a broken fiber bundle. Myofibrils can be
distinguished in fresh muscle, but not in the cured muscle, in which the fibers package is a
compact mass.

Figure 5. SEM images illustrate the evolution of semimembranosus (SM) microstructure by applying a tensile stress
force. Relaxed and stretched fibers are magnified 300x and broken fibers, 1000x.

10

180
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.1.2, 1-14

As previously mentioned, microstructural changes in dry-cured ham during ripening are mainly
linked to salting and dehydration. In this regard, the main water population detected by NMR
relaxometry, T21, has demonstrated to be positive related to water content, therefore, it is possible
to follow the course of ripening by analyzing this NMR parameter. In this context, it is predictable
that T21 population have an inverse relationship with the breaking strength. Figure 6 shows the
evolution of both parameters, T21 population and breaking strength, during ripening for the two
studied muscles. The breaking strength is maximum when T21 values are minimum, which
suggests an antagonistic behavior of both variables. Short relaxation times involve matrix
compaction, therefore, more integrity and less plasticity of the tissue, which require the application
of higher external stress forces to get the breaking point.
The results obtained here suggest that dehydration, expressed in T21 terms, had a marked
effect on the mechanical properties of dry cured ham muscular matrix. It should be mentioned
that the breaking strength for the two studied muscles showed a linear relationship with T21,
especially for SM muscle (Figure 6). This finding is related to the dehydration and salting
dynamics in muscle tissues, since BF is located in a deeper layer of the ham and it is surrounded
in the outside by a thick layer of fat which reduces its water loss (Romero de Ávila, Escudero,
Ordóñez & Cambero, 2014), while SM occupies more external positions and would therefore be
subjected to the greatest degrees of dehydration and salt uptake. On the other hand, the intrinsic
properties of each muscle should be considered to explain their behavior: BF, in comparison to
SM, presents higher collagen content (Wheeler, Shakelford & Koomaraie, 2000) and it is a high
proteolyzed muscle which stays softer at the end of ripening (Parolari, Virgili, & Schivazappa,
1994).

Figure 6. T21 population and breaking strength evolution during ripening for bíceps femoris (BF) and semimembranosus
(SM) muscles.

4. Conclusions

Changes in water mobility and distribution during dry-cured ham processing can be analyzed
by means of NMR T2 relaxometry. Drying induced a notable shift toward shorter T21 relaxation
times related to the dehydration process, salt uptake and the consolidation of a firmer meat matrix.
The mentioned shift was especially notable from the post-salted stage in SM, suggesting that this
external muscle underwent a faster ripening than BF. The emergence of the T2´ population during

11

181
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Structure, IV.1.2, 1-14

the maturing stage was linked to protons related to the fat phase and to the progress of fat
marbling.
Moreover, the main population, T21 showed a strong positive linear dependence with water
content and it was negative related to the evolution of the breaking strength during processing.
The study has demonstrated the potential of NMR T2 relaxometry to elucidate associations
between the biophysical state of intrinsic water and processing of dry-cured ham, being possible
to monitor the whole manufacturing process.

Acknowledgments

The present work received financial support from project AGL2010-19158 funded by the Spanish
Secretary of State of Research, Development and Innovation within the Ministry of Economy and
Competitiveness. A.B.G.G. was awarded a grant (BES-2011-047485) from the same institution.

12

182
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.1.2, 1-14

References

Albarracin, W., Sánchez, I.C., Grau, R., & Barat, J.M. (2011). Salt in food processing; usage and
reduction: A review. International Journal of Food Science and Technology, 46, 1329-1336.

Andersen, R.H., Andersen, H.J., & Bertram, H.C. (2007). Curing-induced water mobility and distribution
within intra- and extra-miofibrilar spaces of three pork qualities. International Journal of Food Science and
Technology, 42, 1059-1066.

Andrés, A., Cava, R., Ventanas, J., Thovar, V., & Ruiz, J. (2004). Sensory characteristics of Iberian ham:
Influene of salt content and processing conditions. Meat Science, 68, 45-51.

AOAC (2006). Official methods of analysis (18th ed.). Washington D. C.: Association of Official Analytical
Chemists.

Bertram, H.C., Dønstrup, S., Karlsson, A.H., & Andersen, H.J. (2001). Continuous distribution analysis
of T2 relaxation in meat- an approach in the determination of water holding capacity. Meat Science, 60, 279-
285.

Bertram, H.C., Karlsson, A.H., Rasmussen, M., Pedersen, O.D., & Andersen, H.J. (2001). Origin of
multiexponential T2 relaxation in muscle myowater. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 3092-
3100.

Bertram, H.C., Purslow, P.P., & Andersen, H.J. (2002). Relationship between meat structure, water
mobility, and distribution: a low-field nuclear magnetic resonance study. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 50, 824-829.

Bertram, H.C., & Andersen, H.J. (2004). Applications of NMR in meat science. Annual Report on NMR
Spectroscopy, 53,158-202.

Cornejo, F., & Chinachoti, P. (2003). NMR in foods: oppotunity and challanges. in Magnetic Resonance
in Food Science: Latest Developments. P. S. Belton, A. M. Gil, G. A. Webb, and D. Rutledge, ed. Royal
Society of Chemistry, Cambridge.

Fantazzini, P., Gombia, M., Schembri, P., Simoncini, N., & Virgili, R. (2009). Use of magnetic resonance
imaging for monitoring Parma dry-cured ham processing. Meat Science, 82, 219-27.

Fullerton, G. D., & Cameron, I. L. (1988). Relaxation of Biological Tissues. Pages 115-155 in Biomedical
Magnetic Resonance Imaging. F. W. Werhli, D. Shaw, and J. B. Kneeland, ed. VCH Publishers Inc., New
York.

García-García, A.B., Fernández-Valle, M.E., Castejón, D., Escudero, R., Cambero, M.I. (2018). Use of
MRI as a predictive tool for physicochemical and rheological features during cured ham manufacturing. Meat
Science (under revision)

Hermansson, A. M. (1983). Protein functionality and its relation to food microstructure. Plant Foods for
Human Nutrition (Formerly Qualitas Plantarum), 32(3), 369-388.

Herrero, A.M., de la Hoz, L., Ordóñez, J.A., Herranz, B., Romero de Ávila, M.D., & Cambero, M.I. (2007).
Breaking strength of dry-fermented sausages and their correlation with texture profile analysis (TPA) and
physico-chemical characteristics. Meat Science, 77, 331-338.

Herrero, A.M., de la Hoz, L., Ordóñez, J.A., Herranz, B., Romero de Ávila, M.D., & Cambero, M.I. (2008).
Tensile properties of cooked meat sausages and their correlation with texture profile analysis (TPA)
parameters and physico-chemical characteristics. Meat Science, 80, 690-696.

Hills, B. P., Manning, C. E., & Ridge, Y. (1996). New theory of water activity in heterogeneous systems.
Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions, 92(6), 979-983.

Honikel, K.O. (1998). Reference methods for the assessment of physical characteristics of meat. Meat
Science, 49, 447-457.

Hoz, L., Cambero, M.I., Cabeza, M.C., Herrero, A.M., & Ordóñez, J.A. (2008). Elimination of Listeria
monocytogenes from vacuum-packaged dry-cured ham by E-beam irradiation. Journal of Food Protection,
71, 2001-2006.

Huff-Lonergan, E., & Lonergan, S. (2005). Mechanisms of waterholding capacity of meat: the role of
postmortem biochemical and structural changes. Meat Science, 71, 194-204.

Jager, I., & Fratz, P. (2000). Mineralized collagen fibrils: A mechanical model with a staggered
arrangement of mineral particles. Biophysics Journal, 79,1737-1746.

13

183
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Structure, IV.1.2, 1-14

Landis, W., J., Librizzi, J.J., Dunn, M.G., & Silver, F.H. (1995). A study of the relationship between mineral
content and mechanical properties of turkey gastrocnemius tendon. Journal of Bone Mineral Research, 10,
859-867.

Larrea, V., Perez-Munuera, I., Hernando, I., Quiles, A., & Lluch, M.A. (2007a). Chemical and structural
changes in lipids during the ripening of Teruel dry-cured ham. Food Chemistry, 102, 494-503.

Larrea, V., Perez-Munuera, I., Hernando, I., Quiles, A., Llorca, E., & Lluch, M.A. (2007b). Microstructural
changes in Teruel dry-cured ham during processing. Meat Science, 76, 574-82.

Maltin, C., Balcerzak, D., Tilley, R., & Delday, M. (2003). Determinants of meat quality: Tenderness.
Proceedings of the Nutrition Society, 62, 337-347.

Mathlouthi, M. (2001). Water content, water activity, water structure and the stability of foodstuffs. Food
Control, 12, 409-417.

Parolari, G., Virgili, R., & Schivazappa, C. (1994). Relationship between cathepsin B activity and
compositional parameters in dry-cured hams of normal and defective texture. Meat Science, 38, 117-122.

Purslow, P. (1985). The physical basis of meat structure: Observations on the fracture behavior of cooked
bovine M. semitendinosus. Meat Science, 12, 39-60.

Romero de Ávila, M.D, Escudero, R., Ordóñez, J.A., & Cambero, M.I. (2014). Weibull analysis
characterizes the breaking properties of dry-cured ham slices. Meat Science, 97, 451-458.

Ruan, R. R., & Chen, P. L. (1998). Water in Foods and Biological Materials: A Nuclear Magnetic
Resonance Approach. 1st edition ed. Technomic Publishing Company, Inc, Lancaster, Pennsylvania.

Ruiz-Ramírez, J., Arnau, J., Serra, X., & Gou, P. (2005). Relationship between water content, NaCl
content, pH and texture parameters in dry-cured muscles. Meat Science, 70, 579-587.

Santos, C., Hoz, L., Cambero, M.I., Cabeza, C., & Ordóñez, J.A. (2008). Enrichment of dry-cured ham
with -linolenic acid and -tocopherol by the use of linseed oil and -tocopheryl acetate in pig diets. Meat
Science, 80, 668-674.

Serra, X., Ruiz-Ramírez, J., Arnau, J., & Gou, P. (2005). Texture parameters of dry-cured ham m. biceps
femoris samples dried t different levels as a function of water activity and water content. Meat Science, 69,
249-254.

Toldrá, F. (2006). Dry-cured ham. En: Handbook of Food Science Technology and Engineering. Ed.
CRC Press, Boca Raton, E.E.U.U.: pp 164.1-164.11

Wheeleer, T.L., Shakeldord, S.D., & Koohmaraie, M. (2000). Variations in proteolysis, sarcomere length,
collagen content, and tenderness among major pork muscles. Journal of Animal Science, 78, 958-965.

Zeugolis, D.I., Paul, R.G., & Attenburrow, G. (2008). Post-self-assembly experimentation on extruded
collagen fibers for tissue engineering applications. Acta Biomaterials, 4, 1646-1656.

14

184
 IV. Resultados

Trabajo 3
Estudio del proceso de proteólisis durante la maduración de modelos cárnicos elaborados
a base de carne picada

Publicado en Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63 (2015), 3039-3045

185
 IV. Resultados

La relaxometría T2 de RMN tiene un gran potencial para el estudio de las dinámicas

de distribución y movilidad de agua en alimentos y posibilita la identificación de
distintas poblaciones de protones en la muestra en función de su grado de interacción
con la matriz, lo cual aporta información de la microestructura de la muestra, a través
de la elucidación de la compartimentación de la matriz en estudio. Los miosistemas
son productos proteicos constituidos principalmente por proteínas miofibrilares, las
cuales condicionan sus propiedades, tanto desde el punto de vista organoléptico como
tecnológico. En el Trabajo 3 se plantea el estudio del proceso de proteólisis que tiene
lugar durante la maduración de modelos cárnicos elaborados a partir de carne cerdo y
que es especialmente relevante para conseguir las características del producto final.
Para ello, se elaboraron, de forma tradicional, dos lotes de modelos cárnicos, con
(SMS) y sin proteasas (SMS+P), con el fin de estudiar mediante relaxometría T2 las
diferencias en la microestructura de los dos tipos de productos generados. Se
realizaron además análisis electroforéticos con el fin de comparar el perfil de
degradación de las fracciones proteicas en ambos lotes. El comportamiento de
degradación fue bastante diferente (mucho más intenso en el lote con proteasas), así
como las distribuciones de los tiempos de relajación T2 obtenidas para cada lote. En
ambos casos, se identificaron distintas poblaciones de protones (T2b, T21, T22) que
experimentaron cambios durante la maduración, reduciéndose los tiempos de
relajación a medida que avanzó el proceso. Estructuralmente, los modelos con
proteasas se caracterizaron por matrices más fluidas y mucho menos organizadas, lo
cual se puso de manifiesto a través de las poblaciones T2b y T22.
Este estudio revela el potencial de la relaxometría T2 para monitorizar el proceso de
maduración de modelos cárnicos, así como su aptitud para evaluar el efecto
estructural de la adición de proteasas a la masa cárnica.

187
 IV. Resultados

Article

pubs.acs.org/JAFC

Proteolysis Process in Fermented Sausage Model Systems As Studied

by NMR Relaxometry
Ana Belén García García,† Lotte Bach Larsen,§ Marıá Isabel Cambero Rodríguez,†
Karen Paola Cruz Díaz,† and Hanne Christine Bertram*,§
†
Departamento de Nutrición, Bromatologı ́a y Tecnologı ́a de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de
Madrid, 28040 Madrid, Spain
§
Department of Food Science, Aarhus University, Research Centre Aarslev, Kirstinebjergvej 10, DK-5792 Årslev, Denmark

ABSTRACT: Proton NMR relaxation analyses were performed in sausage model systems (SMS) at different manufacturing
times (0, 1, 3, 5, 7, and 9 days) to evaluate changes in water distribution and mobility. Three different water populations were
identified, T2b (5−10 ms), T21 (30−70 ms), and T22 (100−300 ms), and the progress of ripening could be followed as a shift
toward shorter relaxation times. In addition, the combined effect of adding commercial proteases (Pronase E and aspartyl
proteinase) on protein breakdown and structural integrity of sausage models (SMS+P) was investigated, resulting in the
formation of a more fluid and less organized meat matrix that led to changes in water populations T2b2 and T22 compared with
SMS. A very different protein degradation pattern between SMS and SMS+P was observed by means of SDS-PAGE and
fluorescamine assay, supporting that some degree of protein aggregation is needed for the presence of the T22 population in
fermented sausages.
KEYWORDS: sausage models, ripening, proteases, NMR relaxation, water distribution, meat fermentation

■ INTRODUCTION
In many foods the intrinsic distribution and mobility of water in
and water properties in sausage models by means of low-field
NMR. To obtain additional data that may contribute to a
meat have a profound influence on essential quality attributes further understanding of the relationship between proteolysis
such as juiciness, tenderness, firmness, and appearance.1 and the NMR T2 relaxation pattern, the study also included
Fermented meat sausage manufacture entails three main sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide gel electrophoresis
steps: formulation, fermentation, and ripening/drying.2 During (SDS-PAGE) to study changes in myofibrillar proteins during
these stages, different technological processes such as chopping, ripening, because SDS-PAGE has proved to be a suitable tool
to study the proteolysis process in fermented sausages.15−17

■
salting, and pH decline result in changes in the structure of the
native muscle proteins that may affect water properties.3 It is MATERIALS AND METHODS
well-known that compounds resulting from protein breakdown
and those generated from amino acid transformation are Model Formulation and Manufacture. Two different batches of
sausage model systems were developed: SMS (model systems without
involved in flavor development in meat products.4 One of the enzyme) and SMS+P (model systems with proteases). SMS with pork
most established methods for accelerating the ripening of (Longissimus lumborum) were produced, consisting of (% w/w)
fermented products involves the addition of exogenous minced lean meat, fat (19%), and curing agents [NaCl (2.5%), KNO3
proteases to accelerate the reactions that modify texture and (0.02%), NaNO2 (0.01%), dextrose (0.8%), lactose (1%), and dextrin
generate flavor.5,6 Consequently, it is essential to elucidate how (1.6%)]. SMS meat mixture was treated with Pronase E from
these enzymes affect the microstructure and, therefore, the Streptomyces griseus and aspartyl proteinase from Aspergillus oryzae at
distribution and mobility of water in fermented sausages to concentrations of 300/100 enzyme units/kg of meat mixture,
understand how the process can be optimized. respectively, to obtain the SMS+P batch. The protease addition was
Low-field NMR relaxation techniques (LF-NMR) can performed according to previous studies conducted with the use of
selective exogenous proteases.4,5 The amount of enzyme added in the
provide information about the state of water in foods, and present study has proved to be suitable to obtain acceptable products
numerous applications in a variety of food matrices have been with viable final quality attributes. No starter culture was used in order
reported.7−10 In fresh meat, NMR relaxation data were found to develop a natural fermentation process. Lean meat and fat were
to indicate the existence of more than one type of water chopped, using an MR-9 mincer (Garhe, Amorebieta, Spain), then
population.11−13 It was also shown that the changes in water mixed with the rest of the ingredients at cool temperature (4 °C), and,
attributes as a function of drying as detected by LF-NMR were after a resting period of 24 h at 4 °C, the sausage mixtures were stuffed
useful to elucidate the microbial safety of fermented meat into 50 mm diameter collagen casings, in pieces of 400 g. Eighteen
products.14 Nevertheless, knowledge about water properties in independent units were manufactured for each batch and placed in an
fermented sausages is still limited, and no detailed inves-
tigations on proteolysis have been reported. Consequently, the Received: February 4, 2015
aim of this work was to study changes in water mobility and Revised: March 9, 2015
distribution during the manufacturing process of sausage model Accepted: March 9, 2015
systems and to elucidate the relationship between proteolysis Published: March 9, 2015

© 2015 American Chemical Society 3039 DOI: 10.1021/acs.jafc.5b00660

J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3039−3045
189
 IV. Resultados

Journal of Agricultural and Food Chemistry Article

FED 53 ripening cabinet (Binder, Tuttlingen, Germany) for a period protein concentration was adjusted with water to give a final
of 9 days. During the first 24 h the units were kept at 22 °C and the concentration of 2 mg/mL and diluted 1:1 with SDS-PAGE sample
relative humidity of 95%. Within 48 h, storage conditions were buffer [2% SDS, 20% glycerol, 20 mM Tris-Cl, pH 6.8, 2 mM
gradually reduced to 89% humidity and 17 °C. Models were stored at ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 160 mM dithiothreitol
12 °C the remaining days. Sampling was carried out at different (DTT), and 0.1 mg/mL bromphenol blue] to give a final
ripening days: 0 (24 h after batter meat preparation and just before concentration of 1 mg/mL. The samples were heated at 100 °C for
stuffing into casings), 1, 3, 5, 7, and 9 days. A total of three units of 5 min prior to electrophoresis. SDS-PAGE was carried out under
each batch were collected for each of the studied times. reducing conditions,24 using Criterion TGX (any kDa) precast ready-
Physicochemical analyses were performed at each sampling time made gels (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). The amount of
and, in any case, before freezing. Then sausages were vacuum packaged protein solution injected into the electrophoresis gels was 20 μL in
and stored at −20 °C until further analyses. each lane. After electrophoresis, the gels were covered with fixative
Physicochemical Analysis. Water activity (aw), pH, and dry solution (40% methanol, 10% acetic acid) and then stained using
matter (DM) were determined in triplicate samples of each of the Coomassie Brilliant Blue R-250. The molecular weights of the
considered products and ripening times. Water activity (aw) was products of proteolysis were estimated by reference to the relative
measured using a Decagon CX1 hygrometer (Decagon Devices Inc., motilities of standard proteins.
Pullman, WA, USA) at 25 °C. The pH was determined in a Statistical Analysis. Statistical analysis was carried out using
homogenate of the sample with distilled water (1:10 w/v). DM was Statgraphics, ver. 5.1. Plus. The analyses were conducted across the
determined by drying the sample at 110 °C to constant weight, and two manufactured batches (SMS and SMS+P) and six different
the results were expressed as a percentage.18 ripening times (0, 1, 3, 5, 7, and 9 days), so 18 individual units per
NMR Analyses. Sausage models were thawed prior to NMR treatment were analyzed. Data are presented as mean and standard
analysis. To carry out thawing, samples were kept at room temperature deviation (SD). One-way ANOVA was performed. Bartlett’s test was
for approximately 6 h. Sausage behavior was similar in both SMS and used to test the null hypothesis that the standard deviations of data
SMS+P, and syneresis or exudate loss was never observed. Samples (within each of the model systems) were the same. Duncan’s test for
(approximately 4 cm long and 1 cm in diameter, weight approximately multiple mean comparisons procedure was used to determine which
5 g) were placed in a cylindrical glass tube (5 cm long by 14 mm means are significantly different from others (at 95% of confidence
diameter). Before measurement, the sausage samples were thermo- level).

■
stated to 25 °C in a water bath for 15−20 min. Proton NMR T2
relaxation measurements were performed on a Maran Benchtop
Pulsed NMR Analyzer (Resonance Instruments, Witney, UK)
RESULTS AND DISCUSSION
operating at 23.2 MHz and equipped with an 18 mm variable- Physicochemical Parameters. DM, pH, and aw mean
temperature probe where the cylindrical glass tubes were placed. A values and standard deviations for SMS and SMS+P are shown
total of six replicates of each product and ripening time were analyzed in Figure 1. The products showed significant differences (P <
at 25 °C. Transverse relaxation time, T2, was measured using the 0.05) for the three physicochemical parameters studied
Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence (CPMG)19,20 with a τ value
throughout all stages of the manufacturing process. As
(time between 90 °C pulse and 180 °C pulse) of 150 μs. Data from
4096 echoes were acquired as 16 scan repetitions. The repetition time expected, results showed that the lowest DM content (P <
between two succeeding scans was 2 s. The obtained T2 data were 0.05) could be attributed to the samples collected on day 0
analyzed using algorithm21 and carried out in MatLab (The (28.11 ± 0.31% for SMS and 27.16 ± 0.30% for SMS+P). As
Mathworks Inc., Natick, MA, USA) using in-house scripts. Distributed ripening progressed, a steady and considerable increase in DM
exponential fittings are shown in a plot of relaxation amplitude versus was observed, and the highest value was reached at day 9 (56.12
relaxation time, over a predefined range of characteristic relaxation ± 0.98% for SMS and 51.66 ± 0.62% for SMS+P). There were
times. also significant differences (P < 0.05) in pH, so the highest
Measurement of Proteolysis. Degree of proteolysis was value was detected at day 0 (5.64 ± 0.04 for SMS and 5.84 ±
estimated by measurement of free amino terminal groups using the
0.03 for SMS+P). Lactic acid production due to the
fluorescamine assay described earlier.22 One hundred milligrams of
each sample was solubilized in 1 mL of phosphate-buffered saline (0.05 fermentation of sugars by lactic acid bacteria led to the lowest
M phosphate buffer, 0.14 M NaCl, pH 6.7). To 500 μL of 1.67 M pH values at day 3 (around 5.00). From day 5, a slight increase
(24%) trichloroacetic acid in water was added an equal volume of in pH was observed in both batches. This may be due to
solubilized sample, and the mixture was held for 20 min on ice to allow production of free amino acids and ammonia as a result of
precipitation of intact proteins. The precipitated mixture was enzymatic activity.2,25 With the increase in DM, previously
centrifuged (17000g for 20 min) and then filtered through a no. 41 mentioned, aw decreased constantly (from 0.960 ± 0.001 in
filter paper (Whatman PLC, Brentford, UK). A 12.5 μL aliquot of this SMS and 0.953 ± 0.001 in SMS+P to 0.911 ± 0.001 and 0.903
filtrate was mixed with 1 mL of 100 mM borate buffer and 500 μL of ± 0.001, respectively), which results in a microbial stabilization
719 μM fluorescamine in acetone, and 250 μL was then transferred to
of the transformed product. The measured parameters are
each well in a microtiter plate. Fluorescence of the samples was
measured, 18 min after the addition of the fluorescamine, at an within the normal range previously described for dry fermented
excitation wavelength of 390 nm and an emission wavelength of 480 sausages,26,27 taking into account that the products manufac-
nm using a model Synergy 2 Multi-Mode microplate reader (Holm & tured for this study had a shorter ripening time (9 days)
Halby, Brøndby, Denmark). Quantitation was achieved by calculating compared to commercial brands (around 20−28 days), which
leucine equivalents using an external leucine standard curve prepared explains that higher DM values have not been reached at the
as follows: a 0.1 M leucine stock solution was made (327.5 mg of end of the process.
leucine in 25 mL of 1 mM HCl), and from the stock solution six NMR Studies on Sausage Model Systems. Water
different concentrations were made (0.00050−0.0030 M leucine) and Mobility and Distribution throughout Sausage Model
mixed with 10 mL of 1 mM HCl and analyzed as the sausage samples. Manufacturing. Distributed exponential analysis of the NMR
SDS-PAGE. Myofibrillar proteins were extracted by homogeniza-
tion of 1 g of sausage in 5 mL of a solution containing 7 M urea, 2 M T2 relaxation data revealed the presence of three different water
thiourea, and 400 mM Tris-base. The homogenate was centrifuged for populations in SMS (Figure 2A): a minor component, with
20 min at 10000g at 4 °C, and the supernatant containing myofibrillar relaxation times around 1−10 ms (T2b), a major component
proteins was separated. The protein concentration of the myofibrillar around 30−70 ms (T21), and a slower relaxing component
protein extracts were determined by using the Bradford assay.23 The (T22) around 100−300 ms. Chopping results in disintegration
3040 DOI: 10.1021/acs.jafc.5b00660

190 J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3039−3045

 IV. Resultados

Journal of Agricultural and Food Chemistry Article

Figure 2. Distributed NMR T2 relaxation times obtained on sausage

models on days 0, 1, 3, 5, 7, and 9 after production: (A) sausage
models systems (SMS); (B) sausage models with proteases (SMS+P).
Figure 1. Physicochemical parameters obtained for sausage model
Each curve represents a mean of six measurements.
systems (SMS) and models with protease (SMS+P) at different
ripening times (mean value and standard deviation of six replicates).
Values with different letters within the same line are statistically amount of immobilized water entrapped by myofibrillar
different (P < 0.05). proteins is reduced; meanwhile, protein chains are approaching
each other, creating aggregates. Once inside the ripening
of the overall structure with maintenance of intact myofila- cabinet, water release from the interior of the sausage takes
ments. It has been previously proved12 that disruption of the place partially by diffusion, due to the moisture difference
macroscopic structure of fresh meat did not change the between the sausages and the environment,31 which leads to
relaxation pattern in meat, so water assignments for minced the appearance of the T22 population, related to this mobile
meat are comparable to those obtained in fresh meat. It has extramyofibrillar water fraction. The drying process of meat
been suggested that T2b represents water closely associated with resulted in a shift toward faster relaxation times for both
macromolecules and/or protons in plasticized macromolecular populations, T21 and T22. This shift may be explained, mainly,
structures; T21 reflects water located within highly organized by the fact that the viscous protein system is transformed from
protein structures, and T22 represents more mobile water the “sol-state” into the colloidal viscous “gel-state”31 that leads
located in extramyofibrillar spaces.12,28,29 The T22 population to the constitution of an irreversible protein network that holds
was not present at day 0, but it was detected on all of the water in a less mobile state.32 The existence of different water
consecutive ripening days analyzed, which suggests that it may fractions and their changes during the drying process in sausage
be related to protein aggregation. Intensive chopping and a models found in the present work is in good agreement with
high concentration of NaCl result in the swelling of myofibrils data obtained in a previous study on fermented meat14 except
and the dissolving process of proteins, so water is mainly for the absence of the T22 component at day 0. This difference
associated with myofibrillar proteins. After a certain period of could be due to the existence of a resting period at cooling
adaptation, the growth of lactic acid bacteria results in the temperature (4 °C, approximately) before stuffing into casings
formation of lactic acid,2 and the pH decrease brings the and the absence of starter added culture in the present work,
myofibrillar proteins gradually closer to their isoelectric point which may have a significant effect on preserving protein
and their water-binding capacity decreases.30 Consequently, the structure from coagulation or aggregation, because, as
3041 DOI: 10.1021/acs.jafc.5b00660

191
J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3039−3045
 IV. Resultados

Journal of Agricultural and Food Chemistry Article

Table 1. Mean Relaxation Time and Relative Area for the T2 Relaxation Populations T21 and T22 Obtained for Sausage Model
Systems (SMS) and Models with Proteases (SMS+P) on Days 0, 1, 3, 5, 7, and 9 after Productiona
T21 T22
sample/ripening time (days) relative area relaxation time relative area relaxation time
SMS/0 96.3 ± 0.3 a,α 56.7 ± 0.9 a,β
SMS/1 93.7 ± 0.3 b,β 52.4 ± 1.3 b,β 3.2 ± 0.4 c 228.9 ± 71.1 a
SMS/3 84.4 ± 0.5 c,β 44.4 ± 1.2 c,β 12.4 ± 0.5 a 260.5 ± 12.0 a
SMS/5 85.0 ± 0.9 c,β 38.3 ± 1.2 d,β 11.7 ± 0.7 b 215.8 ± 8.0 a
SMS/7 85.6 ± 0.6 c,β 37.1 ± 1.4 d,β 11.5 ± 0.3 b 202.7 ± 7.0 b
SMS/9 84.3 ± 0.7 c,β 30.0 ± 1.4 e,β 12.8 ± 0.2 a,α 149.1 ± 21.3 c,β

SMS+P/0 95.7 ± 0.2 a,β 60.4 ± 1.1 b,α

SMS+P/1 94.8 ± 0.5 b,α 66.5 ± 1.1 a,α
SMS+P/3 94.7 ± 0.3 b,α 67.3 ± 2.9 a,α
SMS+P/5 94.5 ± 0.6 b,α 64.7 ± 2.5 a,α
SMS+P/7 92.5 ± 1.2 c,α 51.8 ± 2.5 c,α
SMS+P/9 89.5 ± 1.9 d,α 37.9 ± 2.1 d,α 7.8 ± 1.8 β 190.8 ± 40.5 α
a
Mean values and standard deviation of six replicates. Values with different letters (a−d) in the same column for the same model system indicate
significant differences (P < 0.05): differences between ripening times Values with different letters (α, β) in the same column for the same ripening
time indicate significant differences (P < 0.05): differences between batches.

mentioned above, the temperature and the pH descent are key with large cavities where the T22 can be related to the mobile
factors in promoting the structural changes in the protein water in the cavities. Distributed T2 relaxation times in SMS+P
matrix. compared to that obtained for SMS showed how the structural
Effect of Proteases on Sausage Models Structure. integrity was changed by the introduction of proteases. In fact,
Figure 2B shows distributed T2 relaxation times obtained on the ripening-induced shift of T21 and T22 populations in SMS+P
SMS+P. T2b1, T2b2, and T21 populations were identified for all is not as noticeable as it is in SMS, suggesting that water
ripening times. Previous studies14,33 have related the addition of immobilization is not taking place until day 7, as affected by
salt to the appearance of a T2b2 population (5−10 ms), absent protein degradation.
in fresh meat, and also identified in this batch throughout the Time constants and relative areas (corresponding to the
entire manufacturing process. The presence of this new proportion of protons represented by the specific T 2
population could be associated with a different distribution of population) of the two main components (T21 and T22) for
salt in both batches. For the SMS batch, it was possible to SMS and SMS+P are shown in Table 1. Significant differences
distinguish the T2b2 component only on days 0, 1, and 3 of were detected by comparison between T21 relaxation times
production, although it was not a clear peak and appeared corresponding to SMS and SMS+P throughout ripening time,
almost merged with T2b1. In this batch, ripening took place on a so that SMS+P consistently maintained higher T21 values over
conventional basis, which means that the myofibrils were able time. These findings can be related to the fact that the water
to swell and retain water, and the added salt was easily absorbed content was also higher in SMS+P than SMS for the same
or incorporated into protein structure as ripening progressed. studied stage, ranging from 71.9 ± 0.3 to 43.9 ± 0.9 g of water/
The proteins dissolved as a result of the mincing and the 100 g of sample in SMS and from 72.8 ± 0.3 to 48.3 ± 0.6 g of
addition of salt produce filament-shaped aggregates that water/100 g sample in SMS+P. The drying process resulted in a
interact and contribute to the stability of the gel.2 However, decrease of the relative areas of both populations, although the
in SMS+P models, protein breakdown prevented an efficient decrease was more progressive in SMS and values were higher
absorption of salt by myofibrils in such a way that it together in SMS+P, especially from day 3 on.
with water constituted an independent compartment with faster Proteolysis in Model Samples As Measured by
relaxation time, different from the major myofibrillar protein Increase in Free Amino Groups. Proteolysis was quantified
component (T21) that could be clearly identified during the by assaying for protein breakdown products through
entire process. The presence of the T2b2 population suggests determination of free amino terminals (N-terminal + lysine
that the protein matrix did not present a strong and well- side chains, as well as other amines that may be present).
organized structure. The T22 component was not present in Although the concentration of free amino groups increased for
SMS+P samples until day 9, which constitutes an important both batches over time (Figure 3), higher values were found for
difference compared to T2 distributions in SMS. The absence of SMS+P (concentration varied from 657.83 ± 1.54 to 1487.09 ±
the T22 component suggests a nonaggregation behavior of the 5.06 mg Leu equiv/DM at days 0 and 9, respectively) than for
proteins. Partial denaturation of protein is required as an initial SMS (values from 290.35 ± 3.71 to 487.78 ± 0.93 mg Leu
step to achieve the ordered protein−protein interaction and equiv/DM, respectively), showing that the proteolysis was
aggregation;34 however, the hydrolysis induced by proteases more prominent in the protease-added batch, SMS+P. This
prevents the proper establishment of the protein network and finding is in agreement with previous works4,5 in which the
severely affects final texture resulting in a softening of the nitrogen fractions achieved higher values in protease-added
product, as previously reported.4,5 Consequently, T2b2 and T22 batches than those of the control. Significant differences were
populations are both related to the absence of a strong and firm found over time for both batches regarding free amino group
protein matrix. Proteolysis can also produce an extensive concentration, although the lower increase occurred toward the
unfolding of the protein inducing the formation of a network end of the process for SMS+P, during days 7 and 9 (5.5%),
3042 DOI: 10.1021/acs.jafc.5b00660

192 J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3039−3045

 IV. Resultados

Journal of Agricultural and Food Chemistry Article

extent of proteolysis, and it was possible to distinguish high-

molecular-weight compounds, almost during the whole process.
The considerably lower degree of protein degradation in SMS
samples could explain why different free amino group
concentrations were obtained. On the other hand, as
proteolysis contributes to a weakening of the myofibrillar
network and the subsequent generation of peptides and free
amino acids that contribute to flavor development,36 the
formation of a large amount of free amino groups is
inconsistent with the emergence of the T22 component,
because this fact is opposed to the establishment of an
organized and compact meat matrix. However, a moderate
production of amino groups combined with appropriate
dehydration conditions allow the development of a high
structured meat gel in which T2 distributed data could be
characterized by the presence of the T22 population during
almost the whole process.
SDS-PAGE. As the contribution from myofibrillar proteins is
the most important parameter for the development of desirable
Figure 3. Concentration of free amino groups (mean values and gel characteristics in processed meat products,3,37 SDS-PAGE
standard deviation; expressed as mg leucine equiv/DM) quantified in of myofibrillar proteins was performed to elucidate the
SMS+P and SMS samples over time. Values with different letters
differences in protein degradation pattern between SMS and
within the same line are statistically different (P < 0.05).
SMS+P. Some bands were identified on the basis of their
molecular weights, determined by comparison with standards in
suggesting a trend to stabilization, because the protease activity the stained gel (Figure 4). Heavy myosin chain (MHC) (220
was higher between days 0 and 3 of production. During the kDa), α-actinin (94 kDa), actin (45 kDa), troponin-T (37
fermentation and ripening of dry fermented sausages, a large kDa), tropomyosin (35 kDa), myosin light chains (MLC) 1, 2,
number of biochemical reactions associated with the degrada- and 3 (25, 18, and 15 kDa, respectively), troponin I (24 kDa),
tion of myofibrillar and sarcoplasmic proteins take place.4,5 and troponin C (20 kDa) were present in all SMS samples.38 As
These biochemical reactions are promoted by muscle ripening progressed, a degradation of myofibrillar proteins was
endopeptidases (calpains I and II and cathepsins B, D, H, evident. The intensity of MHC and actin bands decreased over
and L).35 For batch SMS, therefore, the increase of free amino time; troponin T and tropomyosin degradation was also
groups corresponds to a natural proteolysis process conducted noticeable. MLC 1 and troponin I bands were not so intense
by endogenous enzymes, so the protein degradation was lower from day 3 on, and MLC 2 and 3 were especially affected by
during the whole process and, finally, the proteolysis rate proteolysis because they disappeared completely after 3 days of
increased during days 7 and 9, when the greatest increase in the ripening. New polypeptides of smaller size (≈12 kDa) also
concentration was found (53.5%). SMS+P samples experienced accumulated from day 1 on. These findings are in agreement
a substantial degradation from the moment of the addition of with previous studies on fermented sausages,15,16,39 although in
the enzymes (day 0), resulting in low-molecular-weight the present study the pattern of proteolysis was not that intense
compounds. Meanwhile, SMS samples experienced a lower due to the fact that sausages were ripened for a shorter period

Figure 4. SDS-PAGE electrophoretograms of myofibrilar proteins throughout the ripening of sausages. Lanes: 1, protein standards; 2−7, sausage
model systems (SMS), days 0, 1, 3, 5, 7, and 9; 8−13, models with proteases (SMS+P), days 0, 1, 3, 5, 7, and 9. MHC, heavy myosin chain; α-act., α-
actinin; TN-T, troponin-T; TM, tropomyosin; MLC 1, 2, 3, myosin light chains 1, 2, and 3; TN-I, troponin I; TN-C, troponin C.

3043 DOI: 10.1021/acs.jafc.5b00660

193
J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3039−3045
 IV. Resultados

Journal of Agricultural and Food Chemistry Article

of time. Throughout fermentation, the combination of salt, Notes

temperature (20−26 °C), and the decline in pH provokes The authors declare no competing financial interest.
insolubilization of sarcoplasmic and myofibrillar proteins.
Insolubilization progresses during ripening due to advanced
dehydration.2,41 A decrease in the solubility of myofibrillar
■ ACKNOWLEDGMENTS
We thank Hanne Søndergaard Møller, Department of Food
proteins was observed, because the bands were much more Science, Aarhus University, for technical assistance.

