Adn y Biologia Forense

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UNPRG

SEMINARIO
2012

DOCENTE:
INTEGRANTES :
FELIX GONZALES FLORES Cancino Delgado Ingri Greisy
Farroñan González Virginia

UNPRG Página 1
UNIVERSIDAD NACIONAL FACULTAD DE BIOLOGIA
PEDRO RUIZ GALLO GENETICA GENERAL

DEDICATORIA

A nuestros padres que día a


día luchan por nosotros para
brindarnos siempre lo mejor.
También a nuestro profesor
por inculcarnos la investigación

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INTRODUCCIÓN

La medicina legal en su carácter de especialidad, comparte con la biología en su

conjunto importantes transformaciones que le han permitido incorporar a su

ámbito de acción los avances de la tecnología.

La identificación, una de las vertientes fundamentales de la biología forense,

se ha enriquecido en los últimos años con los aportes que los métodos de

investigación en genética molecular le han proporcionado. Forman parte

relevante de dicha metodología las técnicas de tipificación de ADN, las cuales

permiten la investigación de identidad en el marco médico legal.

En Marzo de 1992, un atentado con explosivos destruyó la Embajada de Israel

en Buenos Aires. Desde ese momento comenzaron a practicarse estudios de

ADN destinados al reconocimiento de cadáveres y/o restos humanos que no

pudiesen ser identificados por los métodos tradicionales, fundamentalmente

por la técnica dactiloscópica, de particular relevancia en Argentina por la

existencia de un archivo dactiloscópico de alcance universal para todas las

personas documentadas. También a partir de ese año, la demanda de este tipo

de estudios se amplió, incluyendo casos de criminalística en los cuales las

características del material biológico a investigar impusieron al método

exigencias adicionales.

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EL ADN

El ADN (Ácido Desoxirribonucleico) constituye el material genético de las

células del cuerpo humano. Con un tipo de excepción, el ADN se encuentra

exclusivamente en el núcleo de las células. En el genoma (conjunto integral y

secuenciado del ADN) humano se estima que hay aproximadamente 27,000

genes. Los genes son trozos funcionales de ADN compuestos a su vez de 1,000

hasta 200,000 unidades c/u llamadas nucleótidos. Los nucleótidos se

encuentran organizados formando un par de cadenas apareadas que toman la

forma tridimensional de un doble hélix. Hay más de (3,000'000,000) tres mil

millones de pares de bases que constituyen el genoma de una sólo célula

humana.

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Su secuencia de nucleótidos contiene la información necesaria para poder

controlar el metabolismo un ser vivo. El ADN es el lugar donde reside la

información genética de un ser vivo.

La macromolécula de ADN está constituida por dos cadenas de nucleótidos

complementarias. los nucleótidos, que están formados por la unión de un grupo

fosfato (ácido fosfórico), un azúcar (la molécula pentosa 2-desoxi-D-ribosa) y

una base nitrogenada, se encadenan entre sí mediante la unión del azúcar de

uno de ellos con el azúcar del contiguo a través del fosfato. El grupo fosfato y

la desoxirribosa constituyen una suerte de columna vertebral que sirve de

sostén a bases nitrogenadas de cuatro tipos diferentes; dos de ellas -la

adenina (A) y la guanina(G)- son púricas, con estructura en doble anillo, las

otras dos -la citosina(C) y la timina(T)- son pirimídicas, con estructura en anillo

simple.

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Estructura secundaria

La estructura secundaria del ADN fue propuesta por James Watson y Francis

Crick, y la llamaron el modelo de doble hélice de ADN.

Este modelo está formado por dos hebras de nucleótidos. Estas dos hebras se

sitúan de forma antiparalela, es decir, una orientada en sentido 5' → 3' y la

otra de 3' → 5'. Las dos están paralelas, formando puentes de Hidrógeno

entre las bases nitrogenadas enfrentadas.

Cuando en una hebra encontramos Adenina, en la otra hebra hallamosTimina.

Cuando en una hebra encontramos Guanina, en la otra hallamosCitosina. Estas

bases enfrentadas son las que constituyen los puentes de Hidrógeno. Adenina

forma dos puentes de Hidrógeno con Timina. Guanina forma tres puentes de

Hidrógeno con la Citosina.

Las dos hebras están enrolladas en

torno a un eje imaginario, que gira en

contra del sentido de las agujas de

un reloj. Las vueltas de estas hélices

se estabilizan mediante puentes de

Hidrógeno.

Esta estructura permite que las hebras que se formen por duplicación de ADN

sean copia complementaria de cada una de las hebras existentes.

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Estructura terciaria

El ADN es una molécula muy larga en algunas especies y, sin embargo, en las

células eucariotas se encuentra alojado dentro del minúsculo núcleo. Cuando el

ADN se une a proteínas básicas, la estructura se compacta mucho.

Las proteínas básicas son Histonas o Protaminas.

La unión con Histonas genera la estructura denominada nucleosoma. Cada

nucleosoma está compuesto por una estructura voluminosa, denominada core,

seguida por un eslabón o "Linker". El core está compuesto por un octámero de

proteínas, Histonas, denominadas H2A, H2B, H3 y H4. Cada tipo de histona se

presenta en número par. Esta

estructura está rodeada por un tramo

de ADN que da una vuelta y 3/4 en

torno al octámero. El Linker está

formado por un tramo de ADN que une

un nucleosoma con otro y una histona

H1.

El conjunto de la estructura se

denomina fibra de cromatina de 100Å.

Tiene un aspecto repetitivo en forma de collar de perlas, donde las perlas

serían los nucleosomas, unidos por los linker.

El ADN debe encontrarse más compacto en el núcleo de los espermatozoides.

En este caso, el ADN se une a proteínas de carácter más básico, denominadas

Protaminas. El ADN se enrolla sobre estas proteínas, formando una estructura

muy compacta, denominada estructura cristalina del ADN.

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Estructura cuaternaria

La cromatina en el núcleo tiene un grosor de 300Å. La fibra de cromatina de

100Å se empaqueta formando una fibra de cromatina de 300Å. El

enrollamiento que sufre el conjunto de nucleosomas recibe el nombre de

solenoide.

Los solenoides se enrollan formando la cromatina del núcleo interfásico de la

célula eucariota. Cuando la célula entra en división, el ADN se compacta más,

formando los cromosomas.

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APLICACIONES DEL ADN

La investigación sobre el ADN tiene un impacto significativo, especialmente en

el ámbito de la medicina. A través de la tecnología del ADN recombinante los

científicos pueden modificar microorganismos que llegan a convertir en

auténticas fábricas para producir grandes cantidades de sustancias útiles. Por

ejemplo, esta técnica se ha empleado para producir insulina (necesaria para los

enfermos de diabetes) o interferón (muy útil en el tratamiento del cáncer). Los

estudios sobre el ADN humano también revelan la existencia de genes

asociados con enfermedades específicas como la fibrosis quística y

determinados tipos de cáncer. Esta información puede ser valiosa para el

diagnóstico preventivo de varios tipos de enfermedades.

La medicina forense utiliza técnicas desarrolladas en el curso de la

investigación sobre el ADN para identificar delincuentes. Las muestras de

ADN tomadas de semen, piel o sangre en el escenario del crimen se comparan

con el ADN del sospechoso; el resultado es una prueba que puede utilizarse

ante los tribunales. Véase Pruebas de ADN.

El estudio del ADN también ayuda a los taxónomos a establecer las relaciones

evolutivas entre animales, plantas y otras formas de vida, ya que las especies

más cercanas filogenéticamente presentan moléculas de ADN más semejantes

entre sí que cuando se comparan con especies más distantes evolutivamente.

Por ejemplo, los buitres americanos están más emparentados con las cigüeñas

que con los buitres europeos, asiáticos o africanos, a pesar de que

morfológicamente y etológicamente son más similares a estos últimos.

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La agricultura y la ganadería se valen ahora de técnicas de manipulación de

ADN conocidas como ingeniería genética y biotecnología. Las estirpes de

plantas cultivadas a las que se han transferido genes pueden rendir cosechas

mayores o ser más resistentes a los insectos. También los animales se han

sometido a intervenciones de este tipo para obtener razas con mayor

producción de leche o de carne o razas de cerdo más ricas en carne y con

menos grasa.

PRUEBAS DE ADN

Es importante resaltar que así como hay regiones con función conocida o

supuesta (los genes), sucede que casi la mitad del ADN del genoma humano

consiste de regiones (intrones) con función hasta hoy desconocida y que tienen

una secuencia de nucleótidos repetitiva en muchos casos pero con patrones

hipervariables en muchas regiones del genoma.

