Bacterias Gram Negativas

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INTRODUCCION

Las bacterias son organismos procariotas y, por lo tanto, su material genético no


está delimitado por una membrana nuclear. Son abundantes y poseen una
extraordinaria capacidad de adaptar su metabolismo a una gran variedad de
microcosmos contenidos en tierra, agua, materia orgánica, plantas y animales.1
Las bacterias se reproducen asexualmente por división binaria, una vez
duplicado su ADN (ácido desoxirribonucleico) se alarga la membrana
citoplasmática y se forma una división transversal que separa al ADN original y
a su copia, originándose así dos células hijas. Cada bacteria es una réplica
genéticamente igual a la otra, es decir, es una clona de la célula que le dio
origen.2 Llevan en el planeta Tierra más tiempo que nuestros antepasados
reconocibles más remotos como son los metazoos, vertebrados o mamíferos. En
términos de biomasa, estos organismos son incontables; según los cálculos el
90% de nuestras células corresponde a bacterias, es decir, tenemos más
bacterias que células propias.

Las bacterias son consideradas por muchos autores organismos misteriosos. En


los últimos años se han realizado avances en el estudio de la ultraestructura
bacteriana, lográndose identificar bioquímica y molecularmente muchas
fracciones subcelulares. Además, otros avances en la genética bacteriana y la
biología molecular han permitido ubicar a las bacterias de acuerdo a la
clasificación de Cavalier-Smith de 2004 en el Imperio Prokaryota y en el Reino
Bacteria.4 Son organismos unicelulares microscópicos que presentan un
genoma no delimitado por una membrana nuclear. Algunas bacterias presentan
fragmentos circulares de ADN dispersos en el citoplasma denominados
plásmidos. Pueden presentar una cápsula de mucopolisacáridos y
prolongaciones como flagelos, fimbrias y pilis.

La pared que poseen la mayoría de las bacterias es rígida, flexible y elástica lo


cual explica la firmeza de su forma. Su originalidad reside en la naturaleza
química del compuesto macromolecular que le confiere su rigidez. Este
compuesto, un mucopéptido, está formado por cadenas de acetilglucosamina y
de ácido murámico sobre las que se fijan tetrapéptidos de composición variable.
Las cadenas están unidas por puentes peptídicos. De acuerdo a la composición
química de las paredes, las bacterias pueden comportarse de manera diferente
al teñirlas con el colorante Gram, formado con cristal violeta y una solución
yodurada. Aquellas que retienen el Gram después de lavarlas con
alcoholacetona se denominan Gram-positivas, y aquellas que pierden la
coloración se llaman Gram-negativas.
MARCO TEÓRICO
BACTERIA

Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño de


algunos micrómetros de largo (entre 0,5 y 5 μm, por lo general) y diversas formas
incluyendo esferas, barras y hélices. Las bacterias son procariotas y, por lo tanto,
no tienen núcleo ni orgánulos internos. Generalmente poseen una pared celular
compuesta de peptidoglucanos. Muchas bacterias disponen de flagelos o de
otros sistemas de desplazamiento y son móviles.

Son los organismos más abundantes del planeta. Son ubicuas, encontrándose
en todo hábitat de la tierra, creciendo en el suelo, en manantiales calientes y
ácidos, en desechos radioactivos, en las profundidades del mar y de la corteza
terrestre. Algunas bacterias pueden incluso sobrevivir en las condiciones
extremas del espacio exterior. Se estima que hay en torno a 40 millones de
células bacterianas en un gramo de tierra y un millón de células bacterianas en
un mililitro de agua dulce. En total, se calcula que hay aproximadamente 5×10 30
bacterias en el mundo.

Las bacterias son imprescindibles para el reciclaje de los elementos, pues


muchos pasos importantes de los ciclos biogeoquímicos dependen de éstas.
Como ejemplo cabe citar el fijación del nitrógeno atmosférico. Sin embargo,
solamente la mitad de los filos conocidos de bacterias tienen especies que se
pueden cultivar en el laboratorio, por lo que una gran parte (se supone que cerca
del 90%) de las especies de bacterias existentes todavía no ha sido descrita.

En el cuerpo humano hay aproximadamente diez veces tantas células


bacterianas como células humanas, con una gran cantidad de bacterias en la
piel y en el tracto digestivo. Aunque el efecto protector del sistema inmune hace
que la gran mayoría de estas bacterias sea inofensiva o beneficiosa, algunas
bacterias patógenas pueden causar enfermedades infecciosas, incluyendo
cólera, sífilis, lepra, tifus, difteria, escarlatina, etc. Las enfermedades bacterianas
mortales más comunes son las infecciones respiratorias, con una mortalidad sólo
para la tuberculosis de cerca de dos millones de personas al año.
Louis Pasteur demostró en 1859 que los procesos de fermentación eran
causados por el crecimiento de microorganismos, y que dicho crecimiento no era
debido a la generación espontánea, como se suponía hasta entonces. (Ni las
levaduras, ni los mohos, ni los hongos, organismos normalmente asociados a
estos procesos de fermentación, son bacterias). Pasteur, al igual que su
contemporáneo y colega Robert Koch, fue uno de los primeros defensores de la
teoría germinal de las enfermedades infecciosas. Robert Koch fue pionero en la
microbiología médica, trabajando con diferentes enfermedades infecciosas,
como el cólera, el ántrax y la tuberculosis. Koch logró probar la teoría germinal
de las enfermedades infecciosas tras sus investigaciones en tuberculosis, siendo
por ello galardonado con el premio Nobel en Medicina y Fisiología, en el año
1905. Estableció lo que se ha denominado desde entonces los postulados de
Koch, mediante los cuales se estandarizaban una serie de criterios
experimentales para demostrar si un organismo era o no el causante de una
determinada enfermedad. Estos postulados se siguen utilizando hoy en día.

1.1.1. Morfología de las bacterias

De todas formas, podemos distinguir tres tipos fundamentales de bacterias:

● Coco (del griego kókkos, grano): de forma esférica.