■
intensely stained at the end of ripening than at day 0. The loss
in myofibrillar protein solubility has been previously described REFERENCES
by other researchers.15,40 A dramatically different protein band
pattern was observed for SMS+P, where high-molecular-weight (1) Trout, G. R. Techniques for measuring water-binding capacity in
muscle foods − a review of methodology. Meat Sci. 1988, 23, 235−
compounds cannot be distinguished as a result of the 252.
proteolysis to which samples have been subjected. However, (2) Ordóñez, J. A.; Hierro, E. M.; Bruna, J. M.; Hoz, L. Changes in
protein insolubilization during drying was clearly evident. the components of dry-fermented sausages during ripening. Crit. Rev.
These results, together with proteolysis measurements (Figure Food Sci. 1999, 34, 329−367.
3), prove that protein denaturation on SMS+P was very intense (3) Tornberg, E. Effects of heat on meat proteins-Implications on
from day 0; consequently, the molecular weight of the protein structure and quality of meat products. Meat Sci. 2005, 70, 493−508.
chains is too low, and they solubilize completely before (4) Díaz, O.; Fernández, M.; García de Fernando, D. G.; de la Hoz,
aggregating. The solubility of myofibrillar proteins in SMS+P L.; Ordóñez, J. A. Proteolysis in dry fermented sausages: the effect of
decreased with ripening time due to the dehydration process selected exogenous proteases. Meat Sci. 1997, 46, 115−128.
and the increase in salt concentration, which leads to the (5) Díaz, O.; Fernández, M.; García de Fernando, G. D.; De la Hoz,
L.; Ordóñez, J. A. Effect of the addition of Pronase E on the
aggregation of protein chains and the formation of higher
proteolysis in dry fermented sausages. Meat Sci. 1993, 34, 205−216.
molecular weight compounds, so the bands on days 7 and 9 (6) Fernández, M.; Ordóñez, J. A.; Bruna, J. M.; Herrans, B.; de la
were more intensely stained than on previous days. With regard Hoz, L. Acelerated ripening of dry fermented sausages. Food Sci.
to T2 distributions, the stronger protein chain association at day Technol. 2000, 11, 201−209.
9 compared with earlier stages by reducing the pore size of the (7) Capitani, D.; Mannina, L.; Proietti, N.; Sobolev, A. P.; Tomassini,
matrix due to the water loss, together with the extensive A.; Miccheli, A.; DiCocco, M. E.; Capuani, G.; DeSalvador, F. R.;
unfolding suffered by proteins, could be associated with the Delfini, M. Metabolic profiling and outer pericarp water starte in
appearance of T22 population, suggesting that some degree of Zespri CI.GI and Hayward Kiwifruits. J. Agric. Food Chem. 2013, 61,
aggregation is needed for the presence of the water population 1727−1740.
T22 in dried sausages. The fact that the T2b2 population was also (8) Li, T.; Rui, S.; Li, W.; Chen, X. H.; Jiang, M.; Dong, M. S. Water
distribution in tofu and application of T2 relaxation measurements in
present in the final stages supports the hypothesis that a true determination of tofu’s water holding capacity. J. Agric. Food Chem.
coagulation is not taking place and the structural modification is 2014, 62, 8594−8601.
not complete and, further, related to the dehydration taking (9) Hager, A. S.; Bosmans, G. M.; Delcour, J. A. Physical and
place during ripening. molecular changes during the storage of gluten-free rice and oat bread.
In conclusion, the present study revealed that (i) changes in J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5682−5689.
water mobility and distribution during the manufacture of (10) Greiff, K.; Fuentes, A.; Aursand, I. G.; Erikson, U.; Masot, R.;
sausage model systems were detectable by means of LF-NMR Alcaniz, M.; Barat, J. M. Innovative non-destructive measurements of
relaxation, where ripening produced a shift toward faster water activity and the content of salts in low-salt hake minces. J. Agric.
relaxation times related to the reduction of the intrinsic pore Food Chem. 2014, 62, 2496−2505.
size of the meat matrix; and (ii) the distribution of water in (11) Bertram, H. C.; Dønstrup, S.; Karlsson, A. H.; Andersen, H. J.
Continuous distribution analysis of T2 relaxation in meat- An approach
sausage models was significantly affected by the addition of in the determination of water holding capacity. Meat Sci. 2001, 60,
proteases to the meat batter, supporting the role of myofibrillar 279−285.
proteins in meat coagulation and suggesting that some (12) Bertram, H. C.; Karlsson, A. H.; Rasmussen, M.; Pedersen, O.
aggregation degree is needed for the presence of a T22 D.; Andersen, H. J. Origin of multiexponential T2 relaxation in muscle
population in fermented sausages. Finally, the extinction of myowater. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 3092−3100.
the T22 population in meat systems could be associated with a (13) Bertram, H. C.; Andersen, H. J. Applications of NMR in meat
high enzymatic proteolysis degree and, consequently, the science. Annu. Rep. NMR Spectrosc. 2004, 53, 158−202.
presence of great amounts of free amino groups. (14) Møller, S.; Gunvig, A.; Bertram, H. C. Effect of starter culture

■
and fermentation temperature on water mobility and distribution in
fermented sausages and correlation to microbial safety studied by
AUTHOR INFORMATION nuclear magnetic resonance relaxometry. Meat Sci. 2010, 86, 462−467.
Corresponding Author (15) García de Fernando, D. G.; Fox, P. F. Study of proteolysis
during the ripening of a dry fermented pork sausage. Meat Sci. 1991,
*(H.C.B.) Phone: +45 87 158 353. E-mail: HanneC.Bertram@ 30, 367−383.
food.au.dk. (16) Hughes, M. C.; Kerry, J. P.; Arendt, E. K.; Kenneallu, P. M.;
Funding McSweeney, P. L.; O’Neill, H. Characterization of proteolysis during
The present work received financial support from Project the ripening of semi-dry fermented sausages. Meat Sci. 2002, 62, 205−
AGL2010-19158 funded by the Spanish Ministry of Economy 2016.
(17) Ohashi, K.; Negishi, H. Hydrolysis of pork myofibrillar proteins
and Competitivity − General Directorate of Scientific Research,
during fermentation using starter cultures of Lactobacillus bulgaricus
and A.B.G.G. was awarded a grant (BES-2011-047485) from and Streptococcus thermophilus. Food Sci. Technol. Res. 2014, 20, 679−
the same institution. H.C.B. acknowledges the Danish Research 685.
Council FTP for financial support through Project “Advances (18) Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical
in food and nutrition research through implementation of Chemists, 18th ed., 1st rev.; AOAC International: Gaithersburg, MD,
metabolomics technologies (274-09-0107)”. USA, 2006.

3044 DOI: 10.1021/acs.jafc.5b00660

194 J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3039−3045

 IV. Resultados

Journal of Agricultural and Food Chemistry Article

(19) Carr, H. Y.; Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession (38) Porcio, M. A.; Pearson, A. M. Improved resolution of
in nuclear magnetic resonance experiments. Am. J. Physiol. 1954, 94, myofibrillar proteins with sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel
630−638. electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta 1977, 490, 27−34.
(20) Meiboom, S.; Gill, D. Modified spin-echo method for measuring (39) Roseiro, L. C.; Santos, C.; Sol, M.; Borges, M. J.; Anjos, M.;
nuclear times. Rev. Sci. Instrum. 1958, 29, 688−691. Goncalves, H.; Carvalho, A. S. Proteolysis in Painho de Portalegre dry
(21) Butler, J. P.; Reeds, J. A.; Dawson, S. V. Estimating solutions of fermented sausage in relation to ripening time and salt content. Meat
1st kind integral equations with nonnegative constraints and optimal Sci. 2008, 79, 784−794.
smoothing. SIAM J. Numer. Anal. 1981, 18, 381−397. (40) Astiasarán, I.; Villanueva, R.; Bello, J. Analysis of proteolysis and
(22) Jansson, T.; Clausen, M. R.; Sundekilde, U.; Eggers, N.; protein insolubility during the manufacture of some varieties of dry
Nyegaard, S.; Larsen, L.; Ray, C.; Sundgren, A.; Andersen, H. J.; sausage. Meat Sci. 1990, 28, 111−117.
Bertram, H. C. Lactose-hydrolyzed milk is more prone to chemical (41) Wardlaw, F. B.; Skelley, G. C.; Johnson, M. G.; Acton, J. C.
changes during storage than conventional UHT milk. J. Agric. Food Changes in meat components during fermentation, heat processing
and drying of a summer sausage. J. Food Sci. 1973, 38, 1228−1231.
Chem. 2014, 62, 7886−7896.
(23) Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle
of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248−254.
(24) Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680−
685.
(25) Lücke, F. K. Fermented sausages. In Microbiology of Fermented
Foods; Wood, B. J. B., Ed.; Blackie Academic and Professional: New
York, 1998; pp 441−483.
(26) Ordóñez, J. A.; Hoz, L. Embutidos crudos curados. Tipos.
Fenomenos madurativos. Alteraciones. In Enciclopedia de la Carne y los
Productos Cárnicos; Martin and Macias: Cáceres, Spain, 2001; Vol. II,
pp 1063−1090.
(27) Herrero, A. M.; Ordóñez, J. A.; Romero de Á vila, M. D.;
Herranz, B.; de la Hoz, L.; Cambero, M. I. Breaking strength of dry
fermented sausages and their correlation with texture profile analysis
(TPA) and physico-chemical characteristics. Meat Sci. 2007, 77, 331−
338.
(28) Bertram, H. C.; Purslow, P. P.; Andersen, H. J. Relationship
between meat structure, water mobility, and distribution: a low-field
nuclear magnetic resonance study. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 824−
829.
(29) Venturi, L.; Rocculi, P.; Cavani, C.; Placucci, G.; Rosa, M. D.;
Cremonini, M. A. Water absorption of freeze-dried meat at different
water activities: a multianalytical approach using sorption isotherm,
differential scanning calorimetry, and nuclear magnetic resonance. J.
Agric. Food Chem. 2007, 55, 10572−10578.
(30) Albarracín, W.; Sánchez, I. C.; Grau, R.; Barat, J. M. Salt in food
processing; usage and reduction: a review. Int. J. Food Sci. Technol.
2009, 46, 1329−1336.
(31) Katsaras, K. Microstructure of fermented sausage. Meat Sci.
1992, 31, 121−134.
(32) Sun, X. D.; Holley, R. A. Factors influencing gel formation by
myofibrillar proteins in muscle foods. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf.
2010, 10, 33−51.
(33) Andersen, R. H.; Andersen, H. J.; Bertram, H. C. Curing-
induced water mobility and distribution within intra- and extra-
miofibrilar spaces of three pork qualities. Int. J. Food Sci. Technol. 2007,
42, 1059−1066.
(34) Barbut, S. Importance of fat emulsification and protein matrix
characteristics in meat batter stability. J. Muscle Foods 1995, 6, 161−
177.
(35) Toldrá, F. Biochemical proteolysis basis for improved processing
of dry-cured meats. In Advanced Technologies for Meat Processing;
Nollet, L. M. L., Toldrá, F., Eds.; CRC Press: Boca Raton, FL, USA,
2006; pp 329−354.
(36) Toldrá, F. The role of muscle enzymes in dry-cured mat
products with different drying conditions. Trends Food Sci. Technol.
2004, 17, 164−168.
(37) Andersson, K.; Andersson, A.; Tornberg, E. Microstructure as
related to the water-holding, textural and sensory properties of
emulsion sausages. In Food Colloids − Proteins, Lipids and
Polysaccharides; Dickinson, D., Bergenstahl, B., Eds.; Royal Society of
Chemistry: Cambridge, UK, 1997; pp 29−42.

3045 DOI: 10.1021/acs.jafc.5b00660

195
J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3039−3045
 IV. Resultados

Trabajo 4
Distribución y movilidad de agua durante el proceso de elaboración de embutidos crudos
curados y su relación con características fisicoquímicas y reológicas

Publicado en European Food Research and Technology, 243 (2017), 455-466

197
 IV. Resultados

Continuando con la línea de investigación iniciada con los modelos cárnicos, en el

Trabajo 4 se planteó utilizar la relaxometría T2 para realizar el estudio microestructural
de embutidos crudos curados, recreando las condiciones típicas de un proceso de
elaboración tradicional durante un total de 14 días. Se elaboraron embutidos tipo
chorizo y tipo salchichón con distintos niveles de grasa y se analizaron a distintos
tiempos de maduración. También en este caso, se obtuvieron distintas poblaciones
(T2b, T21, T22) de protones, que experimentaron una evolución durante el curado similar
a la observada previamente en los modelos cárnicos sin proteasas. El avance de la
maduración estuvo marcado por la fermentación microbiana de la masa cárnica, que
indujo cambios en la matriz proteica debido al descenso de pH y que se han
relacionado con la aparición de la población T22, y la deshidratación, que marcó la
reducción de los tiempos de relajación durante todo el proceso. El comportamiento de
ambos tipos de productos fue similar, sugiriendo que experimentaron una maduración
paralela. Se realizó además un análisis de perfil de textura (TPA) en los tiempos de
análisis para evaluar la evolución estructural mediante un método tradicional. El
análisis multivariante mediante análisis de clusters reveló una clara discriminación
entre muestras según su tiempo de maduración y el coeficiente de correlación de
Pearson se utilizó para establecer el grado de dependencia lineal entre T2-parámetros
fisicoquímicos y T2-características de textura. En este sentido, la población mayoritaria
T21 mostró un grado de dependencia más fuerte, especialmente con el contenido en
agua (r=0,93) y la dureza (r=0,87), mientras que las otras poblaciones, T2b y T22,
mostraron un grado de asociación mucho más débil con los parámetros fisicoquímicos
y de textura.
Este estudio demuestra que la relaxometría T2 es una técnica prometedora para
establecer relaciones entre los estados biofísicos del agua intrínseca de la matriz
cárnica y la evolución de las propiedades texturales de los embutidos crudos curados.
Como futura línea de investigación, sería interesante plantear un estudio de RMN
centrado en la grasa, puesto que, en este caso, no se encontraron diferencias
significativas entre los niveles de grasa empleados y sería muy relevante plantear un
nuevo diseño para elucidar este punto.

199
 IV. Resultados
Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466
DOI 10.1007/s00217-016-2759-0

ORIGINAL PAPER

Water mobility and distribution during dry‑fermented

sausages “Spanish type” manufacturing and its relationship
with physicochemical and textural properties: a low‑field NMR
study
Ana Belén García García1 · Mª Isabel Cambero Rodríguez1 ·
Mª Dolores Romero de Ávila Hidalgo1 · Hanne Christine Bertram2 

Received: 18 April 2016 / Revised: 16 June 2016 / Accepted: 16 July 2016 / Published online: 6 August 2016
© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2016

Abstract  Changes in the mobility and distribution of water Keywords  Fermented sausages · Ripening · NMR
in dry-fermented sausages Spanish type (“chorizo” and relaxation · Physicochemical features · Textural properties
“salchichón”, 20 and 40 % fat) throughout ripening were
detected by NMR T2 relaxation. Three to four different
water populations (T2b1, T2b2, T21 and T22) were detected. Introduction
Multivariate cluster analysis revealed a clear discrimina-
tion between samples of different ripening times, and sig- A large variety of dry-cured meat products are produced
nificant differences were found in the physicochemical and consumed in Spain. Dry-fermented sausages, in par-
parameters, T2 relaxation data and textural properties of ticular, are considered traditional products with a high gas-
sausages according to the production day (0, 2, 4, 7, 11 and tronomic value for consumers worldwide. Dry-fermented
14). Pearson product-moment correlation coefficient (PCC) sausages consist of a mixture of meat and fat particles, salt,
was used to establish the degree of linear dependence curing agents, spices and condiments, which have been
between T2 relaxation–physicochemical characteristics and stuffed into casings, fermented and dried [1]. Fermenta-
T2 relaxation-textural properties. A strong correlation was tion refers to the breakdown of carbohydrates present in
found between the main component T21 and the water con- the meat batter, mainly to lactic acid, due to the action of
tent (r = 0.93), T21 and aw (r = 0.87), as well as between lactic acid bacteria (LAB), which results in a pH decrease
T21 and hardness (r  =  −0.78), although the other two at this stage [2]. The ongoing acidification favors color for-
water populations, mainly T2b, showed a lower degree of mation and muscle protein coagulation, increasing firmness
association with the physicochemical and textural param- and cohesiveness of the product [3]. In the final ripening/
eters. Consequently, the study demonstrated that LF-NMR drying phase, sausages are further dried, and the final tex-
relaxometry is a promising technique to elucidate associa- ture and flavor of the product are developed as a result of
tions between the biophysical state of intrinsic water and different biochemical reactions affecting macromolecules
progression in textural properties of dry-fermented meat (proteolysis, lipolysis and lipid oxidation) during this
products. period [4]. Given the nonhomogeneous nature of meat sau-
sages, the study of how water is distributed within the prod-
uct offers both theoretical and practical interest, since the
structural properties and the final quality of the sausages
are determined by the type of interaction water may have
* Hanne Christine Bertram with solutes present in the product, mainly water binding
[email protected] with proteins, since meat proteins represent the main func-
1 tional ingredient in meat products. Different studies have
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología
de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad been previously conducted in order to study distribution
Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spain and mobility of water in meat systems by means of nuclear
2
Department of Food Science, Aarhus University, Research magnetic resonance (NMR) T2 relaxation. Proton relaxa-
Centre Aarslev, Kirstinebjergvej 10, 5792 Årslev, Denmark tion is governed by molecular movement and interaction

13
201
 IV. Resultados

456 Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466

between nuclei, and T2 relaxation provides valuable infor- get a product “salchichón type” (g or ml/Kg of product):
mation about the nuclei environment [5]. It has been previ- sodium chloride (24), lactose (30), dextrose (5), black
ously proved [6] that NMR relaxometry is a useful tech- pepper (2.5) and water (10). For “chorizo type,” sodium
nique to study the drying process and to elucidate microbial chloride (24), dextrose (7), paprika pepper (12), garlic (4),
safety in fermented meat products. A recent study [7] has oregano (2) and water (10) were added. Sausages were
been also conducted in order to establish the influence ripened for 14 days, and the process was conducted using
of lipid type in water and fat distribution in these meat the conditions previously described by García-García [8]
derivatives. Moreover, our group has recently conducted (Fig. 1). Sampling was carried out at different times: days 0
a T2 relaxometry study to elucidate structural changes in (24 h after batter meat preparation and just before stuffing
the protein matrix according to the ripening time and the into casings), 2, 4, 7, 11 and 14. Eighteen independent units
addition of proteases in fermented sausage model systems were manufactured for each batch (72 units were analyzed
[8]. Nevertheless, knowledge about water properties in in total, considering the four mentioned batches). Three dif-
fermented sausages is still only partially explored, despite ferent sausages were collected of each product and manu-
the fact that this type of meat product is one of the most facturing time. Physicochemical and texture analyses were
valuable and consumed meat-based product around the immediately performed, and then units were vacuum-pack-
world. In addition, given the importance of texture in the aged and stored at −20 °C until NMR analyses.
final product, and taking into account the effect of fermen-
tation and drying process on meat structure, it is interest- Physicochemical analysis
ing to evaluate the changes in textural parameters through-
out the manufacturing process, since it may contribute to The water activity (aw) measurements were carried
understand the effect of processing on products, probe the out at 25 °C using a Decagon CX1 hygrometer (Deca-
system structure and reveal critical aspects of food texture gon Devices Inc., Pullman, WA, USA). The dry matter
[9]. Texture profile analysis (TPA) is the most commonly (DM) of the samples was determined by drying the sam-
used instrumental method to study texture of foods nowa- ple at 110 °C to constant weight, and the results were
days, and it has been previously used by different authors expressed as a percentage [18]. The pH was determined
to study sausages [10–17]. However, TPA parameters have in a homogenate of the sample with distilled water (1:10)
not been related to T2 relaxation data, so far. Additionally, (w/v), using a Crison Digit-501 pH meter (Crison Instru-
since texture is a sensory property which derives from the ments LTD, Barcelona, Spain). Six physicochemical
structure of the product (molecular, microscopic and mac- measurements were performed per batch and ripening
roscopic) it can be related to the relaxometry data, since time. To estimate these parameters, two different portions
T2 provides valuable information about food structure of sample (2-cm thickness slices) were removed from the
[5]. Consequently, the aim of this study was to investigate inner central part of the sausage units, and analyses were
the potential of low-field NMR relaxometry for elucidat- performed in triplicate per slice.
ing changes in water mobility and distribution during the
manufacturing process of dry-fermented sausages “Spanish NMR analysis
type,” relating these results to those obtained from com-
pression texture analysis (TPA) and physicochemical fea- Proton NMR relaxometry data were recorded on a Maran
tures in order to obtain a better understanding of the rela- Benchtop Pulsed NMR Analyzer (Resonance Instruments,
tion between the biophysical state of intrinsic water and Witney, UK) operating at 23.2 MHz and equipped with
product texture characteristics. an 18-mm variable temperature probe. Transverse relaxa-
tion time, T2, was measured using the Carr–Purcell–Mei-
boom–Gill sequence [19, 20]. The T2 measurements were
Materials and methods performed with a τ-value of 150 µs (time between 90° and
180° pulse), and data were acquired as 16 scan repetitions.
Production of dry‑fermented sausages “Spanish type” The repetition time between two succeeding scans was
2 s. The obtained T2 data were analyzed using distributed
Two different dry-fermented sausages “Spanish type” were exponential fitting analysis according to the regularization
produced: “salchichón” (S) and “chorizo” (CH). The differ- algorithm by Butler [21] and carried out in MATLAB (The
ent products were manufactured using a basis of pork meat, Mathworks Inc., Natick, MA, USA) version 6.5 using in-
150 ppm NaNO2, 150 ppm NaNO3 and two different levels house scripts. Sausage units were thawed prior to NMR
of fat (20 and 40 % w/w). Four different batches were pro- analysis at room temperature for approximately 6 h. Six
duced: S1, CH1 (20 % fat) and S2, CH2 (40 % fat). The replicates (approx. 4 cm long, 1 cm in diameter) of each
following ingredients were added to this basis in order to product and ripening time were analyzed at 25 °C.

13
202
 IV. Resultados
Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466 457

Fig. 1  Dry-fermented sausages production and sampling procedure. S1: Salchichón (20 % fat), CH1: Chorizo (20 % fat); S2: Salchichón (40 %
fat); CH2: Chorizo (40 % fat); PhCh: physicochemical analysis; TPA: texture profile analysis; NMR: nuclear magnetic resonance analysis

13
203
 IV. Resultados

458 Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466

Texture analysis In order to measure the degree of linear dependence

between two variables, Pearson product-moment correla-
Texture profile analysis (TPA) [22] was carried out to deter- tion coefficient (PCC) was applied on the obtained data
mine mechanical behavior during the ripening process. to establish the dependence between T2 relaxation—phys-
TPA was performed using a TA.XT2i Texture Analyzer icochemical characteristics and T2 relaxation—textural
(Stable Microsystems Ltd., Surrey, England) with the Tex- properties.
ture Exponent 32, 6.0.7.0. Version. Six sample cores (diam-
eter  = 2.5 cm, height = 1.0 cm) were obtained from the
inner part of each of the studied products and ripening time. Results and discussion
A double compression cycle test was performed of up to
50 % compression of the original height with an aluminum Changes during the ripening process
cylinder probe P/25. Force–time deformation curves were
obtained with a 5-kg load cell applied at a crosshead speed Physicochemical parameters
of 1.0 mm/s. Measurements of samples were carried out at
room temperature (25 °C). Dry matter (DM), pH and water activity (aw) mean values
and standard deviation for “chorizo” and “salchichón” are
Data analysis shown in Fig. 2. Using CH2 and S2 as examples (fat con-
tent close to commercial brands), the lowest DM content
To check the normal distribution (90 % confidence) of (P < 0.05) was obtained for day 0 samples (27.5 ± 0.3 %
data, the Shapiro–Wilk test was applied. For the analysis for CH2 and 27.6 ± 0.6 % for S2). As expected, these
of physicochemical, T2 relaxation and textural data, a two- samples also showed the highest aw (0.961 ± 0.001 and
way analysis of variance (ANOVA) was performed, and 0.958  ± 0.000, respectively). DM experienced a pro-
Duncan´s test for multiple mean comparisons procedure gressive increment throughout ripening, and the highest
was used to determine which means were significantly dif- value was reached at day 14, 58.4 ± 0.5 % for CH2 and
ferent (at 95 % of confidence level). For this purpose, Stat- 60.0 ± 1.2 % for S2, meanwhile aw decreased constantly,
graphics, version 5.1. Plus was used. until 0.888 ± 0.002 and 0.897 ± 0.002, respectively. The
The whole data (physicochemical, T2 relaxation and highest pH value was obtained for day 0 (5.65 ± 0.03
textural information obtained for CH1, CH2, S1 and S2 for CH2 and 5.71 ± 0.01 for S2), and the lowest pH was
throughout ripening) were subjected to multivariate clus- reached for days 4–7 (around 5.00), due to the action of the
ter analysis, performed with the methodology of the pro- microbiota naturally present in the meat batter. The same
gramme SPADSPAD.N, (2003) (“Système Portable pour trend was observed for batches CH1 and S1. The experi-
l’analyse des données,” View 5.6 CISIA Montreuil Cedex. mental conditions under which this study was conducted
France), to emphasize variation and bring out strong pat- (14 days of production) could explain slight differences
terns in the dataset, so data became easy to explore and found between these results and data obtained in previous
visualize. A combined strategy of classification algorithms works [17, 23–25], mainly regarding DM and aw which
was applied. In the first stage, type k-means iterative optimi- usually reach higher and lower values, respectively, in
zation techniques were applied, so that very homogeneous finished commercial products with longer ripening times.
groups are identified, although in large number. In a sec- Moreover, the development of a natural fermentation could
ond stage, a hierarchical agglomeration was applied, which be related to slight variations in pH, since it is known that
allows determining the appropriate number of classes. The there is an effect of starter culture on acidification, which
aggregation process is represented in a hierarchical tree, also affects protein denaturation during processing [26]. In
together with a histogram of the levels of aggregation in general, the final quality of fermented sausages is highly
each step. Each cut made in the tree gives rise to a parti- affected by fermentation stage and the starter cultures used
tion or typology. The most suitable cutting is deduced by [27–29]. The results obtained in the present study corre-
observation and analysis of jumps or steps in the histogram spond to a natural fermentation process, where LAB expe-
of aggregation rates. Classes are characterized by those vari- rience a fast growth, due to curing agents, sugars addition,
ables that present values above or below the global aver- nitrates, aw reduction and low oxygen tension [4], and LAB
age. T value, statistical comparison of both mean values, thereby ensure a pH decrease via glycolysis.
was used to stablish the level of significance and to sort the
variables by their importance in the characterization of the NMR relaxometry
classes obtained. The association was carried out taking
into account the textural features (hardness, adhesiveness, Distributed T2 relaxation data obtained on Span-
springiness, cohesiveness, gumminess and chewiness). ish sausages “chorizo” and “salchichón” type during

13
204
 IV. Resultados
Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466 459

was not present in the sausage batters at day 0, since

some extent of protein aggregation degree is required for
the presence of this population in sausage samples. Con-
sequently, at day 2, T22 became visible due to the pH
descent and the onset of water loss as a result of the dry-
ing process. Moreover, T2b2 population was only clearly
observed on days 0 and 2 of production, while from day
4 on, this component was indistinguishable, and the exist-
ence of one single water fraction within 1–10 ms region
is shown, mainly in days 11 and 14, related to the absorp-
tion of the added salt into the protein structure and the
consolidation of a firm, organized structure as the ripen-
ing process progressed. The same trend was obtained for
the two other products studied and levels of fat (distribu-
tions not shown). T2 relaxation time constants and corre-
sponding areas of the two main components (T21 and T22)
for CH2 and S2 (closer to commercial brands) are shown
in Table 1. Mean values of relative area for both T21 and
T22 populations decreased significantly over time in all the
products studied and, similarly, the mean relaxation time
varied for both components, although they were remained
longer throughout the entire ripening process in S2. The
shift of the T21 and T22 populations toward faster relaxa-
tion indicates a higher degree of immobilization of water,
and the change is related to the increase in the consistency
of the meat matrix. While storage temperature of sam-
ples has proven to have a great impact on the degree of
water binding by the myofibillar protein system [35, 36],
Fig. 2  Changes in physicochemical parameters (mean values and in the current study, the results strongly indicate that the
standard deviation) observed in dry-fermented sausages (CH1, CH2, freezing-thawing did not have any major impact on the
S1, S2) during ripening. a, b, c, d, e, f: bars with different letters
time evolution and the relationship between water distribu-
for the same sausage type are statistically different (P < 0.05): dif-
ferences throughout ripening are shown α, β, γ: bars with differ- tion and texture. Fat is, together with proteins, an impor-
ent letters within the same ripening time are statistically different tant component in meat sausages. The small fat globules
(P < 0.05): differences among product type are shown produced as a result of chopping are stabilized by a mem-
brane coating mainly formed by salt-soluble myofibrillar
manufacturing revealed the existence of three to four dif- proteins [37]. In the present study, no significant differ-
ferent populations of water (Fig. 3): two minor compo- ences (P < 0.05) in T2 distributions were found by compar-
nents, with relaxation times around 1–5 ms (T2b1) and ison of the two levels of fat, suggesting that the amount of
5–10 ms (T2b2), respectively, a major component charac- fat added did not affect water compartmentalization. This
terized by relaxation times in the region around 20–60 ms finding deviates from the results reported by Møller [6],
(T21) and finally a slower relaxing component (T22) with a since significant differences in relative areas and relaxa-
relaxation time around 100–400 ms. It has been suggested tion times depending on the level of fat (10, 25 and 40 %)
that the fastest populations with relaxation times between were found. This discrepancy may be due to differences
1–10 ms represent water closely associated to macromol- in the processing of products in the two studies, since fine
ecules; T2b2, in particular, has been related to the addi- cut emulsion-type sausages and dry-fermented sausages
tion of salt to the meat batter [6, 8, 30]. T21 reflects water “Spanish type” present differences in their final structure
located within highly organized protein structures, and T22 and characteristics. Other authors [38] have also described
represents mobile, extramyofibrillar water [31–34]. Water in meat batters a shift of T22 component to longer relaxa-
mobility and distribution were strongly affected by the tion times with the addition of fat. Nevertheless, it could
ripening time, and a shift toward shorter relaxation times be concluded that further investigations exploring the
was observed due to the reduction of the pore size of the effect of fat amount on T2 decay should be conducted in
protein matrix induced by the drying process. As previ- order to elucidate the importance of fat affecting the gela-
ously described by García-García [8], the T22 population tion properties of cured and dry-fermented products.

13
205
 IV. Resultados

460 Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466

◂Fig. 3  Distributed T2 relaxation times obtained on dry-fermented

sausages, batch CH2, at days 0, 2, 4, 7, 11 and 14 after production.
Each curve is a mean of six measurements

Textural properties

The most important changes on instrumental texture

parameters were detected on day 4 for all products, when
the initial meat mixture has been converted into a semisolid
product with a higher consistency due to the loss of solu-
bility of sarcoplasmic and myofibrillar proteins [39], mak-
ing the effect of the drying process on instrumental texture
parameters noticeable. Nevertheless, it should be noted
that the mechanical behavior of samples from days 0 and
2 of production was difficult to measure given their nature
and the characteristics of the equipment, and the values of
the textural parameters for these samples were close to the
detection limits. As expected, hardness tended to increase
with time in all sausages. Similarly, chewiness (product
of hardness x cohesiveness x springiness) and gumminess
(product of hardness x cohesiveness) varied over time as
they are secondary textural characteristics. These textural
parameters reached the highest values at day 14 of ripening.
On the contrary, adhesiveness decreased with time, which
is consistent with the formation of a firmer meat matrix that
leads to a less sticky product. Springiness hardly changed
throughout ripening, instead remaining quite stable over
time. A slight increase in cohesiveness was also observed,
according to a higher consistency of the sausages matrix,
even though changes in cohesiveness during the stud-
ied stages were found to be nonsignificant (P < 0.05) for
S2 samples. This finding could be due to the fact that the
point that marks the decisive change in the texture of the
sausages is fermentation, where the pH declines and the
solubilized myofibrillar proteins start to aggregate to form
a gel [15]. From day 4 on, the ordered protein network is
already formed, and it does not experience additional dras-
tic changes throughout the following 10 days of ripening.
Even though the evolution of the texture profile for the two
types of products studied (CH and S) changed similarly,
the hardness and secondary texture parameters remained
higher for S samples throughout ripening, regardless of the
fat level. Consequently, at the end of production, the max-
imum values for hardness in day 14 were 50.4 N (CH1),
36.6 N (CH2), 81.4 N (S1) and 56.7 N (S2), respectively.
Contrary to observations for T2 relaxation data, tex-
tural properties were highly affected by the fat content,
since hardness was significantly (P < 0.05) higher in 20 %
fat products; the same being the case for gumminess and
chewiness, while adhesiveness was lower in CH1 and S1,
mainly notable at the end of ripening (Fig. 4).

13
206
 IV. Resultados
Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466 461

Cluster analysis

362.1 ± 14.1

296.7 ± 34.0

219.1 ± 20.5

153.2 ± 5.1
355.8 ± 6.1
Relaxation
Table 1  Mean values and standard deviation of relaxation time and relative area for T21 and T22 populations obtained on batches CH2 and S2 on days 0, 2, 4, 7, 11 and 14 after production

Multivariate cluster analysis is a useful tool to classify a set

time

b, α

d, α
a, α

a, α

c, α
T22

–
of individuals into homogeneous groups. Sausage samples

13.8 ± 1.1

13.8 ± 0.6
were associated in four different clusters, using the textural

9.4 ± 1.2

7.6 ± 0.7

9.4 ± 0.5
Relative

features as association criteria (Fig. 5). The effect of ripen-

area

b, β

b, β
a, α

c, α
a, β
T22

–
ing time is observed along Factor 1, while Factor 2 seems
Relaxation

39.3 ± 2.8
56.7 ± 0.9

44.9 ± 0.6

44.4 ± 0.8

33.5 ± 1.7

23.5 ± 1.2
to group samples according to the sausage type (CH and
S). The centroid method was the procedure used for com-
time

b, α

b, α

d, α
c, α
a, α

f, α
T21

puting the distance between two clusters. In this method,

96.1 ± 0.6

83.0 ± 1.1

82.7 ± 0.9

87.2 ± 1.2

88.7 ± 1.0

86.6 ± 0.7
the concept of an “average sausage” is used to represent
Relative

the cluster. The characteristics of a cluster are the centroid

area

d, α

d, α

b, α

b, α

c, α
a, α
T21
S2

or average values of the characteristic of the sausage com-

269.6 ± 13.8

226.4 ± 17.1

177.2 ± 32.0

132.2 ± 13.3
prising the cluster. The cluster is then assumed to consist
277.1 ± 6.5
Relaxation

of one average sausage whose characteristics are the cen-

time

troid. A clear discrimination between samples of different

b, β

d, β
c, α
a, β

a, β
T22

ripening times (days 0, 2, 4, 7, 11 and 14) was revealed,

17.7 ± 0.6

15.9 ± 1.3

11.8 ± 1.0

10.7 ± 0.9

13.5 ± 0.7

and the position of samples on the plot showed a clear trend

Relative

a, b, c, d, e, f: Values with different letters within a column are statistically different (P < 0.05). Effect of ripening time is shown

related to the progress of production. No significant dif-

area

b, α

d, α
a, α

e, α

c, α
T22

ferences (P < 0.05) were found when comparing between

Relaxation

37.3 ± 1.7
54.8 ± 0.8

41.3 ± 0.7

40.6 ± 0.5

29.9 ± 2.2

22.9 ± 1.5

product (CH and S samples); thus, the behavior of both

types of sausages was very similar throughout ripening.
time

d, α
b, β

e, α
a, α

c, β

f, α
T21

α, β: Values with different letters within a row are statistically different (P < 0.05). Effect of product type is shown

Each of the obtained clusters could be characterized taking

85.3 ± 1.2
95.5 ± 0.8

78.0 ± 0.6

81.1 ± 1.5

86.1 ± 1.3

82.8 ± 1.0

into account how different from the overall mean value that
Relative
CH2

the cluster mean was for each studied parameter (Table 2).

area

b, α
d, β

b, β
c, α
a, α

c, β
T21

Cluster 1 explains 33.3 % of the observed variability, and

302.8 ± 26.2
332.0 ± 24.3

189.5 ± 19.9

151.5 ± 15.2
359.9 ± 8.5

it includes 100 % of both CH and S samples of days 0 and

Relaxation

2 of production. Samples belonging to cluster 1 showed

time

b, α

d, α
a, α

c, α

e, α
T22

water content, aw, adhesiveness, T2b, T21, T22 and pH mean

–

values above the overall average, while the textural param-

14.0 ± 1.1

14.1 ± 0.7

8.9 ± 1.6

6.7 ± 0.4

8.6 ± 0.9
Relative

eters chewiness, gumminess, hardness, springiness and

area

b, β

b, β
a, β

c, β

cohesiveness mean values were below the overall average.

T22

a,α
–

Cluster 2 explains 37.5 % of the observed variability, and it

Relaxation

31.2 ± 2.5
43.6 ± 0.9

39.9 ± 1.0

25.0 ± 2.8
56.0 ± 0.9

43.7 ± 0.6

includes products from day 4 (100 %) and day 7 (91.7 %).

time

Springiness, cohesiveness and T22 mean cluster value were

d, α
b, α

e, α
c, α
a, α

f, α
T21

above the overall average, while water content and pH were

196.9 ± 20.2 89.4 ± 0.5
82.2 ± 0.8

87.4 ± 1.9

139.8 ± 12.8 86.9 ± 1.1
95.7 ± 0.4

82.4 ± 1.1

below the overall average. Cluster 3 (20.8 % of the variabil-

Relative
area

ity) includes products from day 11 (91.7 %). Gumminess,

b, α
d, α

d, α

c, α

c, α
a, α
T21
S1

cohesiveness, hardness and chewiness were above the aver-

276.3 ± 7.4

263.3 ± 9.9

224.5 ± 6.2
Relaxation

age; however, water content, aw, adhesiveness T21 and T22

were below the average. Cluster 4 (8.33 % of the variabil-
time

b, β

d, β
c, α
a, β

a, β
T22

ity) includes products from day 14 of production (50 %).

–

Samples showed chewiness, hardness, gumminess, cohe-

10.2 ± 1.1
18.7 ± 0.9

15.3 ± 2.4

11.0 ± 0.3

14.7 ± 1.4
Relative

siveness and springiness mean values above the average

area

b, α

b, α
c, α

c, α
a, α
T22

and water content, aw, T2b, T22, T21 mean values below the
–

overall average. The differences found between clusters are

Relaxation

33.0 ± 2.8
39.4 ± 1.1

37.6 ± 1.1

23.9 ± 1.3
54.8 ± 1.7

41.0 ± 0.5

consistent with the changes in the mobility and distribution

time

d, α
b, β

e, α
a, α

c, β

f, α
T21

of water during the drying process, and the sample classifi-

cation is governed by the progressive loss of water and the
85.0 ± 1.4
81.0 ± 1.4

85.4 ± 1.5

81.6 ± 1.8
95.2 ± 0.4

77.3 ± 0.7
Relative

consolidation of a firmer and more structured meat matrix.

CH1

area

b, α

b, β
c, α
a, α

c, β
e, β
T21

Moreover, the strong separation between clusters 1 and 2 is

probably highly influenced by the on-set of proteolysis dur-
(days)
Time

ing the first ripening days.