Es precisamente de la hipervariabilidad (polimorfismo) de estas regiones del

ADN de lo que se aprovecha para detectar diferencias (o semejanzas) entre un

ser humano y otro, estudiando su ADN. Las regiones repetitivas pueden

presentarse como tandas repetitivas cortas o largas. A esto se le llama VNTRs

(variable number of tándem repeats) entre los que están los STR (short

tándem repeats), que son las regiones hipervariables que estudiamos nosotros

para las pruebas modernas de paternidad.

Toda célula nucleada contiene 46 cromosomas [excepto los gametos: Los

espermatozoides en el hombre y los óvulos en la mujer, que tienen 23

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cromosomas cada uno]. Los cromosomas son tan sólo la forma como la célula

ordena su ADN combinándolo con ciertas proteínas.

En el momento de la concepción, se necesita 46 cromosomas para procrear un

nuevo ser humano. En consecuencia, una persona debe recibir exactamente la

mitad de su material genético de su madre biológica y exactamente la otra

mitad del padre biológico.

La prueba del ADN está basada en un análisis exacto de los perfiles genéticos

de la madre, del niño(a) y del presunto padre. Si se conocen los perfiles

genéticos de la madre y de su hijo(a), el perfil genético del padre puede ser

deducido con certeza casi total.

Si no se hace la prueba a la madre, los perfiles del ADN del niño(a) serán

comparados al perfil del ADN del presunto padre. La técnica utilizada por

nosotros permite obtener el mismo grado de exactitud (probabilidad de

paternidad) en los análisis en que no se examina el ADN de la madre sino sólo

el ADN del hijo(a) y el ADN del padre presunto.

El ADN se puede extraer a partir de una variedad de muestras:

 células epiteliales de la mejilla,

 glóbulos blancos de la sangre

 folículos pilosos

 células fetales (provenientes de líquido amniótico) en cultivo

 semen

 otras muestras biológicas (tejidos, etc.)

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El ADN es el componente fundamental de los cromosomas y contiene la

información hereditaria requerida para transmitir, de padres a hijos,

similitudes y diferencias. El número de cromosomas de la especie humana es de

46, los cuales se agrupan en 23 pares: 22 de ellos llamados "pares autosómicos"

no presentan diferencias de acuerdo al sexo; el restante, el par 23, "par

sexual", tiene características diferentes determinadas por cada uno de los

sexos. Los 23 pares de cromosomas están contenidos en el interior del núcleo

celular.

Si bien existen genes (los genes son trayectos de ADN localizados en

determinadas zonas de los cromosomas) que transmiten familiarmente

caracteres evidenciables, otros no lo hacen. Aquellas áreas de ADN que no

transmiten información para características hereditarias detectables, pueden

organizarse como "secuencias repetitivas", que son pequeños fragmentos de

ADN de idéntica composición que se repiten varias veces. Las técnicas de

identificación por ADN nuclear se apoyan en esta propiedad de ese ADN que

consiste en repetirse en determinadas zonas de los cromosomas.

El ADN posee igual estructura, y por ende las mismas secuencias repetitivas en

todas las células presentes en el organismo.

El análisis del ADN con fines de identificación implica el empleo de técnicas de

laboratorio que utilizan diversos "marcadores" o "sistemas", los que podrían

definirse conceptualmente como instrumentos que investigan esos fragmentos

de ADN en los cuales se instalan las secuencias repetitivas aludidas. Los

resultados que se logran de este análisis de diversas áreas de ADN configuran,

en conjunto, el perfil genético propio de cada individuo.

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El perfil genético, así definido, tiene una capacidad discriminativa de gran

potencia para diferenciar personas. Es esa cualidad del método, que le permite

discriminar con altos grados de certeza, la que explica la denominación de

"huellas digitales genéticas" o "fingerprints" de la literatura anglosajona, que

suele utilizarse para designar este sistema de identificación.

La irrupción de esta metodología en la ciencia forense representó un avance de

particularísima importancia tanto por su potencial grado de certeza a la hora

de discriminar como por su aplicación a prácticamente cualquier tipo de rastro

biológico.

En el ámbito de la criminalística su utilización permite el análisis de ADN en

material biológico de cualquier tipo y presente en pequeñas cantidades en la

evidencia, lo que incrementa notablemente la información brindada por la

muestra para la clarificación del hecho delictivo. Es así posible determinar el

perfil genético de un individuo a través de manchas de sangre o semen, de

material recolectado por hisopados, de pelos, de muestras de saliva (aún las

obtenidas de colillas de cigarrillos), de material cadavérico en distintos

estados de transformación y de fragmentos de tejidos, incluso pequeños, como

restos de piel adheridos a las uñas.

El hallazgo de patrones genéticos en estos rastros biológicos y su comparación

con los perfiles de las personas involucradas, hacen posible establecer una

concordancia (si los perfiles coinciden) o descartarla (si los mismos difieren) y

de este modo señalar o excluir a los involucrados como fuente de la muestras,

con un elevado grado de certeza.

Los dictámenes de filiación también se vieron beneficiados por la altísima

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precisión que puede brindar su aplicación al estudio de vínculos biológicos. Por

otra parte, a diferencia de los métodos que la precedieron, puede aplicarse a la

investigación de parentesco en cadáveres y restos humanos.

Otra de las cualidades de este método que reviste singular importancia

forense es su capacidad de generar resultados en material biológico degradado

por diversos factores, entre los que cabe mencionar, por su frecuencia, los

fenómenos de transformación cadavérica y los procesos de desnaturalización

como el provocado por la acción del fuego.

Aunque la mayor fuente de ADN es el núcleo celular, algunas formaciones

celulares extranucleares, como las denominadas mitocondrias, poseen ADN.

Este ADN mitocondiral que solo se hereda por vía materna, representa una

alternativa más para la identificación forense en circunstancias especiales.

Las características que hemos reseñado, amplían notablemente las

posibilidades de la tipificación de ADN como herramienta de identificación en

todo tipo de casuística judicial. En determinadas circunstancias es el único o

último recurso identificatorio que puede proporcionar algún resultado,

especialmente frente a restos humanos muy fragmentados y muestras

biológicas escasas y/o deterioradas.

NUESTRA EXPERIENCIA EN LA APLICACIÓN DE LOS ESTUDIOS DE ADN

Las técnicas que caracterizan el ADN nuclear presentan un elevado grado de

eficiencia en el campo de la filiación.

Las circunstancias que rodean a ciertos hechos delictivos no permiten alcanzar

resultados tan satisfactorios en el ámbito penal. Las estadísticas de la Unidad

de ADN del Cuerpo Médico Forense reflejan esta realidad, como lo atestiguan

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los siguientes gráficos donde se presenta el porcentaje de los casos en los que

fue posible llegar a un dictamen de identificación, ya sea de concordancia o de

exclusión, en pericias de filiación y de criminalística.

En el caso de las filiaciones, por lo general, los estudios se limitan a las

muestras de sangre venosa o hisopada bucales obtenidos en el momento del

examen. El ADN extraído de las mismas es abundante y presenta un excelente

estado de conservación, razones por las cuales el logro de resultados es

prácticamente seguro. El 10% de casos no resueltos es relacionable a la

incomparecencia del progenitor alegado o a interrupciones del estudio por

motivos procesales.

Corresponde destacar que una importante cantidad de las muestras de

criminalística peritadas a través de nuestro servicio tardó largos períodos en

ingresar al estudio y si bien en parte de ellas fue posible obtener resultados,

en otras ya no era detectable el material genético que podría haber estado

presente en los momentos iníciales.

Esta situación fue particularmente habitual en las "muestras mezcladas", así

denominadas por contener más de un perfil genético, generalmente el de la

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víctima y el del victimario. Tales situaciones corresponden, frecuentemente, a

los indicios de los delitos sexuales: hisopados de cavidades y manchas en

prendas íntimas de la víctima. En ellos, el semen suele hallarse presente en

menor cantidad que el material femenino, a lo que debe añadirse la práctica de

someter a la misma muestra seleccionada, al análisis para la detección de

semen en una primera instancia y luego a la investigación de ADN. Ello hace que

la ausencia de un perfil masculino en la muestra pueda deberse a que nunca se

encontró presente o a la imposibilidad de ponerlo en evidencia, por escasez o

deterioro de dicho material masculino.

La Unidad de ADN observa y recomienda un procedimiento de recolección y

conservación de muestras cuyos lineamientos generales se presentan en el

siguiente protocolo confeccionado por esta Unidad:

TIPIFICACION DE ADN: TOMA Y CONSERVACION DE LAS MUESTRAS

MUESTRA

Sangre recién Extraída Cantidad

EXTRACCION

Aproximadamente 5 a 10 ml.

