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    Listeria Guia

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    Jose Luis Rodriguez
    El documento describe los procedimientos para determinar la presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en alimentos. El procedimiento incluye tres etapas: 1) enriquecimiento selectivo, 2) siembra en placas selectivas, y 3) identificación a través de pruebas bioquímicas y serológicas. El aislamiento e identificación de L. monocytogenes sigue los métodos recomendados por la FDA para garantizar resultados precisos sobre la presencia de esta bacteria en los alimentos analizados.

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    El documento describe los procedimientos para determinar la presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en alimentos. El procedimiento incluye tres etapas: 1) enriquecimiento selectivo, 2) siembra en placas selectivas, y 3) identificación a través de pruebas bioquímicas y serológicas. El aislamiento e identificación de L. monocytogenes sigue los métodos recomendados por la FDA para garantizar resultados precisos sobre la presencia de esta bacteria en los alimentos analizados.

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    El documento describe los procedimientos para determinar la presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en alimentos. El procedimiento incluye tres etapas: 1) enriquecimiento selectivo, 2) siembra en placas selectivas, y 3) identificación a través de pruebas bioquímicas y serológicas. El aislamiento e identificación de L. monocytogenes sigue los métodos recomendados por la FDA para garantizar resultados precisos sobre la presencia de esta bacteria en los alimentos analizados.

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    El documento describe los procedimientos para determinar la presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en alimentos. El procedimiento incluye tres etapas: 1) enriquecimiento selectivo, 2) siembra en placas selectivas, y 3) identificación a través de pruebas bioquímicas y serológicas. El aislamiento e identificación de L. monocytogenes sigue los métodos recomendados por la FDA para garantizar resultados precisos sobre la presencia de esta bacteria en los alimentos analizados.

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    SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

    CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS


    LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
    DETERMINACIÓN DE PRESENCIA Y/O AUSENCIA DE Listeria monocytogenes

    JEYCI LEONOR COVILLA VANEGAS


    Microbióloga

    DETERMINACIÒN DE Listeria monocytogenes

    Es un Bacilo Corto (Cocobacilo) Gram positivo, Aerobio y Anaerobio facultativo, β- hemolítico,


    No posee cápsula, ni forma esporas, pero presenta movilidad (a 22ºC) y es Catalasa positiva, se
    disponen en cadenas cortas o en empalizada. Listeria crece bien incluso a temperaturas de
    refrigeración (4-10ºC).

    La principal vía de entrada de Listeria monocytogenes en el cuerpo humano es la oral, por esto es de
    gran importancia el análisis de los alimentos para detectar su presencia.
    La contaminación tiene lugar, generalmente, durante el consumo de alimentos que contienen la
    bacteria responsable de la enfermedad. Entre estos alimentos están la leche cruda, queso elaborado
    con esta leche, carne cruda o mal cocinada, verduras crudas, embutidos, patés, quesos frescos o
    poco curados (camembert ) la mujer puede transmitir

    Aún no es posible recomendar un sólo método para el aislamiento y la identificación de L.


    monocytogenes que sea completamente satisfactorio para todos los alimentos. Los métodos que se
    utilizan son en esencia similares en principio; comprenden varias etapas sucesivas; enriquecimiento
    selectivo, siembra en placas de Agar selectivo, identificación de las colonias con pruebas
    bioquímicas, confirmación serológica y tipificación de las colonias con pruebas bioquímicas,
    confirmación serológica y tipificación por medio de bacteriófagos.

    La presencia de L. monocytogenes en productos procesados térmicamente, indica tratamiento


    inadecuado o contaminación pos- proceso.

    Equipo y material

     Cabina de flujo laminar


     Frscos schott
     Incubadora a 30ºC y 35ºC +/- 2ºC
     Microscopio
     Microscopio estereoscopio
     Balanza de una
     Pipeteador
     Pipetas bacteriológicas de 1mL y 10mL
     Asa de inoculación
     Gradillas
     Cajas de petri
     Tubos de ensayo estériles
     Láminas porta objetos
     Instrumentos para preparar las muestras: cuchillos, tenedores, pinzas, espátulas,
    sacabocados, morteros, pistilos, etc., previamente esterilizados.
    Medios de cultivo y reactivos
    - Caldo de enriquecimiento para Listeria, EB
    - Agar Oxford en placa
    - Agar Palcam en placa
    - Agar triptosa con acido nalidìxico en placas
    - Agar tripticasa soya con extracto de levadura en placa, TSAYE

    Procedimiento

    La técnica utilizada par el aislamiento e identificación de L. monocytogenes es la recomendada por


    la FDA, modificada en algunos aspectos:

    El aislamiento de Listeria incluye tres etapas fundamentales:


    I. Enriquecimiento selectivo
    II. Siembra en placa en Agar selectivo y diferencial
    III. Identificación

    I. Enriquecimiento selectivo

    1. Pesar 25g representativos de la muestra total (tomando tanto de la superficie como de su


    interior)
    2. Añadir 225mL de caldo de enriquecimiento para Listeria (EB)

    3. Incubar a 30ºC +/- 2ºC durante 24 – 48 horas

    II. Siembra en placa con medios selectivos a las 24 y 48 horas.

    1. Transferir una asada del cultivo obtenido en el caldo de enriquecimiento (EB) a placas con
    Agar Oxford y Palcam, aislar por agotamiento.
    2. Incubar a 35ºC +/- 2ºC por 24 – 48 horas
    3. Las colonia típicas de L. monocytogenes en las placas de Agar Palcam son de color verde
    grisáceo con un halo marrón negro sobre un fondo rojo cereza, debido a la hidrólisis de la
    esculina y no fermentación del manitol.
    4. Otras bacterias pueden formar halos negros, pero el desarrollo de color toma más de dos
    días.
    5. Seleccionar 3- 5 colonias típicas de Listeria en cada placa de Agar utilizado.

    III. Identificación de Listeria

    La identificación de cultivos sospechosos de pertenecer al género Listeria incluye dos etapas


    seguidas:
    Comprobación de las colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas determinativas
    Identificación serológicas de las cepas sospechosas mediante el uso de antisueros.

    Identificación de Listeria mediante pruebas bioquímicas

    A partir de los cultivos puros obtenidos en el Agar tripticasa soya extracto de levadura (TSAYE)
    realizar las siguientes pruebas:
    *Método de Iluminación de Henry
    Observar las colonias con la ayuda de un estereoscopio. Un procedimiento sencillo es disponer de
    una fuente de luz blanca un espejo plano y un trípode. La luz debe de incidir sobre el espejo
    formando un ángulo de 45º y reflejarse hacia arriba atravesando la placa del Agar en un ángulo de
    45º observar la placa mirándola desde arriba. Las colonias de L. monocytogenes son pequeñas, de
    borde nítido, ligeramente abombadas con superficie lisa y con la luz incidente oblicua, exhiben
    superficie azulada.

    *Catalasa
    Colocar en un portaobjeto una gota de peróxido de hidrógeno al 3%. Suspender la colonia. Observar
    si se producen o no burbujas de gas.
    L. monocytogenes es catalasa (+) produce burbuja de gas.

    *Coloración de Gram
    L. monocytogenes es un bacilo o cocobacilo grampositivo. En cultivos viejos pueden observarse
    bacilos o cocos gramnegativos.
    Descartar los cultivos que no cumplan con las siguientes características:
    a). Catalasa (+)
    b). Bacilos o cocobacilos grampositivos

    *Movilidad y reducción de nitrato


    Inocular con asa recta por punción central tubos con Agar movilidad. Incubar a temperatura
    ambiente 2 – 5 días.
    L. monocytogenes: crecimiento típico en forma de sombrilla.
    Descartar los tubos que no presenten esta apariencia.

    MEDIO SIM
    L. monocytogenes desarrolla
    movilidad a temperatura de 25ºC
    y su crecimiento lo hace en
    forma de sombrilla como
    muestra la figura.

    Revelar la prueba de nitrato después de la lectura de la movilidad, comprobar la presencia de


    nitritos en el medio de movilidad – nitrato, añadiendo unos miligramos del reactivo de Griess, la
    aparición de un color rojo, indica presencia de nitritos (posibilidad); en el caso de que no ocurra
    cambio de color añadir unos miliramos de polvo de Zinc para determinar la presencia de nitrato
    residual. La aparición de un color rojo indica presencia de nitrato residual en el medio y por lo tanto
    una reacción negativa.

    Color rojo: no reducción de nitrato


    Color del reactivo: reducción del nitrato
    L. monocytogenes: Nitrato (-)
    Crecimiento típico de sombrilla

    Nota: Actualmente la prueba de reducción de nitratos es opcional.

    BIBLIOGRAFIA

     ALBARRACIN, Y, y HERRERA F. Texto de Microbiología de Alimentos. Universidad


    de Pamplona. 1994
     INVIMA. 1998. Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico
    de alimentos para consumo humano.
     S.J Forsythe y P.R. Hayes, Higiene De Los Alimentos Microbiología Y HACCP.,
    Editorial Acribia S.A página 53-58.

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