12-6-2014

Microbiologia de los Alimentos I

Alumno: Luis Enrique Jiménez Raymundo

Docente: Dra. Graciela Alvino Cornejo

 ESCHERICHIA COLI

Contenido
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 2
Escherichia coli y sus características ............................................................................................. 3
Escherichia coli y su hábitat .......................................................................................................... 6
Escherichia coli en asociación con alimentos ................................................................................ 6
Escherichia coli en relación a los Límites Legales ........................................................................ 10
Escherichia coli y sus Serotipos ................................................................................................. 14
E. coli enterotoxigénica (ETEC)................................................................................................ 14
E. coli enterohemorrágico (EHEC) ........................................................................................... 15
E. coli enteroinvasiva (EIEC) .................................................................................................... 18
E. coli enteropatógena (EPEC) ................................................................................................. 18
E. coli enteroagregativa (EAEC) ............................................................................................... 19
Escherichia coli y su Detección .................................................................................................. 21
DIAGNÓSTICO .............................................................................................................................. 23
Cultivo y métodos inmunológicos para EHEC O157: ......................................................... 23
Métodos de cultivo para cepas EHEC no O157: ..................................................................... 23
Análisis de citotoxicidad en cultivos de tejido:....................................................................... 24
ELISA para la detección directa de Stx:................................................................................... 24
Hibridación con sondas de ADN: ............................................................................................ 24
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): .......................................................................... 24
Diagnóstico serológico: ........................................................................................................... 25
MÉTODOS NORMALIZADOS ........................................................................................................ 26
ISO 7251 Directiva general para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica del NMP
................................................................................................................................................. 26
NF V 08-053 Método de rutina para el recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos
................................................................................................................................................. 27
Detección y aislamiento de Escherichia coli O157 en una muestra de origen bovino a partir
de la técnica de separación inmunomagnética....................................................................... 28
NORMATIVA LEGAL PARA E. coli EN ALIMENTOS ....................................................................... 30
TRATAMIENTO............................................................................................................................. 40
Medidas preventivas contra la intoxicación alimentaria por Escherichia coli ............................ 41
Algunos consejos para evitar la infección con E. coli .................................................................. 42
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................................... 43

1
 ESCHERICHIA COLI

INTRODUCCIÓN
En 1885 Theodore Escherich, un pediatra alemán, describió por primera vez una bacteria
encontrada en las heces de neonatos y niños sanos la cual denominó Bacterium coli commune.
Posteriormente, en 1919 Castellani y Chalmers la denominaron Escherichia coli en su homenaje
y desde entonces ha sido uno de los seres vivos más estudiados, de hecho gran parte de los
conocimientos sobre la biología celular fueron adquiridos en estudios con este microorganismo
(Donnenberg, 2002).

Según el Manual Bergey de bacteriología sistemática son bacterias Gram negativas cilíndricas
con 1,1 – 1,5 µm de diámetro por 2,0 – 6,0 µm de largo que se disponen aisladas o en parejas.
Conforme a la definición general de la familia Enterobacteriaceae a la que pertenecen, son
bacterias quimioheterótrofas facultativas teniendo los metabolismos fermentativo y
respiratorio, no forman esporas, están desprovistas de oxidasa, producen catalasa y β-
galactosidasa, pueden ser móviles por flagelos peritricos o inmóviles y normalmente reducen
nitrato a nitrito.

El género Escherichia comprende cinco especies distintas: E. coli, E. hermanni, E. fergusonii, E.

vulneris y E. blattae (figura 1). La especie tipo es E. coli, además es la única de las cinco con
significación clínica. No obstante, E. hermanni, y E. vulneris han sido involucradas en infecciones
de heridas aunque de manera muy ocasional (Blanco et al., 2002).

El estudio de distintas reacciones bioquímicas puede ayudar en la diferenciación entre las

especies. Las principales pruebas fisiológicas que distinguen E. coli de las demás especies son
producción de indol, reacción negativa para el citrato de Simmons, producción de lisina
descarboxilasa, y fermentación de glucosa, lactosa y D-manitol (Scheutz y Strockbine, 2005).

2
 ESCHERICHIA COLI

Escherichia coli y sus características

Escherichia es el género tipo de la familia Enterobacteriaceae y E. coli es la especie tipo del
género.
Escherichia coli es un bacilo corto, Gram negativo, anaerobio facultativo, catalasa positivo,
oxidasa negativo, fermentador, no esporógeno. Genéticamente, E. coli está íntimamente
relacionado con el género Shigella, aunque característicamente fermenta el azúcar lactosa y por
otra parte es bastante más activo bioquímicamente que Shigella spp. Las cepas de E. coli
fermentadoras tardías de la lactosa, inmóviles y bioquímicamente inertes, pueden sin embargo
resultar difíciles de diferenciar de Shigella.

E. coli puede ser diferenciado de otros representantes de la familia Enterobacteriaceae en base

al número de azúcares que fermenta y mediante otras pruebas bioquímicas. (Cuadro I)
Clásicamente, un grupo importante de pruebas que se utilizan con esta finalidad se conoce con
la sigla IMViC. Estas se utilizan para ensayar la capacidad para:

I: producir indol del triptófano.

M: producir el ácido suficiente para disminuir el pH del medio por debajo de 4,4 punto de
viraje del indicador rojo de metilo.
V: producir acetoína (acetilmetil carbinol)
C: utilizar el citrato.
Puesto que la producción de ácidos mixtos y acetoína son vías alternativas correspondientes al
metabolismo del piruvato, la mayoría de las especies de la familia Enterobacteriaceae, son bien
VP-positivas, bien rojo de metilo-positivas. En las pruebas IMViC, la mayoría de las cepas de E.
coli con indol-positivas y rojo de metilo-positivas, mientras que son VP-negativas y citrato
negativas. Estas pruebas todavía se utilizan a los efectos de identificación aunque hoy día se
suelen utilizar como parte integrante de una serie más amplia de pruebas existentes en los
sistemas modernos de pruebas miniaturizadas.

3
 ESCHERICHIA COLI

E. coli es un organismo mesófilo típico que crece a temperaturas desde 7-10ºC hasta 50ºC, con
una temperatura óptima en torno a 37ºC, aunque ha habido referencias de algunas cepas ETEC
que crecieron a temperaturas tan bajas como es la de 4ºC. No presenta una termorresistencia
acusada, con un valor D a 60ºC del orden de 0,1 de minuto y es capaz de resistir el
almacenamiento en refrigeración o en congelación durante tiempos prolongados. Un pH casi
neutro es óptimo para su crecimiento aunque puede crecer a pH inferior a 4,4 siendo por otra
parte óptimas las demás condiciones de crecimiento. Su actividad de agua mínima de
crecimiento es 0,95.

Para determinar el grupo patógeno al que pertenecen Kauffman desarrolló un esquema de

serotipificación que continuamente varía y que actualmente tiene 176 antígenos somáticos (O),
112 flagelares (H) y 60 capsulares (K). El antígeno “O” es el responsable del serogrupo; la
determinación del antígeno somático y flagelar (O:H) indica el serotipo, el cual en ocasiones se
asocia con un cuadro clínico en particular. (Cuadro II)

La serotipificación de E. coli requiere de gran número de antisueros. Como hay pocos

laboratorios que la realizan, se prefiere identificar las cepas mediante sus factores de virulencia
empleando ensayos in vitro como por ejemplo ensayos de adherencia en células Hep-2 y
ensayos de toxigenicidad en células. También se pueden realizar ensayos in vivo, como el asa
ligada o la prueba de Sereny, así como ensayos inmunológicos y pruebas de manifiesto la
presencia de fragmentos de genes involucrados en el mecanismo de patogenicidad y que sirvan
de marcadores moleculares. (Cuadro III)

4
 ESCHERICHIA COLI

Con base en su mecanismo de patogenicidad y cuadro clínico, las cepas de E. coli causantes de
diarrea se clasifican en seis grupos: enterotoxigénica (ETEC), enterohemorrágica también
conococidas como productoras de toxina Vero o toxina semejante a Shiga (EHEC o VTEC o STEC),
enteroinvasiva (EIEC), enteropatógena (EPEC), enteroagregativa (EAEC) y adherencia difusa
(DAEC). (Cuadro IV)

5
 ESCHERICHIA COLI

Escherichia coli y su hábitat

E. coli es la especie bacteriana predominante de la microbiota aerobia y facultativa del tracto

gastro-intestinal de los animales sangre caliente y se elimina por las heces al exterior. A pesar
de ser el microorganismo facultativo predominante representa una muy pequeña proporción
del contenido total de bacterias en este sitio anatómico. (Blanco et al., 2002; Todar. 2008).
Algunos anaerobios como Bacteroides spp. Son, al menos, veinte veces más abundantes que E.
coli en el intestino grueso. Sin embargo por su presencia regular en el intestino y en las heces,
E. coli es utilizada como indicador de contaminación fecal. Se puede encontrar en el medio
ambiente ya que es capaz de sobrevivir algunos días en el agua y los alimentos, de manera que
su aislamiento es un indicador de contaminación fecal reciente (Blanco et al., 2002; Todar,
2008).
El intestino humano es colonizado por E. coli en las primeras 40 horas tras el nacimiento, siendo
la bacteria ingerida en agua y alimentos u obtenida directamente de otros individuos en
contacto con el recién-nacido. La bacteria se adhiere al moco que recubre el intestino grueso y
una vez establecida una misma cepa puede persistir indefinidamente, aunque constituya solo
aproximadamente el 0,1% de la población total (Prescott, 2002; Todar, 2008).