Esta cantidad puede reducirse en niños pequeños.

Tubos utilizados

Estériles. Irrompibles. Deben contener 0.5 ml de E.D.T.A. al 5%. NO

UTILIZAR OTRO TIPO DE ANTICOAGULANTE.

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Cerrado hermético. Rotulación indeleble (Nombre, fecha de extracción, número

de causa).

Papeles de filtro

Embeber una circunferencia de 1 cm de diámetro como mínimo y secar a

CONSERVACION

temperatura ambiente. 24-36 hs:

Temperatura ambiente o heladera común (4°).

Lapso mayor:

Congelación a -20° ó -70°. Descongelar sólo para el procesamiento.

MUESTRA

Orina

EXTRACCION

Recién emitida

Cantidad

Aproximadamente 20-30 ml.

Obtención inmediata del sedimento.

Cerrado hermético. Rotulación indeleble (Nombre, fecha de extracción, número

de causa).

CONSERVACION:

Se recomienda procesamiento inmediato del sedimento. De no ser posible,

congelar.

MUESTRA

Hisopados de Cavidades:

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*Vaginal

* Rectal

* Bucal

Material

Utilizar material estéril para hisopados, sin otros aditivos.

Recolectar la mayor cantidad posible de exudado de la cavidad investigada.

Secar el hisopado antes de introducirlo en el tubo.

Cerrado hermético. Rotulación indeleble (Nombre, fecha de extracción, número

de causa). 24-36 hs:

Temperatura ambiente o heladera común (4°).

Lapso mayor:

Congelación a -20° ó -70° (preservando de la humedad). Descongelar sólo para

el procesamiento.

MUESTRAS:

Manchas

Orgánicas

(sangre - semen, etc.)

en:

* Prendas

* Telas, tapizados, papeles

* Otras superficies

EXTRACCION:

Recortar la superficie manchada o recuperar la mancha desde las distintas

superficies según las técnicas criminalísticas específicas (raspado o hisopado).

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Secar las manchas húmedas y guardar las muestras en envases de papel para

que no concentren la humedad.

Cerrado hermético. Rotulación indeleble (Nombre, fecha de extracción, número

de causa).

CONSERVACION:

Temperatura ambiente (proteger de calor y humedad y de radiación

ultravioleta intensa).

En estas condiciones pueden mantener su vigencia, incluso durante meses.

MUESTRAS:

Material Cadavérico

EXTRACCION:

Material de elección

* Huesos (Preferentemente zona interna de huesos largos, aunque también las

mismas áreas de huesos cortos suelen proporcionar resultados)

* Dientes (Sin endodoncia).

* Músculo (Si existen zonas en buen estado de conservación).

* Piel (Si existen zonas en buen estado de conservación).

* Pelos (Arrancados con sus raíces).

Cantidad

Volumen no menor de 5 cm. Piezas dentarias: dos o tres. Muestra ideal:

alrededor de 100 cm3.

Instrumental

Pinzas y bisturíes estériles o limpios, sin restos de tejidos de otros cadáveres

o restos.

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Frascos limpios e irrompibles. Cerrado hermético. Rotulación indeleble

(Nombre, fecha de extracción, número de causa).

En caso de restos humanos muy fragmentados e irreconocibles, tomar una

muestra por cada resto que no presente puentes de tejidos que lo unan a otro.

CONSERVACION:

24-36 hs: Temperatura ambiente o heladera común (4°).

Lapso mayor:

Congelación a -20° ó -70°. Descongelar sólo para el procesamiento.

Los huesos de cierta antigüedad que se encuentran libres de restos de tejido y

de humedad, deben permanecer a temperatura ambiente, resguardados del

calor y la humedad.

Es de relevancia destacar que las muestras biológicas de interés forense

pueden ser irrepetibles y de gran valor procesal. En muchas oportunidades, el

material de evidencia es encontrado cuando ya ha sufrido un importante nivel

de degradación. Por lo tanto, aunque la tabla precedente contiene

recomendaciones generales para la obtención y conservación de muestras, a ser

puestas en práctica en todas las oportunidades en las que sea posible, no debe

dejar de intentarse el análisis de muestras deterioradas, sobre todo teniendo

en cuenta que las técnicas actuales pueden tipificar cantidades cada vez

menores de ADN.

Para el total de peritaciones efectuadas durante el período, el promedio de

muestras por cada una de ellas fue de cuatro. Sin embargo, si analizamos por

separado este dato en casos de criminalística y de filiación, observamos que,

en los primeros, el número de muestras procesadas es considerablemente

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superior.

De acuerdo a la estadística de la Sección de Identificación que se refleja en

los siguientes gráficos, en el 80% de los peritajes de filiación se emplearon

hasta tres muestras y sólo en el 20% restante , más de tres.

Por el contrario, sólo en el 33% de las pericias criminalísticas se utilizaron de

una a tres muestras, mientras que el 35% de las mismas requirió entre cuatro y

seis muestras y el 32% restante siete o más.

IDENTIFICACIÓN POR ADN MITOCONDRIAL

En el interior de las células existen pequeñas formaciones ubicadas fuera del

núcleo, denominadas mitocondrias que contienen ADN con posibilidades de

atribuir identidad. La utilización del ADN mitocondrial con fines

identificatorios ha sido explorada con resultados alentadores.

El valor forense del ADN mitocondrial surge de su capacidad para expresar

resultados aún en presencia de ADN nuclear muy escaso o seriamente

deteriorado, al que se suma la presencia de igual estructura genética

mitocondrial en todas las generaciones que comparten un mismo linaje materno,

circunstancia que responde a su transmisión hereditaria sólo por vía materna y

sin sufrir modificaciones en su pasaje de madres a hijos. También resulta

significativo, desde el punto de vista identificatorio, su presencia en células sin

núcleo (anucleadas), como son las que componen el tallo del pelo.

Estas características favorecen su empleo en circunstancias que impiden o

limitan severamente la obtención de ADN nuclear, siendo indicaciones

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específicas para su utilización las siguientes:

a) Análisis de restos humanos de larga data o sometidos a situaciones externas

altamente desfavorables,

b) muestras con escasa cantidad de ADN nuclear disponible y/o en estado de

degradación importante,

c) identificación con familiares lejanos, siempre que el parentesco reclamado lo

sea por vía materna,

d) análisis de pelos hallados en el lugar de un hecho criminal.

Si bien las aplicaciones mencionadas resultan de interés forense y constituyen,

en ocasiones, la única posibilidad de identificación genética, debe señalarse

que, en la práctica, los resultados obtenidos no siempre satisfacen las

expectativas generadas por el empleo de la técnica.

La identificación por ADN mitocondrial brinda niveles de certeza menores que

los obtenidos con el análisis del ADN nuclear.

Si bien mencionamos como propiedad del ADN mitocondrial su pasaje de

generación en generación sin sufrir modificaciones estructurales, existe la

posibilidad de observar variaciones menores entre familiares, generadas por

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fenómenos de mutación. Ello puede complicar la comparación de los resultados

favoreciendo falsas exclusiones, por lo cual dicha mutación deberá ser

contemplada como situación especial.

Es probable que investigaciones futuras, sobre todo las dirigidas a establecer

frecuencias poblacionales de los perfiles mitocondriales, permitan superar

estas limitaciones. Hasta entonces la información brindada por la técnica

deberá ser evaluada cuidadosamente a la hora de asignar identidad.

IDENTIFICACION POR MARCADORES DEL CROMOSOMA "Y"

Un pequeño porcentaje del ADN nuclear conforma lo que podemos denominar el

ADN sexual, determinante del sexo. El componente masculino del ADN sexual,

sólo presente en varones, es el cromosoma "Y". Existen marcadores específicos

capaces de poner en evidencia un patrón genético limitado a este cromosoma,

conocido como "haplotipo Y", que presenta las siguientes características:

a) es propio de cada individuo,

b) se transmite de padres a hijos sin sufrir modificaciones, por lo que los

miembros masculinos de una familia compartirán el mismo haplotipo.

La capacidad identificatoria que estas propiedades le confieren hacen que la

investigación del "haplotipo Y" constituya una técnica adicional entre los

métodos de individualización forense, particularmente útil en la investigación

de delitos sexuales y para reforzar la pertenencia a un determinado grupo

familiar.

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La aplicación de esta técnica al estudio de hechos de violación, se basa en la

eficiencia que, en ocasiones, ha demostrado el análisis del componente

masculino (cromosoma "Y") en las muestras mezcladas, compuestas éstas por la

presencia de material proveniente del victimario y de la víctima tanto femenina

como masculina.

