Titulación Viral

Titulación de los virus
Ensayos de Infectividad
Escuela de Microbiología
Sección de Virología - UNAH
TITULAR
• Significa cuantificar la cantidad de virus

en una muestra o de una solución stock,
es decir conocer la cantidad de partículas
infecciosas presentes por volumen.
Para qué sirve Titular una solución
viral?
• Para poder realizar cualquier prueba
inmunológica y que se pueda interpretar
correctamente, se deben utilizar los “reactivos”
en concentraciones adecuadas para que el
ensayo funcione.
• En cualquier prueba serológica en que

pretendemos determinar el título de un suero
con algún virus, este debe ser cuantificado
previamente y depende de esto para su
realización.
Cómo se hace la titulación?
• Se parte de una solución stock (semilla),
suspensión del virus.
• La suspensión viral se diluye empleando una
solución de sales balanceadas en diluciones
logarítmicas o semi-logarítmicas.
• Estas diluciones se inoculan en sistemas
indicadores de la presencia de virus tales como:
– Cultivo celular
– Huevos Embrionados
– Animales de Laboratorio
Cómo se hace la titulación?
• Se determina la más alta dilución en que se
presenta evidencia de multiplicación viral;
tales como:
– Efecto Citopático (ECP)
– Hemaglutinación con líquido amniótico o
alantoideo
– “Pocks ó pustulas” en membrana corio-
alantadoidea (MCA)
– Patología
– Muerte en embriones de pollo o animales
Métodos de Titulación de virus
• Recuento de Placas en Cultivos Celulares
• Hemadsorción en Cultivos Celulares
• Hemaglutinación en Huevos Embrionados
• Conteo de Pústulas en Huevos Embrionados
• Muerte o Enfermedad en Animales de

Laboratorio
Método de Placas (1)
• Es el método más preciso de medida de
infectividad viral, es un método cuantitativo.
• Se realiza por medio de procedimientos que
determinan la capacidad de una suspensión
viral de establecer un foco o lesión detectable
en una monocapa de células.
• Se hacen diluciones seriadas del virus, se le
añaden de una monocapa de células
susceptibles.
• Se deja “Adsorber” el virus a las células.
• Incubar por varios días dependiendo del virus y
de cuanto tarde en replicarse…
• El virus se replica en las células que infecta y su
progenie infectan a las células vecinas y
eventualmente produce FOCOS detectables de
infección denominados PLACAS.
• Cada Placa representa la infección de una célula
por una partícula infecciosa la cual se
denomina: “ UFP: Unidad Formadora de Placa”
• Se le agrega un medio conteniendo Almidón o
Agarosa para localizar la infección viral.
• Los virus que producen lisis o necrosis de las
células producen placas claras las cuales
pueden ser contadas después de ser
coloreadas.
Métodos de Colorear las Placas (1)
1. Con Colorantes Vitales
• Como el rojo neutro
• El cual se incorpora a la “overlay” o “sobrecapa”

de agarosa y se puede incubar con las células
infectadas hasta que se desarrollen las placas o
focos de células muertas que aparecen claras sin
colorear contra el fondo de células coloreadas.
2. Con colorantes No-Vitales
• Como: Cristal Violeta, Giemsa, Sal de

Tetrasolium, Carbol-Fucsina.
• Debido a que estos colorantes son para células

muertas no se pueden aislar virus de las
placas, son útiles para enumerar las partículas
virales infecciosas.
• Se elimina la sobrecapa “ Overlay” de la
monocapa de las células antes de colorearlas y
luego se fijan con Formalina y se colorean las
placas y se ven las zonas claras en un fondo
coloreado.
• Ventaja: se pueden guardar por mucho

tiempo y permite contar con una prueba
fehaciente de lo realizado.
Cómo calcular el titulo?
• El Título de una preparación viral es calculado
directamente del número de placas y la dilución
de la muestra, la exactitud de este método
depende del número de placas contadas; se
seleccionan entre 30-300 placas a contar.
• Ya que si el numero es mayor el margen de error