11

14
4

7
0

13
207
 IV. Resultados

462 Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466

Fig. 4  Textural profile evolution obtained on fermented sausages, ness (adimensional) (×10); gumminess (N); chewiness (Nm) Dif-
batches CH1, CH2, S1 and S2 on days 4, 7, 11 and 14 of produc- ferent symbol within the same line indicates significant differences
tion. Mean values of the following parameters were plotted: hardness (P < 0.05) throughout ripening time
(N); adhesiveness (Ns) × (−10); springiness (m) (×10); cohesive-

Relationship between T2 relaxation time, association between pH and T22. According to T2 distri-
physicochemical characteristics and textural properties butions, a pH decline is required for the presence of T22,
and when the pH reached its lowest value, T22 achieved its
The degree of association between T2 relaxation data maximum.
and physicochemical characteristics as well as the asso- Regarding the textural properties, hardness showed
ciation between T2 relaxation data and textural properties a strong negative correlation with T21 (r  =  −0.79,
was investigated using bivariate analysis Pearson prod- P < 0.0005) and T22 (r = −0.63, P < 0.0005), and an inter-
uct-moment correlation coefficient (PCC). The correla- mediate correlation with T2b (r  =  −0.40, P < 0.0005).
tion coefficient for each of the considered pairs is shown Gumminess and chewiness, as secondary characteristics
in Table 3. A strong correlation was found between the dependent on hardness, showed a similar degree of depend-
main T2 population, T21, and physicochemical parameters. ence with the T2 populations. Springiness showed a high
A high association degree is shown between T21 and aw degree of association with T21 (r  =  −0.56, P < 0.0005),
(r = 0.88, P < 0.0005) and T21 and water content (r = 0.94, a low degree of association with T22 (r  =  −0.18, non-
P < 0.0005). This high degree of association confirms that significant) and moderate degree of association with T2b
T21 represents a high percentage of the total water content (r  =  −0.32, P < 0.005). Cohesiveness was highly corre-
within the sample, contrary to T22 and, especially T2b which lated with T21 (r = −0.68, P < 0.0005) and moderately cor-
showed a moderate and low degree of association, respec- related with T22 (r = −0.35, P < 0.005) and T2b (r = −0.40,
tively, with these parameters. Regarding pH, a high degree P < 0.0005). On the other hand, adhesiveness showed a
of association (r = 0.68, P < 0.0005) was found with T21, strong positive correlation with T21 (r = 0.68, P < 0.0005)
since pH has a great influence on the water-holding capac- and T22 (r = 0.60, P < 0.0005) and low degree of associa-
ity of myofibrillar proteins [40]. T2b and T22 populations tion with T2b (r  = 0.28, P < 0.005). Intriguingly, signifi-
are less related to pH, but a striking finding is the negative cant associations were also found between water content

13
208
 IV. Resultados
Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466 463

Fig. 5  Plot of the clusters obtained on data acquired on fermented achieved according to the ripening time (0, 2, 4, 7, 11, 14 days). The
sausage samples using textural features as association parameters. direction of the arrow reflects the progress of ripening
The centroid of each cluster is represented. Sample separation was

and textural parameters. A negative correlation was found products revealed a similar development in T2 relaxation
between water content and hardness, springiness and cohe- behavior throughout ripening, and no significant differ-
siveness, while a positive correlation was found between ences between the two levels of fat included (20 and 40 %)
water content and adhesiveness. were detected.
A strong linear dependence was found between the main
component T21 and water content, T21 and aw, as well as
Conclusions between T21 and hardness, although the other two T2 water
populations, mainly T2b, showed a lower degree of associa-
Changes in water mobility and distribution during dry- tion with the physicochemical and textural parameters. No
fermented sausage production were detectable by means significant differences were found when comparing prod-
of LF-NMR. The drying process induced a shift toward uct types (CH and S), suggesting that the drying-induced
shorter T21 and T22 relaxation times related to the loss of changes was very similar throughout ripening for the two
water and the consolidation of a firmer meat matrix. Sig- types of sausages.
nificant changes were also detected in T2 relaxation popula- Overall, the study has demonstrated the potential of LF-
tions in the 1–10 ms region, since two different populations NMR relaxometry to elucidate associations between the
were found at the beginning of the drying process (T2b1 and biophysical state of intrinsic water and progression in tex-
T2b2), and only a single component (T2b) appeared from day tural properties of dry-fermented meat products. Implica-
4 on. The study on “chorizo” and “salchichón” (CH and S) tions of these findings involve that LF-NMR relaxometry

13
209
 IV. Resultados

464 Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466

Table 2  Cluster Characteristic variables Cluster mean Overall mean Cluster SD Overall SD Test value
characterization
CLUSTER 1 (33.33 %)
 Water content*** 67.543 56.329 5.280 9.459 10.02
 aw*** 0.957 0.928 0.004 0.027 9.24
 Adhesiveness*** −0.020 −0.390 0.000 0.351 8.90
 T21*** 49.027 39.132 6.731 9.969 8.41
 pH*** 5.364 5.145 0.321 0.245 7.57
 T22*** 305.279 245.047 38.316 74.362 4.42
 T2b*** 3.392 2.708 1.813 1.472 3.93
 Chewiness*** 0.000 0.016 0.000 0.018 −7.46
 Gumminess*** 5.000 15.658 0.000 11.301 −7.97
 Hardness*** 4.900 24.898 0.000 19.614 −8.62
 Springiness*** 0.000 0.001 0.000 0.001 −9.28
 Cohesiveness*** 0.450 0.553 0.000 0.083 −10.51
CLUSTER 2 (37.50 %)
 Springiness*** 0.001 0.001 0.001 0.001 6.10
 Cohesiveness*** 0.585 0.553 0.047 0.083 3.59
 T22* 266.004 245.047 71.202 74.362 2.79
 Water content*** 52.673 56.329 5.337 9.459 −3.58
 pH*** 5.007 5.145 0.033 0.245 −5.20
CLUSTER 3 (20.83 %)
 Gumminess*** 25.609 15.658 6.625 11.301 5.40
 Cohesiveness*** 0.624 0.553 0.035 0.083 5.26
 Hardness*** 40.747 24.898 9.876 19.614 4.96
 Chewiness** 0.025 0.016 0.008 0.018 2.97
 T22*** 197.310 245.047 41.860 74.362 −3.96
 Water content*** 49.602 56.329 2.989 9.459 −4.36
 T21*** 30.986 39.132 4.657 9.969 −4.91
 aw*** 0.901 0.928 0.005 0.027 −6.12
 Adhesiveness*** −0.900 −0.390 0.220 0.351 −8.92
CLUSTER 4 (8.33 %)
 Chewiness*** 0.064 0.016 0.010 0.018 9.29
 Hardness*** 65.886 24.898 15.853 19.614 7.53
 Gumminess*** 38.358 15.658 10.795 11.301 7.24
 Cohesiveness*** 0.643 0.553 0.039 0.083 3.92
 Springiness*** 0.002 0.001 0.000 0.001 3.68
 T2b* 1.742 2.708 0.325 1.472 −2.37
 Water content*** 44.746 56.329 1.119 9.459 −4.42
 aw*** 0.893 0.928 0.003 0.027 −4.66
 T22*** 145.642 245.047 15.206 74.362 −4.86
 T21*** 24.475 39.132 2.261 9.969 −5.30

Mean values and standard deviation for each cluster against overall values. The percentage of variability
explained by the cluster is also included
*** P < 0.0001; ** P < 0.001: * P < 0.01

13
210
 IV. Resultados
Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466 465

may be used as a tool to study how ingredients and process-

r near ± 1 reveal a stronger correlation between the considered parameters. T2b: one single measurement was considered in the 1–10 ms region. W. cont: water content; Hard: hardness; Adh:
−0.39***
−0.70***
−0.49***
−0.72***
−0.33***
−0.66***
0.96***
−0.64***
0.72***
0.86***
0.98***
Chew ing parameters affect the ripening process and final product
characteristics.

Acknowledgments  The present work received financial support from

−0.40***
−0.73***
−0.55***
−0.75***

−0.66***
0.99***
−0.63***
0.67***
0.85***

0.98***
project AGL2010-19158 funded by the Spanish Secretary of State of

−0.33**
Research, Development and Innovation within the Ministry of Econ-
Gum

omy and Competitiveness. HCB wishes to thank the Danish research

council FTP for financial support through the project ‘Advances in
food quality and nutrition research through implementation of metab-
−0.40***
−0.68***

−0.77***
−0.50***
−0.75***
0.86***
−0.67***
0.89***

0.85***
0.86***
olomics technologies (#274-09-0169)’.
−0.35**
Coh

Compliance with ethical standards 

Conflict of interest  The authors declare that they have no conflict of

interest.
−0.56***

−0.63***
−0.56***
−0.68***
0.67***
−0.72***

0.90***
0.67***
0.72***
−0.32**

−0.18*

Compliance with ethics requirements  This article does not contain

Spr

any studies with human or animal subjects.

0.69***
0.60***
0.75***
0.44***
0.73***
−0.65***

−0.72***
−0.66***
−0.63***
−0.64***
0.28**

References
Adh

1. Fernández M, Ordóñez JA, Bruna JM, Herrans B, de la Hoz L

0.96 ***

(2000) Acelerated ripening of dry fermented sausages. Food Sci

−0.40***
−0.79***
−0.63***
−0.81***
−0.37***
−0.76***

−0.65***
0.67***
0.86***
0.97***

Technol 11:201–209
Table 3  Pearson correlation coefficients matrix for T2 relaxation times, physicochemical and textural properties
Hard

2. Caplice E, Fitzgerald JF (1999) Food fermentations: role of

microorganisms in food production and preservation. Int J Food
Microbiol 50:131–149
3. Campbell-Platt G, Cook PE (1995) Fermented meats, 1st edn.
0.36***
0.94***
0.87***
0.90***
0.74***

−0.76***
0.73***
−0.68***
−0.75***
−0.69***
−0.66***

Chapman & Hall, London

W. cont

4. Ordóñez JA, Hierro EM, Bruna JM, de la Hoz L (1999) Changes

in the components of dry-fermented sausages during ripening.
Crit Revs Food Sci Nutr 39:329–367
5. Bertram HC, Andersen HJ (2004) Applications of NMR in meat
adhesiveness; Spr: springiness; Coh: cohesiveness; Gum: gumminess; Chew: chewiness
0.68***

0.47***

0.74***
−0.37***
0.44***
−0.56***
−0.50***

−0.33***

science. Annu Rep NMR Spectro 53:158–202

0.26**

−0.33**
−0.21*

6. Møller S, Gunvig A, Bertram HC (2010) Effect of starter culture

and fermentation temperature on water mobility and distribution in
pH

fermented sausages and correlation to microbial safety studied by

nuclear magnetic resonance relaxometry. Meat Sci 86:462–467
7. Miklos R, Mora-Gallego H, Larsena FH, Serra X, Cheong Z,
0.34***
0.88***
0.83***

0.47***
0.90***
−0.81***
0.75***
−0.63***
−0.77***
−0.75***
−0.72***

Xub X, Arnau J, Lametscha R (2014) Influence of lipid type on

water and fat mobility in fermented sausage studied by low-field
aw

NMR. Meat Sci 96:617–622

8. García-García AB, Larsen LB, Cambero MI, Cruz-Díaz K, Ber-
tram HC (2015) Proteolysis process in fermented sausage model
0.94***

0.83***

0.87***
−0.63***
0.60***

−0.55***
−0.49***
−0.35**

systems as studied by NMR relaxometry. J Agric Food Chem

0.22*

−0.21*

−0.18

63:3039–3045
T22

9. Foegeding EA, Brown J, Drake MA, Daubert CR (2003) Review.

Sensory and mechanical aspects of cheese texture. Int Dairy J
*** P < 0.0005; ** P < 0.005: * P < 0.05

13:585–591
0.37***

0.94***
0.88***
0.68***
0.94***
−0.79***
0.68***
−0.56***
−0.68***
−0.73***
−0.69***

10. Gimeno O, Ansorena D, Astiasarán I, Bello J (2000) Characteri-

zation of chorizo de Pamplona: instrumental measurements of
colour and texture. Food Chem 69:195–200
T21

11. Mendoza E, García ML, Casas C, Selgas MD (2001) Inulin

as fat substitute in low fat, dry fermented sausages. Meat Sci
57:387–393
0.37***

0.34***

0.36***
−0.40***

−0.39***
−0.39***
−0.39***
0.26**

0.28**
−0.32**
0.22*

12. Muguerza E, Gimeno O, Ansorena D, Bloukas JG, Astiasaran I

(2001) Effect of replacing pork back fat with pre-emulsified olive
T2b

oil on lipid fraction and sensory quality of Chorizo de Pamplona—

a traditional Spanish fermented sausage. Meat Sci 59:251–258
13. De la Hoz L, D’Arrigo M, Cambero MI, Ordóñez JA (2004)
W. cont

Development of an n-3 fatty acid and a-tocopherol enriched dry

Chew
Hard

Gum
Adh

Coh
Spr
T2b
T21
T22

fermented sausage. Meat Sci 67:485–495

pH
aw

13
211
 IV. Resultados

466 Eur Food Res Technol (2017) 243:455–466

14. Houben JH, Van’t Hooft BJ (2005) Variations in product-related 28. Gücükoglu A, Küplülü O (2010) The effect of different starter
parameters during standardized manufacture of a semi-dry fer- cultures and ripening temperatures on formation of biogenic
mented sausage. Meat Sci 69:283–287 amine in Turkish fermented sausages. Eur Food Res Technol
15. González-Fernández C, Santos EM, Rovira J, Jaime I (2006) The 230:875–884
effect of sugar concentration and starter culture on instrumental 29. Mokhtar S, Mostafa G, Taha R, Eldeep GSS (2012) Effect of
and sensory textural properties of chorizo-Spanish dry-cured different starter cultures on the biogenic amines production as a
sausage. Meat Sci 74:467–475 critical control point in fresh fermented sausages. Eur Food Res
16. Herrero AM, Ordóñez JA, Romero de Avila MD, Herranz B, de la Technol 235:527–535
Hoz L, Cambero MI (2007) Breaking strength of dry fermented 30. Andersen RH, Andersen HJ, Bertram HC (2007) Curing-induced
sausages and their correlation with texture profile analysis (TPA) water mobility and distribution within intra- and extra-miofi-
and physico-chemical characteristics. Meat Sci 77:331–338 brilar spaces of three pork qualities. Int J Food Sci Technol
17. Lorenzo J, Franco D (2012) Fat effect on physico-chemical,
42:1059–1066
microbial and textural changes through the manufactured of dry- 31. Bertram HC, Dønstrup S, Karlsson AH, Andersen HJ (2001)
cured foal sausage lipolysis, proteolysis and sensory properties. Continuous distribution analysis of T2 relaxation in meat- an
Meat Sci 92:704–714 approach in the determination of water holding capacity. Meat
18. AOAC, Association of Official Agricultural Chemists
Sci 60:279–285
(2006) Official Methods of Analysis of the Association of 32. Bertram HC, Karlsson AH, Rasmussen M, Pedersen OD,

Official Agricultural Chemists, 18th edn, 1st rev. AOAC Int, Andersen HJ (2001) Origin of multiexponential T2 relaxation in
Gaithersburg muscle myowater. J Agric Food Chem 49:3092–3100
19. Carr HY, Purcell EM (1954) Effects of diffusion on free prece- 33. Bertram HC, Purslow PP, Andersen HJ (2002) Relationship

sion in nuclear magnetic resonance experimets. Am J Physiol between meat structure, water mobility, and distribution: a low-
94:630–638 field nuclear magnetic resonance study. J Agric Food Chem
20. Meiboom S, Gill D (1958) Modified spin-echo method for meas- 50:824–829
uring nuclear times. Rev Sci Instrum 29:688–691 34. Venturi L, Rocculi P, Cavani C, Placucci G, Rosa MD, Cre-
21. Butler JP, Reeds JA, Dawson SV (1981) Estimating solutions of monini MA (2007) Water absorption of freeze-dried meat at dif-
1st kind integral equations with nonnegative constraints and opti- ferent water activities: A multianalytical approach using sorption
mal smoothing. SIAM J Num Anal 18:381–397 isotherm, differential scanning calorimetry, and nuclear magnetic
22. Bourne MC (1978) Texture profile analysis. Food Technol
resonance. J Agric Food Chem 55:10572–10578
32:62–66 35. Li Y, Jia W, Zhang CH, Li X, Wang LC, Zhang DQ, Mu GF
23. Ordóñez JA, de la Hoz L (2001) Embutidos crudos curados. (2014) Fluctuated low temperature combined with high-humidity
Tipos. Fenómenos madurativos. Alteraciones. In: Martin & thawing to reduce physicochemical quality deterioration of beef.
Macías, Enciclopedia de la carne y los productos cárnicos, vol II, Food Bioprocess Tech 7:3370–3380
Caceres, pp 1063–1090 36. Stangierski J, Baranowska HM (2015) The influence of heating
24. Herrero AM, de la Hoz L, Ordóñez JA, Herranz B, Romero de and cooling process on the water binding in transglutaminase-
Ávila MD, Cambero MI (2008) Tensile properties of cooked modified chicken protein preparation, assessed using low-field
meat sausages and their correlation with texture profile analysis NMR. Food Bioprocess Technol 8:2359–2367
(TPA) parameters and physico-chemical characteristics. Meat 37. Gordon A, Barbut S (1992) Mechanisms of meat batter stabiliza-
Sci 80:690–696 tion: a review. Crit Rev Food Sci Nutr 32:299–332
25. Ledesma E, Laca A, Rendueles M, Díaz M (2016) Texture, color 38. Shao J, Deng YM, Song L, Datur A, Jia N, Liu DY (2016) Inves-
and optical characteristics of a meat product depending on smol- tigation of the effects of protein hydration states on the mobility
ing time and casing type. Food Sci Technol 65:164–172 water and fat in meat batters by LF-NMR technique. Food Sci
26. Casquete R, Benito MJ, Martín A, Ruíz-Moyano S, Hernández Technol 66:1–6
A, Córdoba MG (2011) Effect of autochthonous starter cultures 39. Roca M, Incze K (1990) Fermented sausages. Food Rev Int
in the production of “salchichón”, a traditional Iberian dry- 6:91–118
fermented sausage, with different ripening processes. Food Sci 40. Huff-Lonergan E, Lonergan S (2005) Mechanisms of water-

Technol 44:1562–1571 holding capacity of meat: the role of postmortem biochemical
27. Marco A, Navarro JL, Folres M (2008) The sensory quality of and structural changes. Meat Sci 71:194–204
dry fermented sausages as affected by fermentation stage and
curing agents. Eur Food Res Technol 226:449–458

13
212
 IV. Resultados

IV.2. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN DE

DERIVADOS CÁRNICOS Y EXUDADOS CÁRNICOS MEDIANTE
ESPECTROSCOPÍA DE 1H RMN DE ALTA RESOLUCIÓN

La segunda parte de esta Tesis Doctoral recoge tres

trabajos (5 a 7), en los que se describen los resultados obtenidos tras
el desarrollo del segundo objetivo.

213
 IV. Resultados

Trabajo 5
Monitorización del proceso de elaboración de jamón curado mediante espectroscopía de
RMN de alta resolución

Enviado a Journal of Food Composition and Analysis

215
 IV. Resultados

Para estudiar el proceso de maduración de jamón desde un punto de vista

bioquímico, en el Trabajo 5 se recurrió a la espectroscopía de RMN en combinación
con la sonda HRMAS (high resolution magic angle spinning) para analizar las
transformaciones metabólicas ocurridas durante la elaboración del producto. Los
resultados de este trabajo corresponden a los primeros experimentos realizados para
monitorizar el proceso de maduración completo a partir de muestras íntegras, sin
preparación o derivatización previa. A medida que avanzó el curado, se observaron
diferencias significativas en los aminoácidos libres y carbohidratos, relacionadas con
los procesos proteolíticos y glucolíticos típicos de la maduración. La degradación de
nucleótidos también fue observada y las señales de ácidos grasos libres mostraron un
aumento de la intensidad, favorecido por la lipolisis. Los aminoácidos y los ácidos
grasos libres, como era de esperar, fueron las señales en las que las transformaciones
se hicieron más visibles debido a la concentración de solutos que tiene lugar debido a
la deshidratación del producto. Los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, trirosina y
triptófano), en particular, experimentaron una evolución notable. Se realizó, además,
una cuantificación de metabolitos, mediante la integración de las señales aromáticas
de los espectros para conocer la intensidad de los metabolitos identificados y
establecer proporciones para obtener un modelo útil para supervisar el proceso de
maduración.
Por consiguiente, la innovadora metodología 1H RMN HRMAS ha resultado ser una
herramienta con gran potencial para supervisar la fabricación de jamón serrano.

217
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

Use of 1H HR-MAS NMR Methodology for Monitoring Dry

Cured Ham Manufacturing

A.B. García-Garcíaa; D. Castejónb; P. Villab; R. Escuderoa; M.I. Camberoa*

a) Sección Departamental de Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad

Complutense de Madrid. 28040 Madrid. Spain.

b) Centro de Asistencia a la Investigación de Resonancia Magnética Nuclear y de Espín

Electrónico. Universidad Complutense de Madrid. 28040. Madrid. Spain.

* Corresponding author. Tel: +34 913943745; Fax: +34 913943743; E-mail: [email protected]

Abstract: Three different muscles (biceps femoris, semimembranosus and semitendinosus) of

hams at different manufacturing times were analyzed by means of 1H NMR spectroscopy. Results
reported in this paper correspond to the first 1H NMR HRMAS experiments achieved in order to
monitor the entire ripening process. The PCA analysis of the NMR dataset allowed to classify
samples according to the ripening time. As curing time progressed, significant differences were
detected in free amino acids and carbohydrates regions related to characteristic proteolysis and
glycolysis processes. Degradation of nucleotides was also observed and an increase in the
intensity of fatty acids signals was shown according to the intense dehydration suffered for
muscular tissue during ripening. Aromatic amino acids, in particular, experienced a notable
evolution. Integration of their aromatic signals of the spectra was performed, in order to know the
intensity of the detected compounds and to set ratios to obtain a useful model to monitor the
ripening process. Consequently, the innovative 1H NMR HRMAS methodology has proven to be
a suitable tool in order to monitor cured ham manufacturing.

Key words: dry-cured ham, ripening, metabolite profile, 1H NMR HRMAS

219
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

1. Introduction
Dry-cured ham is a traditional meat product highly appreciated by consumers. Its production
is a time-consuming process which varies between different ham types. There are many factors
affecting the final characteristics of dry-cured ham. The quality of the raw material and the process
conditions mainly influence the rate and the extent of biochemical reactions which are in turn
responsible for the formation of specific flavor and texture (Ventanas, 2001). Given the
technological and economic importance of this product, the development of suitable analytical
tools is essential to know the quality of the meat at its best, both structurally and compositionally.
Understanding what changes and transformations happen in each stage of production would
allow to evaluate ham features and quality under different processing conditions. To realize this
work on so valuable samples it is necessary to use non-destructive technologies. High resolution
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy is a well-established technique that, when
applied to complex mixtures, allows the simultaneous detection of a large number of their low
molecular weight components (Bales et al., 1984; Wishart, 2008). Hence, NMR spectroscopy is
gaining wide acceptance in food analysis due to its potential for giving very exhaustive
representations of the chemical composition of the food matrix without extensive manipulation
(Manina et al., 2011; Cheng et al., 2013; Mazzei et al., 2017). For this goal, the NMR spectroscopy
modality known as High Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) has proved to be very useful
for reliably assessing the metabolic profile (metabolome) of intact muscle samples (Ritota et al.,
2012; Mazzei et al., 2017; Sundekilde et al., 2017) Thus, this modality has been applied to
investigate factors that somehow affect meat properties, such as the geographical origin of cattle
(Jung et al., 2010), type of breeds (Ritota et al., 2015), the characterization of metabolic changes
during beef meat ageing (Castejón et al., 2015) or meat derivatives composition (García-García
et al., 2018). Nevertheless, in comparison with other foods, meat has hardly been investigated by
NMR and, still less, the examination of a process as complex as the production of dry cured ham.
The study of ham implies the evaluation of a very heterogeneous product constituted by
several muscles with very different features, such as composition, and therefore it is possible that
they are affected in different ways for the diverse processes that the ham suffers during the
manufacturing process (Arnau et al., 1995). Therefore, the aim of this work was: i) to classify
samples according to the ripening time and ii) to assess the potential of the innovative 1H NMR
HRMAS methodology to rapidly identify the presence of the main metabolites of three different
intact pork leg muscles and iii) to monitor their evolution throughout ripening, from a very small
sample amount with minimum preparation.

2. Material and methods

2.1. Samples

Raw hams obtained from white-breed pigs, Landrace x Landrace White female animals of 10-
11 kg live weight, were purchased from the manufacturing plant Incarlopsa (Tarancón, Cuenca)
at the following stages: raw (3 days after slaughter), during salting (after salt addition, in the first

220
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.2.5, 1-13

2-3 days of processing), post-salting (hams taken during the resting period after salt removal),
half-cured (half-cured hams taken after 6 and 8 months of processing) and cured (fully maturated
hams after 12 and 20 months of processing). Salting and post-salting were managed at low
temperature (0-4 oC); two different processing conditions were established during maturing: a
cold period (13-15 oC, RH: 75-85%) and a warm period (22-26 oC, RH: 60-75%) and ageing was
performed at room temperature (12-17 oC, RH: 60-80), in conformity with Santos et al., 2008.
Once the bones, skin and fat had been removed, muscles corresponding to different anatomical
locations (biceps femoris, semimembranosus and semitendinosus) were taken from the lean
tissue. The visible fat and connective tissue were totally removed from the muscles pieces.
Manufacturing process and sample collection was carried out according to García-García et al.,
2018. The effect of ripening time on the metabolite profile was studied by analyzing one sample
of each muscle at each processing time, representing a total of 21 separate analyses.

2.2. NMR experiments

About 8–10 mg of lean tissue of each of the muscles studied was examined using HR-MAS at
4 ◦C to minimize tissue deterioration and avoid degradation of thermolabile compounds. 1H NMR
HRMAS spectroscopy was carried out at 500.13 MHz using a Bruker AMX500 spectrometer
11.7T.
The samples were placed into a 50 μl zirconium oxide rotor with a cylindrical insert, together
with 20 μl of 0.1mM solution of TSP in D2O. D2O (99.9%) and sodium (3-trimethylsilyl)-2,2,3,3-
tetradeuteriopropionate (TSP) were purchased from SDS and Sigma–Aldrich, respectively.
Experimental runs were performed at the lowest possible spinning rates to minimize structural or
chemical changes during analysis.
Standard solvent suppressed spectra (NOESYPRESAT) were acquired into 16 k data points,
averaged over 256 acquisitions. The total acquisition time was ∼14 min, with a relaxation delay
of 2 s, a mixing time of 150 ms and a spectral width of 8333 Hz. All spectra were processed using
MestReNova 9.0.1 (Mestrelab Research SL, Santiago de Compostela, Spain) and TopSpin 2.1
(Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany). Prior to Fourier transformation, the FIDs were multiplied
by an exponential weight function corresponding to a line broadening of 0.3 Hz. Spectra were
phased, baseline-corrected and referenced to the TSP at δ = 0 ppm. For some of the analyzed
samples, 1D CPMG experiments were also performed to attenuate contribution from high
molecular weight metabolites. Two-dimensional (2D) homonuclear 1H-1H (COSY and TOCSY)
NMR experiments were also measured on the pork samples, and the resulting 2D spectra were
used to assist in assigning signals from 1H HR-MAS NMR spectra. Between consecutive 2D
spectra, a control 1H NMR spectrum was always measured to ensure that the sample remains
uncharged.

2.3. Spectral assignment

221
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

Assignment of resonances in the 1H NMR spectra from beef exudates was based on both spin
connectivity information obtained from 2D experiments and the use, as guidelines, of both data
reported in the literature (Castejón et al., 2015), and data obtained from HMDB database (Human
Metabolite Data Base http://www.hmdb.ca/ ).

2.4. Statistical analysis

Multivariate statistical analysis was conducted on NMR data. A total of 21 ham spectra were
subjected to PCA using AMIX software (version 3.9.11, Bruker BioSpin). Prior to the multivariate
analyses, each individual spectrum was data reduced over the 9.0–0.5 ppm range by dividing it
into spectral regions (buckets) of 0.04 ppm each. Some regions (i.e. unsuppressed water region
and fat signals) were excluded from the bucketing. In order to account for the variable
concentration of each reconstituted sample, its bucket intensities were normalized to the total
spectral intensity over the whole spectrum. The number of principal components (PCs) employed
for PCA was established as the minimum required to explain 95% of the total variance.
Significance analysis of variables (buckets) was based on the procedure of Goodpaster et al.,
2010) using a confidence level of 95%.

3. Results and discussion

3.1. Samples classification by PCA

Unsupervised multivariate analysis by PCA is a useful tool to classify a set of individuals into
homogeneous groups. The whole data set of bucket-reduced 1H NMR spectra for 21 ham
samples was analyzed. Fig. 1A shows the scatter plot of PC1 vs PC2. PC1 and PC2 explain
62.32% and 10.77% of the total variance, respectively. A clear discrimination between samples
of different ripening time was revealed, suggesting that the total spectra contain useful information
for sample classification and to monitor and predict the maturation degree of the samples
analyzed. Fig. 1B shows the main buckets responsible of the variation between groups (red color).

222
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

Figure 1. A.PC1 vs PC2. Each point represents one single sample. The direction of the arrow indicates the progress of
ripening. B. Significant buckets involved in the discrimination between groups.

The principal metabolites contained within these buckets are shown in Table 1. These are
mainly amino acids, followed by carbohydrates and nucleosides. Although it would be expected
that the fats also had an important role in this ordering, it is necessary to remark that to perform
this multivariate analysis the intense fat signals were disregarded.

Table 1. Spectral region (ppm) showing significant differences during processing (P < 0.05). The table includes the
assignment of the main metabolites present in each region and their variation during ripening.

Spectral Variation
region p-value Metabolite during
(ppm) ripening
0.94 5.14E-05 Isoleucine (Ile) ↑
0.98 4.87E-08 Leucine (Leu) ↑
1.02 2.36E-08 Isoleucine (Ile) ↑
1.06 4.90E-08 Valine (Val) ↑
1.50 1.29E-06 -Alanine (-Ala) ↑
1.70 2.02E-06 Arginine (Arg) ↑
1.74 5.84E-10 Leucine (Leu) ↑
1.90 5.92E-08 Lysine (Lys) ↑
1.94 1.20E-07 Acetic acid (AA) ↑
2.34 4.36E-07 γ-Aminobutiric Acid (GABA) ↑
2.38 2.62E-08 Glutamate (Glu) ↑

223
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

2.46 2.04E-05 Glutamine (Gln) ↑

2.66 9.24E-07 Citric acid (CA) --
2.70 3.67E-07 Anserine (Ans) ↑
2.98 2.26E-08 Glutathione (GSH) --
γ-Aminobutiric Acid (GABA)
3.02 1.69E-07 --
Creatine/Phosphocreatine (Cr/PCr)
3.10 1.67E-07 Carnosine (Car) --
3.14 2.97E-05 Phenylalanine (Phe) ↑
3.18 2.05E-06 Choline (Cho) ↑
3.26 4.40E-07 Anserine (Ans) ↑
3.34 2.75E-05 Proline (Pro) ↑
3.46 2.07E-06 Carnitine (Cart) / -Glucose (β-Glc) ↓
3.50 1.01E-06 β-Glucose (β-Glc) ↓
3.54 7.73E-06 -Glucose (-Glc) ↓
3.58 7.71E-08 Glycerol ↑
3.62 6.58E-06 Phosphocholine (Pcho) ↑
3.66 8.79E-07 Glycerol ↑
3.78 4.00E-09 -Alanine (-Ala) ↑
3.94 1.26E-07 Creatine/Phosphocreatine (Cr/PCr) --
3.98 6.41E-06 -Glucose (-Glc) ↓
4.02 3.27E-05 Creatinine (Crn) / Choline (Cho) --
4.14 4.22E-06 Lactic Acid (LA) --
4.18 2.60E-05 Phosphocholine (Pcho) --
4.42 3.12E-06 Inosine (Ino) ↑
4.50 9.80E-08 Inosine 5´-phosphate (IMP) --
4.54 1.22E-05 Anserine (Ans) ↑
4.58 1.38E-05 Glutathione (GSH) ↑
4.66 9.28E-06 β-Glucose (β-Glc) ↓
Inosine 5´-phosphate (IMP) /
4.78 7.77E-08 ↑
Inosine (Ino)
6.10 1.75E-10 Inosine (Ino) ↑
6.82 6.10E-07 Tyramine (Tyrm) ↑
6.90 9.73E-06 Tyrosine (Tyr) ↑
7.10 1.50E-05 Tyramine (Tyrm) ↑
7.18 1.74E-06 Tyrosine (Tyr) / Tryptophan (Trp) ↑
Carnosine (Car) / Anserine (Ans) /
7.26 1.30E-06 ↑
Tryptophan (Trp)
7.30 3.95E-05 Trp ↑
7.34 2.15E-05 Phenylalanine (Phe) ↑
7.38 5.33E-07 Phenylalanine (Phe) ↑
7.42 3.53E-07 Phenylalanine (Phe) ↑
7.58 1.44E-05 Nicotinic Acid (NA) ↑
8.22 4.81E-07 Hypoxanthine (Hx) ↑
8.26 6.42E-07 Inosine 5´-phosphate (IMP) ↑
8.38 2.59E-08 Inosine (Ino) ↑
8.94 1.25E-06 Nicotinic Acid (NA) --

224
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

3.2. Metabolite evolution during the manufacturing process

Although the three most important muscle of ham were studied, in this paper, the main
emphasis is on semimembranosus muscle (SM). Figure 2 shows the spectra obtained for SM at
different ripening times and the assignation of the main signals detected.
Biceps femoris (BF) is an internal muscle covered with a thick layer of subcutaneous fat on
one side; this slows down salt uptake, and salt content slowly increases throughout the process.
The slow increase in salt contributes to higher proteolytic activity in this muscle, which influences
the final textural properties (Virgili et al., 1998; Ruíz-Ramírez et al., 2006; Zhao et al., 2008). On
the other hand, SM muscle is situated close to the surface without fat covering. It results in a fast
salt uptake during the salting stage (Parreno et al., 1994). As expected (Flores et al., 1997; Toldrá,
2006), the semitendinosus (ST) muscle presented the higher fat content. Since the extent of
biochemical changes during the manufacturing process is different for these three muscles, the
same trend was found during ripening and SM was used as the marker muscle for the
monitorization of the metabolic changes during the manufacturing process.
As dry-curing time progressed, significant differences in several regions of the spectra were
observed, including the increase in the intensity of fatty acids signals, the degradation of
nucleotides, the degradation of carbohydrates, and the increase of the amino acids (mainly
aromatics) related to proteolysis process.

225
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

Figure 2. Assignation of the main signals in 1H NMR spectra obtained for SM muscle at different processing times. A: raw ham; B: post-salted, C: half-cured, D: cured.

226
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

3.2.1. Proteolysis during dry cured ham manufacturing

All amino acids exhibited increased concentration during the long process. Though the
enzymatic activity decreases, in the final stages of the process (Ruíz-Ramírez et al., 2006; Zhao
et al., 2005; Harkouss et al., 2015), the increase in the signals corresponding to free amino acids
was remarkable, such us the aromatic amino acids (Figure 3), due to the concentration of
compounds related to dehydration.
Dipeptides such as carnosine (ß-ala-his) and anserine (ß-ala-1-methyl-his) also increased
during the process. Nishimura and Kato, (1988) reported that both dipeptides had notable buffer
action at pH > 6.0 and thereby were important in the improvement of taste since the taste effects
of ionic components of foods are strongly dependent on pH (Fuke and Konosu, 1991).
Concentrations of free amino acids found in long-processed hams were similar to those reported
by Aristoy and Toldrá (1991) for a Spanish dry-cured ham.
Previous studies have indicated that these amino acids play an important role in the aroma
and flavour development of hams. They can be used as markers of the dry-curing process.

Figure 3. Changes in aromatic signals of 1H NMR HRMAS-spectra of Semimbranosus muscle during ripening. Trp:
tryptophan; Phe: Phenilalanine; Tyr: Tyrosine; Car: Carnosine; Ans: Anserine

3.2.2. Lipolysis during dry cured ham manufacturing

A quantitative variation in lipid compounds was detected and an increase in the release of free
fatty acids during fermentation stage and at the end of ripening, as shown in Figure 4. This finding
was the result of the lypolisis of intramuscular lipids that contribute to the formation of the final
dry-cured ham flavor. The increase in the relative intensities of the fatty acid signals was revealed
as ripening proceeded, a phenomenon favored by the concentration of solutes by progressive

227
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Compositiosn and Analysis, IV.2.5, 1-13

dehydration of samples, since the lipolytic activity remain constant during processing (Virgili et
al., 1998).

Figure 4. Changes in fatty acids signals of 1H NMR HRMAS-spectra of Semimbranosus muscle during ripening. FA:
fatty acids.

3.3. Ripening time predictive model

The aromatic signals are highly related to the final characteristics of the product and they are
quite representative of the process, since they show up during the entire process and they are
not overlapped with closer signals. For these reasons, integration of these signals of the spectra
(Figure 3) was performed, in order to know the intensity of the detected compounds and to set
ratios to obtain a useful model to monitor the ripening process (Table 2).
The resultant equation was:

Ripening period = 0,013 + 37,25*Trp2 - 0,823*Tyr2 - 2,073*Phe*Trp + 0,305*Phe*Tyr + 1,394*Tyr -

6,861*Trp (R2=0,98)

where ripening period values < 1 correspond to raw ham; values within the range ≥ 1 and < 2
correspond to post salted ham; values within the interval ≥ 2 and < 3 correspond to half-cured
ham and values ≥ 3 correspond to cured ham].

Table 2. Regression model for ripening time using aromatic amino acids signal intensity. (Phe: phenilalanine; Trp:
tryptophan; Tyr: tyrosine)

228
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

Dependent Independent
R2 SE Coefficient F-ratio P-value
variable variable

Ripening time 98.544 0.209 Constant 0.013

Trp*Trp 37.25 29.12 0.0030

Tyr*Tyr -0.823 32.70 0.0023

Phe*Trp -2.073 28.02 0.0032

Phe*Tyr 0.305 28.76 0.0030

Tyr 1.394 24.55 0.0043

Trp -6.861 11.44 0.0196

4. Conclusions
As far as we know, this is the first 1H NMR study of dry-cured ham manufacturing, where the
complete metabolite profile of intact BF, SM and ST muscles and their evolution throughout
ripening was reported. The applied 1H NMR HRMAS methodology has been found to be a rapid
and effective technique to monitor the changes associated with the drying-curing processes. The
non-invasive analysis (just a needle of biopsy is required) proposed along the whole ripening
process allows to create predictive models that facilitate the monitoring and control of processing,
as well as to evaluate the possible effects that occur on the metabolic profile as a consequence
of modifications in the ripening conditions (temperature, humidity, time...). Consequently, 1H NMR
HRMAS spectral profiles of dry-cured products can be very useful in evaluating the metabolome
variations as a function of different muscle processing conditions.

Acknowledgements
The authors are grateful for the financial support of UCM-BSCH Group 920176GR35/10A,
project AGL2010‐19158 funded by the Spanish Secretary of State of Research, Development and
Innovation within the Ministry of Economy and Competitiveness and the cooperative collaboration
with the members of the CAI of NMR and RSE (UCM). A.B.G.G. was awarded a grant (BES-
2011-047485) from the same institution.

229
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analyisis, IV.2.5, 1-13

References

Virgili, R., Schivazappa, C., Parolari, G., Bordini, C. S., Degni, M. (1998). Proteases in fresh pork muscle
and their influence on bitter taste formation in dry-cured ham. Journal of Food Biochemistry, 22, 53-63.