○ Diplococo: cocos en grupos de dos.

○ Tetracoco: cocos en grupos de cuatro.


○ Estreptococo: cocos en cadenas.
○ Estafilococo: cocos en agrupaciones irregulares o en racimo.
● Bacilo (del latín baculus, varilla): en forma de bastoncillo.

● Formas helicoidales:
○ Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma, judía o cacahuete.
○ Espirilo: en forma helicoidal rígida o en forma de tirabuzón.
○ Espiroqueta: en forma de tirabuzón (helicoidal flexible).
Algunas especies presentan incluso formas tetraédricas o cúbicas. Esta amplia
variedad de formas es determinada en última instancia por la composición de la
pared celular y el citoesqueleto, siendo de vital importancia, ya que puede influir
en la capacidad de la bacteria para adquirir nutrientes, unirse a superficies o
moverse en presencia de estímulos. A continuación se citan diferentes especies
con diversos patrones de asociación:

● Neisseria gonorrhoeae en forma diploide (por pares).


● Streptococcus en forma de cadenas.
● Staphylococcus en forma de racimos.

● Actinobacteria en forma de filamentos. Dichos filamentos suelen rodearse de


una vaina que contiene multitud de células individuales, pudiendo llegar a
ramificarse, como el género Nocardia, adquiriendo así el aspecto del micelio de
un hongo.

Estructuras extracelulares

Las bacterias disponen de una pared celular que rodea a su membrana


citoplasmática. Las paredes celulares bacterianas están hechas de
peptidoglucano (llamado antiguamente mureína). Esta sustancia está compuesta
por cadenas de polisacárido enlazadas por péptidos inusuales que contienen
aminoácidos. Estos aminoácidos no se encuentran en las proteínas, por lo que
protegen a la pared de la mayoría de las peptidasas. Las paredes celulares
bacterianas son distintas de las que tienen plantas y hongos, compuestas de
celulosa y quitina, respectivamente. Son también distintas a las paredes
celulares de Archaea, que no contienen peptidoglucanos. El antibiótico penicilina
puede matar a muchas bacterias inhibiendo un paso de la síntesis del
peptidoglucano.
Paredes celulares bacterianas. Arriba: Bacteria Gram positiva. 1-membrana
citoplasmática, 2-pared celular, 3-espacio periplásmico. Abajo: Bacteria Gram
negativa. 4-membrana citoplasmática, 5-pared celular, 6-membrana externa, 7-
espacio periplásmico.

Existen dos diferentes tipos de pared celular bacteriana denominadas Gram


positiva y Gram-negativa, respectivamente. Estos nombres provienen de la
reacción de la pared celular a la tinción de Gram, un método tradicionalmente
empleado para la clasificación de las especies bacterianas. Las bacterias Gram-
positivas tienen una pared celular gruesa que contiene numerosas capas de
peptidoglicano en las que se inserta ácido teicoico. En cambio, las bacterias
Gram-negativas tienen una pared relativamente fina, consistente en unas pocas
capas de peptidoglicano, rodeada por una segunda membrana lipídica (la
membrana externa) que contiene lipopolisacáridos y lipoproteínas.

Los micoplasmas son una excepción, pues carecen de pared celular. La mayoría
de las bacterias tienen paredes celulares Gram-negativas; solamente son Gram-
positivas Firmicutes y Actinobacteria. Estos dos grupos eran antiguamente
conocidos como bacterias Gram-positivas de contenido GC bajo y bacterias
Gram-positivas de contenido GC alto, respectivamente. Estas diferencias en la
estructura de la pared celular dan lugar a diferencias en la susceptibilidad
antibiótica. Por ejemplo, la vancomicina puede matar solamente a bacterias
Gram-positivas y es ineficaz contra patógenos Gramnegativos, tales como
Haemophilus influenzae o Pseudomonas aeruginosa. Dentro del filo
Actinobacteria cabe hacer una mención especial al género Mycobacterium, el
cual, si bien se encuadra dentro de las Gram positivas, no parece serlo desde el
punto de vista empírico, ya que su pared no retiene el tinte. Esto se debe a que
presentan una pared celular poco común, rica en ácidos micólicos, de carácter
hidrófobo y ceroso y bastante gruesa, lo que les confiere una gran resistencia.

Helicobacter pylori visto al microscopio electrónico, mostrando numerosos


flagelos sobre la superficie celular.
Muchas bacterias tienen una capa S de moléculas de proteína de estructura
rígida que cubre la pared celular. Esta capa proporciona protección química y
física para la superficie celular y puede actuar como una barrera de difusión
macromolecular. Las capas S tienen diversas (aunque todavía no bien
comprendidas) funciones. Por ejemplo, en el género Campylobacter actúan
como factores de virulencia y en la especie Bacillus stearothermophilus
contienen enzimas superficiales.

Los flagelos son largos apéndices filamentosos compuestos de proteínas y


utilizados para el movimiento. Tienen un diámetro aproximado de 20 nm y una
longitud de hasta 20 μm. Los flagelos son impulsados por la energía obtenida de
la transferencia de iones.

Esta transferencia es impulsada por el gradiente electroquímico que existe entre


ambos lados de la membrana citoplasmática.

Escherichia coli presenta unas 100-200 fimbrias que utiliza para adherirse a las
células epiteliales o al racto urogenital.

Movimiento
Los diferentes tipos de disposición de los flagelos bacterianos: A-Monotrico; B-
Lofotrico; C-Anfitrico; D-Peritrico.

Algunas bacterias son inmóviles y otras limitan su movimiento a cambios de


profundidad. Por ejemplo, cianobacterias y bacterias verdes del azufre contienen
vesículas de gas con las que pueden controlar su flotabilidad y así conseguir un
óptimo de luz y alimento. Las bacterias móviles pueden desplazarse por
deslizamiento, mediante contracciones o más comúmente usando flagelos.
Algunas bacterias pueden deslizarse por superficies sólidas segregando una
sustancia viscosa, pero el mecanismo que actúa como propulsor es todavía
desconocido. En el movimiento mediante contracciones, la bacteria usa su pilus
de tipo IV como gancho de ataque, primero lo extiende, anclándolo y después lo
contrae con una fuerza notable (>80 pN).