también, al igual que si son muy pocas no son
estadísticamente significativas.
HEMADSORCION
• Los cultivos infectados son cubiertos de una
sobrecapa de medio y después de un período de
incubación, la sobrecapa es removida y se le agrega
la suspensión de GR, los cuales se adhieren a los
focos de células infectadas y las placas pueden
entonces ser contadas microscópicamente.
• Los virus productores de placas pueden ser
purificados y se puede obtener una línea
genéticamente pura, pues provienen de una sola
partícula viral.
Conteo de Pústulas en Huevos
Embrionados (1)
• Cuando el virus crece en huevos embrionados en
la Membrana Corioalantoidea se forman unas
lesiones que se llaman Pústulas o “POCKS”
• La formación de Pústulas como la formación de

Placas empieza con la infección de una sola
célula.
• La respuesta de una infección local es compleja

con edema y hemorragia.
Conteo de Pústulas en Huevos
Embrionados (2)
• El conteo de pústulas es satisfactorio
solamente para los virus que son liberados de
la células muy despacio para dar lugar a otra
infección secundaria.
• Las pústulas aparecen después de 36-72 hrs

como áreas opacas usualmente blancas sobre
una membrana trasparente.
Métodos del Punto Final (De Todo o
Nada) = Ensayos Cualitativos (1)
• En este método el virus es diluído

seriadamente y en un volumen constante de
cada dilución es inoculado en un numero de
“UNIDADES TEST”
• Pueden ser ratones, huevos embrionados o

cultivos celulares= Unidad Test
Métodos del Punto Final (De Todo o
Nada) = Ensayos Cualitativos (2)
• Se manifiesta como: Muerte o enfermedad del

animal o embrión
• Degeneración del tejido celular= ECP
• Reconocimiento de la progenie viral por ej.

Hemaglutinación.
Forma de expresar los Títulos
• ID 50 o DI 50 (dosis infecciosa media)
• LD50 Dosis Letal Media
• PD50 Parálisis
• TCD50 si es cultivo de células o ECP
• El virus se deja multiplicar por un tiempo suficiente

para permitir la detección del efecto de una sola
partícula viral infecciosa por efecto de la amplificación.
• La dilución más alta del virus que causa un efecto debe
contener al menos una partícula viral infecciosa.
Cuantificación (1)
• El punto final se toma como la mayor dilución que
produce muerte en la mayoría de los especímenes
inoculados (animales, tubos de cultivos celulares o
huevos embrionados).
• La dosis letal 100% puede ser afectada por pequeñas

variaciones; se acostumbra utilizar la dosis infectiva o
letal media [50%], a la cual la mitad de los animales o
cultivos reaccionan y la otra mitad no. Para poderlo
lograr se deben utilizar gran cantidad de animales o
tubos de cultivo.
Cuantificación (2)
• El punto final al 50% se basa en diferentes tipos
de reacción. La más utilizada DL50 se basa en la
mortalidad por dosis letal de 50% de los
especímenes inoculados. TCDI50% es la dosis
letal para 50% de los cultivos celulares.
• Cuando se obtiene el título de una “suspensión

viral” se utiliza la misma “dosis” para los ensayos
de modo que los resultados sean comparables
con otros ensayos a nivel nacional e
internacional.
TITULOS (1)
• La precisión puede mejorarse por el uso de un
gran número de unidades test.
• El título de la DI50 es calculado por el método

de Reed & Müench o por el de Karber.
• La DI50 es el punto donde la mitad de los

animales mueren y la otra mitad NO.
TITULOS (2)
• Generalmente se usan de 6-8 animales por
cada dilución del virus, se incluyen controles
que solo se inoculan con el medio de cultivo.
• Ambos métodos de cálculo son similares en

cuanto a la precisión, el de Karber es un poco
más sencillo.
FORMULA REED-MUENCH
Acumulados
Dilución Mortalidad Muertos Vivos Muertos Vivos Razón %
10-1 6/6 6↓ 0↑ 17 0 17/17 100