Escherichia coli en asociación con alimentos

Escherichia coli es el microorganismo más estudiado, y ha servido para dar los primeros pasos
en proyectos tan grandes como el del esclarecimiento del genoma humano.

Fue descubierta por Theodore Von Escherich en 1885. Es un germen comensal de la microbiota
intestinal de diversos animales, y como tal se lo usó tempranamente como indicador de
contaminación fecal en agua. Cuando se observó que había cepas productoras de diarrea,
especialmente en niños, los aislamientos obtenidos de los brotes epidémicos fueron tipificados
serológicamente utilizando sus antígenos somáticos (O), capsulares (K) y flagelares (H), y se
crearon antisueros que permitirían distinguir estas cepas, las cuales se denominaron
genéricamente como E. coli “enteropatógenos”

La contaminación fecal de las redes de abastecimiento de agua y los manipuladores de alimentos

contaminados, han sido implicados muy frecuentemente en brotes de enfermedad causados
por EPEC, EIEC y ETEC. Han sido implicados varios alimentos, entre los que se incluyen un
sustitutivo del café en Rumanía en 1961, las hortalizas, la ensalada de patatas y el sushi. En los
Estados Unidos, en 1971, los quesos blandos madurados por mohos han sido responsables de
brotes relacionados con EIEC en los que resultaron afectadas más de 387 personas y en 1983
fueron causados por ETEC (ST). No sería de esperar que E. coli sobreviviese favorablemente en
un producto lácteo fermentado con un pH inferior a 5 pero, en aquellos casos en los que la
contaminación está asociada con la maduración por mohos, el aumento local del pH como
consecuencia de la utilización del lactato y de la producción de aminas por el moho permitiría el
crecimiento del organismo.

Los brotes causados por el serotipo O157:H7 de EHEC han implicado principalmente a carne
picada insuficientemente cocida y accidentalmente a leche fresca. Seiscientas personas
enfermaron y cuatro niños murieron en un brote importante ocurrido en EEUU en 1993 causado
por hamburguesas insuficientemente cocidas. Este brote causó un importante clamor público
sobre la higiene de la carne y motivó, entre otras cosas, la implantación de normas nuevas

6
 ESCHERICHIA COLI

relativas al etiquetado de las carnes. Las inspecciones han aislado el serotipo en el 3,7% (6/164)
de las muestras de carne de vacuno que se vende al por menor y en un porcentaje importante
(1-2%) de otros productos cárnicos frescos, por ejemplo en la carne de cerdo, en los canales de
aves de corral y en la carne de cordero. En un brote habido en el RU, un rollo de pavo frío fue
implicado en terrenos epidemiológicos.

Hoy se sabe que E. coli productores de diarrea exhiben diversos mecanismos patogénicos,
posibilitados por sus múltiples factores de virulencia; y para dividirlas en las diversas categorías
actuales se utilizan sofisticadas técnicas tales como, patrones de adherencia a células in vitro,
hibridación con sondas de ácidos nucleicos, etc.

En los últimos tiempos, el grupo que adquirió mayor notoriedad como causante de Enfermedad
Transmitida por Alimentos (ETAs) es el de los E. coli productoras de Toxina Shiga (STEC), también
conocidas como VTEC por la actividad de su citotoxina sobre las células Vero, cuyo miembro más
conocido es Escherichia coli O157:H7. Este serotipo tiene características bioquímicas distintivas
(sobre el resto de E. coli) como la de no fermentar sorbitol y la de no tener actividad
betaglucoronidasa. De esta facilidad para tipificarla por pruebas sencillas posiblemente ha
resultado un cierto sobre-notificación relativa, respecto a las demás STEC no-O157.

El primer brote epidémico importante (700 enfermos, 4 muertos) ocurrió en Estados Unidos por
el consumo de hamburguesas insuficientemente cocidas en la cadena de comidas rápidas “Jack
in the Box”, en 1993. La enfermedad consistía en una diarrea sanguinolenta con graves
consecuencias extraintestinales, y a la bacteria se la catalogó como E. coli enterohemorrágica
(EHEC).

La emergencia de este patógeno con particulares características como una baja dosis infectiva y
tolerancia a los ácidos, condujo a una revisión de los conceptos aceptados sobre
tiempo/temperatura y acidez para preservar los alimentos de gérmenes nocivos. El
microorganismo, que ya había sido asociado a otro brote en 1982, esta vez originó importantes
cambios en la legislación alimentaria.

Cuando se hizo evidente que no era factible erradicar el microorganismo de la cadena

alimenticia, la prevención se focalizó en los más sencillo y efectivo, basándose en su fragilidad
al calor por ser una bacteria Gram negativa, se modificaron las normas elevando la temperatura
de cocción de las hamburguesas y se obligó a pasteurizar jugos de frutas tradicionales
expendidos en la vía pública que también fueron vehículo de la bacteria.

En 1994 el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) obligó a etiquetar los
alimentos en relación al manejo sanitario de productos cárnicos y avícolas, y luego reglamentó
el sistema de Análisis de Peligros y Puntos de Control Críticos (HACCP), requiriendo que muchas
compañías incluyeran la EHEC al identificar los peligros en sus planes. La nueva legislación otorgó
a la USDA competencia para retirar productos del mercado, y en agosto de 1997, luego de un
brote, se recogió la mayor cantidad de alimentos registrada en EEUU hasta la fecha.
Diversos brotes donde los alimentos vehículos involucrados fueron vegetales (brotes de alfalfa,
jugo de manzana, lechuga, coles de Bruselas, rábanos, etc.) trajeron aparejados cambios en la
horticultura. Se revisó la práctica de reciclar estiércol como abono, al observarse que el
microorganismo podía sobrevivir más de los sesenta días aceptados hasta el momento como
período de retención. Y a los horticultores comenzó a considerárseles como manipuladores de
alimentos, considerando los vegetales que se consumen crudos.

En 1996 en el Reino Unido fue comisionado por el gobierno un equipo de expertos liderado por
el profesor T H Pennington de la Universidad de Aberdeen, a raíz de un brote de E. coli O157 en

7
 ESCHERICHIA COLI

Escocia Central que causó 500 casos y una veintena de muertes. Los afectados fueron
principalmente personas de edad avanzada que recibieron sándwiches de carne preparados por
el carnicero local. Las sugerencias y normativas elaboradas para prevenir la enfermedad
actuando a distintos niveles de la cadena de producción, se conoció como el Informe
Pennington. La información más actualizada sobre las VTEC se comunica en foros
internacionales periódicos. El primero se realizó en Otawa, Canadá (1991), luego le siguieron
otros en Bergamo, Italia (1994); Baltimore, EEUU (1997); Kyoto, Japón (2000); y Edinburgh,
Escocia (2003), Australia (2006), Argentina (2009). En estos encuentros trianuales (Triennial
Internacional Symposium on Vero Cytotoxigenic Escherichia coli Infections) se comunican las
líneas de investigación en curso. Son encuentros interdisciplinarios de expertos (pediatras,
nefrólogos, hematólogos, gastroenterólogos, microbiólogos, internistas, veterinarios,
científicos, científicos de alimentos, sanitaristas, bioquímicos, inmunólogos, biólogos
moleculares, etc.). Las diversas áreas cubiertas son: la cadena alimenticia, aspectos sanitarios,
agrícola-ganaderos; epidemiológicos; mecanismos patogénicos, factores de virulencia, modelos
animales, el tratamiento y las medidas preventivas.

Con objeto de vigilancia epidemiológica Estados Unidos creó una red, la PulseNet, para detectar
grupos de enfermedades bacterianas transmitidas por alimentos y ayudar en las investigaciones
de brotes, extendiéndola luego a Canadá y a Latinoamérica. Agrupa a los laboratorios de salud
pública y de las agencias inspectoras de alimentos coordinada por el Centro de Control y
Enfermedades de Atlanta (CDC). Sus participantes utilizan una misma forma de subtipificación
consistente en la técnica de electroforesis en el de campos pulsados. Con esta nueva
herramienta se puede lograr identificar y relacionar hallazgos de distinto origen (clínico,
alimentario, veterinario, medioambiental). Y esa información fue usada para rastrear lotes de
alimentos en el mercado y retirarlos rápidamente, antes de que se extendieran. La creación de
Pulsenet-Latinoamérica tuvo origen en Buenos Aires en diciembre de 2003, y en julio de 2004,
se realizó el primer taller de la red en Buenos Aires, con apoyo de OPS/INPPAZ y del Instituto
Malbrán, donde fueron capacitados microbiólogos de salud pública de seis países (Brasil, Chile,
Colombia, México, Uruguay y Venezuela).