El flagelo bacteriano es un largo apéndice filamentoso helicoidal propulsado por


un

motor rotatorio (como una hélice) que puede girar en los dos sentidos. El motor
utiliza como energía un gradiente electroquímico a través de la membrana. Los
flagelos están compuestos por cerca de 20 proteínas, con aproximadamente
otras 30 proteínas para su regulación y coordinación. Hay que tener en cuenta
que, dado el tamaño de la bacteria, el agua les resulta muy viscosa y el
mecanismo de propulsión debe ser muy potente y eficiente. Los flagelos
bacterianos se encuentran tanto en las bacterias Gram-positivas como Gram-
negativas y son completamente diferentes de los eucarióticos y, aunque son
superficialmente similares a los arqueanos, se consideran no homólogos.
El flagelo bacteriano es un apéndice movido por un motor rotatorio. El rotor
puede girar a 6.000-17.000 rpm, pero el apéndice usualmente sólo alcanza 200-
1000 rpm. 1-filamento, 2-espacio periplásmico, 3- codo, 4-juntura, 5-anillo L, 6-
eje, 7-anillo P, 8-pared celular, 9-estator, 10-anillo MS, 11-anillo C, 12- sistema
de secreción de tipo III, 13-membrana externa, 14-membrana citoplasmática, 15-
punta.
Según el número y disposición de los flagelos en la superficie de la bacteria se
distinguen los siguientes tipos: un solo flagelo (monotrico), un flagelo en cada
extremo (anfitrico), grupos de flagelos en uno o en los dos extremos (lofotrico) y
flagelos distribuidos sobre toda la superficie de la célula (peritricos). En un grupo
único de bacterias, las espiroquetas, se presentan unos flagelos especializados,
denominados filamentos axiales, localizados intracelularmente en el espacio
periplásmico, entre las dos membranas. Estos producen un movimiento rotatorio
que hace que la bacteria gire como un sacacorchos desplazándose hacia
delante.
Muchas bacterias (tales como E. coli) tienen dos tipos de movimiento: en línea
recta (carrera) y aleatorio. En este último, se realiza un movimiento tridimensional
aleatorio al combinar la bacteria carreras cortas con virajes al azar. Las bacterias
móviles pueden presentar movimientos de atracción o repulsión determinados
por diferentes estímulos.
Estos comportamientos son denominados taxis, e incluyen diversos tipos como
la quimiotaxis, la fototaxis o la magnetotaxis. En el peculiar grupo de las
mixobacterias, las células individuales se mueven juntas formando ondas de
células, que terminarán agregándose para formar los cuerpos fructíferos
característicos de este género. El movimiento de las mixobacterias se produce
solamente sobre superficies sólidas, en contraste con E. coli, que es móvil tanto
en medios líquidos como sólidos.
Varias especies de Listeria y Shigella se mueven dentro de las células huésped
apropiándose de su citoesqueleto, que normalmente movería los orgánulos. La
polimerización de actina crea un empuje en un extremo de la bacteria que la
mueve a través del citoplasma de la célula huésped.
CLASIFICACIÓN DE BACTERIAS

Gram Positivo

En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias


que se tiñen de azul oscuro ovioleta por la tinción de Gram: de aquí el nombre
de "Gram-positivas" o también "grampositivas". Esta característica Química está
íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un
tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos
de bacterias, y cuando se tratan comotaxón se utiliza también el nombre
de Posibacteria. Las restantes son las bacterias Gram negativas.
La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana
citoplasmática y una pared celularcompuesta por una gruesa capa
de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la
membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La capa
de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la
responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram. A diferencia de
las Gram-positivas, las Gram-negativas no presentan una segunda membrana
lipídica externa a la pared celular y esta pared es mucho más gruesa. Incluyen
especies tanto móviles (vía flagelos) como inmóviles con forma
de bacilo (Bacillus, Clostridium,Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria)
o coco (Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin
ellas (Mycoplasma). Algunas especies son fotosintéticas, pero la mayoría
son heterótrofas.

Muchas de estas bacterias forman endosporas en condiciones


desfavorables. Realmente, no todas las bacterias del grupo son Gram-positivas
(no se tiñen por la aplicación de ese método), pero se incluyen aquí por su
similitud molecular con otras bacterias Gram-positivas.

Gram Negativo

En microbiología, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias


que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un
color rosado tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas" o también
"gramnegativas".

Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura


celular ( el tipo de pared bacteriana) , por lo que refleja un tipo natural de
organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias y
cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Negibacteria. Las
restantes son las bacterias Gram positivas.
Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que
se localiza una fina pared celular depeptidoglicano, mientras que las bacterias
Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de
peptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante
durante la tinción de Gram.
Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades.
Diferencia entre bacteria Gram Positiva y Gram Negativo

Imagen N°1 diferencia de estructura de bacterias Gram (+) y (-).

Diferencia microscópicamente de las estructuras de bacterias Gram


Positiva y Gram Negativa.
Estructura

La mayoría de las bacterias tienen una pared celular que es químicamente Gram
negativa. Este tipo de pared celular Gram-negativa, consta de tres estructuras:
una membrana interna, una capa de peptidoglicano, y una membrana externa.

 La membrana interna es la membrana plasmática y presenta las


características habituales de todas las bacterias.

 La capa media contiene una capa fina de peptidoglicano. El


peptidoglicano es el responsable de la incapacidad de la pared celular
para conservar el color violeta en la decoloración con etanol durante
la tinción de Gram.

 Además la pared celular Gram-negativa contiene una membrana externa


adicional, compuesta por fosfolípidos y lipopolisacáridos que hacen frente
a las condiciones del medio exterior. La naturaleza altamente cargada de
los lipopolisacáridos confiere una carga negativa total a la pared. Los
lipopolisacáridos presentes sobre la membrana externa, tienen una
estructura química que es única para cada cepa bacteriana específica y
es responsable de muchas de las características antigénicas de estas
cepas.