Ruiz-Ramirez, J., Arnau, J., Serra, X., Gou, P. (2006). Effect of pH24, NaCl content and proteolysis index
on the relationship between water content and texture parameters in biceps femoris and
semimembranosus muscles in dry-cured ham. Meat Scenc,i 72, 185-194.

Zhao GM, Tian W, Liu YX, Zhou GH, Xu XL, Li MY (2008) Proteolysis in biceps femoris during Jinhua ham
processing. Meat Science, 79, 39–44.

Harkouss, R., Astruc, T., Lebert, A., Gatellier, P., Loison, O., Safa, H., Portanguen, S., Parafita, E., Mirade,
P. S. (2015). Quantitative study of the relationships among proteolysis, lipid oxidation, structure and
texture throughout the dry-cured ham process. Food Chemistry, 166, 522-530.

Ventanas, J. (2001). Factores del proceso que determinan la calidad del jamón. En: Jamón Ibérico y
Serrano. Fundamentos de la elaboración y de la calidad. Ed. Paraninfo, Madrid: pp. 63-103

Wishart, D.S. (2008). Quantitative metabolomics using NMR. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 27, 228-
237.

Bales, J.R., Higham, D.P., Howe, I., Nicholson, J K., Sadler, P.J. (1984). Use of high-resolution proton
nuclear magnetic resonance spectroscopy for rapid multi-component analysis of urine. Clinical
chemistry, 30, 426-432.

Mannina, L., Sobolev, A.P., Viel, S. (2012). Liquid state 1H high field NMR in food analysis. Progress in
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, 66, 1-39.

Mazzei, P., Piccolo, A., Valentini, M., & Webb, G.A. (2017). Intact Food Analysis by Means of HRMAS-NMR
Spectroscopy. In: Web G. (eds.) Modern Magnetic Resonance, 1-16.

Arnau, J.; Guerrero, L.; Casademont, G.; Gou, P. (1995). Physical and chemicalchanges in different zones
of normal and pse dry-cured ham during processing. Food Chemistry, 52, 63-9.

Cheng, J.H., Dai, Q., Sun, D.W., Zeng, X.A., Liu, D., Pu, H.B. (2013). Applications of non-destructive
spectroscopic techniques for fish quality and safety evaluation and inspection. Trends in food science &
technology, 34, 18-31.

Ritota, M., Casciani, L., Failla, S., Valentini, M. (2012). HRMAS-NMR spectroscopy and multivariate analysis
meat characterisation. Meat science, 92, 754-761.

Sundekilde, U.K., Rasmussen, M.K., Young, J.F., Bertram, H.C. (2017). High resolution magic angle
spinning NMR spectroscopy reveals that pectoralis muscle dystrophy in chicken is associated with
reduced muscle content of anserine and carnosine. Food chemistry, 217, 151-154.

Jung, Y., Lee, J., Kwon, J., Lee, K.S., Ryu, D.H., Huang, G.S. (2010). Discrimination of the Geographical
Origin of Beef by 1H NMR-Based Metabolomics. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 10458–
10466.

Ritota, M., Casciani, L., Failla, S., Valentini, M. (2015). HRMAS-NMR spectroscopy and multivariate analysis
meat characterization. Meat Science, 92, 754–761.

Castejón, D., García-Segura, J.M., Escudero, R., Herrera, A., Cambero, M.I. (2015). Metabolomics of meat
exudate: Its potential to evaluate beef meat conservation and aging. Analytical Chemical Acta, 901,1 –
11.

García-García, A.B., Lamichhane, S., Castejón, D., Cambero, M.I., Bertram, H.C. (2018). 1H HR-MAS NMR-
based metabolomics analysis for dry-fermented sausage characterization Food Chemistry, 240, 514-
523.

García-García, A.B., Fernández-Valle, M.E., Castejón, D., Escudero, R., Cambero, M.I. (2018). Use of MRI
as a predictive tool for physicochemical and rheological features during cured ham manufacturing. Meat
Science (under revision).

Santos, C., Hoz, L., Cambero, M.I., Cabeza, C., & Ordóñez, J.A. (2008). Enrichment of dry-cured ham with
-linolenic acid and -tocopherol by the use of linseed oil and -tocopheryl acetate in pig diets. Meat

230
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Journal of Food Composition and Analysis, IV.2.5, 1-13

Science, 80, 668-674.

Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., & Kennedy, M. A. (2010). Statistical significance analysis of
nuclear magnetic resonance-based metabonomics data. Analytical Biochemistry, 401, 134–143.

231
 IV. Resultados

Trabajo 6
Identificación de los principales metabolitos presentes en embutidos crudos curados y
evolución de los mismos durante el proceso de maduración

Publicado en Food Chemistry, 240 (2018), 514-523

233
 IV. Resultados

Los productos madurados experimentan importantes transformaciones durante su

elaboración que no solamente afectan a sus características estructurales, sino también
a los aspectos relacionados con su bioquímica y composición. Los fenómenos
proteolíticos y lipolíticos, entre otros, modifican notablemente durante el proceso las
características de la fracción proteica y lipídica original, respectivamente, y tienen
importantes consecuencias sobre las características del producto final, estando
implicados en el desarrollo del aroma y sabor típicos de los embutidos madurados.
Con el fin de monitorizar los cambios bioquímicos acaecidos durante la
maduración, y de esta forma, contar con una visión global de los cambios madurativos,
en el Trabajo 6 se llevó a cabo el estudio del perfil metabólico de embutidos tipo
salchichón mediante la espectroscopía 1H RMN HRMAS. Aunque esta metodología ha
visto incrementado su empleo en el análisis de alimentos en los últimos años, este es
el primer estudio realizado para elucidar el perfil metabólico en muestras intactas de
embutido. Se identificaron un gran número de metabolitos, tanto originales de la
carne como de adición, y fue posible estudiar su variación cuantitativa durante las
etapas de fermentación y maduración. El análisis metabolómico de las muestras
analizadas permitió diferenciar los procesos de fermentación y maduración e hizo
posible la clasificación de las muestras en función del tiempo de maduración a través
del Análisis de Componentes Principales (PCA).
De este estudio se concluye que la espectroscopía 1H RMN HRMAS es una
herramienta rápida y eficaz para monitorizar los cambios bioquímicos asociados a la
fermentación y a la maduración de productos curados.

235
 IV. Resultados
Food Chemistry 240 (2018) 514–523

Contents lists available at ScienceDirect

Food Chemistry
journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchem

1
H HR-MAS NMR-based metabolomics analysis for dry-fermented sausage MARK
characterization
Ana Belén García-Garcíaa, Santosh Lamichhanec, David Castejónb, Mª Isabel Camberoa,
⁎
Hanne Christine Bertramc,
a
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spain
b
CAI de Resonancia Magnética Nuclear y Espín Electrónico, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spain
c
Department of Food Science, Aarhus University, Research Centre Aarslev, Kirstinebjergvej 10, DK-5792 Årslev, Denmark

A R T I C L E I N F O A B S T R A C T

Keywords: Proton high-resolution magic angle spinning (1H HR-MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in
Dry-fermented sausages combination with principal component analysis (PCA) was employed to characterize dry-fermented sausages
Fermentation salchichón type throughout the manufacturing process. 1H HR-MAS NMR metabolite profiling was achieved from
Ripening a small sample of intact sausage after 0, 2, 4, 7, 11 and 14 days of drying. Intriguingly, the obtained results
1
H HR-MAS NMR spectroscopy
enabled the identification of the three main stages in the traditional production of salchichón. Formulation,
Meat metabolites
Culinary meat
fermentation and drying-ripening periods showed distinct and characteristic metabolomic profiles.
Compositional changes related to microbial activity, as well as proteolytic and lipolytic phenomena, decisive
steps in such a ripening process, could be monitored through the NMR spectra. This study shows the potential of
1
H HR-MAS as a rapid method for probing metabolomic profiles and compositional changes during sausages
processing.

1. Introduction From a production point of view, the satisfaction of consumers must

be ensured by offering high quality products, including both organo-
Drying represents one of the oldest forms of meat preservation. leptic and nutritional value. In this regard, an elucidation of the me-
Within the category of cured meat products, salchichón is one of the tabolite profile of the product is essential. Metabolomics seeks to
most popular dry sausage type produced and consumed in Spain. The identify and quantify the complete set of metabolites in a cell or tissue
main distinguishing feature of this group of meat products is that they type, and to do so as quickly as possible and without bias (Weckwerth,
rely on microbial fermentation to achieve their final properties. 2003). To achieve this objective, NMR spectroscopy is a quantitative
Production occurs by stimulating the growth of the desired fermenta- nondestructive, noninvasive, nonequilibrium perturbing technique that
tion microbiota, while the growth of spoilage bacteria is suppressed, provides detailed information on molecular structures, based on atom-
mainly due to the pH decline in the product and the controlled decrease centered nuclear interactions and properties. It allows the detection of a
of moisture, related to water activity (aw) reduction (Fernández, wide range of structurally diverse metabolites simultaneously, pro-
Ordóñez, Bruna, Herranz, & de la Hoz, 2000). In naturally produced viding a metabolic 'snapshot' at a particular time point (Beckonert et al.,
dry-fermented sausages without starter cultures, the typical microbiota 2007). Generally, NMR spectroscopy has been used in the elucidation of
(lactic acid bacteria (LAB) and Micrococcaceae) highly contributes to the chemical compounds in solution, but in recent years its application
obtain the desired taste, appearance and texture of fermented sausages in the field of food, together with Metabolomics, has opened new per-
(Ordóñez, Hierro, Bruna, & de la Hoz, 1999). However, the final prop- spectives, allowing changing and increasing the targets in the study of
erties of the product depend not only upon the products of carbohy- food samples (Laghi, Picone, & Capozzi, 2014).
drate fermentation but are also strongly influenced by biochemical and Newly, NMR analysis has been employed to obtain metabolic pro-
physical changes occurring during the drying process with the con- files of meat samples and to investigate different factors affecting meat
sequence of more concentrated flavour components and firmer sausage properties including the geographical origin of beef (Jung et al., 2010),
texture (Fernández-López, Sendra, Sayas-Barberá, Navarro, & Pérez- the muscle type according to bull breed (Ritota, Casciani,
Álvarez, 2008). Failla, & Valentini, 2015), the effects of different irradiation doses on

⁎
Corresponding author.
E-mail address: [email protected] (H.C. Bertram).

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.07.150
Received 5 April 2017; Received in revised form 24 July 2017; Accepted 27 July 2017
Available online 29 July 2017
0308-8146/ © 2017 Elsevier Ltd. All rights reserved.

237
 IV. Resultados
A.B. García-García et al. Food Chemistry 240 (2018) 514–523

the beef metabolome (Zanardi et al., 2015), the wooden breast ab- sausage units for each ripening time were analyzed. Samples of lean
normality in chicken (Sundekilde, Rasmussen, Young, & Bertram, 2017) meat were obtained from the inner part of the salchichón units. A D2O
and the evaluation of beef exudates as suitable matrix to study beef solution (15 μL) containing trimethylsilyl 3-propionic acid sodium salt
ageing (Castejón, García-Segura, Escudero, Herrera, & Cambero, 2015). (TSP, 0.1 mM) was added to the 30 μL disposable Kel-F HR-MAS inserts
However, few NMR spectroscopic studies focused on the examination of (Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany) together with the meat tissue
fermented sausages have been conducted. Siciliano et al., 2013 de- sample (10 ± 2 mg). TSP was used as internal chemical shift reference
termined the variations in the fatty acid composition based on analyses (0.00 ppm). The insert was placed into a 4 mm zirconium rotor. Proton
of lipid extracts and Mati, Staruch, & Soral, 2015 studied the quantita- NMR spectra were recorded on a Bruker Avance 600 spectrometer,
tive changes in carnosine and free amino acids in the aqueous fraction operating at a 1H frequency of 600.13 MHz, equipped with a HR-MAS
during ripening. Consequently, studies on the application of NMR- probe (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Germany). A water-suppressed
based metabolomics for the detection of compounds in dry-fermented Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spin echo sequence [90°-(t-180°-
meat are still limited and no detailed investigations on the complete t)n–acquisition] (Mannina, Sobolev, & Viel, 2012) was used to eliminate
profiling of intact sausages have been reported. Therefore, the aim of signals from lipids and macromolecules with an effective echo time of
this study was to investigate the potential of a 1H HR-MAS methodology 300 ms. This effective echo time was previously optimized in our la-
for an explorative and untargeted elucidation of changes in the meta- boratory (Lamichhane et al., 2015). Proton spectra were acquired at
bolites of dry fermented sausages salchichón type during a traditional 4 °C with a spin rate of 5 kHz. Two hundred and fifty-six scans over a
manufacturing process and to explore the ability of this technique to spectral region of 10 kHz were collected into 32k data points with a
monitor and predict the early days of ripening. relaxation delay of 5 s. The free induction decay (FIDs) obtained were
multiplied by an exponential weight function corresponding to a line
2. Materials and methods broadening of 0.3 Hz before Fourier transformation. The spectra were
phased, baseline-corrected and referenced to TSP using the Bruker
2.1. Dry fermented sausages manufacture Topspin software (version 2.1).

Traditional dry fermented sausages salchichón type were produced

using a basis of pork (Longissimus lumborum) and 20% of fat (w/w). The 2.4. Statistical analysis
following non-meat ingredients were also added to this basis to get the
final features of the product: sodium chloride (2.5% w/w), lactose One-way ANOVA was performed, using Statgraphics, version 5.1.,
(1.0% w/w), dextrose (0.8% w/w), dextrine (1.8% w/w), sodium glu- to determine the effects of ripening time on physicochemical para-
tamate (0.25% w/w), sodium ascorbate (0.046% w/w), NO2 (0.0065% meters. Bartlett’s test was used to examine the null hypothesis that the
w/w), NO3 (0.0085% w/w) and black pepper (0.14% w/w). In order to standard deviations of data were the same. Duncan’s test for multiple
study the spontaneous fermentation process, no starter cultures were mean comparisons procedure was used to determine which means are
added to the meat batter. A fine chopping of meat and fat was carried significantly different from others (at 95% of confidence level). The
out at cooled temperature, then the remaining ingredients were added analyses were conducted across six different ripening times and data
and the final mixture was refrigerated for 24 h to facilitate interactions are presented as mean values and their standard deviation. A simple
between its components. Fifty mm collagen casings were stuffed with regression model was also obtained to predict pH values from carnosine
400–500 g emulsion, which resulted in sausages with a length of 20 cm. chemical shift data.
The units were fermented and dried for a period of 14 days, under Multivariate statistical analysis was conducted on NMR data. A total
controlled conditions of temperature, relative humidity and air flow. of 18 salchichón spectra were subjected to PCA using AMIX software
During the first 24 h sausages were kept at 22 °C and relative humidity (version 3.9.11, Bruker BioSpin). Prior to the multivariate analyses,
of 95%. Within 48 h, storage conditions were reduced gradually to 89% each individual spectrum was data reduced over the 9.03–0.76 ppm
and 17 °C. Hereafter, units were stored at 12 °C for the rest of the range by dividing it into spectral regions (buckets) of variable width.
manufacturing time. Air flow was established in 1 m/s. Eighteen in- These variable widths were chosen to account for the chemical shift
dependent salchichón units were manufactured in total and sampling variations due to working with non-buffered samples. Regions with
was carried out at different ripening times: 0 (24 h after batter meat spectral artifacts (i.e. unsuppressed water region) were excluded from
preparation and just before stuffing into casings), 2, 4, 7, 11 and the bucketing. Therefore, a total of 161 buckets were defined and the
14 days. Three different units of each ripening time were collected for integral of each bucket was calculated. The variable buckets used for
the analysis. the multivariate analysis, including their midpoint and their width are
provided in Supplementary material, Table S1. In order to account for
2.2. Physicochemical analyses the variable concentration of each reconstituted sample, its bucket in-
tensities were normalized to the total spectral intensity over the whole
In order to monitor the process and ensure the proper ripening spectrum. For the unsupervised PCA analysis a 161 × 18 matrix was
development and behavior of the manufactured products, conventional constructed, its rows representing the different salchichón samples
physicochemical analyses were performed. Water activity (aw) mea- (cases) and its columns the integrated buckets (variables). These col-
surements were carried out at 25 °C using a Decagon CX1 hygrometer umns were scaled to unit variance prior to PCA calculations, resulting
(Decagon Devices Inc., Pullman, WA, USA). The dry matter (DM) con- in all the buckets becoming equally important in the final analysis; in
tent of the samples was determined by drying the sample at 110 °C to short, case clustering, if evidenced, should be explained by differences
constant weight and the results were expressed as a percentage (AOAC, in the metabolite profile of the cases rather than in their metabolite
2006). The pH was determined in a homogenate of the sample with absolute levels. The number of principal components (PCs) employed
distilled water (1:10) (w/v), using a Crison Digit-501 pH meter (Crison for PCA was established as the minimum required to explain 95% of the
Instruments LTD, Barcelona, Spain). Physicochemical parameters were total variance. Significance analysis of variables (buckets) was based on
determined in triplicate. The obtained results are provided in the procedure of Goodpaster, Romick-Rosendale, & Kennedy, 2010
Supplementary material, Fig. S1. using a confidence level of 95%.

2.3. 1H HR-MAS NMR measurements

Three representative sections originating from three different

238 515
 IV. Resultados
A.B. García-García et al. Food Chemistry 240 (2018) 514–523

Fig. 1. Representative 1H NMR spectra of salchichón sau-

sages acquired on days 0 (A), 2 (B) and 14 (C) of production.
The aromatic region between 6.00 and 9.00 ppm was ex-
panded for better visibility. Assignments for the numbered
resonances are given in Table 1.

3. Results and discussion the databases: HMDB (Human Metabolite Data Base http://www.hmdb.
ca/) and Chenomx (NMR Suite version 7.6, Edmonton, Canada). The
3.1. 1H HR-MAS NMR spectra assignment of the main signals present in the 1H HR-MAS spectra
(Fig. 1) is reported in Table 1. Several metabolites were identified:
A comparison of representative one-dimensional 1H HR-MAS NMR amino acids, peptides and analogues; carbohydrates; organic acids and
spectra of intact salchichón samples collected on days 0 (meat batter), 2 derivatives; nucleosides, nucleotides and analogues; fatty acids and
(fermentation stage) and 14 (final product) is shown in Fig. 1. These miscellaneous, including Acetone, Crn, Cho, PCho, GPCho or IMP (ab-
spectra represent the distinctive stages of the ripening process where breviations in Table 1).
the metabolic information shows the greatest differences throughout From the comparison of the three spectra it is evident that some
the process. The spectroscopic changes observed are correlated with the metabolites experienced a remarkable change during manufacturing.
three well-defined periods in the sausages manufacturing process, These major spectral differences will be discussed below in further
previously described by conventional analytical methods: formulation, detail.
fermentation and drying-ripening (Ordóñez et al., 1999). Table 1 includes the spectral information of each 1H NMR signal
Metabolite assignments were based on information previously (chemical shift and group, multiplicity and coupling constants) and also
published by our research group (Castejón et al., 2010, 2015) and on its intensity of variation during the fermentative and ripening/drying

516 239
 IV. Resultados
A.B. García-García et al. Food Chemistry 240 (2018) 514–523

Table 1
Chemical shift assignment of 1H NMR signals for the main components in salchichón samples with the peak notation shown in Fig. 1. The table includes the bucket numbers assigned in
Table S1, and the magnitude of their variation during fermentation and ripening/drying.

1
Peak Compound Group H(ppm) Mult.:J(Hz) Bucket Variation Variation
(fermentation) (ripening/drying)

1 Fatty Acid (FA) CH3 0.88 t 1 ↑↑ ↑

2 Isoleucine (Ile) δ-CH3 0.96 t 2 ↑↑ ↑↑↑
3 Leucine (Leu) δ′-CH3/δ′-CH3 0.97 m 2 ↑↑ ↑↑↑
4 Valine (Val) γ-CH3 1.00 d:7.05 3 ↑↑ ↑↑
5 Isoleucine (Ile) γ-CH3 1.02 d:7.05 4 ↑↑ ↑↑
6 Valine (Val) γ′-CH3 1.05 d:7.02 5 ↑↑↑ ↑↑
7 2,3-Butanediol CH3 1.15 d:6.12 7 ↑↑↑↑ ↑
8 2,3-Butanediol CH3′ 1.15 d:6.12 7 ↑↑↑↑ ↑
9 Ethanol (EtOH) CH3 1.19 t 8 ↑↑↑↑ ↓↓↓
10 Isoleucine (Ile) γ-CH2 1.27 m 9 ↑↑↑ ↔
11 Fatty Acid (FA) (CH2)n 1.30 – 9 ↑↑↑ ↔
12 Lactic Acid (LA) CH3 1.34 d:6.96 9 ↑↑↑ ↔
13 Lysine (Lys) γ-CH2 1.48 m 11 ↑↑ ↑↑
14 α-Alanine (α-Ala) β-CH3 1.48 d:7.25 11 ↑↑ ↑↑
15 Fatty Acid (FA) COOHeCH2CH2CH2 1.57 – 12 ↑↑ ↑↑
16 Leucine (Leu) β-CH2 1.69 – 13 ↑↑ ↑↑
17 Arginine (Arg) γ-CH2 1.70 – 13 ↑↑ ↑↑
18 Leucine (Leu) γ-CH 1.72 m 13 ↑↑ ↑↑
19 Lysine (Lys) δ-CH2 1.72 m 13 ↑↑ ↑↑
20 Leucine (Leu) β′-CH2 1.74 m 14 ↑↑ ↑↑
21 Lysine (Lys) β-CH2 1.91 – 17 ↑↑ ↑↑
22 γ-Aminobutyric Acid (GABA) β-CH2 1.91 m 17 ↑↑ ↑↑
23 Arginine (Arg) β-CH2 1.92 – 17 ↑↑ ↑↑
24 Acetic Acid (AA) CH3 1.94 s 18 ↑↑↑↑ ↓
25 Isoleucine (Ile) β-CH 2.00 m 19 ↑↑ ↑
26 Proline (Pro) γ-CH2 2.02 m 19 ↑↑ ↑
27 Fatty Acid (FA) CH2eCH2eCH]CH 2.04 – 19 ↑↑ ↑
28 Glutamate (Glu) β-CH2 2.06 m 20 ↑↑ ↑
29 Proline (Pro) β-CH2 2.07 m 20 ↑↑ ↑
30 Methionine (Met) SeCH3 2.10 s 21 ↑↑ ↑↑
31 O-Acetylcarnitine (OACart) CH3eCOO 2.15 – 22 ↑↑ ↑
32 Glutamine (Gln) β,β′-CH2 2.15 m 22 ↑↑ ↑
33 Methionine (Met) β-CH2 2.16 s 22 ↑↑ ↑
34 Glutathione (GSH) β,β′-CH2 2.16 m 22 ↑↑ ↑
35 Acetone CH3eCOO 2.22 s 23 ↑↑ ↑↑
36 Fatty Acid (FA) CH2eCH2eCOOR 2,27 23 ↑↑ ↑↑
37 Valine (Val) β-CH 2.29 m 24 ↑↑ ↑↑
38 γ-Aminobutyric Acid (GABA) α-CH2 2.31 – 24 ↑↑ ↑↑
39 3-Hydroxybutyric Acid (3-HBA) α-CH2 2.31 – 24 ↑↑ ↑↑
40 Glutamate (Glu) γ-CH2 2.38 m 25 ↑↑ ↑↑
41 Succinic Acid (SA) α,β-CH2 2.42 s 25 ↑↑ ↑↑
42 3-Hydroxybutyric Acid (3-HBA) α′-CH2 2.42 – 25 ↑↑ ↑↑
43 Carnitine (Cart) α-CH2 2.45 m 26 ↑ ↓
44 Glutamine (Gln) γ-CH2 2.46 t:6.89 26 ↑ ↓
45 O-Acetylcarnitine (OACart) α-CH2 2.51 m 27 ↑↑↑ ↓
46 Citric Acid (CA) α-CH2 2.54 d:15.44 27 ↑↑↑ ↓
47 β-Alanine (β-Ala) α-CH2 2.57 t 28 ↓ ↑↑
48 Methionine (Met) γ-CH2 2.63 – 29 ↑↑ ↑↑
49 Citric Acid (CA) α′-CH2 2.68 d:15.44 29 ↑↑ ↑↑
50 Carnosine (Car) NH2eCH2eCH2 2.69 m 29 ↑↑ ↑↑
51 Anserine (Ans) NH2eCH2eCH2 2.70 m 29 ↑↑ ↑↑
52 Fatty Acid (FA) CH]CHeCH2eCH] 2.79 – 32 ↑↑ ↑↑
53 Trimethylamine (TMA) NeCH3 2.91 s 34 ↑ ↑
54 Glutathione (GSH) CH2eSH 2.97 d 36 ↑↑ ↑↑
55 γ-Aminobutyric Acid (GABA) γ-CH2 3.02 t:7.66 37 ↑↑ ↓↓
56 Lysine (Lys) ε-CH2 3.02 m 37 ↑↑ ↓↓
57 Creatine (Cr) / Phosphocreatine (PCr) NeCH3 3.04 s 37 ↑↑ ↓↓
58 Creatinine (Crn) NeCH3 3.06 s 38 ↓ ↑
59 Anserine (Ans) β,β′-CH2 3.08 m 38 ↓ ↑
60 Carnosine (Car) β,β′-CH2 3.11 m 39 ↑↑ ↑↑
61 Phenylalanine (Phe) β,β′-CH2 3.13 m 40 ↑ ↑
62 β-Alanine (β-Ala) β-CH2 3.17 t 41 ↑ ↔
63 Choline (Cho) N(CH3)3 3.18 s 42 ↔ ↑↑
64 Phosphocholine (PCho) N(CH3)3 3.21 s 42 ↔ ↑↑
65 Arginine (Arg) δ-CH2 3.23 – 43 ↔ ↑
66 Carnosine (Car) NH2eCH2 3.23 m 43 ↔ ↑
67 Anserine (Ans) NH2eCH2 3.23 m 43 ↔ ↑
68 Carnitine (Cart) N(CH3)3 3.24 s 43 ↔ ↑
69 Carnosine (Car) β,β′-CH2 3.25 m 44 ↓↓ ↔
70 Anserine (Ans) β,β′-CH2 3.26 m 44 ↓↓ ↔
71 β-Glucose (β-Glc) CH-2 3.26 – 44 ↓↓ ↔
72 Betaine (Bet) N(CH3)3 3.27 s 45 ↔ ↔
(continued on next page)

240 517
 IV. Resultados
A.B. García-García et al. Food Chemistry 240 (2018) 514–523

Table 1 (continued)

1
Peak Compound Group H(ppm) Mult.:J(Hz) Bucket Variation Variation
(fermentation) (ripening/drying)

73 Taurine (Tau) NeCH2 3.27 t 45 ↔ ↔

74 Phenylalanine (Phe) β,β′-CH2 3.28 m 46 ↓ ↔
75 β-Glucose (β-Glc) CH-4 3.40 – 50 ↓↓↓ ↔
76 α-Glucose (α-Glc) CH-4 3.43 – 50 ↓↓↓ ↔
77 Taurine (Tau) NeCH2 3.43 t:6.74 50 ↓↓↓ ↔
78 β-Glucose (β-Glc) CH-5 3.45 – 51 ↓↓↓ ↔
79 Carnitine (Cart) γ,γ′-CH2 3.45 m 51 ↓↓↓ ↔
80 β-Galactose (β-Glc) CH-2 3.48 dd:9.89;7.86 52 ↓↓↓ ↔
81 β-Glucose (β-Glc) CH-3 3.49 – 53 ↓↓↓ ↔
82 Choline (Cho) CH-1 3.53 – 55 ↓ ↔
83 α-Glucose (α-Glc) CH-2 3.54 – 55 ↓ ↔
84 Glycerol CH-1 3.57 dd:11.7;6.6 57 ↓ ↑
85 Threonine (Thr) α-CH 3.61 – 59 ↑ ↑
86 Valine (Val) α-CH 3.62 d 60 ↔ ↑
87 O-Acetylcarnitine (OACart) γ-CH2 3.62 m 60 ↔ ↑
88 Phosphocholine (PCho) β-CH2 3.62 – 60 ↔ ↑
89 2,3-Butanediol CH 3.63 – 61 ↑↑ ↔
90 β-Galactose (β-Glc) CH-3 3.64 dd:9.91;3.50 61 ↑↑ ↔
91 Ethanol (EtOH) CH2 3.65 – 61 ↑↑ ↔
92 Glycerol CH2eOH 3.66 dd:11.7;4.30 62 ↑↑ ↓
93 Glycerophosphorylcholine (GPCho) β-CH2 3.67 – 62 ↑↑ ↓
94 Isoleucine (Ile) α-CH 3.68 d 63 ↓ ↓
95 2,3-Butanediol CH′ 3.73 – 66 ↓ ↑
96 α-Glucose (α-Glc) CH-3 3.72 – 65 ↓↓ ↔
97 β-Glucose (β-Glc) CH2-6,6′ 3.72 – 65 ↓↓ ↔
98 Leucine (Leu) α-CH 3.74 m 66 ↓ ↑
99 Arginine (Arg) α-CH 3.76 – 67 ↑ ↑
100 Lysine (Lys) α-CH 3.76 m 67 ↑ ↑
101 Glutamate (Glu) α-CH 3.77 m 67 ↑ ↑
102 α-Alanine (α-Ala) α-CH 3.78 – 68 ↓ ↔
103 Glutathione (GSH) CH2 3.78 s 68 ↓ ↔
104 α-Glucose (α-Glc) CH2-6,6′ 3.78 – 68 ↓ ↔
105 Glycerol CHeOH 3.79 m 69 ↓ ↔
106 Glutamine (Gln) α-CH 3.79 m 69 ↓ ↔
107 Glutathione (GSH) α-CH 3.79 m 69 ↓ ↔
108 α-Galactose (α-Glc) CH-2 3.82 m 71 ↓↓ ↓↓
109 α-Glucose (α-Glc) CH-5 3.84 – 72 ↓↓↓ ↓
110 α-Glucose (α-Glc) CH2-6,6′ 3.85 – 73 ↓↓↓ ↔
111 Inosine (Ino) CH-5 (Rib) 3.85 m 73 ↓↓↓ ↔
112 Methionine (Met) α-CH 3.87 – 75 ↔ ↑
113 Anserine (Ans) NeCH3 3.87 s 75 ↔ ↑
114 β-Glucose (β-Glc) CH2-6,6′ 3.90 – 77 ↓↓↓ ↔
115 O-Acetylcarnitine (OACart) γ-CH2 3.90 m 77 ↓↓↓ ↔
116 β-Galactose (β-Glc) CH-4 3.92 d:3.07 78 ↓ ↔
117 α-Mannose (α-Man) CH-2 3.94 – 79 ↑ ↓
118 Creatine (Cr) / Phosphocreatine (PCr) α-CH2 3.94 s 79 ↑ ↓
119 α-Galactose (α-Glc) CH-4 3.98 d:2.66 81 ↓↓ ↑
120 Phenylalanine (Phe) α-CH 3.99 m 82 ↓↓ ↑
121 β-Ribofuranose CH-2 4.00 m 82 ↓↓ ↑
122 3-Hydroxybutyric Acid (3-HBA) β−CH 4.00 – 82 ↓↓ ↑
123 Creatinine (Crn) CH2 4.01 s 82 ↓↓ ↑
124 Inosine 5′-phosphate (IMP) CH2 4.02 m 83 ↓ ↔
125 Choline (Cho) α-CH2 4.05 – 84 ↔ ↑
126 β-Galactose (β-Glc) CH-1 4.07 t:5.98 86 ↓↓ ↑↑
127 Lactic Acid (LA) α-CH 4.13 q:6.94 88 ↑ ↓
128 Phosphocholine (PCho) α-CH2 4.19 t 89 ↑↑ ↑↑↑
129 Threonine (Thr) β-CH 4.26 – 91 ↔ ↑↑
130 Inosine (Ino) CH-4 (Rib) 4.28 m 92 ↑ ↑↑
131 Glycerophosphorylcholine (GPCho) α-CH2 4.34 t 93 ↑ ↑↑
132 Inosine 5′-phosphate (IMP) CH-4 (Rib) 4.36 m 94 ↑ ↑↑
133 Inosine (Ino) CH-3 (Rib) 4.44 m 94 ↑ ↑↑
134 Inosine 5′-phosphate (IMP) CH-3 (Rib) 4.51 m 95 ↔ ↔
135 Carnosine (Car) CHeCOOH 4.52 m 95 ↔ ↔
136 Anserine (Ans) CHeCOOH 4.53 m 95 ↔ ↔
137 Histidine (His) CH 4.58 – 97 ↑↑ ↔
138 Glutathione (GSH) CH 4.58 m 97 ↑↑ ↔
139 Carnitine (Cart) β-CH 4.59 m 97 ↑↑ ↔
140 β-Glucose (β-Glc) (Lactose) CH-1 4.66 d:7.92 99 ↓↓↓ ↓
141 β-Glucose (β-Glc) CH-1 4.68 d:7.92 99 ↓↓↓ ↓
142 Inosine 5′-phosphate (IMP) CH-2 (Rib) 4.77 m 100 ↓↓ —
143 Inosine (Ino) CH-2 (Rib) 4.79 m 100 ↓↓ —
144 α-Glucose (α-Glc) (Dextrin) CH 5.08 – 103 ↓↓ ↓
145 α-Mannose (α-Man) CH-1 5.18 d:3.95 104 ↓↓ ↓↓
146 α-Glucose (α-Glc) CH-1 5.24 d:3.70 105 ↓↓ ↓↓
(continued on next page)

518 241
 IV. Resultados
A.B. García-García et al. Food Chemistry 240 (2018) 514–523

Table 1 (continued)

1
Peak Compound Group H(ppm) Mult.:J(Hz) Bucket Variation Variation
(fermentation) (ripening/drying)

147 α-Galactose (α-Glc) CH-1 5.26 d:3.66 105 ↓↓ ↓↓

148 β-Ribofuranose CH-1 5.26 d 105 ↓↓ ↓↓
149 Fatty Acid (FA) CH = CH 5.33 – 106 ↑↑ ↑
150 α-Glucose (α-Glc) (Dextrin) CH 5.44 – 107 ↓↓ ↔
151 Inosine (Ino) CH-1 (Rib) 6.11 d 111 ↓ —
152 Inosine 5′-phosphate (IMP) CH-1 (Rib) 6.16 d 112 ↓ —
153 Fumaric Acid (FuA) α,β CH = CH 6.53 s 115 ↓ ↑↑
154 Tyramine (Tyrm) CH-3,5 6.80 m 119 ↑↑ ↔
155 Tyrosine (Tyr) CH-3,5 6.89 d:8.16 120 ↑↑ ↑↑
156 Tyramine (Tyrm) CH-2,6 7.12 m 122 ↑↑↑ ↔
157 Tyrosine (Tyr) CH-2,6 7.19 d:8.16 124 ↑↑↑ ↑
158 Tryptophan (Trp) CH-6 7.19 – 124 ↑↑↑ ↑
159 Carnosine (Car) CH-5 (His) 7.27 s 126 ↑ ↔
160 Anserine (Ans) CH-5 (His) 7.27 s 126 ↑ ↔
161 Tryptophan (Trp) CH-5 7.27 – 126 ↑ ↔
162 Tryptophan (Trp) CH 7.30 s 127 ↑↑↑ ↑↑
163 Phenylalanine (Phe) CH-2,6 7.32 m 127 ↑↑↑ ↑↑
164 Phenylalanine (Phe) CH-4 7.38 m 129 ↑↑↑ ↑↑
165 Phenylalanine (Phe) CH-3,5 7.42 m 130 ↑↑↑ ↑↑
166 Tryptophan (Trp) CH-7 7.53 – 132 ↔ ↑↑
167 Tryptophan (Trp) CH-4 7.73 – 134 ↑ ↔
168 Hypoxanthine (Hx) CH-8 8.19 s 142 ↑↑↑↑ ↓
169 Hypoxanthine (Hx) CH-2 8.21 s 142 ↑↑↑↑ ↓
170 Inosine 5′-phosphate (IMP) CH-8 8.25 s 143 ↓ —
171 Inosine (Ino) CH-8 (Purin) 8.24 s 143 ↓ —
172 AMP CH-8 8.25 s 143 ↓ —
173 Formic Acid (FoA) CH 8.46 s 147 ↑↑ ↔
174 AMP CH-2 8.49 s 149 ↓ —
175 Inosine 5′-phosphate (IMP) CH-2 8.51 s 149 ↓ —
176 Carnosine (Car) CH-2 (His) 8.59 s 152 ↑↑↑ ↔
177 Anserine (Ans) CH-2 (His) 8.63 s 153 ↑↑↑ ↑↑

The intensity of the quantitative variation of each bucket is represented as follows:

↑: buckets which experienced ≤25% of variation within the indicated period.
↑↑: buckets which experienced 25–50% of variation within the indicated period.
↑↑↑: buckets which experienced 75–100% of variation within the indicated period.
↑↑↑↑: buckets which experienced ≥100% of variation within the indicated period.
—: Not detected compound.

processes. The magnitude of the variation experienced by metabolites from carbohydrates but this spectral region also contains resonances of
during fermentation and ripening (Table 1) is based on the integration other metabolites, such as amino acids, and quantitative changes in
of the buckets previously defined in Table S1. In some instances, one amino acids signals are subjected to the variation of sugars and their
single bucket region contained contribution from more than one me- real variation is not revealed. The same would apply to lipid signals, as
tabolite, and therefore quantifying the level of a singular metabolite in resonances from fatty acids may hide the real variation of adjacent
salchichón samples was a difficult task because of spectral crowding and metabolites. Spectral crowding together with the pronounced decrease
spectral overlap and great care is required with integration quantifi- in pH during the fermentation stage (Fig. S1) are responsible for the
cation approaches. Moreover, it must be noted that chemical shifts are mentioned inconsistencies. Conclusions concerning the increase or de-
highly sensitive to environmental changes. In particular, changes in pH crease of a singular metabolite have been made considering specific
between samples will alter the ionization of the functional groups and buckets in which the relevant metabolite is hardly overlapped or
thus affect the final chemical shift of some hydrogen nucleus (Dona slightly influenced by the presence of other metabolites.
et al., 2016). Indeed, AA and SA resonances (in Table 1, signal 24 and The main metabolites that define the spectral fingerprint of each
41, respectively) were visibly affected by the decrease in pH between manufacturing stage are described below.
day 0 and 2 (see Fig. S1), since an obvious shift from their usual spectral
positions was observed.
3.1.1. Formulation stage profile
Despite the CPMG pulse sequence employed to attenuate contribu-
The representative 1H NMR spectra of salchichón at 0 day (Fig.1A)
tion from high molecular weight metabolites, it was possible to detect
appeared to be very similar to that obtained recently for raw beef meat
signals corresponding to FAs, however, signals from triglycerides that
(Castejón et al., 2015), reflecting that at this stage the unripened matrix
have a very short relaxation time, were completely removed from the
1 made from lean meat, fat and non-meat ingredients to a great extent
H spectrum. The lipid profile obtained in this study was expected for
influences the overall metabolite composition. At first glance, the
fermented sausages (Siciliano et al., 2013). Table 1 contains data of the
spectra of salchichón were dominated by the intense resonances of lactic
characteristics signals of saturated fatty chains (signals 1, 11, 15, 36),
acid (LA) (signals 12, 127), creatine/phosphocreatine (Cr/PCr) (signals
monounsaturated fatty chains (signals 27, 149) and polyunsaturated
57, 118) and carnosine (Car) (signals 50, 60, 66, 69, 135, 159, 176).
chains (signal 52). Moreover, signals from phospholipids, PCho (signals
The signals of fatty acids are also noticeable in the spectra of day 0,
64, 88, 128) and GPCho (signals 93, 131), could be observed.
since fat is one of the main component of sausages, representing20% of
In table Table 1, it is possible to identify some lack of agreement
the total composition in the present study.
between the quantitative fluctuations experienced by the different
Some of the additives used in the elaboration of the salchichón are in
chemical shifts for the same metabolite. In this regard, it should be
concentration range to be observed in the 1H spectrum, especially in the
noted the spectral region 3.25 to 5.50 ppm contains several resonances
carbohydrate region. This spectral part showed remarkable differences

242 519
 IV. Resultados
A.B. García-García et al. Food Chemistry 240 (2018) 514–523

when comparing raw and processed meats (data not shown) due to the degradation of α-Glc and β-Glc as a result of microbial consumption is
fact that dextrose, dextrin and lactose were intentionally added to the revealed and significant differences between days 0 and 2 (P < 0.05)
minced meat in order to improve microorganism growth. Dextrose is were observed. On the contrary, the remaining metabolites, EtOH, LA,
the D-isomer for glucose (D-glucose) and glucose signals in the 1H NMR AA, FoA and 2,3-butanediol, (Fig. 2B–F) exhibited a different behavior
spectrum were considerably more prominent in sausage samples than in with a strongly and significant (P < 0.05) increase during the first
raw meat. On the other hand, dextrins which are polymers of D-glucose, 48 h, thus they are byproducts resulting from fermentative metabolism.
contain singular anomeric signals in the 1H NMR spectra (signals 144, There are also significant changes (P < 0.05) throughout the ripening
150) that are not present in raw meat (Castejón et al., 2015; Rodrigues process (2–14 days) in EtOH, LA and AA. These metabolites, clearly
et al., 2010). Finally, lactose was detectable through the resonances of linked to fermentation, decreased noticeably as ripening proceeded. On
their constituent monosaccharides, glucose and galactose. the other hand, Glc, FoA and 2,3-butanediol remained relatively stable
(non-significant differences) during the subsequent production days.
Regarding amino acids, Ile, Leu, Val, α-Ala Lys, Arg, Met and Glu
3.1.2. Fermentation stage profile were increased during the fermentation stage, as well as the aromatic
As shown in Fig.1B, the 1H NMR signals corresponding to amino amino acids signals intensities (Phe, Tyr, Trp and Tyrm). Moreover,
acids, carbohydrates and organic acids experienced notable changes notable changes in nucleotides during the first 48 h of the process were
compared with the previous stage and the most striking finding was the also detected, as well as changes in purine derivatives. While, AMP, IMP
pronounced increase in EtOH (signal 9), AA (signal 24) and 2,3-buta- and Ino underwent a significant decrease, Hx was notably increased at
nediol (signals 7, 8, 89). Variation in these metabolites can be explained this stage. These changes are consistent with the degradation process of
by the intense microbial activity during the first 48 h of the process as a ATP in muscle, according to which: ATP → ADP → AMP → IMP →
result of the LAB anaerobic fermentative metabolism and the microbial Ino → Hx → Xa → uric acid.
enzymatic activity related to the onset of proteolysis (Aymerich,
Martín, Garriga, & Hugas, 2003). Related to this microbial activity, a
pronounced decrease in the signals assigned to α-Glc, β-Glc, α-Gal and 3.1.3. Final product profile
β-Gal in day 2 was also observed, as carbohydrates serve as energy Fig.1C shows the representative 1H HR-MAS NMR spectra of a sal-
substrate for LAB. chichón type product after 14 days of ripening. The analysis of the me-
Fig. 2 shows the variation of the integral values (arbitrary units) of tabolite profile revealed a decrease or even an almost complete ex-
the mentioned metabolites during processing. In Fig. 2A, the tinction of these compounds linked to the fermentative metabolism in

Fig. 2. Changes in representative metabolites integral (mean values and standard deviation) during salchichón manufacturing (days 0, 2, 4, 7, 11, and 14). A: α-Glc; β-Glc. B:EtOH. C: LA,
D: AA, E: FoA, F: 2,3-butanediol.