En particular, Escherichia coli O157:H7 ha sido implicada en muchos brotes alimentarios en

donde el vehículo principal ha sido la carne picada, aunque también es posible encontrar brotes
producidos por otros serotipos, tanto los mencionados anteriormente, como nuevas variantes
que se van descubriendo a medida que se realizan nuevos estudios. Estos problemas tienen más
probabilidades de ocurrir en niños y en adultos con sistemas inmunológicos debilitados.
Dada la severidad que tiene dicho microorganismo para la Salud Pública se ha establecido
tolerancia cero en este tipo de productos, porque la Escherichia coli O157:H7 puede ocasionar
enfermedad aun en pequeñas dosis.
Los síntomas más comunes en estos casos son diarrea, vómitos, dolor agudo de estómago y o
fiebre. En caso de poseer uno o más de los mismos, es fundamental no automedicarse y acudir
a un centro médico para realizar una evaluación por parte de un profesional, quien podrá
identificar correctamente si los síntomas son provocados por la ingestión de esta bacteria o por
otros factores.

8
ESCHERICHIA COLI

Amstrong et al., 1996

9
 ESCHERICHIA COLI

Escherichia coli en relación a los Límites Legales

Las empresas alimentarias deben cumplir los criterios de seguridad alimentaria relativos a E. coli
en los alimentos de mayor riesgo, establecidos en el Reglamento (CE) 2073/2005, de la
Comisión de 15 de noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los
productos alimenticios y sus posteriores modificaciones.

10
ESCHERICHIA COLI

11
ESCHERICHIA COLI

12
ESCHERICHIA COLI

13
 ESCHERICHIA COLI

Escherichia coli y sus Serotipos

Con base en su mecanismo de patogenicidad y cuadro clínico, las cepas de E. coli causantes de
diarrea se clasifican en cinco grupos: enterotoxigénica (ETEC), enterohemorrágica también
conococidas como productoras de toxina Vero o toxina semejante a Shiga (EHEC o VTEC o STEC),
enteroinvasiva (EIEC), enteropatógena (EPEC), enteroagregativa (EAEC).

E. coli enterotoxigénica (ETEC)

La enfermedad por ETEC se suele presentar transcurridas entre 12 y 36 horas después de la

ingestión del organismo. Los síntomas pueden variar desde una ligera diarrea hasta un síndrome
grave parecido al cólera, con heces acuosas sin sangre ni moco, dolores de estómago y vómito.
La enfermedad suele autolimitarse, persistiendo durante 2-3 días, aunque en países en
desarrollo es causa corriente de diarrea en los niños en los que puede causar una deshidratación
grave.
El organismo ingerido se opone a ser expulsado con el quimo que fluye rápidamente
adhiriéndose al epitelio gracias a factores de fijación o de colonización en forma de fimbrias
existentes en la superficie de la célula bacteriana. Las fimbrias pueden tener morfología
diferente y ser estructuras, bien rígidas (6-7 nm de diámetro, bien flexibles (2-3 nm de diámetro)
compuestas de subunidades de proteínas de 14-22 kDa. son resistentes a la manosa, es decir,
median la hemoaglutinación en presencia de manosa, por lo que determinadas fimbrias de
colonización están restringidas a determinados serotipos O:H. Son codificadas en la superficie
de plásmidos que frecuentemente también codifican las toxinas causantes de diarrea. Son
elaborados dos tipos de toxinas: las toxinas termoestables (ST), que son capaces de resistir el
calentamiento a 100ºC durante 15 minutos, y las toxinas termolábiles (LT) que son inactivadas
a 60ºC después de 30 minutos y a pH bajo. La toxina LT-I guarda una gran semejanza con la
toxina colérica; consta de cinco subunidades B (11,5 kDa), que son responsables de la unión de
la toxina a las células epiteliales, y de una subunidad A (25 kDa) que es desplazada al interior de
la célula epitelial donde activa la adenilatociclasa. A continuación, el subsiguiente aumento de
las concentraciones de MPAc inhibe la absorción de Na+, de Cl- y de agua por las células de la
vellosidad y estimula su desaparición de las células de las criptas intestinales provocando así una
diarrea profusa. La toxina LT-II producida por determinadas cepas de ETEC tiene una actividad
biológica parecida a la de la toxina LT-I pero no tiene reacción cruzada ni con el antisuero frente
a la toxina LT-I ni con el antisuero frente a la toxina colérica.
Han sido identificados dos tipos de ST; el más común STA, es un polipéptido de peso molecular
bajo, poco antígeno, producido a partir de un precursor de 72 aminoácidos. Se ha indicado que
la molécula extracelular tiene un tamaño variable por estar integrada por 18-42 aminoácidos y
su resistencia al calor, al pH bajo y a la digestión proteolítica probablemente derivan de su
estructura tridimensional compacta. Actúa estimulando la producción de MPGC por la
guanilociclasa en las células epiteliales. El mecanismo de acción de STB, que se puede diferenciar
de la STA por su incapacidad para producir secreción de líquido en el intestino de ratones
lactantes, se desconoce pero no parece ser que actúe estimulando la producción de nucleótidos
cíclicos.

Las ETEC son importantes en lactantes, principalmente en niños menores de dos años, y en
particular durante los primeros seis meses de vida. La frecuencia de aislamiento de este grupo
patógeno de E. coli en niños con diarrea es de 10 a 30 %. En los niños en edad escolar puede ser
asintomática y poco frecuente o producir la diarrea del viajero. La enfermedad tiene un periodo
de incubación de 14 a 50 horas. El cuadro clínico se caracteriza por diarrea aguda, generalmente

14
 ESCHERICHIA COLI

sin sangre, sin moco, sin pus y en pocos casos se presentan fiebre y vómito. La diarrea producida
por ETEC puede ser leve, breve y autolimitada pero también puede ser grave.
La contaminación fecal de agua y alimentos es la principal fuente de infección, siendo la dosis
infectiva de 108 UFC.

E. coli enterohemorrágico (EHEC)

A veces también conocido como E. coli productor de Verotoxina (VTEC), fue descrito por primera
vez en Canadá donde en algunas comarcas rivaliza con Campylobacter y con Salmonella como
la causa más frecuente de diarrea. Son capaces de provocar diarrea varios serotipos pero el
serotipo O157:H7 es el que con mayor frecuencia se aísla en las personas. Ha llamado la atención
no sólo porque la transmisión de la enfermedad alimentaria es más corriente que en el caso de
otras cepas de E. coli productoras de diarrea, sino también porque es capaz de causar
enfermedades que amenazan la vida como son la colitis hemorrágica, el síndrome urémico
hemolítico y la púrpura trombótica trombocitopénica.
La Colitis Hemorrágica es típicamente una diarrea aguda, sanguinolenta y autolimitante que
empieza con retortijones de estómago y diarrea acuosa después de un período de incubación
de 3-8 días. Se puede de la colitis inflamatoria por la falta habitual de fiebre y por la ausencia de
leucocitos en las heces. Afecta principalmente a las personas adultas, con una incidencia máxima
en los meses de verano y en las personas ancianas puede hacer temer por su vida.
El Síndrome Urémico Hemolítico se caracteriza por tres rasgos: insuficiencia renal aguda, anemia
hemolítica (reducción del número de glóbulos rojos) y trombocitopenia (descenso del número
de plaquetas sanguíneas), a veces precedida de una diarrea sanguinolenta. Es más corriente en
niños en los que es la causa principal de insuficiencia renal aguda en la Europa Occidental y en
América del Norte.

La Púrpura Trombótica Trombocitopénica está relacionada con el síndrome hemolítico pero

incluye fiebre y síntomas nerviosos.

La adhesión es un factor de virulencia importante y se ha comprobado que las cepas del serotipo
O157:H7 possen un plásmido de 60 MDa que codifica los factores de oclonización de las fimbrias
que producen una lesión parecida, pero no idéntica, a la que producen las cepas de EPEC en los
extremos de las vellosidades.