Cuando la víctima es de sexo femenino, el material genético masculino, si es

muy escaso, puede no ser puesto en evidencia por la interferencia del material

genético femenino claramente predominante.

Ello puede no ocurrir con el "haplotipo Y", que se puede manifestar aún en

presencia de abundante material femenino. Esta característica resulta todavía

más valiosa en el caso de violaciones con perpetradores múltiples.

En los casos en los que la víctima pertenece al sexo masculino, el "haplotipo Y"

del victimario que pudiera estar presente en la evidencia, puede inferirse por

sus diferencias con el "haplotipo Y" de la víctima.

Si el niño y los familiares pertenecen al sexo masculino y no se cuenta con el

perfil genético del padre, el empleo del "haplotipo Y" brindará información

complementaria, especialmente valiosa para el dictamen de exclusión, dado que

si el titular no pertenece a ese grupo familiar podrá presentar un "haplotipo Y"

diferente al de los varones de la familia que comparten un linaje paterno.

Si bien no cabe duda sobre los beneficios que esta técnica puede brindar en

situaciones como las descriptas, la limitación del método reside en las

dificultades de interpretación de los dictámenes de no exclusión, generadas

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por el hecho de presentar todos los familiares de un padre alegado o de un

sospechoso, aún los más alejados, el mismo haplotipo. Por el contrario, los

dictámenes de exclusión son definitorios.

La historia de los análisis de ADN en el Cuerpo Médico Forense habrá

comenzado hace 10 años para cuando este escrito esté publicado.

Su aplicación se efectúa cotidianamente. El archivo y la organización de sus

resultados se logra mediante una base de datos que contiene, someramente:

información y trayectoria judicial de la causa o expediente, cantidad y tipo de

muestras analizadas, variación de los resultados alcanzados con los distintos

materiales y en distintas condiciones, y patrones genéticos obtenidos.

La toma de muestras está protocolizada y se registra fotográficamente.

Aún así, luego del tiempo transcurrido y a pesar de la intención por abarcar

todos los aspectos que optimizan esta práctica, la identificación por ADN no se

escapa absolutamente de aquella antigua premisa que dice que "la medicina

legal es la medicina de la excepción".

Situaciones excepcionales, por las características de su presentación y

avatares de toda índole en el curso de su resolución, se plantearon también en

esta tarea.

Todas las diversas circunstancias en las cuales se requirió judicialmente la

prueba de ADN, que han sido reflejadas en este trabajo, fueron objeto, con

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mayor o menor frecuencia, del quehacer pericial del Cuerpo Médico Forense.

Los esfuerzos organizativos en el seguimiento de la casuística y la actividad

docente, dentro y fuera del Poder Judicial, que genera el intercambio de

impresiones y expectativas, contribuyen al procesamiento de la experiencia y

por lo tanto al aprendizaje.

IDENTIICACION CON ADN

La identificación con ADN o “huella genética” se basa en el estudio de una

serie de fragmentos de ADN presentes en todos los individuos pero que

poseen la característica de ser altamente variables o polimórficos entre los

mismos.

El análisis de un determinado número de estas secuencias o fragmentos de

ADN permite identificar a un individuo con una probabilidad muy cercana al

100%.

Además de ser muy polimórfico, el ADN que se utiliza para la identificación en

Genética Forense es un ADN no codificante o no expresivo, por lo que no revela

características fenotípicas de los individuos; este hecho es de gran

importancia a la hora de considerar la creación de las bases de datos

genéticas.

Para analizar dichos polimorfismos del ADN, los laboratorios de Genética

Forense utilizan una serie de técnicas que están en continua evolución,

consiguiendo que cada vez la identificación por medio del ADN sea más precisa

y rápida.

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1. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN

La Hemogenética Forense nace a principios de siglo, cuando Karl Landsteiner

describe el sistema ABO de los hematíes y Von Durgen y Hirschfeld descubren

su transmisión hereditaria. Esta ciencia surgió como una rama de la

Criminalística cuyo objetivo era la identificación genética tanto en casos de

investigación criminal como en estudios biológicos de la paternidad.

Inicialmente, las investigaciones se centraban en el estudio de antígenos

eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), proteínas séricas, enzimas

eritrocitarias y sistema HLA. Con el estudio de dichos marcadores podía

incluirse o excluirse una persona como posible sospechoso por poseer una

combinación genética igual o diferente a la del vestigio biológico hallado en el

lugar de los hechos.

Pero fue a mediados de siglo cuando gracias al descubrimiento del ADN y de su

estructura y al posterior avance en las técnicas de análisis de dicha molécula la

Hemogenética Forense evolucionó considerablemente hasta el punto de que hoy

en día puede hablarse de una nueva subespecialidad dentro de la Medicina

Forense: la Genética Forense. Dicha ciencia estudia básicamente unas regiones

del ADN que presentan variabilidad entre los distintos individuos, es decir,

estudia regiones polimórficas del ADN. Así, analizando un determinado número

de regiones polimórficas, la probabilidad de que dos individuos sean

genéticamente iguales es prácticamente nula (excepto en el caso de gemelos

univitelinos).

Aunque la Ciencia poseía las herramientas necesarias para el estudio del ADN,

su aplicación en la resolución de casos judiciales no se produjo hasta 1985,

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cuando el Ministerio del Interior Británico solicitó la ayuda de Alec J.

Jeffreys, profesor de Genética de la Universidad de Leicester. Los primeros

casos de Criminalística fueron resueltos gracias a la técnica de los RFLPs

(Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica). Jeffreys descubrió la

existencia de unas regiones minisatélites hipervariables dispersas por el

genoma humano que al ser tratadas con enzimas de restricción generaban

fragmentos de longitud variable. Estudios posteriores realizados el mismo

Jeffreys demostraron que las diferencias en el tamaño de estos fragmentos

se debían a que estas regiones consistían en un determinado número de

repeticiones en tándem de una secuencia central, el cual variaba de unos

individuos a otros.

El primer locus de ADN polimórfico fué descubierto por Wyman y White en

1980 usando una sonda de ADN arbitraria. De esta manera observaron

fragmentos de más de 15 longitudes diferentes en una pequeña muestra de

individuos. Posteriormente se encontraron otros loci hipervariables como en la

secuencia del gen de la insulina humana, en el oncogen “ras”, en el pseudogen de

la zeta-globina y en el gen de la mioglobina. Estos loci hipervariables constaban

de repeticiones en tándem de una secuencia de oligonucleótidos (11 a 60 pb), de

manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados dependían

del número de dichas repeticiones y se les denominó VNTR (“Variable Number

of Tandem Repeat”).

Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se vio que éstos podían ser

aplicados a la medicina forense y sustituir a los marcadores clásicos.

En un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hizo por medio de

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la técnica llamada hibridación con sondas o Southern blot. Esta técnica consta

básicamente de las siguientes etapas:

1. Digestión del ADN con enzimas de restricción tras conseguir extraer un

ADN de alta molecularidad.

2. Separación de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis

en gel de agarosa.

3. Desnaturalización de los fragmentos separados y cortados.

4. Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o

nylon y fijación de las mismas por medio de calor (80ºC).

5. Prehibridación con sondas de ADN inespecífico para bloquear los lugares

de unión inespecíficos que pudiera haber en la membrana.

6. Marcaje de la sonda con nucleótidos radioactivos (32 P normalmente).

7. Hibridación de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos

de ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para eliminar el

exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado mal.

8. Revelado en placa radiográfica e interpretación de los resultados.

El tipo de sondas utilizadas puede ser de dos tipos:

Sondas Mono-locus (SLP): son específicas para una región de un

determinado cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucleótidos y

presentan mayor variabilidad que las sondas multi-locus. Como resultado se

observan una o dos bandas por individuo, según sea homocigoto o heterocigoto.

El patrón de bandas obtenido con estas sondas se denomina perfil unilocus de

ADN o “DNA profiling”

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Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatélites

presentes en varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15

nucleótidos que se repiten múltiples veces y tras el revelado se observan de 10

a 20 bandas por persona. Este patrón de múltiples bandas se conoce como

huella genética multilocus o “DNA fingerprint”.

Sondas multilocus Sondas unilocus

Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de ventajas e inconvenientes

con respecto a una serie de parámetros como son:

Información aportada: las sondas multi-locus tienen una mayor capacidad

discriminativa al aparecer múltiples bandas. No obstante, las mono-locus son

más específicas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es de mayor

tamaño.

Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas multi-locus se

requiere aproximadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que

en el caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y este ADN no

necesariamente debe estar en perfecto estado, siempre y cuando el fragmento

complementario a la sonda esté intacto.

Especificidad entre especies: las sondas multi-locus permiten su uso

sobre el ADN humano y de cientos de animales superiores, mientras que las

mono-locus son exclusivas de ADN humano.

A pesar de que el análisis SLP ha sido y es bastante útil en estudios de

paternidad no puede decirse lo mismo de su aplicación a la Criminalística ya que

presenta una serie de inconvenientes como son:

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La cantidad de ADN que se necesita está entre 20 y 100 ng, cantidad

difícil de conseguir en casos de criminalística en los que los indicios biológicos

encontrados son mínimos.

En cuanto a la calidad del ADN, en la práctica forense es muy difícil

encontrar en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se necesita

para un análisis con sondas mono-locus.

El tiempo requerido para este tipo de análisis es de dos o tres días.

El hecho de que se requieran cantidades elevadas de ADN hacen que

normalmente, con el primer análisis se consume la totalidad de la muestra, con

lo que se dificultan contrapericias y una posterior revisión del caso.

Todas estas limitaciones fueron superadas gracias a la aplicación en Genética

Forense de una técnica, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (“PCR”), que

supuso una revolución en muchos campos de la Biología y de la Medicina.

El estudio de indicios biológicos por PCR ha permitido la resolución de un gran

número de casos en Criminalística que hasta entonces eran desestimados por

no poseer la suficiente cantidad de muestra para su análisis por RFLP. Con el

uso de la PCR muestras tan mínimas como pueden ser un pelo con raíz, una

minúscula mancha de sangre o semen e incluso caspa son suficientes en muchos

casos para llevar a cabo un análisis de identificación genética.

Análisis por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en

inglés, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de

veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma,

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siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta

técnica fue ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de

Química en 1993 por dicho invento.

Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20

nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que

se quiere amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su

nombre en inglés, "primers") actúan como cebadores para la síntesis in vitro de

ADN la cual está habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq

polimerasa. Dicha enzima se aísla de una bacteria termófila,

denominadaThermus Aquáticus, que es capaz de crecer a temperaturas

elevadas (79 - 85 º C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener

una media de extensión de más de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas

en uniones G-C. La temperatura optima a la que actúa la Taq polimerasa permite

el uso de elevadas temperaturas para la unión de los primers y para la

extensión, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la reacción y se

reduce la extensión de los primers unidos inespecíficamente al ADN.

La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye

tres fases o pasos:

1. DESNATURALIZACIÓN: Para que comience la reacción es necesario

que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se

consigue aplicando temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de

los puentes de hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de

ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de

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toda la muestra está temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el

ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a renaturalizares

rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los primers y una

posterior extensión.

2. HIBRIDACIÓN: Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de

emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye

la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para

que se pueda producir la unión de los primers a las secuencias

flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de

fusión o annealing (Tm, “melting temperature”) depende de varios

factores y es relativamente específica para cada primer. La longitud de

los primers y la secuencia son críticas en la designación de los

parámetros de una amplificación, una fórmula simple para calcular la Tm

es la siguiente:

Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).

No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales

para determinar su temperatura de annealing específica ya que si la

temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es

muy alta no se producirá una unión completa.

3. EXTENSIÓN: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora

nucleótidos en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena

de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a

cabo este paso suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que

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la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una

extensión de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores

de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.

Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de

rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a

otra y depende del diseño y de las características del aparato donde se realiza

automáticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de

termocicladores este factor se ha ido optimizando para hacerlo mínimo.

Componentes de la PCR

a. BUFFER DE AMPLIFICACIÓN

Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y

MgCl2. El MgCl2 es el componente que más influye en la especificidad y

rendimiento de la reacción ya que los iones Mg2+ son necesarios para la

actividad de la Taq polimerasa, es decir, actúan como cofactores de la

polimerasa.

La concentración óptima de MgCl2 está en torno a 1.5 mM si se emplean

concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es

necesario probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo

origina una acumulación de productos inespecíficos y una cantidad insuficiente

hace que disminuya el rendimiento de la amplificación.

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b. PRIMERS

A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de

ADN hay una serie de reglas a seguir:

La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24

bases ya que se ha comprobado que primers de mayor longitud (30-35 bases)

no aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de suficiente

especificidad.

Ambos primers deben tener una Tm similar (como mucho la diferencia entre

ambas temperatura debe ser de 5ºC).

La relación bases púricas: bases pirimidínicas debe ser 1:1 (o como mucho 40-

60%).

La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases púricas.

Para evitar la formación de dímeros de primers es necesario comprobar

que los primers no contengan secuencias complementarias entre sí.

Los dímeros de primers consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitud

es muy próxima a la de la suma de los primers y se producen cuando un primer

es extendido a continuación del otro. El mecanismo exacto por el que se forman

estos dímeros no está completamente determinado. La observación de que

primers con los extremos 3' complementarios favorecen su formación sugiere

que el paso inicial se debe a interacciones transitorias que aproximan los

extremos complementarios. Algunas polimerasas, incluida la Taq, han mostrado

una débil actividad polimerizadora no dirigida por un ADN patrón, la cual puede

unir nucleótidos adicionales al doble extremo apareado. Si esta actividad puede

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producirse sobre una hebra sencilla de oligonucleótidos, resultaría una buena

oportunidad para que la extensión formara un corto solapamiento en el

extremo 3' con el otro primer, suficiente para promover la formación del

dímero.

c. DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATOS

Las concentraciones de dNTPs que suelen usarse están en torno a 200 µM para

cada uno de ellos. En un volumen de reacción de 25 µl con esta concentración

de dNTPs se sintetizarían entre 6-6.5 µg de ADN. La concentración de dNTPs

y de MgCl2 va relacionadas ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que

concentraciones elevadas de dNTPs inhibirían la reacción al no tener la Taq

polimerasa suficiente Mg como para incorporar dNTPs. Para una concentración

de 200 µM de cada dNTP se suele añadir MgCl2 a una concentración de 1.5 mM.

d. TAQ-POLIMERASA

Las cantidades óptimas de Taq polimerasa necesarias para la síntesis de ADN

están alrededor de 2 unidades en 25 µl de volumen final de reacción. La

actividad de este enzima se ve influenciada por la concentración de dNTPs, de

Mg2+ y de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas

de los mismos inhiben dicha actividad.

Por otro lado, pequeñas concentraciones de KCl estimulan la actividad sintética

de la Taq en un 50-60% con un máximo aparente cuando su concentración es de

50 mM. Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos

reactivos que se emplean antes de la amplificación y que alteran la actividad de

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la Taq. Por ejemplo concentraciones 1M de urea estimulan la actividad, el SDS

a bajas concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones mayores del

10% de etanol.

e. ADN MOLDE O “TEMPLATE"

Es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, es, por tanto,

el ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la síntesis de nuevas

cadenas polinucleotídicas. La cantidad de ADN necesaria para la PCR depende

de varios factores:

Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son más

específicos o bien cuyas condiciones de amplificación están mejor optimizadas

que las de otros. Por esta razón puede darse el caso de que cierta cantidad de

ADN (sobre todo cuando jugamos con cantidades mínimas) amplifique para unos

marcadores pero no para otros. Por ello, cuando en un laboratorio se va a

utilizar un nuevo marcador es necesario hacer un estudio de validación en él

que se incluye un estudio de sensibilidad. De dicho estudio de sensibilidad

puede sacarse como conclusión cuál es la mínima cantidad de ADN que amplifica

en condiciones estándar. De manera general, para casi todos los STR utilizados

en Genética Forense la cantidad óptima de ADN que asegura un rendimiento

adecuado está en torno a los 5 ng.

Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es óptima no suele

haber problemas en la amplificación y cantidades del mismo por encima e

incluso por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados. El problema aparece

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cuando la calidad del ADN obtenido no es la idónea, bien porque esté

degradado o bien porque dicho ADN vaya ligado a una serie de contaminantes

que pueden inhibir la actividad de la polimerasa. Si el ADN está degradado por

la acción de enzimas de restricción el que obtengamos o no resultado en la

amplificación va a depender de que el fragmento a amplificar haya sido dañado

o no. En el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de

contaminantes habría que intentar diluir al máximo la muestra para disminuir

dichos contaminantes, pero siempre dentro de un rango de ADN que no esté

por debajo del límite de sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades

mínimas de ADN y la presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un

hecho habitual en Criminalística y requiere un estudio pormenorizado de la

muestra antes de la amplificación.