Superficie de bacteria E. coli. Microscopio electrónico de barrido.

Como en el caso de la bicapa fósforo, la parte lípida de la membrana externa es


en gran parte impermeable a todas las moléculas cargadas. Sin embargo, unos
canales denominados porinas, presentes en la membrana externa, permiten el
transporte pasivo de muchos iones, azúcares y aminoácidos a través de la
membrana externa. Estas moléculas están, por lo tanto, presentes en
el periplasma, la región comprendida entre las membranas citoplasmática y
exterior. El periplasma contiene la capa de peptidoglicano y muchas proteínas
responsables de la unión al substrato, hidrólisis y recepción de señales
extracelulares. Se supone que el periplasma se encuentra en un estado de tipo
gel más que en estado líquido debido a la alta concentración de proteínas y de
peptidoglicano que contiene. Debido a la localización del periplasma entre las
membranas citoplásmica y externa, las señales recibidas y los substratos son
transportados mediante las proteínas que contiene.

La envoltura celular de las bacterias gramnegativas está compuesta por una


membrana citoplasmática (membrana interna), una pared celular delgada de
peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la
pared celular de estas bacterias. Entre la membrana citoplasmática interna y la
membrana externa se localiza el espacio periplásmico, relleno de una sustancia
denominada periplasma, la cual contiene enzimas importantes para la nutrición
en estas bacterias.

Durante la tinción de Gram el colorante (cristal violeta) penetra en todas las


células bacterianas (tanto grampositivas como gramnegativas) a través de la
pared bacteriana. A continuación, la mezcla de alcohol-acetona decolora las
bacterias gram-negativas (no así las gram-positivas). Por último, un colorante de
contraste (safranina o fucsina) vuelve a las bacterias grammnegativas de color
rosado, mientras que las grampositivas permanecen con color violeta-azul
oscuro.

La pared externa de las bacterias Gram negativas

Al observar la pared de las bacterias Gram negativas al microscopio se


encuentran las siguientes capas

– Membrana externa que contiene fosfolípidos y el lipopolisacárido (LPS). Esta


capa está estrechamente unida al peptidoglicano y es considerada un
componente la pared celular de las bacterias Gram negativas.
– Una fina capa de péptidoglicano
– Espacio periplasmático o periplasma
– Membrana citoplasmática
La membrana externa de las bacterias Gram negativas

Las bacterias Gram negativas poseen en su pared celular una capa adicional
compuesta de lipopolisacárido (LPS) cuya estructura tiene tres partes:

Polisacárido O específico: Este varía entre especies, generalmente está


formado por unidades de azúcares de seis carbonos (glucosa, ramnosa,
galactosa o manosa), así como uno o más dideosiazúcares poco frecuentes
como abeucosa, colitosa, paratosa o tivelosa. Estos azúcares se unen formando
cadenas de cuatro o cinco unidades, que frecuentemente se encuentran
ramificadas. La repetición de estas secuencias da lugar a la formación del
polisacárido O. Este componente es un potente estimulador de la respuesta
inmune.

Núcleo del polisacárido: Generalmente está formado por azúcares como la


glucosa.

Lípido A: Es la parte lipídica del lipopolisacárido, no corresponde a un lípido de


glicerol, en su lugar la unión de los ácidos grasos se hace por medio de uniones
amino éster a un disacárido y este se une al núcleo del polisacárido. Los lípidos
que se suelen encontrar en esta estructura son el ácido caproico, laúrico,
mirístico, palmítico y esteárico. La estructura del lípido A del LPS puede ser
tóxica para los animales y constituye el denominado complejo de la endotoxina.

Función del lipopolisacarido, los fosfolípidos y las proteínas

Estos tres componentes cumplen la función de conformar o estructurar la


membrana exterior de las bacterias gram negativas, favoreciéndolas en cuanto
a la resistencia que estas le confieren.

 Lipopolisacarido: también llamados endotoxinas, son polímeros


complejos con restos de ácidos grasos como parte lipófila y cadenas
características de oligosacáridos y polisacáridos, que forman la parte
mayoritaria de la capa externa de la membrana externa de bacterias Gram
negativas. En su conjunto, forman una capa protectora hidrófila en torno
a la célula bacteriana que impide ser atravesada por moléculas lipófilas.

 Fosfolípidos: Componente estructural de la membrana celular. Los


fosfolípidos son un tipo de lípidos anfipáticos (son aquellas moléculas que
poseen un extremo hidrofílico o sea que es soluble en agua y otro
hidrófobo o sea que rechaza el agua) compuestos por una molécula de
glicerol, a la que se unen dos ácidos grasos (1,2-diacilglicerol) y un grupo
fosfato.
 Proteínas: son moléculas formadas por cadenas lineales de
aminoácidos. Pueden trabajar juntas para cumplir una función particular,
a menudo asociándose para formar complejos proteicos estables. Las
proteínas son necesarias para la vida, sobre todo para las funciones de la
celula (constituyen el 80 % del protoplasma deshidratado de toda célula),
pero también por sus funciones biorreguladoras (forman parte de las
enzimas) y de defensa (los anticuerpos son proteínas).
Filogenia

Dentro del grupo de las bacterias gramnegativas es posible diferenciar dos


niveles de organización, que se distinguen por la composición de la membrana
externa.56 En el primer subtipo la membrana externa presenta solo
simples fosfolípidos, mientras que en el segundo subtipo además presenta la
inserción de moléculas complejas de lipopolisacáridos (la estructura típica
descrita anteriormente). Los primeros incluyen solamente
a Thermotogae (termófilos y heterótrofos fermentativos) y a Deinococcus-
Thermus (quimiorganotrofos extremófilos); estos últimos, aunque dan positivo en
la tinción de Gram, son estructuralmente similares a las bacterias gramnegativas.