15
 ESCHERICHIA COLI

Las cepas EHEC producen la citotoxina verotoxina (llamada así por su capacidad para destruir las
células Vero, que son células renales del mono verde africano). Determinadas investigaciones
han revelado la existencia de al menos dos, VT-I y VT-II, que por su semejanza con toxina Shiga
también han sido denominadas toxinas parecidas a la toxina Shiga, SLT-I y SLT-II. De hecho, la
VT-I es la que más se parece a la toxina Shiga; tiene reacción cruzada con los antisueros frente a
la toxina Shiga, también está formada por las subunidades A(32 kDa) y B (7,7 kDa) y las
subunidades B son estructuralmente idénticas. La VT-II también incluye una subunidad A y una
subunidad B pero éstas son de mayor tamaño que en la VT-I (35 kDa y 10,7 kDa respectivamente)
y, desde el punto de vista inmunológico, no reaccionan de modo cruzado, a pesar de que
comparten con la toxina Shiga un 60% de la homología de la secuencia de aminoácidos. Se ha
demostrado que, en algunas cepas, ambas toxinas son codificadas por fagos.
Riley describió y relacionó a EHEC con brotes caracterizados por dolor abdominal, diarrea acuosa
con sangre y poco o nada de fiebre, cuando al que se le llamó colitis hemorrágica (CH) y que era
debido a la ingestión de carne cruda o mal cocida. La bacteria aislada de todos los casos fue E.
coli del serotipo O157:H7. Karmali en 1983, la asoció con casos aislados de síndrome urémico
hemolítico (SUH) caracterizado por daño renal agudo, trombocitopenia y anemia hemolítica
microangiopática, precedida por diarrea con sangre, con la presencia en heces de E. coli
productora de una citotoxina con actividad en vesículas Vero, por lo que se llama verotoxina
(VT), y a las cepas capaces de producirla se les denominó E. coli verotoxigénicas (VTEC). Además,
se observó que la citotoxina se neutralizó con antitoxina obtenida a partir de Shigella
dysenteriae tipo 1, por lo que también se le llamó “shiga-like toxin” o toxina semejante a shiga
(SLT) o “shiga toxin” (STX), y a las E. coli capaces de producirla se les da el nombre de STEC.
La capacidad toxigénica de las cepas es necesaria para que el paciente desarrolle colitis
hemorrágica y diarrea con sangre, ya que la citotoxina STX es el principal mecanismo de
patogenicidad de EHEC y su síntesis está relacionada con la presencia del bacteriófago STX, que
está insertado en el genoma. La STX actúa a nivel de síntesis de proteínas ya que se une a la
subunidad 60S de los ribosomas intestinales o renales del hospedero. En las cepas EHEC aisladas,
se han encontrado las variantes STX1 y STX2 que son inmunológicamente diferentes, de tal
manera que se pueden aislar bacterias que sinteticen alguna de las toxinas o ambas. Además de
la toxina, las EHEC tienen otros mecanismos de patogenicidad como el fenómeno de adherencia
y esfacelación (A/E), y presentan el gene cromosomal eae que codifica para la proteína de
membrana externa (OMP) de 94 kDa, llamada intimina, cuya expresión es regulada por genes
plasmídicos; el gene eae también se encuentra en las cepas EPEC. Otro factor de patogenicidad
es el plásmido pO157, de 60MDa, que codifica para la enterohemolisina.

Actualmente hay al menos dos clasificaciones del grupo EHEC. Una es en función de la presencia
de sus factores de patogenicidad: a) cepas típicas cuando tienen el fago, el plásmido de 60 MDa
y presentan el fenómeno de A/E, y b) cepas atípicas, cuando no producen lesiones de A/E y
pueden presentar o no el plásmido de 6 MDa.

La otra clasificación es en función del serotipo: a) cepas E. coli O157:H7. Este serotipo no
fermenta el D-sorbitol ni la ramnosa y no produce beta-glucoronidasa; esta bacteria puede
producir principalmente SUH y CH. E. coli O157:H7 se puede encontrar en bovinos, cabras,
borregos y con menos frecuencia en cerdos y pollos; su principal reservorio es el intestino de
ganado bovino. También se ha logrado recuperar de frutas y vegetales como lechuga, rábanos,
alfalfa; además en productos industrializados como mayonesa y jugos de naranja y manzana no
pasteurizados, aun cuando estos alimentos tengan un pH de 3,4, condición en la que puede
sobrevivir varios días. La transmisión de E. coli O157:H7 puede ser por ingerir carne cruda o mal
cocida, leche bronca, agua contaminada; también puede ser de persona a persona o debida a
los manipuladores de alimentos. Hay estudios que sugieren la importancia de la mosca

16
 ESCHERICHIA COLI

doméstica como vector en la transmisión de E. coli O157:H7, y cepas no-O157:H7 cuya

frecuencia de aislamiento es cuatro veces mayor que las O157:H7.
Estas cepas pueden ser sorbitol positivo, y sus serotipos son diferentes del O157:H7.
Actualmente hay más de 200 serotipos. El cuadro clínico causado por las cepas no-O157 se
caracteriza por diarrea acuosa con dolor abdominal y colitis hemorrágica. Las cepas no-O157
son capaces de causar brotes o casos aislados de diarrea y en ocasiones no se logra establecer
la fuente de contaminación, aunque se sabe que se pueden aislar de los mismos alimentos que
las cepas de serotipo O157:H7 y también de carne de guajolote, ternera, pescado y mariscos.
El principal mecanismo de patogenicidad de las cepas EHEC no-O157:H7 es la toxina STX;
también tienen el fenómeno de A/E y la presencia de pO157.
El período de incubación de EHEC es de 1 a 8 días; inicialmente produce diarrea son sangre, con
o sin vómito, dolor abdominal, fiebre, y después de 1 a 2 días la diarrea se torna sanguinolenta
y se intensifica el dolor abdominal, de una duración de 4 a 10 días, con heces abundantemente
sanguinolentas. Se cura o bien llega hasta SUH.
La identificación de EHEC se puede hacer mediante las pruebas moleculares como RFLP,
hibridación, campos pulsados, PCR y RAPD-PCR que pueden detectar hasta 102 UFC/0.1g de
materia fecal, además de que permiten realizar una subtipificación con fines epidemiológicos de
este grupo de bacterias.
Es importante el trabajo conjunto del laboratorio y los epidemiólogos para la vigilancia y
detección oportuna de E. coli O157:H7 para prevenir posible brotes.

17
 ESCHERICHIA COLI

E. coli enteroinvasiva (EIEC)

El grupo EIEC y Shigella spp están relacionados genética y bioquímicamente ya que son
descarboxilasa negativas, no móviles y lactosa negativas.

La infección por EIEC origina los síntomas cla´sicos de una disentería bacilar invasora
normalmente asociada con Shigella. De igual modo que Shigella, EIEC invade las células
epiteliales del colon y se multiplica en su interior causando ulceración e inflamación. Los signos
clínicos son fiebre, solores abdominales intensos, malestar y con frecuencia una diarrea acuosa
que precede a la eliminación de heces que contienen sangre, moco y leucocitos fecales. La
invasividad se determina por el número de proteínas de la membrana externa que son
codificadas en la superficie de un plásmido de gran tamaño (140 MDa). Parece ser que la dosis
infecciosa de EIEC es bastante más elevada que la correspondiente a Shigella y se cree que esto
es un reflejo de la mayor sensibilidad del organismo a la acidez gástrica.

El mecanismo de patogenicidad de EIEC es la invasión del epitelio del colon; para ello el primer
paso es la adherencia de la bacteria a las vellosidades de la mucosa requiriendo de mucinasa y
adhesinas, para después entrar por endocitosis a la célula, y posterior multiplicación de la EIEC
dentro de la célula, y diseminación a células sanas adyacentes. La información genética para este
mecanismo está en loci del cromosoma y del plásmido, además de tener la capacidad de
elaborar una o másenterotoxinas que pudieran ser importantes en la producción de diarrea. Los
genes necesarios para la invasión se encuentran en un plásmido de 140 MDa llamado pInv, que
codifica para proteínas, como por ejemplo las Ipa y otras que están involucradas en el proceso
de patogénesis.

Los síntomas característicos en personas infectadas por EIEC son diarrea acuosa, con sangre y
moco, pero algunos casos sólo presentan diarrea, ésta en ocasiones es indiferenciable de la que
produce ETEC, las cepas EIEC se asocian más con brotes que con casos aislados, en los cuales la
transmisión puede ser de persona a persona, por ingestión de alimentos y agua contaminada,
convirtiéndose en un patógeno importante en niños mayores de seis meses.

El diagnóstico de EIEC se hace por prueba in vivo como la de Sereny, que es la inoculación de un
cultivo puro de la bacteria en un ojo de un cobayo en el cual después de 24 a 96 horas se produce
una ulceración en el ojo, pero también hay métodos inmunológicos y moleculares.

E. coli enteropatógena (EPEC)

EPEC fue el primer grupo que se identificó serológicamente y se asoció con casos de diarrea en
infantes, siendo la adherencia su principal factor de patogenicidad. El proceso de adherencia
íntima entre la bacteria y la membrana de las células del epitelio intestinal, seguida de la
destrucción de la microvellosidad, con polimnerización de actina, que lleva a la alteración del
citoesqueleto en el sitio de la unión de la bacteria, debido al aumento de los niveles de calcio
intracelular y de proteína cinasa C, ha sido denominado adherencia y esfacelamiento (A/E). La
adherencia está mediada por pilis o fimbrias que se llaman Bfp (bundle-forming pilus) cuya
información genética está codificada en un plásmido de 50-70MDa denominado EAF (EPEC
adherence factor) y de algunos genes cromosomales. En la adherencia es necesaria la síntesis
de una proteína de membrana externa de 94 kDa llamada intimina, codificada por el gene
cromosomal eae y que sirve como señal en A/E.