520 243
 IV. Resultados
A.B. García-García et al. Food Chemistry 240 (2018) 514–523

the previous stage, mainly carbohydrates. As previously described,

spectral signals of EtOH and AA were significantly reduced.
Nevertheless, the signs of proteolysis were more evident at this time
point reflected in the increase observed in the signals assigned to Ile,
Leu, Val, α-Ala, Glu, Gln, Met, Thr, Phe, Tyr and Trp. These free amino
acids will contribute prominently to the sensory characteristics of the
product, since they are highly correlated with flavor development in
cured products (Díaz, Fernández, García de Fernando, de la
Hoz, & Ordóñez, 1997).
The nucleoside degradation initiated during the fermentation stage
also continues during ripening/drying. Indeed, IMP (signals 142, 152,
170, 175), Ino (signals 143, 151, 171) and AMP (signals 172, 174) are
present in very low concentration and the integration/quantification of
these signals is almost impossible for being very close to the baseline
and noise level. Similar changes in purine derivatives have previously
been detected in salmon (Castejón et al., 2010) and beef samples
(Castejón et al., 2015).
A quantitative variation in lipid compounds was detected during the
process and a slight increase in the release of free FAs during fermen-
tation stage and at the end of ripening was revealed from the integra-
tion of the lipid signals detected throughout manufacturing. The re-
lative proportions of FAs signals compared to other metabolites from
the spectrum changed during maturation, and the increase in the re-
Fig. 3. Principal component analysis (PCA) of salchichón samples. Scores plot of PC1 vs
lative intensities of the FAs signals was revealed as ripening proceeded,
PC3 is shown. Each data point corresponds to one single sample. Separation was achieved
a phenomenon favored by the concentration of solutes by progressive according to the ripening time (0, 2, 4, 7, 11, 14 days). The two main stages of production
dehydration of samples. To illustrate this fact, FA:Cr/PCr ratio was are reflected: PC1 represents the initiation of fermentation and PC3 reflects the progress
calculated for day 0 (0.97), day 2 (1.40) and day 14 (7.02) To be able to of drying.
do that, the concentration of Cr/PCr was considered constant during the
ripening process. these histograms the quantitative variation of the bucket for each stage
In addition, by inspection of the spectral data, it was possible to regarding the total variation is represented and it allows to easily define
predict the sample pH value. The pH-dependent 1H chemical shift (δ) of metabolic spectral variations occurring during the manufacturing pro-
the aromatic histidine signals from Car allowed to develop a fitting cess described in this study. In addition, as a result of the foregoing, the
model. A statistically significant relationship (P < 0.05) between pH application of the NMR-based metabolomics allowed to identify the
and δ Car was observed and a simple regression model was obtained to compounds and the changes that the sausages salchichón type under-
predict the pH value from δ Car. The adjusted model equation was: went during the ripening process.
pH = 29.55–18.40 * Δδ Car (R2 = 89%), where Δδ Car is the chemical
shift difference between the two aromatic protons from Car, reference
chemical shifts located at 7.27 and 8.59 ppm, values referred to day 0 4. Conclusions
samples. The obtained correlation coefficient (−0.94) revealed a strong
relationship among the considered variables. This finding constitutes an To the best of our knowledge, this study is the first to report the
interesting approach to study changes in meat pH directly from the changes in the complete metabolic profile of intact dry-fermented
spectral information. sausages salchichón type during ripening by means of 1H HR-MAS NMR
spectroscopy. The study revealed that NMR is a powerful tool to ex-
3.2. Monitoring the ripening process by PCA amine intact sausages and to obtain complementary information, since
it allowed the identification and the quantitation of the main salchichón
The significant differences in metabolite concentrations provide the metabolites. The applied 1H HR-MAS NMR methodology has been
basis for a hypothesis on the underlying causes for the observed seg- found to be a rapid and effective technique to monitor the changes
regation of the groups. The possibility to monitor the different stages of associated with the fermentation and drying-curing processes. PCA of
production through the changes observed in the spectra was confirmed the 1H NMR spectra of salchichón allowed to monitor the fermentation
by applying an unsupervised multivariate analysis method, PCA. The process (PC1) and to classify the samples according to their ripening
whole data set of bucket-reduced 1H NMR spectra (columns) for 18 time (PC3). Consequently, 1H HR-MAS NMR spectral profiles of dry-
salchichón samples (rows) was analyzed. Fig. 3 shows the scatter plot of fermented products can be very useful in evaluating the metabolome
PC1 vs PC3. PC1 and PC3 explain 40.76% and 10.59% of the total variations as a function of different sausage processing conditions.
variance, respectively. A clear discrimination between samples of dif-
ferent ripening time was revealed. PC1 allowed the spectra to be se-
Acknowledgements
parated according to the fermentation stage, being possible to distin-
guish the onset of fermentation and the discrimination between raw
The authors are grateful for the financial support of project
and ripened samples, while PC3 classified the samples according to
AGL2010‐19158 funded by the Spanish Secretary of State of Research,
their ripening time. Moreover, this multivariate analysis suggests that
Development and Innovation within the Ministry of Economy and
the total spectra contain useful information for sample classification
Competitiveness.
and to monitor and predict the maturation degree of the sausages
analyzed.
In order to illustrate the changes during fermentation and ripening/ Appendix A. Supplementary data
drying considered above, Fig. 4 shows the representative profiling of
salchichón samples for fermentation stage (Fig.4A) and drying/ripening Supplementary data associated with this article can be found, in the
(Fig.4B) on the basis of the most characteristic buckets of each stage. In online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.07.150.

244 521
 IV. Resultados
A.B. García-García et al. Food Chemistry 240 (2018) 514–523

Fig. 4. Plot of the buckets which experienced notable changes A: during fermentation and B: during ripening/drying. The variation of the integral of each bucket (A: 0–2 days and B:
0–14 days) compared to the final value of the bucket of each stage is represented.

References artisanal low-acid sausages. Applied Environmental Microbiology, 69, 4583–4594.

Beckonert, O., Keun, H. C., Ebbels, T. M. D., Bundy, J., Holmes, E., Lindon, J. C., et al.
(2007). Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR
Association of Official Agricultural Chemists (2006). Official Methods of Analysis of the spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols, 2,
Association of Official Agricultural Chemists1st rev.(18th ed.). Gaithersburg, USA: 2692–2703.
AOAC Int. Castejón, D., García-Segura, J. M., Escudero, R., Herrera, A., & Cambero, M. I. (2015).
Aymerich, M. T., Martín, B., Garriga, M., & Hugas, M. (2003). Microbial quality and direct Metabolomics of meat exudate: Its potential to evaluate beef meat conservation and
PCR identification of lactic acid bacteria and nosnpathogenicStaphylococci from aging. Analytical Chemical Acta, 901, 1–11.

522 245
 IV. Resultados
A.B. García-García et al. Food Chemistry 240 (2018) 514–523

Castejón, D., Villa, P., Calvo, M. M., Santa-María, G., Herraiz, M., & Herrera, A. (2010). 9781782622741-00171 pp. 171–180.
1
H-HRMAS NMR study of smoked Atlantic salmon (Salmo salar). Magnetic Resonance Mannina, L., Sobolev, A. P., & Viel, S. (2012). Liquid state 1H high field NMR in food
in Chemistry, 48, 693–703. analysis. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, 66, 1–39.
Díaz, O., Fernández, M., García de Fernando, D. G., de la Hoz, L., & Ordóñez, J. A. (1997). Mati, M., Staruch, L., & Soral, M. (2015). Use of NMR spectroscopy in the analysis of
Proteolysis in dry fermented sausages: The effect of selected exogenous proteases. carnosine and free amino acids in fermented sausages during ripening. Chemical
Meat Science, 46, 115–128. Papers, 69, 1319–1324.
Dona, A. C., Kyriakides, M., Scott, F., Shephard, E. A., Varshavi, D., Veselkov, K., et al. Ordóñez, J. A., Hierro, E. M., Bruna, J. M., & de la Hoz, L. (1999). Changes in the
(2016). A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/ components of dry-fermented sausages during ripening. Critical Reviews in Food
metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal, 14, Science and Nutrition, 39, 329–367.
135–153. Ritota, M., Casciani, L., Failla, S., & Valentini, M. (2015). HRMAS-NMR spectroscopy and
Fernández, M., Ordóñez, J. A., Bruna, J. M., Herranz, B., & de la Hoz, L. (2000). multivariate analysis meat characterization. Meat Science, 92, 754–761.
Accelerated ripening of dry fermented sausages. Food Science and Technology, 11, Rodrigues, J. E. A., Erny, G. L., Barros, A. S., Esteves, V. I., Brandao, T., Ferreira, A. A.,
201–209. et al. (2010). Quantification of organic acids in beer by nuclear magnetic resonance
Fernández-López, J., Sendra, E., Sayas-Barberá, E., Navarro, C., & Pérez-Álvarez, J. A. (NMR)-based methods. Analytica Chimica Acta, 674, 166–175.
(2008). Physico-chemical and microbiological profiles of “salchichón” (Spanish dry- Siciliano, C., Belsito, E., De Marco, R., Di Gioia, M. L., Leggio, A., & Liguori, A. (2013).
fermented sausage) enriched with orange fiber. Meat Science, 80, 410–417. Quantitative determination of fatty acid chain composition in pork meat products by
Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., & Kennedy, M. A. (2010). Statistical sig- high resolution 1H NMR spectroscopy. Food Chemistry, 136 564-554.
nificance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data. Sundekilde, U. K., Rasmussen, M. K., Young, J. F., & Bertram, H. C. (2017). High re-
Analytical Biochemistry, 401, 134–143. solution magic angle spinning NMR spectroscopy reveals that pectoralis muscle
Jung, Y., Lee, J., Kwon, J., Lee, K. S., Ryu, D. H., & Huang, G. S. (2010). Discrimination of dystrophy in chicken is associated with reduced muscle content of anserine and
the Geographical Origin of Beef by 1H NMR-Based Metabolomics. Journal of carnosine. Food Chem. 217, 151–154. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.
Agricultural and Food Chemistry, 58, 10458–10466. 08.104.
Laghi, L., Picone, G., & Capozzi, F. (2014). Nuclear magnetic resonance for foodomics Weckwerth, W. (2003). Metabolomics in systems biology. Annual Review of Plant Biology,
beyond Food analysis. Trends in Analytical Chemistry, 59, 93–102. 54, 669–689.
Lamichhane, S., Yde, C. C., Mielby, L. H., Kidmose, U., Møller, J. R., Hammershøj, M., Zanardi, E., Caligiani, A., Palla, L., Mariani, M., Ghidini, S., Di Ciccio, P. A., et al. (2015).
et al. (2015). High-resolution magic angle spinning studies of semi-hard Danbo (30+) Metabolic profiling by 1H NMR of ground beef irradiated at different irradiation
cheese-impact of processing condition and relation to sensory perception. Magnetic re- doses. Meat Science, 103, 83–89.
sonance in food science. defining food by magnetic resonancehttp://dx.doi.org/10.1039/

246 523
 IV. Resultados

Trabajo 7
Valoración de los exudados de cerdo como matriz apta para la monitorización de la
conservación de la carne tratada con electrones acelerados
Enviado a Food Research International

247
 IV. Resultados

Los exudados cárnicos constituyen un subproducto de deshecho procedente de la

carne fresca de manera natural e inevitable. Son fáciles de obtener y apenas requieren
manipulación previa para su análisis. A pesar de no ser empleados para la nutrición
humana, contienen numerosas sustancias que también están presentes en la carne de
procedencia y, por tanto, su análisis podría ser interesante para obtener información
sobre diversos procesos y tratamientos.
En el Trabajo 7 se presenta por primera vez el perfil metabólico de los exudados de
cerdo obtenido mediante la metodología 1H RMN HRMAS, que permite obtener gran
cantidad de información, tanto cualitativa como cuantitativa de la muestra. Se plantea
la posibilidad de emplear los exudados de cerdo como matriz de análisis para
identificar los procesos y las trasformaciones habituales que tienen lugar durante el
almacenamiento de carne sometida a un proceso de conservación mediante la
aplicación de electrones acelerados. Tanto la dosis del tratamiento como el tiempo de
almacenamiento de las muestras tratadas tienen un efecto notable sobre los
metabolitos cárnicos que pueden ser percibidos a partir de los datos espectrales
obtenidos. Se identificaron numerosos metabolitos presentes en las muestras de
exudados. Además, la aplicación de herramientas quimiométricas al conjunto de datos
espectroscópicos puso de manifiesto cuáles fueron los metabolitos que
experimentaron variaciones significativas durante el almacenamiento de la carne. El
estudio metabolómico realizado hizo posible la clasificación de las muestras de carne
de acuerdo a su tiempo de almacenamiento a través del Análisis de Componentes
Principales (PCA).
En función de los resultados obtenidos es posible concluir que los perfiles de RMN
de los exudados de la carne de cerdo podrían utilizarse para la monitorización de la
conservación y almacenamiento de la carne.

249
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, V.2.7, 1-17

Evaluation of E-beam Irradiation and Storage Time in Pork

Exudates Using NMR Metabolomics

García-García, A.B. a; Herrera, A. b; Fernández-Valle, M. E. c; Cambero, M.I. a,*; Castejón, D. c

a) Sección Departamental de Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad

Complutense de Madrid. 28040 Madrid. Spain.

b) Departamento de Química Orgánica. Facultad de Químicas. Universidad Complutense de Madrid.

28040 Madrid. Spain.

c) Centro de Asistencia a la Investigación de Resonancia Magnética Nuclear y de Espín Electrónico.

Universidad Complutense de Madrid. 28040. Madrid. Spain.

* Corresponding author. Tel: +34 913943745; Fax: +34 913943743; E-mail: [email protected]

Abstract: Seventy-two exudates from pork tenderloin samples, subjected to E-beam irradiation
treatments, have been employed to monitor, through 1H-NMR analysis, the effects of irradiation dose
(0, 1, 2 and 6 kGy) and storage time (1, 6 and 12 days). As far as we know, this is the first study where
meat exudate is employed to monitor the effects of irradiation dose and storage time. The 1H-NMR
spectra, obtained after ~ 2 minutes, allowed to determine the main components of the pork exudate.
Results show that 1H-NMR-based metabolomics provides valuable information about the metabolic
changes suffered during storage and how these transformations could be affected by E-beam irradiation
treatment. The ease to obtain exudates, the simple NMR sample preparation, the good correlation
between the selected metabolites, the irradiation treatment and the storage times point to that this study
could be the first step to develop a new method for analysis and control of meat conservation and to
evaluate its irradiation treatment.

Keywords: Exudate, 1H-NMR, Pork, Meat, Storage, Quality & Safety, Traceability, Irradiation

251
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

1. Introduction

Nowadays, quality and safety remains a major concern facing the food industry and it is a critical
component in ensuring food and nutrition security worldwide (FAO, 2012). Regarding meat products,
quality refers to intrinsic attributes critical for the technological, nutritional and sensory suitability of meat
for eating, processing, and storage (Listrat et al., 2016). Therefore, it is imperative to pay close attention
to meat quality and safety. These targets are becoming dynamic and challenging concerns which require
the generation of new information and continuous reevaluation of the existing knowledge for meeting
market’s demands (Sofos, 2008). One of the successful techniques to preserve food with minimum
interruption to the functional, nutritional, and sensory properties is irradiation (Chauhan et al., 2009).
This processing involves controlled application of energy from ionizing radiations such as gamma rays,
X-rays, and electron beam for food preservation. Irradiation preserves the food by disrupting the
biological processes that lead to decay of food quality (Farkas, 2006). Radiation interacts with water and
other biological molecules in a food system and produces various radiolytic products, which generally
act as oxidizing agents and can cause several changes in the molecular structure of organic matter.
Radiations also damage DNA molecules effectively, therefore living cells such as in microorganisms,
insects, and gametes are prevented from reproduction, resulting in a preservative effect. In contrast,
irradiation, like other processing techniques, results in physicochemical changes in food products. The
nature and extent of these changes depend on the kind of food subjected to irradiation and the irradiation
dose (Chauhan et al., 2009). Recently, a study developed by our group reveled the suitability of electron
beam (E-beam) irradiation to increase the shelf life of whole fresh pork loin stored at 4°C (García-
Márquez et al., 2012).
In general, the traditional techniques and methods for evaluation and detection of meat quality and
safety are tedious, laborious, expensive and time-consuming while spectroscopic techniques have
successfully overcome some of these disadvantages and can supplement or replace them. There are
growing interests in spectroscopic techniques, such as Nuclear Magnetic Resonance (NMR), due to
their high specificity, convenience, non-destructive, non-invasive, cost effective and quick response
(Cheng et al., 2013). NMR spectroscopy for structural and compositional characteristics of complex
biological samples (Martínez et al., 2005) has frequently been applied in food analysis to a broad range
of analytical challenges (Capitani et al., 2012; Rodrigues et al., 2010; Straadt et al., 2014). In studies on
meat, NMR has shown a high potential for compositional analysis of muscles (Ritota et al., 2012;
Sundekilde et al., 2017), storage (Castejón et al., 2015), geographical origin (Jung et al., 2010), quality
(Bertram, 2017) or fatty acids profiling (Sicialiano et al., 2013). Traditionally the high-resolution NMR
sampling of biological tissue starts with an extraction procedure followed by a conventional liquid NMR
spectroscopy acquisition (Mannina et al., 2012). However, magic angle spinning (MAS-)NMR allowed
measuring directly on a few milligrams of intact tissue making the extraction procedure unnecessary
and thus much faster and less resource demanding (Castejón et al., 2010).

252
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.2.7, 1-17

In this paper, we present an alternative that consists in the direct study of pork exudate. The loss of
exudates from muscle is unavoidable due to some loss of moisture that occurs due to the presence of
water in a free form in muscle tissue. Therefore, the exudate is an easy to obtain substrate which
manipulation does not mean loss or alteration of the sample from which it comes from. They are
valueless, easy-to-obtain and, their presence in small amounts in commercial meat packages cannot
be associated with significant degradation or alteration of the meat from which they proceed. Rather
than this, they should be considered as the natural juice from raw meat that conveniently analyzed could
provide homogeneous information of the whole meat sample. Despite all these advantages, pork
exudate has been poorly studied. Recently, the influence of accumulated exudate on the quality
characteristics of fresh and freeze-thawed pork during cold storage was considered (Kim et al., 2013).
Moreover, in order to assure meat processing and final meat quality, identification of proteins (Pioselli
et al., 2011) and fatty acids (Benet et al., 2015) in cooked ham exudates was conducted. NMR spectra
of complex mixtures show hundreds of signals, coming from a great number of diverse metabolites. This
fact and the overlap between signals, sometimes, make it difficult to extract information, either “visually”
or by simple processing of the data. The most effective way to analyse these “holistic profiles” is by
using chemometric tools which enable the visualization of the data in a reduced dimension and the
classification of the samples into established classes based on inherent patterns in a set of spectral
measurements (Alonso-Salces et al., 2007).
Fresh meat is usually commercialized in trays, vacuum packed with or without modified atmosphere
packaging (MAP). Therefore, exudates naturally extracted from meat are accumulated and contained
inside these packaging. The objective of the present work is to determine if, under the commercial
conditions mentioned, meat exudates can be considered a suitable matrix to study the metabolic
changes that occur in the meat during the storage and conservation, as well as during the application
of an irradiation treatment. This statement is based in a previous work (Castejón et al., 2015) that
verifies that exudates extracted from beef provide important metabolic information of the meat piece
from which it proceeds due to the strong correlation found between meat NMR spectra and exudates
NMR spectra. Thus, 1H NMR would be a suitable technology for non-destructive analysis allowing the
monitoring of different procedures associated with meat processing.
Therefore, the aim of the present work was: i) to evaluate the feasibility of NMR techniques to analyze
pork exudates as a new suitable matrix to obtain fresh meat metabolome ii) to identify changes in the
molecular profile of pork exudate during storage and iii) to study whether irradiation has a positive effect
on the degradation of pork exudates during storage and also, to determine the suitable irradiation doses.
According to these objectives, samples under four different irradiation doses (0, 1, 2 and 4 kGy) stored
at three different times (1, 6 and 12 days) were analyzed, and the ability of NMR together with
chemometric tools to differentiate between irradiated and non-irradiated samples was evaluated.

253
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

2. Materials and methods

2.1. Sample collection

Twenty-four hours postmortem, pork tenderloin pieces (3.5 to 5 kg in weight) were collected from
two local butcher markets. Meat samples did not differ in their postmortem period. Thermally insulated
containers were employed during transportation of the samples to the laboratory, which, in all cases,
took no longer than 1 hour. Afterwards, ~ 50 g pieces of each pork tenderloin sample was vacuum-
packed at 20 kPa in 10 x 10 cm laminated film bags (90 μm copolymer of polyamide/polyethylene) of
low gas permeability (transmission rates of 35 cm 3 24h-1 m-2 bar-1 and 150 cm3 24h-1 m-2 bar-1 for O2 and
CO2, respectively) and stored at 4°C until irradiation treatment, which was performed in the next 12-14
h. To evaluate pork exudates as a suitable matrix to analyze meat metabolites, a preliminary study was
conducted to compare both, intact muscle and exudates spectra. Results are shown in Figure S2
(Suplementary information)

2.2. Irradiation Treatments

Seventy-two samples (6 pork x 4 doses x 3 storage times) were transported under refrigeration (2-3
ºC) in insulated boxes to the irradiation plant (Ionmed S.A., Tarancón, Cuenca, Spain), and treated
under an electron-beam (E-beam) radiation source operating at 10 MeV. The radiation treatment was
adjusted to apply doses of 1, 2 and 6 kGy, dose lower than 10 kGy, which is considered the safety dose
by the World Health Organization (WHO, 1999). The dose absorbed by the samples was checked by
determining the absorbance of cellulose triacetate dosimeters (ASTM, 2000) simultaneously irradiated.
Non-treated samples were used as control (0 kGy). After irradiation treatment samples were kept
refrigerated at 4 °C.

2.3. Exudates collection

At 1, 6 and 12 days of storage, the released exudate was collected from vacuum-packed samples
(twenty-four samples per storage point), frozen at -80 ºC, and freeze-dried at room temperature. Freeze-
dried exudates were stored at -80 ºC until NMR analysis.

2.4. Preparation of samples for NMR analysis

For 1H-NMR analysis 23.6 ± 0.3 mg of the lyophilized pork tenderloin exudates were reconstituted in
an eppendorf by adding 650 μL phosphate buffer solution in D 2O (0.1M; pH=7.0) containing 1 mM
sodium trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteroproprionate (TSP), an internal chemical shift standard.
Samples were vortexed for 30 seconds and transferred to 5 mm NMR tube. The pH of the samples was
measured after the NMR experiment, pH= 6.57 ± 0.05.

2.5. NMR Analysis

254
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.2.7, 1-17

2.5.1 One-dimensional NMR experiments

1H-NMR spectra of the reconstituted exudates were recorded randomly at 298K on a Bruker Avance
500MHz spectrometer using a 5-mm multinuclear direct detection broadband probe (Bruker BioSpin
GmbH, Rheinstetten, Germany). 1D NOESY (NOESYPRESAT) standard solvent suppressed sequence
was acquired into 32 k data points, averaged over 32 scans. The total acquisition time was 2 min and
23 s, with a relaxation delay of 2 s. A mixing time of 150 ms and a spectral width of 9058 Hz were used.
The free induction decays (FIDs) obtained were processed using Bruker Biospin TOPSPIN software
(version 2.1). Prior to Fourier transformation, the FIDs were multiplied by an exponential weight function
corresponding to a line broadening of 0.3 Hz. Spectra were phased, baseline-corrected and referenced
to the TSP at δ = 0 ppm.

2.5.2 Two-dimensional NMR experiments

Assignments of NMR signals were confirmed through the standard two-dimensional experiments;
namely, 1H,1H-COSY, 1H,1H-TOCSY, 1H,13C-HSQC, and 1H,13C-HMBC. Standard homonuclear COSY
and TOCSY experiments with water suppression were acquired with 2k data points in t 2 domain and
384 increments in t1, each with 64 scans. A spectral width of 13 ppm for both dimensions was employed.
A mixing time of 70 ms was used for TOCSY experiment. The parameters selected for heteronuclear
HSQC and HMBC experiments were: 2k data points in t2 domain and 384 increments in t1, each with
256 scan; a spectral width of 13 ppm for f2 dimension and 260 ppm for f1 dimension. In addition, short-
range and long-range couplings were set to 145 Hz and 10 Hz, respectively. Two-dimensional data sets
were enhanced using the technique of forward linear prediction in first dimension on the real data points
to 512 and zero filling to 1024 and squared sine bell window functions in both dimensions prior to Fourier
transformation.

2.5.3 Spectral assignment

Assignment of resonances in the 1H-NMR spectra from pork tenderloin exudates was based on
previous studies (Castejón et al., 2015). These assignations were confirmed through the information of
connectivity between the spins obtained from 2D experiments.

2.6. Statistical analysis

A total of 72 spectra were subjected to multivariate analysis. Principal Component Analysis (PCA)
and Partial Least Squares (PLS) were performed using AMIX software (version 3.9.11, Bruker Biospin)
and MetaboAnalyst (Version 3.0, URL: http://www.metaboanalyst.ca) (Xia, Sinelnikov, Han, & Wishart,
2015; Xia, & Wishart, 2016). The 1D spectra of pork exudates were data reduced over the shift range
of δ= 8.94 - 0.50 ppm into spectral integral regions (buckets) of 0.04 ppm. These constant buckets
widths were chosen due to work with buffered exudate samples. Regions with spectral artefacts (i.e.,

255
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

unsuppressed water region) were excluded from bucketing. A total of 212 buckets were defined, and
the integral of each of them, calculated by summing up the intensities of all its points, was divided by
the total number of points in the bucket. PCA and PLS were performed using the data from the bucketed
1D spectra of pork exudates.

3. Results and discussion

3.1. Evaluation of the 1H-NMR spectrum of pork exudate

In the first part of the work, exudate profiles of the unirradiated samples were evaluated. Figure 1
shows the comparison between representative 1H-NMR spectra of exudate samples stored during 1 (A),
6 (B) and 12 (C) days. The chart gives a general overview of the main metabolites present in the
spectrum (carnosine, creatine and lactate) and the spectral regions where fundamental nutrients
appear.

Fig. 1. 1H-NMR spectrum, obtained after ~ 2 minutes of analysis time in a 500 MHz spectrometer, which enables the determination
of the main components of the non-irradiated pork exudates at 1(A), 6(B) and 12(C) days of storage.

As previously mentioned, signal assignments for 1H-NMR spectra from pork exudates were checked
out though the 2D NMR spectra. As a result, it allowed us to confirm that all the metabolites identified in

256
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.2.7, 1-17

the pork exudates spectra had been described previously in studies carried out in our laboratory
(Castejón et al.,2015). Therefore, our research was focused on, as set forth below, changes in the main
metabolites between samples subjected to different storage times and conservation irradiation dose.
At this point, it was noticed that it was possible to extract additional information though the spectral
data that allowed to predict samples pH value. The pH-dependent 1H chemical shift (δ) of the aromatic
histidine signals from carnosine showed a statistically significant relationship (P < 0.05) between pH
value of the sample and its δ. This fact has been recently reported in salchichón sausages (García-
García et al., 2018). This finding constitutes an interesting approach to study changes in meat pH directly
from the spectral information, especially taking into account that pH of muscle tissue is extremely
important to meat science since the pH at specific times during the conversion of muscle to meat, as
well as the ultimate pH of meat, affects many quality factors (Li et al., 2014).

3.1.2 NMR-based evaluation of the long-term storage

Exudate pork samples were analyzed according to their storage time under an unsupervised
dimensionality reduction approach, Principal Component Analysis (PCA). Eighteen samples of 212
buckets each, ranging from 1, 6 and 12 days after the purchase. As a result, 96.1% of the variance was
explained by the first six Principal Components (PCs).

A) B)

B - 6 days

A - 1 day
C - 12 days

Figure 2. Left A) Scores plot between PC1 and PC2. Each data point corresponds to one pork exudate sample. The explained
variances are shown in brackets. Right B) Expanded regions of 1H spectra of pork exudates at 1, 6 and 12 days of storage. The
graphic shows the evolution of nucleotides (IMP, Ino and Hx) and degradation of sugars (α, β-Glc and α-Man) involved in meat
storage processes.

257
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

The PCA score plot for the first two PCs (Fig. 2A) shows a clear cluster of the exudate spectra
according with their storage time explaining 81.3% of the total variance. The best direction that explains
the variance in the data set (PC1) resulted closely related to sample storage.
The important features identified by one-way ANOVA and post-hoc analysis (Table S1 in
supplementary data) correspond with buckets connected with the expected metabolic changes that take
place during beef storage (Castejón et al., 2015). Fig. 2B illustrates, in terms of spectral peak variations,
the main nucleosides (IMP, Ino and Hx) and sugar (α, β-Glc and α-Man) changes that can be detected
in pork exudate spectra due to the meat evolution during the storage times considered. Regarding
nucleotides, figure reflects the well-known storage degradation pathway
(ATP/ADP>AMP>IMP>Ino>Hx>Xn). It is important to note that the nucleotide profile in pork exudate
had the same behavior that previously was observed on samples of beef exudate. In fact, this profile
after 12 days of storage was practically the same in both species. On the other hand, figure shows the
signals from anomeric protons of carbohydrates. Signals from α, β-Glc and α-Man were observed at
one postmortem day but after 6 days of storage they were not longer detected. This evolution, related
to microbial degradation, is contrary to what was observed in beef exudates where after 12 days of
storage the characteristic doublets of the carbohydrates could be observed. Therefore, the analysis of
the evolution of sugars could serve as an indicator of the microbial load present and also, depending on
the final fermentation products detected in the 1H-NMR spectrum, could get information about the types
of microorganisms present (Müller, 2008). There were also significantly buckets related with the increase
levels of free amino acids, associated with the proteolysis process which starts after slaughtering, and
the transformation of Gln to Glu that happen during storage.

C - 12 days

A - 1 day

B - 6 days

Figure 3. Multivariate analysis using PLS-DA. PLS-DA 2D score plot of component 1 versus component 2 (66.8% and 8.8%
respectively) for comparison of the global metabolite profiles of pork exudates stored at 1, 6 and 12 days

258
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, IV.2.7, 1-17

To maximize the differences between groups and to determine the main variables that contribute to
discrimination, a supervised pattern recognition method was further employed for spectral data. As
shown in the PLS-DA score plots (Fig. 3), the exudate samples with different storage time were clearly
separated into three groups according with the three storage times analyzed. Therefore, both the
unsupervised (PCA) and the supervised (PLS-DA) analysis revealed a notable and consistent
separation between the three groups according with their storage time.

3.1.3 NMR-based evaluation of irradiation treatment

In order to isolate the effect of irradiation treatment, we focused on exudate samples at one day of
storage. Analysis of these exudate NMR spectra at 0, 1, 2 and 6 kGy did not show significant differences
or characteristic signals that could be associated with preservative treatments that use beta radiation as
previously was described in the literature (Castejón et al., 2015; Zanardi et al., 2015; Villa et al., 2013).
The PLS-DA supervised analysis of the four groups did not show a classification according to the dose
of irradiation applied although a trend was observed (see Figure S1 in supplementary information). This
tendency has been associated with the conservative effect of irradiation. The non-irradiated samples
already undergone an evolution during the first 24 hours of storage.

3.1.4 NMR-based evaluation of storage and irradiation treatment.

In order to evaluate jointly the effect of storage time and the dose of irradiation applied, an
unsupervised multivariate analysis of the 72 samples (6 porks x 4 doses x 3 storage times) was
performed, where a Pareto data scaling showed the best PCA classification (Figure 4).

A) B)
B - 6 days
0 kGy

1 kGy 0 kGy

2 kGy

6 kGy
1 kGy
C - 12 days

A - 1 day

2 kGy

6 kGy

Figure 4. A) Scores plot between PC1 and PC2. Each data point corresponds to one pork exudate sample. The explained
variances are shown in brackets. B) Expanded regions of 1H spectra from non-irradiated (0 kGy) and irradiated (1, 2 and 6 kGy)
samples of pork exudates stored during 1, 6 and 12 days. Abbreviations: Glc, Glucose; Man, Mannose.

259
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

As it is known, PCA is an unsupervised method aiming to find the directions that best explain the
variance in a data set (X) without referring to class labels (Y). The explained variance of each PC is
shown in the corresponding diagonal cell. In our analysis with only 5 PCs, 87.7% of the variance was
explained. The first principal component (PC1) explained 42.3% of the variance in the initial data set,
the second one (PC2) explained 25.9% and the third (PC3) 8.3%. Figure 4 shows the 2D PCA score
plot where the classification of the groups according to their storage time is clearly observed. In addition,
the longer the storage time the easier is the classification between groups of the same storage time as
a function of the dose of irradiation applied. As reported by the chart, PC1 mostly accounted for exudate
classification according to meat storage while PC2 seems to separate the samples in accordance with
irradiation dose. In Fig. 4B, the 1H-NMR expanded regions shows metabolite degradation during storage
and how these changes could be slowed down by the effect of E-beam irradiation treatment. As shown
in the figure, the intensity of Glc and Man signals and therefore, their concentration, seems to have a
clear correlation with applied irradiation dose. After 1 kGy a preservative effect is shown and this effect
increase with the applied dose. This behavior had a good correlation with previous works developed in
our laboratory on samples of smoked and fresh salmon (Villa et al., 2013; Castejón et al., 2016).
However, in this case, the conservative effect of the E-beam irradiation was noticeably lower. This fact
is not conflicting, since, as it has been demonstrated, and it was expected, the irradiation dose needed
to achieve the desired benefit in each product depends on its intrinsic characteristics.

3.2 Correlations among metabolite peak integrals, storage time and irradiation dose.

As we have previously observed, 1H-NMR spectroscopy, as a non-specific detection method, allows

monitoring the evolution of the main metabolites present and as a consequence, the different processes
associated with storage. In the same way, it is possible to evaluate the effect of a conservation method
applied through the integral of selected sentinel metabolites. Hence, a correlation between these
variables could result in a predictive model. For a better understanding of these relations, the estimated
response surface for the pork exudates metabolite integral (nucleotides and carbohydrates described
above) using storage time (days) and irradiation dose (kGy) is shown in Fig. 5.

10

260
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

Figure 5. Response surface plot showing the relation of the percentage of metabolite integral versus storage time and irradiation
dose.

The figure clearly shows how metabolite integral is affected by storage time and irradiation dose
applied. The correlation study carried out between the values of the integrals of the selected metabolites,
storage times and irradiation dose applied allowed to define a predictive model according to the
regression equation (R2 = 0.96), meaning, T= Time (days) and ID= Irradiation dose (kGy):

Metabolite integral = 94.87 – 5.19 * T + 5.47 * ID + 0.05 * T2 + 0.42 * T * ID – 0.69 * ID2

According to the results, the effect and the interaction of the irradiation dose and the storage time
had a clear influence on the value of the integral of the selected metabolites from exudate of pork and
this effect could be predicted with the proposed model. This study reaffirms the potential of the exudate
as a new food matrix to monitor and to control meat systems and raises the possibility that the NMR-
based metabolomic analysis of meat exudate could lead to be an official method to myosistems
monitorization.