El resto de las bacterias gramnegativas pertenecen al segundo subtipo y


presentan lipopolisacáridosen su membrana externa. Las proteobacterias son
uno de los grupos principales, que incluyen a Escherichia coli, Salmonella y
otras enterobacterias, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomon
as, Bdellovibrio, bacterias del ácido acético, Legionella y las proteobacterias
alfa, como Wolbachia, y muchas otras. Otros grupos notables son
las cianobacterias, espiroquetas y las bacterias verdes del azufre y no del
azufre.
Se desconoce si la doble membrana es una característica primitiva o derivada.
Si fuese primitiva, las bacterias gramnegativas serían las primeras bacterias en
originarse, con las grampositivas derivadas a partir de ellas.7
 Una opción es que las bacterias grampositivas fueran las que aparecieron
primero, puesto que son las más simples. Se ha propuesto que cuando
un grupo de estas bacterias desarrolló los mecanismos para
producir antibióticos (como hace por ejemplo, la bacteria Streptomyces),
la presión selectiva obligó a las demás a protegerse de los efectos de
estas sustancias. Una de estas estrategias fue desarrollar una membrana
externa, dando lugar a las bacterias gramnegativas.86

 La opción alternativa considera que la doble membrana es una


característica primitiva y que la segunda membrana se perdió al crecer la
pared de peptidoglicano que impide la transferencia de lípidos para formar
la membrana externa.92 La hipótesis del citoplasma fuera describe un
posible modelo para la aparición de la doble membrana de las bacterias
gramnegativas. Otro posible escenario para la aparición de la membrana
externa es el de la esporulación.

Anillo de la vida obtenido a partir de estudios genómicos que muestra a las


bacterias grampositivas (Posibacteria, abajo) derivándose de las
gramnegativas (las restantes).
DIFERENCIAS ENTRE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM
NEGATIVAS

El científico danés Hans Christian Gram ideó un método para diferenciar dos
tipos de bacterias basándose en las diferencias estructurales en sus paredes
celulares. En su prueba, las bacterias que retienen el colorante violeta cristal lo
hacen debido a una capa gruesa de peptidoglicano y se llaman bacterias Gram-
positivas. Por el contrario, las bacterias Gram-negativas no retienen el tinte
violeta y son de color rojo o rosa. En comparación con las bacterias Gram-
positivas, las bacterias Gram-negativas son más resistentes a los anticuerpos
debido a su pared celular impenetrable. Estas bacterias tienen una amplia
variedad de aplicaciones que van desde el tratamiento médico hasta el uso
industrial y la producción de queso suizo.
Tinción e identificación

En una prueba de tinción de Gram , las bacterias se lavan con una solución
decolorante después de teñirlas con violeta cristal. En la adición de un colorante
de contraste tal como safranina o fuchsine después del lavado, las bacterias
Gram-negativas son de color rojo manchado o rosa mientras Gram-
positivas bacterias conservan su tinte violeta cristal.

Esto se debe a la diferencia en la estructura de su pared celular bacteriana. Las


bacterias Gram-positivas no tienen una membrana celular externa que se
encuentra en bacterias Gram-negativas. La pared celular de bacterias Gram-
positivas es alta en peptidoglicano que es responsable de retener el tinte violeta
cristalino.

Patogénesis
Patogénesis en humanos

Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas pueden ser


patógenas (ver lista de bacterias patógenas ). Se sabe que seis géneros de
bacterias grampositivas causan enfermedades en humanos: estreptococos,
estafilococos, corinebacterias, listeria, bacilos y clostridios. Otros 3 causan
enfermedades en las plantas: Rathybacter, Leifsonia y Clavibacter.

Muchas bacterias gramnegativas también son patógenas, p. Ej., Pseudomonas


aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Yersinia
pestis. Las bacterias Gram-negativas también son más resistentes a
los antibióticos porque su membrana externa comprende un lipopolisacárido
complejo (LPS) cuya porción de lípidos actúa como una endotoxina. También
desarrollan resistencia antes :
Una gran cantidad de bacterias Gram-negativas, saldrán de la caja, si se quiere,
resistentes a una serie de antibióticos importantes que podríamos usar para
tratarlas. Estamos hablando de agentes con nombres como Acinetobacter,
Pseudomonas, E. coli. Estas son bacterias que históricamente han hecho un
muy buen trabajo desarrollando muy rápidamente la resistencia a los
antibióticos. Tienen muchos trucos en la manga para desarrollar resistencia a los
antibióticos, por lo que son un grupo de agentes que pueden volverse resistentes
rápidamente y pueden presentar desafíos importantes para la resistencia. Y lo
que hemos visto en la última década es que estos agentes Gram-negativos se
vuelven cada vez más resistentes a todos los agentes que tenemos disponibles
para tratarlos.

Una mayor resistencia de bacterias gramnegativas también se aplica a una clase


de antibióticos recientemente descubierta que se anunció a principios de 2015
después de una sequía de décadas en nuevos antibióticos. No es probable que
estos medicamentos funcionen en bacterias gramnegativas.

Patologías
Enterobacterias multirresistentes
La familia de las enterobacterias (Enterobacteriaceae) incluye múltiples géneros
y especies de bacilos gramnegativos, algunos de los cuales son patógenos para
el ser humano. Tienen una amplia distribución: en el agua, el suelo, las plantas
y la flora intestinal de muchos animales y del hombre. Algunas especies
(Shigella spp., varias serovares de Salmonella, Yersinia pestis) se han adaptado
al ser humano y se consideran patógenos primarios, mientras que otras
(Escherichia coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp.,
Morganella morganii, Proteus spp., Providencia spp., Serratia spp., etc.) forman
parte de la microbiota normal, pero pueden comportarse como patógenos
oportunistas.

El principal mecanismo de transmisión de estos microorganismos se produce a


través de las manos del personal sanitario, que se coloniza cuando entra en
contacto con pacientes que a su vez están colonizados.