ADYUVANTES DE LA PCR

Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. Aunque

algunos autores han recomendado el uso del DMSO y del glicerol, el adyuvante

más extendido y utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8

µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como una proteína

captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa.

La PCR ofrece una serie de ventajas, frente al uso de las técnicas de análisis

genético utilizadas con anterioridad, como son:

Su capacidad para obtener resultados en casos en los que la cantidad de

ADN es mínima o en casos en los que el ADN esté parcialmente degradado.

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Genera en un espacio corto de tiempo un elevado número de copias de la

secuencia de ADN que es objeto de estudio, lo cual permite utilizar técnicas

de visualización más sencillas y rápidas que el uso de sondas marcadas

radioactivamente.

Permite la determinación y agrupación alélica en clases discretas, lo que

facilita la elaboración de bases de datos al ser la estandarización inmediata y

posibilitar la aplicación de métodos bioestadísticos y programas elaborados.

El uso de marcadores microsatélites de pequeño peso molecular aumenta las

probabilidades de obtener resultados positivos de amplificación cuando el ADN

se encuentra degradado ya que puede ser que dichos fragmentos no hayan sido

digeridos. Esta ventaja es de gran importancia en Criminalística ya que

normalmente los indicios biológicos encontrados han estado sometidos a

diversos factores (calor y humedad) que favorecen el crecimiento bacteriano.

Sin embargo, una de las grandes ventajas de la PCR que es su elevada

sensibilidad puede, en ocasiones, convertirse en un gran problema ya que se

podría coamplificar un ADN extraño o ajeno al que nos interesa. No obstante,

en los laboratorios de Genética Forense las medidas de precaución que se

toman para evitar problemas de contaminación por manipulación son extremas.

Una vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados en

función de su tamaño por medio de un proceso de electroforesis. Actualmente

se utilizan dos tipos de electroforesis en los laboratorios de Genética Forense:

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Electroforesis en geles verticales de poliacrilamida

Electroforesis capilar

La electroforesis capilar es una técnica relativamente novedosa en el campo de

la Genética Forense pero que está poco a poco sustituyendo a los sistemas de

electroforesis vertical. En este caso el proceso electroforético es llevado a

cabo en un capilar de silica de unas 50 m de diámetro, lo cual hace que la

cantidad de calor generado sea menor y que puedan aplicarse voltajes mayores.

Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar los primers o los

dideoxinucleótidos (en el caso de la secuenciación) deben ser marcados

fluorescentemente con unas moléculas denominadas fluorocromos que emiten

fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son excitados por

láser. El equipo en el que se realiza el proceso lleva acoplado un ordenador

encargado de traducir los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o

fragmentos con sus correspondientes alelos asignados. La electroforesis

capilar presenta una serie de ventajas frente a los sistemas de electroforesis

vertical como son:

Rapidez: ya que permite el análisis simultáneo de varios loci aunque éstos

posean alelos con tamaños solapantes.

Sensibilidad: hace posible detectar cantidades muy pequeñas de ADN

amplificado.

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Los resultados se obtienen de manera informatizada, lo que evita problemas

de interpretación de los resultados y facilita el análisis de los mismos a través

de programas informáticos.

Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando

electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se

observan los patrones bandas podrá comprobarse como

los perfiles obtenidos en las manchas de sangre

encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans)

del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la

víctima (V)

Caso de estudio biológico de la

paternidad realizado con

electroforesis capilar. Cada

pico corresponde a un alelo, el

hijo (H) debe poseer un alelo

de la madre (M) y otro del

padre (P) para que la

paternidad sea compatible

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FUTURAS TECNOLOGÍAS: BIOCHIPS

Las técnicas de análisis genético se encuentran hoy en día en continuo

desarrollo y evolución. La necesidad de técnicas que permitan el aislamiento y

análisis de los casi cien mil genes que componen el genoma humano justifica la

existencia de líneas de investigación destinadas al descubrimiento de nuevos

métodos que permitan monitorizar elevados volúmenes de información genética

en paralelo y que reduzcan tanto el tiempo empleado como el coste por

análisis.

Desde el análisis de los primeros polimorfismos de ADN con fines

identificativos, la Genética Forense ha sufrido una gran evolución. Los

expertos en la materia han sido testigos de cómo el descubrimiento de la PCR

revolucionó las técnicas de identificación genética. Es probable que la próxima

revolución la constituyan los llamados biochips o microarrays.

Los biochips surgen como consecuencia de una combinación entre técnicas

microelectrónicas empleadas para la fabricación de microprocesadores

informáticos y materiales biológicos. En general puede decirse que la principal

característica de los chips es su capacidad para generar información en muy

poco espacio, ya que posibilitan el procesamiento de multitud de ensayos

simultáneamente. Esta característica es la que hace que los biochips sean

probablemente la tecnología del futuro en el campo de las investigaciones

biomédicas.

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La fabricación de los biochips es similar a la de los chips informáticos: por

medio de la técnica denominadafotolitografía se depositan circuitos

microscópicos sobre láminas de silicio. En el caso concreto de los biochips,

estas láminas son de vidrio y lo que se deposita en dichas láminas son cadenas

de ADN. Las láminas de vidrio presentan una serie de ventajas como son:

 Posibilidad de unir las cadenas de ADN a la superficie del cristal,

convenientemente tratada, mediante enlaces covalente.

 Su capacidad para aguantar altas temperaturas y lavados de elevada

fuerza iónica.

 Al ser un material no poroso el volumen de hibridación puede reducirse

al mínimo.

Su baja fluorescencia evita ruidos de fondo. Hay compañías comerciales que

han desarrollado otras estrategias para la fabricación de biochips. No

obstante, los más usados actualmente y con mayor número de aplicaciones son

los basados en técnicas fotolitográficas.

Estos chips, como se dijo anteriormente, consisten en una pequeña lámina de

vidrio que posee unos grupos reactivos, a los que posteriormente se unirán los

nucleótidos, protegidos mediante una película realizada con un agente químico

fotodegradable. Mediante una máscara que se sitúan sobre el chip, se logra

enfocar un haz de luz hacia unas posiciones y regiones determinadas,

degradando al agente químico protector en dichas zonas y dejándolo intacto en

las zonas protegidas por la máscara. A continuación se añade al chip un medio

que contiene uno de los cuatro nucleótidos que se unirá, mediante enlace

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covalente, al cristal con los grupos reactivos que hayan quedado desprotegidos.

Cada grupo añadido lleva una molécula receptora fotodegradable.

Todo este proceso se va repitiendo con los diferentes nucleótidos y máscaras

hasta generar unos oligonucleótidos con las secuencias que nos interesen. El

siguiente esquema muestra el todo el proceso explicado anteriormente.

Cada “casilla” del chip posee una cadena de un oligonucleótido de manera que

solamente aquel fragmento de ADN que hibride perfectamente con ella

permanecerá unido tras los diversos lavados.

Previamente a la hibridación, el ADN de la muestra a estudiar debe haber sido

amplificado y marcado fluorescentemente en uno de sus extremos. Una vez

marcado se incuba en el recipiente que contiene al chip tras lo cual se lava

varias veces para eliminar los fragmentos que no hayan hibridado y se

introduce el chip en un escáner en el que se detectan los patrones de

hibridación. Esta detección se realiza en base a la fluorescencia emitida por los

fluorocromos de la muestra cuando son excitados por luz y en aquellos pocillos

en los que la unión haya sido completa la fluorescencia será mayor que los que

contengan alguna base desapareada.

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Un ordenador conectado al escáner es el que identifica las secuencias sonda

por su posición el chip.

Aplicaciones de los biochips

A pesar de ser una tecnología muy reciente y que, por lo tanto, está aún en vías

de experimentación, actualmente los biochips están siendo aplicados en:

Monitorización de expresión génica: permite determinar cuál es el

patrón de expresión génica y cuantificar el nivel de expresión de manera

simultánea para un elevado número de genes. Esto permite realizar

estudios comparativos de activación de determinados genes en tejidos

sanos y enfermos y determinar así la función de los mismos.

Detección de mutaciones y polimorfismos: Permite el estudio de todos

los posibles polimorfismos y la detección de mutaciones en genes

complejos.

Secuenciación: Mientras que se han diseñando algunos biochips para

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secuenciación de fragmentos cortos de ADN, no existe aún en el

mercado ningún biochip que permita secuenciar de novo secuencias

largas de ADN.

Diagnóstico clínico y detección de microorganismos: Posibilitan la

identificación rápida empleando unos marcadores genéticos de los

patógenos.