4. Conclusions

The analysis of the metabolic profile of pork exudate provides valuable information about the
changes that the different compounds suffer during storage and how these changes have been affected
by the conservative treatment with E-beam irradiation. The spectral information allowed to monitor the
metabolic changes associated with the storage process and to evaluate as much the conservative as
dose effects of the irradiation treatment. In addition, it was possible to establish relationships among the
value of the metabolites integral with the absorbed radiation dose and the storage time, which permitted
to obtain a predictive model. These findings could be the first step to develop a new method for non-
destructive analysis and for the control of meat conservation as well as to evaluate irradiation treatment.

11

261
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

5. Supporting Information

Supplementary materials related to this article can be found online at http://

6. Acknowledgements

The authors acknowledge financial support from MICINN (grants AGL2010-19158 and CTQ2010-
14936) and the members of the CAI of NMR and RSE of the Complutense University for the cooperative
collaboration, with special mention to Elena Sáez.

12

262
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

References

Alonso-Salces, R. M., Moreno-Rojas, J. M., Holland, V. M., Reniero, F., Guillou, C., Serra, F., & Segebarth, N.
(2007). NMR and Isotopic Fingerprinting for Food Characterization. European Comission.

[ASTM] American Society for Testing and Materials. (2000). E1650-97e1 Standard Practice for Use of Cellulose
Acetate Dosimetry Systems. Standards on Disc, 12.

Benet, I., Ibañez, C., Guàrdia, M. D., Solà, J., Arnau, J., & Roura, E. (2015). Optimization of stir-bar sorptive
extraction (SBSE), targeting medium and long-chain free fatty acids in cooked ham exudates. Food Chemistry,
185, 75-83.

Bertram, H. C. (2017). NMR spectroscopy and NMR metabolomics in relation to meat quality. In Elsevier (1st Ed.)
New Aspects of Meat Quality: From Genes to Ethics, (Chapter 13).

Capitani, D., Sobolev, A. P., Tomassini, A., Sciubba, F., De Salvador, F. R., Mannina, L., & Delfini, M. (2012). Peach
fruit: metabolic comparative analysis of two varieties with different resistances to insect attacks by NMR
spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(8), 1718-1726.

Castejón, D., Villa, P., Calvo, M. M., Santa‐María, G., Herraiz, M., & Herrera, A. (2010). 1H‐HRMAS NMR study of
smoked Atlantic salmon (Salmo salar). Magnetic Resonance in Chemistry, 48(9), 693-703.

Castejón, D., García-Segura, J. M., Escudero, R., Herrera, A., & Cambero, M. I. (2015). Metabolomics of meat
exudate: Its potential to evaluate beef meat conservation and aging. Analytica chimica acta, 901, 1-11.

Castejón, D., García-Segura, J. M., Herrera, A., & Cambero, M. I. (2016). NMR-detection of methylamine
compounds in Atlantic salmon (Salmo salar) subjected to E-beam irradiation. Food Control, 60, 455-460.

Chauhan, S. K., Kumar, R., Nadanasabapathy, S., & Bawa, A. S. (2009). Detection methods for irradiated foods.
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 8(1), 4-16.

Cheng, J. H., Dai, Q., Sun, D. W., Zeng, X. A., Liu, D., & Pu, H. B. (2013). Applications of non-destructive
spectroscopic techniques for fish quality and safety evaluation and inspection. Trends in Food Science &
Technology, 34(1), 18-31.

Farkas, J. (2006). Irradiation for better foods. Trends in Food Science & Technology, 17(4), 148-152.

FAO, W. F. P. IFAD (2012). The state of food insecurity in the world 2012. Economic Growth is necessary but not
Sufficient to Accelerate Reduction of Hunger and Malnutrition. FAO, Rome, Italy, 1-61.

García-García, A. B., Lamichhane, S., Castejón, D., Cambero, M. I., & Bertram, H. C. (2018). 1H HR-MAS NMR-
based metabolomics analysis for dry-fermented sausage characterization. Food Chemistry, 240, 514-523.

García-Márquez, I., Cambero, M. I., Ordóñez, J. A., & Cabeza, M. C. (2012). Shelf-life extension and sanitation of
fresh pork loin by E-beam treatment. Journal of Food Protection, 75(12), 2179-2189.

Kim, G. D., Jung, E. Y., Lim, H. J., Yang, H. S., Joo, S. T., & Jeong, J. Y. (2013). Influence of meat exudates on the
quality characteristics of fresh and freeze-thawed pork. Meat Science, 95(2), 323-329.

Jung, Y., Lee, J., Kwon, J., Lee, K. S., Ryu, D. H., & Hwang, G. S. (2010). Discrimination of the geographical origin
of beef by 1H NMR-based metabolomics. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(19), 10458-10466.

Li, P., Wang, T., Mao, Y., Zhang, Y., Niu, L., Liang, R., & Luo, X. (2014). Effect of ultimate pH on postmortem
myofibrillar protein degradation and meat quality characteristics of Chinese yellow crossbreed cattle. The
Scientific World Journal, 2014.

Listrat, A., Lebret, B., Louveau, I., Astruc, T., Bonnet, M., Lefaucheur, L., & Bugeon, J. (2016). How muscle structure
and composition influence meat and flesh quality. The Scientific World Journal.
http://dx.doi.org/10.1155/2016/3182746.

Mannina, L., Sobolev, A. P., & Viel, S. (2012). Liquid state 1H high field NMR in food analysis. Progress in Nuclear
Magnetic Resonance Spectroscopy, 66, 1-39.
13

263
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

Martinez, I., Bathen, T., Standal, I. B., Halvorsen, J., Aursand, M., Gribbestad, I. S., & Axelson, D. E. (2005).
Bioactive compounds in cod (Gadus morhua) products and suitability of 1H NMR metabolite profiling for
classification of the products using multivariate data analyses. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
53(17), 6889-6895.

Müller, V. (2008). Bacterial Fermentation. In Encyclopedia of Life Sciences (ELS), John Wiley & Sons, Chichester,
1-8.

Pioselli, B., Paredi, G., & Mozzarelli, A. (2011). Proteomic analysis of pork meat in the production of cooked ham.
Molecular Biosystems, 7(7), 2252-2260.

Ritota, M., Casciani, L., Failla, S., & Valentini, M. (2012). HRMAS-NMR spectroscopy and multivariate analysis
meat characterization. Meat Science, 92(4), 754-761.

Rodrigues, J. E. A., Erny, G. L., Barros, A. S., Esteves, V. I., Brandão, T., Ferreira, A. A., & Gil, A. M. (2010).
Quantification of organic acids in beer by nuclear magnetic resonance (NMR)-based methods. Analytica
Chimica Acta, 674(2), 166-175.

Siciliano, C., Belsito, E., De Marco, R., Di Gioia, M. L., Leggio, A., & Liguori, A. (2013). Quantitative determination
of fatty acid chain composition in pork meat products by high resolution 1H NMR spectroscopy. Food chemistry,
136(2), 546-554.

Sofos, J. N. (2008). Challenges to meat safety in the 21st century. Meat science, 78(1), 3-13.

Straadt, I. K., Aaslyng, M. D., & Bertram, H. C. (2014). An NMR-based metabolomics study of pork from different
crossbreeds and relation to sensory perception. Meat Science, 96(2), 719-728.

Sundekilde, U. K., Rasmussen, M. K., Young, J. F., & Bertram, H. C. (2017). High resolution magic angle spinning
NMR spectroscopy reveals that pectoralis muscle dystrophy in chicken is associated with reduced muscle
content of anserine and carnosine. Food Chemistry, 217, 151-154.

Villa, P., Castejón, D., Herraiz, M., & Herrera, A. (2013). 1H‐HRMAS NMR study of cold smoked Atlantic salmon
(Salmo salar) treated with E‐beam. Magnetic Resonance in Chemistry, 51(6), 350-357.

World Health Organization. (1999). High-Dose Irradiation: Wholesomeness of Food Irradiatied with Doses above
10 kGy. World Health Organization, No. 890.

Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., & Wishart, D. S. (2015). MetaboAnalyst 3.0—making metabolomics more
meaningful. Nucleic Acids Research, 43(W1), W251-W257.

Xia, J., & Wishart, D. S. (2016). Using MetaboAnalyst 3.0 for Comprehensive Metabolomics Data Analysis. Current
Protocols in Bioinformatics, http://dx.doi.org/10.1002/cpbi.11.

Zanardi, E., Caligiani, A., Palla, L., Mariani, M., Ghidini, S., Di Ciccio, P. A., & Ianieri, A. (2015). Metabolic profiling
by 1H NMR of ground beef irradiated at different irradiation doses. Meat science, 103, 83-89.

14

264
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

SUPPLEMENTARY MATERIAL
(3 pages)

Manuscript entitled: Evaluation of E-beam Irradiation and Storage Time in Pork

Exudates Using NMR Metabolomics

García-García, A.B.; Herrera, A.; Fernández-Valle, M. E.; Cambero, M.I.; Castejón, D.

Table of contents

1). Table S1. Variable buckets used for the multivariate data analysis……………………….…p. 16

2). Figure S1. Scores plot between PC1 and PC2…………………………………………………p. 17

3). Figure S2. Exudates vs intact muscle samples spectra ………………………………….……p. 18

15

265
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Reseach International, IV.2.7, 1-17

1). Table S1. Variable buckets used for the multivariate data analysis. The table includes the magnitude
of their variation during storage and the assignment of the main metabolites present in each bucket.

Name f.value p.value menosLOG10(p) FDR Post-hoc tests 0-6 days 6 -12 days Main Metabolite
2.54 438.11 4.96E-14 13.30 5.16E-12 1 - 12; 6 - 12   Gln
3.42 423.16 6.41E-14 13.19 5.16E-12 1 - 12; 1 - 6   a,b-Glc
8.22 412.49 7.74E-14 13.11 5.16E-12 12 - 1; 6 - 1   Hx
0.98 387.91 1.22E-13 12.92 5.16E-12 12 - 1; 6 - 1; 12 - 6   Ile, Val, Leu
3.62 387.87 1.22E-13 12.92 5.16E-12 12 - 1; 6 - 1   Thr, Val
3.26 376.94 1.50E-13 12.82 5.31E-12 12 - 1; 12 - 6   NI
4.66 329.28 4.05E-13 12.39 1.13E-11 1 - 12; 1 - 6   b-Glc
3.46 327.15 4.25E-13 12.37 1.13E-11 1 - 12; 1 - 6   b-Glc
5.26 237.17 4.45E-12 11.35 1.05E-10 1 - 12; 1 - 6   a-Glc
2.74 232.72 5.11E-12 11.29 1.08E-10 12 - 1; 12 - 6   NI
3.50 228.42 5.85E-12 11.23 1.13E-10 1 - 12; 1 - 6   a-Glc
2.50 206.83 1.20E-11 10.92 2.12E-10 1 - 12; 1 - 6; 6 - 12   Gln
3.74 182.64 2.95E-11 10.53 4.81E-10 1 - 12; 1 - 6   b-Glc
3.82 165.90 5.89E-11 10.23 8.92E-10 1 - 12; 1 - 6   a-Glc
7.14 153.96 1.01E-10 10.00 1.34E-09 1 - 12; 6 - 12   NI
8.26 153.57 1.02E-10 9.99 1.34E-09 1 - 12; 1 - 6   Ino, AMP
5.22 152.55 1.07E-10 9.97 1.34E-09 1 - 12; 1 - 6   a-Glc
6.10 140.83 1.90E-10 9.72 2.04E-09 1 - 12; 1 - 6   Ino
2.46 140.63 1.92E-10 9.72 2.04E-09 1 - 12; 1 - 6   Gln
3.86 139.75 2.01E-10 9.70 2.04E-09 1 - 12; 1 - 6   a-Glc, Ino
2.82 139.60 2.02E-10 9.69 2.04E-09 1 - 12; 6 - 12   NI
7.02 134.44 2.64E-10 9.58 2.55E-09 1 - 12; 6 - 12   NI
4.46 131.53 3.09E-10 9.51 2.85E-09 1 - 12; 1 - 6   Ino, IMP

Abbreviations: AMP, Adenosine 5´-phophate; Glc, Glucose; Gln, Glutamine; Hx, Hypoxanthine; Ile,
Isoleucine; IMP, Inosine 5´-phosphate; Ino, Inosine; Leu, Leucine; NI, Not Identified; Thr, Threonine;
Val, Valine.

16

266
 IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

2). Figure S1. PLS-DA scores plot between Component-1 and Component-2. Each data point
corresponds to one pork exudate spectrum at one day of store time at 0, 1, 2 and 6 kGy. The explained
variances are shown in brackets.

17

267
IV. Resultados
García-García et al., 2018, enviado a Food Research International, IV.2.7, 1-17

3). Figure S2. Representative exudates vs intact muscle samples spectra. Region between 1.00 and
4.5 ppm is shown. The same metabolites are present in each sample type.

18

268
V. Discusión integradora

269
 Con el desarrollo de esta Tesis Doctoral se ha pretendido avanzar en la aplicación de
la RMN al análisis de alimentos, profundizando en el potencial de las distintas técnicas
de RMN para el estudio de miosistemas de naturaleza cárnica. Así, se ha empleado la
IRM para la monitorización del proceso de elaboración de jamón curado, se ha utilizado
la relaxometría T2 de RMN para el análisis de productos cárnicos elaborados a partir de
piezas cárnicas enteras (jamón curado) y a partir de carne picada (embutidos crudos
curados) con el fin de estudiar los cambios en la movilidad y distribución del agua y la
grasa y su relación con la microestructura del producto y se ha recurrido a la
espectroscopía de RMN para el análisis de distintas matrices cárnicas (jamón curado,
embutidos crudos curados y exudados cárnicos) tratando de evaluar y monitorizar
distintos procesos (curado, fermentación e irradiación). En definitiva, el objetivo global
planteado fue dar un paso más en la aplicación de la RMN a la monitorización y control
de procesos en la industria cárnica. Tras el análisis conjunto de los resultados obtenidos,
consideramos que se han conseguido importantes aportaciones de interés científico y
técnico.

En este apartado de la memoria se discuten en conjunto las distintas experiencias

realizadas, la conexión existente entre ellas y la relación entre los resultados obtenidos.
Por último, se analizan las posibles aplicaciones industriales de los resultados obtenidos
y su posible proyección en futuras investigaciones.

271
 V. Discusión integradora

V.1. ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA DE DERIVADOS CÁRNICOS

V.1.1. APLICACIÓN DE LA IRM AL ESTUDIO DE LA MACROESTRUCTURA DE JAMÓN

CURADO

El jamón curado es un derivado cárnico muy apreciado por los consumidores por su
gran calidad sensorial y nutritiva, condicionadas por las particularidades del animal del
que procede, de su alimentación y del proceso de elaboración. Se trata de un producto
de indiscutible valor añadido que requiere un control exhaustivo en todas las etapas de
su procesado.

Las particularidades de este producto se deben a un proceso complejo, el curado,

caracterizado fundamentalmente con la solubilización proteica. Por otra parte, el hecho
de que este producto se elabore a partir de la extremidad posterior del cerdo,
conservando toda su integridad anatómica, condiciona de forma substancia su
evolución desde producto fresco a producto madurado. En definitiva, se trata de un
miosistema complejo en el que el desarrollo de atributos sensoriales depende de
múltiples factores difíciles de controlar y predecir.

Estudios previos han demostrado el potencial de la IRM como herramienta no

destructiva para el análisis de jamón curado. Dichos estudios se han centrado,
principalmente, en la estimación de la composición corporal del cerdo (Mitchell et al.,
2001) y la distribución del contenido de agua y grasa en la matriz cárnica (Caro et al.,
Dolata et al., 2003). Más recientemente, la IRM en combinación con un método de
análisis de imagen automatizado se ha utilizado para la caracterización y reconocimiento
de los distintos músculos en jamón ibérico. Estos estudios han permitido establecer una
descripción cuantitativa del volumen y la evolución de la relación humedad/peso
durante el curado (Antequera et al., 2007). Pérez-Palacios et al., 2011 estudiaron,
también en cerdo ibérico, el efecto de distintos tipos de dieta sobre las características
del músculo porcino. Finalmente, la IRM junto con la relaxometría de bajo campo, se
empleó para el estudio del curado de distintos músculos en jamón de Parma (Fantazzini
et al., 2009).

273
 V. Discusión integradora

En el Trabajo 1 de la presente Tesis Doctoral se ha utilizado la IRM para explorar y

monitorizar los cambios macroestructurales asociados al curado de jamón procedente
de cerdo blanco. Los datos de IRM permitieron la obtención de los mapas de los tiempos
de relajación transversal espín-espín (T2), longitudinal espín-red (T1) y del coeficiente de
difusión aparente (CDA). Este trabajo ahonda en el estudio de la macroestructura de
jamón curado, complementando la información bibliográfica previamente obtenida
sobre T2 y T1 y, de forma novedosa, incluye el cálculo de CDA, parámetro que no había
sido analizado en estudios previos.

Los mapas T2 aportan mucha información estructural. En ellos, las tonalidades

oscuras (hipointensidades) corresponden a bajos valores de T2. Las demás tonalidades
(desde grises oscuros hasta blanco brillante) indican un incremento de este parámetro,
tanto más elevado cuanto más clara (hiperintensa) se presenta la zona de estudio,
indicando diferentes grados de interacción de los 1H de agua y de la grasa con la matriz
proteica. Según avanza la maduración, la estructura cárnica se oscurece debido a la
bajada de T2 que se produce por la pérdida de agua libre y a la presencia de agua poco
ligada, sin embargo, la grasa permanece hiperintensa durante todo el proceso.

En los mapas T1, las intensidades más claras y brillantes indican valores de T1 más
altos asociados a un mayor contenido de agua libre, con elevada movilidad y dificultad
para ceder su energía al medio. La asociación del agua a macromoléculas produce una
reducción del T1, lo que se manifiesta en tonalidades grisáceas, más oscuras cuanto
menor es el valor de T1. De forma similar, la pérdida de agua dará lugar a un
oscurecimiento de las zonas en proporción al descenso del valor de T1. Además, las
zonas de tejido adiposo en estos mapas aparecen oscuras, debido a que la grasa posee
un valor de T1 bajo.

En los mapas CDA las zonas donde hay mayor difusión de agua se muestran con
tonalidades claras y brillantes, mientras que las estructuras densas y organizadas, con
bajo CDA, aparecen oscuras.

En conjunto, en este trabajo se ha observado que los mapas T2 permiten el análisis

de la macroestructura del jamón, los mapas T1 y de T2 facilitan el seguimiento de la
pérdida de agua y del proceso de maduración del producto y los mapas CDA informan

274
 V. Discusión integradora

acerca de la movilidad molecular en el sistema, favorecida por las dinámicas de salado

y deshidratación. Los resultados obtenidos concuerdan con estudios previos realizados
en jamón de Parma (Fantazzini et al., 2009). En ambos casos se observa claramente que
los cambios estructurales (seguidos mediante las variaciones de T1 y T2) a través del
tiempo de maduración dependen del tipo de músculo analizado, cuya localización
anatómica y su grado de exposición al aire condicionan la velocidad de los procesos de
deshidratación y absorción de sal.

En la presente Tesis Doctoral el empleo de la IRM resultó muy útil para la obtención
de imágenes de la sección interna de distintos músculos de jamón. Frente a otras
técnicas de imagen, la IRM ofrece la posibilidad de obtener parámetros cuantitativos,
como son los valores medios de T1, T2 y CDA, que permiten el procesado estadístico y el
establecimiento de relaciones entre atributos estructurales, características
fisicoquímicas y propiedades reológicas. El análisis de las imágenes, a través del cálculo
de los tiempos de relajación anteriormente mencionados y el CDA, permitió la
discriminación entre el tejido muscular y los depósitos de grasa. Esta técnica ha
permitido el seguimiento de los cambios estructurales de los componentes de la pieza
cárnica a lo largo de las distintas etapas de elaboración (véase apartado I.4.3.3.). En
estudios previos, se ha demostrado que las medidas volumétricas de grasa y músculo de
regiones bien definidas de la espalda y pata del cerdo proveen información precisa de la
composición corporal total del cerdo (Mitchell et al., 2001) pudiendo incluso utilizarse
esta técnica como método de clasificación de canales. En este trabajo se refuerza la idea
de emplear la IRM para monitorizar, de forma no destructiva, el proceso de producción
de jamón curado, principalmente, a través del seguimiento del curso de la transferencia
de agua y sal. Este procedimiento facilitaría en gran medida el control en las líneas de
producción. Adicionalmente, en esta Tesis Doctoral se ha propuesto establecer
relaciones matemáticas entre los parámetros de relajación de IRM (T2, T1 y CDA) y el
comportamiento reológico del derivado cárnico lo que permitiría la predicción de
parámetros de textura, como la dureza. Con esta nueva proyección de aplicación de los
parámetros de IRM, se abre la posibilidad de incorporar las técnicas no destructivas de
resonancia a la estimación de la calidad de las piezas de jamón y a la determinación de
los tiempos más adecuados de consumo. Este aspecto requiere mayores investigaciones

275
 V. Discusión integradora

para relacionar los parámetros de IRM con la percepción sensorial del comportamiento
reológico y constituyen una de las líneas de trabajo futuro abiertas para proseguir a
partir de los resultados expuestos en la presente Tesis Doctoral.

V.1.2. APLICACIÓN DE LA RELAXOMETRÍA T2 DE RMN AL ESTUDIO MICROESTRUCTURAL

DE DISTINTAS MATRICES CÁRNICAS

En el afán de profundizar en el estudio de los cambios estructurales que acontecen

durante el proceso de maduración de los derivados cárnicos, se recurrió al análisis de
relaxometría T2 de RMN para estudiar la microestructura de distintas matrices cárnicas
(Trabajos 2, 3 y 4). Como se ha mencionado, el tiempo de relajación transversal (T2) es
una medida de las interacciones espín-espín, que aporta información estructural, en
términos de movilidad nuclear y compartimentación, debido a que cada protón está
influenciado por los núcleos de los diferentes componentes (agua, grasa, proteínas) de
su entorno (Bertram y Andersen, 2004; Charlton, 2009). Este hecho conduce a que los
sistemas complejos presentes diversos tiempos de relajación T2 dependiendo del estado
de los protones, siendo posible diferenciar distintas poblaciones con tiempos de
relajación próximos y, por tanto, evaluar diferencias sutiles, aunque importantes, de la
estructura de determinados tejidos.

Recientemente, la relaxometría T2 de RMN se ha empleado, mayoritariamente, para

estudiar la distribución y movilidad del agua dentro de la matriz cárnica (Bertram &
Andersen, 2004). Los datos de relajación T2 han sido ampliamente relacionados con la
estructura miofibrilar de la carne y, por tanto, con su capacidad de retención de agua
(Bertram & Andersen, 2004, McDonnell et al., 2013; Pearce et al., 2011), propiedad
determinante de la calidad final del producto.

En el músculo cárnico, como sistema heterogéneo que es, la relajación es

multiexponencial (Bertram & Andersen, 2007) y se han descrito diferentes poblaciones
de agua definidas por constantes T2 características:

▪ agua fuertemente asociada a macromoléculas, caracterizada por el tiempo de

relajación T2b. Es el componente minoritario de relajación más rápida (1-5 ms).
Se podría considerar el agua de hidratación.

276
 V. Discusión integradora

▪ agua incluida en el entramado de miofibrillas, atrapada en el interior de la red

tridimensional proteica, determinada por el tiempo de relajación T21. Con
valores intermedios (40-80 ms) es el componente mayoritario en las muestras
cárnicas y suele referenciarse como agua miofibrilar.

▪ agua localizada en los espacios extra-miofibrilares, caracterizada por T22. Es la

población de protones más móviles, de relajación más lenta (200-400 ms). Es
el agua extramiofibrilar.

En la Figura V.I se representa la distribución de los distintos tipos de agua que han
sido descritos en carne fresca mediante el uso de la relaxometría. En ella se pone de
manifiesto el comportamiento multicomponente de la relajación T2, puesto que cada
señal se corresponde con una población o grupo de protones con un grado de asociación
determinado a la matriz proteica. En general, cuanto menor es T2, mayor será el grado
de asociación o ligazón de los protones a las estructuras de la muestra.

Figura V.I. Distribución de los tiempos de relajación T2b, T21 y T22 en músculo de cerdo. Cuanto más fuertemente
ligadas se encuentran las moléculas de agua, más corto es el tiempo de relajación T 2. (Bertram y Andersen, 2008).

En la Figura V.2 se representa la estructura muscular y las localizaciones de los

principales compartimentos del agua presente en la matriz miofibrilar y su relación con
los mencionados tiempos de relajación. El agua intra-miofibrilar es retenida por las
miofibrillas en el espacio entre filamentos. El agua extra-miofibrilar se encuentra en el
sarcoplasma, en el espacio entre miofibrillas (agua inter-miofibrilar), entre las fibras
musculares y en los espacios inter-fasciculares (agua inter-fascicular) y en el espacio
extra-fascicular entre los fascículos musculares (agua extra-fascicular) (Pearce et al.,
2011).

277
 V. Discusión integradora

Figura V.2. Principales componentes musculares y localizaciones de los compartimentos del agua muscular
(Adaptado de Pearce et al., 2011).

Para el desarrollo de esta Tesis, en primer lugar, nos centramos en la aplicación de la

relaxometría de RMN sobre muestras de jamón curado y así complementar la
información macroestructural obtenida mediante IRM durante el curado (Trabajo 2).
Esta metodología permitió desgranar los valores medios de los tiempos de relajación T2
mediante la obtención de las distribuciones continuas de los diferentes tiempos de
relajación T2. De esta forma, fue posible obtener información relevante a nivel
microestructural. Las modificaciones de las variables del proceso, aun siendo pequeñas,
afectan a la microestructura, con la consiguiente repercusión en la macroestructura y
en la percepción sensorial del producto. El análisis causa-efecto es de gran interés para
la elaboración de alimentos y la industria alimentaria actual donde se busca la
estandarización y unificación del producto final.

En segundo lugar, nos planteamos el estudio de la maduración en sistemas cárnicos

modelo (Trabajo 3), y cómo este proceso se ve afectado por el empleo de proteasas
exógenas (Pronasa E de Streptomyces griseus y aspartyl proteinase de Aspergillus
oryzae), puesto que la adición de estas enzimas suele emplearse para acelerar las
reacciones que modifican la textura y generan el flavor contribuir a la generación del
flavor característico de los productos cárnicos curados (Díaz et al., 1993; Diaz et al.,
1997). Por ello, es importante saber cómo estos enzimas afectan a la microestructura
del producto y, por tanto, a la distribución y movilidad del agua, para entender cómo se

278
 V. Discusión integradora

puede optimizar el proceso madurativo del sistema cárnico de elaboración de derivados

cárnicos.

En tercer lugar, planteamos un estudio sobre la microestructura de productos

comerciales, tipo chorizo y tipo salchichón, de maduración corta, con el fin de
caracterizar su maduración y establecer modelos predictivos de las características
fisicoquímicas y reológicas a partir de los distintos tiempos de relajación T2 (Trabajo 4).

V.1.2.1. Modificaciones derivadas del curado de piezas cárnicas enteras versus matrices
cárnicas picadas

El análisis de las distribuciones T2 obtenidas para jamón curado (Trabajo 2), revela la
existencia de distintos componentes T2 distintos en las muestras cárnicas, en función del
grado de asociación de los protones de la muestra con la matriz proteica: T2b, T21, T22.
Como se mencionó anteriormente en esta memoria, estos tres componentes han sido
descritos previamente en la carne fresca (Bertram et al., 2001; Bertram et al., 2002;
Bertram et al., 2004) y son comunes a los distintos derivados cárnicos [modelos cárnicos
(Trabajo 3) y embutidos crudos curados (Trabajo 4)] examinados, si bien su
presencia/ausencia se ve alterada dependiendo del producto y/o etapa de maduración.
En este sentido, el componente mayoritario, T21 está presente siempre, sin excepción, y
las diferencias entre productos y tiempos se hacen visibles a través de los componentes
T2b y T22.

Cabe destacar una peculiaridad en las distribuciones T2 obtenidas en productos

elaborados a base de carne picada (Trabajos 3 y 4) y es que el componente T22 no está
presente en todos los puntos del proceso de maduración, sino que se hace visible a partir
del día 2 de producción, tanto en los sistemas modelo como en los embutidos crudos
curados. De acuerdo con estudios previos (Ordóñez et al., 1999; Tornberg, 2005), puede
decirse que en este punto del proceso comienza a producirse la verdadera modificación
estructural del producto, puesto que hasta ese momento era solo una masa de carne
picada. Su introducción en las cámaras de maduración, en condiciones controladas de
temperatura y humedad relativa, así como el desarrollo de la actividad microbiana
anaerobia fermentativa durante las primeras horas del proceso condicionan que el
fluido sistema proteico original inicie su transformación desde el estado “sol” hacia el

279
 V. Discusión integradora

sistema coloidal “gel”. Esta transformación conduce al establecimiento de una red

tridimensional proteica irreversible (Figura V.3) donde el agua se encuentra en un
estado de menor movilidad correspondiente a valores más cortos de T21 (Gordon y
Barbut, 1992; Li et al., 2014). En el interior de la cámara de maduración, el agua
comienza a desplazarse por difusión, debido a la diferencia de humedad entre las piezas
cárnicas y el ambiente, lo que conduce a la aparición de la población T22, relacionada
con esta fracción de agua extramiofibrilar más móvil. Este hallazgo constituye un hecho
relevante puesto que los resultados sugieren que es necesario cierto grado de
asociación o agregación proteica para la presencia del componente T22 en los derivados
cárnicos elaborados a partir de carne de cerdo.

Figura V.3. Transformación desde estado sol hasta estado coloidal gel y constitución de la red tridimensional
proteica.

Además de las tres poblaciones comunes con diferente T2 mencionadas

anteriormente (T2b, T21 y T22), en los modelos cárnicos y en los embutidos curados, fue
posible identificar una cuarta población, T2b2, que se atribuye a la característica adición
de sal en este tipo de productos (Andersen et al., 2007; MØller et al., 2010; García-García
et al., 2015).

En todos los productos estudiados, el avance del curado se hizo patente en las
distribuciones obtenidas. Por un lado, la deshidratación de la matriz proteica, propia del
curado/maduración, se manifestó a través de cambios en la distribución y movilidad de
los protones, de manera que en las distribuciones T2 se produjo un desplazamiento de
las señales hacia tiempos de relajación más cortos, especialmente visible a través del
componente mayoritario T21. Este comportamiento fue descrito previamente por MØller

280
 V. Discusión integradora

et al., 2010 durante el proceso de elaboración de embutidos fermentados. Dicho

desplazamiento se relaciona con un mayor grado de ligazón de los protones con la
matriz, lo que sugiere un mayor grado de compactación de la misma a medida que
avanza el proceso de maduración.

En el caso concreto del jamón curado (Trabajo 2), cabe destacar la presencia de una
nueva población, T2´, con un tiempo de relajación entorno a los 80 ms, no contemplado
hasta el momento en la bibliografía. Este componente no está presente en todas las
distribuciones de jamón, sino que se hace visible a partir de un cierto grado de curado,
concretamente, durante la etapa de secado. El valor del tiempo de relajación de dicha
señal (más largo que el agua intramiofibrilar y más corto que el agua extramiofibrilar),
junto con el alto grado de infiltración de la grasa en la matriz muscular en este punto del
proceso (Fernández et al., 2007), han llevado a asociar el componente T2´ con los
protones de la fase grasa. Además, la obtención de imágenes de microscopía electrónica
de barrido (MEB) resultó de gran ayuda para interpretar las modificaciones
estructurales. Su análisis permitió observar la reducción del tamaño intrínseco de poro
de la matriz proteica, debido a los fenómenos de solubilización proteica, absorción de
sal y deshidratación, típicos del curado, así como la visualización de la evolución de la
infiltración grasa en el músculo.

Por tanto, en el caso del jamón curado (Trabajo 2), fue posible tanto monitorizar la
maduración como observar cambios en la distribución de la grasa, gracias a la aparición
de la señal T2´, cuya presencia puede utilizarse como marcador de etapas avanzadas del
curado. Además, se detectaron diferencias de comportamiento entre músculos, puesto
que el efecto de la maduración se hizo más notorio en el músculo semimembranoso. El
componente T21 en las distribuciones obtenidas para este músculo a partir de la etapa
de post-salado presentó tiempos de relajación más bajos en comparación con el
músculo bíceps femoral, sugiriendo que los fenómenos madurativos afectan más
rápidamente al músculo semimembranoso que, por tratarse de un músculo externo, de
contacto directo con el aire, experimenta antes los efectos de las dinámicas de difusión
de agua y sal (Arnau et al., 1995) y eso se refleja en los tiempos de relajación.

Cabe destacar que el componente T2´ presente en jamón curado, no se hizo visible ni
en las distribuciones T2 obtenidas en los modelos cárnicos ni en los embutidos curados

281
 V. Discusión integradora

(Trabajos 3 y 4). Sin embargo, sí aparece una señal similar en otros productos
madurados, como el queso curado de oveja (Cruz-Díaz, 2016) en el que se describió un
comportamiento bimodal de la relajación transversal T2, de forma que el componente
que presentaba un tiempo de relajación más bajo (T2 < 20 ms) se relacionó con una
fracción de agua menos móvil asociada a la fracción proteica y el componente con un
tiempo de relajación más largo (T2 = 20-80 ms), se relacionó con la fracción de agua más
móvil, asociada a la fase grasa. En relación con los quesos, otros autores coinciden en
dicho comportamiento bimodal. Así, Kuo et al. (2001) y Luo et al. (2013) lo describieron
en queso Mozzarella y Mulas et al. (2013) en queso Pecorino y queso Fiore Sardo.

Las diferencias en T2 observadas entre productos se deben, en gran medida, a las

diferencias estructurales de las materias primas de partida que condicionarán,
posteriormente, todo el proceso de transformación. En todos los casos, durante el
procesado, se buscó la consecución del gel cárnico que está íntimamente asociado al
desarrollo de una textura adecuada del producto final. Como se ha comentado
previamente, la gelificación de las proteínas miofibrilares requiere la desnaturalización
parcial seguida de la agregación irreversible de las cadenas de miosina. Este proceso
conduce al establecimiento de una red tridimensional proteica que retiene agua en su
interior (Toldará y Flores, 1998).

Como se pone de manifiesto en esta Tesis, cuando el agua se elimina de un

miosistema por un proceso de deshidratación, fenómenos como el incremento de la
concentración local de sal, la solubilización de la miosina y los cambios en la interacción
agua-macromoléculas debidos a la desnaturalización proteica, inducen una reducción
en el espacio entre miofilamentos. Este hecho da lugar al descenso de la movilidad
molecular, con la consiguiente aceleración de la relajación nuclear y la reducción de los
tiempos de relajación (Ruiz cabrera et al. 2004, Vestegaard et al. 2005).

282
 V. Discusión integradora

Extracción proteica Interacción proteína-proteína

Desnaturalización Red tridimensional
Solubilización proteica
Exposición de grupos

Músculo sales de curado

MP Gel
íntegro Tª, HR Tª, HR

Músculo Picado y
+ fermentación
MP Gel
Grasa Tª, HR Tª, HR
+ masa cárnica
Ingredientes no
cárnicos
Extracción proteica
Desnaturalización
Solubilización proteica Interacción proteína-proteína
Red tridimensional
Exposición de grupos

Figura V.4. Proceso de gelificación proteica en músculo íntegro y masa cárnica. MP: proteínas miofibrilares. HR:
humedad relativa.

Existen numerosos factores que condicionan la gelificación proteica: pH, fuerza

iónica, variables del proceso, concentración proteica, temperatura o la presencia de
aditivos, entre otros (Sun y Holley, 2011). El jamón curado es un producto elaborado a
partir del músculo íntegro que conserva su estructura miofibrilar intacta sometido al
efecto directo de la sal, principal responsable de la solubilización proteica. Por otra
parte, los modelos cárnicos y los embutidos crudos curados poseen una estructura
tridimensional gelificada a partir de una masa dispersa que gelifica, principalmente, por
pH (Figura V.4).

V.1.2.2. Efecto de la adición de proteasas

Respecto a los sistemas modelo con y sin adición de proteasa (Trabajo 3), cabe
destacar que las distribuciones T2 mostraron notables diferencias al comparar ambos
lotes de productos (Díaz et al., 1997; Fernández et al., 2000). Estas diferencias se hacen
visibles, sobre todo, en los componentes minoritarios, T2b y T2b2, y en el componente de
relajación más lenta, T22. Además, para ayudar a interpretar las distribuciones T2, se
realizaron pruebas clásicas, como electroforesis SDS-PAGE y ensayo de fluorescamina.
Con estas técnicas se pretendía observar desde distintos ámbitos qué ocurre con las
proteínas miofibrilares durante un proceso de maduración con y sin adición de enzima.
En este sentido, el patrón electroforético obtenido para las proteínas miofibrilares de
ambos lotes fue significativamente diferente. En los modelos sin adición de proteasas se

283
 V. Discusión integradora

produjo una degradación proteica progresiva que se corresponde con una situación
normal de maduración. Sin embargo, en los modelos con proteasas, la degradación fue
patente desde el principio, donde ya no fue posible distinguir compuestos de alto peso
molecular debido a la proteólisis experimentada desde las etapas iniciales del proceso.

En los modelos sin proteasa, las poblaciones T2b y T2b2 constituyen dos señales
distintas hasta el día 3 de producción, aproximadamente. A partir de entonces, en la
región entre 1-10 ms solo se distingue una única señal. Este hallazgo, también visible en
los embutidos curados, se ha atribuido a la absorción de sal por parte de la matriz cárnica
que tiene lugar durante el proceso de maduración. Sin embargo, en los modelos cárnicos
a los que se les ha añadido proteasas exógenas, ambas poblaciones, T 2b y T2b2,
permanecen separadas casi durante todo el proceso y no es hasta el día 7,
aproximadamente, cuando comienza a observarse un solo componente en la región
comprendida entre 1-10 ms. Lo que ocurre en este lote de producto es que el efecto de
la proteólisis impide que se produzca una adecuada absorción de la sal por la matriz
proteica, de hecho, la aparición de una sola señal de T2 bajo coincide con la aparición
del componente T22 en este tipo de productos, lo cual sugiere la necesidad de cierto
grado de agregación proteica para la aparición de estos fenómenos. La electroforesis
apoya la teoría de que a partir del día 7 comienza a producirse un acercamiento entre
las cadenas peptídicas previamente degradadas, probablemente favorecido por la
deshidratación en este punto del proceso, cuya reorganización favorece la
compactación de la matriz y los cambios mencionados previamente (García de Fernando
et al., 1991, Ordóñez et al., 1999).

Los estudios de relaxometría T2 sobre sistemas modelo y embutidos curados

permiten monitorizar los cambios en la microestructura de los productos durante un
proceso de curado, donde el avance de la maduración se traduce en un desplazamiento
de las distribuciones hacia tiempos de relajación más bajos. Además, la distribución y
movilidad de agua se vieron afectadas notablemente por la adición de proteasas a la
masa cárnica, sugiriendo que esta metodología es adecuada para el estudio de cómo
distintas condiciones de procesado pueden afectar a las características del producto
final.