Muchas enterobacterias tienen una beta-lactamasa cromosómica (de las


clasesA o C) y expresan de forma basal o aumentada bombas de expulsión
activa, lo que determina una resistencia intrínseca a bastantes antimicrobianos 7.
Además, se pueden seleccionar con facilidad mutaciones cromosómicas en los
genes que codifican las topoisomerasas de claseii (relacionadas con la
resistencia a quinolonas) o las porinas (responsables de un ligero incremento del
nivel basal de resistencia a múltiples compuestos). También adquieren
fácilmente plásmidos que codifican otras beta-lactamasas y mecanismos de
resistencia a aminoglucósidos (enzimas modificadoras y metilasas), a
quinolonas (proteínas Qnr…) o a otros grupos de antimicrobianos clínicamente
relevantes.
La mayoría de estudios han relacionado la multirresistencia en enterobacterias
con la presencia de beta-lactamasas adquiridas, en especial las beta-lactamasas
de espectro extendido (BLEE), las cefamicinasas (enzimas de claseC)
plasmídicas y las carbapenemasas.

Las enterobacterias productoras de BLEE se describieron inicialmente en


España en 1988, poco después de su detección inicial en Alemania y
Francia. K.pneumoniae y E.coli fueron las especies de mayor importancia inicial
en cuanto a la producción de BLEE, causando brotes nosocomiales en grandes
hospitales, principalmente en unidades de cuidados intensivos, quirúrgicas y
neonatales. Sin embargo, en los últimos años han cobrado gran relevancia las
infecciones de origen estrictamente comunitario (en especial por E.coli) y por
otras especies como Enterobacter spp., P. mirabilis y Salmonella.

En un estudio multicéntrico realizado en España en el año 2000, el 93%


de K.pneumoniaeBLEE se aislaron en pacientes hospitalizados, pero el 51%
de E.coli con BLEE ya se aislaron en pacientes que en el momento de toma de
la muestra clínica no estaban hospitalizados. Varios autores han descrito un
aumento del número de portadores fecales de BLEE en la comunidad, lo que
podría incrementar la probabilidad de colonización en otros individuos. En este
sentido Valverde et al. describen que la colonización fecal de enterobacterias
productoras de BLEE aumentó significativamente en pacientes hospitalizados y
ambulatorios, de 0,3 y 0,7%, respectivamente, en 1991, a 11,8 y 5,5%, en 2003.
La tasa de colonización entre voluntarios sanos fue de 3,7%.

Las cepas productoras de BLEE son, en términos generales, resistentes a


penicilinas, cefalosporinas (excluidas cefamicinas, que no se hidrolizan por estas
enzimas) y monobactámicos. Además, las cepas productoras de BLEE también
presentan altos niveles de resistencia a quinolonas y aminoglucósidos.
Aunque las cepas de K.pneumoniae productoras de BLEE causantes de brotes
nosocomiales con frecuencia estaban relacionadas clonalmente, en el caso
de E.coli ha sido más frecuente la coexistencia de múltiples clones, en particular
en el medio extrahospitalario. En los últimos años, sin embargo, se está
documentando la existencia de clones de E.coli ampliamente distribuidos (p.ej.,
el que presenta la secuencia tipo [ST] ST131).

Se calcula que en la actualidad, en España, entre el 5 y el 15% de las cepas


de E.coli aisladas de muestras clínicas producen BLEE. Este porcentaje puede
ser aún mayor en K.pneumoniae(aunque existen importantes variaciones
locales).

Factores como la edad avanzada, la utilización de hemodiálisis, de sonda


vesical, o de catéteres intravenosos, y el tratamiento antibiótico, se han asociado
a las infecciones por enterobacterias de adquisición nosocomial. Cuando
hablamos de infecciones adquiridas en la comunidad, los factores de riesgo
cambian, y los 4 más frecuentes son el tratamiento antibiótico previo, la
hospitalización reciente, la cirugía y el género masculino. Además, cada tipo de
infección presenta unos factores de riesgo específicos. En este sentido, por
ejemplo, se han descrito recientemente como factores de riesgo asociados a las
infecciones del tracto urinario (ITU) comunitarias por enterobacterias productoras
de BLEE la hospitalización previa, el tratamiento antibiótico en los meses previos
(incluyendo cefalosporinas de segunda y tercera generación, penicilinas y
quinolonas), la infección urinaria recurrente, la edad avanzada, la diabetes y el
sexo masculino.

Algunas enterobacterias poseen una AmpC cromosómica que puede


hiperexpresarse de forma inducible (por la presencia de beta-lactámicos) o de
forma constitutiva (por selección de mutantes con alteraciones en genes
reguladores, conocidas por ello como mutantes desreprimidas). Estas últimas
cepas se pueden seleccionar con el uso de beta-lactámicos que, como las
cefalosporinas de tercera generación, inducen la enzima y se hidrolizan por ella.
A diferencia del fenotipo conferido por las BLEE, estas cepas son resistentes a
cefamicinas y —con alguna salvedad— a combinaciones de penicilinas con
inhibidores de beta-lactamasas, manteniendo la sensibilidad a cefalosporinas de
cuarta generación y carbapenémicos, aunque también pueden seleccionarse
mutantes resistentes a estos últimos compuestos por disminución de la
permeabilidad.

Otras enterobacterias han adquirido a través de un plásmido una enzima


relacionada con las AmpC cromosómicas (cefamicinasas plasmídicas) y
presentan un fenotipo habitualmente similar al de las mutantes desreprimidas de
AmpC cromosómica. Un estudio multicéntrico reciente en España indica que la
prevalencia de estas enzimas es del 0,64%, y que las familias más frecuentes
son CMY (en E.coli y P.mirabilis) y DHA (en Klebsiellaspp.).