En ensayos in vitro las cepas EPEC se caracterizan por formar microcolonias en el citoplasma de
las células Hep-2 y su estudio incluye factores de patogenicidad como el efecto A/E, presencia
de plásmidos y fimbrias.

18
 ESCHERICHIA COLI

Las cepas EPEC se consideran típicas cuando tienen los genes eae para la intimina, que participan
en A/E, y el plásmido EAF que codifica para Bfp; se dice que son atípicas cuando sólo presentan
los genes eae pero no el plásmido EAF.

Los síntomas de la infección por EPEC son: malestar, vómito y diarrea con deposiciones que
contienen moco pero a la vez sangre, aparecen 12-36 horas después de la ingestión del
organismo. En los niños la enfermedad es más grave que algunas otras infecciones diarreicas y
en algunos casos puede persistir durante un tiempo de dos semanas. Parece ser que la patogenia
está relacionada con la capacidad de las cepas de EPEC para adherirse causando el
desprendimiento de la célula de los extremos de las vellosidades. Se supone que esto causa
diarrea porque se rompe el equilibrio entre la absorción y la secreción en el intestino delgado.

EPEC puede ocasionar brotes o casos aislados de diarrea. Este grupo afecta principalmente a
niños menores de seis meses y a los de dos años. También puede aislarse en adultos enfermos
y sanos, principalmente cuando hay un factor predisponente como diabetes. La forma de
transmisión de la enfermedad es fecal-oral por manos contaminadas de manipuladores de
alimentos. Los reservorios de EPEC pueden ser niños y adultos con o sin síntomas.

El diagnóstico de EPEC incluye ensayos in vitro en cultivos celulares y métodos moleculares.

E. coli enteroagregativa (EAEC)

Este serotipo ha sido sólo encontrado en humanos. Son llamadas enteroagregativas porque
tienen fimbrias con las que aglutinan células en los cultivos de tejidos. Se unen a la mucosa
intestinal causando diarrea acuosa sin fiebre. No son invasivas. Producen hemolisina y una
enterotoxina ST similar a la de las enterotoxigénicas. se le asocian dos toxinas:

 Toxina termoestable enteroagregante (EAST)

 Toxina codificada por plasmidos (PET)

Scaletsky y Nataro encontraron cepas aisladas de pacientes con diarrea, las cuales por serología
no correspondían al grupo EPEC pero si presentaban un patrón característico de adherencia
diferente a EPEC y que además eran negativas a la prueba de EAF. En estudios posteriores se
encontró el fenotipo de adherencia agregativa, caracterizada por autoaglutinación de las
bacterias entre sí y por ser inespecífica, porque las bacterias se adhieren a la superficie de las
células Hep-2 y a la superficie del cubreobjetos libre de células Hep-2.

La adherencia a células Hep-2 y la hemaglutinación de eritrocitos humanos se debe a la

presencia de una fimbria o adhesina flexible llamada fimbria I de adherencia agregativa (AAF/I),
codificada por el gene aggA que se encuentra en un plásmido de 60MDa. También se ha descrito
la fimbria AAF/II inmunológicamente diferente a AAF/I y que está codificada por el gene aafA;
sin embargo, no todas las EAEC presentan estas fimbrias.

El mecanismo de patogenicidad de EAEC están implicadas la bacteria y diversas moléculas que

ella produce; también se sabe que las cepas EAEC tienen la capacidad de incrementar en la
mucosa la producción y secreción de moco que atrapa a las bacterias que se autoaglutinan en
una fina película en el epitelio intestinal. La producción de moco puede estar relacionada con la
capacidad de EAEC para colonizar persistentemente el intestino y causar diarrea. E el plásmido
de 60 MDa de EAEC también se encuentra los genes que codifican para la toxina EASTI.

19
 ESCHERICHIA COLI

Mecanismo de patogenicidad de los diferentes serotipos de E. coli

20
 ESCHERICHIA COLI

Escherichia coli y su Detección

Según la Organización Internacional de Normalización (ISO) en acuerdo con la Comisión del Codex
Alimentarius, brindan información (Programa conjunto FAO/OMS sobre Normas Alimentarias con
respecto a la Higiene de los Alimentos, en el vigésimo quinto periodo de sesiones Hanoi, Vietnan, del 11
al 15 de noviembre de 2013)

Pues la colaboración entre el ISO/TC34 (inclusive el ISO/TC34/SC9) y el Codex es importante para

fortalecer la coordinación mutua en sus trabajos, evitar inconsistencias y duplicación de sus respectivas
labores, así como permitir que éste cumpla las necesidades del CCFH en términos de los métodos de
referencia al nivel internacional.

Con lo que respecta a Escherichia coli, las Normas publicadas son:

Normas publicadas:
Referencia Fecha de Título de la Norma
de la Norma publicación
Método horizontal para la detección y recuento de Escherichia coli
ISO 7251 2005 presuntiva -- Técnica del número más probable.
Prueba, en tiempo real, de polimerización en cadena (PCR): Método
basado en la detección de patógenos transmitidos por el consumo de
ISO 13136 2012 alimentos -- Método horizontal para la detección de la toxina Shiga
producida por Escherichia coli (STEC) y la determinación de los
serogrupos: O157, O111, O26, O103 y O145.

Normas publicadas y bajo revisión:

Referencia de la
norma publicada: Fecha
Referencia del estimada de Título de la Norma
fecha de publicación
Proyecto publicación

Método horizontal para la recuento de

Escherichia coli positiva a la β-glucuronidasa--
1ra. Parte: Técnica de conteo de colonias a 44º
ISO 16649-1 ISO 16649-1:2001 2016 C usando membranas y 5-bromo-4-cloro-3-
indolil β-D-glucuronido.

Método horizontal para el recuento de E. coli

positiva a la β-glucuronidasa-- 2da., parte:
Técnica de conteo de colonias a 44ºC usando
ISO 16649-2 ISO 16649-2:2001 2016 membranas y 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-
glucuronido.
Método horizontal para la recuento de E. coli
positiva a la β-glucuronidasa-- 3ra. Parte:
ISO/TS 16649- Técnica del número más probable usando 5-
ISO 16649-3 2014
3:2005 bromo-4-cloro-3-indolil- beta-D-glucorónido.

ISO ISO 16654:2001 2016 Método horizontal para la detección de

16654/AMD1 Escherichia coli O157.

21
 ESCHERICHIA COLI

ISO 7251:2005 da las pautas generales para la detección y enumeración de presuntiva de Escherichia
coli por medio de la técnica del medio de cultivo líquido y el cálculo del número más probable (NMP)
después de incubación a 37 ° C, y luego a los 44 ° C. Esta Norma Internacional es aplicable a los productos
destinados al consumo humano y la alimentación de los animales, y las muestras ambientales en el área
de la producción alimentaria y manipulación de alimentos.

Para el aislamiento, la identificación y la caracterización de cepas de E. coli se aplican métodos

tradicionales. Métodos in vivo y de biología molecular.

El método tradicional es el aislamiento de la bacteria. Tomada directamente de materia fecal o con hisopo
rectal. Ocurre secuencialmente:

- Siembra con la punta del hisopo en la parte superior de una placa de agar Mc Conkey u otro
medio selectivo.
- Con una ansa en anillo, se continúa el aislamiento, sembrando por estría cruzada.
- Se incuba a 37ºC/18-24 horas.
- Se seleccionan de 5 a 10 colonias típicas de E. coli lactosa positivas.
- Cuando se sospecha la presencia de EHEC se reemplaza lactosa por Agar Mc Conkey con 1% de
sorbitol.

TABLA C. Pruebas de laboratorio de las formas patógenas de E. coli

 SEROTIPO
EPEC
 SONDA DNA PARA EL PLASMIDO EAF
 Sonda de DNA
 Células adrenales del ratón YI
 Células CHO
ETEC (TLT)  Hemolisis inmune pasiva
 ELISA
 PRUEBAS DE PRECIPITINAS
 ELISA de gangliósidos
 Aglutinación de partículas de látex
 Radio inmunoensayo
 Prueba del ratón lactante
ETEC (TST)  Radioimunoensayo
 ELISA
 Sonda de DNA
 Serotipado
EHEC  Ensayo de células VERO
 ELISA
 Sonda de ADN
 Serotipado
 Sonda de DNA
EIEC  ELISA de la proteína de la membrana externa
 Prueba de sereny
 Células HELA
 CelulaHE-2

22
 ESCHERICHIA COLI

DIAGNÓSTICO
Han existido y aun se estudian y proponen varios métodos y/o estrategias para diagnosticar a
EHEC, estas difieren en complejidad, sensibilidad, especificidad y costo. El aislamiento de los
diferentes serotipos de Escherichia coli permite su caracterización por una variedad de
métodos, incluyendo serotipificación O:H, caracterización del fago, polimorfismo de los
fragmento de restricción, electroforesis en gel de campo pulsado, amplificación y secuenciación
del ADN, entre otros, algunos de los cuales, son de uso limitado en el laboratorio clínico, por
su elevado costo y necesidad de personal especializado, pero son de gran importancia desde el
punto de vista epidemiológico, sobre todo al aparecer un brote.