284
 V. Discusión integradora

V.1.3. RMN Y CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DE DERIVADOS CÁRNICOS

Las características fisicoquímicas más relevantes de los alimentos a analizar (pH,

actividad de agua, capacidad de retención de agua, contenido en humedad, contenido
en sal, contenido en grasa, entre otros) suelen obtenerse mediante análisis
convencionales destructivos. Con el fin de explotar al máximo el potencial de las técnicas
de RMN, en la presente Tesis se ha evaluado la aptitud de la IRM, en jamón curado
(Trabajo 1), y de la relaxometría T2, en jamón curado (Trabajo 2) y embutidos crudos
curados (Trabajo 4), como herramientas predictivas de atributos fisicoquímicos. Con
este objetivo se han utilizado los parámetros de RMN T1, T2 y CDA.

La posibilidad de utilizar la IRM para monitorizar los cambios del contino en agua y la
concentración en sal en jamón curado ha sido previamente documentada por otros
autores. Guiheneuf et al., 1996 obtuvo mapas paramétricos de IRM (T1, T2 y densidad
protónica) de muestras de carne de cerdo curado que mostraron una disminución de
estos parámetros en función del aumento de la concentración de NaCl. Además, se han
establecido relaciones lineales (p < 0,0001) entre los contenidos de agua y de sal y los
parámetros de IRM (T1 y T2) en el músculo Longissimus dorsi salado con distintos
porcentajes de NaCl (Fantazzini, 2005). También se emplearon modelos de regresión
múltiple para construir un modelo que permita determinar el contenido en sal en los
músculos semitendinoso y bíceps femoral en jamón de Parma. T1, T2, su proporción
(T1/T2) y la densidad protónica fueron los parámetros empleados para establecer este
modelo, existiendo una alta correlación entre el contenido en sal (R2=0,90, p < 0,001) y
los parámetros de IRM (Fantazzinni, 2009).

En el Trabajo 1 de la presente Tesis, se establecieron modelos matemáticos para cada

tipo de músculo estudiado (bíceps femoral, semimembranoso y semitendinoso)
empleando el contenido en agua y el contenido en sal como variables dependientes y
los parámetros de IRM (valores medios de T1, T2 y CDA) como parámetros
independientes. El cálculo de regresión lineal múltiple permitió observar una relación
muy estrecha entre el contenido en agua y los parámetros de IRM (R2=0,97 para BF;
R2=0,98 para SM y R2=0,97 para ST; p < 0,05). El contenido en sal también resultó
altamente correlacionado con dichos parámetros (R2=0,99 para BF; R2=0,95 para SM y
R2=0,99 para ST; p < 0.05).

285
 V. Discusión integradora

En el Trabajo 2, se emplearon los valores de T21 obtenidos a partir de las

distribuciones adquiridas mediante el estudio por relaxometría en muestras de jamón
curado para establecer posibles correlaciones con el contenido en agua en los músculos
bíceps femoral y semimembranoso. En este caso, se estableció una fuerte dependencia
lineal positiva entre ambas variables, sugiriendo que la población T21 es un valioso
parámetro “centinela” para monitorizar el curso del curado, puesto que su evolución en
el tiempo es paralela a la deshidratación que marca el proceso.

En el Trabajo 4, la relación entre parámetros fisicoquímicos y relajación T2 en

embutidos crudos curados, tipo chorizo y salchichón, se estableció mediante el análisis
bivariante de correlación de Pearson. En este caso, se observó un alto grado de
correlación entre el componente T21 y la actividad de agua (r = 0,88, p < 0,0005), así
como entre T21 y el contenido en agua (r = 0,94, p < 0,0005). Este mismo hecho también
fue descrito en jamón curado (Trabajo 2). Este resultado confirma que la población T21
representa un porcentaje elevado del agua total contenida en la muestra, al contrario
que T22 y, especialmente, T2b, que mostraron un grado de correlación moderado y bajo,
respectivamente, con dichos parámetros. Además, se estableció una asociación notable
entre la población T21 y el pH (r = 0,68, p < 0,0005), dada la influencia que el pH tiene
sobre la capacidad de retención de agua de las proteínas miofibrilares (Huff-Lonergan y
Lonergan, 2005). Por otro lado, las poblaciones T2b y T22 presentaron una relación más
débil con el pH y es interesante destacar la relación negativa observada entre el pH y el
T22. De acuerdo con las distribuciones T2 adquiridas a partir de estos derivados cárnicos,
el descenso de pH es necesario para la presencia del componente T 22, de forma que,
cuando el pH alcanza su mínimo, el T22 alcanza su máximo.

Estos trabajos han profundizado en el gran potencial de la RMN como herramienta

predictiva de parámetros fisicoquímicos, extendiendo al máximo el concepto de técnicas
de análisis no invasivas y no destructivas, puesto que a partir de un solo análisis de RMN
sería posible determinar parámetros que, tradicionalmente, requerirían la invasión y/o
la destrucción de la muestra.

286
 V. Discusión integradora

V.1.4. RMN Y COMPORTAMIENTO REOLÓGICO DE DERIVADOS CÁRNICOS

Dada la importancia de la textura en la calidad final de los derivados cárnicos y,

considerando su indiscutible relación con la estructura del producto, siendo una de las
propiedades que más cambia durante un proceso de curado/maduración, se planteó su
estudio a través de la determinación del comportamiento reológico de los productos
estudiados. Para ello, se utilizó el análisis del perfil de textura (TPA) para el jamón curado
(Trabajo 1) y los embutidos crudos curados (Trabajo 4). Por otra parte, se ha recurrido
al ensayo de tracción uniaxial destructivo para determinar la fuerza necesaria para la
rotura del tejido muscular en distintos puntos del proceso de elaboración de jamón
curado (Trabajo 2).

El TPA es el ensayo de compresión más utilizado en el estudio de productos cárnicos

dada sus posibilidades para emular el proceso de masticación. Existen múltiples
referencias de aplicación de este análisis de derivados cárnicos (Muguerza et al., 2003;
Herranz et al., 2005, Herrero et al., 2007; Herrero et al., 2008). Los ensayos de tracción
se emplean habitualmente en Ciencia de los Materiales para estudiar la tenacidad
(resistencia a la rotura y capacidad de absorber energía antes de la rotura) y la
elasticidad. Sin embargo, estos ensayos han sido muy poco empleados en el análisis
alimentos y, más concretamente, en el estudio de las propiedades reológicas de los
productos cárnicos. No obstante, se han utilizado, por ejemplo, para determinar los
cambios de las propiedades mecánicas de las fibras musculares en el almacenamiento
post-mortem (Farouk et al., 2005; Gillet et al., 2006) y, más recientemente para la
caracterización de la resistencia de lonchas de jamón curado (Romero de Ávila et al.,
2014).

La información obtenida en los ensayos de tracción complementa a la aportada por

el TPA. Cabe añadir que la relación esfuerzo/deformación obtenida tras la aplicación de
un ensayo de tracción a un determinado material, permite analizar su comportamiento
mecánico y, por tanto, obtener información sobre su deformación elástica, fluencia,
deformación plástica o rotura (Romero de Ávila et al., 2014).

En cualquier caso, los ensayos de tracción y el TFA, al igual que cualquier otro análisis
mecánico del comportamiento reológico, son destructivos y requieren grandes

287
 V. Discusión integradora

cantidades de muestra para garantizar su repetitividad. De nuevo, en el transcurso de

esta Tesis, nos planteamos la posibilidad de emplear parámetros de RMN como
herramienta predictiva de las características reológicas.

En el Trabajo 1, el TPA se empleó para determinar el comportamiento reológico de

distintos músculos (semimembranoso, semitendinoso y bíceps femoral) de jamón
curado durante la maduración. Los parámetros evaluados fueron: dureza, elasticidad,
cohesividad, adhesividad, gomosidad y masticabilidad. Estos atributos mostraron
diferencias significativas (p < 0.05), dependiendo del tipo de músculo y la etapa del
proceso de elaboración considerados.

Conforme a estudios anteriores (Monin et al., 1997, Serra et al., 2005) la dureza
aumentó durante la maduración. El descenso de la actividad de agua y el contenido en
agua fue acompañado de un aumento notable de la dureza. Del mismo modo, la
masticabilidad también aumentó, ya que es una característica reológica secundaria
(producto de la dureza por la cohesividad por la elasticidad). La sal también puede
incrementar la estabilidad y la rigidez de la estructura miofibrilar mediante su
mineralización. En relación con estos hechos, en los tres músculos considerados, se
observó un aumento progresivo de la dureza y la masticabilidad, alcanzando su valor
máximo al final de la maduración. El músculo que mostró los valores más altos de dureza
durante todo el proceso de maduración fue el semimembranoso, seguido del bíceps
femoral y, finalmente, el semitendinoso, el más suave de los tres músculos estudiados.
Este último mostró el contenido en grasa más alto, el nivel de mineralización más bajo
debido a su posición más interna y un nivel de humedad medio. La conjunción de estos
factores explicaría su menor resistencia mecánica en relación con el bíceps y, sobre todo
con el semimembranoso, que por su posición más externa experimenta una rápida e
intensa deshidratación

Según Serra et al., 2005, la cohesividad y la elasticidad de derivados cárnicos

muestran una relación lineal positiva con la actividad de agua y el contenido de
humedad. Con la deshidratación creciente durante la maduración, la cohesividad
(cohesividad (grado de deformación que puede experimentar un material antes de la
rotura) y la elasticidad (relación en la que un material deforme vuelve a su forma inicial
tan pronto como cesa la acción de la fuerza que le deformaba) se redujeron. El músculo

288
 V. Discusión integradora

semimembranoso presentó los valores más altos para cohesividad y elasticidad durante
el proceso de maduración. El valor de la adhesividad también se redujo con el avance
del curado. El bíceps fue el músculo que presentó el valor más bajo al final del proceso.

Este estudio conjunto de los parámetros de IRM y derivados del TPA, ha permitido
obtener modelos de predicción de los atributos de textura (dureza, elasticidad,
adhesividad y cohesividad) a partir de T1, T2 y CDA que vendrían a indicar la existencia
de una fuerte relación entre los parámetros de IRM y la estructura muscular. La dureza
mostró una correlación negativa con T1, T2 y CDA, mientras que la elasticidad y la
cohesividad mostraron una relación positiva con dichos parámetros.

En el Trabajo 4, se empleó de nuevo el TPA para estudiar el comportamiento

reológico de embutidos crudos curados durante la maduración y, en base a ello, se
realizó un análisis multivariante de clusters que permitió la clasificación de las muestras
cárnicas en distintos grupos en función del tipo de producto y del tiempo de
maduración. Se calcularon, además, los coeficientes de correlación de Pearson para
establecer el grado de dependencia entre los parámetros de TPA y las constantes de
RMN, T2b, T21 y T22. y al igual que en el caso del jamón curado fue posible establecer
relaciones entre los resultados de ambos estudios. Cabe destacar la relación negativa de
T21, T22 y T2b con la dureza. La gomosidad y la masticabilidad, como característica
reológicas secundarias, dependientes de la dureza, mostraron un grado de dependencia
de las poblaciones T2 similar a ésta. La elasticidad, la cohesividad y la adhesividad se
relacionaron fuertemente con T21. Los dos últimos parámetros de textura también se
relacionaron con T22. Estos resultados sugieren que los cambios de los parámetros de
textura están fuertemente vinculados o condicionados por las modificaciones
estructurales asociados a la evolución del componente T21.

Además del análisis de TPA, en el caso del jamón, el análisis del comportamiento
reológico de distintos músculos durante el proceso de curado se ha completado con la
estimación de su resistencia a la rotura y del límite elástico mediante análisis de tracción
destructivos (Trabajo 2). En términos generales, se puede decir que ambos parámetros
se vieron incrementados durante la maduración, siendo especialmente notable su
progresión en el músculo externo semimembranoso.

289
 V. Discusión integradora

Como se ha mencionado previamente, los cambios microestructurales en jamón

curado están ligados íntimamente al salado y a la deshidratación. En este sentido, la
principal población detectada por relaxometría de RMN, T21, ha demostrado estar
positivamente relacionada con el contenido en agua, como se pone de manifiesto en los
Trabajos 2 y 4. Por tanto, existen fuertes evidencias para pensar que es posible seguir el
curso de la maduración de jamón a través del análisis de este parámetro. Los datos
analizados en el Trabajo 2, ponen de manifiesto una relación inversa entre la fuerza de
rotura y la población T21, de forma similar a lo ocurrido con la dureza, otro atributo que
indica la resistencia de la matriz analizada. La fuerza de rotura alcanzó su valor máximo
en los músculos estudiados cuando los valores de T21 fueron mínimos, lo que sugiere un
comportamiento antagonista entre ambas variables. Los tiempos de relajación cortos se
asocian con la compactación de la matriz, por tanto, una mayor integridad y menor
plasticidad del tejido, lo que requiere la aplicación de mayores fuerzas externas para
alcanzar el punto de rotura.

En conjunto, los resultados obtenidos en la primera parte de la presente Tesis

Doctoral indican el potencial de las técnicas de RMN, y más en concreto de la
determinación de los tiempos de relajación longitudinal (T1) y transversal (valor medio
de T2 y de sus componentes T2b, T21, T2´ y T22) para monitorizar el proceso de maduración,
los cambios estructurales y las dinámicas de distribución y movilidad de agua y grasa en
distintos derivados cárnicos. Cabe de nuevo resaltar que los valores medios de los
parámetros de IRM (T1, T2 y CDA), así como el valor de la población T21, como exponentes
de la estructura del miosistema, permitirían establecer modelos matemáticos para
estimar parámetros fisicoquímicos y el comportamiento reológico de productos
cárnicos, destacando que, el trabajo realizado ha sido, hasta donde los autores conocen,
el primer intento de estimación del comportamiento reológico de derivados cárnicos
desde atributos estructurales.

Sería necesario incrementar el número de unidades analizadas para obtener modelos

más robustos, así como realizar los requeridos ajustes para una mayor aproximación de
los datos experimentales y calculados. No obstante, se estima que los resultados
obtenidos abren una importante vía de aplicación de la relaxometria de RMN para el
control, estimación de la calidad y trazabilidad de la producción de derivados cárnicos

290
 V. Discusión integradora

de elevada calidad y valor añadido. Una de las ventajas más interesantes de los equipos
de IRM es que son lo suficientemente grandes como para permitir el estudio de piezas
cárnicas enteras, por ejemplo, jamones curados sin deshuesar. Esto permitiría el trabajo
en continuo, siendo posible el acoplamiento de cintas transportadoras a los equipos
para un análisis detallado de las piezas, lo cual resultaría muy atractivo desde el punto
de vista productivo. Por otro lado, el empleo de relaxómetros, equipos específicos para
los estudios de relaxometría, permitiría disponer de herramientas de gran utilidad para
el análisis estructural con un ahorro de costes y espacio asociado, simplificando los
requerimientos técnicos.

291
 V. Discusión integradora

V.2. ANÁLISIS METABOLÓMICO DE DERIVADOS CÁRNICOS Y EXUDADOS

V.2.1. DERIVADOS CÁRNICOS

Los derivados cárnicos son sistemas heterogéneos y complejos desde el punto de

vista estructural y bioquímico. En la presente Tesis Doctoral se ha estudiado el perfil
metabólico de jamón curado (Trabajo 5) y embutidos crudos curados, tipo salchichón
(Trabajo 6). Los distintos compuestos presentes en estos productos, así como su
evolución durante el proceso tradicional de maduración condicionan su calidad sensorial
y particularidades. Para este fin se ha recurrido al potencial de la espectroscopía de 1H
RMN HRMAS, que permite el estudio de muestras semisólidas integras.

En el Trabajo 5 se empleó la metodología 1H RMN HRMAS para estudiar los cambios

en el perfil metabólico de la carne de cerdo blanco sometida a un proceso tradicional de
curado. Con este objetivo, se analizaron muestras en distintas etapas del proceso de
elaboración de jamón curado: pernil fresco, salado, postsalado, en la fase de secado y
en la fase de bodega. El análisis de componentes principales permitió establecer la
discriminación entre muestras y su agrupación en función de su etapa de maduración.
Como se mencionó anteriormente, a través del espectro de 1H RMN HRMAS se obtiene
información metabólica de la muestra mediante la monitorización de las señales de
resonancia de los metabolitos de bajo peso molecular. Así, es posible identificar ácidos
grasos, triglicéridos, fosfolípidos, hidratos de carbono, nucleótidos y derivados,
osmolitos, aminoácidos, dipéptidos y ácidos orgánicos, entre otros. El avance de la
maduración en jamón curado se tradujo en un incremento en las señales de ácidos
grasos, favorecida por la concentración de macromoléculas debido a la deshidratación,
y a la actividad enzimática (lipolisis), la degradación de nucleótidos, la reducción de las
señales correspondientes a carbohidratos, debido al consumo de azúcares, y el aumento
en las señales correspondientes a aminoácidos, debido a los fenómenos proteolíticos
implicados en el desarrollo del flavor (Toldrá, 2005), especialmente notable en la región
de los aminoácidos aromáticos, fenilalanina, tirosina y triptófano.

Este estudio constituye una aportación novedosa al ámbito cárnico, puesto que es el
primer trabajo, hasta donde los autores han podido averiguar, en el que se monitoriza

292
 V. Discusión integradora

la evolución del perfil metabólico del jamón curado durante su elaboración a partir de
muestras íntegras de tejido.

Un estudio similar se ha realizado en otros productos con largos periodo de

maduración, como es el queso de oveja de coagulación enzimática y pasta prensada
(Cruz-Díaz, 2016). En este caso fue posible discriminar las muestras en función del
tratamiento térmico recibido por la leche de origen (fresca o pasteurizada), origen
(Castilla la Mancha y Castilla León) y proceso de elaboración (industrial y tradicional).

Además, la espectroscopia de RMN ha permitido observar modificaciones

metabólicas durante procesos distintos al curado/maduración, por ejemplo, durante el
almacenamiento de ciertos miosistemas, como el salmón ahumado (Castejón et al.,
2010) o la carne de ternera (Castejón et al., 2015), en los que los fenómenos de
glucólisis, lipólisis, proteólisis o degradación de nucleótidos son transformaciones
comunes.

Volviendo a los derivados cárnicos, la evolución metabólica observada en el jamón

curado fue similar a la obtenida tras el análisis de muestras de embutidos crudos
curados. En el Trabajo 6 se aplicó la metodología 1H RMN HRMAS en combinación con
el análisis de componentes principales (PCA) para caracterizar metabólicamente el
salchichón, a partir de muestras intactas de producto, sin ningún tipo de manipulación
previa. Al igual que es estudio de jamón curado, se realizaron análisis de 1H RMN HRMAS
en distintos puntos del proceso de maduración: días 0, 2, 4, 7, 11 y 14. A partir de los
resultados obtenidos fue posible diferenciar entre las tres etapas principales que
caracterizan la producción de este tipo de embutidos. Se obtuvieron distintos y
específicos perfiles metabólicos para la etapa de formulación, fermentación y
maduración. La aplicación de PCA a la totalidad de los datos espectrales adquiridos
permitió la monitorización del proceso de fermentación, a través del componente
principal PC1, y la clasificación de las muestras en función de su tiempo de maduración
(PC2). El perfil metabólico de la etapa de formulación fue similar al obtenido para la
carne fresca, con la excepción de la región de los carbohidratos en la que se observaron
notables diferencias entre producto crudo y madurado, dado que la lactosa (disacárido
formado por glucosa y galactosa), la dextrina (polímeros de D-glucosa) y la dextrosa
(isómero D de glucosa) son ingredientes no cárnicos que fueron añadidos

293
 V. Discusión integradora

intencionadamente a la masa cárnica durante el proceso de elaboración de salchichón

con el fin de impulsar el crecimiento de los microorganismos presentes naturalmente
en la carne. Por ello, en las muestras de salchichón, las señales de los azúcares
(principalmente, glucosa y galactosa) fueron más intensas que en el producto fresco y
aparecieron, además, nuevas y características señales correspondientes a los protones
anoméricos de la dextrina.

En este punto, cabe destacar que durante el desarrollo de esta Tesis también se ha
realizado el estudio bioquímico sobre muestras de chorizo. Los datos obtenidos a partir
de estos experimentos mostraron, como era de esperar, que el perfil metabólico del
producto, así como su evolución durante la maduración era bastantes similares a los
obtenidos con el salchichón. En la Figura V.5 se muestra la ampliación de las zonas del
espectro en las que se observó mayor evolución de señales para este producto. Estos
resultados forman parte de una comunicación “Caracterización metabólica de chorizo
artesanal mediante espectroscopía de RMN”, presentada en las Jornadas UCM de
Investigación en Ciencias de la Salud para Pregraduados (Madrid, 2016).

Figura V.5. Principales cambios observados en los espectros de chorizo durante los días 0, 2 y 14 de maduración. Val:
valina; Ile: isoleucina; Ala: alanina; AA: ácido acético; EtOH: etanol; Glu: glucosa; Phe: fenilalanina; Trp: triptófano;
Tyr: tirosina.

294
 V. Discusión integradora

Las principales diferencias detectadas entre los espectros de salchichón y chorizo se

observaron en el día 0 de producción, es decir, en la etapa de formulación, y, más
concretamente, en la región espectral correspondiente a los carbohidratos. Este hecho
se debe a que, en ambos casos, los ingredientes no cárnicos añadidos a la masa para la
consecución de las características finales fueron distintos. De hecho, los espectros de
chorizo están marcados por la presencia de unas señales muy intensas, ausentes en
salchichón, y que se han atribuido a la presencia de sacarosa (Figura V.6), azúcar añadido
intencionadamente en este tipo de derivado cárnico como fuente de energía para los
microrganismos.

Figura V.6. Comparación de espectros salchichón vs chorizo en día 0 de producción. A: espectros completos. B:
ampliación de la región de carbohidratos. C: asignación de las señales características de la sacarosa.

Respecto a la fermentación en las muestras de salchichón, esta etapa estuvo marcada

por la reducción significativa de la intensidad de las señales correspondientes a los
azúcares ( y -glucosa, galactosa y dextrina) debido a su rápido consumo por parte de
los microorganismos de la carne, principalmente bacterias ácido-lácticas (BAL). Al mismo
tiempo, se produjo un incremento de las señales relacionadas con aquellos compuestos

295
 V. Discusión integradora

que son, predominantemente, de síntesis microbiana. En consecuencia, se observó un

incremento significativo en las señales de etanol, ácido acético, ácido láctico y 2-3-
butanodiol durante las primeras 48 horas del proceso debido, principalmente, a la
acción de BAL homo y heterofermentivas. En la Figura V.7 se muestran las principales
vías de fermentación de los azúcares, los microorganismos implicados en cada caso y los
productos finales de la fermentación.

Figura V.7. Principales vías de fermentación de azúcares, microorganismos implicados y productos finales (Müller,
2008).

Durante estos primeros días del proceso y, también relacionado con la actividad
microbiana, comenzó a desencadenarse una proteólisis temprana que se tradujo en el
aumento de las señales correspondientes a aminóacidos: Ile, Leu, Val, α-Ala Lys, Arg,
Met y Glu aumentaron durante la etapa fermentativa, así como las señales aromáticas
de Phe, Tyr, Trp y Tyrm.

Además, se produjeron cambios en los nucleótidos, de manera que ATP/ADP/AMP,

IMP e Ino experimentaron un descenso significativo, mientras que Hx se incrementó
notablemente en esta etapa. Estos cambios concuerdan con el proceso de degradación
de ATP en el músculo, de acuerdo al cual: ATP → ADP → AMP → IMP → Ino → Hx → Xa
→ ácido úrico.

296
 V. Discusión integradora

Finalmente, durante la etapa de maduración, las señales asociadas al metabolismo

microbiano se redujeron significativamente o incluso desaparecieron. Por otra parte, los
signos de la proteólisis y de la lipólisis se hicieron cada vez más evidentes, puesto que el
incremento de las señales de aminoácidos fue notable y las intensidades relativas de las
señales de ácidos grasos libres también sufrió un incremento hacia el final del proceso
de elaboración. Del mismo modo, la degradación de ATP fue notable también durante
esta etapa.

Al igual que en el caso del jamón curado, el estudio en embutidos resulta muy
novedoso, puesto que, hasta donde los autores han podido averiguar, es la primera vez
que se aplica la espectroscopía 1H HRMAS al análisis de muestras íntegras de embutidos
crudos curados con el fin de obtener el perfil metabólico completo. El trabajo revela que
la RMN es una herramienta con gran potencial para el análisis de muestras intactas, con
el fin de obtener información cualitativa (identificación de metabolitos) y cuantitativa
(integración de señales y variación) del producto.

La metodología 1H HRMAS es una técnica rápida y efectiva para monitorizar los

cambios asociados a la maduración de derivados cárnicos y puede resultar muy útil para
evaluar las variaciones del metaboloma en función de las diferentes condiciones de
procesado.

V.2.2. EXUDADOS CÁRNICOS

Como se ha comentado previamente, los miosistemas son productos alimenticios de

origen animal constituidos íntegramente por la parte muscular del animal del que
proceden (carne o pescado) y cuyas características finales, tanto sensoriales como
tecnológicas, están condicionadas por la fracción proteica miofibrilar mayoritaria.

El agua es el principal componente de la carne y el pescado y puede liberarse como

una manifestación de la mayor o menor capacidad de retención que de este
componente tenga la estructura cárnica. El agua liberada, junto con las sustancias
solubilizadas, constituye el exudado que se aprecia sobre las superficies de corte de las
porciones musculares y en su entorno. La cantidad de exudado liberado de una pieza
muscular depende de diversos factores físicos y bioquímicos.

297
 V. Discusión integradora

Ante la facilidad de obtención de los exudados y la no afectación o deterioro de la

pieza cárnica de procedencia que su uso, como muestra de análisis, implicaría, nos
planteamos evaluar la aptitud de este material para monitorizar distintos tipos de
procesos en varios miosistemas mediante la espectroscopía RMN.

En este sentido, se realizaron estudios para determinar la cercanía entre la

composición de metabolitos de la carne y la del exudado liberado, y si el estudio de los
exudados reflejaría, a nivel metabólico, los cambios acontecidos en las porciones
cárnicas de procedencia debidos a distintos factores o tratamientos. Las primeras
experiencias se realizaron con exudados procedentes de carne de ternera tratada con
electrones acelerados. Este estudio preliminar se llevó a cabo con el fin de determinar
si el estudio de los exudados cárnicos por RMN podía ser un método analítico no invasivo
que permitiera evaluar el efecto del tratamiento de irradiación en carne de vacuno. El
tratamiento con electrones acelerados se utiliza para ampliar la vida útil de los alimentos
y obtener un producto final seguro sin alterar sus características sensoriales. Las
normativas que regulan este tratamiento varían de unos países a otros, siendo
obligatoria la indicación del tratamiento en el etiquetado. Para facilitar el control e
inspección de productos en este campo, es importante disponer de métodos analíticos
que permitan detectar y cuantificar el tratamiento aplicado.

El análisis por RMN del exudado liberado por la carne de vacuno irradiado permitió
seguir de forma indirecta la evolución de la matriz miofibrilar frente al tratamiento con
electrones acelerados. En conjunto, se observaron diferencias significativas en las
señales correspondientes a carnosina, carnitina, glutamato y metionina, entre muestras
irradiadas y no irradiadas (Figura V.8).

Parte de los resultados obtenidos en este estudio se presentaron en el 2ª Congreso

Internacional de Seguridad Alimentaria ACOFESAL (Madrid, 2013), con el título,
“Viabilidad del análisis de exudados cárnicos por RMN para el estudio de carne tratada
con electrones acelerados”. De este estudio se concluyó que el análisis de exudados por
RMN puede utilizarse como un método no invasivo, fácil y rápido para la trazabilidad de
carnes irradiadas.

298
 V. Discusión integradora

Figura V.8. Ampliación de la región del espectro de 1H RMN de exudado de ternera que muestra la diferencia en la
intensidad de señales en muestras irradiadas y no irradiadas.

Dado que las primeras experiencias demostraron claramente el potencial de los

exudados cárnicos como sustrato para el análisis no destructivo mediante RMN, en la
presente Tesis Doctoral se planteó continuar en esta línea de trabajo para profundizar y
optimizar la aplicación de esta metodología. El estudio realizado constituye el Trabajo
7, en el que se ha evaluado el efecto conservador de la irradiación y la estimación del
tratamiento aplicado mediante el estudio metabólico de exudados de carne de porcino.
Como se ha mencionado previamente, la aplicación de electrones acelerados (radiación
β) es una tecnología con un gran potencial para extender la vida útil de los alimentos.
Sin embargo, este tratamiento puede modificar algunas características que pueden
condicionar la aceptación por parte del consumidor y la comercialización del producto.
El estudio de los cambios que se producen en los metabolitos durante la aplicación de
este tipo de tratamiento resulta de gran interés, tanto para detectar productos
irradiados como para determinar el límite de su uso. En este trabajo, se realizó un
estudio mediante 1H RMN HRMAS de exudados procedentes de carne de cerdo con el
objetivo de monitorizar los efectos de la dosis (0, 1, 2 y 6 kGy) de irradiación y del tiempo
de almacenamiento en refrigeración (0, 6 y 12 días) sobre el metaboloma cárnico. Para
comprobar la reciprocidad del perfil metabólico de la carne de porcino y del exudado
cárnico liberado, se realizó un análisis inicial de los espectros de la carne y de su exudado
cárnico (Trabajo 7). El estudio comparativo de ambos espectros demostró la
equivalencia entre los metabolitos detectables en ambas muestras. Las diferencias
apreciadas entre los espectros cárnicos y de exudado se redujeron a las regiones
correspondientes a componentes lipídicos. En ambos casos, espectros de 1H RMN

299
 V. Discusión integradora

permitieron la identificación de los principales componentes del exudado de cerdo:

carbohidratos, nucleótidos, aminoácidos, dipéptidos, ácidos grasos y ácidos orgánicos.
El análisis quimiométrico de los datos adquiridos mediante PCA permitió clasificar las
muestras de exudados en función de la dosis de irradiación aplicada y el tiempo de
almacenamiento. A través del análisis de los espectros fue posible monitorizar los
efectos de la irradiación, siendo evidentes numerosos cambios metabólicos con el
tiempo de almacenamiento. Se observó, por ejemplo, la degradación de azúcares,
glucosa y manosa, así como de derivados nucleotídicos, Inosina e IMP, aminoácidos y
dipéptidos, como el ácido glutámico y el GABA, o diversos ácidos orgánicos, como el
ácido acético. La intensidad de los cambios observados fue tanto menor cuanto mayor
fue la dosis de irradiación aplicada, de acuerdo con el efecto conservador del
tratamiento. Además, fue posible correlaciones entre el valor de la integral de los
metabolitos con el tiempo de almacenamiento y la dosis de irradiación (R2 = 0,96) y
obtener modelos predictivos.

En conjunto, el análisis del perfil metabólico de exudados de cerdo aportó valiosa

información sobre la reducción del deterioro de la muestra por efecto de la irradiación,
siendo posible la monitorización y evaluación tanto de la conservación como de la dosis
de irradiación aplicada. De forma indirecta, a mayor dosis de irradiación, mayor
ralentización de las reacciones/procesos de degradación.

Este estudio podría constituir el primer paso para el desarrollo de un nuevo método
de análisis para el control de la conservación de la carne y para la evaluación del
tratamiento de irradiación. La combinación de la metodología 1H RMN HRMAS junto con
el empleo de exudados cárnicos, permite el establecimiento de un protocolo de análisis
completamente no invasivo, no destructivo, con grandes ventajas para la industria
cárnica, desde el punto de vista de la rapidez analítica y la preservación del producto.

Cabe destacar que los resultados obtenidos en relación con los exudados
procedentes de miositemas no se limitan solamente a muestras cárnicas, sino que
también se han realizado pruebas con resultados muy satisfactorios en matrices
miofibrilares de pescado.

300
 V. Discusión integradora

En este contexto, se obtuvo la información metabólica extraída mediante el análisis

por espectroscopía de 1H RMN HRMAS del exudado de merluza (Merluccius merluccius)
y se correlacionó con el tiempo de almacenamiento y el grado de frescura del pescado.
El procedimiento de estudio seguido consistió en la recolección de exudados liberados
por filetes de merluza comercializados en distintos establecimientos. La toma de
muestras se efectuó a distintos tiempos de su almacenamiento en refrigeración (hasta
12 días). Parte de los resultados obtenidos se recogen en el trabajo “Análisis
metabolómico del exudado de merluza (Merluccius merluccius): potencial como
indicador de la conservación del pescado”, presentado al VIII Congreso CYTA-CESIA
(Badajoz, 2015). En la Figura V.9 se muestran ampliaciones de distintas regiones del
espectro de 1H RMN donde se observa la variación de diferentes metabolitos con el
almacenamiento desde el día 1 hasta el día 12 (A). El estudio quimiométrico mediante
PCA de los espectros 1H de los exudados de merluza, permitió clasificar las muestras de
acuerdo al tiempo de almacenamiento en refrigeración (4 ºC), donde cada uno de los
puntos representa un espectro de 1H RMN a distintos días de almacenamiento (Figura
V.9. B).

Figura V.9. Regiones del espectro de 1H RMN que muestra la variación de metabolitos en los días 1 y 12 de
almacenamiento(A) y PCA (B). OTMA: óxido de trimetilamina, DMA: dimetilamina, IMP: Inosina monofosfato

El estudio cuantitativo de los datos espectrales permitió conocer la variación de la

concentración de distintos metabolitos relevantes, considerados, indicadores de la
frescura del pescado. En esta línea, se detectó una reducción de IMP e inosina a medida
que avanzó el tiempo de almacenamiento, ya que, como es sabido, uno de los primeros

301
 V. Discusión integradora

cambios que se producen tras la muerte del animal es la degradación del ATP para
formar adenosina difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP), inosina monofosfato
(IMP), inosina (Ino) e hipoxantina (Hx). La relación de estos metabolitos constituye el
valor o índice K, utilizado como indicador de frescura del pescado en diversos países. La
espectroscopía de 1H RMN HRMAS permitió seguir la evolución de IMP a Ino y de Ino a
Hx. Además, este espectro también permitió identificar las señales del óxido de
trimetilamina (OTMA) y trimetilamina (TMA), cuya relación también puede utilizarse
como indicador de frescura. Los datos obtenidos mostraron claramente una reducción
de OTMA y un incremento de TMA con el tiempo de almacenamiento. Estos resultados
concuerdan con los obtenidos en estudios preliminares realizados en muestras de
salmón (Castejón et al., 2010; Castejón et al., 2016).

Figura V.10. Ampliación de región del espectro de 1H RMN de exudados de salmón que muestra el aumento de TMA
con el tiempo de almacenamiento. TMA: trimetilamina.

Un estudio similar se ha realizado con el exudado liberado por porciones de salmón

(Salmo salar) para evaluar cambios durante el almacenamiento. Los resultados
obtenidos constituyen el estudio titulado “A preliminary study of Atlantic salmon
(Salmo salar) exudates by NMR spectroscopy to evaluate fresh fish quality” presentado
en el Kiel Food Science Symposium (Kiel, 2014). Como ocurrió con los exudados de
merluza, los espectros de 1H RMN de exudados de salmón permitieron observar el

302
 V. Discusión integradora

incremento y el descenso de Ino, asociado a la degradación de nucleótidos. Así mismo

también se detectó la degradación de azúcares y el incremento de TMA (Figura V.10).
Se analizaron tanto las muestras de exudado con las de músculo fresco, concluyendo
que se pueden monitorizar los mismos procesos de degradación en ambas matrices y
que dichos procesos correlacionan con los previamente descritos por nuestro grupo
sobre muestras de salmón ahumado. (Castejón et al., 2016).

De los estudios preliminares realizados en exudado de pescado se concluye que este

sustrato puede utilizarse como matriz analítica alternativa para estudiar la composición
de pescado. Los resultados mostrados en la presente Tesis Doctoral (Trabajo 7)
permiten realizar la misma conclusión respecto a los exudados de matrices cárnicas. En
conjunto, los trabajos realizados hasta la actualidad indican que el estudio mediante
espectroscopia de RMN de los exudados liberados es una metodología eficaz para
determinar la calidad y el grado de frescura de miosistemas.

En conjunto, en el desarrollo de esta Tesis Doctoral, se ha recurrido al empleo de

distintas metodologías de RMN para el estudio de varias matrices de origen cárnico con
un doble afán: por un lado, afianzar los conocimientos sobre procesos de producción,
conservación y almacenamiento de productos cárnicos y por otro, profundizar en la
adaptación de las distintas técnicas de RMN y consolidar su potencial como herramienta
rápida y eficaz para el análisis no invasivo de alimentos.

303
VI. Conclusiones / Conclusion

305
 VI. Conclusiones

Los principales resultados del trabajo presentado en esta Tesis Doctoral se pueden
resumir en las siguientes conclusiones:

1. La relaxometría T2 permite la monitorización del proceso de elaboración de

jamón curado y embutidos crudos curados mediante la señal asociada a los
protones del entorno de las miofibrillas (T21).

2. Las distribuciones de los tiempos de relajación T2 son características de cada

proceso de elaboración, y pueden utilizarse como marcadores de maduración en
el jamón curado (T2´) y de gelificación en los embutidos crudos curados (T22), así
como del efecto de la adición de proteasas en modelos cárnicos.

3. Las curvas de distribución T2 obtenidas para distintos miosistemas pueden

relacionarse con el contenido acuoso y de sal, así como con la actividad de agua
y parámetros de textura.

4. Los tiempos de relajación (T1 y T2) y el coeficiente de difusión aparente (CDA)

obtenidos mediante la Imagen de Resonancia Magnética (IRM) permiten obtener
modelos de predicción para la estimación de parámetros de textura y
características fisicoquímicas de jamón curado.

5. La espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear de protón (1H RMN), junto

con la sonda de alta resolución de ángulo mágico (HRMAS, High Resolution Magic
Angle Spinning) permite el análisis de muestras íntegras de jamón curado y
embutidos crudos curados, haciendo posible la monitorización de los procesos
de glucólisis, proteólisis y lipólisis que caracterizan su maduración.

6. La RMN metabolómica permite monitorizar los cambios producidos durante la

maduración de miosistemas y puede utilizarse para su clasificación y para
estimar el tiempo de curado.

7. Los espectros de RMN de protón (1H RMN) de los exudados liberados por la carne
de cerdo son un fiel reflejo de los obtenidos de los músculos de los que provienen
y permiten monitorizar los mismos procesos descritos en las muestras sólidas.
Por tanto, se propone este material para el análisis quimiométrico no invasivo,

307
 VI. Conclusiones

con un elevado potencial para el estudio y control de la calidad de la carne de

porcino.

8. Los exudados procedentes de carne de cerdo se proponen como material para

el análisis quimiométrico no invasivo, con un elevado potencial para el estudio y
control de la calidad de la carne de porcino.

9. La RMN metabolómica de los exudados liberados por la carne permite estimar el

tiempo de almacenamiento y evaluar el efecto conservador del tratamiento con
radiaciones ionizantes.

Conclusión final

Las distintas técnicas de Resonancia Magnética Nuclear tienen un elevado potencial

para el análisis de la estructura y composición de miosistemas. Los datos obtenidos
pueden utilizarse en la industria cárnica para la monitorización del proceso de
elaboración, estimación del tiempo de almacenamiento y predicción de características
fisicoquímicas y de textura.