Las enterobacterias hiperproductoras de AmpC cromosómica o de AmpC


plasmídicas producen infecciones comunitarias, relacionadas con la asistencia
sanitaria y nosocomiales, particularmente en pacientes predispuestos, con
factores de riesgo similares a los observados para otras infecciones por
enterobacterias multirresistentes.
De entre los problemas emergentes de multirresistencia en enterobacterias, el
relacionado con la producción de carbapenemasas es el menos importante en
nuestro entorno, pero en otros países está alcanzando dimensiones muy
preocupantes. Las carbapenemasas de mayor importancia incluyen las de la
familia KPC (claseA), las metalo-beta-lactamasas de claseB (NDM y en menor
medida VIM, IMP y otros tipos) y OXA-48. En un estudio multicéntrico español
realizado en 2009 la prevalencia de carbapenemasas fue de tan solo el 0,04%,
identificándose algunos aislados con enzimas tipo VIM o IMP. Recientemente se
han descrito varios brotes epidémicos, de amplias dimensiones, causados por
cepas productoras de OXA-48.
El aislamiento de enterobacterias de sitios anatómicos que suelen estar estériles
casi siempre implica infección, en tanto que su aislamiento de sitios no estériles,
en particular de heridas abiertas y el aparato respiratorio, requieren correlación
clínica para diferenciar la colonización de la infección.

Las formas clínicas de las infecciones por enterobacterias productoras de BLEE


varían según el contexto epidemiológico. Las infecciones de carácter endémico
y las aparecidas fuera del entorno de las unidades de cuidados intensivos (UCI)
se localizan preferentemente en el tracto urinario. Los brotes en la UCI
frecuentemente consisten en infecciones graves, relacionadas con catéteres
vasculares y del tracto respiratorio. Los microorganismos productores de BLEE
son responsables de infecciones graves como bacteriemia, neumonía
nosocomial, peritonitis, infecciones urinarias, quirúrgicas y meningitis.
Podríamos decir que casi cualquier órgano o cavidad corporal puede ser
infectado por un una enterobacteria resistente. E.coli, y en menor
grado Klebsiella y Enterobacter, causan la mayor parte de las infecciones
extraintestinales por enterobacterias multirresistentes y se encuentran entre los
patógenos más virulentos de este grupo.

La bacteriemia se asocia típicamente a determinadas puertas de entrada, como


catéteres venosos centrales, ITU, neumonías o infecciones intraabdominales. En
pacientes cirróticos no es raro que ocurra sin puerta de entrada evidente
(bacteriemia primaria), como también sucede en pacientes neutropénicos.
Las ITU producidas por enterobacterias BLEE-positivas son cada vez más
frecuentes y a su vez también una de las causas de sepsis por gramnegativos
en pacientes hospitalizados. La neumonía y la bacteriemia (de cualquier origen)
son las infecciones más graves que pueden desencadenar un shock séptico con
fracaso multiorgánico, llegando a tasas de mortalidad asociadas de hasta el 50%.

El diagnóstico microbiológico de las infecciones por enterobacterias


multirresistentes no plantea dificultades especiales, pues estos microorganismos
crecen bien en medios convencionales. Además, la identificación a nivel de
especie es poco compleja, la determinación de la sensibilidad a los
antimicrobianos está estandarizada, y los resultados de ambas cuestiones con
los métodos automáticos habituales son muy fiables. El reconocimiento de cepas
que producen BLEE tampoco es especialmente problemático (salvo que
coincidan mecanismos adicionales de resistencia a beta-lactámicos en la misma
cepa) y se basa en el incremento de la actividad de cefalosporinas de amplio
espectro en presencia de ácido clavulánico. Durante un tiempo se ha
considerado que la presencia de una BLEE automáticamente implicaba la
categorización de la correspondiente enterobacteria como resistente a
penicilinas, monobactámicos y cefalosporinas (salvo cefamicinas). Sin embargo,
en la actualidad tanto el Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) como el
EUCAST recomiendan que sea el valor de la CMI y su relación con los puntos
de corte de sensibilidad establecidos, en vez de la simple presencia de BLEE, lo
que determine si, desde un punto de vista terapéutico, la cepa debe considerarse
sensible o resistente a estos compuestos. No todos los autores con experiencia
en el tema están de acuerdo en esta posición, y además el reconocimiento de
cepas con BLEE sigue siendo importante por la relevancia epidemiológica de
estas enzimas.

Hay mucha menos experiencia en la detección de AmpC plasmídica,


procedimiento que no ha sido estandarizado aún por el CLSI o el EUCAST.
También hay cierta controversia en cuanto al mejor método para detectar
carbapenemasas. En ambos casos el uso de herramientas moleculares para la
detección de genes que codifican los correspondientes enzimas siguen siendo
importante.

Las opciones de tratamiento en las infecciones causadas por enterobacterias


productoras de BLEE son limitadas, ya que, como se ha indicado, presentan
resistencia a la gran mayoría de beta-lactámicos. Los únicos beta-lactámicos que
mantienen actividad frente a las enterobacterias productoras de estas enzimas
son, además de las cefamicinas, como la cefoxitina, las combinaciones de beta-
lactámicos con inhibidores de beta-lactamasas (como amoxicilina-clavulánico o
piperacilina-tazobactam) y los carbapenémicos (imipenem, meropenem,
ertapenem). No obstante, existen dudas respecto a la utilización de cefamicinas
y las combinaciones de beta-lactámicos con inhibidores de beta-lactamasas.
Como se ha señalado, los plásmidos que codifican las BLEE suelen portar genes
de resistencia a otros antibióticos como el cotrimoxazol, aminoglucósidos y
tetraciclinas, y el fenómeno de resistencia cruzada es muy frecuente. Por
razones no del todo claras, estas cepas son también resistentes a las
fluoroquinolonas con mayor frecuencia que las cepas no productoras de BLEE.
Por todo ello, el tratamiento de las infecciones producidas por bacterias
productoras de BLEE entraña una dificultad notabl