Cultivo y métodos inmunológicos para EHEC O157:

Por mucho tiempo, el medio de cultivo en agar MacConkey sorbitol (AMCS) fue el método más
empelado para el aislamiento de EHEC, debido a el predominio de O157:H7 y O157:H2, como
agentes etiológicos de enfermedad en humanos en Norteamérica y Europa. La mayoría de estas
cepas no pueden fermentar sorbitol (colonias incoloras en AMCS), que las distingue de las E.
coli de origen fecal pertenecientes a otros serotipos.
Comercialmente se encuentran disponibles varios reactivos de aglutinación al látex, para
detectar el antígeno O157 y H7, y así confirmar las colonias sospechosas. También pueden
usarse métodos de ELISA para la detección rápida del antígeno O157 en muestras fecales, los
cuales tienen buena sensibilidad; sin embargo, es necesario corroborar la producción de Stx,
debido a que no todas las O157 son productoras de esta toxina, esto limita la sensibilidad del
cultivo en AMCS, otra limitante es la incapacidad de reconocer la cepa O157 cuando su
concentración es menor al 1% de la flora gastrointestinal. Sin embargo, se ha mejorado el
índice del aislamiento de EHEC O157 agregándole cefixima al medio, para inhibir a otros mi-
croorganismo como Proteus spp, y así han surgido varias modificaciones para hacer este medio
de cultivo, más selectivo a cepas EHEC pertenecientes al serogrupo O157, incluyendo el shock
ácido propuesto por Grant.
La enfermedad producida por EHEC, está asociada a muchos otros serogrupos, y aunque
algunas son sorbitol negativas, la mayoría son sorbitol positivas, debido a ello, la eficacia de
este medio (AMCS) variará de acuerdo con el predominio local del serotipo de EHEC, por lo
que aislar solo las sorbitol negativas, produce un sesgo significativo en el diagnóstico de este
patógeno.

Métodos de cultivo para cepas EHEC no O157:

No hay característica bioquímica definitiva para distinguir cepas de EHEC pertenecientes a

serogupos diferentes del O157, lo que complica el aislamiento de tal microorganismo. Sin
embargo, casi todos los O157 y una proporción significativa de cepas no O157 producen
enterohemolisina Hly, y pertenecen al subgrupo de EHEC. Estas cepas EHEC- Hly muestran
zonas hemolíticas en agar sangre, después de 24 h de incubación. La producción de EHEC-Hly
tiene un alto valor predictivo positivo, pues se ha demostrado que las cepas de E. coli
enterohemolíticas son a su vez productoras de Stx, mientras que, en las Hly negativas, no se
puede predecir si producirá o no Sxt. Recientemente Aldick et al., identificaron 5 cepas raras
de E. coli aisladas, de casos de SUH, que presentaban gen hly y no producían Stx.

23
 ESCHERICHIA COLI

Análisis de citotoxicidad en cultivos de tejido:

La sensibilidad de células Vero (células de riñón de mono verde), a Stx fue observada por
Konowalchuk et al., y la citotoxicidad para esta línea celular sigue siendo el patrón de oro para
la confirmación de aislamientos de E. coli productor de toxina shiga. Estas células tienen una alta
concentración de Gb3 y de Gb4 (el receptor preferido para Stx2e, presente en cerdos) en sus
membranas plasmáticas, y pueden ser utilizadas para detectar todas las variantes de Stx
conocidas. Las células HeLa (células de carcinoma cérvicouterino) también se han utilizado,
pero esta línea celular carece de Gb4 y por lo tanto es menos sensible a Stx2e. Este método tiene
limitaciones porque no todos los laboratorios microbiológicos realizan cultivo de tejido de
células Vero, además el diagnóstico rápido es importante, y los resultados de la prueba de
citotoxicidad no están disponible sino hasta después de 48 a 72 h, que sería el tiempo de
desarrollo de esta línea celular.

ELISA para la detección directa de Stx:

Los análisis mediante ELISA (del inglés enzyme linked immunosor- bent assays) juegan un papel
importante en el diagnóstico, porque pueden detectar la presencia de ECST (o de otra especie
que produzca Stx), de cualquier serogrupo. Actualmente se han creado muchas variantes de esta
técnica diagnóstica, siendo afectada la sensibilidad de los métodos de ELISA por un número de
variables como, los tipos de anticuerpos usados, y el tipo y cantidad de Stx producida por una
cepa dada. ELISA es generalmente menos sensible que el análisis de verocitotoxicidad, pero más
asequible de realizar en los laboratorios de análisis clínico.

Hibridación con sondas de ADN:

La necesidad de determinar la presencia de los genes stx1 y stx2, permitió el desarrollo de las
sondas de ADN para la detección de EHEC. Inicialmente, las sondas eran etiquetadas con P 32
o S 35 y fueron utilizadas para probar una gran cantidad de aislamientos de E. coli para la
presencia de genes stx por hibridación de un fragmento de ADN de la colonia con la sonda
marcada. Estos procedimientos son altamente sensibles y específicos, y cuando son rigurosas las
condiciones en las que se realiza, las cepas que poseen stx1 y stx2, o ambas, pueden ser
distinguidas. Actualmente las sondas stx son marcadas con material no radiactivo como
digoxigenina y biotina, sin pérdida de sensibilidad o especificidad.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

Este método permite la amplificación de los genes stx. Los extractos de DNA de las colonias
aisladas de los cultivos pueden ser utilizados como moldes. Los productos específicos dela PCR
son revelados por electroforesis en gel del agarosa al 2%, teñido con bromuro de ethidium.
Hasta la fecha, los análisis de PCR para la detección de stx, han combinado diversos pares de
oligonucleótidos para stx1 y stx2, y las variantes de stx2, en algunos casos. La PCR también tiene
utilidad para la detección de los genes que codifican otros factores de patogenicidad en cepas
de EHEC, tales como eaeA y ehxA. Esta información puede ser significativa porque hay relación
entre la presencia de estos genes y la capacidad de ECST de causar enfermedad humana. Así, un
caso de diarrea aguda producido por una cepa de EHEC, también positiva para eaeA y ehxA,
tendría aumentado el riesgo de desarrollar complicaciones tales como SUH.

24
 ESCHERICHIA COLI

Diagnóstico serológico:

El diagnóstico serológico de la enfermedad provocada por EHEC es conveniente cuando el

número de ECST en heces es pequeño, y pueda ser imperceptible por el PCR. Los anticuerpos
contra Stx o el LPS se han propuesto como marcadores de infección reciente, pero se debe
considerar el periodo agudo y convaleciente de la enfermedad, probándose el incremento o
descenso de los títulos de anticuerpos en el suero.
Se ha descrito el análisis de immunoblot para los anticuerpos contra Stx1, el cual es más
específico y sensible que ELISA y puede ser una herramienta útil para estudios
seroepidemiológicos. Otro estudio es el análisis de hemaglutinación para anti-LPS que implica
el uso de eritrocitos de ovejas cubiertos con LPS de una gama de serogrupos, incluyendo el
O157.
Actualmente se emplean métodos diagnósticos basados en la detección del serotipo con el
antisuero, y estos han incrementado su uso en el laboratorio clínico por su bajo costo y fácil
realización, sin embargo, se debe tener presente que no todos los serotipos, son
verdaderamente pato- génicos, pues el marcador del serotipo no le confiere patogenicidad a la
cepa; o la similaridad de algunos antígenos, puede dar falsos positivos. Para estos casos ha sido
propuesto el uso de la PCR, la cual puede reducir el alto grado de falsos positivos obtenidos por
serotipificación.
La selección del mejor método diagnóstico de EHEC implicará lograr un equilibrio entre
tiempo, especificidad, sensibilidad, y costo de los mismos. El laboratorio clínico de
microbiología debe establecer el cultivo de las muestras fecales para constatar la presencia de
EHEC y poder realizar el diagnóstico microbiológico y molecular. El análisis de PCR de muestras
aisladas de cultivos fecales, es probablemente el método más sensible y específico para la
detección de EHEC. Pero la mayoría de los laboratorios carecen de la capacidad de investigación
por PCR o de análisis de verocitotoxicidad, que aunque es lenta, es un alternativa altamente
satisfactoria, y emplean métodos tales como, ELISA para detección de Stx y enterohemolisina,
análisis para detección del LPS, serología para la serotipificación, etc, que aunque son útiles en
ciertas circunstancias, ellos son secundarios por razones de baja sensibilidad, o incapacidad de
detectar todas las EHEC.