10-2 6/6 6↓ 0↑ 11 0 11/11 100
10-3 4/6 4↓ 2↑ 5 2 5/7 71
10-4 1/6 1↓ 5↑ 1 7 1/8 13
10-5 0/6 0↓ 6↑ 0 13 0/13 0
CÁLCULOS
Distancia proporcional entre las diluciones a las cuales
ocurre el 50% del ECP
=
(% Mortalidad en dilución mayor 50%) - 50%
(% Mortalidad en dilución mayor 50%) – (% Mortalidad dilución Menor 50%)
71 - 50 21
= = 0.36 ~ 0.4
71 - 13 58
Continuación de cálculos…
Logaritmo negativo del título LD50= Log Neg

de la dilución mayor al 50% menos el 50%
de la mortalidad
Log Neg. del título LD50= -3.0-0.4 = -3.4
Título LD50= 10-3.4 Esto significa que a la dilución 10-3.4 [

2.5x10-3] se mueren el 50% de los animales o huevos embrionados
afectados o ECP en las monocapas celulares.
En un tubo colocar 1 ml de la suspensión del virus 10-3 adicionar 1.5

ml de diluente para una dilución final de virus a la 10-3.4
FORMULA DE KARBER
• -Log DL50= -L-d (S-0.5)
DONDE:
• L= el log de la dilución negativa mas baja=-0.1
• d= Diferencia entre las diluciones=Log 10=1.0
• S=Suma de las proporciones de las pruebas positivas
(ECP+)
• Log negativo del título DL50=
• = -L-d [ (S/100 -0.5)]= -0.1-1[100+100+71+13]/100 -0.5
• = -1-1[2.84-0.5]
• -1-1[2.34]= 3.34 TITULO DL50= 10-3.4

Titulación Viral

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Titulación Viral

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Titulación Viral

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Titulación de los virus

• Significa cuantificar la cantidad de virus

• En cualquier prueba serológica en que

• Hemadsorción en Cultivos Celulares

• Hemaglutinación en Huevos Embrionados

• Conteo de Pústulas en Huevos Embrionados

• Muerte o Enfermedad en Animales de

• Como el rojo neutro

• El cual se incorpora a la “overlay” o “sobrecapa”

• Como: Cristal Violeta, Giemsa, Sal de

• Debido a que estos colorantes son para células

• Ventaja: se pueden guardar por mucho

• Ya que si el numero es mayor el margen de error

• La formación de Pústulas como la formación de

• La respuesta de una infección local es compleja

• Las pústulas aparecen después de 36-72 hrs

• En este método el virus es diluído

• Pueden ser ratones, huevos embrionados o

• Se manifiesta como: Muerte o enfermedad del

• Degeneración del tejido celular= ECP

• Reconocimiento de la progenie viral por ej.

• El virus se deja multiplicar por un tiempo suficiente

• La dosis letal 100% puede ser afectada por pequeñas

• Cuando se obtiene el título de una “suspensión

• El título de la DI50 es calculado por el método

• La DI50 es el punto donde la mitad de los

• Ambos métodos de cálculo son similares en

Dilución Mortalidad Muertos Vivos Muertos Vivos Razón %

10-1 6/6 6↓ 0↑ 17 0 17/17 100

(% Mortalidad en dilución mayor 50%) – (% Mortalidad dilución Menor 50%)

Logaritmo negativo del título LD50= Log Neg

Log Neg. del título LD50= -3.0-0.4 = -3.4

Título LD50= 10-3.4 Esto significa que a la dilución 10-3.4 [

En un tubo colocar 1 ml de la suspensión del virus 10-3 adicionar 1.5

También podría gustarte