Pseudomonas aeruginosa
El género Pseudomonas incluye múltiples especies con amplia distribución en
diversos ambientes, en especial los húmedos. La especie más importante en
patología humana es P.aeruginosa, que causa infecciones graves, con elevada
morbimortalidad, en pacientes inmunosuprimidos, principalmente en el ámbito
hospitalario, en UCI y en unidades de críticos oncohematológicos; además, es la
causa más frecuente de infección respiratoria crónica en pacientes con fibrosis
quística40,41. Las infecciones nosocomiales generalmente incluyen neumonías,
bacteriemias, infección de herida quirúrgica e infecciones de vías urinarias 40.
P.aeruginosa logra sobrevivir en ambientes y temperaturas propias del entorno
clínico y crece fácilmente en medios de cultivo habituales, pues sus
requerimientos nutritivos son escasos. Su identificación en el laboratorio y la
determinación de su sensibilidad a los antimicrobianos no suelen plantear
dificultades, con la excepción de los fenotipos mucosos que suelen identificarse
en pacientes con fibrosis quística.
P.aeruginosa es naturalmente resistente a la mayoría de las penicilinas, las
cefalosporinas de primera, segunda y muchas de las de tercera generación
(salvo ceftazidima), las tetraciclinas, el cotrimoxazol y la rifampicina42,43. Esta
resistencia basal se debe a la poca permeabilidad de su membrana externa
(mucho menor que la de las enterobacterias), a la existencia de varios sistemas
de expulsión activa que eliminan los antimicrobianos que alcanzan el interior del
microorganismo y a la producción de una beta-lactamasa cromosómica de tipo
AmpC, que —como en el caso de algunas enterobacterias— puede inducirse o
hiperexpresarse en mutantes desreprimidas. Algunas cepas producen además
de AmpC otras beta-lactamasas adquiridas, incluyendo las del grupo PSE,
algunas OXA, BLEE (mucho menos frecuentes que en enterobacterias) o
carbapenemasas (en especial las de claseB, como VIM, IMP…).
Los carbapenémicos penetran en el interior de P.aeruginosa a través de la
porina OprD, por lo que su pérdida contribuye a la resistencia a estos
antimicrobianos (sin que exista resistencia cruzada con otros beta-lactámicos)44.
El uso de carbapenémicos puede seleccionar durante el tratamiento mutantes
deficientes en OprD, que son responsables de fracaso terapéutico. Aunque
AmpC tiene muy poca eficacia como carbapenemasa, su actividad es mayor
frente a imipenem que frente a meropenem. Por otra parte, el sistema de
expulsión MexAB-OprM elimina meropenem (aunque no imipenem), por lo que
su hiperexpresión se relaciona con la resistencia a este antimicrobiano en
concreto. Muchas cepas de P.aeruginosa deficientes en OprD son a la vez
resistentes a imipenem y a meropenem, pero como la desrepresión de AmpC es
más frecuente que la hiperexpresión de MexAB-OprM, en cepas clínicas se
observa con más frecuencia resistencia a imipenem que a meropenem 42.

Con independencia de estos mecanismos, la resistencia a carbapenémicos


también puede ser debida a la producción de carbapenemasas, en particular de
metaloenzimas (VIM, IMP, SPM…)33. En ausencia de otros mecanismos de
resistencia estas últimas cepas son sensibles a aztreonam, ya que este
compuesto no se hidroliza por las beta-lactamasas de claseB42.
La principal causa de la resistencia de P.aeruginosa a aminoglucósidos es la
producción de enzimas modificadoras, aunque también contribuye el sistema de
expulsión activa MexXY-OprM. La resistencia a quinolonas depende de la
existencia de las ya citadas bombas de expulsión y de alteraciones en las
topoisomerasas. La gran mayoría de cepas de P.aeruginosa son sensibles a
colistina, aunque también se han descrito cepas resistentes

DIFERENCIAS ENTRE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM


NEGATIVAS
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes
celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas

La pared celular de las bacterias gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos: anclado en la cara
interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el
ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado
solamente en el peptidoglicano (también conocido como mureína).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las gram negativas es delgada, y
se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de
composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa
delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La
membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas


direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el
material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las gram positivas
lo poseen en mucha mayor proporción que las gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que


la membrana externa de las gram negativas es soluble en solventes orgánicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que
posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal
violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa,
perdiéndose la coloración azul-violácea. Por el contrario, las gram positivas, al
poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de
peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que
este actúa deshidratando los poros, cerrándolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-
violeta.

Características de las bacterias Gram-negativas

 Puede presentar una capa superficial cristalina denominada capa S. la


cual está unida directamente a la membrana externa.

 La pared celular no es tan resistente en comparación con las bacterias


gram positivas

 No son resistentes a la decoloración, se debe a que la membrana externa


de las gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por
ejemplo la mezcla de alcohol/acetona

 Se colorean o se tiñen de rosadas


 No forman el complejo iodo-cristal violeta por la cual el colorante es
liberado por la acción del solvente (alcohol/ acetona). Es decir que
presentan poca capacidad de retención del colorante.

 La capa de Peptidoglicano que posee es delgada. Poseen ¼ respecto a


la capa de las bacterias gram positivas.

 la membrana externa es soluble en solventes orgánicos, como por


ejemplo la mezcla de alcohol/acetona.

 La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas está compuesta por


una membrana citoplasmática (membrana interna), una pared celular
delgada de peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana
externa que recubre la pared celular de estas bacterias.

 Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana


exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína,
fosfolípido y lipopolisacárido.

 No presentan ácidos teicoicos ni ácidos lipoteicoicos, típicos de las


bacterias Gram-positiva

 presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina
pared celular de Peptidoglicano. Al ser la pared fina, no retiene el
colorante durante la tinción de Gram.

 La mayoría no forma endosporas a excepción (Coxiella burnetti, produce


estructuras similares a las endosporas ).
Cuadros comparativos Bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
CONCLUSIONES

Se concluyó el conocimiento de la clasificación de las bacterias gram negativas.


Se concluyó conocer la clasificación a través del método de tinción.

BIBLIOGRAFIA

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clinica-28-articulo-infecciones-causadas-por-bacterias-gramnegativas-
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positivas-y-gram-negativas

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