Screening y toxicología de fármacos: el empleo de los biochips permite

el analizar los cambios de expresión génica que se dan durante la

administración de un fármaco de forma rápida, así como la localización

de nuevas posibles dianas terapéuticas y los efectos toxicológicos

asociados.

Seguimiento de terapia: los biochips permiten valorar rasgos genéticos

que pueden tener incidencia en la respuesta a una terapia.

Medicina preventiva: El conocimiento y posible diagnóstico de ciertos

caracteres genéticos asociados a determinadas patologías permite una

prevención de las mismas antes de que aparezcan los síntomas.

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BIOLOGIA FORENSE

1. ANTECEDENTES.

HISTORIA DE LA BIOLOGIA FORENSE

En el año 1000, Quintilian utilizó como prueba de un homicidio la impresión de

una palma sangrante ante la Corte Romana.

En la China feudal del siglo XIII, se halla el primer antecedente del uso de

insectos en la solución de un caso de homicidio.

En 1839 H. Bayard publicó una técnica de detección de espermatozoides por

microscopía.

En 1853 Ludwig Teichmann, en Polonia, desarrolló el primer ensayo

cristalográfico para hemoglobina, usando cristales de hemina o hematina.

En 1863 el científico alemán Schönbein descubre la habilidad de la hemoglobina

para reducir el peróxido de hidrógeno, provocando una espuma o burbujeo

(primer test presuntivo para sangre).

En 1901 Paul Uhlenhuth, un inmunologo alemán desarrolla la técnica de

precipitinas como test para determinar la especie en sangre.

En 1900 Karl Landsteiner descubre la existencia de grupos sanguíneos

humanos, por lo que recibio el Premio Nobel en 1930.

En 1904 Oskar and Rudolf Adler desarrolló un test presuntivo para sangre

basado en la bencidina, una nueva sustancia desarrollada por Merk.

En 1912 Masaeo Takayama desarrolló otro método microcristalogáfico para

detectar hemoglobina, usando cristalles de hemocromogeno.

En 1915 Leone Lattes, profesor del Instituto de Medicina de Turín, desarrolló

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el primer test de serológico para grupos sanguíneos y lo utilizó para resolver el

primer caso de paternidad.

En 1920 Georg Popp inicia el uso de identificación botánica aplicado al trabajo

forense.

En 1923 Vittorio Siracusa, en Italia, desarrollo el test de absorción-elución

para tipificación de grupos sanguíneos en manchas secas.

En 1925 Saburo Sirai, un científico japonés identifica la presencia de

antigenos grupo-específicos de secreción en otros fluidos corporales

diferentes a la sangre.

En 1928 Meüller desarrolla un método presuntivo de detección de amilasa en

manchas de saliva.

En 1938 Walter Specht, en Alemania desarrolló el reactivo quimioluminiscente

luminol para test presuntivos de detección de sangre.

En 1940 Landsteiner y A.S. Wiener descubren el factor sanguíneo Rh.

En 1945 Frank Lundquist, en Noruega desarrolla el primer test de detección de

fosfatasa ácida en semen.

En 1958 A. S. Weiner y otros introducen el uso de H-lectin para determinar

positivamente el tipo sanguíneo O.

En 1963 D.A. Hopkinson y otros identificó la naturaleza polimórfica de la

fosfatasa ácida de eritrocitos (EAP).

En 1964 N. Spencer y otros identifican la naturaleza polimórfica de la

fosfoglucomutasa en eritrocitos (PGM).

En 1966 R. A. Fildes and H. Harris identificaron la naturaleza polimorfica de la

Adenilato ciclasa en eritrocitos (AK).

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Brian J. Culliford y Brian Wraxall desarrollo la técnica de inmunoelectroforesis

para haptoglobina en la tipificación de manchas de sangre.

En 1973 Hopkinson y otros identificaron la naturaleza polimorfica de la

esterase D (ESD).

En 1978 Brian Wraxall y Mark Stolorow desarrollaron un multisistema para

evaluar las isoenzimas PGM, ESD, y GLO simultáneamente. También

desarrollaron métodos para tpificar proteínas de suero sanguíneo tales como la

haptoglobina y el Gc.

En 1983 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue concebido por Kerry

Mullis, en la Corporación Cetus. Publicado recien en 1985.

En 1984 Sir Alec Jeffreys desarrollo el primer test de tipificación de DNA.

Utilizado en la detección de un patrón RFLP multilocus. Publicado en la revista

Nature en 1985. Utlizado pro primera vez en una corte inglesa en un caso de

violación y homicidio en 1986.

Henry Erlich desarrolla la técnica de PCR, usado en kits comerciales forenses,

para HLA DQ-alpha (DQA1).

Thomas Caskey, en Texas, desarrollan kits comerciales de uso forense para

tipificar STR-DNA.

En 1994 Roche desarrolla un kit de cinco polimarcadores, conjuntamente con

HLA-DQA1.

En 1997 es usado por primera vez en EEUU la tipificación de ADN mitocondrial

en una corte.

En 1998 el FBI desarrolla la primera base de datos de DNA.

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La Biología Forense en Latinoamérica y el Perú

En 1991, la justicia brasileña dispuso que Pele se sometiera a la prueba de ADN

la cual demostró que era padre de una niña.

En 1992, Julio Iglesias fue declarado padre de un menor por la justicia

española al no someterse a la prueba de ADN.

1995, El presidente argentino Raúl Menem reconoce a su nieta gracias una

prueba de ADN.

1996, primer caso en el Perú: La empresa pionera BIOLINKS ayuda a exculpar

a un inocente profesor en Puno.

En 1997, caso del violador de Parcona – ICA, es identificado por un vello

púbico.

En 1998, una niña descuartizada y hallada en Vitarte es identificada por el

ADN.

Se logra identificar restos óseos calcinados, hallados en Huachipa en 1993 y

corresponden a los estudiantes y profesores desaparecidos de la Universidad

la Cantuta.

En 1999, se decreta la Ley del Código Civil en el Perú, donde se admite como la

única prueba biológica de identificación humana.

En el año 2000, en Arequipa, se logra identificar unos restos óseos hallados en

una laguna en la localidad de Arcata y a la vez se logra esclarecer el homicidio.

Actualmente en el Perú, es usada como prueba de rutina en casos de

investigación de delitos de violencia sexual, homicidios, secuestros, delitos

contra el patrimonio, etc.

Introducción:

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La introducción la biología como ciencia en el proceso de la investigación policial

y la administración de justicia, ha redefinido el concepto de prueba del delito,

pues esta nunca antes había sido tan clara y consistente a la hora de resolver

casos criminales”

La biología es una ciencia antigua (50 mil años) desde que el hombre observa su

entorno y lo representa en el arte rupestre, era una manera primitiva como

hacían biología a través de su conocimiento empírico para garantizar su

supervivencia

La Biología

estudia y evalúa sistemáticamente y continuamente a la vida tanto vegetal,

animal como también a los seres humanos y lo que estos en conjunto generan.

La biología forense:

• Análisis e interpretación de las evidencias ejemplo sangre, semen u otros

fluidos corporales en la escena de un delito para resolver problemas judiciales

y forenses así como las pruebas de paternidad que determinen en última

instancia la participación de los implicados o el parentesco familiar.

Conceptos:

La biología nos ayuda en el esclarecimiento de delitos relacionados

consustancias orgánicas, violaciones sexuales, contaminación de alimentos,

homicidios y otros; son muchos los exámenes que la criminalística usa los

conocimientos de esta ciencia, como exámenes biológicos de mancha de sangre,

en cadáveres, en deferentes armas, en vehículos, etc.

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Entendiendo a la Biología como la ciencia de la vida. Esto incluye todos los

aspectos de forma, función, evolución, conducta, origen y distribución de

plantas y animales (incluida obviamente la especie humana). Diremos que la

Biología Forense es la aplicación de este conocimiento científico a cualquier

contexto legal.

Aplicación de conocimientos de las Ciencias Biológicas en la Criminalística,

mediante el estudio sistemático de las huellas o indicios biológicos dejados por

el autor o víctima en la escena del crimen, con la finalidad de determinar la

relación de éstos con el hecho delictuoso y apoyar técnica y científicamente en

el esclarecimiento de problemas policiales y judiciales.

La biología forense como parte de la práctica de análisis bioquímicos

consistentes en sangre, semen, orina, saliva, etc. Así como examinar restos de

tejidos humanos especímenes animales, vegetales y otros indicios.

Estos análisis se realizan en sustancias liquidas (manchas frescas o secas), y en

sustancias solidas las otras de cualquier otro tipo.