308
 VI. Conclusion

The principal results of the work presented in this Doctoral Thesis can be summarized
in the following conclusions:

1. T2 NMR relaxometry allows to monitor the manufacturing process of dry cured

ham and raw cured sausages by means of the signal associated to the protons of
the myofibrillar environment (T21).

2. T2 distributed data are typical of each production process and T2 populations can
be used as indicators of the ripening stage in dry cured ham (T2') and of protein
gel formation in the raw cured sausages (T22), as well as of the effect of the
addition of proteases in meat models.

3. T2 distributions obtained for different myosistems can be related to the water

and salt content, as well as to the water activity and textural parameters.

4. The relaxation times (T1 and T2) and the apparent diffusion coefficient (ADC)
calculated by Magnetic Resonance Imaging (MRI) allow to obtain predictive
models for the estimation of textural parameters and physicochemical
characteristics of dry cured ham.

5. Proton nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy, together with the
high resolution magic angle spinning (HRMAS) probe allows the analysis of intact
samples of dry cured ham and raw cured sausages, making possible the
monitoring of the glycolysis, proteolysis and lipolysis processes typical of
ripening.

6. NMR metabolomics allows to monitor the changes happened during the

maturing process of myosistems and it can be used for samples discrimination
and for estimating the ripening time.

7. Proton NMR spectra (1H RMN) of exudates released from pork are a faithful
reflection of the obtained for the muscle which they come from and allow to
monitor the same processes described in the solid samples. Therefore, pork
exudates are proposed as suitable matrix for the non-invasive chemometric
analysis, with a high potential for the study and control of pork quality.

309
 VI. Conclusion

8. NMR metabolomics of pork exudates allows to estimate the storage time and to
evaluate the conservative effect of the E-beam treatment.

Final conclusion

The different NMR-based techniques have a high potential for the analysis of the
structure and composition of myosistems. The obtained information can be in used in
the meat industry for the monitoring of the manufacturing process, estimation of the
storage time and prediction of physicochemical and textural features.

310
VII. Bibliografía

311
 VII. Bibliografía

Aberle, E. D.; Forrest, J. C.; Gerrard, D. E.; Mills, E.W. (2012). Principles of Meat Science. 5th ed.
Kendall Hunt Publishing Company, Dubuque, IA.

Albarracín, W.; Sánchez, I. C.; Grau, R.; Barat, J. M. (2011). Salt in food processing; usage and
reduction: a review. Int. J. Food Sci. Technol., 46, 1329-1336.

Andersen, R.H.; Andersen, H.J.; Bertram, H.C. (2007). Curing-induced water mobility and
distribution within intra- and extra-miofibrilar spaces of three pork qualities. Int. J. Food
Sci. Technol., 42, 1059-1066.

Andrés, A. I.; Cava, R.; Martin, D.; Ventanas, J.; Ruíz, J. (2005). Lipolysis in dry-cured ham:
Influence of salt content and processing conditions. Food Chem., 90, 523-533.

ANICE (Asociación Nacional de Industrias de la Carne de España). (2015).

Antequera, M. T. & Martín, L. (2001). Reacciones químicas y bioquímicas que se desarrollan

durante la maduración del jamón Ibérico. En: Tecnología del jamón Ibérico, J. Ventanas
(Ed), pp. 293-323. Madrid: Mundi Prensa.

Antequera, T.; Caro, A.; Rodríguez, P. G.; Pérez, T. (2007). Monitoring the ripening process of
Iberian ham by computer vision on magnetic resonance imaging. Meat Sci., 76, 561-567.

Arnau, J.; Guerrero, L.; Casademont, G.; Gou, P. (1995). Physical and chemical changes in differ
ent zones of normal and PSE dry-cured hams during processing. Food Chem., 52, 63-69.

Aue, W.; Bartholdi, E.; Ernst, R. R. (1976). Two-dimensional spectroscopy. Application to

nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys., 64, 2229-2246.

Batlle, N.; Aristoy, M. C.; Toldrá, F. (2000). Early postmortem detection of exudative pork meat
based on nucleotide content. J. Food Sci., 65, 413-416.

Bello, J. (2008). Jamón curado. Aspectos científicos y tecnológicos. Ed. Díaz de Santos, Madrid.
ISBN: 9788479788841.

Bligh, E. G., Dyer, W. J. (1959). Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. Can J Biochem
Phys, 37, 911-917.

B.O.E. (2002). Real Decreto 142/2002, de 1 de febrero, por el que se aprueba la lista positiva
de aditivos distintos de colorantes y edulcorantes para su uso en la elaboración de
productos alimenticios, así como sus condiciones de utilización. Boletín Oficial del
Estado, 44, 20/2/2002, 6756-6799.

B.O.E. (2008). Real Decreto 2129/2008, de 26 de diciembre, por el que se establece el

Programa nacional de conservación, mejora y fomento de las razas ganaderas. Boletín
Oficial del Estado, 23, 27/01/2009, 9211-9242.

B.O.E. (2014). Real Decreto 474/2014, de 13 de junio, por el que se aprueba la norma de
calidad de derivados cárnicos. Boletín Oficial del Estado, 147, 18/06/2014, 46058-46078.

Bloch, F. (1946). Nuclear induction. Phys. Rev., 70, 460-464.

Belitz, H. D.; Grosch, W.; Schieberle, P. (2012). Química de los alimentos. 3º ed. Ed. Acribia,
Zaragoza. ISBN: 978-84-200-1162-2.

Berendsen, H. J. C. (1992). Rationale for using NMR to study water relations in foods and
biological tissues. Trends Food Sci. Technol., 3, 202-205.

313
 VII. Bibliografía

Bertram, H. C.; Andersen, H. J. & Karlsson, A. H. (2001a). Comparative study of low-field NMR
relaxation measurements and two traditional methods in the determination of water
holding capacity of pork. Meat Sci, 57, 125-132.

Bertram, H. C.; Karlsson, A. H.; Rasmussen, M.; Pedersen, O. D.; Dønstrup, S.; Andersen, H. J.
(2001b). Origin of multiexponential T2 relaxation in muscle myowater. J Agric Food
Chem, 49, 3092-100.

Bertram, H. C.; Dønstrup, S.; Karlsson, A. H., Andersen, H. J. (2002). Continuous distribution
analysis of T2 relaxation in meat: An approach in the determination of water-holding
capacity. Meat Sci., 60, 279-285.

Bertram, H. C. & Andersen, H. J. (2004). Applications of NMR in meat science. Annu. Rep. NMR
Spectro., 53,158-202.

Bertram, H. C.; Kristensen, M.; Andersen, H. J. (2004). Functionality of myofibrillar proteins as

affected by pH, ionic strength and heat treatment: A low-field NMR study. Meat Sci., 68,
249-256.

Bertram, H.C. & Andersen, H. J. (2006). Proton NMR Relaxometry in Meat Science. Modern
Magnetic Resonance, Springer, Netherlands, 1729-1733.

Bertram, H. C.; Andersen, H. J. (2007). NMR and the water-holding issue of pork. J. Anim.
Breed. Genet., 124, 35-42.

Bertram, H. C.; Meyer, R. L.; Zhiyun, W.; Zhou, X.; Andersen, H. J. (2008). Water distribution
and microstructure in enhanced pork. J. Agri. Food Chem., 56, 7201-7207.

Budiman, M.; Stroshine, R.L.; Cornillon, P. (2002). Moisture measurement in cheese analogue
using stretched and multi-exponential models of the magnetic resonance T2 relaxation
curve. Journal of Dairy Research, 69, 619-632.

Caplice, E. & Fitzgerald, G.F. (1999). Food fermentations: role of microorganisms in food
production and preservation. Int. J. Food Microbiol., 50, 131-149.

Caro, A.; Durán, M.; Rodríguez, P. G.; Antequera, T.; Palacios, R. (2003). Mathematical
morphology on MRI for the determination of Iberian ham fat content. En: Sanfeliu A.,
Ruiz-Shulcloper J. (eds). Progress in Pattern Recognition, Speech and Image Analysis.
CIARP 2003. Lecture Notes in Computer Science, vol. 2905. Springer, Berlin,
Heidelberg.

Carr, H. Y. & Purcell, E. M. (1954). Effects of Diffusion on Free Precession in Nuclear Magnetic
Resonance Experiments. Phys. Rev., 94, 630-638.

Carrasco, J. A. (2001). Secaderos. En: Enciclopedia de la carne y de los productos cárnicos,

Martín & Macías(Ed), pp. 995-1.020, Plasencia, Cáceres.

Castejón, D.; Villa, P.; Calvo, M. M.; Santa‐María, G.; Herraiz, M.; Herrera, A. (2010). 1H‐HRMAS
NMR study of smoked Atlantic salmon (Salmo salar). Magn. Reson. Chem., 48, 693-703.

Castejón, D.; García-Segura, J. M.; Escudero, R.; Herrera, A.; Cambero, M. I. (2015).
Metabolomics of meat exudate: Its potential to evaluate beef meat conservation and
aging. Anal. Chem. Acta, 901, 1-11.

314
 VII. Bibliografía

Castejón, D.; García-Segura, J.M.; Herrera, A.; Cambero, M.I. (2016). Effect of e-beam
treatment on the methylamine compounds in Atlantic salmon. Food Control, 60, 455-
460.

Capitani, D. ;Mannina, L.; Proietti, N.; Sobolev, A.; Tomassini, A.; Miccheli, A.; Di Cocco, M.;
Capuani, G.; De Salvador, R.; Delfini, M. (2010). Monitoring of metabolic profiling and
water status of Hayward kiwifruits by nuclear magnetic resonance. Talanta, 82, 1826-
1838.

Cernadas, E.; Carrio, P.; Rodríguez, P. G.; Muriel, E.; Antequera, T. (2005). Analyzing magnetic
resonance images of Iberian pork loin to predict its sensorial characteristics. Comput.
Vis. Image Underst., 98, 345-361.

Charlton, J. A. (2009). High resolution NMR analysis of complex mixtures. En: M. Gudjónsdóttir,
P. S. Belton, & G. A. Webb (Eds.), Magnetic resonance in food science: challenges in a
changing world (pp. 3-12). Cambridge: Royal Society of Chemistry.

Chang, S. F., Huang, T. C., Pearson, A. M. (1996). Control of the dehydration process in
production of intermediate-moisture meat products: a review. En: Advances in food and
mutrition research, Taylor, S.L. (Ed), vol. 39, pp 71-161. Academic Press, Inc., San Diego,
California, EE.UU.

Cifuentes, A. (2013). Foodomics: Advanced mass spectrometry in modern food science and
nutrition, Vol. 52, John Wiley and Sons (Ed), Nueva York-USA.

Codex Alimentario (2005). CAC/RCP 58/2005: Código de Prácticas de Higiene para la Carne.
Disponible en: www.codexalimentarius.org/normas-oficiales/lista-de-las-normas.
Documento consultado: Marzo 2017.

Córdoba, J. J.; Antequera, T.; García, C.; Ventanas, J.; López-Bote, C.; Asensio, M. A. (1994).
Evolution of free amino acids and amines during ripening of Iberian cured ham. J. Agri.
Food Chem., 42, 2296-2301.

Cruz-Díaz, K., Fernández-Valle, M.E., García-García, A.B., Castejón, D.; Escudero, R.; Romero de
Ávila, M.D., Cambero, M.I. (2014). Relaxometry and MRI study of Manchego cheese
during ripening and its relationship with rheological behavior. XII International
Conference on the Applications of Magnetic Resonance in Food Science: Defining Food by
Magnetic Resonance, Cesena, Italia.

Cruz, K.P. (2017). Aplicación de técnicas de RMN al análisis de quesos de oveja y películas
comestibles. Evaluación de su potencial para la supervisión y predicción de
características reológicas y estructurales. TESIS DOCTORAL

Damez, J. L. & Clerjon, S. (2008). Meat quality assessment using biophysical methods related to
meat structure. Meat Sci, 80, 132-149.

DeMasi, T. W.; Wardlaw, F. B.; Dick, R. L; Acton, J. C. (1990). Non-protein nitrogen (NPN) and
free aminoacids contents of dry, fermented and non-fermented sausages. Meat Sci., 27,
1-12.

Díaz, O.; Fernández, M.; García de Fernando, G. D.; De la Hoz, L.; Ordóñez, J. A. (1993). Effect of
the addition of Pronase E on the proteolysis in dry fermented sausages. Meat Sci., 34,
205-216.

315
 VII. Bibliografía

Díaz, O.; Fernández, M.; García de Fernando, D. G.; de la Hoz, L.; Ordóñez, J. A. (1997).
Proteolysis in dry fermented sausages: the effect of selected exogenous proteases. Meat
Sci., 46, 115-128.

Dolata, W.; Piotrowska, E.; Waidzik, J.; Tritt-Goc, J. (2004). The use of the MRI technique in the
evaluation of water distribution in tumbled porcine muscle. Meat Sci., 67, 25-31.

Emsley, J. & Feeney, J. (2007). Forty years of progress in nuclear magnetic resonance
spectroscopy. Prog. Nucl. Magn. Reso. Spectrosc., 50, 179-198.

Estévez, M.; Morcuende, D.; Ventanas, S. (2009). Determination of oxidation. En: Handbook of
processed meats and poultry analysis, Press, Taylor y Francis Group (Ed), pp. 141-162.
Boca Raton, Florida.

Fantazzini, P.; Bortolotti, V.; Garavaglia, C.; Gombia, M.; Riccardi, S.; Schembri, P. (2005).
Magnetic resonance imaging and relaxation analysis to predict noninvasively and non-
destructively salt-to-moisture ratios in dry-cured ham. Magn. Reson. Imaging, 23, 359-
361.

Farouk, M.M.; Zhang, S.X. Waller, J. (2005). Meat spaghetti tensile strength and extensibility as
indicators of the manufacturing quality of thawed beef. J. Food Quality, 28, 452-466.

Farrán, A.; Zamora, R.; Cervera, P. (2003). Tablas de composición de alimentos del CESNID. Ed.
Mc- Graw-Hill / Interamericana y Edicions Universitat de Barcelona.

Fernández, M.; Ordóñez, J. A.; Bruna, J. M.; Herrans, B.; de la Hoz, L. (2000). Accelerated
ripening of dry fermented sausages. Food Sci. Technol., 11, 201-209.

Fernández, M.; Ordóñez, J.A.; Cambero, I.; Santos, C.; Pin, C.; Hoz, L. (2007). Fatty acid
composition of selected varieties of Spanish dry ham related to their nutritional
implications. Food Chem., 101, 107-112.

Fiehn, O. (2001). Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to

understand metabolic networks. Comp. Funct. Genomics, 2, 155-168.

Fiehn, O. (2002). Metabolomics the link between genotypes and phenotypes. Plant Molec.
Biol., 48, 155-171.

Flores, J. (1997). Mediterranean vs northern European meat products. Processing technologies

and main differences. Food Chem., 59, 505-510.

Flores, M.; Aristoy, M. C.; Toldrá, F. (1996). HPLC purification and characterization of soluble
alanyl aminopeptidase from porcine skeletal muscle. J. Agric. Food Chem., 44, 2578-
2583.

Flores, M.; Aristoy, M. C.; Antequera, T.; Barat, J. M.; Toldrá, F. (2009). Effect of prefreezing
ham on endogenous enzyme activity during the processing of Iberian dry-cured hams.
Meat Sci., 82, 241-246.

Froehlich, D. A.; Gullett, E. A.; Usborne, W. R. (1983). Effect of nitrite and salt on the color,
flavor and overall acceptability of ham. J. Food Sci., 48, 152-154.

316
 VII. Bibliografía

Gálvez, M. M.; Farías A. M.; Asahi, K. T.; & Bravo C. E. (2005). Cálculo de tiempos T1 y T2 in
vitro. Revista chilena de radiología, 11, 109-115

Gandemer, G. (2002). Lipids in muscle and adipose tissues, changes during processing and
sensory properties of meat products. Meat Sci., 62, 309-321.

García-Cañas, V.; Simó, C.; Herrero, M.; Ibáñez, E.; Cifuentes, A. (2012). Present and future
challenges in food analysis: Foodomics. Anal. Chem., 84, 10150-10159.

García de Fernando, D. G.; Fox, P. F. (1991). Study of proteolysis during the ripening of a dry
fermented pork sausage. Meat Sci., 30, 367-383.

García-García, A. B.; Larsen, L. B.; Cambero, M. I.; Cruz-Díaz, K.; Bertram, H. C. (2015).
Proteolysis process in fermented sausage model systems as studied by NMR
relaxometry. J. Agric. Food Chem., 63, 3039-3045.

García- Márquez, I., Cambero, M. I., Ordóñez, J. A., Cabeza, M. C. (2012). Shelf life extension
and sanitation of fresh pork loin by E-beam treatment. J Food Protec.,75, 2179-2189.

Godber, J. S. (1994). Nutritional Value of Muscle Foods. En: Muscle Foods. Meat Poultry and
Seafood Technology. D.M. Kinsman, A.W. Kotula y B.C. Breidenstein (Eds). Chapman y
Hall, New York.

Gordon, A.; Barbut, S. (1992). Mechanisms of meat batter stabilization: a review. Crit. Rev.
Food Sci. Nutr., 32, 299-332.

Gou, P. & Comaposada, J. (2000). La transferencia de sal en el interior del jamón curado.
Eurocarne, 86, 35-64.

Guiheneuf, T. M.; Tessier, J. J.; Herrod, N. J.; Hall, L. D. (1996). Magnetic resonance imaging of
meat products: Automated quantitation of the NMR relaxation parameters of cured
pork, by both bulk NMR and MRI methods. J. Sci. Food Agri., 71, 163-173.

Hanson, S. W. F.; Olley J. (1963). Application of the Bligh and Dyer method of lipid extraction to
tissue homogenates. Biochem J., 89,101-102.

Herranz, B.; de la Hoz, L.; Hierro, E.; Fernández, M.; Ordóñez, J. A. (2005). Improvement of the
sensory properties of dry‐fermented sausages by the addition of free aminoacids. Food
Chem., 91, 673-682.

Herrero, A. M.; Cambero, M. I.; Ordonez, J. A.; Castejon, D.; Romero de Avila, M. D.; de la Hoz,
L. (2007). Magnetic resonance imaging, rheological properties, and physicochemical
characteristics of meat systems with fibrinogen and thrombin. J Agri Food Chem, 55:
9357–9364.

Herrero, A. M.; de la Hoz, L.; Ordóñez, J. A.; Herranz, B.; Romero de Ávila, M. D.; Cambero, M. I.
(2008). Tensile properties of cooked meat sausages and their correlation with texture
profile analysis (TPA) parameters and physico-chemical characteristics. Meat Sci., 80,
690-696.

Herrero, A.M.; de la Hoz, L.; Ordóñez, J.A.; Castejón, D.; Romero de Ávila, M.D.; Cambero, M.I.
(2009). Magnetic resonance imaging studies of the cold-set gelation on plasma powder
and meat systems. Food Res. Int., 42, 1362-1372

317
 VII. Bibliografía

Honikel, K. (2008). The use and control of nitrate and nitrite for the processing of meat
products. Meat Sci., 78, 68-76.

Huff-Lonergan, E. & Lonergan, S. M. (2005). Mechanisms of water-holding capacity of meat:

The role of postmortem biochemical and structural changes. Meat Sci., 71, 194-204.

Incze, K. (1992). Raw fermented and dried meat products. Fleischwirtschaft, 72, 58-72.

Joo, S. T. & Kim, G. D. (2011). Meat quality traits and control technologies. S.T. Joo (Ed.),
Control of meat quality, Research Signpost, 6-10, Kerala, India.

Jurado, A.; García, C.; Timón, M.; Carrapiso, A. (2007). Effect of ripening time and rearing
system on amino-acid related flavor compounds of Iberian ham. Meat Sci., 75, 585-594.

Kim, G. P.; Jung, E. Y.; Lim, H. J.; Yang, H. S.; Joo, S. T.; Jeong, J. Y. (2013). Influence of meat
exudates on the quality characteristics of fresh and freeze-thawed pork. Meat Sci., 95,
323-329.

Koohmaraie, M. (1994). Muscle proteinases and meat aging. Meat Sci., 36, 93-104.

Kuo, M. I.; Gunasekaran, S.; Johnson, M.; Chen, C. (2001). Nuclear magnetic resonance study of
water mobility in pasta filata and non-pastafilata Mozzarella. J. Dairy Sci., 84, 1950-1958.

Laghi, L.; Picone, G.; Capozzi, F. (2014). Nuclear magnetic resonance for foodomics beyond.
Food analysis. Trends Anal. Chem., 59, 93-102.

Larrea, (2003). Caracterización química y microestructural de proceso de elaboración de jamón

curado D.O. Teruel. (Tesis Doctoral). Universidad Politécnica de Valencia, Departamento
de Tecnología de los Alimentos. Valencia, España.

Larson, G.; Dobney, K.; Albarella, U.; Fang, M.; Matisoo-Smith, E.; Robins, J.; Lowden, S.;
Finlayson, H.; Brand, T.; Willerslev, E.; Rowley-Conwy, P.; Andersson, L. y Cooper, A.
(2005). Worldwide phylogeography of wild boar reveals multiple centers of pig
domestication. Science. 307, 1618-1621.

Lauterbur, P. C. (1973). Image formation by induced local interactions: examples employing

nuclear magnetic resonance. Nature, 242, 190-191.

Lavine, B. & Workman, J. J. (2004). Chemometrics. Anal. Chem., 76, 3365-3372.

Li, Y.; Jia, W.; Zhang, C. H.; Li, X.; Wang, L. C.; Zhang, D. Q.; Mu, G. F. (2014). Fluctuated low
temperature combined with high-humidity thawing to reduce physicochemical quality
deterioration of beef. Food Bioprocess Tech., 7, 3370-3380.

Liang, Z. & Lauterbur, P. C. (2000). Principles of magnetic resonance imaging. SPIE Optical
Engineering, New York.

Lücke, F. K. (1998). Fermented sausages. En: Microbiology of Fermented Foods, Wood, B. J. B.

(Ed), pp. 441-483. Blackie Academic and Professional. Londres, Reino Unido.

Luo, J.; Pan, T.; Gou, H. Y.; Ren, F. Z. (2013). Effect of calcium in brine on salt diffusion and
water distribution of Mozzarella cheese during brining. J. Dairy Sci., 96, 824-831.

Mannina, L.; D'Imperio, M.; Capitani, D.; Rezzi, S.; Guillou, C.; Mavromoustakos, T.; Vilchez, M.
D.; Fernández, A. H.; Thomas, F.; Aparicio, R. (2009). 1H NMR based protocol for the

318
 VII. Bibliografía

detection of adulterations of refined olive oil with refined hazelnut oil. J. Agri. Food
Chem., 57, 11550-11556.

Mansfield, P. & Grannell, P. K. (1973). NMR diffraction in solids? Journal of Physics C: solid
state physics, 6, L422.

MAPAMA (Ministerio de Agricultura, Pesca, Alimentación y Medio Ambiente) (2016a).

Indicadores económicos de la carne de cerdo 2015. Disponible en:
www.mapama.gob.es/es/ganaderia/temas/produccionymercadosganaderos/indicadoresecon
omicoscarnedecerdo2015_tcm7-422853.pdf. Documento consultado: Marzo 2017.

MAPAMA (Ministerio de Agricultura, Pesca, Alimentación y Medio Ambiente) (2016b).

Informe de consumo alimentario 2015. Disponible en:
www.mapama.gob.es/es/alimentacion/temas/consumoycomercializacionydistribucionaliment
aria/panel-de-consumo-alimentario/ultimos-datos. Documento consultado: Marzo 2017.

Marusic, N.; Aristoy, M. C.; Toldrá, F. (2013). Nutritional meat compounds as affected by ham
dry-curing. Meat Sci., 93, 53-60.

Martín, L.; Córdoba, J. J.; Ventanas, J.; Antequera, T. (1999). Changes in intramuscular lipids
during ripening of Iberian dry-cured ham. Meat Sci., 51, 129-134.

McDonnell, C. K.; Allen, P.; Duggan, E., Arimi, J. M.; Casey, E.; Duane, G.; Lyng, J. (2013). The
effect of salt and fibre direction on water dynamics, distribution and mobility in pork
muscle: A low field NMR study. Meat Sci., 95, 51-58.

Meiboom, S. & Gill, D. (1958). Modified Spin-Echo Method for Measuring Nuclear Relaxation
Times. Rev. Sci. Instrum., 29, 688-691.

Melody, J. L.; Lonergan, S. M.; Rowe, L. J.; Huiatt, T. W.; Mayes, M. S.; Huff-Lonergan, E. (2004).
Early postmortem biochemical factors influence tenderness and water-holding capacity
of three porcine muscles. J. Anim. Sci., 82, 1195-1205.

Mitchell, A. D.; Scholz, A. M.; Wang, P. C.; Song, H. (2001). Body composition analysis of the pig
Magnetic Resonance Imaging. J. Anim. Sci., 79, 1800-1813.

Møller, S.; Gunvig, A.; Bertram, H. C. (2010). Effect of starter culture and fermentation
temperature on water mobility and distribution in fermented sausages and correlation
to microbial safety studied by nuclear magnetic resonance relaxometry. Meat Sci., 86,
462-467.

Molly, K.; Demeyer, D.; Johansson, G.; Raemaekers, M.; Ghistelinck, M.; Geenen, I. (1997). The
importance of meat enzymes in ripening and flavor generation in dry fermented
sausages. First results of a European project. Food Chem., 59, 539-545.

Mora, L. (2010). Determinación de compuestos bioquímicos para el control de calidad en la

elaboración de jamón cocido y jamón curado. (Tesis Doctoral). Universidad de Valencia.
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA). Valencia, España.

Moreiras, O.; Carbajal, A.; Cabrera, L.; Cuadrado, C. (2013). Tablas de composición de
alimentos. 16 ed. Ed. Pirámide. ISBN: 9788436829037.

319
 VII. Bibliografía

Morrissey, P. A. Sheehy, P. J. A.; Galvin, K.; Kerry, J. P.; Buckley, D. J. (1998). Lipid stability in
meat and meat products. Meat Sci., 49, 73-86.

Muguerza, E.; Ansorena, D.; Astiasaran, I. (2003). Improvement of nutritional properties of cho
rizo de Pamplona by replacement of pork backfat with soy oil. Meat Sci, 65, 1361-1367.

Mulas, G.; Roggio, T., Uzzau, S.; Anedda, R. (2013). A new magnetic resonance imaging
approach for discriminating Sardinian sheep milk cheese made from heat-treated or raw
milk. J. Dairy Sci., 96, 7393-7403.

Müller, V. In Bacterial Fermentation; John Wiley&Sons: Chichester. UK, 2008. DOI: 10.1002/
/9780470015902.a0001415.pub2.

Motilva, M. J.; Toldrá, F.; Nieto, P.; Flores, J. (1993). Muscle lipolysis phenomena in the
processing of dry-cured ham. Food Chem., 48, 121-125.

Monin, G.; Marinova, P.; Talmant, A.; Martin, J. F.; Cornet, M.; Lanore, D.; Grasso, F. (1997).
Chemical and structural changes in dry-cured hams (bayonne hams) during processing
and effects of the dehairing technique. Meat Sci., 47, 29-47.

Nawar, W.W. (1996). Lipids. En: Food Chemistry, O.R. Fennema (Ed), pp. 225-319. New York:
Marcel Dekker, Inc.

Olmos, J. V. (2006). Atlas Monte Nevado de anatomía del jamón serrano. Edita Jamones
Segovia, S.A.

Ordóñez, J. A.; Cambero M. I.; Fernández, L.; García M. L.; García de Fernando, G.; de la Hoz, L.;
Selgas, M. D. (1998). Cambios post mortem del músculo. En: Tecnología de los
Alimentos. Alimentos de origen animal. 170-184. Síntesis (Ed), Madrid.

Ordóñez J. A.; Hierro, E. M.; Bruna, J. M.; de la Hoz, L. (1999). Changes in the components of
dry-fermented sausages during ripening. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 39, 329-367.

Ordóñez J.A. & de la Hoz, L. (2001). Embutidos crudos curados. Tipos. Fenómenos
madurativos. Alteraciones. En: Enciclopedia de la carne y los productos cárnicos, vol. II,
Martin & Macías (Ed), pp. 1063-1090, Cáceres.

Organización Mundial de la Salud. Carcinogenicidad de la carne roja y de la carne procesada.

Disponible en: http://www.who.int/features/qa/cancer-red-meat/es/. Consultado en:
Octubre 2017.

Pearce, K. L.; Rosenvold, K.; Andersen, K. J.; Andersen, H. J; Hopkins, D. L. (2011). Water
distribution and mobility in meat during the conversion of muscle to meat and ageing
and the impacts on fresh meat quality attributes: A review. Meat Sci., 89, 111-124.

Pichner, R.; Hechelmann, H.; Gareis, M.; Steinruck, H. (2006). Shigatoxin producing Escherichia
coli (STEC) in conventionally and organically produced salami products. Fleischwirtschaft,
86, 112-114.

Purcell, E. M.; Torrey, H.; Pound, R. V. (1946). Resonance absorption by nuclear magnetic
moments in a solid. Phys. Rev., 69, 37-38.

Prändl, O.; Fischer, A.; Schmidhofer, T.; Sinell, H. J. (1994). Tecnología e higiene de la carne.
Acribia (Ed), Zaragoza.

320
 VII. Bibliografía

Piñeiro, M. E.; Punín, M. O.; Lage, M. A. (2001). Determinación de ácidos grasos en carne de
cerdo. En: Alimentaria: Revista de tecnología e higiene de los alimentos. ISSN: 0300-
5755, Vol. 327, 41-45.

Pospiech, E.; Grzes, B.; Lyczynski, A.; Borzuta, K.; Szalata, M.; Mikolajczak, B. (2003). Muscle
proteins and their changes in the process of meat tenderization. Anim. Sci. Pap. Rep., 21,
133-155.

Prieto, B. & Carballo, J. (1997). El control analítico de la calidad en los productos cárnicos
crudos-curados. Ciencia y Tecnología de Alimentos, 1, 112-120.

Price, J. F. & Schweigert, B. S. (1994). Ciencia de la carne y de los productos cárnicos. Acribia
(Ed), Zaragoza.

Ramakrishnan, V. y Luthria, D. L. (2017). Recent applications of NMR in food and dietary

studies. J. Sci. Food Agri., 97, 33-42.

Ramírez, C.; Germain, J. C.; Aguilera, J. M. (2009). Image analysis of representative food
structures: application of the bootstrap method. J. Food Sci., 74, 65-72.

Romero de Ávila, M. D; Escudero, R.; Ordóñez, J. A.; Cambero, M. I. (2014). Weibull analysis
characterizes the breaking properties of dry-cured ham slices. Meat Sci., 97, 451-458.

Ruan, R. R. y Chen, P. L. (1998). Water in Foods and Biological Materials: A Nuclear Magnetic
Resonance Approach. 1st edition ed. Technomic Publishing Company, Inc, Lancaster,
Pennsylvania.

Sánchez-Molinero, F. & Arnau, J. (2010). Processing of dry-cured ham in a reduced-oxygen

atmosphere: Effects on sensory traits. Meat Sci., 85, 420-427.

Savage, A. W.; Warriss, P. D.; Jelley, P. D. (1990). The amount and composition of the proteins
in drip from stored pig meat. Meat Sci., 27, 289-303.

Scheffler, T. L. & Gerrard, D. E. (2007). Mechanisms controlling pork quality development: The
biochemistry controlling postmortem energy metabolism. Meat Sci., 77, 7-16.

Schievano, E.; Pasini, G.; Cozzi, G.; Mammi, S. (2008). Identification of the production chain of
Asiago d’Allevo cheese by nuclear magnetic resonance spectroscopy and principal
component analysis. J. Agric. Food Chem., 56, 7208-7214.

Serra, X.; Ruiz-Ramirez, J., Arnau, J.; Gou, P. (2005). Texture parameters of dry-cured ham,
muscle biceps femoris samples, dried at different levels as a function of water activity
and water content. Meat Sci., 69, 249-54.

Skiba, G.; Raj, S.; Polawska, E.; Pastuszewska, B.; Elminowska-Wenda, G.; Bogucka, J.; Knecht,
D. (2012). Profile of fatty acids, muscle structure and shear force of
musculus longissimus dorsi (MLD) in growing pigs as affected by energy and protein or
protein restriction followed by realimentation. Meat Sci.e, 91, 339-346.

Skibsted, L. H. (1992). Cured meat products and their oxidative stability. En: The chemistry of
muscle based foods, D. A. Ledward, D. E. Johnston y M. K. Knight (Eds), pp. 266-286.
Londres: Royal Society of Chemistry.

Skibsted, L. H. (2011). Nitric oxide and quality and safety of muscle based foods. Nitric Oxide –
Biol. Chem., 24, 176-183.

321
 VII. Bibliografía

Suárez, M.V.; Barba, C.; Forero, J.; Sereno, J. R. B.; Diéguez, E.; Delgado, J. V. (2002).
Reproductive characterization of various pig breed from Iberian origin. I. Descriptive
analysis. Archivos de Zootecnia, 51, 245-248.

Tautenhahn, R.; Cho, K.; Uritboonthai, W.; Zhu, Z.; Patti, G. J.; Siuzdak, G. (2012). An
accelerated workflow for untargeted metabolomics using the METLIN database. Nat.
Biotechnol., 30, 826-828.

Toldrá, F.; Cerveró, C.; Part, C. (1993). Porcine aminopeptidase activity as affected by curing
agents. J. Food Sci., 58, 724-726.

Toldrá, F.; Flores, M.; Aristoy, M. C.; Virgili, R.; Parolari, G. (1996). Pattern of muscle proteolytic
and lipolytic enzymes from light and heavy pigs. J. Sci. Food Agri., 71, 124-128.

Toldrá, F. (1998). Proteolysis and lipolysis in flavour development of drycured meat products.
Meat Sci., 49, 101-110.

Toldrá, F. (2006). Dry-cured ham. En: Handbook of Food Science Technology and Engineering.
CRC Press (Ed), pp 164.1-164.11, Boca Raton, E.E.U.U.

Toldrá, F. & Aristoy, M.C. (2010). Dry-cured ham. En: Handbook of Meat Processing, F. Toldrá
(Ed), pp.351-362. Ames, Iowa.

Tornberg, E. (2005). Effects of heat on meat proteins-Implications on structure and quality of

meat products. Meat Sci., 70, 493-508.

Totosaus, A., Montejano, G. J., Salazar, J. A., Guerrero, I. (2002). A review of physical and
chemical protein-gel induction. Int. J. Food Sci. Technol., 37, 589-601.

Ventanas, J. (2001). Factores del proceso que determinan la calidad del jamón. En: Jamón
Ibérico y Serrano. Fundamentos de la elaboración y de la calidad. pp. 63-103, Paraninfo
(Ed), Madrid.

Wakamatsu, J., Hayashi, N., Nishimura, T., y Hattori, A. (2010). Nitric oxide inhibits the
formation of zinc protoporphyrin IX and protoporphyrin IX. Meat Science, 84, 125– 128.

Windham, C. T.; Wyse, B. W.; Hansen, R.G. (1990). Thiamin, riboflavin, niacin and pantothenic
acid. En: Meat and Health, Advanced Materials Research. Volume: 6. M. Pearson y T.R.
Dutson (Ed), págs. 401-459. Elsevier Applied Science, London.

Wüthrich, K. (1974). Nuclear magnetic resonance in protein research. Experientia, 30, 577-585.

Xia, X.; Kong, B.; Liu, Q.; Liu, J. (2009). Physicochemical change and protein oxidation in
porcine longissimus dorsi as influenced by different freeze–thaw cycles. Meat Sci., 83,
239-245.

Zhang, G.; Hailemariam, D.; Dervishi, E.; Deng, Q.; Goldansaz, S. A.; Dunn, S. M.; Ametaj, B. N.
(2015). Alterations of innate immunity reactants in transition dairy cows before clinical
signs of lameness. Animals, 5, 717-747.

322
VIII. Índice de abreviaturas

323
 VIII. Índice de abreviaturas

ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS

aw: Actividad de agua

ATP: adenosín trifosfato
AMP: adenosín monofosfato
BAL: Bacterias ácido-lácticas
BF: bíceps femoral
BHT: Butilhidroxitolueno
CDA: Coeficiente de difusión aparente
CE-MS: Espectroscopía de masas acoplada a electroforesis capilar
CH1: Chorizo con 20% de grasa
CH2: Chorizo con 40% de grasa
CIIC: Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer
CMPG: Carl-Purcell-Meiboom-Gill
CPD: Crytical point drying
CRA: Capacidad de retención de agua
DFD: Dark, firm, dry
D.O.P.: Denominación de origen protegida
DP: Densidad protónica
DSS: 3,3-dimetil-2,2-silapentano-5-sulfónico
DTT: Ditiotreitol
EDTA: etilendiaminotetraacético
ES: Extracto seco
E.T.G.: Especialidad tradicional garantizada
FID: Free inducción decay
FOV: Field of View
GC-MS: Espectroscopía de masas acoplada a cromatografía de gases
1H-COSY: Correlated spectroscopy
1H-TOCSY: Total correlated spectroscopy
1H-NOESY: Nuclear overhauser effect spectroscopy
1H,X-HSQC: Heteronuclear single quantum correlation

325
 VIII. Índice de abreviaturas

1H,X-HMQC: Heteronuclear multiple quantum correlation

1H,X-HMBC: Heteronuclear multiple bond correlation
HR: humedad relativa
HRMAS: High resolution magic angle spinning
Hx: Hipoxantina
I.G.P.: Indicación geográfica protegida
IMP: Inosina monofosfato
Ino: Inosina
IRM: Imagen de resonancia magnética
LC-MS: Espectroscopía de masas acoplada a cromatografía líquida
LF-NMR: low- field NMR
Mb: Mioglobina
MEB: Microscopía electronica de barrido
MS: Espectroscopía de masas
NMR: Nuclear Magnetic Resonance
NP: Nitrógeno peptídico
NPP: Nitrógeno no proteico
OMS: Organización Mundial de la Salud
OTMA: Óxido de trimetilamina
PC: Principal component
PCA: Principal component analysis
Phe: Fenilalanina
PLS: Partial least squares
PSE: Pale, soft, exudative
R.D.: Real Decreto
RF: Radiofrecuencia
RMN: Resonancia Magnética Nuclear
ROI: Region of interest
S1: Salchichón con 20% de grasa
S2: Salchichón con 40% de grasa
SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-poly- acrylamide gel

326
 VIII. Índice de abreviaturas

SEM: Scanning electron microscopy

SM: Semimembranoso
SMS: Sistema modelo sin enzimas adicionadas
SMS+P: Sistema modelo con enzimas adiciondas
ST: Semitendinoso
T1: Tiempo de relajación longitudinal
T2: Tiempo de relajación transversal
TMA: Trimetilamina
TE: Tiempo de eco
TF: Transformada de Fourier
TMS: Tetrametilsilano
TPA: Texture profile analysis
TR: Tiempo de repetición
Trp: Triptófano
TSP: 3-(trimetilsilil)propionato-2,2´-3,3´-sódico-d4
Tyr: Tirosina

327
 II. Objetivos

En conjunto, se estima que se han abordado objetivos de interés científico y

tecnológico, especialmente mediante la optimización de técnicas de RMN para el
estudio de productos madurados y la estimación de su potencial de aplicación, como
técnicas no destructivas, a nivel industrial.

328