25
 ESCHERICHIA COLI

MÉTODOS NORMALIZADOS

ISO 7251 Directiva general para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica
del NMP

Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de enriquecimiento selectivo de doble

concentración con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una
cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. A continuación se siembran
tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una cantidad determinada
de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para
otros productos. Después y en las mismas condiciones se siembran tres tubos de
enriquecimiento selectivo de concentración simple con la primera dilución decimal obtenida de
la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 35 – 37º C según acuerdo
durante 24 – 48 horas, y se realiza el examen en busca de tubos con gas. A partir de cada tubo
que muestra desprendimiento de gas se inocula un tubo con medio selectivo líquido EC. La
reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de
Durham, como consecuencia de la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares a
45º C. Se hacen las lecturas a las 24 y 48 horas. A partir del número de tubos positivos en medio
selectivo EC se siembra una nueva serie de tubos con agua de triptona. Incubación a 45º C, 24 –
48 horas y se examina la producción de indol. A partir de los tubos positivos a la producción de
gas en medio selectivo y a la producción de indol en agua de triptona, se calcula el número más
probable de E. coli por mililitro o gramo de muestra de ensayo.

26
 ESCHERICHIA COLI

NF V 08-053 Método de rutina para el recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa

positivos

Este método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar PTX o PTG, en una placa
de Petri con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad
determinada de la suspensión madre para otros productos. En las mismas condiciones, siembra
de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las
placas a 44º C durante 18 – 24 horas. Cálculo del número de Escherichia coli por mililitro o por
gramo de muestra a partir del número de colonias características obtenidas en las placas de
Petri.
El recuento se lleva a cabo contando las colonias de color azul y multiplicando por el factor de
dilución.

27
 ESCHERICHIA COLI

Detección y aislamiento de Escherichia coli O157 en una muestra de origen bovino a

partir de la técnica de separación inmunomagnética.

Introducción
Los métodos microbiológicos tradicionales para la detección de patógenos se basan en el
crecimiento en medios de cultivo seguido de identificación bioquímica y serológica.
Dado que las bacterias poseen antígenos característicos, se pueden utilizar anticuerpos
específicos para su detección, y éstos representan herramientas sensibles y específicas para
detectar, identificar y cuantificar los antígenos de un virus, de una bacteria o de un parásito.
(Murray P. 2006). La técnica de separación inmunomagnética representa una valiosa
herramienta para lograr concentrar las bacterias que eventualmente se encuentren en la
muestra, mejorar su recuperación y así optimizar el diagnóstico.

Objetivo:
- Detectar Escherichia coli O157 en muestras obtenidas de carcasas de bovinos recién
faenados destinados a consumo de carne.
Métodos:
Separación inmunomagnética para la detección de E. coli O157:H7/NM
(Miliwebsky, Deza et al. 2006)

Fundamento:
La técnica de separación inmunomagnética
(SIM) consiste en la detección de E.
coli O157:H7/NM mediante la utilización de
anticuerpos anti-E.coli O157 purificados,
adsorbidos y unidos covalentemente a la
superficie de partículas esféricas
paramagnéticas de poliestireno, uniformes
y microscópicas, que reaccionan con el
antígeno somático O157.
Las perlas marcadas con los anticuerpos específicos son incubadas con 1 ml del caldo de
enriquecimiento. Durante esta incubación los anticuerpos se unen a las E. coli O157:H7/NM
presentes, permitiendo concentrarlas utilizando un imán. El concentrado es resuspendido en
buffer y sembrado para el aislamiento diferencial de E. coli O157:H7/NM en medios selectivos.

Determinación de la sensibilidad de la técnica de Separación Inmunomagnética

Se realizó previamente a probar la técnica con muestras experimentales, suspendiendo en
solución fisiológica una cepa de referencia E.coli O157:H7 (cepa 933), equivalente a 0,5 de la
escala Mc Farland. A partir de esa suspensión se realizaron distintas diluciones de acuerdo al
siguiente esquema.

28
 ESCHERICHIA COLI

Se tomaron siete muestras de carne molida de 1 g cada una y se colocaron en tubos Falcon. Cada
una de ellas se inoculó con 0,1 mL de las diluciones respectivas y luego se les adicionó 9 mL de
caldo Casoy con Novobiocina. Dichas muestras se incubaron a 42ºC durante 18-24 horas para
optimizar el enriquecimiento. Además se trabajó con una muestra de carne molida sin
contaminar sometida al mismo tratamiento que las inoculadas.
Cada una de estas muestras se sometió a separación Inmunomagnética y posterior siembra en
los medios CT- SMAC AGAR Mac Conkey sorbitol y Medio cromogénico.
E. coli O157 presenta colonias color malva, Coliformes colonias azul metálico, Proteus colonias
incoloras o color ceniza.

Se encontraron colonias sospechosas hasta la última dilución realizada. Las colonias sospechosas
fueron sometidas a la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para detectar aquellas que
poseen genes que codifican para la producción de toxina.
Una vez optimizada la técnica se probaron por esta metodología 20 caldos de cultivo
provenientes de 20 muestras congeladas con glicerol al 20% en freezer de -20ºC.
Diez de las muestras habían sido tomadas de hisopados intestinales de bovinos recién faenados
y otras diez fueron tomadas de esponjado sobre las carcasas de los mismos animales a las 24 hs.
en cámara frigorífica.

RESULTADOS
De las veinte muestras probadas se encontraron colonias
sospechosas en cuatro de ellas, todas procedentes de
carcasas.
Las colonias sospechosas fueron probadas en pooles de 5
colonias por PCR para detección de toxinas Shiga.
En uno de los pooles, se detectó la presencia de los genes
portadores de ambas toxinas, Stx1 y Stx2.
Se realizó el reaislamiento y la tipificación de la cepa a
través de pruebas bioquímicas para Escherichia coli,
confirmando sus características.
CONCLUSIONES
Este hallazgo es muy significativo dentro del trabajo que se está realizando con muestras
procedentes de un matadero-frigorífico, ya que hasta el momento sólo se había detectado E.
coli O157 en muestras de carne molida. Esta constituye la primera evidencia de la presencia de
la bacteria sobre la superficie del animal.
Estudios de subtipificación molecular posteriores permitirán establecer si existe vinculación
genética entre las cepas halladas.

29
 ESCHERICHIA COLI

NORMATIVA LEGAL PARA E. coli EN ALIMENTOS

De acuerdo a la Norma Sanitaria NTS Nº 071 – MINSA/DIGESA-V.01: “Norma que establece los
criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de
consumo humano”, establece dentro de las Disposiciones Generales que a los microorganismos
se les agrupan en tres clases:

1. Microorganismos indicadores de alteración: las categorías 1, 2, 3 definen los

microorganismos asociados con la vida útil y alteración del producto tales como
microorganismos aerobios, mesófilos, bacterias heterotróficas, aerobios mesófilos
esporulados, mohos, levaduras, levaduras osmófilas, bacterias ácido lácticas,
microorganismos lipolíticos.
2. Microorganismos indicadores de Higiene: en las categorías 4, 5 y 6 se encuentran los
microorganismos no patógenos que suelen estar asociados a ellos, como Coliformes (que
para efectos de la presente norma sanitaria se refiere a coliformes totales), Escherichia coli,
anaerobios sulfitoreductores, Enterobacterias (a excepción de Preparaciones en polvo o
fórmulas para lactantes que se consideran en el grupo de microorganismos patógenos.
3. Microorganismos patógenos: son los que se hallan en las categorías 7 a la 15. Las categorías
7, 8 y 9 corresponde a microorganismos patógenos tales como Staphylococcus aureus,
Bacillus cereus, Clostridium perfringens, cuya cantidad en los alimentos condiciona su
peligrosidad para causar enfermedades alimentarias. A partir de la categoría 10
corresponde a microorganismos patógenos, tales como Salmonella sp, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 y Vibrio cholerae entre otros patógenos, cuya
sola presencia en los alimentos condiciona su peligrosidad para la salud.

30
ESCHERICHIA COLI

31
ESCHERICHIA COLI

32
ESCHERICHIA COLI

33
ESCHERICHIA COLI

34
ESCHERICHIA COLI

35
ESCHERICHIA COLI

36
ESCHERICHIA COLI

37
ESCHERICHIA COLI

38
ESCHERICHIA COLI

39
 ESCHERICHIA COLI

TRATAMIENTO
La diarrea suele ser una afección autolimitada y la intervención terapéutica debe realizarse en
función a los síntomas presentados. Los objetivos de una terapéutica eficaz serían: limitar la
severidad y/o duración de síntomas gastrointestinales; prevenir las complicaciones sistémicas
peligrosas para la vida tales como el SUH; y prevenir la expansión de la infección a otras
personas. Para el tratamiento pueden usarse las siguientes estrategias:

Uso de antibióticos: Ciertos estudios sugieren asociación entre la administración de antibióticos

con el aumento del riesgo a desarrollar SUH. Sin embargo, en otra investigación realizada en
Minnesota (EEUU), se le administró antibióticos a un grupo de pacientes que padecía de
síndrome diarreico con evolución a SUH, y la enfermedad se tornó más leve. Por otra parte, se
ha demostrado que la proporción de los pacientes que progresaron de diarrea sanguinolenta a
SUH es más baja, cuando los antibióticos son administrados en un plazo de 3 días del inicio de
síntomas, comparados con los pacientes que no son tratados o a los que se les suministró
antibióticos más adelante en el curso de la infección. Además se ha reportado que la
administración tardía del trimetoprim sulfametoxazol a los pacientes infectado con ECST O157,
no previene la progresión a SUH.