SINÓNIMOS DE BIOLOGÍA FORENSE:

Biocriminalistica

Biología legal

Biología judicial

AREAS DE ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA FORENSE.

La biología forense comprende las siguientes aéreas:

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Hematología:

Concepto:

Es la aplicación criminalística de la morfología serológica y bioquímica de la

sangre, abarcando tanto el aspecto reconstructor como el identificador ya sea

en el ámbito Policial, Civil y Penal.

Esta ciencia se encarga de realizar exámenes de manchas de sangre y

muestras sanguíneas, para determinar:

♣ La naturaleza biológica.

♣ Origen humano.

♣ Tipificación por sistemas de grupos sanguíneos.

♣ Análisis de la morfología y patrones de las manchas sanguíneas.

Valor Criminalistico:

Es el estudio de la sangre ya sea en estado fresco o como mancha seca el cual

permitirá determinar el grupo sanguíneo al cual pertenece (O,A,B ó AB), el

factor sanguíneo características de las manchas formas de las manchas y el

aspecto de las mismas.

Esta determinación de las manchas podrá realizarse en el laboratorio o en el

lugar de los hechos.

En el Laboratorio: A través de exámenes biológicos y analíticos

especiales, y que por la delicadez de los métodos y equipos utilizados no

pueden ser verificados en el mismo lugar de los hechos

En el lugar de los Hechos: Esta se realiza en la misma escena del delito

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en las prendas de vestir, en instrumentos y en cualquier otra evidencia

incluyendo el cuerpo y cadáver mismo de las personas.

Es importante analizar también la naturaleza y la forma de la mancha sanguínea

ya que muchas veces esta sufre modificaciones.

Existen también otras sustancias orgánicas e inorgánicas que tienen semejanza

a la sangre en estos casos el diagnostico criminalistico es de mucha importancia

para poder determinar la investigación.

Como sustancias orgánicas: pueden darse en cualquier tipo de vegetales

ejemplo la betarraga, tomates, con el látex de sangre de grado.

Con sustancias Inorgánicas: con algunos ácidos o químicos ejemplo el aceptil

rojo.

Espermatologia:

Concepto: Es una ciencia que se ocupa del estudio de la morfología y bioquímica

del semen en los casos de delitos

contra la Libertad sexual

comprendiendo exámenes, para la

identificación de restos

seminales en secreciones

espermáticas (lavado balano-

prepucial), vaginales, bucales,

rectales y en muestras

incriminadas, determinando:

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♣ La naturaleza biológica de manchas seminales.

♣ Origen humano.

♣ Estudio anormalidades de la morfología de los espermatozoides y otros con

fines de identificación.

♣ Tipificación por antígenos secretores ABO.

Valor criminalistico: Consiste en la identificación y el hallazgo del

espermatozoide para poder determinar si pertenece a una célula del género

masculino humano, animal o vegetal.

El estudio del Semen debe llevarse acabo tanto en prendas de vestir u otros

soportes que se encuentren sobre el cadáver o la victima así como en el

agresor ya sea en la escena del crimen o en el laboratorio.

Es importante obtener las prendas de vestir manchadas con semen tanto de la

víctima como del acusado y enviarlas por separado, embaladas y lacradas por

ningún motivo deben mezclarse las prendas en un solo paquete

También existen falsas huellas que generalmente son fabricadas o creadas por

la victima para acusar al presunto agresor por el delito de violación sexual.

Ojo: Si se Recoge las muestras después de 4 días de suscitado el hecho sexual

Será un frasco de indicio o evidencia.

TRICOLOGÍA:

Concepto: Ciencia que se ocupa del estudio de los pelos tanto en la

individualización como en la identificación de los pelos del presunto agresor y

de la víctima.

Por otro lado la tricología también realiza estudios de identificación y

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comparación de fibras y pelos, determinando:

♣ La naturaleza de la fibra (vegetal, animal, mineral o sintética).

♣ Si es animal o humana.

♣ Sexo.

♣ Procedencia (cabello, vello lanugo fetal, etc.)

♣ Identificación de caracteres adquiridos (corte de pelo, ondulado, teñido,

etc.).

Alcance De La Tricología:

• En humanos

– Hechos delictivos relacionados a lesiones u homicidios.

– Hechos delictivos relacionados contra la libertad sexual

• En animales

– Matanza clandestina de animales.

Objetivos:

• Probar origen humano

• De qué región proviene

• Si ha caído espontáneamente,

arrancado, cortado o quemado

• Determinar el sexo

• Edad del sujeto que proviene

• Si están teñidos

• Si está decolorado

• Si está traumatizado

• Individualidad del pelo

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Valor Criminalistico: Los pelos pueden estudiarse tanto microscópicamente

como macroscópicamente.

Microscópicamente: aquí se determinara la morfología del pelo que puede

variar según la raza región corporal y otros aspectos (teñirse el cabello), así

como también se determinara el numero de pelos, porque cuanto mayor sea el

numero que se estudie más seguro será el examen.

Macroscópicamente: Permite apreciar con precisión las estructuras internas y

determinar sus características para la individualización e identificación del

pelo para poder identificar si es que este presenta alguna sustancia (sangre,

polvo, tinte, etc.). Es importante que el estudio se realice tal como se en

cuantra el pelo en la escena del delito.

Biología MolecularADN – Forense:

Realiza exámenes en diferentes secreciones biológicas para identificar a

las personas por su ADN.

En Casos Forenses a fin de comparar la muestra del sospechoso con la

evidencia encontrada en la escena del crimen o recuperada de la víctima.

Investigaciones de Personas Desaparecidas.

Determinación de Paternidad.

Determinación de **Filiación**.

Identificación de especímenes animales y vegetales.

El proceso que sigue un análisis de ADN es el siguiente:

 Dependiendo del tipo de tejido se sigue el procedimiento específico

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estandarizado de extracción del ADN.

 Amplificación de la muestra por reacción en cadena de la polimerasa o

PCR a fin de obtener millones de copias del fragmento de ADN.

 Tipificación, donde se evidencia las características de cada una de las

muestras que se cotejan (Víctima, sospechoso y evidencias).

Análisis Especiales:

Concepto: Es una parte de la biología forense que se encarga del estudio de

diversas muestras tales como insectos, uñas, escamas, secreciones biológicas,

restos vegetales, animales y otros de índole biológica.

Valor Criminalística:

Como ejemplo:

Uñas: Se estudiaran las huellas dejadas por las uñas en el cuerpo de la victima

sospechosa sobre una superficie blanda que pueda dar indicios importantes con

los obtenidos en el laboratorio.

Recojo y envió de muestras biológicas al laboratorio de criminalística:

Recojo de muestras: Estas deben ser levantadas por el pesquisa o perito con el

mayor cuidado posible cuidando las muestras que se hallo en la escena del

delito.

En el caso de manchas de sangre se recogerán levantando en lo posible el

soporte donde se encuentran (piedras pequeñas, madera, utensilios, telas, etc),

así mismo se indicara el lugar de donde se recogen y se les colocara la

numeración correspondiente.

En el caso del semen este se recogerá con instrumentos adecuados y se

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colocara en tubos de ensayo a una temperatura adecuada para evitar

contaminación.

Embalaje de muestras: Una vez recogidas las muestras y reconocidas estas, se

procederá a su marcado y sellado para su envió al laboratorio de criminalística.

Para cada tipo de muestra o indicio se utilizara un procedimiento diferente

(ejemplo: recojo de unas, cabellos prendas, etc.)

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AGRADECIMIENTO

Agradecemos a Dios nuestro padre celestial por protegemos día a día.

También nuestros más gratos sentimientos hacia nuestro profesor y hacia

nuestros compañeros, pues les agradecemos de antemano su atención y sus

críticas constructivas, pues sabemos que el presente trabajo no es perfecto

pero es nuestro esfuerzo y merecemos saber nuestros errores y nuestros

puntos a favor, viéndolo también como un estímulo, gracias también a nuestros

familiares y a las personas a las que les tenemos afecto personal pues muchas

de éstas nos han estimulado a seguir adelante y aunque el cansancio nos quiera

vencer, ellos no nos han dejado rendirnos. Gracias.

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REFERENCIA BIBLIOGRAFICA:

MAZPARROTE, Serafín. (1998). Biología 9no

grado Educación Básica. Editorial Biosfera. pp. 192

Encarta 2001 Nº1 : Articulo ADN Y ARN.

LINKOGRAFIA

html.www.genetica-forense.html
http://es.scribd.com/doc/4877732/INTRODUCCION-A-LA-

BIOLOGIA-FORENSE

http://www.criminalistica.net/forense/general/adn/57-

biologia-forense.html

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