Los antibióticos que dan lugar a lisis de la célula bacteriana, pueden aumentar la cantidad de Stx
libre en el lumen del intestino, y quedar así disponible la toxina para la absorción sistémica. Este
efecto es más pronunciado con antibióticos, tales como, trimetoprim sulfametoxazol y
ciprofloxacina, que interfieren con síntesis de ADN bacteriano. En segundo lugar, se ha
observado un alto índice de resistencia a antibióticos de las cepas EHEC, y el tratamiento
inadecuado le puede conferir una ventaja selectiva a ésta, sobre otros miembros de la flora
intestinal.

Existen estudios “in vitro" sobre la acción de ciertos antibióticos en la producción de las Stx1
y Stx2, donde se ha demostrado que la ampicilina, imipenem, cefaclor, ceftazidima,
sulfatrimetoprim, son capaces de aumentar la liberación de ambas toxinas. La fosfomicina, si
bien aumenta la liberación de ambas toxinas, sólo aumenta la incidencia de SUH cuando se usa
después de los 7 días de comenzada la infección. Los inhibidores de la síntesis proteica como la
doxiciclina, tetraciclina y kanamicina, impiden que aumente la liberación de toxinas, pero tienen
poca acción lítica sobre la bacteria.

Estrategias terapéuticas dirigidas contra Stx: Considerando la alta afinidad de Stx1 y Stx2 por el
receptor Gb3, una estrategia podría ser la administración oral de análogos de Gb3 con capacidad
para unir Stx y evitar su traslocación. Así se realizó un estudio multicéntrico controlado que
evaluó los efectos de un compuesto formado por una matriz de silicona no absorbible que tenía
ligado Gb3 (SYNSORB-Pk). Los pacientes que recibieron SYN- SORB-Pk tuvieron evolución similar
del SUH que aquellos que no lo recibieron lo que sugirió que una vez que comienza la diarrea
sanguinolenta y la toxina ya llegó a la vasculatura sanguínea, impedir el pasaje de más Stx por la
barrera intestinal, no presenta mayores beneficios.

La posibilidad de administrar absorbentes de toxina a nivel sistémico, así como anticuerpos

monoclonales que neutralicen la citotoxicidad por bloqueo de los sitios de unión de la toxina
Stx, puede ser otra estrategia a ser considerada. En estudios previos se ha observado que
mutantes no tóxicos de Stx2B, neutralizaron la acción de la toxina en mucosa colónica humana
in vitro, y en células epiteliales tubulares renales humanas en cultivo. Sin embargo, para que
esta estrategia sea considerada válida deberá ser ensayada en un modelo animal de SUH que
reproduzca la enfermedad humana. Recientemente se de- mostró en un modelo de ratón nulo
para la síntesis del Gb3/CD77 (knock-out), que el daño tisular producido por Stx desaparece.

40
 ESCHERICHIA COLI

Esos resultados sugieren que la estrategia de neutralizar los receptores de Gb3 en los órganos
blanco, puede ser un método efectivo para protegerlos contra los desórdenes relacionados con
la patogénesis de EHEC.

Uso de vacunas: Las vacunas basadas en Stx pueden ser eficaces en la prevención del SUH y la
severidad de síntomas gastrointestinales. Se ha demostrado eficacia protectora de las vacunas
para la protección contra Stx2e en cerdos; además se ha sugerido la inmunización
transcutánea con la subunidad StxB como una práctica provechosa para la prevención o
reducción de patología, aunque debe probarse su eficacia en humanos.

También pueden usarse vacunas para prevenir la colonización del intestino por EHEC. Se
espera que vacunas dirigidas contra los factores de colonización, por ejemplo, la intimina de
EHEC, puede ser un blanco apropiada para la vacunación, por lo menos para la mayoría de las
cepas patógenas humanas de EHEC, que la producen.

Las vacunas dirigidas contra LPS también pueden ser eficaces, puesto que la experiencia con
otros patógenos entéricos sugiere que IgG específico presente en el suero contra LPS, puede
dirigirse hacia el lumen del intestino en cantidades suficientes como para bloquear la
colonización, sin embargo, debe acentuarse, que las vacunas basadas en LPS proporcionarán
solamente protección serotipo específico.

Medidas preventivas contra la intoxicación alimentaria por

Escherichia coli

El sistema HACCP [Hazard Analyis and Critical Control Point], sistema de control de procesos
diseñado para identificar y prevenir los microbios y otros peligros en la producción de alimentos,
no elimina la E. coli O157:H7 de los mismos, a menos que se combine con métodos más efectivos
para eliminar la bacteria como la pasteurización o irradiación.
La irradiación ionizante es una prometedora tecnología que permite eliminar la bacteria
manteniendo crudos los alimentos. Aunque su uso está aprobado en los Estados Unidos para
controlar variados patógenos en alimentos como carne de cerdo y vegetales, esta tecnología
aún está muy subutilizada. La aprobación para usarse con la carne de res y los mariscos está
pendiente.
El uso de la pasteurización a vapor (rociadura rápida de vapor en los cadáveres del ganado
vacuno) es otro método que parece efectivo para eliminar la E. coli O157: H7. Se ha reportado
que este método logra reducir la bacteria en una proporción de 1000 veces.
Investigaciones actuales muestran que la exclusión competitiva tiene el potencial de eliminar la
E. coli O157:H7 del ganado antes del sacrificio. Este método incluye el uso de microorganismos
no patógenos que desplacen a la bacteria del tracto gastroinstestinal de los animales.

41
 ESCHERICHIA COLI

Algunos consejos para evitar la infección con E. coli

 Cocinar bien los alimentos (La E. coli O157 se destruye a 75ºC durante tres minutos).
 Evitar consumir leche sin pasteurizar.
 Lavar las manos cuidadosamente antes de preparar y consumir alimentos.
 Tratar las fuentes de agua con cloro u otros desinfectantes efectivos.
 Lavar las manos después de manipular carne cruda o animales domésticos y de crianza
(especialmente ganado vacuno y perros), cambiar pañales y cuidar enfermos.
 Lavar las frutas y vegetales antes de manipularlas y comerlas.
 No usar estiércol fresco para fertilizar cultivos de frutas y vegetales.
 Evitar la contaminación cruzada de alimentos con carne cruda.
 Debido a que el organismo vive en los intestinos de ganado saludable deben estudiarse
medidas preventivas en las granjas de crianza y en los centros de procesamiento de las
carnes.
 Si le sirven una hamburguesa insuficientemente cocida u otro producto en base a carne
picada en un restaurante, devuélvala para que se la cocinen mejor y le cambien el plato.
 Evitar propagar bacterias nocivas en su cocina. Mantener la carne cruda separada de los
alimentos listos para comer. Lave sus manos, los mostradores y los utensilios con agua
caliente y detergente después de tocar la carne cruda. Nunca coloque alimentos cocidos o
que se ingerirán crudos en un plato donde previamente se ha colocado carne cruda.
 Cuando adquiera leche o jugo verifique que estos estén pasteurizados o esterilizados, no
consuma estos productos u otros productos que lo contengan en sus ingredientes, en lugares
no aptos para su expendio o los que son vendidos “sueltos”.
 Beber siempre agua potable o agua envasada de origen confiable.
 Si utiliza natatorios, evite tragar agua mientras nada.

42
 ESCHERICHIA COLI

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

LINKOGRAFIA

 http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/vigilancia/rtv0997.pdf
 ftp://ftp.fao.org/codex/meetings/ccfh/ccfh45/fh45_04_add1s.pdf
 http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/agns/pdf/Preventing_Ecoli_es.pdf
 http://www.scielo.org.ar/pdf/aap/v105n3/v105n3a01.pdf
 http://comunidad.ainia.es/web/ainiacomunidad/blogs/biotecnologia/-
/articulos/Dfu9/content/deteccion-de-e-coli-stec-o157-o104-y-otros-grupos-
productores-de-toxina-shiga-en-alimentos
 http://www.fcm.uncu.edu.ar/jornadas2012/index.php/articulos/view/66
 http://eurolab.org.es/Newsletter/julio2013/13.Anexo.2.pdf
 http://www.analizacalidad.com/docftp/fi148anmic.pdf
 http://www.unavarra.es/genmic/micalm/resumen-practicas.pdf
 http://www.fcm.uncu.edu.ar/jornadas2012/index.php/articulos/view/66

43